Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Técnicas Instrumentais

Prof. Fabricio Rochedo Conceiçãofabricio.rochedo@ufpel.edu.br

fabriciorc@pop.com.br

11 de maio de 2012

Espectrofotometria

Espectrofotometria visível e ultravioleta

• Método analítico baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética

• Permite identificar e quantificar compostos orgânicos e inorgânicos

• Região ultravioleta – 200 a 400 nm

• Região visível – 400 a 800 nm

Aplicações• Esta técnica é muito usada em laboratórios de

controle de qualidade (indústrias), pesquisa e de análises clínicas e toxicológicas

• Em biotecnologia: - Proteômica - Genômica - Transgenia - Expressão de proteínas recombinantes...

*** Análise de proteínas, DNA e RNA

Absorção de Radiação

• Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, como: reflexão, refração, espalhamento ou absorção

Absorção de Radiação

• Os comprimentos de onda que uma certa substância absorverá são característicos da sua estrutura, diferindo de substância para substância. Exemplos:

– DNA e RNA = 260 nm – Proteínas = 280 nm– Células bacterianas = 600 nm– Benzeno = 255 nm ...

Lei de Lambert-Beer

• Através dessa lei, intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução

– Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são considerados nessa lei.

– A radiação incidente deve ser monocromática

Lei de Lambert-Beer

• I0 = intensidade da luz incidente

• I1 = é a intensidade da luz uma vez tendo atravessado o meio

• l = é a distância que a luz atravessa

A = - log10 TA = - log10 T

T = I1 / I0T = I1 / I0

Transmitância• É a intensidade de luz remanescente após passar por

uma amostra de matéria.• 0 a 100%

Absorbância• É a capacidade do material em absorver radiações de

comprimento de onda específico. • 0 a 2

ENFIM, a lei de Lambert-Beer permite determinar a concentração de uma substância em função da absorção de luz

Espectrofotômetro

• É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz em função de um comprimento de onda específico.

Diagrama de um espectrofotômetro

Fontes luminosas mais comuns

• Luz UV – Lâmpada de gás hidrogênio ou deutério– Mercúrio

• Luz Visível – Tungstênio

Cubetas

• Espectrofotometria de Luz Visível– Cubeta de Vidro ou Plástico

• Espectrofotometria de Luz Ultravioleta– Cubeta de Quartzo

Dicas• Localização do espectrofotômetro - Bancada estável e exclusiva (se possível) - Longe de fontes eletromagnéticas (rádio, microondas...)

• Ligar 30 mim antes do uso

• Cubetas (tipo e manuseio)

• Calibração

Obrigado!