Funcionalização de nanoestrelas de ouro

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    06-Dec-2014
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Relatório final do projeto estágio da Licenciatura em Bioquímica

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  • 1. IUNIVERSIDADE DO PORTOFACULDADE DE CINCIASINSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICAS DE ABEL SALAZARRelatrio de Estgio da Licenciatura em BioqumicaPreparao de nanobioconjugados de nanoestrelas de ouro e tirosi-nasepara o desenvolvimento de sensores.Rui Pedro Fernandes Ribeiro2013

2. Preparao de nanobioconjugados de nanoestrelas de ouro e tirosi-naseIIpara o desenvolvimento de sensores.REQUIMTE, Departamento de Qumica e Bioqumica da Faculdade de Cincias da Uni-versidadedo Porto, 4169-007 Porto, PortugalOrientadoraProfessora Doutora Eullia PereiraCo-orientadoraMestre Leonor SoaresPorto, 2013 3. IIIAgradecimentos Professora Doutora Eullia Pereira, minha orientadora, gostaria de agradecer aoportunidade de estagiar no seu grupo de investigao, a confiana e motivao depositadaem mim, bem como os conhecimentos transmitidos e a sua enorme disponibilidade.A todos os elementos do grupo de investigao agradeo pelo companheirismo e ex-celenteambiente de trabalho, em especial Mestre Leonor Soares, minha co-orientadora, eao Doutor Pedro Quaresma, pela amizade, simpatia e pacincia e pelo constante apoio naelaborao deste projeto. Quero agradecer-lhes por tudo o que aprendi durante estes largosmeses: as tcnicas, as dicas e os conselhos sbios que levo comigo e me ajudaro na minhacarreira cientfica, mas tambm os grandes momentos de descontrao que se misturaramcom o trabalho.Aos meus amigos, por toda amizade que aqui impossvel descrever, em especial, minha grande amiga Francisca Dias que nos ltimos quatro anos me ajudou a descobrir overdadeiro gosto pela cincia, pois quando se tem esprito cientfico no h limites para oconhecimento.Aos meus pais deixo aqui o meu sentido agradecimento, e quero dizer-lhes que des-cobrique tenho mais deles em mim do que imaginava: ao meu pai, com quem partilho amesma boa disposio e curiosidade pelo mundo que nos rodeia e minha me, de quemherdei o esprito de sacrifcio, resistncia e perfecionismo. Obrigado pelo apoio e fora in-condicionaisque me motivam todos os dias a ser mais e melhor. minha restante famlia agradeo por me ter acompanhado todos os dias da minhavida, em especial minha prima Ana a quem mais uma vez agradeo por me ter dado mui-tomais do que me apercebi, e minha av Eduarda que, nos ltimos dozes anos tem sidoum pilar essencial na minha vida.A todos vocs, obrigado por terem entrado na minha vida, me terem inspirado e ilu-minadocom a vossa presena! 4. IVAbreviaturasAAuNPs nanopartculas de ouroAuNSs nanoestrelas de outroAla alaninaAsn asparaginaCCALNN pentapptido de carga neutra (Cis- Ala-Leu-Asn-Asn)Cis cistenaDD.L.S. Disperso dinmica de luz (Dynamic light scattering)ou espetroscopia de correlao fotnicaLLeu leucinaMM concentrao molar11-MUA cido 11-mercaptoundecanicoNNPs nanopartculasPPVP polivinilpirrolidonaSseeds ncleos de crescimento 5. VTT.E.M. Microscopia de transmisso eletrnicatips pontas das nanoestrelasTYR tirosinaseUUV/vis Ultravioleta/visvel comprimento de onda 6. VINDICE1Introduo11.1Nanotecnologia11.2NanopartculasdeOuro21.2.1Caractersticasepropriedades21.2.2Tcnicasdesntese21.3Interaonanopartcula-proteina41.4Tcnicasdecaracterizaoeanlisedenanopartculasedainteraodestascompptidoseprotenas71.4.1EspetrofotometriaUV/Vis71.4.2Medidasdedispersodinmicadeluz(D.L.S.)71.4.3Medidasdepotencialzeta(Potencial)81.4.4Microscopiaeletrnicadetransmisso(T.E.M.)92Objetivos103MateriaiseMtodos113.1ReagenteseSolventes113.2Instrumentao123.3Procedimentoslaboratoriais133.3.1Sntesedencleosdecrescimento(seeds)deouro133.3.2FuncionalizaodeAuNPscomPVP143.3.3SntesedeAuNSs153.3.4CentrifugaodasAuNSs163.3.5DeterminaodaconcentraoedareasuperficialdasAuNSs163.3.6FuncionalizaodeAuNSscomopptidoCALNNeMUA173.3.7Formaodosbionanoconjugadoscomtirosinase173.3.8Caracterizaodasnanopartculas183.3.9EstudodaestabilidadecoloidaldasAuNSs194Resultados204.1SnteseefuncionalizaodeAuNPsesfricaspelomtododareduodocitrato204.2FuncionalizaodasesferascomoPVP21 7. 4.3Sntesedencleosdecrescimentodeouro224.4SntesedeAuNSs234.5EstudodaestabilidadecoloidaldasAuNSs274.6FuncionalizaodasAuNSs274.7Formaodebionanoconjugadosdetirosinase315Consideraesfinais336RefernciasBibliogrficas34VII 8. VIIIndice de FigurasFigura 1-1 Ilustrao representativa da escala nano [3]. 1Figura 1-2 Representao grfica da concentrao atmica em funo do tempoilustrando os fenmenos de nucleao e crescimento (adaptado de Xia et al. [9]). 3Figura 1-3 Representao do mecanismo proposto para a reao entre DMF-PVP eHAuCl4 (adaptado de Kedia et al. [15]). 4Figura 1-4 Coroa de protenas na NP. A ligao da protena partcula pode levar a umasrie de consequncias, nomeadamente alteraes conformacionais, que podem levar amudanas na atividade biolgica, fibrilao, ou estabilizao de determinada conformao.(adaptado de Yang et al. [16]). 5Figura 1-5 Frmula de estrutura dos agentes de revestimento utilizados: PVP, 11-MUA eCALNN. 6Figura 1-6 Estrutura cristalogrfica da tirosinase de Agaricus bisporus (PDB-2Y9W). 7Figura 1-7 Representao do potencial eltrico em funo da distncia da superfcie deAuNPs (adaptado de Wikipdia [22]). 8Figura 4-2 A- espetro de extino de soluo das seeds, em etanol, aps sofrerem asrespetivas centrifugaes; B - espetro de extino das AuNSs, em etanol, sintetizadas comas seeds diferenciais. 22Figura 4-3 Representao esquemtica da uma AuNS de 4 tips no plano e 2 tips noplano , e espetro de extino de AuNSs com diferentes nmeros de tips. 24Figura 4-4 Espetro de extino das amostras do stock de 120 mL de AuNSs em DMF,etanol e gua. 25Figura 4-5 Imagens de T.E.M. e anlise estatstica do dimetro mdio das solues deAuNSs sintetizadas a partir de seeds com 18 nm de dimetro. A - 7 mL de AuNSs de rcio9; B - 7 mL de AuNSs de rcio 11; C - 7 mL de AuNSs de rcio 15; D - 120 mL de AuNSsde rcio 15. 26Figura 4-6 Espetros de extino da soluo stock de 120 mL de AuNSs aps a variaocom o pH (A) e com a fora inica (B). Imagens de T.E.M. de AuNs sem adio de NaCl(C), com 0,5M de NaCl (D) e 3M de NaCl (E). 28Figura 4-7 A espetro de extino de aliquotas de 1,5 mL de AuNSs funcionalizadascom CALNN e 11-MUA antes e aps a diminuio do pH; B espetro de extino dasoluo stock de 120 mL de AuNSs funcionalizadas antes e aps a diminuio do pH;distribuio do potencial z das AuNSs funcionalizadas com o CALNN logo aps a 9. funcionalizao (C e D) e 6 dias depois (E e F), com o 11-MUA (G e H) e dafuncionalizao de 10 mL de AuNSs com CALNN (I e J). 29Figura 4-8 Representao grfica do potencial z e do dimetro mdio das partculas emfuno da quantidade de enzima adicionada. 32Figura 4-9 Espetro de extino das AuNSs em funo da quantidade de enzimaadicionada. 32IX 10. Xndice de TabelasTabela 3-I Caractersticas dos rotores utilizados. 12Tabela 4-I Comparao do dimmetro mdio das AuNPs antes e aps a funcionalizaocom PVP obtidos por trs tcnicas diferentes. 20Tabela 4-II Descrio das centrifugaes diferenciais das AuNPs. 23Tabela 4-III Comparao do dimetro calculado com o obtido por T.E.M das AuNSssintetizadas com diferentes rcios. 24Tabela 4-IV Concentrao do stock de 120 mL AuNSs antes e aps as centrifugaes. 25Tabela 4-V Medies de Potencial z das AuNSs antes e aps a funcionalizao. 30Tabela 4-VI Resultados do potencial z e de D.L.S. de solues de AuNSs com diferentesconcentraes de enzima. 31 11. XIResumoA combinao de nanomateriais inorgnicos com produtos biolgicos permite a cria-ode nanomateriais biologicamente ativos com potenciais aplicaes na indstria, medi-cinae at mesmo a nvel ambiental, j que a produo destes materiais fundamenta-se hojeem dia no conceito de Qumica Verde, que pode ser definida como o uso de metodologiasque visam a reduo de reagentes ou produo de produtos que possam ser nocivos ao ho-memou ao ambiente.O trabalho desenvolvido neste projeto teve como objetivo a preparao de bioconju-gadoscom possvel aplicao no desenvolvimento de biossensores e em biorremediao.Este relatrio descreve a sntese e funcionalizao de ncleos de crescimento e de na-noestrelasde ouro e utilizao destas para a preparao e estudo de bionanoconjugadoscom tirosinase.Os ncleos de crescimento so nanoesferas de ouro sintetizadas pelo mtodo da redu-odo citrato e funcionalizadas com PVP. Estes ncleos de crescimento so posteriormen-teutilizados na sntese de nanoestrelas de ouro.Para tornar a superfcie das nanoestrelas biocompatvel com materiais biolgicos co-moprotenas, estas foram funcionalizadas com o pptido tiolado CALNN, e outro agentede revestimento tambm tiolado, 11-MUA, servindo este ltimo apenas como controlo.Aps a funcionalizao das nanoestrelas estas so mais aptas adsoro de biomol-culas superfcie, podendo ser utilizadas como biossensores, catalisadores de reaes bio-lgiasou como transportadores de frmacos. Para a formao destes bionanoconjugadosfoi utilizada a enzima tirosinase que realiza duas reaes de catlise distintas.Ao longo de todo o trabalho experimental, foram utilizadas diversas tcnicas de carac-terizaode nanopartculas como a espetrofotometria UV/vis, a microscopia de transmis-soeletrnica e medidas de disperso dinmica de luz e de potencial zeta. 12. 11 Introduo1.1 NanotecnologiaDefine-se nanocincia como o estudo das propriedades da matria numa escala entre1 e 100 nm (Figura 1-1) e nanotecnologia como a manipulao de materiais a essa escala, deforma a produzir materiais que sejam teis para o desenvolvimento humano. A nanotecno-logia um campo bastante multidisciplinar abrangendo reas como a engenharia de mate-riais,eletrnica e mecnica, bem como a biologia, fsica e qumica.Uma nova rea de estudos que tem sido intensamente explorada pelos cientistas ananomedicina, ou seja a aplicao da nanotecnologia, nanomateriais e nanodispositivospara o diagnstico e teraputica de doenas. Por exemplo, muitos cientistas tentam desen-volvernanobiossensores, que quando inseridos no corpo humano podem continuadamentemonitorizar nveis de glucose no sangue [1], transportadores de frmacos baseados em na-nopartculas,ou utilizar as prprias nanopartculas para terapia termal contra o cancro [2].Portanto, a expanso do conhecimento em nanocincia e nanotecnologias de cr