Gláucya de Figueiredo Mecca - USP€¦ · AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

“Efeito da composição polínica e qualidade proteica do alimento

larval na determinação de castas em Melipona scutellaris

(Hymenoptera: Apidae: Meliponini)”

Gláucya de Figueiredo Mecca

RIBEIRÃO PRETO - SP

2015

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENTOMOLOGIA

“Efeito da composição polínica e qualidade proteica do alimento

larval na determinação de castas em Melipona scutellaris

(Hymenoptera: Apidae: Meliponini)”

Gláucya de Figueiredo Mecca

Orientador: Prof. Dr. Fábio Santos do Nascimento

Co-orientador: Prof. Dr. Hipólito F. Paulino Neto

Versão Corrigida

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,

como parte das exigências para a obtenção do

título de Doutor em Ciências, Área: Entomologia.

RIBEIRÃO PRETO – SP

2015

AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR

QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE

ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Figueiredo-Mecca, Gláucya.

“Efeito da composição polínica e qualidade proteica do

alimento larval na determinação de castas em Melipona scutellaris

(Hymenoptera: Apidae: Meliponini).” Ribeirão Preto, 2015.

80 p.: 23 il. 30 cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - USP. Área de

concentração: Entomologia.

Orientador: Nascimento, Fábio Santos.

1. Abelha sem Ferrão. 2. Desenvolvimento larval. 3.

Alimento larval. 4. Pólen. 5. Casta.

Ao meu pai Braz.

Que me olhava com aqueles olhos azuis

cheios de ternura.

E que nos deixou tão cedo...

À minha avó Letícia.

Que me chamava de “flor de maracujá”.

E que está nos deixando aos pouquinhos...

Dedico

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Fabio Santos do Nascimento por aceitar o desafio desta orientação, mesmo

sabendo das limitações de tempo impostas pelas minhas atividades docentes.

Ao Prof. Dr Hipolito Paulino Netto pela co-orientação, sempre precisa e incentivadora

mesmo nos momentos mais difíceis.

Ao Prof. Dr. Lucas Matheus da Rocha por aceitar a parceria mesmo em prazo tão reduzido e

se dedicar intensamente às análises palinológicas.

Ao Dr. Sidnei Mateus, amigo e companheiro de trabalho, que não mediu esforços para que

tudo desse certo, pelas longas conversas, pelos conselhos e pelas fotos da capa.

Ao Sr. Edvaldo Biscaro que se dispôs a dirigir até a Bahia para buscar minhas abelhas com

todo o cuidado, e que se sensibilizou ao “tirá-las do paraíso”.

Aos colegas e parceiros de trabalho:

Katia Paula que me ensinou e me acompanhou na preparação das lâminas de palinologia

com toda sua disposição;

Ayrton Vollet que participou da modelagem dos bioensaios e dividiu comigo a

responsabilidade da “criação” das larvinhas, mesmo à distância; e

Tulio Nunes que providenciou as análises das glândulas.

À Bruna Leite Mecca e Jefferson Luiz da Silva que durante um estágio breve e produtivo, me

apresentaram o Prof. Lucas Matheus.

Ao Cristiano Menezes pelas dicas preciosas sobre os testes desenvolvimento.

À Denise Alves pelo empréstimo de colônias em momentos críticos.

À Aline Borba, companheira de sala, de “bandejão”, de eventos científicos e

confraternizações... Sempre disponível para acertar um gráfico, uma formatação... essas

coisas chatas de se fazer. E principalmente, pra rir comigo quando as coisas desandavam,

já que chorar não resolveria.

À Yara Roldão, pela ajuda com as colônias no início, por ter me oferecido a rainha na

divisão da colônia, pelas informações precisas e pelo socorro na reta final.

À todos os colegas do laboratório, que de alguma forma colaboraram com a realização

deste trabalho. Pela solidariedade nos momentos difíceis e pelas boas risadas nos

momentos de descontração. Aos “filhotes biológicos” que me adotaram e me contaminaram

com esse jeito jovem de ser, cheios de planos e de energia para realiza-los.

À todos os amigos, próximos ou distantes, que me acompanharam e me encorajaram nesta

jornada.

À Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras - Ribeirão Preto e ao

Programa de Pós Graduação em Entomologia, pela oportunidade.

À CAPES/PROAP pelo auxílio financeiro.

E especialmente à minha família

Ao meu marido Pedro. Pela compreensão e por apoiar minhas decisões.

Aos meus filhos:

Pedro Lucas, que desta vez ficou só na torcida; e

Fernando, pelas sugestões, críticas e help com o inglês.

Às norinhas Giselle e Monique pelo apoio e carinho.

Ao meu irmão Ed, que sempre me incentivou; e que formou uma linda família com a Dayane

e a Lina enquanto esta tese tomava forma.

À minha mãe Dalci, por tudo. Porque o tudo de uma mãe é imensurável...

À todos que se interessaram, incentivaram, curtiram, tentaram entender, entenderam, ou

não... poder contar com vocês (mesmo que a distância) fez toda a diferença.

Em meio a livros, artigos e textos; planilhas,

tabelas e gráficos; pipetas, frascos e reagentes... de

repente me vi pensando em minhas origens. Talvez eu

venha a ser a primeira doutora da família. E então

lembrei-me de meu avô, um agricultor de origem simples,

praticamente sem estudos, que sabiamente dizia:

“Vou deixar aos meus filhos uma coisa que

ninguém rouba e que o tempo não leva - um diploma”.

E assim se fez.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1- Colônia de M. scutellaris mantida no interior do laboratório. Conexão para

a área externa (A); abertura central para coleta de amostras (B)..............................14

Figura 2- Tubos de entrada (área externa) ...............................................................15

Figura 3- Parâmetros utilizados para determinação das condições internas da

colônia........................................................................................................................16

Figura 4- Favos de cria destruídos por operárias após manipulação (A e B)............20

Figura 5- Favo de cria com células abertas para coleta de alimento larval e larvas

(A- ovo; B- larva deitada; C- larva em pé)..................................................................28

Figura 6- Transferência de larvas para a Placa de Elisa (A). Larvas recém

transferidas (B)...........................................................................................................28

Figura 7- Placa de Elisa mantidas em Placa de Petri com água (A) e com solução

salina (B)....................................................................................................................29

Figura 8- Experimento com solução salina no 2º dia e alimento

desidratado.................................................................................................................30

Figura 9- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris entre colônias

ao longo dos meses...................................................................................................34

Figura 10- Variação do teor proteico do alimento larval entre as colônias de M.

scutellaris....................................................................................................................36

Figura 11- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris ao longo dos

meses.........................................................................................................................38

Figura 12- Relação entre o teor proteico do alimento larval e as condições das

colônia........................................................................................................................39

Figura 1- Alguns dos grãos de pólen encontrados nas amostras de alimento

larval...........................................................................................................................40

Figura 14- Ocorrência dos diferentes tipos polínicos nas amostras de alimento larval

ao longo do ano..........................................................................................................42

Figura 15- Relação entre o valor proteico dos tipos polínicos e sua ocorrência ao

longo dos meses (R2 = 0,0658)..................................................................................43

Figura 16- Comparação entre os valores proteicos do alimento larval (vermelho) e

dos valores proteicos dos tipos polínicos das espécies de plantas (verde)...............44

Figura 17- Correlação entre os valores proteicos do alimento larval e os valores

proteicos dos tipos polínicos das espécies vegetais..................................................45

Figura 18- Análise histoquímica de Glândula Salivar de Melipona scutellaris (imagem

em aumento de 400x).................................................................................................46

Figura 19- Análise histoquímica de Glândula Hipofaríngea de Melipona scutellaris

(imagem em aumento de 400x)..................................................................................47

Figura 20- Pupas de operárias e rainhas em desenvolvimento após 36 dias (as setas

indicam as rainhas). Teste 6, tratamento com 150µl de alimento com suplementação

proteica.......................................................................................................................48

Figura 21- Variação de sexo e castas entre os indivíduos sobreviventes em cada

tratamento..................................................................................................................53

Figura 22- Ocorrência de Rainhas nos diferentes testes ao longo dos meses..........55

Figura 23- Ocorrência de rainhas nos diferentes tratamentos. Indices de significância

entre os tratamentos controle e com suplementação proteica em diferentes volumes

de alimento.................................................................................................................56

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1- Colônias utilizadas a cada mês para coleta das amostras de alimento

larval no período de estudo (abril/2012 a março/2013)..............................................18

Tabela 2- Colônias utilizadas a cada mês para coleta de material para os testes de

desenvolvimento in vitro.............................................................................................26

Tabela 3- Média mensal e desvio padrão ( DP) do teor proteico do alimento larval

em porcentagem de peso seco nas colônias de Melipona scutellaris (Apidae,

Meliponini) estudadas.................................................................................................35

Tabela 4- Graus de significância da variação do teor proteico do alimento larval entre

as diferentes colônias.................................................................................................37

Tabela 5- Graus de significancia da variação do teor proteico entre os meses do

ano..............................................................................................................................38

Tabela 6- Resultados da regressão linear mostrando a relação entre o valor proteico

e a ocorrência dos tipos polínicos..............................................................................43

Tabela 7- Resultados obtidos nos diferentes tratamentos utilizados nos testes de

desenvolvimento in vitro.............................................................................................50

Tabela 8- Testes que apresentaram rainhas e suas respectivas porcentagens em

relação às operarias (*)..............................................................................................54

X

Resumo

Melipona scutellaris (Apidae: Meliponini) é uma espécie de abelha sem ferrão

popularmente conhecida como abelha Uruçu. Como outros meliponíneos, forma

colônias perenes e apresenta diferenciação de castas. É encontrada na zona litorânea

do Sul da Bahia ao Ceará, e em regiões do interior da Bahia e Pernambuco. Os ninhos

são construídos somente em troncos ocos de árvores e apresentam arquitetura

elaborada. As células de cria são verticais, arranjadas em favos horizontais formando

placas que se sobrepõe. Seus principais recursos alimentares são pólen e néctar. A

quantidade de alimento estocada nos potes está relacionada com a manutenção e

produção de operárias, rainhas virgens e machos. Por não apresentar células de cria

diferenciadas para o desenvolvimento de rainhas e operárias, não é possível

estabelecer seguramente os fatores responsáveis pela determinação das castas neste

grupo de abelhas. Estudos indicam que mecanismos genéticos e tróficos, incluindo a

qualidade do alimento larval, somados a fatores ambientais interferem na produção

de rainhas. Este estudo avaliou a variação do teor proteico e composição polínica do

alimento larval ao longo de um ano. Os resultados mostraram que o valor proteico do

alimento larval variou de forma equivalente para todas as colônias em todos os meses,

com elevação significativa no mês de julho. O valor proteico do alimento larval não

apresentou correlação com o valor proteico dos tipos polínicos. O valor proteico dos

tipos polínicos não apresentou relação significativa com sua ocorrência no alimento

larval, o que indica hábitos generalistas para a coleta de recursos alimentares. Através

de bioensaios, foi testada a interferência do volume e da suplementação proteica do

alimento larval na determinação de rainhas, cujos resultados demonstraram uma

ocorrência de rainhas significativamente maior nos tratamentos com suplementação

proteica. Conclui-se que embora os tipos polínicos não influenciem diretamente o teor

proteico do alimento larval, os resultados encontrados sugerem que a alteração do

valor proteico do alimento larval depositado nas células seja um fator importante na

determinação de castas nesta espécie.

Abstract

Melipona scutellaris (Apidae: Meliponini) is an indigenous stingless bee species. Like

other Meliponine, colonies are perennial and have female caste differentiation. This

species is found from the cost area of Bahia to Ceará states. The nests are built only

in hollow trees and have an elaborate architecture. The brood cells are vertical,

arranged in horizontal overlapping combs. Pollen and honey are the main food source.

The quantity of food stored in the pots is associated with the maintenance and

production of workers, queens and males. Since there are no differences between the

cells that queens and workers are reared, the factors responsible for caste

determination are still unknown. Studies suggest that both genetic and trophic

mechanisms, including the larval food quality, combined with environmental factors,

interfere in the production of queens. This study evaluated the variation protein content

and the pollinic composition of larval food among colonies of M. scutellaris across a

year. The results showed that the protein content of the larval food varied equivalently

for all the colonies at all months, but presenting an elevation on the protein content in

July. The protein content in the larval food had no correlation with the pollen types. The

protein content of the pollen types showed no significant relation with the pollen types

occurring in the larval food, indicating that the species M. scutellaris presents

generalist habits for food gathering. The interference of volume and protein

supplementation of larval food on queen rearing determination was tested via

bioassays, which results showed a significantly higher occurrence of queens in the

treatments with protein supplementation. We concluded that although the pollen types

did not influence directly the protein content of the larval food, the results obtained

suggest that the variation of protein content of the larval food deposited in the cells

may be an important factor in caste determination in this species.

SUMÁRIO

Introdução geral...........................................................................................................1

Meliponíneos: Apresentação e distribuição geográfica.....................................2

Melipona scutellaris...........................................................................................4

Forrageamento, Estoque de Alimento e Produtividade da Colônia...................4

Castas................................................................................................................7

Justificativa......................................................................................................12

Objetivos..........................................................................................................12

Materiais e métodos...................................................................................................13

1. Determinação dos fatores internos que regulam a produtividade das

colônias...........................................................................................................15

2. Coleta do alimento larval e acompanhamento dos favos de cria................17

3. Teor Proteico do Alimento...........................................................................20

4. Análise Polínica...........................................................................................21

4.1. Valor proteico dos tipos polínicos..................................................22

5. Análise Histoquímica de Glândulas Salivares e Hipofaríngeas...................22

6. Teste de Desenvolvimento in vitro...............................................................23

6.1. Coleta do alimento larval e montagem do experimento.................25

7. Análises estatísticas ...................................................................................30

Resultados..................................................................................................................32

1. Teor proteico do alimento larval..................................................................33


3. Análise das glândulas salivares e hipofaringeas.........................................45

4. Teste de desenvolvimento in vitro...............................................................47

Discussão...................................................................................................................57

1. Teor proteico do alimento larval..................................................................58


3. Teste de desenvolvimento in vitro...............................................................62

Conclusões.................................................................................................................67

Referências bibliográficas..........................................................................................70

Introdução

2 Introdução

Meliponíneos: Apresentação e distribuição geográfica.

Segundo Michener (2000), as diversas famílias de abelhas estão agrupadas na

superfamília Apoidea, entre as quais encontra-se a Família Apidae, que está

geograficamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais. Nas regiões tropicais,

a Família Apidae representa o grupo de abelhas mais abundante, onde apresenta

grande diversidade. Estão presentes também na Austrália, Ásia tropical e África, em

menor número em Madagascar e de maneira dispersa nas Antilhas. Formam o grupo

de abelhas mais comum da América Tropical, e provavelmente o principal polinizador

das espécies vegetais dessa região (Wille & Michener 1973). Segundo Roubik (1989)

principalmente as espécies de ocorrência tropical são na sua maioria sociais, e

provavelmente evoluíram como parte integrante deste ecossistema, de tal forma que

sua alta representatividade torna-se uma regra.

A Família Apidae subdivide-se em várias subfamílias. Destas, a subfamília

Apinae compreende diversas tribos, entre elas a Tribo Euglossini, Tribo Bombini, Tribo

Apini e Tribo Meliponini, da qual a espécie em estudo faz parte (Michener 2000).

As abelhas pertencentes à tribo Meliponini (ou grupo dos Meliponíneos), são

popularmente conhecidas como abelhas indígenas ou abelhas sem ferrão, por terem

um ferrão atrofiado e nunca poderem usá-lo como arma de defesa. Entretanto o termo

“abelha sem ferrão” foi consagrado internacionalmente como por exemplo “stingless

bees” e “stachellose Bienen” (Nogueira-Neto 1970).

Os meliponíneos são eussociais, formam colônias perenes, com população que

pode variar de poucas dúzias a 100.000 operárias ou mais. Apresentam diferenciação

de castas com indivíduos comportamental e morfologicamente distintos. A rainha é

incapaz de sobreviver sozinha principalmente por não forragear, assim como as

operárias não são capazes de manter uma colônia sem rainha, por não produzirem

3 Introdução

fêmeas férteis. Possuem sistemas eficientes de comunicação, armazenamento de

alimento e termorregulação (Sakagami 1982; Michener 2000; 2007).

Os ninhos de meliponíneos apresentam arquitetura elaborada. Geralmente

ocupam cavidades pré-existentes encontradas pelas abelhas, que variam desde

pequenas tocas de besouros abandonadas a grandes cavidades em troncos de

árvores ou cavidades no solo (Michener 2000). O material utilizado na construção é

principalmente o cerume, uma mistura de cera e própolis, e nas espécies do gênero

Melipona ocorre o batume, uma mistura de barro e própolis (também denominada por

Nogueira-Neto 1997, de geoprópolis), como é o caso de Melipona scutellaris. A

entrada do ninho pode ser constituída por um orifício situado no centro de raias de

barro ou geoprópolis ou apresentar-se sob a forma de um tubo de cera, que

normalmente se projeta tanto para o exterior como para o interior, e em geral

desemboca próximo às células de cria (Nogueira-Neto 1970). O alimento, pólen e mel,

é armazenado em potes ovalados construídos de cerume, agrupados nas laterais do

ninho. As células de cria são verticais, com abertura na parte superior que é

operculada após a oviposição. Essas células ou alvéolos, como também podem ser

chamadas, são na maioria das espécies, arranjadas em favos horizontais formando

placas que se sobrepõem, apoiadas por pilastras de cerume, permitindo a passagem

de abelhas por entre as placas. Os favos de cria são frequentemente envolvidos por

lamelas de cerume que formam o invólucro. Algumas espécies, entretanto,

apresentam células de cria isoladas em forma de cachos. (Nogueira-Neto 1970;

Michener 1974; Kerr et al. 1996). A calefação da colônia é feita com cerume,

frequentemente muito rico em própolis (Nogueira-Neto 1970).

4 Introdução

Melipona scutellaris

Segundo Nogueira-Neto (1970), esta espécie é encontrada na zona litorânea

do Sul da Bahia ao Ceará, porém há referências de sua ocorrência em localidades no

interior da Bahia e Pernambuco (Moure & Kerr 1950 apud Nogueira-Neto 1970) e

estudos demonstram que a espécie habita a região úmida do Nordeste (Lamartine

1962 apud Nogueira-Neto 1970). A espécie Melipona scutellaris é popularmente

conhecida como Abelha Uruçu, porém como esta denominação refere-se também à

outras espécies, pode ser identificada como “Uruçu do Litoral Baiano e Nordestino”

(Nogueira-Neto 1970), ou simplesmente Uruçu do Nordeste (Kerr et al. 1996).

Na natureza esta espécie nidifica somente em ocos de troncos de árvores, e

apresenta a entrada do ninho típica, localizada no centro de raias convergentes de

barro, guardada por uma única sentinela. Segundo Lindauer e Kerr (1960) a

população de uma colônia de M. scutellaris compreende aproximadamente 400 a 600

abelhas.

Forrageamento, Estoque de Alimento e Produtividade da Colônia

Devido à grande quantidade de materiais envolvidos nas coletas, raramente se

conhece as características estruturais e bioquímicas dos produtos utilizados pelas

abelhas, além do que, sabe-se muito pouco sobre os mecanismos que atuam na

escolha. A composição, qualidade e facilidade de coleta podem variar entre os tipos

de pólen utilizados pelas abelhas. Alguns contém menor quantidade de proteína, mas

por outro lado, menor teor de água, o que não exigiria um forrageamento tão intensivo

(Roubik 1989). Para Imperatriz-Fonseca et al. (1985), em algumas espécies, a

5 Introdução

atividade de forrageamento pode depender, principalmente, da viabilidade floral,

porém conjugada a outros fatores abióticos.

As abelhas forrageiras coletam produtos variados para a construção e defesa

do ninho, para a manutenção de seu metabolismo e alimentação das larvas. Esses

recursos englobam produtos vegetais como resinas, madeira apodrecida, sementes,

folhas, tricomas, fragrâncias, pólen, néctar, esporos, ceras, entre outros. Alguns

produtos animais também são coletados por algumas espécies, como: fezes, carniça,

urina e pelos. Entretanto, o pólen e o néctar são os principais materiais coletados e

utilizados para a alimentação das abelhas (Roubik 1989).

Experimentos realizados por Castilho-Hyodo (2001) mostraram uma ampla

variedade de concentração de proteína no alimento larval para praticamente todas as

colônias em estudo, e em todas as estações do ano, supostamente relacionada à

disponibilidade de pólen, ou a qualidade proteica do pólen como recurso disponível

em cada estação do ano.

Em Melipona beecheii, Moo-Valle e colaboradores (2001) constataram que a

quantidade de reservas de alimento das colônias tem uma forte influência na produção

de indivíduos reprodutivos, visto que colônias privadas de alimento produzem uma

pequena quantidade de rainhas virgens, e uma proporção reduzida de machos, que

pode apresentar uma queda de 23,4% nas colônias bem alimentadas para 0,7% nas

colônias com restrição alimentar. Morais e colaboradores (2006) verificaram em

Melipona compressipes fasciculata que a produção de machos ocorre somente em

colônias fortes, nas quais houve também um aumento na produção de rainhas em

relação às colônias fracas. Segundo Oster & Wilson (1978) esta redução na produção

de sexuados dá condições à colônias fracas de gastar seus recursos alimentares

6 Introdução

primeiramente para produzir operárias que cumpram tarefas diretamente ligadas à

sobrevivência da colônia.

Interessantemente, há uma estratégia que implica na habilidade que as

colônias têm de modular a produção de machos em relação à quantidade de estoque

de alimento acumulado. Deve haver uma ligação entre as condições de reservas de

alimentos e as condições comportamentais e/ou fisiológicas individuais na produção

de machos. Esta ligação pode prover tanto um feedback estimulador quando as

reservas alimentares são grandes, quanto um feedback inibidor as reservas de

alimento são pequenas (Moo-Valle et al. 2001).

Segundo Bego (1977), a produção de machos em Scaptotrigona aff.

depilis (citada como Nanotrigona postica) também está mais diretamente ligada às

condições internas da colônia (quantidade de alimento e população) do que à variação

dos fatores climáticos, apesar de vários autores terem estabelecido épocas

determinadas para a produção de machos em Meliponíneos. Embora as chuvas e

altas temperaturas sejam fatores extrínsecos importantes para determinar as floradas,

não estão diretamente relacionados à alta produtividade das colônias, inclusive de

machos. Segundo o estudo, a idade fisiológica e cronológica da rainha não influencia

na produção de machos, entretanto tanto a rainha como as operárias controlam sua

produção através da ingestão de ovos funcionais. As questões relacionadas à razão

sexual de indivíduos reprodutivos em insetos sociais são bem difíceis de serem

estimadas devido aos vários fatores que interagem e controlam toda a população da

colônia; é possível que, em colônias de insetos sociais, as frequências de fêmeas e

machos variem em ciclos anuais distintos. A produção de rainhas em S. depilis ocorre

durante o ano todo, não ocorrendo somente em colônias muito fracas. Quando

aumenta o crescimento dos favos, as células reais também tendem a aumentar,

7 Introdução

existindo uma correspondência entre a produção de machos uma maior produção de

rainhas. As rainhas virgens são comumente observadas andando pela colônia, até

que seu corpo seja coberto por cerume e ela provavelmente morra por inanição.

Quando ocorre o processo de substituição da rainha, pode-se sugerir que deva existir

uma falta de atratividade por parte da rainha velha, que induz as operárias a matá-la

ao surgir uma nova rainha atrativa, como já foi levantado por outros autores.

Para Bego (1998), a compreensão dos mecanismos reprodutivos nos

meliponíneos, principalmente no que diz respeito à produção de machos, requer

estudos mais aprofundados, necessitando de observações realizadas a longo prazo,

correlacionando-se diversos parâmetros como: sazonalidade, produção da cria,

estoque de alimento, estado fisiológico da rainha, além de observações do

comportamento das operárias e rainha nas colônias.

Por oferecerem uma boa indicação do estado da colônia, o estoque de alimento,

a quantidade e o tamanho dos favos de cria e o número de células em construção,

são critérios utilizados por diversos autores para determinar os padrões das colônias

em seus estudos, como Bego (1977, 1982 e 1990) em Scaptotrigona depilis, Hilário

et al. (2000) em Melipona bicolor, Paxton et al. (2003) em S. depilis, Pereira (2003)

em Melipona scutellaris, Morais et al. (2006) em Melipona compressipes e Figueiredo-

Mecca et al. (2013) em S. depilis.

Castas

Durante décadas uma série de trabalhos tem sido realizados com o objetivo de

elucidar as várias questões que envolvem a determinação de castas nas diferentes

espécies de abelhas.

8 Introdução

A primeira sugestão de que as castas (operárias e rainhas), nas espécies do

gênero Melipona seriam predeterminadas geneticamente, foi feita por Ihering (1903)

apud Kerr (1948). O autor não admitia que condições externas determinassem o sexo

e a casta dos indivíduos, pois logo após a postura a célula era fechada, portanto a

evolução da larva já estaria determinada, assim como não aceitava a suposição de

que dependeria da quantidade de alimento, tendo em vista que rainhas e operárias

recebiam quantidades iguais de alimento por não haver células diferenciadas para

uma ou outra.

Segundo Campos (1979) em Apis as larvas que originam rainhas ou operárias

são geneticamente iguais, porém a quantidade e a qualidade do alimento oferecido

influenciam na sua diferenciação. As larvas que originam rainhas recebem maior

quantidade de alimento, este em forma de geleia real, enquanto as que originam

operárias recebem uma mistura de mel e própolis, e em menor quantidade em relação

às que originarão rainhas. Nos “Trigonini”, as larvas que se diferenciam em rainhas

ou operárias seriam geneticamente iguais, porém as larvas de rainha se desenvolvem

em uma célula de tamanho maior e recebem uma quantidade maior de alimento que

as larvas de operária, o que sugere ser este o mecanismo de diferenciação de castas

neste gênero, já que aparentemente o alimento é o mesmo. Em Melipona a

diferenciação seguiria um mecanismo genético alimentar através do qual as larvas

geneticamente pré-dispostas a se desenvolverem em rainhas devem receber alimento

em quantidade suficiente para tal.

Observando alguns registros comportamentais do processo de

aprovisionamento e oviposição (POP) em espécies de abelha sem ferrão, nota-se que

o fato das células produtoras de rainhas virgens receberem menos descargas de

alimento larval do que as células produtoras de operárias pode indicar que elas

9 Introdução

receberam mais alimento (Van Veen 2000). Este fato pode ser explicado, pois a

quantidade de alimento depositado nas células é inversamente relacionada com o

número de operárias que realizam a deposição (Kerr et al. 1966).

O processo de aprovisionamento e oviposição (POP) e cuidado com a cria

ocorrem de formas diferentes nos diferentes grupos de abelhas sociais. Em Apis a

oviposição ocorre em uma célula vazia e cerca de três dias após a oviposição as larvas

começam a ser alimentadas de maneira progressiva, por cerca de cinco dias, quando

então a célula é fechada. Nos Meliponíneos ocorre o provisionamento em massa, ou

seja, a postura é realizada pela rainha em uma célula já preenchida com alimento

larval, que logo em seguida é operculada (Sakagami 1982).

Durante a existência de uma colônia de abelhas sociais, a rainha pode morrer

ou ser morta. Em caso de orfandade, a colônia só sobreviverá se a rainha for

substituída. A ausência da rainha ou sua senilidade pode ser percebida pelas

operárias devido a diminuição de seus feromônios ou de outros sinais relacionados à

sua presença (Michener, 1974). Nunes e colaboradores (2014) demonstraram que

hidrocarbonetos cuticulares específicos são responsáveis pela manutenção das

funções biológicas da rainha em uma colônia, uma vez que esses compostos causam

um acionamento neuronal sobre as operárias e exercem controle fisiológico e

comportamental sobre estes indivíduos. Oi e colaboradores (2015) mostraram que

hidrocarbonetos cuticulares são os principais compostos químicos responsáveis pela

sinalização reprodutiva da rainha em uma colônia. Esses compostos podem sinalizar

a presença de uma rainha produtiva e, desta forma, inibir a reprodução de ovos

haploides destinados a produzir machos em abelhas, formigas e vespas. Segundo

Michener (1974) em Apis a orfandade funciona como sinalização para a produção de

10 Introdução

uma nova rainha e sua substituição, já em Melipona as rainhas são produzidas

continuamente.

Estudos demonstram que existem três processos pelos quais larvas de abelhas

podem se desenvolver em rainhas (Michener, 1974; Sakagami,1982):

1- Determinação trófica através da qualidade de alimento;

2- Determinação trófica através da quantidade de alimento;

3- Determinação trofo-genética;

Para Velthuis & Sommeijer (1991) a variação na concentração de proteínas do

alimento larval pode estar relacionada ao desenvolvimento das glândulas

hipofaringeanas das operárias ou ao conteúdo proteico dos grãos de pólen ingeridos

que influenciaria na composição do alimento regurgitado nas células de cria.

A análise da secreção das glândulas salivares de algumas espécies de abelhas

sociais mostrou a presença de proteínas, lipídeos e polissacarídeos em quantidades

variáveis, dependendo da idade do indivíduo e do tipo de glândula, predominando

lipídeos nas glândulas salivares da cabeça e proteínas no tórax (Cruz-Landim 1968;

Cavasin-Oliveira 1995; Meirelles et al. 2001, Moraes 2002).

Estudo realizado por Morais et al. (2006) em Melipona compressipes sugere

que a proporção na produção de indivíduos de diferentes castas é afetada

primeiramente pelas condições internas da colônia, seguida pela disponibilidade dos

recursos alimentares. Verificou-se que rainhas virgens foram produzidas ao longo de

todo o ano, independente da idade da rainha fisogástrica, corroborando outros

trabalhos (Kerr 1948; Darchen & Delage-Darchen 1975; Moo-Valle et al. 2001;

Sommeijer et al. 2003; Wenseleers et al. 2004).

Após muita investigação e debate, ainda não se determinou o mecanismo que

dispara o desenvolvimento de rainhas em Melipona. Em M. beecheii, Jarau et al.

11 Introdução

(2010) identificaram a presença de geraniol como principal componente da secreção

das glândulas labiais das operárias (nurses), como um fator exógeno na determinação

de castas. Segundo os autores, o destino das castas em Melipona é definido tanto

geneticamente, como por um fator associado ao alimento larval. Larvas de fêmeas

geneticamente predispostas a se tornarem rainhas, somente seguirão este padrão de

desenvolvimento se receberem quantidades suficientes de um determinado

composto, que no caso desta espécie, seria o geraniol. O geraniol foi a primeira

substância do alimento larval identificada como um sinal químico exógeno para o

desenvolvimento de rainhas, portanto mais estudos são necessários para melhorar o

conhecimento sobre o assunto.

Para Van Veen (2000) a importância dos fatores alimentares e dos fatores

genéticos na determinação das castas pode ser compreendida se forem levados em

consideração os fatores ambientais e os aspectos reprodutivos da colônia. Somente

sob condições alimentares favoráveis ocorre a expressão gênica, resultando na

produção de rainhas virgens, condições estas relacionadas com o período de floração,

proporcionando maiores possibilidades de forrageamento.

12 Introdução

Justificativa

O presente trabalho teve como finalidade analisar a composição proteica do

alimento larval como fator do processo de determinação de castas em Melipona

scutellaris. Além disso, verificamos a necessidade de um estudo mais aprofundado

sobre as questões que envolvem fatores ecológicos como a variabilidade polínica

disponibilizada no ambiente. Desta forma, um estudo sobre a variação sazonal, as

condições intrínsecas das colônias (fatores internos) e a qualidade nutricional do

alimento larval fornece informações importantes sobre essa questão que vem sendo

discutida há quase um século.

Objetivo

Verificar se a produção de rainhas é afetada pela variabilidade do alimento

depositado nas células de cria de Melipona scutellaris; tal variabilidade é impingida

pela proporção relativa de proteína, sua relação com os tipos polínicos encontrados

neste alimento, sazonalidade e sua influência na produção de rainhas. Além disso,

neste estudo foi testada se a suplementação experimental das proporções proteicas

incrementa a produção de rainhas.

Materiais e

Métodos

14 Materiais e Métodos

O estudo foi realizado no Laboratório de Comportamento e Ecologia de

Insetos Sociais, Campus de Ribeirão Preto, FFCLRP, Universidade de São Paulo –

USP.

Foram utilizadas 23 colônias da espécie Melipona scutellaris, mantidas em

laboratório, em caixas de madeira específicas para criação racional de abelhas

indígenas (figura 1), com abertura para o exterior (figura 2) permitindo o trânsito das

operárias forrageadoras.

Para a análise proteica e polínica do alimento larval, foram utilizadas inicialmente

cinco colônias, denominadas B, C, D, E e F. Este número não se manteve constante

devido ao enfraquecimento ou a perda de algumas dessas colônias e,

posteriormente, sua consequente substituição. No decorrer do período de trabalho

foram utilizadas ainda as colônias denominadas: G, H, I, J, K, L e M para a coleta de

alimento larval para análise.

Figura 1- Colônia de M. scutellaris mantida no interior do laboratório com conexão para a

área externa (A) e abertura central para coleta de amostras (B).

A

B

B


Figura 2- Tubos de entrada (área externa).

1- Determinação dos fatores internos que regulam a

produtividade das colônias.

A produtividade e as condições internas das colônias foram determinadas

através de censo mensal, durante todo o período de pesquisa.

As estruturas apontadas na figura 3 a seguir, foram utilizadas como

parâmetros, para esta avaliação.

1 - número de potes de pólen;

2 - número de potes de mel;

3 - número de células em construção;

4 - número de favos de cria;

5 - diâmetro do favo de cria.

A B


Figura 3- Parâmetros utilizados para determinação das condições internas da colônia.

O censo mensal foi realizado durante o momento da abertura das colônias

para a coleta das amostras do alimento larval, tomando-se o cuidado em minimizar

as interferências que pudessem afetar ou interromper qualquer comportamento

dentro da população colonial. Pelos parâmetros analisados, pôde-se acompanhar as

condições em que as colônias se apresentavam durante o período de estudo.

Aquelas que apresentaram enfraquecimento, ausência ou irregularidade na postura,

ou outras anormalidades tiveram a coleta de amostras suspensa até que voltassem

às condições normais.

1 2

3

4

5


2- Coleta do alimento larval e acompanhamento dos favos de cria

As amostras foram coletadas de abril de 2012 a março de 2013. Ao final do

período foram utilizadas um total de 12 colônias, porém não concomitantemente,

como mostra a tabela 1 a seguir.

Foram coletadas mensalmente 10 amostras de alimento larval de cada

colônia, durante um período de doze meses, procurando manter um mínimo de três

colônias ao mês. A coleta mensal das amostras foi evitada nas colônias que

apresentavam condições fracas, porém o número de amostras coletadas em cada

colônia utilizada se manteve constante. Com o cuidado de não coletar amostras em

colônias órfãs, as coletas foram realizadas em colônias cujas rainhas estivessem

presentes, com única exceção ocorrida no mês de maio. Entretanto, embora a

rainha da colônia B não tenha sido visualizada, a colônia não aparentava estar órfã e

os resultados das análises proteicas não apresentaram valores discrepantes dos

demais. Inicialmente foram utilizadas cinco colônias, porém algumas colônias

enfraqueceram ou mesmo morreram, levando à necessidade de utilizar novas

colônias, como descrito anteriormente e apresentado na tabela 1.


Tabela 1- Colônias utilizadas a cada mês para coleta das amostras de alimento larval no período de estudo (abril/2012 a março/2013).

Colônia/Mês Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar

B X X X X X X X X X X - -

C X X X X - - - - - - - -

D X X - X X - - - - - - -

E X X - X - - - - - - - -

F X X X X X - X - - - - X

G X X X - X -

H X - - -

I X X - -

J X - -

K X -

L X X

M X


As colônias foram abertas uma por vez, o invólucro retirado deixando o favo

de cria mais novo exposto e as operárias de cria (de preferência envolvidas no

aprovisionamento das células) foram coletadas. Assim que a agitação das abelhas

diminuía, as amostras de alimento larval foram coletadas. Dez células de cria da

borda do favo (recém operculadas) foram escolhidas, desoperculadas, os ovos

foram removidos e o alimento larval coletado com micropipeta calibrada para 140µl

para garantir que todo o alimento larval fosse coletado, considerando um o volume

médio de aproximadamente 120µl por célula de cria. As amostras de alimento larval

foram mantidas em geladeira até o término da coleta diária, quando cada uma delas

foi homogeneizada em vórtex. Em seguida foram retirados de cada amostra:

- 20µl depositado em eppendorf, levados à estufa para desidratação e

posterior análise proteica – Bradford.

- 20µl em Tubo Falcon, à qual foram adicionando 3ml de álcool 70% para

posterior análise polínica.

O restante da amostra foi congelada em freezer comum à temperatura

aproximada de -20oC para possíveis necessidades ou utilização futura.

No início dos estudos, para a realização da coleta do alimento larval, o favo

foi retirado com cuidado, colocado em placa de Petri e a amostra coletada fora da

colônia. A seguir o favo (com a placa) foi recolocado na colônia e acompanhado até

que se pudesse identificar os indivíduos (operárias, rainhas e machos) o que é

possível na fase de “pupa de olho preto”. Após cerca de 26 a 30 dias pôde-se iniciar

a verificação dos favos. Entretanto, como este período pode variar, os favos foram

colocados na estufa para garantir que não ocorresse a emergência das abelhas até

que fosse possível a verificação do número de operárias e rainhas.

O acompanhamento dos favos de cria foi realizado somente durante os


meses de abril a agosto, pois estes favos foram frequentemente destruídos pelas

próprias operárias figura 4, causando o enfraquecimento ainda maior das colônias.

Portanto, para reduzir os danos e obter os resultados, as amostras de alimento larval

para a análise passaram a ser retiradas diretamente dos favos, no interior da

colônia.

Figura 4- Favos de cria destruídos por operárias após manipulação (A e B).

3- Teor Proteico do Alimento

A quantificação proteica do alimento depositado nas células de cria foi

realizada de acordo com protocolo baseado no método de ligação de corante de

Bradford proposto por Paulino-Neto et al. (submetido).

A amostra destinada para análise proteica foi desidratada em estufa a 40ºC

por pelo menos 8 a 10 dias para secagem e análise subsequente. Algumas

amostras foram mantidas em estufa por períodos maiores, até que estivessem em

condições de desidratação consideradas adequadas para a realização da pesagem.

A B


Para a análise proteica foi pesado 0,001g de cada amostra de alimento seco

que é moído no próprio eppendorf utilizando um bastão de vidro. Posteriormente, foi

adicionado quantidade semelhante de alumínio em pó para facilitar a pulverização

do alimento e 50µl de NaOH a 0,1 mol/L para umidificar. Após macerada, cada

amostra de pólen é recuperada em 200µl de NaOH a 0,1 mol/L e mantida em

refrigerador por pelo menos 24h para a quebra da parede do pólen e liberação da

proteína. Posteriormente, cada amostra foi fervida em banho-maria por 5 min e

centrifugada a 10.000 rpm por outros 5 minutos à temperatura de 5°C. 30µl do

sobrenadante foi retirado e colocado em eppendorf. A esta solução foi adicionado

0,5ml de solução de Bradford. Foram pipetados em Placa de Elisa a albumina para a

curva padrão e 200µl de cada amostra, em duplicata e lidas em espectrofotômetro

para quantificação da proteína.

Para a construção da curva padrão foi utilizada albumina sérica bovina (BSA).

A quantificação das amostras foi realizada por leitura utilizando comprimento de

onda de 595 nm em espectrofotômetro Beckman® Coulter DXT-880-multimode

detector. Os teores proteicos foram calculados em porcentagem de peso seco.

Três amostras com valores proteicos muito discrepantes foram eliminadas da

análise final dos dados, portanto o número amostral mensal pode apresentar

variação.

4- Análise Polínica

As amostras foram acetolisadas seguindo o método proposto por Erdtman

(1960). Após a acetólise, o pólen foi acondicionado em glicerina 50% por, pelo

menos, 24h. Posteriormente, foi preparada uma lâmina por amostra.


A análise palinológica e identificação do material polínico foi realizada por

meio de parceria firmada com o Professor Dr. Lucas Matheus da Rocha. Para tal, as

lâminas com o material amostral foram enviadas para o Laboratório de Botânica da

Faculdade de Ciências Integradas do Pontal - Universidade Federal de Uberlândia –

UFU – Campus de Ituiutaba.

A identificação dos tipos polínicos presentes nas lâminas foi realizada por

comparação em microscópio binocular EasyPath modelo EP31-05121, com aumento

até 1000x, utilizando o Catálogo Polínico (Silva, 2014) disponível e palinoteca

própria.

A análise foi feita mediante a contagem dos primeiros 400 grãos de pólen

encontrados nas lâminas, como sugerido por Montero & Tormo (1990). Em seguida

será determinado as porcentagens e classes de ocorrência de acordo com a

classificação de Barth (1970) e Louveaux et al. (1970, 1978): pólen dominante (>

45% do total de grãos da lâmina), pólen acessório (de 15 a 44,99%), pólen isolado

importante (3 a 14,99%) e pólen isolado ocasional (< 3%).

4.1- Valor proteico dos tipos polínicos

Para a análise dos dados, foram utilizados os valores proteicos do pólen das

espécies vegetais obtidos de Paulino-Neto et al. (submetido) para as famílias

Annonaceae, Bignoniaceae e Arecaceae; para as demais espécies vegetais Paulino-

Neto et al. (2010), Paulino-Neto et al. (2012a); Paulino-Neto et al. (2012b).


5- Análise Histoquímica de Glândulas Salivares e Hipofaríngeas

A cada coleta mensal de alimento larval, foram capturadas seis operárias

forrageiras e seis operárias de aprovisionamento de cada colônia. Estes indivíduos

foram submetidos à dissecção e análise do conteúdo glandular para investigação de

sua importância na secreção de proteínas no alimento larval.

A análise investigativa do material foi realizada no Laboratório de Microscopia

Eletrônica e Confocal do Instituto de Biociências da UNESP, Rio Claro, SP pelo Dr.

Pablo Henrique Nunes por meio da técnica de Xilidine Ponceau (Junqueira, 1983). O

material previamente fixado em paraformaldeído 4% foi desidratado em soluções

crescentes de etanol, transferido para resina de embebição, incluído e seccionado. A

embebição e a inclusão foram efetuadas em historesina Leica. Os cortes, com uma

espessura de 3 m, foram então recolhidos em lâminas de vidro, e corados por 30

minutos com solução de Xilidine Ponceau, depois passados em tampão acetato de

sódio pH 3,5 por 1 minuto e em seguida lavado em água destilada. Na sequência,

após a secagem, foi feita a montagem com bálsamo do Canadá para observação ao

microscópio e documentação fotográfica.

6- Teste de Desenvolvimento in vitro

Para avaliar a influência da concentração proteica do alimento larval no

desenvolvimento das abelhas e possível determinação de castas, foram realizados

bioensaios utilizando-se técnica descrita por Menezes (2010) com algumas

modificações conforme apresentado a seguir.


Para a suplementação proteica do alimento larval foi utilizada Albumina

Bovina Sérica (BSA), por apresentar em sua composição (Peters 1995) os

aminoácidos essenciais para a nutrição de abelhas melíferas, conforme apresentado

por Somerville (2011).

Inicialmente o teste foi realizado com dois grupos. O primeiro recebeu

alimento larval homogeneizado e água mineral (grupo controle) e o segundo recebeu

o alimento larval com suplementação proteica. Para tal foi utilizada albumina sérica

bovina, usada no preparo das amostras para leitura da curva padrão para Bradford,

diluída em água mineral cuja marca foi escolhida aleatoriamente, porém mantida por

todo o estudo para padronização.

Para os cálculos de suplementação com albumina foram utilizados os valores

obtidos nas análises de alimento larval realizadas até a época do início dos testes.

Determinou-se que para cada µl de alimento larval seria adicionado 1,5µg de

albumina, valor este que corresponde ao valor máximo encontrado em uma célula,

subtraído do valor médio do quartil superior (75% dos valores mais altos).

Nos testes de 1 a 4 foi utilizada albumina cristalizada diluída em água mineral,

portanto para o controle adicionou-se água mineral (de mesma marca) em

quantidade correspondente à de proteína utilizada para suplementação das

amostras experimentais, para evitar a influência da mesma nos tratamentos com

albumina. A partir do Teste 5 foi utilizada albumina líquida. Como não havia

necessidade de diluição em água, o controle passou a ser realizado com alimento

puro.

Inicialmente decidiu-se utilizar 120µL por célula, media do volume de alimento

larval encontrado para esta espécie (Menezes, 2007) e 15 células por vez, sendo

necessários 1800uL de solução final para cada tratamento. Por garantia, foi


preparada uma solução de 2100µL, quantidade suficiente para verificação do teor

proteico do alimento puro e após a suplementação, e eventual perda por aderência

nas paredes do frasco. Portanto, para cada 2100µl de alimento foram adicionadas

16µl albumina (ou água dependendo do tratamento). Esta proporção entre os

volumes de alimento e albumina foi tomada como padrão para todos os testes

realizados durante o experimento, já que não havia referências para tal

procedimento. Posteriormente foram adicionados tratamentos com 150 µL e 180 µL

por célula, utilizando alimento puro e com suplementação proteica em

concentrações equivalentes aos respectivos volumes.

6.1- Coleta do alimento larval e montagem do experimento

Durante a manipulação dos favos para retirada do alimento e larvas a sala foi

mantida úmida para evitar que o alimento, os ovos e larvas desidratem. Para isso foi

utilizado um recipiente com água mantida em fervura por dois ebulidores elétricos

(em substituição ao umidificador).

As colônias foram selecionadas de acordo com a posição e tamanho dos

favos de cria, presença de células em construção e quantidade suficiente de células

recém operculadas, das quais foram retirados o alimento larval e posteriormente as

larvas a serem transferidas. Os favos selecionados foram retirados das colônias para

facilitar a manipulação e evitar a saída excessiva de operárias. Os ovos tendem a

tombar durante a manipulação dos favos, portanto quando utilizados foram retirados

dos favos nas próprias colônias.

A princípio foram utilizadas para os testes o alimento larval e as larvas

provenientes de três colônias (L, M e N). Posteriormente novas colônias foram

adquiridas e sua utilização está demonstrada na Tabela 2 a seguir.


Tabela 2- Colônias utilizadas a cada mês para coleta de material para os testes de

desenvolvimento in vitro.

Colônia/Mês Mar Abr Mai Jun Ago Set Out Nov Dez Jan Fev

L x x x x x

M x x x x x

N x x x

435 x

484 x x x

501 x x

505 x x

524 x x

528

530 x

532 x x

534 x x x x

543

Para a montagem do experimento, inicialmente os favos removidos das

colônias tiveram suas células de cria mais novas abertas, os ovos retirados e

descartados. O alimento larval foi então coletado em quantidades semelhantes de

cada colônia (quando possível), utilizando uma micropipeta 20/200µl ou pipeta

Pasteur descartável. O alimento foi revolvido antes da remoção, sugando e

devolvendo com a própria pipeta duas ou 3 vezes antes da retirada e em seguida

depositado em tubo Falcon graduado ou frasco de vidro em quantidade suficiente

para todos os tratamentos. Posteriormente o alimento foi homogeneizado em vórtex

e dividido em tubos destinados aos diferentes tratamentos. Neste momento o

material foi homogeneizado novamente e foram retiradas amostras de 20 µl de cada

tipo de tratamento para análise proteica através do método de Bradford (alimento


com suplementação proteica, alimento com adição de água e alimento larval puro).

O alimento foi depositado em cavidades de placas de Elisa devidamente

identificadas de acordo com o tipo de tratamento.

Para o desenvolvimento das larvas foram utilizadas placas de acrílico (Placas

de Elisa) com 96 orifícios de 7mm de diâmetro e 10 mm de profundidade. As Placas

de Elisa foram utilizadas seguramente por apresentarem cavidades com dimensões

e formato semelhantes às células de cria naturais de M. scutellaris e, portanto,

adequadas ao desenvolvimento das larvas desta espécie. Só então os ovos ou

larvas foram transferidos. As células de cria foram desoperculadas uma a uma, os

ovos ou larvas foram retirados com o auxílio de um alfinete entomológico dobrado

em forma de gancho e depositados cuidadosamente nas cavidades das placas de

Elisa que já se encontram com o alimento larval. Foram utilizadas preferencialmente

as larvas de ovos recém eclodidos “larvas em pé” e as “larvas deitadas” mais

próximas dos ovos e das bordas da célula de cria, por serem mais jovens (Figuras 5

e 6).


Figura 5- Favo de cria com celulas abertas para coleta de alimento larval e larvas (A- ovo; B-

larva em pé; C- larva deitada).

Figura 6- Transferência de larvas para a Placa de Elisa (A). Larvas recém transferidas (B).

A

B

C

A B


As larvas mais próximas foram distribuídas entre os diferentes tratamentos

para evitar que um tratamento receba as larvas mais jovens e outro as mais velhas,

ou que “clusters” de rainhas como descritos por Koedam (1999) em M. favosa e

Ferreira-Caliman (2012) em M. scutellaris, fossem transferidos para um único

tratamento interferindo no resultado final.

As Placas de Elisa foram mantidas sem tampa, dentro de placas de Petri

(150x30mm) tampadas. Após o 6º dia, foi adicionada uma solução salina saturada

de NaCl para controlar a umidade relativa (UR) (figura 7), que foi mantida em

75%UR (Menezes 2013). O 6º dia foi considerado como referência, entretanto, a

solução salina somente foi adicionada à Placa de Petri após a total ingestão do

alimento pelas larvas, para evitar que o mesmo desidratasse e as levasse à morte

(figura 8).

Figura 7- Placa de Elisa mantidas em Placa de Petri com água (A) e com solução salina (B).

Solução salina

A B


Figura 8- Experimento com solução salina no 2º dia e alimento desidratado.

Os tratamentos foram mantidos em Estufa Incubadora B.O.D. Cientec modelo

CT 703 à 28°C e acompanhados diariamente durante o período larval e de três em

três dias durante o período de pupa com o objetivo de identificar possíveis

adversidades na técnica e para a retirada dos indivíduos que viessem a morrer.

O número de alvéolos utilizados foi determinado de acordo com a

disponibilidade de alimento nas colônias, procurando perfazer um número amostral

significativo e mantido constante nos testes subsequentes.

7- Análises estatísticas

Os dados amostrais obtidos até o momento foram analisados de forma

descritiva calculando-se a média e desvio padrão para o teor de alimento larval das

colônias ao longo do ano. Os resultados das análises realizadas foram avaliados

utilizado o programa Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA, 2007) com nível

de 5% de probabilidade.


Para comparação do teor proteico do alimento larval entre colônias e ao longo

dos meses os dados foram analisados estatisticamente utilizando Modelos lineares

de análise de variância para comparar a importância dos fatores meses e colônias

sobre a variável (teor proteico). Para verificar se as colônias diferiram entre si em

termos de teor proteico foi realizado o teste Tukey a posteriori.

Para análise comparativa da produção de rainhas entre o tratamento controle

e o tratamento com suplementação proteica para cada volume de alimento, foi

aplicado o teste exato de Fisher devido a frequência inferior a cinco.

As análises realizadas para relacionar o valor proteico dos diferentes tipos

polínicos com a ocorrência destes no alimento larval ao longo dos meses foram

realizadas por meio do programa Statistica 9.0. De acordo com os dados obtidos foi

realizado teste de regressão linear simples, utilizando o teor proteico das espécies

de plantas como variável independente e a média mensal de ocorrência de cada tipo

polínico como variável dependente.

Para verificar a relação entre o valor proteico dos tipos polínicos e o valor

proteico do alimento larval foi realizado o teste de correlação de Spearman por meio

do programa Sigmastat 3.5. A distribuição dos dados e elaboração dos gráficos

foram realizadas utilizando o programa Sigmaplot 10.

Resultados

Resultados

33

Resultados

1- Teor proteico do alimento larval

As análises realizadas indicam uma variação no teor proteico do alimento

larval ao longo do ano. De maneira geral, os menores valores ocorreram nos meses

de setembro e março, apresentando respectivamente valor médio mensal de 3,86%

(n = 10) e 4,72% (n = 30). Entretanto o menor valor de teor proteico foi de 0,29% (n

= 30) que ocorreu em outubro. As amostras que apresentaram os teores proteicos

mais elevados ocorreram em julho, com valor médio mensal de 19,74% (n = 47) e

maior valor amostral geral, alcançando 32,98% (Figura 9). Com altos índices

proteicos, os meses de junho e julho são os únicos a apresentarem diferença

significativa em relação a todos os outros meses, inclusive entre si (tabela 5).

A tabela 3 apresenta os dados relativos aos valores médios de teor proteico

do alimento larval de cada colônia, a cada mês (abril/2012 a março/2013) e os

respectivos valores de desvio padrão.

34 Resultados

Figura 9- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris entre colônias ao longo dos meses.

0

5

10

15

20

25

30

35

abr mai jun jul ago set out nov dez jan fev mar

Teo

r p

rote

ico

(%

)

Colônia B Colônia C Colônia D Colônia E Colônia F Colônia G Colônia H Colônia I Colônia J Colônia K Colônia L Colônia M

35

Resultados

Tabela 3- Média mensal e desvio padrão ( DP) do teor proteico do alimento larval em porcentagem de peso seco nas colônias de Melipona scutellaris

(Apidae, Meliponini) estudadas.

X

COLONIA Abril Maio Junho Julho Agosto Setembro Outubro Novembro Dezembro Janeiro Fevereiro Março

B 7,80 ± 4,32 12,31 ± 2,05 13,13 ± 1,18 25,02 ± 2,15 3,84 ± 2,27 3,86 ± 1,59 6,90 ± 1,85 7,54 ± 1,52 10,93 ± 2,02 8,97 ± 1,84 - -

C 14,16 ± 4,63 7,99 ± 2,72 15,23 ± 1,83 29,05 ± 7,30 - - - - - - - -

D 8,30 ± 1,86 7,61 ±3,11 - 29,61 ± 0,62 7,01 ± 2,48 - - - - - - -

E 5,92 ± 1,86 3,69 ± 2,64 - 6,91 ± 3,63 - - 6,11 ± 3,24 - - - - -

F 5,80 ± 1,76 8,53 ± 0,86 15,85 ± 1,51 6,45 ± 2,84 5,10 ± 2,50 - - - - - - 3,68 ± 1,77

G - - - - - - 8,47 ± 3,12 10,20 ± 1,76 6,08 ± 2,15 - 5,97 ± 1,14 -

H - - - - - - - - 7,37 ± 1,78 - - -

I - - - - - - - - 9,36 ± 1,04 5,93 ± 1,27 - -

J - - - - - - - - - 5,06 ± 0,49 - -

K - - - - - - - - - - 5,33 ± 0,53 -

L - - - - - - - - - - 4,88 ± 1,45 6,42 ± 2,00

M - - - - - - - - - - 4,05 ± 1,52

36

Resultados

Resultados

Os resultados mostraram que os níveis de teor proteico encontrado nas

amostras das colônias C e D se assemelham entre si e diferem de todas as outras

colônias, enquanto a maioria delas (B, E, F, G, H, I, J, K, L, M) apresentam

semelhanças significativas entre si, podendo ser consideradas como um grande

grupo representativo. Os níveis de teor proteico da colônia C, apresentou diferença

significativa entre todas as demais, exceto D (Figura 10 e tabela 4). Embora não se

possa afirmar se esta diferença realmente ocorra devido à falha na amostragem

decorrente da variação no número de colônias utilizadas em cada mês, pois

algumas delas foram perdidas durante o processo, possivelmente devido à intensa

manipulação, aliada às condições ambientais (baixa temperatura ambiente e

umidade relativa do ar) e escassez de recursos, características desse período do

ano.

Figura 10- Variação do teor proteico do alimento larval entre as colônias de M. scutellaris.

Mediana

25%-75%

Variância

OutliersB C D E F G H I J K L M

Colônias

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

Te

or

Pro

teic

o (

%)

37 Resultados

Resultados

Tabela 4- Níveis de significância da comparação da proporção do teor proteico (em %) do

alimento larval entre as diferentes colônias estudadas.

Col B C D E F G H I J K L M

B

C 0,000018

D 0,187109 0,377512

E 0,262071 0,000018 0,000605

F 0,106046 0,000018 0,000053 1,000000

G 0,616167 0,000018 0,002519 0,999972 1,000000

H 0,972840 0,001131 0,208334 1,000000 1,000000 1,000000

I 0,894749 0,000022 0,036580 0,999997 1,000000 1,000000 1,000000

J 0,329428 0,000022 0,007063 0,999765 0,995448 0,985353 0,999393 0,993959

K 0,419233 0,000026 0,011377 0,999957 0,998592 0,994006 0,999815 0,997692 1,000000

L 0,107683 0,000018 0,000291 0,999964 0,996449 0,985340 0,999860 0,996319 1,000000 1,000000

M 0,099946 0,000018 0,000975 0,984616 0,914574 0,856436 0,985019 0,923903 1,000000 0,999998 0,999929

O gráfico oriundo da comparação do teor proteico entre os meses (Figura 11

e tabela 5) revela diferença estatística no teor proteico do alimento larval quando

analisado independente das colônias, apresentando uma flutuação ao longo do ano,

com uma acentuada elevação nos meses de junho e julho. Após o aumento

expressivo registrado no mês de julho, foi verificado um novo declínio nos valores

proteicos (agosto e setembro) seguido de uma pequena elevação nos meses

seguintes (outubro, novembro e dezembro) e nova queda nos meses de janeiro,

fevereiro e março.

38 Resultados

Resultados

Figura 11- Variação do teor proteico do alimento larval de M. scutellaris ao longo dos meses.

Tabela 5- Níveis de significância da variação do teor proteico (em %) entre os meses do ano.

Meses Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Jan Fev Mar

Abr

mai 0,999963

Jun 0,000024 0,000018

Jul 0,000018 0,000018 0,001506

Ago 0,127731 0,424774 0,000018 0,000018

Set 0,175872 0,383783 0,000018 0,000018 0,999695

Out 0,976812 0,999842 0,000018 0,000018 0,954035 0,801356

Nov 1,000000 0,999964 0,002364 0,000018 0,343679 0,268390 0,989155

Dez 1,000000 1,000000 0,000025 0,000018 0,272219 0,269081 0,996022 1,000000

Jan 0,837317 0,989126 0,000018 0,000018 0,996520 0,926757 1,000000 0,924798 0,943418

Fev 0,152204 0,473915 0,000018 0,000018 1,000000 0,999493 0,966498 0,379822 0,310780 0,997977

Mar 0,026794 0,141770 0,000018 0,000018 0,999999 0,999999 0,749269 0,136063 0,079006 0,935978 0,999996

Mediana

25%-75%

Variância

Outliers

abril

maio

junho

julho

agosto

setembro

outubro

nov embro

dezembro

janeiro

f ev ereiro

março

Meses

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

Te

or

Pro

teic

o (

%)

39 Resultados

Resultados

Os dados indicam que os meses de abril, maio, outubro, novembro, dezembro

e janeiro não apresentaram diferença estatística quanto ao teor proteico do alimento

larval mantendo valor mediano entre 5% e 10% do peso seco. Os meses de junho e

julho apresentam diferença significativa entre eles e todos os demais em relação ao

teor proteico do alimento larval. Somente os meses de setembro e março

apresentaram valores de mediana abaixo de 5%, entretanto também não

apresentam diferença significativa com todos os demais (figura 11 e tabela 5).

A comparação entre as colônias considerando suas condições (fraca, média e

forte) não mostrou diferenças significativas, indicando que a variação do teor

proteico independe da condição da colônia utilizada (Kruskal-Wallis = H; p>0,05)

(figura 12).

Figura 12- Relação entre o teor proteico do alimento larval e as condições das colônias.

Mediana

25%-75%

Variância

Outliersboa f orte f raca

Condições das Colônias

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

Te

or

Pro

teic

o (

%)

média

40 Resultados

Resultados


Através da análise dos grãos de pólen presentes nas 81 amostras de alimento

larval, foram identificadas 75 diferentes espécies de plantas das quais 40 com valor

proteico conhecido (Paulino-Neto, 2010; 2012a; 2012b; submetido). Alguns desses

grãos de pólen estão apresentados na figura 13.

Figura 13- Grãos de pólen encontrados nas primeiras lâminas analisadas. (A) Handroanthus

vellosoi; (B) Anadenanthera peregrina; (C) Eucalyptus moluccana; (D) Poincianella pluviosa

e (E) Caesalpinia pulcherrima.

Os valores de teor proteico variaram de 37,7% do peso seco do pólen em

Eucalyptus citriodora, que ocorreu apenas oito vezes nas 81 amostras, a 3,88% em

Cecropia pachystachya que ocorreu três vezes em todo o período estudado.

Caesalpinia pulcherrima, presente em todas as amostras, mostrou valor

proteico de 10,96% enquanto Brunfelsia uniflora e Handroanthus heptaphyllus que

Fo

tos:

Lucas M

ath

eus d

a R

ocha

41 Resultados

Resultados

ocorreram em apenas uma amostra revelaram valores proteicos de 12,84% e

11,92%, todas elas com valores abaixo do valor médio de 16,35%.

Diferente do esperado, as análises de regressão não mostraram uma relação

significativa entre o valor proteico dos tipos polínicos com sua ocorrência no

alimento larval ao longo dos meses. Várias plantas se repetem nas diferentes

amostras, independente de seu valor proteico e com porcentagens de ocorrência

variadas, o que pode ser observado a seguir (figuras 14 e 15; tabela 6).

42 Resultados

Valores proteicos: (Paulino‐Neto et al, 2010; 2012a; 2012b; submetido) Figura 14- Ocorrência dos diferentes tipos polínicos nas amostras de alimento larval ao longo do ano. As cores mais intensas indicam maior ocorrência do pólen nas amostras mensais.

43 Resultados

Resultados

Figura 15- Relação entre o valor proteico dos tipos polínicos e sua ocorrência ao longo dos

meses (R2 = 0,0658).

Tabela 6- Resultados da regressão linear mostrando a relação entre o valor proteico e a

ocorrência dos tipos polínicos.

Soma dos Quadrados

Graus de Liberdade

Quadrado da Media

F P

Intercepto 4326,02 1 4326,021 35,50960 0,000000

Ocorrência 1837,69 11 167,063 1,37131 0,194001

Valor Proteico 1635,47 1 1635,475 13,42459 0,000361

Ocorrência vs Valor Proteico 1539,24 11 139,931 1,14861 0,329556

Erro 15715,66 129 121,827

Embora os grãos de pólen sejam parte constituinte do alimento larval, não

houve correspondência em relação sua ocorrência e a variação de seus respectivos

valores proteicos. Pode-se notar na figura 16 que o valor proteico dos tipos

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Ocorrência (%)

0

5

10

15

20

25

30

35

40P

rote

ína

Ocorrência (%):Proteína: y = 17,8574 - 0,1535*x; r2 = 0,0658

Va

lor

pro

teic

o d

o p

óle

n

44 Resultados

Resultados

polínicos não apresentou grande variação (correspondendo entre 10% e 20% do

peso seco), enquanto nas amostras de alimento larval este valor apresentou uma

variação elevada (de 0,3% a 35% aproximadamente).

Figura 16- Comparação entre os valores proteicos do alimento larval (vermelho) e dos

valores proteicos dos tipos polínicos das espécies de plantas utilizadas (verde).

A análise não mostrou correlação significativa entre os valores proteicos dos

tipos polínicos e do alimento larval (P = 0,861), apresentando coeficiente de

correlação (r) de - 0,0198 (figura 17).

Amostras

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Va

lor

pro

teic

o (

%)

0

5

10

15

20

25

30

35

Alimento larval

Tipos polínicos

45 Resultados

Resultados

Figura 17- Correlação entre os valores proteicos do alimento larval e os valores proteicos

dos tipos polínicos das espécies vegetais.

3- Análise das glândulas salivares e hipofaringeas

As análises histoquímicas realizadas indicaram alta atividade metabólica nas

células das glândulas hipofaríngeas. Essa atividade é evidenciada pelo grande

núcleo celular e acumulo de proteínas junto à membrana nuclear. Apesar do alto

metabolismo em uma das glândulas, a coloração clara das células mostra ausência

de secreção proteica pelas glândulas analisadas. A pequena quantidade de proteína

presente nas células, que aparece em forma de grânulos mais escuros, é típica do

metabolismo basal das células (Figuras 18 e 19). Embora este método apresente

Valor proteico do alimento larval (%)

0 5 10 15 20 25 30 35

Va

lor

pro

teic

o d

os

tip

os

po

lín

ico

s (

%)

10

12

14

16

18

20

22

46 Resultados

Resultados

alto grau de confiabilidade, seriam necessários outros métodos de análise para

confirmação dos resultados.

Figura 18- Análise histoquímica de glândula salivar de Melipona scutellaris (imagem em

aumento de 400x).

47 Resultados

Resultados

Figura 19- Análise histoquímica de glândula hipofaríngea de Melipona scutellaris

(imagem em aumento de 400x).

4- Teste de desenvolvimento in vitro

Os experimentos foram realizados inicialmente através da transferência de

ovos, que vieram a tombar impedindo que eclodissem. Portanto este teste (T1) não

produziu resultados. Em uma segunda tentativa (T2), foram transferidas larvas

recém-eclodidas, o que resultou em taxas de sobrevivência satisfatórias, com valor

médio alcançando 68,75%. Apesar dos primeiros testes (T2, T3 e T4) terem

apresentado um bom índice de sobrevivência, alcançando 68,75%, 84,44% e

21,67% respectivamente, por não apresentarem o desenvolvimento de rainhas em

nenhum dos tratamentos, nem mesmo no controle, a partir do teste seguinte (T5)

foram adicionados quatro novos tratamentos com volumes de 150µl e 180µl,

48 Resultados

Resultados

seguindo o mesmo padrão dos anteriores e que foram mantidos nas demais

repetições como pode ser observado na tabela 7 a seguir. Portanto, somente os

resultados de T5 e dos testes subsequentes foram considerados para as análises de

dados.

Embora nenhuma rainha tenha sido produzida em T5, os mesmos

tratamentos foram mantidos para os testes seguintes para que houvesse uma

padronização. Em T6 foram produzidas as primeiras 6 rainhas em dois tratamentos

cujos volumes eram de 150µl (3 rainhas) (figura 20) e 180µl (3 rainhas) ambos com

suplementação proteica.

Figura 20- Pupas de operárias e rainhas em desenvolvimento após 36 dias (as setas

indicam as rainhas). Teste 6, tratamento com 150µl de alimento com suplementação

proteica.

49 Resultados

Resultados

Em T7 foram produzidas um total de 8 rainhas em quatro tratamentos. Nos

tratamentos com volume de 120µl com suplementação proteica (2), 150µl com

suplementação (3), 180µl com suplementação (2) e 180µl controle (1). Em T8 não

houve rainha novamente, entretanto foram produzidos 13 machos, distribuídos por

todos os tratamentos exceto em 120µl controle. Em T9 foi produzida somente uma

rainha no tratamento com 120µl com suplementação proteica. Em T10 e T11 não

surgiram rainhas.

Machos vieram a ocorrer somente em T8, representando 19,4% do total de

sobreviventes com 13 machos para 67 sobreviventes, conforme demonstrado na

tabela 7.

50

Resultados

Tabela 7- Resultados obtidos nos diferentes tratamentos utilizados nos testes de desenvolvimento in vitro.

TRATAMENTOS Nº

AMOSTRAL SOBREVIVENTES RAINHAS (R) OPERÁRIAS (OP) MACHOS SOBREVIVÊNCIA (%) % R

T1 - 19/03/2014 (TOTAL) 30 - - - - - -

120 Controle (água 16ul) 15 - - - - - -

120 Albumina (16ul) 15 - - - - - -

T2 - 23/04/2014 (TOTAL) 32 22 - 22 - 68,75 -

120 Controle (água 16ul) 10 9 - 6 - 90 -

120 Albumina (16ul) 10 7 - 7 - 70 -

120 Controle 2 (água 16ul) 6 6 - 9 - 100 -

120 Albumina 2 (16ul) 6 - - 0 - - -

T3 - 08/05/2014 (TOTAL) 45 38 - 38 - 84,44 -

120 Controle (água 16ul) 15 13 - 13 - 86,67 -

120 albumina (16ul) 15 13 - 13 - 86,67 -

120 albumina 2x (32ul) 15 12 - 12 - 80,00 -

T4 -17/06/2014 (TOTAL) 60 13 - 13 - 21,67 -

120 Controle (água) 15 2 - 2 - 13,33 -

120 albumina (16ul) 15 4 - 4 - 26,67 -

120 albumina 2x (32ul) 15 2 - 2 - 13,33 -

120 albumina 4x (64ul) 15 5 - 5 - 33,33 -

T5 -15/08/2014 (TOTAL) 90 64 - 64 - 71,11 -

120 controle (puro) 15 13 - 13 - 86,67 -

120 albumina 16ul 15 13 - 13 - 86,67 -

150 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -

51

Resultados

TRATAMENTOS Nº


150 albumina 16ul 15 10 - 10 - 66,67 -

180 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -

180 albumina 16ul 15 9 - 9 - 60,00 -

T6 -19/09/2014 (TOTAL) 90 63 6 57 - 70,00 9,52

120 controle (puro) 15 11 - 11 - 73,33 -

120 albumina 16ul 15 14 - 14 - 93,33 -

150 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -

150 albumina 16ul 15 10 3 7 - 66,67 30

180 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -

180 albumina 16ul 15 6 3 3 - 40,00 50

T7 -10/10/2014 (TOTAL) 105 71 8 63 - 67,62 11,27

120 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -

120 albumina 16ul 15 11 2 9 - 73,33 18,18

150 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -

150 albumina 16ul 15 13 3 10 - 86,67 23,08

180 controle (puro) 15 8 1 7 - 53,33 12,50

180 albumina 16ul 15 8 2 6 - 53,33 25,00

T8 -28/11/2014 (TOTAL) 105 67 - 54 13 63,81 -

120 controle (puro) 15 11 - 11 0 73,33 -

120 albumina 16ul 15 10 - 9 1 66,67 -

150 controle (puro) 15 10 - 7 3 66,67 -

150 albumina 16ul 5 11 - 9 2 73,33 -

180 controle (puro) 15 9 - 5 4 60,00 -

52

Resultados

TRATAMENTOS Nº


180 albumina 16ul 15 9 - 7 2 60,00 -

T9 - 16/12/2014 (TOTAL) 105 90 1 89 - 85,71 1,11

120 controle (puro) 15 13 - 13 - 86,67 -

120 albumina 16ul 15 14 1 13 - 93,33 7,14

150 controle (puro) 15 14 - 14 - 93,33 -

150 albumina 16ul 15 13 - 13 - 86,67 -

180 controle (puro) 15 13 - 13 - 86,67 -

180 albumina 16ul 15 10 - 10 - 66,67 -

T10 - 28/01/2015 (TOTAL) 105 68 - 68 - 64,76 -

120 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -

120 albumina 16ul 15 11 - 11 - 73,33 -

150 controle (puro) 15 10 - 10 - 66,67 -

150 albumina 16ul 15 9 - 9 - 60,00 -

180 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -

180 albumina 16ul 15 9 - 9 - 60,00 -

T11 - 11/02/2015 (TOTAL) 105 50 - 50 - 47,62 -

120 controle (puro) 15 9 - 9 - 60,00 -

120 albumina 16ul 15 8 - 8 - 53,33 -

150 controle (puro) 15 8 - 8 - 53,33 -

150 albumina 16ul 15 6 - 6 - 40,00 -

180 controle (puro) 15 5 - 5 - 33,33 -

180 albumina 16ul 15 7 - 7 - 46,67 -

53

Resultados

Resultados

Foi transferido um total de 630 larvas, das quais 421 sobreviveram

resultando em 15 rainhas, 394 operárias e 13 machos. Em termos percentuais,

foi obtida uma taxa de 66,83% de sobrevivência, cujo rateio representa 3,56%

de rainhas, 93,59% de operárias e 2,85% de machos (figura 21).

Figura 21- Variação de sexo e castas entre os indivíduos sobreviventes em cada

tratamento.

Considerando-se somente as Rainhas e Operárias, a partir das mesmas

630 larvas transferidas foram obtidas 64,92% de sobreviventes, das quais

3,67% rainhas e 96,33% operárias, distribuídas em diferentes tratamentos de

apenas três testes, referentes aos meses de setembro, outubro e dezembro,

conforme demonstrado na tabela 8 e figura 22, a seguir.

82%

84%

86%

88%

90%

92%

94%

96%

98%

100%

Controle Albumina Controle Albumina Controle Albumina

120µl 150µl 180µl

Operária Rainha Macho

54

Resultados

Tabela 8- Testes que apresentaram rainhas e suas respectivas porcentagens em relação às operarias (*).

(*) Considerando os indivíduos sobreviventes, excluindo os machos.

TRATAMENTOS SOBREVIVENTES RAINHAS (R) OPERÁRIAS (OP) % SOBREVIVÊNCIA % Rainha % Operária

T6 -19/09/2014 (TOTAL) 60 6 54 66,67 10,00 90,00

150 albumina 16ul 10 3 7 66,67 30 70,00

180 albumina 16ul 7 3 4 46,67 42,86 57,14

T7 -10/10/2014 (TOTAL) 71 8 63 67,62 11,27 88,73

120 albumina 16ul 11 2 9 73,33 18,18 81,82

150 albumina 16ul 13 3 10 86,67 23,08 76,92

180 controle (puro) 8 1 7 53,33 12,50 87,50

180 albumina 16ul 8 2 6 53,33 25,00 75,00

T9 - 16/12/2014 (TOTAL) 90 1 89 85,71 1,11 98,89

120 albumina 16ul 14 1 13 93,33 7,14 92,86

55

Resultados

Resultados

Figura 22- Ocorrência de Rainhas nos diferentes testes ao longo dos meses.

A análise comparativa por volume de alimento considerando os

tratamentos controle e com suplementação, mostraram que a produção de

rainhas em volumes de 150µl foi significativamente maior nos tratamentos com

suplementação proteica (p=0,0016). Em volumes 180µl a ocorrência de rainhas

nos tratamentos com suplementação proteica também apresentou significância

positiva (p=0,02). Em volumes de 120µl a produção de rainhas nos tratamentos

com suplementação não foi significativa, embora tenha apresentado índice

próximo ao limite (p=0,06) (figura 23).

64

54

63

54

89

68

50

0

6

8

0

1

0

0

T5 ago

T6 set

T7 out

T8 nov

T9 dez

T10 jan

T11 fev

Rainha Operária

56 Resultados

Resultados

Figura 23- Ocorrência de rainhas nos diferentes tratamentos. Indices de significância

entre os tratamentos controle e com suplementação proteica em diferentes volumes de

alimento.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Controle 120 ul

Operárias

Rainhas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Controle 150 ul

Operárias

Rainhas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Controle 180 ul

Operárias

Rainhas

Tratamento Rainhas Operárias

Controle 0 100

Suplementação 3,75 96,25

Fisher exact P=0.06


Controle 0 100


Fisher exact p=0.0016


Controle 1,72 98,28


Fisher exact p=0.02

120µl

180µl

150µl

Controle Suplementação



Discussão

58 Discussão

1- Teor proteico do alimento larval

O alimento larval dos Meliponineos é constituído por grande quantidade de

pólen. Em Melipona marginata este componente alcança 50% do volume do

alimento larval como verificado por Rensi (2006). Em Melipona scutellaris 31%

(Menezes et al. 2010) e em Scaptotrigona depilis 16,7% (Menezes 2010).

No presente estudo, a análise do teor proteico do alimento larval apresentou

uma variação perceptível ao longo dos meses, variações entre as colônias em cada

mês, e entre as amostras de uma mesma colônia. Considerando o pólen como

principal fonte proteica do alimento larval, estes dados foram previamente

confirmados por Rensi (2006), que constatou em Melipona marginata, haver

variação significativa no volume e na proporção de pólen do alimento larval em duas

colônias estudadas. Na presente análise os dados das colônias puderam ser

agrupados e comparados de forma aleatória mês a mês, pois os resultados não

parecem ser influenciados pela colônia utilizada. Isto pode ser demonstrado pois nos

meses de abril, maio e julho, os únicos meses em que foram utilizadas as mesmas

colônias (B, C, D, E e F) para a coleta das amostras, houve uma disparidade entre

os valores proteicos registrados. Nos meses de abril e maio, o teor proteico foi

similar na maioria das colônias, apresentando valores entre 5% e 10%, enquanto no

mês de julho (período seco e inverno) ocorreu uma elevação considerável,

registrando-se a maioria dos valores proteicos em torno de 25% e os valores

máximos atingindo aproximadamente os 33%. Já nos meses de abril, maio, outubro,

novembro, dezembro e janeiro não foi observada uma diferença significativa entre os

valores proteicos analisados. Nas colônias estudadas por Rensi (2006) a proporção

de pólen encontrada no alimento larval foi maior no inverno, o que poderia explicar o

59 Discussão

aumento dos valores proteicos registrado nos meses de junho e principalmente de

julho.

A análise dos dados, considerando as condições das colônias, reforçam a

afirmação de que a variação do teor proteico independe da condição da colônia,

tendo em vista que tenham sido utilizadas preferencialmente colônias fortes e

médias no presente estudo. Entretanto não houve diferença significativa entre os

valores proteicos encontrados e as condições internas das colônias. Ao analisar em

pares colônias fortes, médias e fracas de Schwarziana quadripunctata, Castilho-

Hyodo (2001) encontrou diferenças significativas somente entre fortes e fracas e

entre médias e fracas, sugerindo que a distinção entre as colônias fortes e médias

não seja tão clara como para as fracas. Entretanto, Cremonez et al. (1998) afirma

que em Apis mellifera baixos teores de proteína na hemolinfa dos adultos podem

comprometer a manutenção e o crescimento da colônia. Brodschneider & Crailsheim

(2010) acrescentam que as larvas são extremamente dependentes da proteína

presente no alimento larval e uma baixa quantidade de proteína pode levar a colônia

ao enfraquecimento. Para Vollet-Neto e colaboradores (2010) as larvas de

meliponíneos se alimentam de uma grande quantidade de pólen, cujo teor proteico

afeta tanto indivíduos adultos como imaturos. O fato de termos utilizado colônias

fracas em poucas ocasiões poderia explicar o fato da variação proteica não estar

relacionada às condições das colônias. Portanto apesar do forte desbalanceamento

entre o número de colônias amostradas em cada mês, a variação na escolha destas,

permitiu um resultado confiável. A variação significativa encontrada quanto ao teor

proteico do alimento larval analisado é corroborada pelas afirmações de Velthuis &

Sommeijer (1991) de que não se espera encontrar em nenhuma espécie, os

componentes do alimento larval nas mesmas proporções em cada célula de cria.

60 Discussão

Menezes e colaboradores (2007) também verificaram uma variação tanto na

concentração quanto no perfil proteico, ao analisar a camada superior do alimento

larval de diferentes alvéolos de cria em M. scutellaris. Estudos realizados por

Castilho-Hyodo (2001) em seis colônias de S. quadripunctata revelaram que além de

diferenças significativas na concentração de proteínas entre as colônias, há também

uma grande variação sazonal no teor proteico do alimento larval. Hartfelder & Engels

(1989) encontraram uma especificidade entre a composição proteica do alimento

larval e as diferentes espécies de abelhas sem ferrão. Entretanto, provavelmente a

composição de aminoácidos do alimento larval não seja controlada pelas abelhas

nutridoras, já que o néctar e pólen presentes no alimento contribuem para o conjunto

de aminoácidos (Weaven & Kuiken, 1951; Hartfelder & Engels, 1989). Desta maneira

estes aminoácidos específicos a cada espécie podem ser resultantes de diferentes

estratégias de forrageio ou de preferências de recursos polínicos para cada espécie

de abelhas (Johnson & Hubbell, 1974; Imperatriz-Fonseca et aI. 1984).


Nas abelhas sem ferrão, as operárias forrageiras saem à procura de flores

para coletar pólen e néctar que serão utilizados como recurso alimentar na colônia

(Kerr et al. 1996). O pólen representa a única fonte natural de proteína em Apis

(Brodschneider & Crailsheim, 2010) e nos Meliponini representa o recurso principal,

representando a maior fonte de nitrogênio para a maioria das espécies de abelhas

(Roulston et al. 2000).

As análises polínicas realizadas no alimento larval de Melipona scutellaris

indicaram 75 diferentes tipos polínicos, com ocorrência variável ao longo do ano não

demonstrando correlação significativa com seu valor proteico. Alguns autores

61 Discussão

afirmam a capacidade de “escolha” das abelhas por tipos polínicos mais nutritivos,

mais próximos das colônias, ou por questões espaço-temporais como verificado por

Faria et al. (2012) em Scaptotrigona aff. depilis que concentram-se suas coletas em

um grupo limitado de plantas quando muitos recursos estão disponíveis e exploram

fontes mais variadas em períodos de menor disponibilidade.

Outros autores afirmam que a coleta esteja relacionada simplesmente com a

disponibilidade do pólen oferecido pelas espécies vegetais (Roubik 1982; Bismeijer

et al. 1999). Por não ter encontrado diferenças qualitativas na composição de

aminoácidos do pólen nas diferentes estações do ano, Negrão (2014) considera a

presença do pólen das mesmas três famílias botânicas em todas as estações do

ano, um indício de que as abelhas concentram a coleta de recursos de acordo com a

disponibilidade das plantas nas estações.

Entretanto, deve-se notar o fato de que o pólen coletado é armazenado na

colônia em potes, aos quais são adicionadas substâncias glandulares regurgitadas

pelas operárias para que ocorra a fermentação do mesmo antes de sua utilização

(Kerr et al. 1996). Portanto a presença dos tipos polínicos em determinados períodos

pode não estar diretamente relacionada com a fenologia do referido período.

Neste estudo foi verificado que o mês de julho apresentou os mais altos

índices proteicos no alimento larval e a maior diversidade de tipos polínicos. Como

estas variáveis não apresentaram correlação entre si, este resultado pode ser um

indício de que neste mês a quantidade de pólen (proporção em relação aos outros

componentes) no alimento tenha sido maior. Deve-se considerar também a

possibilidade de haver um desvio nos resultados no que se refere ao teor proteico do

pólen a cada mês, devido a ausência deste dado para algumas espécies vegetais,

62 Discussão

pois estudos realizados por Negrão (2014) mostraram um maior teor proteico total

no pólen no período do inverno.

De acordo com Velthuis & Sommeijer (1991), ao transportar alimento (polén e

mel) às células de cria, o pólen pode passar do papo para o ventrículo da operária,

onde ocorre sua degradação. A proteína atinge a hemolinfa e pode ser transportada

para as glândulas hipofaríngeas onde a secreção proteinácea que compõe o terceiro

componente do alimento larval é produzida. As funções desta secreção não são

completamente conhecidas; sabe-se que possui valor nutritivo em Apis além de

propriedades nutritivas e enzimáticas em Meliponini. Portanto, embora as análises

das glândulas hipofaríngeas não tenham indicado armazenamento de proteínas,

outra questão a ser considerada seria a possibilidade de que esta secreção

contenha proteína proveniente de outras fontes e não somente do pólen.

3- Teste de desenvolvimento in vitro

Um século de pesquisa não foi suficiente para elucidar os mecanismos que

desencadeiam o desenvolvimento de rainhas no gênero Melipona. Com o intuito de

acrescentar novas informações à esta discussão, foram realizados bioensaios

envolvendo aspectos quantitativos e qualitativos da composição nutricional do

alimento das larvas de Melipona scutellaris, no que se refere ao seu valor proteico.

No segundo teste (T2), foram transferidas larvas recém-eclodidas. Com um

índice de sobrevivência de 68,75%, os resultados do referido teste foram

considerados satisfatórios quando comparados aos 51,04% alcançados por

Menezes (2006) nas mesmas condições. Portanto todos os testes subsequentes

passaram a ser realizados através da transferência de larvas recém-eclodidas.

63 Discussão

Os primeiros testes (T2, T3 e T4) apresentaram índices de sobrevivência de

68,75%, 84,44% e 21,67% respectivamente, entretanto não resultaram no

desenvolvimento de rainhas em nenhum dos tratamentos, nem mesmo no controle.

Considerando a possibilidade do volume de alimento larval utilizado (120µl) estar

agindo como fator limitante para o desenvolvimento de rainhas, conforme proposto

por Maciel-Silva & Kerr (1991) assim como por (Engels & Imperatriz-Fonseca, 1990;

e por Velthuis & Sommeijer, 1991) que afirmaram existir um limite na quantidade de

alimento, abaixo do qual todos os indivíduos se desenvolvem em operárias, a partir

do quinto teste (T5) foram adicionados tratamentos com maior volume de alimento

(150µl e 180µl). O maior volume, entretanto não excedeu volume máximo

encontrado para a espécie, para não ocasionar a morte das larvas como constatado

por Menezes (2006) em tratamentos com 240µl de alimento. Em T5 embora 71,11%

das larvas tenham se desenvolvido até a idade adulta, não houve produção de

rainhas em nenhum dos tratamentos, entretanto em testes posteriores surgiram

rainhas em dois tratamentos com 120µl (T7 e T9), colocando em dúvida a questão

da quantidade de alimento como fator limitante.

Em T6 surgiram as primeiras rainhas, que continuaram a ser produzidas nos

testes seguintes. Diferentemente de Menezes (2006), que obteve uma porcentagem

maior de rainhas no grupo controle em relação ao grupo com alimento rico em pólen

(supostamente mais proteico), foram encontradas rainhas com maior frequência e

em maior porcentagem nos tratamentos com suplementação proteica, entretanto

não foi possível determinar os teores de proteína, pois as amostras foram perdidas

em um incidente ocorrido na estufa onde eram mantidas para desidratação.

Seguindo a hipótese de Kerr (1946,1948) a diferenciação de castas em

Melipona ocorre por meio de uma combinação entre mecanismos genéticos e

64 Discussão

alimentares, e ainda segundo Kerr (1966) fatores externos, que incluem a

quantidade de alimento poderia interferir nesta diferenciação, Embora Sakagami

(1982) afirme que todas as larvas de Melipona recebam alimento em quantidades

semelhantes e Hartfelder & Engels (1989) não terem detectado variações

relacionadas a determinação de castas nas análises realizadas em alimento larval

de Melipona, até o momento das 15 rainhas produzidas 14 delas se desenvolveram

em tratamentos com suplementação proteica e 12 em tratamentos com volume igual

ou superior a 150µl de alimento larval.

Kerr (1948) observou uma variação na porcentagem de rainhas na colônia em

dois períodos distintos. Um período considerado normal, que compreende os meses

de setembro a abril, quando a colônia apresenta o máximo de atividade devido às

condições ambientais e apresenta alta produção de rainhas, e o período de inverno,

de maio a agosto, quando a porcentagem de rainhas é menor. Os resultados destes

estudos estão próximos das segregações mendelianas (7:1 e 3:1), correspondendo

aos valores teóricos propostos por Kerr (1950).

Embora a porcentagem de rainhas obtidas através destes bioensaios (3,67%

de rainhas para 96,33% de operárias) tenha ficado muito aquém dos valores

propostos pelo autor, os meses em que elas ocorreram (setembro, outubro e

dezembro) coincidem com o período considerado de alta produção.

Apesar de alguns autores terem descrito uma flutuação nas taxas de

produção de rainhas, a sua continuidade ao longo do ano é um fato comum em

colônias do gênero Melipona, conforme observado por Moo-Valle et al. (2001);

Sommeijer et al. (2003); Van Veen et al. (2004); Morais et al. (2006); Alves (2010).

Este fato não foi observado nestes estudos, possivelmente em função do pequeno

número amostral.

65 Discussão

Durante os testes realizados, foi observado que as rainhas de Melipona

scutellaris se desenvolvem mais precocemente se comparadas às operárias e

machos. Em geral as rainhas atingiram o estágio final de desenvolvimento (desde a

transferência até a emergência) em torno de 2 a 3 dias antes das operárias, que se

desenvolvem em aproximadamente 57 dias (embora tenham sido registrados

períodos de 51 a 61 dias para o desenvolvimento total destas). Estudos realizados

por Kerr et al. (1996) mostraram que em Melipona compressipes fasciculata o ciclo

de desenvolvimento completa-se em aproximadamente 45 dias para a operária e 40

dias para a rainha, em Melipona quadrifasciata dura em média 39,5 dias para

operária, 36,8 para rainha e 39,8 dias para machos, e em Melipona rufiventris 42

dias para operária, 39,4 dias para rainha e 45,5 dias para machos. Segundo o autor,

o desenvolvimento total é influenciado pela temperatura e pela quantidade de

operárias na colônia. Estes dados corroboram a afirmação de Cruz-Landim (2004),

de que além da duração do estágio pupal ser variável entre as diferentes espécies,

nas abelhas eussociais existem diferenças no tempo de desenvolvimento entre os

sexos e as castas.

Segundo Velthuis et al. (2003) e Cruz-Landim (2004), para atingir os

diferentes tamanhos encontrados nos adultos de algumas espécies do gênero

Melipona, as larvas ingerem diferentes quantidades de alimento contido nas células

de cria. Entretanto a metamorfose não ocorre em resposta à quantidade de alimento

ingerida, mas a um mecanismo temporal que regula o período em que ocorrem as

mudas, comum às várias espécies. Isto provavelmente explicaria o resultado obtido

nestes testes, nos quais as larvas que receberam maior quantidade de alimento (180

µl) foram maiores, mas os adultos originados apresentaram tamanho semelhante e

66 Discussão

se desenvolveram no mesmo período de tempo que os dos tratamentos com

quantidade menor de alimento.

A produção de machos ocorreu somente nos dois últimos testes, e de acordo

com Bego (1990, 1998) e demais autores como Roubik (1982), Van Veen et al.

(1992), Koedam (1999), Moo-Valle et al. (2001), Sommeijer et al. (2003), Tóth et al.

(2004), Velthuis et al. (2005), Morais et al. (2006), Alves & Imperatriz-Fonseca

(2010), sua compreensão necessita de observações a longo prazo e depende da

correlação entre uma série de fatores intrínsecos e extrínsecos à colônia, que não

foram averiguados neste estudo, como variações climáticas, estoque de alimento,

condições gerais da colônia e recente substituição da rainha.

Conclusões

68 Conclusões

As análises mostraram uma diferença significativa no valor proteico do alimento

larval entre as colônias estudadas, que apresentou variação mensal relativamente

uniforme quando avaliado independentemente da colônia. Exceto no mês de julho,

quando o alimento larval apresentou teor altamente proteico em todas as colônias

estudadas. Entretanto, a hipótese de que a disponibilidade de recursos florais

representasse fator determinante para esta variação não foi confirmada, tendo em

vista não haver correlação positiva entre os teores proteicos do alimento larval e os

teores proteicos dos tipos polínicos encontrados nas amostras.

Apesar de terem sido identificadas 75 espécies vegetais, não houve uma

relação significativa entre o valor proteico dos tipos polínicos contidos no alimento

larval com sua ocorrência ao longo dos meses, sugerindo que Melipona scutellaris

seja uma espécie generalista.

A possibilidade de haver armazenamento de proteínas nas glândulas salivares

e hipofaríngeas não foi confirmada. No entanto, não se pode descartar definitivamente

se os fatores que regulam a concentração proteica do alimento larval são

determinados pelas operárias.

Os bioensaios apresentaram índice de 64,82% de sobrevivência considerando

somente rainhas e operárias. Destes, somente 3,67% rainhas, produzidas nos meses

de setembro, outubro e dezembro, considerados meses de maior atividade das

colônias.

69 Conclusões

Houve produção de rainhas em todos os volumes de alimento utilizados (120µl,

150µl e 180µl), embora em 120µl tenha ocorrido somente em tratamentos com

suplementação proteica. Portanto para este teste a quantidade de alimento não

parece ter sido fator limitante. Contudo, a produção de rainhas foi significativamente

maior nos tratamentos com suplementação proteica.

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Gláucya de Figueiredo Mecca - USP€¦ · AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,...

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