Genética del paisaje y ecología de pastos subalpinos de Festuca eskia y F. gautieri en el Parque Nacional de Aigüestortes y Estany de Sant Maurici

Isabel MARQUES (1), David DRAPER (2), Benjamin KOMAC (3), José Gabriel SEGARRA-MORAGUES (4), Luis VILLAR (5), Elvira SAHUQUILLO (6), Ernesto PÉREZ-COLLAZOS (1), Juan VIRUEL (1), Pilar CATALÁN (1*) (1) Escuela Politécnica Superior de Huesca, Universidad de Zaragoza (Huesca, España) (isabel.ic@gmail.com; ernextop@unizar.es; viruel@unizar.es; *pcatalan@unizar.es) (2) Universidad Técnica Particular de Loja (Loja, Ecuador) (ddmunt@gmail.com) (3) CENMA - Institut d'Estudis Andorrans (Sant Julià de Lòria, Principat d’Andorra) (benjamin@komac.fr) (4) CIDE-CSIC Centro de Investigación sobre Desertificación (Moncada, Valencia, España) (J.Gabriel.Segarra@uv.es) (5) IPE-CSIC Instituto Pirenaico de Ecología (Jaca, España) (lvillar@ipe.csic.es) (6) Universidade da Coruña (Coruña, España) (elvira@udc.es) (*) corresponding autor

ABSTRACT Individuals of Festuca eskia (FE) and F. gautieri (FG) were sampled across the PNAESM and in other Iberian localities. Genetic studies were based on nuclear SSRs and plastid DNA sequences. The PNAESM populations showed intermediate genetic diversity values, higher Fis and lower Fst values than other Pyrenean and Cantabrian populations. Their plastid haplotypes were shared with those from other Pyrenean (FE) and eastern Iberian (FG) populations. Bayesian landscape-genetics analysis indicated the existence of a single genetic group for the common FE and 10 genetic groups for the less abundant FG, reflecting the large ocurrence of gene flow in a continuous landscape and the spatial isolation of restricted patches for one and the other species, respectively.

Keywords: DNA sequences, Festuca, hybridization, landscape genetics, SSR, subapine grasslands.

RESUMEN Individuos de Festuca eskia (FE) y F. gautieri (FG) fueron muestreados en el PNAESM y en otras localidades ibéricas. Los estudios genéticos se basaron en análisis de microsatélites nucleares y de secuencias de DNA plastídicas. Las poblaciones del PNAESM mostraron valores de diversidad genética intermedios e índices Fis mayores y Fst menores que los de otras poblaciones pirenaicas y cantábricas, compartiendo haplotipos cpDNA con los de otras poblaciones pirenaicas (FE) y del este peninsular (FG). Análisis bayesianos genético-paisajísticos indicaron la existencia de un único grupo genético en la más abundante FE y 10 grupos genéticos en la menos abundante FG, reflejando la amplia ocurrencia de flujo génico en un paisaje continuo frente al aislamiento espacial en fragmentos en una y otra especie, respectivamente.

Palabres clave: Festuca, genética del paisaje, hibridación, pastos subalpinos, secuencias de DNA, SSR.

INTRODUCCIÓN Los pastos subalpinos pirenaico-cantábricos así como otros ecosistemas de montaña se encuentran entre los biomas más frágiles del planeta debido a los cambios de uso del suelo y a los cambios ambientales y ecológicos que se están produciendo como consecuencia del calentamiento paulatino de la tierra (Parmesan & Yohe 2003; Parmesan 2006). Las especies herbáceas subalpinas y alpinas pirenaico-cantábricas se ven sometidas a efectos drásticos sobre su viabilidad (Gottfried et al. 2012; Pauli et al. 2012), aunando el problema de la imposibilidad de colonización de altitudes mayores. Aunque las consecuencias que acarrearían tales migraciones son aun imprevisibles, resulta imprescindible el conocimiento de los parámetros de diversidad genética y adaptación ecológica actual de las festucas espinosas subalpinas a sus hábitats ya que esos datos resultan fundamentales a la hora de poder establecer qué factores son los determinantes en el establecimiento y desarrollo óptimo de estas especies en su nicho ecológico actual (Gonzalo-Turpin et al. 2009a, b) y para poder predecir con garantías los posibles cambios que experimentarían ante diversos escenarios de cambio global. Las gramíneas modelo seleccionadas en este estudio corresponden a dos especies de Festuca dominantes en los pastos subalpinos pirenaico-cantábricos Festuca eskia Ramond ex DC y F. gautieri (Hackel) K. Richter, caracterizadas por presentar hojas plegadas con ápice punzante y glumas y lemas con amplio margen escarioso (Festuca subgen. Festuca sect. Eskia Willkomm) (Torrecilla et al. 2003). Festuca eskia es endémica de los Pirineos y de la Cordillera Cantábrica, y se distribuye preferentemente en comunidades instaladas sobre suelos acidófilos del piso subalpino (1700-3000m) donde, dada la abundancia de

la planta, ha dado nombre a la alianza donde se incluyen las comunidades a las que caracteriza (Festucion eskiae; Braun-Blanquet 1948), catalogada entre los hábitats de interés comunitario europeo (Directiva 92/43/CEE, de 21 de mayo de 1992, Anexo I). Su congénere F. gautieri, endémica de las montañas calcáreas de la mitad oriental de la Península Ibérica y de algunos macizos del norte peninsular; muestra un rango de distribución altitudinal mayor que abarca desde el piso montano superior hasta algo más del límite del subalpino (700-2700m) y forma comunidades extensas en suelos inestables o someros (Festucion scopariae; Braun-Blanquet 1948). Ambas especies presentan un enorme interés ecológico, la primera por constituir las mayores extensiones de pastos subalpinos y sustentar a una importante cadena trófica (invertebrados, ungulados silvestres y ganado) y la segunda por ser una especie pionera especializada en la colonización de suelos desnudos, contribuyendo a la fijación del sustrato y al establecimiento del pasto. Estas comunidades son las predominantes en los pastos subalpinos pirenaicos del Parque Nacionale de Aigüestortes - Estany de Sant Maurici (PNAESM) y de otras localidades pirenaicas e ibéricas. Estudios filogenéticos y biogeográficos del género Festuca han mostrado el estrecho parentesco de las especies hermanas F. eskia y F. gautieri, pertenecientes a uno de los linajes ancestrales de las festucas de hojas finas y sobrevivientes de las glaciaciones en los refugios del norte y oriente peninsular (Torrecilla et al. 2003; Catalán 2006; Inda et al. 2008). Estas plantas relícticas, mayoritariamente diploides, muestran asimismo una divergencia reciente, lo que apoya su ocasional capacidad de hibridación. El elevado mosaicismo de los pastos pirenaicos subalpinos de F. eskia y F. gautieri ha podido facilitar la formación de numerosas zonas

híbridas que hasta el momento han pasado desapercibidas.

El objetivo del proyecto de investigación 059_2009 (Ministerio de Medio Ambiente, O. A. Parques Nacionales) fue desarrollar estudios de genética y ecología del paisaje en

comunidades subalpinas de pastos de Festuca eskia, F. gautieri y sus híbridos en dos Parques Nacionales de los Pirineos y uno de la Cordillera Cantábrica (PNOMP, PNAESM, PNPE), con el fin de promover medidas de conservación de la

biodiversidad. Para ello se investigaron aspectos genético-paisajísticos y filogeográficos con el fin de interpretar la influencia de los procesos históricos y ecológicos en el

modelado genético del paisaje. En este estudio se presentan los resultados de parte de estos trabajos en el PNAESM.

MATERIAL Y MÉTODOS Muestreos de campo y toma de datos geoambientales y ecológicos Se muestrearon individuos de las tres especies en estudio (Festuca eskia (FE), F. gautieri (FG) y F. x picoeuropeana (FP) en el Parque Nacional de Aigüestortes i Estany de Saint Maurici (PNAESM), en otros Parques Nacionales del Pirineo, P. N. Ordesa y Monte Perdido (PNOMP), y de las montañas Cantábricas, P. N. Picos de Europa (PNPE), y en otras localidades del norte y del este ibérico. Se prospectaron todas las cuadrículas UTM de 1x1 km en las que se habían cartografiado o citado las especies, utilizándose los mapas SIG generados previamente. Se muestrearon entre 5 y 10 individuos por parcela y cuadrícula con el fin de cubrir de forma homogénea todas las áreas con presencia de estas especies en cada uno de los tres Parques. Para cada individuo muestreado se tomaron los datos de campo de sus coordenadas geográficas y de otros parámetros geoambientales (altitud, orientación, pendiente, sustrato litológico, pH edáfico) y ecológicos (porcentaje de cobertura vegetal, especies florísticas acompañantes). Festuca eskia es la especie más abundante en el PNAESM debido a la predominancia de los sustratos silíceos donde habita, por el contrario F. gautieri muestra una distribución más restringida debida a la escasez de los sustratos carbonatados donde normalmente crece, si bien también se

ha detectado su presencia sobre suelos graníticos. Hasta la fecha no se conocía la presencia de F. x picoeuropeana en el PNAESM. Los estudios genéticos indican la posible existencia de una población con individuos híbridos en el Parque. No obstante, debido a la escasa representatividad, no se han desarrollado posteriores análisis con ellos. Obtención de marcadores microsatélites SSR y de haplotipos plastídicos de las muestras Se elaboró una librería genómica de marcadores microsatélites nucleares SSR para F. gautieri. Se seleccionaron las 10 regiones que mostraban un éxito total de amplificación y de transferibilidad entre las tres especies y que detectaron mayores niveles de polimorfismo (Segarra-Moragues & Catalán 2011). Se analizaron un total de 1.732 individuos que generaron 17.320 genotipos SSR. Se obtuvieron secuencias de DNA de las regiones plastídicas trnT-L y trnL-F en representantes de las tres especies en estudio en sus respectivos rangos de distribución geográfica. Se generaron un total de 279 secuencias trnT-L y 263 secuencias trnL-F. La matriz concatenada trnT-F de secuencias comunes consistió en 226 secuencias x 1.588 posiciones. Esta matriz fue utilizada en análisis

evolutivos basados en máxima parsimonia (MP) y NJ y en análisis de redes haplotípicas mediante parsimonia estadística (TCS). Estudios de genética del paisaje Se procedió a la caracterización de los grupos y subgrupos genéticos bayesianos de cada especie (BAPS), basada en los patrones multilocus de marcadores SSR de sus individuos, y a

la proyección cartográfica de las unidades y subunidades genéticas detectadas (teselas Voronoi) en la cartografía SIG de cada Parque. Se estudiaron los grupos genéticos de cada especie en cada Parque. En el PNAESM se analizó la distribución de los grupos genéticos de F. eskia y F. gautieri.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Análisis genéticos de F. eskia, F. gautieri y F. x picoeuropeana por sus patrones genotípicos multilocus SSR Los análisis de diversidad genética poblacional (Tabla 1) mostraron diferencias significativas a nivel de especie, para distintos parámetros genéticos, entre los tres Parques. Festuca eskia presentó un mayor número promedio de alelos por locus (A) (p**) y mayores índices de heterozigosis observada (Ho) y diversidad genética dentro de población (Hs) en el PNOMP que en los otros Parques, mientras que el coeficiente de endogamia (Fis) fue mayor en el

PNAESM, y el índice de fijación (FST) más elevado en el PNPE. Estos resultados indican que pese a haber mayor diversidad genética en PNOMP (seguido del PNAESM), las poblaciones están más estructuradas en el PNPE. Festuca gautieri muestra un patrón similar, con valores de A y Hs mayores en PNOM y PNAESM que en PNPE, pero con valores FST más elevados en PNPE que en los parques pirenaicos. Festuca x picouropeana (no analizada en PNAESM) es asimismo más variable, para todos los parámetros en PNOMP, pero muestra una fuerte estructura en PNPE.

Tabla 1. Comparación de valores promedio de índices de polimorfismo entre grupos de poblaciones de Festuca eskia, Festuca gautieri, y el híbrido Festuca x picoeuropeana en los Parques Nacionales pirenaico-cantábricos

Festuca eskia1 Festuca x picoeuropeana

1 Festuca gautieri

1

Parque A HO2 HS

2 FIS FST A

1 HO

2 HS

2 FIS FST A

1 HO

2 HS

2 FIS FST

PNOMP 3.365 0.628 0.685 0.083 0.050 1.731 0.595 0.763 0.220 0.097 1.761 0.611 0.790 0.227 0.057

PNAESM 3.224 0.453 0.645 0.298 0.029 na na na na na 1.754 0.492 0.788 0.376 0.096

PNPE 2.826 0.475 0.581 0.183 0.226 1.449 0.461 0.403 -0.144 0.474 1.581 0.769 0.586 -0.313 0.088

p-value 0.001 0.019 0.017 0.062 0.004 0.001 0.188 0.001 0.004 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.951

1 Tamaños muestrales: F. eskia: PNOMP, N=19; PNAESM, N=11 ; PNPE, N=4. F. xpicoeuropeana: PNOMP, N=14; PNAESM, N=0; PNPE, N=26. F.

gautieri: PNOMP, N=33; PNAESM, N=6 ; PNPE, N=3 poblaciones. 2HO, HS, valores promedio de heterozigosidad observada y diversidad genética intrapoblacional, respectivamente.

Los valores significativos, basados en 1000 permutaciones se indican en negrita.

Los análisis de relaciones genotípicas entre poblaciones de las tres especies mediante proyecciones bidimensionales en el gráfico de coordenadas principales PCO basado

en distancias genéticas (DA, Nei et al. 1983) entre pares de poblaciones (Fig. 1) mostraron distintas relaciones de F. x picoeuropeana con respecto a sus dos potenciales especies progenitoras.

Las poblaciones de F. eskia y F. gautieri de los tres Parques se separaron en ambos extremos del eje 1 (25.76% varianza), indicando sus distintas composiciones genéticas. En una posición intermedia entre ambas se emplazaron todas las poblaciones de F. x picoeuropeana del PNOMP y parte de las del PNPE, que posiblemente correspondan a poblaciones híbridas recientes. La única población detectada de F. x picoeuropeana en el PNAESM muestra una relación de mayor afinidad con F.

gautieri. A lo largo del segundo eje (15.27% de la varianza) se separó del grupo de F. gautieri un segundo grupo de poblaciones de F. x picoeuropeana del PNPE más las poblaciones de F. gautieri de este mismo Parque. Este agrupamiento indica una distinta constitución genética de estas poblaciones de Picos, que podrían corresponder a un híbrido estabilizado o a una nueva microespecie.

Figura 1. Análisis de Coordenadas Principales basado en el índice de distancias genéticas DA (Nei et al. 1983), mostrando las relaciones entre poblaciones de Festuca eskia (N=53), Festuca gautieri (N=66) y el híbrido F. x picoeuropeana (N=53). Redes haplotípicas plastídicas: El análisis de redes haplotípicas mediante parsimonia estadística de la matriz combinada trnT-F detectó 42 haplotipos cloroplásticos. La red recobrada mostró la existencia de varios haplotipos compartidos entre F. eskia, F. gautieri y F. x picoeuropeana (2), entre las dos especies progenitoras (2), y entre el híbrido y F. gautieri (1) (Fig. 2A). El haplotipo más común, h. III (64 individuos), que presentó mayor probabilidad de ancestralidad, estaba compartido entre representantes de los tres taxones, seguido de los haplotipos h. XX (20 individuos), exclusivo de F.

gautieri, y h. IX (17 individuos), compartido entre F. eskia y F. gautieri. Además de la ausencia de estructura taxonómica cloroplástica en la red, indicativa de una alta tasa de hibridogénesis. La red haplotípica mostró una resolución ambigua en ciertas ramas (‘loops’), debido probablemente a unos niveles altos de homoplasía de los datos. La distribución de los haplotipos en la red mostró sin embargo una cierta estructura geográfica (Fig. 2B). Del haplotipo ancestral, distribuido en los Pirineos y Picos de Europa, se deriva

-0.34 -0.16 0.03 0.21 0.40

-0.29

-0.10

0.09

0.28

0.47

Axis 1 (25.76%)

Axis

2 (

15

.27

%)

F. eskia F. gautieri

F. x picoeuropeana PNPE

F. x picoeuropeana PNOMP

F. x picoeuropeana PNAESM

una ramificación principal y otras menores de haplotipos de F. gautieri distribuidos en los Pirineos centrales (PNOMP, PNAESM) y orientales (Girona, Andorra) y en el Prepirineo (Guara). Dos radiaciones satélites incluyen haplotipos distribuidos en los macizos central y occidental de Picos (PNPE). Otras ramificaciones establecen conexiones con haplotipos de F. eskia y F. gautieri distribuidos en el PNAESM y el Pirineo Oriental (Andorra), que a su vez muestran ramificaciones hacia haplotipos de F. eskia distribuidos en las montañas Cantábricas occidentales y centrales. Los haplotipos de F. gautieri distribuidos en los sistemas bético (La Sagra) e ibérico (Javalambre) son comunes o muestran afinidad por este último grupo de haplotipos de PNAESM, mientras que los

mayoritarios de F. x picoeuropeana de los macizos central y oriental de Picos, y un grupo del macizo occidental (PNPE), muestran conexiones con este grupo y otro grupo de haplotipos de F. eskia de PNAESM (Fig. 2B). El análisis de la red parece mostrar un patrón de divergencia general Oriental (Pirineos, Prepirineos) -Occidental (Picos de Europa, Cordillera Cantábrica) si bien los muy variables haplotipos del PNAESM aparecen distribuidos tanto en las agrupaciones del Este como en las del Oeste. Curiosamente, los haplotipos de F. gautieri del SE y CE ibérico son iguales o están próximos a haplotipos de F. gautieri y F. eskia de PNAESM y de los Pirineos Orientales.

A)

B)

Figura 2. Red de parsimonia estadística de 42 haplotipos plastídicos trnTF de F. eskia, F. gautieri y F. x picoeuropeana en su área de distribución ibérica. A) circunscripción taxonómica; B) rangos geográficos.

La mayor probabilidad de ancestralidad la mostró el haplotipo h.1 de los Pirineos centrales en la red de F. eskia, el h. XIX de PNAESM en la de F. gautieri, y el h. I de PNOMP y PNPE en la de F. x picoeuropeana (resultados no mostrados). En esta última red se observó una mayor distancia de haplotipos específicos de los macizos oriental y central de Picos, y una menor

de los del macizo occidental, con respecto a los de Ordesa, mientras que los haplotipos de PNAESM se hallaban más próximos a los Picos que a los de Ordesa. Estos resultados pueden deberse a los distintos orígenes híbridos y los distintos progenitores maternos que han podido tener las distintas poblaciones de F. x picoeuropeana.

Análisis filogenéticos: Se desarrollaron análisis filogenéticos con las secuencias trnT-F del total de los 226 individuos estudiados, que se resumieron en los 42 haplotipos distintos detectados en el grupo interno más tres haplotipos de grupos externos utilizados para enrraizar los árboles (Festuca ovina, F. rubra, Poa sp). En la Fig. 4 se muestra el árbol NJ. El grupo interno se resolvió monofilético, aunque con escaso apoyo BS; en consonancia con los resultados obtenidos del análisis de redes haplotípicas (Fig. 2), ninguna de las especies progenitoras resultó

monofilética (Fig. 4). Curiosamente, los linajes basales correspondieron a haplotipos de F. x picoeuropeana de los tres macizos de Picos y a haplotipos de F. eskia y de las tres especies de PNAESM (Fig. 4). Una divergencia posterior separó a dos linajes recientes de haplotipos mayoritarios de F. eskia de PNAESM y de F. gautieri de los Pirineos. El primer grupo incluía también haplotipos de F. eskia de la Cordillera Cantábrica y de los Pirineos Orientales (Andorra) y a haplotipos de F. gautieri de La Sagra y Javalambre.

Figura 4. Árbol NJ basado en el análisis de secuencias plastídicas trnT-F de F. eskia, F. gautieri y F. x picoeuropeana La estrecha relación de los plastomas de los individuos de F. gautieri del sur y este ibérico con respecto a los de F. eskia de los Pirineos centro-orientales y orientales ha quedado evidenciada tanto en los análisis de redes haplotípicas (Fig. 2) como en el árbol NJ (Fig. 4). El segundo grupo incluyó un subclado recientemente evolucionado de haplotipos de F. gautieri de los Pirineos y los Prepirineos (Guara), mientras que sus linajes más ancestrales correspondieron a haplotipos de F. gautieri de PNAESM y PNPE y de F. eskia de los Pirineos centrales, y los de

emplazamiento intermedio a los de F. x picoeuropeana de PNOMP y Picos occidentales y de las tres especies de Pirineos y Picos (Fig. 4). Estos resultados parecen evidenciar el reciente origen y subsecuente expansión de las poblaciones de F. gautieri en los Pirineos y Prepirineos, el posible origen reciente de los híbridos F. x picoeuropeana de los Pirineos, y una dispersión ancestral de plastomas de F. eskia y de ancestros de F. x picoeuropeana entre Pirineos y Picos.

Genética del paisaje en PNAESM Los muestreos de poblaciones de las tres especies de Festuca en el PNAESM se muestran en la Fig. 7. En Festuca eskia los resultados BAPS indicaron la existencia de un único grupo genético que englobaba a las 33 poblaciones analizadas de esta especie en este Parque (Fig. 8A). La teselación voronoi mostró su distribución en las diferentes áreas donde se muestreó la planta (Fig. 8B). Debido a la homogeneidad genética no se proyectaron las teselas en el mapa SIG. En Festuca gautieri los resultados BAPS mostraron la existencia de 10 grupos genéticos para las 19 poblaciones analizadas de esta especie en este Parque (Fig. 8C). La proyección de las teselas voronoi (Fig. 8D) en el mapa SIG (Fig. 8E) mostró la existencia de 2 grupos genéticos exclusivos del valle de Boí, de 3 en el valle de Espot y 1 en Capdella. En Festuca x picoeuropeana los resultados BAPS mostraron la existencia de 4 grupos genéticos para los 5 individuos analizados de esta especie en este Parque. Sin embargo el limitado

tamaño muestral hizo inviable la obtención del teselado voronoi, que no pudo ser proyectado en el mapa SIG. Los análisis genético-paisajísticos muestran distintos resultados para las dos especies principales analizadas. La más abundante F. eskia, pese a estar ampliamente distribuída en las distintas áreas de pastos subalpinos del PNAESM, muestra una elevada homogeneidad genética. Esta continuidad espacial explica la posible amplia ocurrencia de flujo génico en un paisaje continuo, donde no se han detectado barreras físicas que limiten dicho flujo. Esta carencia de estructura genética es la causante de que todas las poblaciones formen un único grupo genético. Por el contrario, la poco abundante F. gautieri presenta un alto número de grupos genéticos (10), de distribución espacial fragmentada y muy restringida. Esta elevada estructuración espacial puede ser debida al aislamiento ecológico de sustratos calizos o carbonatados entre valles o a tratarse de una zona de sutura para esta especie.

Figura 7. Mapa de los muestreos de poblaciones de F. eskia (verde) y F. gautieri (rojo) en el PNAESM.

a) b)

c) d)

e)

Figura 8. Resultados de los análisis de genética del paisaje de F. eskia (A, B) y F. gautieri (C, D, E) en el PNAESM basados en el análisis bayesiano de la estructura genética con BAPS, teselación de Voronoi y mapeo mediante SIG (de FG).

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