Guia de Treinamento NAT HIV-HCV

Diviso de Atendimento ao Cliente e Ps - Marketing DIACM

Maro de 2012

Elaborado pela DIACM

Aprovado por Linda Khalili Boukai Reviso: 29/03/2012

ii

nnndddiiiccceee Princpio do Ensaio .................................................................................................................... 1 Introduo a Biologia.................................................................................................................. 3 CIDOS NUCLICOS ................................................................................................................ 3 ESTRUTURA DA MOLCULA DE DNA .................................................................................... 6 ESTRUTURA DA MOLCULA DE RNA .................................................................................... 8 Cdigo do DNA .......................................................................................................................... 9 DA SEQUENCIA DE DNA SNTESE PROTICA ................................................................... 9 Duplicao / Replicao ........................................................................................................... 11 Transcrio .............................................................................................................................. 12 Sntese de Protenas Traduo ............................................................................................. 13 HIV HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS ......................................................................... 15 ESTRUTURA VIRAL E GENMICA ........................................................................................ 15 REPLICAO DO HIV ............................................................................................................. 16 CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 19 DINMICA DO HIV NO ORGANISMO INFECTADO ............................................................... 19 HCV HEPATIT VIRUS C ....................................................................................................... 20 Estrutura Viral e Genmica do Vrus ........................................................................................ 20 REPLICAO DO HCV ........................................................................................................... 22 TRANSMISSO ....................................................................................................................... 23 CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 24 Princpio da tcnica .................................................................................................................. 25 Reao de polimerase em cadeia ............................................................................................ 25 Cintica da reao ................................................................................................................... 26 Etapas da reao de PCR ........................................................................................................ 27 Condies da PCR ................................................................................................................... 28 PCR em Tempo Real ............................................................................................................... 29 PCR Multiplex .......................................................................................................................... 29 RT-PCR .................................................................................................................................... 29 PCR em Tempo Real no NAT HIV / HCV de Bio-Manguinhos ................................................. 31 Biossegurana ......................................................................................................................... 32 Componentes e Apresentao do Kit ....................................................................................... 33 Formato do Kit .......................................................................................................................... 33 Componentes e Apresentao do Kit........................................................................................33 Relao dos componentes fornecidos com o produto:............................................................. 33 Relao dos materiais necessrios no fornecidos ................................................................. 34 Indicao das condies adequadas de armazenamento e transporte ................................... 34 Material de reposio ............................................................................................................... 34 Precaues, cuidados especiais e esclarecimentos sobre os riscos decorrentes do manuseio

do produto e seu descarte .................................................................................................... 35 Influncias pr-analticas, tais como, anticoagulantes e temperatura ...................................... 36 Cuidados com as amostras biolgicas ..................................................................................... 36 Plataforma NAT Nacional ......................................................................................................... 37 Fluxo Metodolgico .................................................................................................................. 38 Esquema do Teste ................................................................................................................... 38 NAT Teste de cido Nuclicos .............................................................................................. 39 A) Preparo do Pooling .............................................................................................................. 40 Etapas e Equipamentos: .......................................................................................................... 40 Procedimento ........................................................................................................................... 41 Utilizao do Janus .................................................................................................................. 41 Inicializao do rob (Initialize): ............................................................................................... 42



iii

Remoo de bolhas e lavagem do sistema (FlushSysLiq) ....................................................... 42 Procedimento Pool de seis amostras ....................................................................................... 45 Rotinas utilizando somente amostras em Single ...................................................................... 55 B) EXTRAO ......................................................................................................................... 56 PROCEDIMENTOS .................................................................................................................. 56 Utilizao do MDx: ................................................................................................................... 56 2.1. Instrues gerais Sistema de reposio e descarte de lquido: ..................................... 60 - Preparo da Mesa de Trabalho e Carrossel do Equipamento ................................................. 62 Carregamento das amostras na mesa de trabalho .................................................................. 72 2.4 Verificao de cogulos ..................................................................................................... 73 C) Protocolo de Reao de PCR - JANUS ............................................................................... 79 D) Amplificao e Deteco ..................................................................................................... 86 Amplificao ............................................................................................................................. 86 Deteco .................................................................................................................................. 86 4. Procedimento para Amplificao e Deteco Real Time 7500 ......................................... 87 E) Processamento de dados e Resultados .............................................................................. 90 E.1 Gerao do laudo de resultados no Software de Bio-Manguinhos .................................... 92 E.2 Interpretao dos Resultados ............................................................................................ 95 E.2.1: Interpretao do Laudo .................................................................................................. 95 E.2.2 Interpretao das curvas de amplificao no ABI 7500 .................................................. 97 A. Controle interno e amostras no detectveis ....................................................................... 98 B.Controles Negativos e positivos ............................................................................................ 99 C. Perfis dentro do padro esperado ..................................................................................... 101 Perfis fora do padro esperado .............................................................................................. 102 Armazenamento do Kit ........................................................................................................... 105 Condies de Transporte ....................................................................................................... 105 Conservao e Estocagem .................................................................................................... 105 Instrues de uso do Tag........................................................................................................106 EQUIPAMENTO MDx ............................................................................................................ 107 PROCEDIMENTOS DE MANUTENES ............................................................................. 107 Liquid containers cleaning Limpeza dos recipientes de lquidos ...................................... 110 MANUTENES DIRIAS .................................................................................................... 110 Tip-Disposal Station Cleaning Maintenace - Limpeza da estao Tip-Disposal ..................... 110 Worktable cleaning Maintenance Limpeza da mesa de trabalho ........................................ 110 Bar Code Reader Windows Cleaning Maintenence Limpeza da janela do leitor de cdigos de

barra ................................................................................................................................... 111 High-Dispensing System and Liquid Detectors Maintenance - Manuteno do Sistema de

detector de lquido e sistema dispensador de alta velocidade ............................................ 111 MANUTENES SEMANAIS ................................................................................................ 111 Reagent Carousel Cleaning Maintenance Limpeza o carrossel de reagentes .................... 114 MANUTENES MENSAIS .................................................................................................. 114 System Liquid Container Cleaning Maintenance Limpeza do recipiente de lquido do sistema

............................................................................................................................................ 114 Worktable Cleaning Maintenance Limpeza da mesa de trabalho ....................................... 115 Robotic Handling System Cleaning Maintenance Limpeza do Lab Hand ......................... 115 Biannual Maintenance Procedure Manuteno semestral .................................................. 115 MANUTENES SEMESTRAIS ........................................................................................... 115 EQUIPAMENTO ABI 7500 ..................................................................................................... 116 Calibrao do ABI 7500 ......................................................................................................... 116 A) Calibrao ROI: ................................................................................................................. 116 B) Calibrao Background ..................................................................................................... 117 C) Calibrao ptica .............................................................................................................. 117 D) Calibrao do Dye ............................................................................................................. 118



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E) Calibrao do DYE 3 ......................................................................................................... 119 BACKUP DOS EQUIPAMENTOS .......................................................................................... 121 BACKUP JANUS: ................................................................................................................... 121 BACKUP MDx: ....................................................................................................................... 122 BACKUP ABI 7500: ................................................................................................................ 122 ENVIO DE ARQUIVOS PARA A DIACM ................................................................................ 123 Problema na consolidao no Janus : .................................................................................... 123 Problemas no MDx: ................................................................................................................ 123 MENSAGENS DE ERROS DOS EQUIPAMENTOS: ............................................................. 125 Mensagens de Erros no Janus: .............................................................................................. 125 ERRO: Liquid Handling Error ................................................................................................. 125 ERRO: System liquid empty ................................................................................................... 126 ERRO : Dilutor Module Error .................................................................................................. 126 ERRO 2: Liquid Handling Error .............................................................................................. 127 Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no Janus: ................................................... 128 Cdigos de ERROS BioRobot MDx : ..................................................................................... 129 Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no MDx: ..................................................... 130 Mensagem de erro do ABI 7500 : .......................................................................................... 131 Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no ABI 7500: .............................................. 131 Descontaminao .................................................................................................................. 132 Ambiente ................................................................................................................................ 132 Janus ...................................................................................................................................... 132 MDx ........................................................................................................................................ 132 ABI ......................................................................................................................................... 133 Cuidados adicionais para os hemocentros no uso da plataforma NAT .................................. 133 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................................... 140



v

SSSiiiggglllaaasss

AIDS Sndrome da Imunodeficincia Adquirida

cDNA DNA complementar

DNA cido desoxiribonuclico

EPC Equipamento de proteo coletiva

EPI Equipamento de proteo individual

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

HCV Vrus da Hepatite C

HIV Vrus da imunudeficincia humana

IL interleucina

mRNA RNA mensageiro

NAT Teste de cidos nuclicos

ORF Open Reading Frame

PCR Reao de Polimerase em Cadeia

RNA cido ribonuclico

rRNA RNA ribossmico

TNF - fator de neurose tumoral

tRNA RNA transportador



1

PPPrrriiinnncccpppiiiooo dddooo EEEnnnsssaaaiiiooo

A Plataforma NAT Multiplex HIV/HCV emprega tcnicas de Biologia Molecular para a

deteco, em tempo real, dos produtos de amplificao gerados numa reao de PCR

(Reao da Polimerase em Cadeia). O diagnstico laboratorial, nesta tecnologia, usado

para a pesquisa de cidos nuclicos especficos baseada na amplificao e deteco

simultnea de sequncias de RNA de HIV (Vrus da Imunodeficincia Humana) e HCV (Vrus

da Hepatite C). O processo de deteco realizado atravs da captao de fluorescncia

emitida pela amplificao do produto, com maior especificidade, devido utilizao de sondas

especficas marcadas com fluorforos para o fragmento alvo na reao.

Esse ensaio consiste na extrao automatizada de cidos nuclicos de um conjunto de

seis amostras biolgicas, chamado pool, juntamente com uma partcula calibradora

biossegura, ocorrendo purificao do material gentico que amplificado enquanto reage

com sondas marcadas (TaqMan chemistry). Estes marcadores utilizam a atividade nuclease

5' da enzima polimerase. O sistema de sondas possui fluorforos especficos (Reporter) e

uma molcula dissipadora de energia (Quencher) (Fig.1). A transferncia de energia ocorre

em virtude do fenmeno FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer. A reao

acontece quando h degradao da sonda, pois o aumento da distncia entre o reporter e a

molcula do quencher causa a emisso de fluorescncia, que pode ser detectada pela leitura

do comprimento de ondas especficas para cada tipo de fluorforo liberado. O monitoramento

do progresso da PCR medida que ela ocorre, em tempo real, possibilitado por meio da

leitura das intensidades da fluorescncia a cada ciclo, uma vez que as intensidades so

proporcionais ao nmero de amplicons gerados. Utiliza-se o fluorforo VIC para HIV, FAM

para HCV e DYE 3 para a partcula calibradora. Abaixo o esquema da reao de amplificao

em tempo real e as sondas utilizadas (Fig. 1).



2

Fig 1. Processo de liberao do Reporter aps a atividade 5 3 nuclease da enzima DNA polimerase.



3

IIInnntttrrroooddduuuooo aaa BBBiiiooolllooogggiiiaaa MMMooollleeecccuuulllaaarrr

CIDOS NUCLICOS

Os cidos nuclicos so macromolculas de extrema importncia biolgica em todos os

organismos vivos. As clulas recebem instrues sobre que protenas sintetizarem e em que

quantidades, a partir dos cidos nuclicos, que so molculas que estocam e transmitem a

informao gentica na clula.

Essas molculas constituem os genes, localizados nos cromossomos das clulas (Fig.

2). Essa informao transmitida atravs do cdigo gentico, cuja traduo resulta na sntese

protica.

Fig. 2: Cada cromossomo formado por uma nica molcula de dupla hlice de DNA condensada com protenas (histonas). Esse complexo de DNA mais protenas chamado de cromatina. Em uma clula eucaritica, quase todo o DNA est compactado na cromatina. O DNA "empacotado na cromatina para diminuir o tamanho da sua molcula, e para diminuir o tamanho da sua molcula, e para permitir maior controle por parte da clula de

tais genes.

Os cidos nuclicos so polmeros lineares de nucleotdeos, unidos por ligaes

fosfodister. Polmeros lineares so molculas muito longas compostas por um grande

nmero de subunidades pequenas que se repetem chamadas de monmeros.

Existem dois tipos de cidos nuclicos: cido desoxirribonuclico (DNA) e cido

ribonuclico (RNA). O acar que compe ambos os cidos nuclicos uma pentose, a nica

diferena est na presena de um oxignio ligado ao carbono 2 da cadeia, o DNA composto

de uma desoxirribose e o RNA de uma ribose (Fig. 3).



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H

H

H

N

NN

NH

Purina

H H

H

H

N

N

Pirimidina

H

H

NH2

N

NN

NH

Adenina (A)

H

NH2

O

N

NHN

NH

Guanina (G)

O H

H

NH2

NH

N

Citosina (C)

O H

H

O

NH

NH

Uracil (U)

Fig. 3. A: Representao de um nucleotdeo mostrando o acar, o grupo fosfato e a base nitrogenada. B: Molculas representativas dos aucares Ribose e Desoxirribose que compem o RNA e o DNA respectivamente.

Notar que essas duas molculas diferem entre si somente pelo fato da ribose possuir um tomo de oxignio a mais em relao desoxirribose.

. :

As bases adenina (A), guanina (G), e citosina (C), so encontradas em ambos os

cidos nuclicos, enquanto que a timina (T), s encontrada no DNA e a uracila (U), s no

RNA. Essas bases nitrogenadas so classificadas em dois tipos: purinas e pirimidinas. As

purinas (adenina, guanina e uracila) possuem dois anis unidos e as pirimidinas (timina e

citosina - DNA) possuem um nico anel heterocclico (Fig. 4).

Fig. 4. Estrutura das bases nitrogenadas que compem a molcula de DNA e RNA.

A

. B

BaseO

Fosfato

OHOH

H

BaseO

Fosfato

OH

Ribose

Desoxirribose



5

Cada nucleotdeo (monmero) composto de um grupamento fosfato, um acar

(pentose), uma base nitrogenada (purinas e pirimidinas) e cido fosfrico (Fig. 3A). Esses

nucleotdeos so interligados por pontes ou ligaes do tipo fosfodister. Essas ligaes

unem o carbono 3 da pentose do nucleotdeo adjacente. O esqueleto de um cido nuclico

composto por fosfatos e pentoses que se alternam. As bases nitrogenadas esto ligadas aos

acares desse esqueleto.

Uma sequncia de nucleotdeos possui uma orientao qumica de extrema

importncia. Em uma fita de DNA ou RNA, numa das extremidades h um grupo fosfato ligado

ao carbono 5 do acar (extremidade 5) e na outra h uma hidroxila ligada ao carbono 3 do

acar (extremidade 3). Convencionou-se escrever e ler a sequncia nucleotdica da

esquerda para a direita, no sentido 5 3 (Fig. 5). A cadeia polipeptdica possui

individualidade, determinada pela seqncia de suas bases, conhecida como estrutura

primria. nessa estrutura primria que a informao gentica est contida. O gene

corresponde a uma sequncia particular de DNA codificadora de uma informao (protena ou

RNA).

Fig. 5: Esquema ilustrativo do segmento de uma cadeia de DNA e RNA mostrando os nucleotdeos (A= adenina,

C = citosina, G = guanina, T = timina, U = uracila) interligados por uma ligao fosfodister.

Ligao

Fosfodister



6

ESTRUTURA DA MOLCULA DE DNA O DNA est presente nos organismos vivos na forma de molculas lineares de peso

molecular extremamente elevado, contendo informaes necessrias para manter a

hereditariedade das clulas. Em 1953, James Watson e Francis Crick propuseram um modelo

de estrutura tridimensional do DNA, baseado principalmente, nos estudos de difrao de raios

X de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins e em estudos qumicos da molcula.

Este modelo mostrou que o DNA uma dupla-hlice, no qual essas duas fitas se

enrolam em torno do eixo da hlice (Fig. 6). As desoxirriboses ficam externas em relao s

bases nitrogenadas como se fossem os corrimes de uma escada circular, expostas ao meio

aquoso (Fig. 5). As ligaes fosfodister, nas duas fitas, esto em direes opostas uma em

direo 5 3 e a outra 3 5 sendo, portanto, antiparalelas (Fig. 6). Os anis aromticos

das bases nitrogenadas so hidrofbicos e ficam orientados para o interior, quase

perpendiculares ao eixo da hlice. As bases esto pareadas entre as duas fitas da molcula,

mantendo a sua estrutura.

Fig. 6: Desenho ilustrativo da estrutura em dupla hlice da molcula de DNA proposta por Watson e Crick.



7

As duas cadeias polinucleotdicas mantm-se unidas atravs de ligaes de hidrognio,

que se estabelecem entre pares de bases especficas: adenina com timina e citosina com

guanina. Desde que exista uma distncia fixa entre as duas molculas de acar nas fitas

opostas, somente certos pares de bases podem se encaixar na estrutura. Os nicos pares

possveis so AT e CG. importante salientar que o par AT unido por duas pontes de

hidrognio e o par CG, por trs pontes de hidrognio, isso faz com que o par CG seja mais

estvel que o AT (Fig. 7).

Fig. 7: Esquema ilustrativo mostrando os dois pares de bases do DNA. As bases complementares so adenina e timina (A -T) e citosina e guanina (C - G). Observe que entre A - T existem duas ligaes de hidrognio, e entre

C - G so trs ligaes de hidrognio.

A sequncia de bases dispostas ao longo de uma cadeia de polinucleotdeo pode variar

consideravelmente, porm na outra cadeia a sequncia ser sempre complementar (Fig. 6).

Assim, as duas cadeias de polinucleotdeos que constituem um segmento de DNA so ditas

complementares entre si.

J que a estrutura de dupla hlice do DNA preservada por ligaes intermoleculares

fracas (ex.Ligao de hidrognio), possvel separ-las atravs de mtodos que envolvem,

por exemplo, aquecimento ou pH alcalino. A temperatura necessria para romper os pares

GC maior do que a necessria para romper o par AT, uma vez que este ligado por duas

ligaes de hidrognio. A temperatura na qual ocorre separao das cadeias de DNA (ponto

de desnaturao) depende da razo AT/GC.

Se o DNA aps a desnaturao for vagarosamente resfriado, as cadeias

complementares pareiam-se de forma ordenada, restabelecendo assim a conformao

original de dupla hlice (renaturao).

Duas ligaes de hidrognio

entre Adenina e Timina

Trs ligaes de hidrognio

entre Guanina e Citosina



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ESTRUTURA DA MOLCULA DE RNA

A estrutura primria do RNA semelhante do DNA, sendo composta tambm por

nucleotdeos (Fig. 3A). A primeira diferena, entretanto, que o acar presente a ribose

em vez da desoxirribose, vindo da o seu nome, cido ribonuclico. Como visto anteriormente,

a molcula de ribose difere da molcula de desoxirribose por apresentar um grupo OH ligado

ao carbono 2 em vez de um tomo de hidrognio (Fig. 3B).

Outra diferena que a base timina do DNA substituda no RNA pela base uracila

(U). Enquanto o DNA formado pela dupla hlice, o RNA encontrado principalmente como

uma cadeia simples de nucleotdeos, embora a molcula de RNA possa dobrar-se e formar

cadeia dupla entre bases complementares.

Existem trs principais classes de RNA: RNA mensageiro (mRNA), o RNA

transportador (tRNA) e o RNA ribossmico (rRNA). Todos esto envolvidos na sntese

protica e cada um consiste de uma fita nica de ribonucleotdeos e possuem um peso

molecular, uma sequncia nucleotdica e funes biolgicas caractersticas.

O RNA mensageiro (mRNA) possui as informaes para a sntese do RNA. Ele possui

as trincas de bases nitrogenadas que definem os aminocidos. O mRNA funciona como um

arquivo de computador, no qual um programa pode ser fielmente copiado. Vale ressaltar, que

o mRNA no fabricado como uma cpia exata do DNA, mas sim como uma molcula

complementar que respeita as mesmas regras de ligao entre as bases nitrogenadas,

somente a base timina (T) do DNA substituda pela base uracila (U) no RNA. A esse evento,

se d o nome de transcrio (discutida em maiores detalhes a diante). J o RNA transportador

(tRNA) tem a funo de identificar e transportar os aminocidos at os ribossomos e o RNA

ribossmico (rRNA) liga-se s protenas para compor os ribossomos, que so organelas do

citoplasma, onde acontece a sntese das protenas.

Apesar da molcula de RNA possuir uma nica cadeia de polinucleotdeo, o RNA no

uma estrutura linear simples e lisa. As molculas de RNA possuem extensas regies de

complementao nas quais as pontes de hidrognio entre os pares de bases AU e GC so

formadas unindo diferentes pores da mesma molcula. Como resultado disso, a molcula

dobra-se sobre si mesma, formando estruturas denominadas alas (Fig. 8).



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Fig. 8: Esquema ilustrativo da molcula de RNA dobrando-se e formando alas.

DA SEQUENCIA DE DNA SNTESE PROTICA Cdigo do DNA

Como a molcula de DNA carrega a informao correta da sequncia de aminocidos

que compem milhares de protenas na clula?

Comparando-se a molcula de DNA com a cadeia polipeptdica, ambas so formadas

por cadeias lineares, sem ramificaes. Portanto, o cdigo do DNA deve ser linear, de acordo

com a sequncia de nucleotdeos na molcula. Alm disso, cada posio na molcula de DNA

pode ser ocupada por um dos quatro nucleotdeos, enquanto na protena qualquer um dos 20

aminocidos pode aparecer em determinado ponto.

obvio, portanto, que o cdigo no pode ser um simples nucleotdeo controlando a

posio de um aminocido, pois, nesse caso, teramos somente quatro possibilidades. Mesmo

dois nucleotdeos no seriam suficientes para definir a posio dos 20 aminocidos na cadeia

polipeptdica, pois o nmero de cdigos possveis seria somente 16. Se, por outro lado, cada

trs letras do DNA definir um dos aminocidos, teremos 64 possibilidades, mais do que

suficiente para designar os 20 aminocidos diferentes.

Em 1966, com o cdigo do DNA ou cdigo gentico completamente decifrado, foi

demonstrado que: 1. todos os aminocidos das protenas so codificados por uma

combinao de trs bases do DNA, formando um trplex chamado cdon; 2. um mesmo

aminocido pode ser definido por mais de um cdon e, por isso, o cdigo dito degenerado;

3. existem trs cdons que, em vez de determinar a entrada de um aminocido especfico na



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cadeia polipeptdica, funcionam como o fim de um programa, determinando a interrupo da

cadeia que esta sendo sintetizada (Fig. 9).

Fig. 9: Cdigo gentico. Cada conjunto com trs bases (cdon) determina a entrada de um aminocido especfico ou marca o fim da sntese na cadeia polipeptdica (cdons em cinza com a denominao STOP em

vermelho). O cdon AUG (marcado em laranja) representa a iniciao de uma cadeia de aminocidos, em eucariotos.

O dogma central da biologia molecular foi sugerido em 1957 por Crick. Essa teoria

estabelece que o fluxo da informao gentica na clula unidirecional, sendo que o DNA

transcrito em RNA, o qual ento traduzido em protena. Entretanto, dois outros eventos

constituem exceo a essa regra. Primeiro, por ocasio da diviso celular, o DNA copiado

em outras molculas de DNA, em um processo conhecido como duplicao do DNA.

Segundo, alguns vrus, que possuem como material gentico o RNA em vez do DNA (como o

caso do HIV), tm sua molcula de RNA copiada e revertida em DNA em um processo

chamado de transcrio reversa (Fig. 10).

Fig. 10: Dogma central: estabelece que o fluxo da informao gentica na clula unidirecional. A duplicao do

DNA e a transcrio reversa constituem excees a essa regra.

DNA mRNA Protena

Transcrio

Traduo

Transcrio

reversa Duplicao



11

Duplicao / Replicao

Toda clula ao se dividir, tem seu contedo de DNA duplicado na ntegra, transmitindo

assim, todas as caractersticas genticas, esse processo chamado de replicao. Ela ocorre

de maneira semiconservativa, porque quando as duas fitas originais so separadas, cada uma

vai servir de molde para a construo de uma fita nova.

A fita cpia sintetizada pela ao catalisadora da DNA polimerase III, enzima que

utiliza como molde cadeia precursora e incorpora os nucleotdeos de forma sequencial na

nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases (Fig. 11). Como

essa polimerase sintetiza DNA na direo 5 3, a sntese de uma das cadeias

complementares realizada de forma contnua enquanto que a outra sintetizada

descontinuamente. Os fragmentos da cadeia descontnua so ligados pela enzima DNA

ligase. Muitas outras protenas esto envolvidas na estabilizao e manuteno da

integridade das cadeias simples que so precursoras para a sntese da fita dupla, assim como

no reconhecimento dos stios de iniciao. As DNA polimerases possuem alm da funo de

sintetizar polinucleotdeos, atividade exonuclesica chamada de correo de leitura na qual

os nucleotdeos incorporados incorretamente so removidos. Esta propriedade fundamental

para a manuteno da integridade da sequncia original.

Muito da complexidade inerente replicao de DNA advm do fato de que as duas

cadeias da dupla hlice se orientam em direes opostas ( 5 3 e 3 5) e suas cpias

devem, igualmente, apresentar direes opostas. Ainda, h o alongamento de todas as

cadeias cpias individuais que ocorre na direo 5 3. Esse aparente paradoxo foi

esclarecido com a descoberta de que uma fita cpia construda de forma descontnua, a

partir de pores menores que se alongam, individualmente em direo oposta. Essa

construo necessita de duas enzimas a DNA polimerase I para preencher as lacunas e a

DNA ligase para juntar os fragmentos.



12

Fig. 11: Esquemas ilustrativos da replicao de DNA.

Transcrio

Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma nica sequncia de

mRNA para cada gene (Fig. 12). A indicao de qual fita deve ser transcrita orientado por

uma sequncia especfica chamada promotor, localizada antes da sequncia a ser transcrita,

que reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetizadora de mRNA). Como a RNA

polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosdeo extremidade 3 da

cadeia de RNA em crescimento, a polimerizao ocorre na direo 5 3 (Fig. 11 e 13). Isso

significa que cada molcula de mRNA ser idntica sequncia nucleotdica da fita de DNA

que no transcrita. O mRNA transcrito transportado para os ribossomos (rRNA) no

citoplasma, onde ocorre a sntese protica.

No caso do retrovrus (como o HIV), a informao gentica segue o sentido inverso

de RNA para DNA esse processo conhecido por transcrio reversa e ocorre devido

presena de uma enzima a transcriptase reversa.



13

Fig. 12: Esquema ilustrativo da transcrio do DNA, ou seja, formao do mRNA a partir de uma fita de DNA. Cada sequncia de trs bases nitrogenadas representam 1 cdon.

.

Nos organismos superiores, incluindo o homem, uma regio do DNA com a mensagem

para a sntese de uma cadeia polipeptdica , geralmente, interrompido por certas pores

que no tm funo codificante e, portanto, no aparecem representadas na protena. Tais

pores so referidas como ntrons, enquanto as regies que carregam a informao

codificada para a sntese de protenas so os xons. Quando um arquivo ativado, o RNA

copia fielmente tanto os ntrons como os xons; entretanto, antes de o RNA deixar o ncleo,

as pores correspondentes aos ntrons so removidas, em um evento chamado de

processamento do RNA ou splicing. Dessa forma, no RNA mensageiro, aquele que

efetivamente carrega a mensagem para o citoplasma, est presente somente as pores que

correspondem aos xons (Fig. 13).

Fig. 13: Esquema ilustrativo do processo de transcrio do DNA. As partes em cinza mostram as pores referidas como ntrons que so retiradas aps o splicing atravs da enzima RNA polimerase.



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Sntese de Protenas Traduo

A sntese proteica no resultante da leitura direta da sequncia nucleotdica do DNA.

Como o DNA est localizado no cromossomo (Fig. 2) (no ncleo da clula) e a sntese

protica ocorre quase que na sua ntegra, nos ribossomos localizados no citoplasma, as

informaes genticas contidas na sequncia nucleotdica do DNA tem que ser transferida

para uma molcula intermediria que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro

(Fig. 12).

O processo de decodificao, pelo qual a informao gentica presente na molcula de

mRNA dirige a sntese protica, chamada traduo. Esse processo envolve os trs RNAs

mensageiro, ribossmico e transportador.

Na traduo, o ribossomo liga-se primeiro a um stio especfico na molcula de mRNA

(cdon de iniciao - ATG - Fig. 9) que ajusta a fase de leitura. O ribossomo ento se

movimenta ao longo da molcula de mRNA, traduzindo um cdon de cada vez usando os

tRNA para adicionar aminocidos ao final da cadeia polipeptdica em alongamento. A

traduo finalizada quando o ribossomo reconhece na fita de mRNA a presena do cdon

de terminao (Fig. 14). A direo da leitura de 5 3, sendo que a sequncia de

nucleotdeos da fita de DNA corresponde sequncia de aminocidos da protena traduzida

na direo amino-terminal para carboxi-terminal.



15

Fig. 14: Representao grfica do processo de sntese de protena, que ocorre no citoplasma celular.



16

HHHIIIVVV HHHUUUMMMAAANNN IIIMMMMMMUUUNNNOOODDDEEEFFFIIICCCIIIEEENNNCCCYYY VVVIIIRRRUUUSSS

ESTRUTURA VIRAL E GENMICA O HIV pertence famlia Retroviridae, gnero dos Lentivirus. Esse vrus possui uma

forma esfrica, com aproximadamente 110 nm de dimetro. A estrutura da partcula viral

infectante recebe o nome de vrion. Nessa estrutura so observadas as protenas estruturais

que so codificadas pelos genes gag, env e pol. O gene gag codifica as protenas do

capsdeo viral (p24 e p17); o gene env, as glicoprotenas contidas no envelope do vrus (gp41

e gp120); e o gene pol codifica as enzimas transcriptase reversa, integrase e protease (Fig.

15).

Fig. 15.:Esquema ilustrativo do vrus HIV mostrando o RNA viral, as protenas que compem o envelope viral e a

enzima transcriptase reversa.

O HIV apresenta genoma diplide duas molculas de RNA de fita simples de

polaridade positiva = de 9,8 kb covalentemente ligadas dentro de um nucleocapsdeo protico

em formato de cone, circundado por um envelope lipoprotico onde se encontram ancoradas

as glicoprotenas (Fig. 15).

O genoma j foi todo sequenciado e analisado, sendo que seus genes receberam a

seguinte nomenclatura: gag, pol, vif, vpr, tat, ver, vpu, env e nef.



17

As protenas sintetizadas a partir do gene gag compem o ncleo (core) que envolve

o genoma viral. O gene gag traduzido na forma de uma protena precursora Pr55gag que

posteriormente clivada para compor as protenas p17 (protena de matriz), p24 (protena

estrutural do capsdeo), p9 (protena do nucleocapsdeo que se liga fortemente ao RNA viral)

e p7. O gene pol tambm traduzido na forma de um precursor, Pr160gag-pol e codifica para as

enzimas virais: Protease (p10), transcriptase reversa Rnase-H (p51/66) e integrase (p32). O

gene vif (p23), parece atuar aumentando a infectividade, mas sua funo ainda no foi

totalmente elucidada. A funo do gene vpr (p15) codifica os ativadores da transcrio. A

protena p14, codificada pelo gene tat, atua como transativador transcricional, interagindo com

fatores de transcrio celulares e a sequncia TAR viral, promovendo a iniciao e elongao

dos transcritos virais. O gene ver (p19), indispensvel replicao viral, age como

transativador ps-transcricional, ligando-se sequncia RRE viral e fatores celulares,

promovendo splicing e/ou transporte do mRNA viral. O gene vpu (p16) influencia a liberao

das partculas virais e aumenta a reciclagem do antgeno CD4+. O gene env codifica a

glicoprotena precursora gp160, que posteriormente clivada para formar a gp41,

transmembranar, e a gp120, glicoprotena de face externa, responsvel pela ligao do vrus

ao receptor celular. Por fim, o gene nef (p27) potencializa a infectividade viral, mantendo altos

os nveis de infeco.

REPLICAO DO HIV

O principal receptor para a entrada do HIV-1 (subcategoria do vrus HIV) na clula do

hospedeiro o linfcito TCD4+. A infeco tem inicio quando uma partcula viral, que contm

duas cpias de RNA HIV, encontra uma clula com uma molcula de superfcie chamada

CD4. A interao do vrus com a membrana celular feita pela ligao da gp 120 ao receptor

CD4 da clula hospedeira, porm co-receptores (quimiocinas CCR5 e CXCR4 - mediadores

ou regulares de processos inflamatrios com habilidade de recrutar e ativar subpopulaes

especficas de leuccitos) ou receptores secundrios so tambm necessrios para a entrada

do vrus na clula.

Quando o gene que codifica o CCR5, apresenta uma deleo mutante, o receptor

celular codificado por esse gene fica estruturalmente alterado. A condio de homozigose

est associada a um efeito protetor infeco pelo HIV-1. A condio de heterozigose, apesar

de no proteger o indivduo da infeco, est associada no progresso, ou perodos de

latncia clnica mais prolongados.



18

Embora as clulas TCD4+ paream ser o principal alvo para o HIV, outras clulas do

sistema imune com molculas CD4 em suas superfcies tambm so infectadas. Entre elas

esto os moncitos e macrfagos, que podem hospedar grandes quantidades de vrus sem

serem mortos, desse modo, atuam como reservatrios.

Aps a interao da membrana do envelope viral com a membrana celular, ocorre uma

alterao conformacional que expe um peptdeo de fuso a gp41. O capsdeo viral ento

liberado no citoplasma da clula hospedeira.

Por ao da transcriptase reversa do vrus, no citoplasma da clula, a fita de RNA

serve de molde para a transcrio reversa de duas fitas complementares de DNA viral

(cDNA). O cDNA viral (fita dupla) transportado para o ncleo, e incorporado ao genoma da

clula hospedeira pela ao da integrase, e passa a ser denominado provrus (DNA do HIV

incorporado aos genes da clula hospedeira. Em um mesmo organismo o provrus pode, em

algumas clulas, permanecer em latncia e no dar sinal de sua presena. Em outras clulas,

o processo replicativo pode ser lento com multiplicao controlada, ou acelerado levando

lise celular). Para que o DNA proviral produza novos vrus, cpias de RNA devem ser feitas.

O provrus, para se replicar, subverte a maquinaria celular e passa a comandar os

mecanismos enzimticos da clula hospedeira. Isso significa dizer que as enzimas celulares

passam a trabalhar na sntese de RNAs genmicos mensageiros (RNAm) e na sntese de

protenas virais.

As citocinas, protenas envolvidas na regulao normal da resposta imune, podem

tambm regular a transcrio. Molculas como fatores de necrose podem tambm regular a

transcrio. Molculas como fatores de necrose tumoral alfa (TNF-) e interleucinas (IL)-6,

secretados em nveis elevados pelas clulas de pacientes HIV positivos, podem auxiliar na

ativao do DNA proviral.

O mRNA viral transportado do ncleo celular para o citoplasma e comea a traduo

das protenas virais, utilizando a maquinaria celular de sntese protica. O prximo passo a

montagem da partcula viral (protenas e RNAs virais) e o ancoramento da partcula

membrana plasmtica da clula hospedeira. Uma partcula viral imatura formada e ao aderir

membrana celular, adquire um envelope. Ocorre o brotamento do vrus imaturo de forma

intensa provocando a destruio da clula hospedeira. Durante este ponto do

amadurecimento feito pela ao da protease viral que cliva as longas cadeias de protenas e

enzimas que constituem o ncleo em pedaos menores. Essa clivagem resulta em partculas

virais infecciosas (Fig. 16).



19

Figura 16: A: Imagem ilustrativa do HIV (representado pelos crculos verdes) infectando uma clula. B: Infeco pelo HIV-1 atravs da ligao gp120 (envelope viral) receptores CD4 e CCR5 (clula hospedeira) (Fase 1).

Citoplasma, transcrio reversa da fita de DNA complementar ao RNA viral pela transcriptase reversa (Fase 2). Ncleo, insero do DNA pr-viral ao DNA da clula hospedeira, (integrase do HIV) (Fase 3). Ativao celular, transcrio de cpias do RNA viral (RNA polimerase humana), sntese de protenas e glicoprotenas virais bem

como cpias ntegras do RNA genmico do HIV (Fase 4). Por fim, empacotamento do RNA viral seguido de brotamento da clula hospedeira (Fase 5), dando incio a disseminao da infeco de novas clulas.

B.

A.



20

DINMICA DO HIV NO ORGANISMO INFECTADO

Estudos indicam que cerca de 10 bilhes de vrus so produzidos por dia e que essas

partculas virais tem uma meia vida de aproximadamente 4 horas. De forma semelhante, um

grande nmero de linfcitos TCD4+ produzido e destrudo, sendo que a meia vida de um

linfcito infectado de 2,4 dias. O linfcito TCD4+ a principal clula-alvo do HIV.

No h, portanto, perodo de latncia virolgica e, mesmo durante a infeco crnica

assintomtica, observa-se uma grande batalha entre o sistema imune do indivduo infectado e

o vrus. Com o passar do tempo, o vrus desestrutura a arquitetura dos rgos linfticos,

comprometendo a reposio dos linfcitos TCD4+.

CARGA VIRAL

O nmero de partculas virais presentes em uma determinada amostra de um indivduo

infectado conhecido como carga viral.

A carga viral plasmtica, detectada na forma de RNA do HIV, reflete a dinmica desse

vrus nos indivduos infectados, quantificando as partculas que esto sendo produzidas e

lanadas na circulao sangunea.

O nvel de RNA do HIV no plasma um marcador clnico importante. O nmero de

partculas virais mais elevado durante a infeco primria e mais baixo na fase

assintomtica. Existe uma relao direta entre a quantidade de HIV detectada e a rapidez com

que a infeco progride. Nveis elevados de replicao do vrus e o aumento da carga viral

esto associados deteriorao acelerada do sistema imune (Fig. 17). O colapso do sistema

imune, que antecede o aparecimento da AIDS, resultado da destruio das clulas CD4+ e

das alteraes imunitrias provocadas pelo vrus.

Fig. 17: Grfico representativo da contagem de linfcitos TCD4+ e da carga viral, ao longo da infeco pelo HIV.



21

HHHCCCVVV HHHEEEPPPAAATTTIIITTT VVVIIIRRRUUUSSS CCC

A hepatite C vem sendo estudada h vrios anos, mesmo antes da descoberta do vrus

causador da doena o Vrus da Hepatite C (VHC). Nesta ltima dcada, entretanto, houve

avanos significativos no entendimento de sua epidemiologia, modos de transmisso,

patognese, diagnstico e teraputica.

Sabemos, hoje, que a hepatite C compete com a doena heptica alcolica como a

maior causa de doena crnica do fgado, podendo ser a vencedora em vrias reas

geogrficas. Estima-se que 3% da populao mundial esteja contaminada, sendo relevante o

nmero de pessoas que desconhece o fato de albergar o vrus. Um estudo populacional na

cidade de So Paulo mostrou prevalncia de 1 a 4% de anti-VHC, variando com a faixa etria.

As altas porcentagens de cronicidade da doena, seu potencial evolutivo para cirrose e

hepatocarcinoma, assim como o fato de ser a mais freqente etiologia diagnosticada em

casos de transplante heptico, fazem com que constitua grave problema de sade pblica.

Estrutura Viral e Genmica do Vrus

O HCV um vrus RNA da famlia Flaviviridae, com genoma em fita simples de

polaridade positiva medindo 9,7 kilobases de comprimento e com cerca de 9400 nucleotdeos

(FIg. 18). Nessa sequncia, encontra-se uma longa fase de leitura aberta (ORF Open

reading frame) que compreende quase todo o genoma e codifica uma poliprotena de pouco

mais de 3000 aminocidos.

Fig. 18: Representao do vrus da hepatite C, que um vrus RNA da famlia Flaviviridae de 50 nm de dimetro.

Na extremidade 5, encontram-se trs a quatro pequenas ORFs, cuja real traduo em

protenas questionada. Entretanto, esta regio mais conservada entre os diferentes vrus

isolados, sugerindo que deve ter um papel regulatrio muito importante durante a replicao



22

viral. Esta sequncia conservada, aliada ao fato de conter uma estrutura secundria que a

torna mais resistente digesto por ribonucleases (RNAses), torna esta regio como a melhor

para seleo de primers para a biologia molecular com fins de deteco deste vrus em

amostras provenientes de diferentes regies do mundo.

Uma pequena regio no traduzida na extremidade 3 tambm est presente,

possuindo uma cauda de poli-A caracterstica. Esta pequena regio, no traduzida, apresenta

estruturas secundrias que parecem ser bem conservadas, podendo ter um significado

importante durante a replicao genmica do vrus, pois nela que ocorre a ligao da

sequncia complementar enzima replicase. Porm, observou-se que, quando ocorrem

variaes na sequncia genmica desta regio, pode haver diminuo da eficincia de ligao

da replicase, bem como alterao na replicao viral. Tais fatos podem ser parcialmente

responsveis pelos diferentes nveis de patogenicidade do vrus da hepatite C e tambm pela

sensibilidade ao interferon.

As protenas estruturais do HCV so trs: protena C encontrada na extremidade N-

terminal e duas glicoprotenas E1 (GP 33) e E2/NS1 (GP 72), provveis constituintes do

envelope viral. A E1 uma protena matriz e a outra, E2/NS1, provavelmente anloga

glicoprotena principal do envelope dos pestivrus.

As protenas no estruturas NS2, NS3, NS4 e NS5 representam a extremidade carboxi-

terminal do genoma viral. NS2 e NS4 so protenas hidrofbicas e, portanto devem estar

ligadas membrana da clula hospedeira. NS3 tem pelo menos duas funes; helicase, no

desdobramento do genoma viral durante a replicao, e protease participando na clivagem de

protenas no estruturais a partir do precursor. A protena NS5 contm pelo menos a funo

de RNA replicase RNA dependente, mas deve ser multifuncional.

A anlise filogentica das sequncias genmicas permitiu a caracterizao de 6

gentipos (1 a 6) que so subdivididos em grupos a, b, c, etc. Dentro de um mesmo gentipo

e subtipo podemos ainda ter variaes do HCV, que so denominadas quasispcies. Isso

possvel devido replicao imperfeita do vrus, com o surgimento de pequenas e constantes

mutaes. A maior ou menor diversidade das quasispcies parece estar relacionada com a

presso imunolgica, j que costuma ser pequena nas fases iniciais da doena, com

aminotransferases normais, sendo de alta heterogeneidade nos casos de doena heptica

mais avanada e/ou baixa resposta teraputica.

O tempo de incubao da hepatite C mostra-se bastante varivel, de 1 a 13 meses,

com mdia de 8. Logo aps a contaminao, o melhor marcador e nico disponvel at o

presente a determinao do RNA-HCV, j que os anticorpos surgem apenas 4 a 20

semanas aps o contgio.



23

REPLICAO DO HCV

O vrus da hepatite C replica principalmente nos hepatcitos do fgado, onde

estimado que cada clula infectada produza diariamente cerca de cinquenta partculas virais

com um total calculado de um trilho de partculas virais geradas. O vrus tambm pode se

replicar em clulas mononucleares de sangue perifrico, contribuindo potencialmente para os

altos nveis de distrbios imunolgicos encontrados em pacientes infectados pelo HCV

cronicamente. O HCV tem uma grande variedade de gentipos e sofre mutaes rapidamente

devido a uma alta taxa de erro por parte do vrus "dependente de RNA-polimerase do RNA. A

entrada nas clulas do hospedeiro ocorre atravs de interaes complexas entre os virions

(partcula viral) e as molculas da superfcie de clulas.

Uma vez dentro do hepatcito, o HCV assume parcelas da mquina intracelular para

replicar. A dinmica de replicao do HCV pode ser deduzida a partir das rpidas taxas de

produo de vrus e emergncia de mutantes. Outra caracterstica da replicao do HCV a

gerao rpida de variantes de vrus. Mesmo dentro de um paciente HCV no existe como

uma entidade nica, mas sim como um enxame de microvariants de predomnio de, um

fenmeno que tem sido referido como quasispecies (para uma reviso ver Holanda et al.,

1992).

A deteco de anticorpos anti-HCV pode ser realizada inicialmente por mtodos de

elevada sensibilidade (100%) e especificidade (entre 99,6% a 99,84%), como o

enzimaimunoensaio (ELISA) e o enzimaimunoensaio de micropartculas (MEIA), que

empregam peptdeos sintticos do VHC. Posteriormente, os resultados reagentes obtidos nos

mtodos de triagem devem ser confirmados por mtodos de elevada especificidade, como o

recombinant immunoblot assay (RIBA) ou Western Blot (WB), a deteco de RNA viral pela

reao em cadeia da polimerase (PCR) qualitativa e quantitativa e a tcnica do cido

desoxirribonuclico (DNA)-branched (bDNA).



24

TRANSMISSO

Demonstrou-se que o HCV o agente causal de mais de 90% das hepatites ps-

transfusionais. Assim, todas as pessoas que receberam transfuso de sangue ou

hemocomponentes at o incio dos anos 90, com ou sem histria de hepatite ps-

transfusional, devem ser avaliadas para provvel contaminao com o vrus da hepatite C. No

Brasil, a partir de 1993, h a obrigatoriedade dos testes sorolgicos (anti-HCV) em candidatos

a doadores de sangue. Assim, a hepatite ps-transfusional tornou-se rara, mas outros meios,

parenterais ou no, continuam a disseminar a doena. Alm dos produtos do sangue,

agulhas/seringas contaminadas ou mesmo a inalao de drogas com o uso de espelhos e

canudos contaminados so vias importantes.

Outras formas parenterais de contaminao so os procedimentos mdicos,

odontolgicos, acupunturistas ou tatuagens. Portanto, qualquer material cortante ou

perfurante pode ser veculo transmissor do vrus de uma para outra pessoa, como o alicate da

manicura, a lmina do barbeiro ou mesmo a escova de dentes, compartilhada por cnjuges ou

filhos. Em nosso meio, demonstramos que dentre os casos eventualmente rotulados como

espordicos por serem afastados transfuso de sangue ou o uso de drogas ilcitas houve uma

porcentagem significativa de pacientes com cirurgias prvias e/ou atendimentos mdicos de

urgncia em prontos-socorros ou ainda a hiptese j confirmada de contaminao mdica

durante o ato cirrgico.

Dentre as formas no parenterais de transmisso da hepatite C torna-se importante

ressaltarmos a possibilidade da transmisso sexual. Embora pouco eficiente, deve-se

examinar e alertar o parceiro sexual, particularmente nos indivduos promscuos, para os

quais mandatrio o uso de preservativos. Aos casais monogmicos de longa data, sem

doenas sexualmente transmissveis, facultativo o uso continuado de preservativos, sendo

possvel a gravidez. A disseminao intrafamiliar tambm pode existir, possivelmente por

compartilharem materiais cortantes ou ento pela exposio de ferimentos abertos. A

transmisso materno-fetal revela-se pouco significativa na hepatite C, podendo ocorrer

particularmente no momento do parto. No existe profilaxia para o recm-nascido, que ter o

anti-HCV da me nos primeiros 6 a 12 meses de vida. Os anticorpos costumam desaparecer

nesse perodo, podendo haver verdadeira contaminao com permanncia do RNA-HCV em

raros casos, principalmente quando a co-infeco HCV e HIV.



25

CARGA VIRAL

Existem vrios mtodos para medir a concentrao do vrus no soro, que uma

avaliao indireta da carga viral. Estes mtodos incluem o PCR (Polimerase Chain Reaction)

quantitativo e em tempo real, que sero discutidos posteriormente. Os nveis de HCV RNA

so normalmente bastante estveis, embora possam variar de forma espontnea, 3 a 10

vezes ao longo do tempo. Esses ensaios quantitativos podem fornecer importantes dados

sobre a natureza da hepatite C. A maioria dos pacientes com hepatite C crnica tm nveis de

HCV RNA (carga viral) entre 100.000 (105) e 10 milhes (107) cpias / mL. Expressos em IU,

estas mdias so de 50.000 a 5.000.000 UI.

As taxas de resposta a um curso de peginterferon e ribavirina so maiores em

pacientes com baixos nveis de HCV RNA. H vrias definies de "baixo nvel" do RNA do

HCV, mas a definio usual de 400.000 UI (~ 1 milho de cpias / mL) ou menos.

No incio da infeco observar-se um aumento no nvel da carga viral e ao redor do 70

dia aps a infeco, h o incio da produo de anticorpos e consequentemente uma

diminuio da carga viral no paciente.

Fig. 19. Marcadores do HCV durante o incio da infeco.



26

RRReeeaaaooo dddeee pppooollliiimmmeeerrraaassseee eeemmm cccaaadddeeeiiiaaa

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) consiste em fazer cpias do material

gentico in vitro usando elementos bsicos do processo de replicao natural do DNA e foi

desenvolvida principalmente por Mullis et al. (1985).

A especificidade da tcnica dada pelo uso de iniciadores especficos para o gene ou

regio do DNA de interesse. A utilizao de dois iniciadores delimitam o alvo e a repetio dos

ciclos da PCR, dando origem a bilhes de cpias do alvo.

Mullis utilizou a ento recm-descrita Taq DNA polimerase termoestvel isolada da

bactria de fontes termais Thermus aquaticus, origem do nome da enzima. Esta enzima se

mantm estvel em temperaturas de at 117C, com temperatura tima de 72C. Porm, a

realizao manual dos ciclos de temperatura, banhando-se um rack de tubos em vrios

banhos-maria de temperaturas diferentes, ainda constitua um fator dificultante do processo.

Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automtico.

At hoje, a maioria dos termocicladores automticos funciona com o mesmo princpio:

aquecimento por resistncias eltricas e refrigerao com ventoinhas e tubulaes em

serpentina preenchidas por etileno glicol. Aperfeioaram-se os sistemas de contagem de

tempo, para aumentar a confiabilidade das reaes. Em meados dos anos 90 surge o padro

Peltier, cujo bloco de aquecimento composto por uma liga metlica que aquece ou resfria de

acordo com o sentido da corrente eltrica aplicada e este o utilizado pelo equipamento

ABI7500 da Plataforma NAT.

Princpio da tcnica

A tcnica explora funo natural da enzima Taq polimerase, esta enzima semelhante

enzima DNA polimerase que capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no

sentido 5 3. Para catalisarem essa sntese, os precursores de DNA devem estar presentes

sob a forma de deoxirribonucleotdeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP).

Esta consiste em ciclos de reaes de sntese de regies especficas do DNA (gene ou

parte dele), na qual a cada ciclo o nmero de fragmentos duplicado, havendo assim um

crescimento exponencial do fragmento desejado.

Hoje, a PCR se constitui no mtodo diagnstico de rotina para isolar rapidamente

sequncias especficas a partir de uma mistura complexa de sequncias genmicas ou de

DNA complentares (cDNAs), DNA gerados a partir de uma sequencia de um RNA

mensageiro.



27

Cintica da reao

A PCR realizada em trs etapas, repetidas em ciclos. Cada etapa desenvolvida a

uma temperatura apropriada para sua maior eficincia, as etapas so:

a) desnaturao das cadeias do DNA ou c-DNA por aquecimento, realizada a uma

temperatura prxima de 95C. A essa temperatura as pontes de hidrognio existentes

entre as duas fitas rompem separando-as;

Fig 20. Representao grfica da separao das fitas do DNA durante o processo de desnaturao (95C), na qual ocorre o rompimento das pontes de hidrognio.

b) anelamento (annealinng) dos iniciadores ao DNA da amostra (DNA molde ou template).

Iniciadores so oligonucleotdeos com 20-24 bases usualmente seletivos o suficiente

para localizar um stio nico em um genoma de alta complexidade de tamanho. Sua

funo delimitar a sequncia a ser amplificada atravs do estabelecimento de pontes

de hidrognio com a sequncia alvo, respeitando a regra de pareamento descrita por

Watson e Crick (Adenina Timina; Citosina Guanina);

Fig 21. Representao do anelamento dos pares de iniciadores complementares aos flancos da sequncia alvo na faixa de 55C a 65C, durante a PCR.

c) extenso, na qual ocorre a incorporao dos deoxirribonucleotdeos dispersos no meio

a partir dos iniciadores, em suas extremidades 3, em temperatura tima especfica. A

adio de nucleotdeos ocorre apenas se os inicadores estiverem pareados seus

stios especficos obedecendo a propriedade de complementaridade de bases dos

cidos nucleicos.

Iniciador 1

Iniciador 2



28

Fig. 22. Representao da etapa de extenso da fita no sentido 53 com incorporao de deoxinucleotdeos presentes no meio pela Taq-polimerase.

Por fim, o objetivo da repetio destes eventos de desnaturao, anelamento e

extenso duplicar a quantidade deste fragmento presente no meio a cada ciclo, acumulando

este produto exponencialmente.

Etapas da reao de PCR

Fase de screening - ciclos iniciais.

Os iniciadores se anelam na fita simples de DNA em sua regio complementar. Nesta etapa, a

quantidade de iniciadores abundante em relao aos fragmentos de DNA, tronando fcil

este processo.

Fase intermediria:

O processo de amplificao est ocorrendo, com os iniciadores agindo de modo a permitir o

acmulo exponencial do fragmento de DNA. O pareamento do iniciador com a sequncia que

lhe complementar j est bem facilitada, pois j existem vrias cpias das sequncias alvos.

Fase tardia ou fase de plat:

A amplificao j sub-tima devido limitao dos reagentes e competio dos produtos

gerados. Esta fase ocorre devido aos fatores relacionados abaixo:

- Perda da atividade da enzima;

- Acmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do

pareamento com os inicadores;

- Aumenta a possibilidade de amplificao de produtos inespecficos

- Gasto dos reagentes, especialmente de iniciadores e deoxirribonucleotdeos;

- Acmulo de pirofosfato, resultante das ligaes fosfodisteres;

- Competio com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficincia menor, mas

tambm foram se acumulando.

Taq DNA

Polimerase

3

5

5

3



29

Condies da PCR

Inibidores da PCR podem ter origem na prpria amostra ou nos reagentes usados na

coleta e no preparo desta. Substncias tais como grupamentos heme presentes no sangue

total, produtos da lise das clulas vermelhas, bilirrubina, bile e sais inibem a PCR ou podem

ainda degradar o cido nucleico de amostras biolgicas como clulas do sangue perifrico,

tecido animal e fluidos corporais, incluindo, fluido crebro-espinhal, material de bipsia, entre

outros.

Uria, detergentes (SDS), acetato de sdio, heparina, fenol entre uma grande

variedade de compostos orgnicos e inorgnicos podem ser inibidores da reao de PCR por

interferir no funcionamento da DNA polimerase na reao. Como exemplo, podemos citar o

magnsio (Mg+2), que um ction presente na reao de PCR que se liga DNA polimerase,

sendo um co-fator essencial para a atividade da enzima. Esta concentrao precisa ser tima,

pois em falta na reao, acarretar formao de menor quantidade de produtos, e, em

excesso, reduzir a fidelidade do resultado por formao de produtos inespecficos (aumento

da taxa de erro). Por este motivo, substncias quelantes de ctions divalentes como o EDTA

podem interferir reduzindo a atividade da enzima.

O tempo e a temperatura de armazenamento da amostra podem tambm impactar

significativamente na recuperao dos cidos nucleicos e na eficincia dos procedimentos

subsequentes.

Os laboratrios de biologia molecular precisam ter uma estrutura que permita um

perfeito fluxograma de trabalho, com reas dedicadas. Cada estao possui seus prprios

equipamentos, as superfcies devem ser lisas e construdas de forma a facilitar a limpeza.

Programas de qualidade devem incluir verificao peridica dos equipamentos, como

manutenes mensais, trimestrais e ou semestrais usualmente realizadas pelas empresas

parceiras. Manutenes dirias e semanais so executadas pelos operadores. Nestas

manutenes esto inclusos os procedimentos de limpeza, descontaminao e algumas

outras verificaes, dependendo do equipamento.

Finalmente, o resultado da PCR baseado na presena ou no do produto amplificado

em eletroforese em gel de agarose, ou na visualizao de resultados grficos captados em

sistema ptico.

Para garantir que um resultado negativo ou no, deve-se ter a certeza de que a

ausncia de bandas, ou de fluorescncia, devido ausncia de DNA molde, e no falhas

na reao. Para tanto, deve-se considerar utilizar um controle interno de amplificao nas

reaes. Os controles nas reaes de PCR so verificados a partir da amplificao de uma



30

sequncia que obrigatoriamente existe no material analisado, e preferencialmente em uma

nica cpia.

RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR)

Em algumas situaes, a fonte inicial da informao a ser amplificada uma molcula

de RNA. Neste caso necessria a realizao de uma etapa prvia PCR que a sntese de

uma fita de cDNA (DNA complementar) tendo a molcula de RNA como molde.

Em sua extrao o mRNA separado de uma soluo de RNA total extrada de um

tecido ou suspenso celular.

A soluo catalisada pela enzima transcriptase reversa que converter o RNA-m em

cDNA. Em seguida o cDNA pode ento submetido reao de PCR semelhana do DNA

genmico.

Esta tcnica chamada de RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain

Reaction).

Sintetiza-se cDNA empregando-se a enzima transcriptase reversa de origem viral. A

partir do cDNA, emprega-se o mtodo de PCR para amplificao. A deteco do mRNA til

no diagnstico de infeces causadas por vrus que possuem uma fase latente. A deteco do

mRNA expressa somente infeco produtiva e evidncia de uma infeco viral ativa

PCR Multiplex A PCR Multiplex uma reao onde vrias regies diferentes de DNA (ou c-DNAs) so

amplificadas ao mesmo tempo. Isto possvel devido a utilizao simultnea de diversos

pares de iniciadores especficos para cada locus a ser identificado sem que eles possam

hibridizar entre si. Se a temperatura de anelamento for semelhante e os diferentes amplicons

produzidos apresentarem tamanhos distintos, possvel que o diagnstico atravs de uma

PCR multiplex seja realizado. A vantagem a economia de reagentes e tempo, visto que,

duas reaes ou mais podem ser realizadas conjuntamente.

PCR em Tempo Real

Este procedimento permite, de forma simultnea, a deteco e quantificao de um

fragmento especfico de DNA ou cDNA. O PCR convencional no apresenta valores

quantitativos, por isso foi desenvolvido o PCR em tempo real, que uma tcnica descrita

como quantitativa porque consegue quantificar o nmero de molculas produzidas a cada

ciclo.



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A localizao da sequncia alvo feita pelos iniciadores, assim como no processo de

PCR convencional, porm, dispe ainda em sua reao, de outro oligonucleotdeo; uma

sonda marcada por fluorforo (molcula que, quando excitada por luz, emite fluorescncia em

comprimento de onda especfico), na sonda h duas molculas, o reporter e um quencher, na

qual o primeiro possui a fluorescncia, enquanto o segundo a absorve. Por questes fsicas,

enquanto o quencher estiver prximo ao reporter (sonda intacta) no haver a emisso de

fluorescncia. Ao estender as fitas a partir dos iniciadores, a Taq polimerase degrada a sonda

separando a o fluorforo de seu abafador. Desta forma, essa molcula poder emitir energia

que ser captada pelo sistema ptico do equipamento que realiza a PCR em tempo real.

Assim, a cada ciclo, ocorre a deteco do aumento do produto da PCR em tempo real,

a partir do aumento da fluorescncia emitida, decorrente da degradao da ligao do

fluorforo da sonda ligada ao fragmento de DNA que est sendo amplificado. A emisso

crescente de sinal luminoso monitorada em cada reao/tubo de PCR, a cada ciclo, para

gerar curvas de amplificao tpicas da PCR quantitativa.

Fig. 23. Grfico representando uma amostra positiva para um alvo especfico, na qual a fluorescncia gerada pela amplificao do produto e as trs fases da PCR em tempo real.

A cintica da reao de PCR em tempo real semelhante a reao convencional, a

amplificao dividida em 3 fases: a linha basal na qual no h produtos de PCR suficientes

para detectar fluorescncia, a fase log em que a quantidade de produtos de PCR dobra a

cada ciclo (fase da deteco) e a fase plat onde no h mais aumento no nmero de

produtos, conforme explicado anteriormente (Fig.23).



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As caractersticas relevantes do PCR em tempo real so rapidez, especificidade,

sensibilidade e opcional quantificao. Atualmente o mtodo do PCR em tempo real

considerado um dos mtodos de escolha p/ testes moleculares quantitativos e qualitativos em

decorrncia de suas vantagens sobre o PCR convencional:

Maior rapidez de execuo

Maior sensibilidade e reprodutibilidade;

Menor risco de contaminao de amostras no ambiente laboratorial, devido a

ausncia de manipulao das amostras aps o processo de amplificao.

PCR em Tempo Real no NAT HIV / HCV de Bio-Manguinhos

No ensaio NAT HIV/HCV de Bio-Manguinhos emprega-se uma combinao destes

protocolos, com a identificao de dois genomas virais compostos por RNA, portanto se trata

de uma RT-PCR. necessria a etapa prvia de composio do cDNA.

multiplex, por detectar simultaneamente os vrus HCV, HIV e o controle interno da

reao, a Partcula Calibradora - fragmento sinttico de cido nucleico viral inserido na etapa

de pooling de amostras.

Em adio, esta deteco se faz continuamente, em tempo real, com captao da

fluorescncia decorrente da luminescncia produzida pela dissociao do fluorforo, a partir

da sonda, no momento da extenso.

Ao detectar-se esta fluorescncia, podemos indicar a presena do cDNA que, por sua

vez, identifica a presena vrus na amostra. Ou seja, esse sistema se mostra mais especfico,

pois a sonda degradada apenas aps hibridizar-se ao material a ser detectado.

Desta forma, o ensaio NAT se trata de uma RT-PCR multiplex em tempo real para

deteco do HIV e do HCV em amostras de doadores de sangue.

A simples presena destes tipos virais em uma amostra de sangue inviabiliza a sua

transferncia a outro paciente. Este protocolo no visa a quantificao de carga viral e, sim, a

qualidade do sangue como passvel de transfundir ou no.



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BBBiiiooosssssseeeggguuurrraaannnaaa

Materiais biolgicos tais como sangue, soro e clula so potencialmente infectantes e

muitas vezes esto contaminados com agente etiolgicos diferentes do que se est

pesquisando, ou ainda desconhecidos. Por isso fundamental que medidas de biossegurana

adequadas sejam adotadas nos laboratrios onde h manipulao desses materiais.

Equipamentos de Proteo Individual (EPI) devem ficar em lugar de fcil acesso aos

funcionrios do laboratrio.

culos de segurana, protetor facial e mscara descartvel usadas sempre que

houver possibilidade de aerossis.

Jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, preferencialmente descartvel

deve ser usado somente dentro da rea do laboratrio.

Luvas descartveis devem ser resistentes, de material sinttico (vinil) ou latex para

manipulao de matrias potencialmente infectantes. As luvas descartveis, usadas

para os procedimentos da tcnica PCR devem ser isentas de talco.

Pipetas automticas devem estar calibradas e validadas.

Props descartveis

Calados fechados e de material resistente.

Equipamento de Proteo Coletiva (EPC) so utilizados para minimizar a exposio dos

funcionrios ao risco e em caso de acidentes, reduzir suas conseqncias.

Chuveiro de emergncia e lava-olhos devem estar instalados prximos ao ambiente

laboratorial.

Extintores de incndio.

Centrifugas com rotor provido de tampa.

Cabines de segurana biolgica classe II devem ser posicionadas longe de portas,

janelas e de equipamentos que de alguma forma promovam a movimentao do ar,

empurrando ar no filtrado, diretamente para a superfcie de trabalho, podendo assim

contaminar o material que est sendo manipulado.



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FFFooorrrmmmaaatttooo dddooo KKKiiittt

Componentes e Apresentao do Kit

Relao dos componentes fornecidos com o produto:

MDULO COMPONENTES VOLUMES

Controles

Controle Positivo 02 Frascos com de 800 L cada

Controle Negativo 02 Frascos com de 800 L cada

Partcula Calibradora 02 Frascos com de 800 L cada

Extrao

Tampo de Lise 01 Frasco com 33 mL

Carreador de RNA 01 Frasco liofilizado

Tampo de Lavagem 1 01 Frasco com 83 mL

Tampo de Lavagem 2 01 Frasco com 68 mL

Tampo de Eluio 09 Frascos com 2,0 mL cada

Fluido TE 04 Frascos com 1,4 mL cada

Placa de Vcuo 01 Unidade de 96 poos

Placa de Eluio 01 Unidade de 96 poos

Placa de Reao 01 Unidade de 96 poos

Protease 01 Frasco liofilizado

Solvente de Protease 01 Frasco com 6 mL

Recipientes Descartveis 02 Unidades

Placa ptica 01 Unidade

Selo ptico 01 Unidade

Tubo de 5 mL 01 Unidade

Manual de Instruo 01 Unidade

Carto Bio 01 Unidade

Amplificao

Mistura de PCR 02 Frascos com 900 L cada

Enzima RT 02 Frascos com 30 L cada

gua/DEPC 02 Frascos com 600 L cada

Sondas 02 Frascos com 180L cada

Iniciadores 02 Frascos com 50L cada



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Material de reposio

Etanol P.A. Merck 96%;

Tubo BD PPT EDTA K2 com gel (600 tubos/rotinas);

Desinfetante amnia quaternria 50% (soluo de uso diluda 1:600. Ex.: 5 ml de

desinfetante para 3 L de gua);

1 Frasco plstico de 500 mL para etanol dedicado para utilizao de 12

processamentos no MDx;

Ponteiras de 1100 L MDx - 7 caixas com 96 unidades cada;

Ponteiras de 175L Janus - 9 caixas com 96 unidades cada;

Tubo Secundrio - 4 embalagens com 25 unidades cada.

Relao dos materiais necessrios no fornecidos

gua destilada

Luva descartvel sem talco

Etiquetas com cdigo de barras para tubo secundrio

Proveta de 500 mL calibrada

Sacos de descarte de lixo biolgico

Duas pipetas automticas 1000 L (calibradas)

Ponteiras com filtro 1000 L

Indicao das condies adequadas de armazenamento e transporte

O KIT NAT HIV/HCV composto por 3 mdulos, com temperaturas de estocagem

diferentes:

Mdulo de Controle: armazenar de -80C a -60C;

Mdulo de Extrao: armazenar de 15C a 25C;

Mdulo de Amplificao: armazenar de -30C a -10C;

Obs.: Os mdulos de Controle e de Amplificao sero transportados em gelo seco

(-80C a -60C), mas devero ser armazenados nas temperaturas indicadas, no rtulo

externo, desde o ato do recebimento at a utilizao do conjunto.



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Precaues, cuidados especiais e esclarecimentos sobre os riscos

decorrentes do manuseio do produto e seu descarte

A Partcula Calibradora e o Controle Positivo no possuem capacidade replicativa in

vivo e, portanto, so biosseguros (no infecciosos).

Este kit contm produtos qumicos, podendo representar uma fonte de risco. Ao

manusear qualquer um dos reagentes observe as precaues necessrias. A qualidade dos

resultados obtidos depende do cumprimento s boas prticas de laboratrio tais como:

O teste deve ser usado somente para monitoramento in vitro e uso profissional,

de acordo com as instrues fornecidas no kit;

Os reagentes contm agentes irritantes e devem ser manipuladas com cuidado.

Observar as recomendaes em relao s medidas de segurana dos reagentes;

Tampo de Lise e Tampo de Lavagem 1 contm cloridrato de guanidina, que

pode formar compostos reativos quando combinado com hipoclorito de sdio.

perigoso e irritante se ingerido ou em contato com olhos e pele;

Protease contm subtilisina: sensibilizante, irritante se inalado (prejudicial para o

sistema respiratrio e para a pele); tambm acarretar risco quando em contato com os

olhos;

Utilizar equipamento de proteo individual (EPI) tais como luvas descartveis (sem

talco) e jaleco em todas as etapas do teste;

Aps o uso, desprezar ponteiras, tubos, placas, reagentes, insumos/produtos bem

como os itens consumveis (tubos de coleta e secundrios, entre outros) no descarte de

risco biolgico;

Os tubos com amostras devero ser colocados em saco vermelho duplo (descarte

de risco biolgico) e encaminhados para um local apropriado para resduos. De acordo

com a poltica de descarte de cada hemocentro;

Desprezar a placa ptica aps a amplificao e deteco em descarte no

reciclvel;

Todas as sobras de reagentes devero ser descartadas aps a utilizao de cada

mdulo do kit, de acordo com os procedimentos de cada Hemocentro;

No utilizar reagentes com a validade vencida.

Nunca misturar componentes de lotes diferentes;



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Cuidados com as amostras biolgicas

A coleta das amostras de sangue perifrico deve ser feita, preferencialmente, em tubo

PPT contendo anticoagulante K2 EDTA e gel de poliester para separao de plasma e

frao celular do sangue total. Coletar 5 mL de sangue total;

Homogeneizar a amostra por inverso aps a coleta;

Centrifugar o tubo at oito horas aps a coleta 800g (em uma centrfuga com 100

mm de raio, corresponde a 2700 rpm) por 10 minutos;

No utilizar tubos de coleta reciclados;

No congelar o tubo aps a coleta, pois o gel pode se desprender e alterar a carga

viral do paciente;

Aps a centrifugao conservar as amostras refrigeradas de 2C a 8C por no mximo

72h at a realizao do teste;

Os fatores interferentes para o uso da amostra so hemlise, lipemia e presena de

bilirrubina.

No utilizar tubos com anticoagulante heparina;

Influncias pr-analticas, tais como, anticoagulantes e temperatura

No devero ser aceitas amostras que no forem coletadas no tubo BD PPT contendo

anticoagulante K2 EDTA e gel de polister;

A temperatura do espao fsico destinado ao teste deve ser monitorada e mantida entre

15 e 25C.

Utilizar gua destilada/deionizada.



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PPPlllaaatttaaafffooorrrmmmaaa NNNAAATTT NNNaaaccciiiooonnnaaalll

A plataforma integrada para o Teste de cidos Nuclicos Brasileiro foi desenvolvida por

Bio-Manguinhos para a Hemorrede Nacional, integrando tecnologias modernas existentes no

mercado. A plataforma Brasileira NAT Multiplex HIV/HCV, contm os equipamentos JANUS

(PerkinElmer) (Fig.: 24), BioRobot MDx (Qiagen) (Fig.: 25) e Termociclador ABI 7500 (Life

Technologies) (Fig.: 26).

JANUS = Estao de pipetagem automtica (funes: Preparo do pool, Confeco da

mistura da reao de PCR e Pipetagem da mesma na microplaca de 96 poos).

Fig. 24: Fotografia do equipamento Janus vista frontal.

BioRobot MDx = Dispositivo de purificao simultnea de DNA e RNA (Lise, Extrao

e Purificao).

Fig. 25: Equipamento MDx (Visualizao interna).



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Termociclador ABI 7500 = PCR em Tempo Real (Amplificao e Deteco).

Fig. 26: Foto ilustrativa do equipamento ABI 7500.

As amostras biolgicas a serem testadas sero misturadas em um conjunto (pool) de

seis amostras que, ainda na etapa inicial, ter a partcula calibradora adicionada. O material

completo (pool de amostras + partcula calibradora) ser submetido lise celular e o material

gentico ser purificado e estabilizado. A mistura de PCR acrescentada ao material gentico

Guia de Treinamento NAT HIV-HCV

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