Guilherme PereiraIsabela Ascencio

Rafael Della ColettaRaquel PeronSuzane Saito

Introdução

“Um animal que possui seu genoma modificado artificialmente pelo homem, quer por meio da introdução, quer da alteração ou

da inativação de um gene. Esse processo deve culminar na alteração da informação genética contida em todas as células

desse animal, até mesmo nas células germinativas, fazendo com que essa modificação seja transmitida aos descendentes”

(Federação Européia das Associações de Ciência em Animais de Laboratório)

Animal Transgênico

Tópicos Abordados

• Como são “produzidos” estes animais?– Cultivo de células, processos de transfecção e

geração do animal

• Aonde e para quê são utilizados?

• Outros exemplos

• Algumas considerações

Cultivo de Células Animais

• Cultura de células animais pequenas quantidades tecidos específicos

• Colocados meio de cultura com proteases para quebrar ligação entre células

• Trocada de meio e adição Fetal Bovine Serum - Soro Fetal Bovino (suplementação nutricional da célula-tronco e células iPS)

• Dois tipos de linhagens celulares: – Células mortais– Células imortais

Definições

• Transfecção= inserção DNA exógeno dentro célula animal• 2 estágios:

1= inserção dentro célula2= integração ao genoma

• Transfecção transitória: modo rápido de analise de genes exógenos e seus produtos uma vez que a célula degrada o DNA inserido durante divisão celular

• Transfecção estável: DNA exógeno é integrado genoma do hospedeiro e é replicado junto com o cromossomo do mesmo e a expressão do gene pode ou não ocorrer

DNA exógeno precipitado pelo CaCl2 e incorporado via endocitose

Eficiência 1-2%

Transfecção Química

Transfecção Mediada Lipossomo

Esferas de lipídios catiônicos são usadas para encapsular DNA

Lipossomo carregado se liga a membrana plasmática e ocorre transferência DNA

Transfecção

• Peptídeos: algumas sequências de peptídeos podem ser ligar ao DNA e promover transfecção por endocitose

• Direta: através de plasmídio com gene de interesse inserido diretamente no núcleo baixa eficiência quando comparado a por lipossomos

• SV40: vírus dupla fita encontrado em primatas que infecta células dos rins e células mamarias variadas limitado pelo tamanho DNA exógeno 2300 bp

• Eletroporação: desestabilização membrana plasmática por exposição a campo elétrico

Transfecção Adenovírus

Vetor com capacidade transferir 7 Kbp de DNA exógeno

Expressão transiente de genes

Utilizado terapia gênica

Transfecção Adeno-Associated Virus (AAV)Vírus não descrito associado família parvovírus

DNA fita simples; naturalmente deficiente na replicação

Requer a presença de outro vírus para completar seu ciclo; inseri DNA no cromossomo 19 apenas

Habilidade infectar vários tipos celulares

Transfecção Retrovírus2 fitas simples de RNA parecidas com mRNA; utiliza transcriptase reversa

Infecção por ligação específica do envelope viral com receptores da membrana do hospedeiro

Desvantagens: i.efeitos deletérios

ii. classe HTLV requer células em processo divisão para que ocorra infecção

iii.classe HIV não requer células em divisão, mas sua utilização como vetor não é segura

Marcadores Seleção e Amplificação de Genes

Marcadores mais utilizados são os que conferem resistência a drogas: antibióticos entre outros

Genes de resistência a drogas são inseridos juntamente com o gene de interesse e expressos no genoma do hospedeiro

Com o passar das gerações pode ocorrer amplificação da resistência

Expressão Genes em Células Animais

• Expressão está intimamente ligada aos elementos de controle de transcrição e tradução

• Muitos promotores que regulam expressão em animais são constitutivos

• Alguns fortes promotores constitutivos são: adenovírus MPL, SV40, Rous sarcoma vírus etc.

Principais Métodos

• Injeção Pronuclear

• Células Tronco Embrionárias

• Transferência Nuclear

Injeção Pronuclear

• Pronúcleo masculino – Maior• Pronúcleo feminino – Menor• Transfecção direta do DNA

– Antes da fusão dos pronúcleos– in vitro – Mórula– Filhotes heterozigotos

• Cruzamento para homozigose

Injeção Pronuclear

• Vantagem– Não precisa de vetor

• Desvantagem– Não pode ser utilizado para knockout– Inserção aleatória

• Afeta expressão

– Mosaico• Transgene integra depois da primeira divisão celular• Múltiplas inserções

Células Tronco Embrionárias

• Células internas de blastocistos• in vitro – células separadas• Transfecção com plasmídeo• Introdução em novos blastocistos• Quimeras

– Cruzamento com não-transgênico – heterozigoto– Cruzamento entre heterozigotos

Células Tronco Embrionárias

• Vantagens– Eficiência na recombinação homóloga– Knockout e alterações em genes

• Desvantagens– Ocorrem recombinações não-homólogas

Knockout

• 3 classes geradas– Letal

• Analisada em heterozigose

– Fenótipo não-observável• Genes compensando a função• Técnica pouco desenvolvida

– Fenótipo observável• Conferir background da linhagem• Tempo e custo

Knockout

• Sítios de loxP + Cre recombinase– Transfecção com plasmídeo– Cre com promotor induzível

• Interferon - presença• Tetraciclina - ausência

– Gene marcador de resistência• Indesejados no animal

– Usado em fenótipos letais• Gene flanqueado por loxP• Knockout após nascimento

Transferência Nuclear

• Produzir óvulo anucleado• Inserir novo núcleo• Ex: ovelha Dolly

– Célula doadora quiescente– Fusão celular– 277 fusões - > Dolly– DNA mitocondrial ≠

Transferência Nuclear

• Possíveis vantagens– Produção de proteínas recombinantes– Xenotransplante

• Desvantagens– Ineficiência– Anormalidades – embriões e gestação– Idade genética - telômeros– Padrões de metilação

Terapia Gênica

• Modificar expressão de genes– Tratar, curar ou prevenir doenças

• Germ-line gene therapy– Modificações em gametas– Proibido na maioria dos países

• Somatic gene therapy– Não passa para próxima geração– in vivo e ex vivo

• Não tem muitos resultados positivos

Medicina

• Modelos de estudo:– Causas, progressão, estágios e sintomas de doenças

cardiovasculares, auto-imunes, neurológicas, etc.

• Terapia gênica• Xenotransplante:

– Transplante de órgãos e tecidos de animais em seres humanos– Aumenta estoque de órgãos– Grande obstáculo sistema imune reconhece e destrói todas

as células que não possuem marcadores específicos humanos na sua superfície (rejeição)

Medicina

• Xenotransplante:– Porém, porcos transgênicos com gene que codifica uma

proteína da superfície de células humanas sistema imune não ataca

– Ou porcos transgênicos sem a enzima 1,3-galactosiltransferase na superfície do órgão animal sistema imune não ataca

– Apesar do grande potencial muitos outros estudos devem ser feitos (microrganismos latentes, questões éticas, etc.)

Pecuária

• Introdução de características desejáveis:– Menos tempo e mais precisão– Sem cruzamento seletivo, nem uso de hormônios– Exemplos:

• Vacas dão mais leite ou leite com menos lactose ou com menos colesterol

• Porcos e bovinos produzem mais carne, resistente a doenças

• Ovelhas produzem mais lã

Pecuária

• Animais como biorreatores:– Produção de proteínas recombinantes humanas

de grande interesse biológico e comercial, como enzimas, hormônios e fatores de crescimento

– Geralmente são expressas no leite suprir carências nutricionais, tratar doenças (hemofilia, por exemplo), etc.

Indústria

• Indústria farmacêutica:– Utilização de modelos animais (camundongos) no

desenvolvimento de novas drogas.– Um gene é retirado do genoma do animal pela

técnica de knockout e, em substituição, um gene humano é inserido pelo método de adição gênica.

– Facilita o desenvolvimento de novos medicamentos, diminui custos e tempo.

• Janeiro 2012• Terapia com células-tronco embrionárias em humanos• Tratamento em 2 mulheres• Injeções nos olhos• Células injetadas foram derivadas de uma antiga

linhagem de CTEs• Tratamento imunossupressor• Melhora pequena, mas animadora

http://www.robertlanza.com/

Caso Malária/Dengue

• Malária 2,1 milhões de mortes por ano no mundo

• Dengue:

Caso Malária/Dengue

• Áreas endêmicas:– Programas de prevenção, combate e controle

dessas doenças estão comprometidas

• O que fazer então?

Utilizar mosquitos transgênicos para bloquear oureduzir a transmissão da doença

Modelos para estudo é o da malária aviária (serve como baseantes de testar o sistema da malária humana)

Caso Malária/Dengue

• Como?– Conhecer o ciclo de vida do parasita dentro do

mosquito– Para o parasita penetrar nas glândulas salivares do

mosquito, ele precisa estar recoberto pela proteína CSP

– Existe um soro (N2H6D5) que funciona como anticorpo para a proteína CSP e impede a passagem do parasita para a glândula salivar

Caso Malária/Dengue

• Construíram um gene para produção deste anticorpo

• Introdução do transgene no mosquito através de vírus recombinantes

• Mosquitos expostos a pintainhos infectados com o parasita (Plasmodium gallinaceum)

• Mosquitos que expressam o transgene reduziram 99,8% o número de parasitas na glândula salivar

Considerações Finais

• Ferramenta muito poderosa• Auxilia muito no desenvolvimento da medicina• Permite a prevenção, tratamento e cura de doenças

• Mas exige muita pesquisa:– Não pode haver equívocos – É necessário conhecer todas as consequências da

introdução de um novo gene no organismo

• Deve atuar em conjunto com outras técnicas

Considerações FinaisApesar do intenso estudo e pesquisa sobre animais

transgênicos e suas consequências

Muitas pessoas não aceitam!

Considerações Finais

Pressão popular pode atrapalhar odesenvolvimento das pesquisas

Como lidar com esta situação?Como demonstrar a confiabilidade destas pesquisas?

CAPURRO, M.L.; et al. Mosquitos transgênicos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 2001.

LANZA, R.; et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancenet, 2012.

PESQUERO, J.B.; et al. Animais transgênicos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 2002.

PESQUERO, J.B.; et al. Aplicações dos animais transgênicos. Scientific American Brasil, 2007.

REECE, R.J. Analysis of genes and genomes (Cap. 12 e 13) 2004.