PREPARAÇÃO DE NANOBIOCONJUGADOS DE

NANOESTRELAS DE OURO E TIROSINASE PARA

DESENVOLVIMENTO DE SENSORES

Rui Pedro Fernandes Ribeiro

Orientadora: Prof.ª Doutora Eulália PereiraCoorientadora: Mestre Leonor Soares

Julho 2013

Introdução

Nanotecnologia: um campo multidisciplinar!

Bionanoconjugados

nanopartículas com biomuléculas adsorvidas à superfície tornando-a mais biocompatível.

Biossensores e Bioremediação

imagem adaptada de http://nanotech.ica.ele.puc-rio.br/nano_introducao.asp

Sumário

1. Síntese de núcleos de crescimento;

2. Síntese de Nanoestrelas;

3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoestrelas;

4. Funcionalização de nanoestrelas;

5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase.

1. Síntese de núcleos de de crescimento

A450nm ⁄ ASPR T.E.M D.L.S. Potencial ζ

AuNPs 14,3 nm 13,7 ± 1,5 nm 16,0 ± 3,6 nm - 45 ± 19 mV

AuNPs + PVP 19,1 nm - 18,7 ± 1,4 nm - 37,2 ± 13 mV

N O

HH

n

Funcionalização com PVP:• 60 moléculas / nm2

Diâmetro (nm)

Con

tage

m

10 12 14 16 18 20 220

2040

6080

100

120

140 Diâmetro médio

13,71 ± 1,52 nm

300 400 500 600 700 800

� (nm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Abs

AuNPsAuNPs + PVP

2. Síntese de Nanoestrelas

Reagentes• Percursor metálico: HAuCl4

• Agente Redutor: DMF

• Agente de Revestimento: PVP

• Núcleo de Crescimento (NP-PVP)

Método de Liz-Marzán

2. Síntese de Nanoestrelas

300 400 500 600 700 800 900 1000

� (nm)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Abs

Cfg1Cfg2Cfg3Cfg4

300 400 500 600 700 800 900 1000

� (nm)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Abs

Racio 9Rácio 11Rácio 15

Espetro de extinção de AuNSs (rácio 9) sintetizadas com diferentes tamanhos de seeds:

• Cfg1 - 19,3 nm

• Cfg2 - 18,9 nm

• Cfg3 - 17,9 nm

• Cfg4 - 15,9 nm

Espetro de extinção de AuNSs sintetizadas com seeds Cfg3 em diferentes rácios.

2. Síntese de Nanoestrelas

AuNSs Calculado T.E.M.

Rácio 9 38,8 nm 36,1 ± 6,05 nm

Rácio 11 41,2 nm 39,7 ± 5,30 nm

Racio 15 45,3 nm 47,6 ± 9,09 nm

Fig. 1. (a) Schematic representation of a 4-fold nanostar, with two relevant symmetryplanes: the plane ! where the number of tips is varied and the polarization plane ". (b)Absorption cross sections for Au nanostars with different number of tips from S1 to S6,along with that for the equivalent Au nanosphere.

electromagnetic field distribution on the surface of the nanostars at the LSPRs, from which theabsorption cross section is worked out, as needed to determine the steady-state temperature ofa metallic NP.

2. LSPRs of gold nanostars

Let us consider a NS whose geometrical shape is described as a deformable parametric surfacecalled Supershape [20], which depends on certain parameters that basically modify the sphereformula in spherical coordinates. Particularly, we fix a configuration of parameters that allowus to change the number of tips in a star-like volume, preserving its shape. In order not tointroduce too much complexity in the system under study, we only vary the number of tips inthe plane ! (see Fig. 1(a)) from n = 1 to n = 6. In the perpendicular plane ", the symmetryof the number of star tips is kept constant in such a way that two opposing tips, one pointingupwards and the other one downwards. We will refer to the nanostar with n tips in the plane !as Sn. Such star-like shapes indeed closely resemble those of fabricated colloidal NSs [13].In Fig. 1(b) the absorption cross section is plotted for NSs made of gold described by the

dielectric constant reported in reference [21]. The incident field is a plane wave impingingfrom the bottom, its plane of incidence being the plane ", Fig. 1(a). NSs have arms 40 nm long,and increasing number of tips. The LSPRs for Au-NSs are red-shifted when the number of tipsin the plane! increases from S1 to S6: #LSP (nm)=521, 548, 560, 587, 628, 688, respectively. InFig. 2(a-f) we have plotted the norm of the surface electric field (SF) of the NSs in logarithmicscale. As a general result, the SF is accumulated on the vertex of the NSs, thereby providinglarge field enhancements, about |E|2 ! 104. Incidentally, these values make nanostars suitablefor SERS applications [11, 13]. Essentially, such SF patterns results from the dipolar characteron the plane ! of the corresponding lowest-energy LSPR. In addition, SF enhancements at theLSPR grow for increasing number of tips from S1 to S6, in agreement also with the absorptioncross section in Fig. 1(b), that shows the same trend from S1 to S6; except for S2, which hasan absorption cross section and SF slightly larger than expected, presumably due to its 2-tipsymmetry along the polarization axis, specially suited to match the dipolar LSPR pattern. Inthis regard, the NS asymmetry on the plane " along the polarization axis reduces its quality asdipole-like resonant cavity.

3. Temperature profile of optically heated gold nanostars

From the point of view of the applicability for thermal therapy, such large absorption crosssections make Au NSs good candidates to be used as heat sources.

�����������������86' 5HFHLYHG����6HS�������UHYLVHG���'HF�������DFFHSWHG���'HF�������SXEOLVKHG����'HF�����(C) 2012 OSA 2 January 2012 / Vol. 20, No. 1 / OPTICS EXPRESS 623

Racio 9 Racio 11 Racio 15

imagem adaptada de Rodríguez-Oliveros et al., 2012.

2. Síntese de Nanoestrelas

400 500 600 700 800 900 1000" (nm)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

Abs

AuNSs (DMF)AuNSs (Etanol)AuNSs (Água)

395 400 405 410

0.235

0.24

0.245

0.25

Diâmetro (nm)

Con

tage

m

20 30 40 50 60 70 80

020

4060

80

Diâmetro médio50,25 ± 8,53 nm

Síntese de uma solução stock de 120 mL de AuNSs

Espetro de extinção de AuNSs antes e após as lavagens.

3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoestrelas

300 400 500 600 700 800 900 1000

� (nm)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Abs

pH 3pH 5pH 6,45 (neutro)pH 7pH 8pH 9pH 10

300 400 500 600 700 800 900 1000

� (nm)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

Abs

sem sal27 mM55 mM110 mM145 mM182 mM

Espectros de extinção de AuNSs após a variação do pH e da força iónica.

Espetro de extinção de AuNSs variando o pH numa gama entre 3 e 10.

Espetro de extinção de AuNSs variando a força iónica pela adição de NaCl.

3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoestrelasEstabilidade com NaCl

0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl

AuNS 3/4 nm NaBH4 seeds

Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!) mas  ainda  não  cheguei  a  nenhuma  conclusão…  podem  dar-me uma ajuda?

Estabilidade com NaCl

0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl

AuNS 3/4 nm NaBH4 seeds

Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!) mas  ainda  não  cheguei  a  nenhuma  conclusão…  podem  dar-me uma ajuda?

Estabilidade com NaCl

0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl

AuNS 3/4 nm NaBH4 seeds

Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!) mas  ainda  não  cheguei  a  nenhuma  conclusão…  podem  dar-me uma ajuda?

* Imagens T.E.M. cedidas gentilmente pela Mestre Leonor Soares

0 M 0,5 M 3 M

Imagens T.E.M.* de AuNSs após a adição de NaCl

4. Funcionalização de nanoestrelas

Permissas1. A reação de síntese de AuNSs é completa.

2. O ouro adicionado distribui-se igualmente por todas as partículas.

3. Crescimento esférico.

Determinação da concentração e área superficial das AuNSs

Esta equação prevê o raio final da partícula (esférica) após o seu crescimento.

4. Funcionalização de nanoestrelas

Funcionalização com CALNN e 11-MUA:• 6 moléculas / nm2

HS NH

HN

NH2

NH2O

O

NH

O

O

HN

O

OH

OH

OO

NH2

Cis Ala Leu Asn Asn

SH OH

O

CALNN 1 CALNN 2 MUA 1 MUA 2Potencial ζ inicial / mV - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0

Potencial ζ após / mV -33,03±24,9 -19,87±29,6 -9,00±10 -10,93±10,7

Potencial ζ (6dias) / mV -15,67 ±12,2 -21,97±21,8- -

Potencial ζ 10mL / mV -33,47 ±26,8 -29,13±30,4 - -

CALNN 11- MUA

4. Funcionalização de nanoestrelas

300 400 500 600 700 800 900 1000

� (nm)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Abs

AuNPs AuNPs + CALNN AuNPs + CALNN (pH 3,80)

300 400 500 600 700 800 900 1000

� (nm)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

Abs

AuNPsAuNPs + CALNNAuNPs + CALNN (pH 3,85)AuNPs + CALNN (após 6 dias)AuNPs + 11-MUA AuNPs + 11-MUA (pH 3,82)

Espect ro de ext inção de 1 ,5 mL AuNSs funcionalizadas antes e após a diminuição do pH.

Espectro de extinção de 10 mL de AuNSs funcionalizadas antes e após a diminuição do pH.

5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase

tirosinase de Agaricus bisporus (PDB - 2Y9W)• Massa atómica : 119500 Da• Raio: 3,25 nm• Diâmetro: 6,50 nm

195 enzimas por partícula

(1,6 ng / mL de AuNSs)

5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase

0 100 200 300 400 500 600

TYR (µL)

-25

-20

-15

-10

-5

0

Pote

ncia

l % (m

V)

20

40

60

80

100

Diâ

met

ro m

édio

(nm

)

Potencial %D.L.S.

Considerações Finais

• A centrifugação diferencial de seeds permite um maior controlo do tamanho e forma final de AuNSs e

uma maior reprodutibilidade;

• As AuNSs são estáveis numa gama de pH entre 3 e 10

• A diminuição do pH permite ter uma ideia se a funcionalização ocorreu;

• A AuNSs são passíveis de serem funcionalizadas.

• Verificar a funcionalização por técnicas mais sensíveis (XPS);

• Estudar a influência do NaCl na alteração das forma das AuNSs;

• Realizar estudos aprofundados sobre interação entre as AuNSs e a tirosinase:

‣ Alterar as concentrações do tampão;

‣ Alterar as concentrações de enzima.

Conclusões:

Perspetivas futuras: