4

Herakles Antonio García Pérez

Diagnóstico, caracterização molecular e

epidemiologia de tripanossomas

de ungulados

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Área de concentração: Parasitologia

Orientadora: Profa. Dra. Marta Maria Geraldes Teixeira

Versão original

São Paulo 2012

12

RESUMO

García HA. Diagnóstico, caracterização molecular e epidemiologia de tripanossomas de ungulados. [Tese (Doutorado em Parasitologia)]. São São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2012.

As espécies do gênero Trypanosoma são parasitas heteroxênicos com distribuição mundial e ampla

diversidade de hospedeiros. Ungulados domésticos e silvestres podem ser infectados por diversas espécies de

tripanossomas. Diversos fatores eco-biogeográficos atuam na distribuição, diversidade e densidade das

populações de vetores e hospedeiros, modulando as interações com os tripanossomas. T. vivax, T. evansi, T.

equiperdum, T. congolense, T. b. brucei e T. simiae são de origem africana e patogênicos para bovinos,

bufalinos, ovinos, caprinos, equinos e suínos. Com exceção de T. vivax, T. evansi e T. equiperdum, as demais

espécies estão restritas ao continente africano, onde circulam entre ungulados selvagens e são ciclicamente

transmitidas por moscas tsé-tsé ou mecanicamente por diversas moscas hematófagas. Outros tripanossomas

com distribuição mundial, T. theileri e espécies relacionadas, também infectam ruminantes. Apesar da limitada

patogenicidade, fatores associados à condição imune do hospedeiro podem determinar infecções graves.

Compreender a epidemiologia e as interações entre vetores, tripanossomas e hospedeiros requer

estudos abrangentes de estrutura populacional, filogeografia, diversidade e relações filogenéticas entre isolados.

Estudos de epidemiologia molecular que visam a identificar e melhor entender a distribuição geográfica e as

associações com espécies e genótipos demandam o desenvolvimento de testes diagnósticos específicos e

sensíveis. Com esse intuito, foram desenvolvidos e avaliados métodos para diagnóstico e genotipagem

moleculares baseados em sequências de DNA codificadoras ou não, com diferentes taxas de evolução, e

marcadores de microssatélites. Esses marcadores foram empregados em estudos de diversidade genética e

filogeografia de tripanossomas em amostras de sangue de animais domésticos e selvagens com infecções

naturais e experimentais. Sequências do gene codificador da enzima catepsina L-“like” (CATL) foram

empregadas com sucesso como alvos em reações de PCR para o diagnóstico específico de T. vivax (TviCATL-

PCR) em amostras de sangue de ovelhas, bois, cavalos, búfalos, cabras, antílopes, e também em moscas tsé-

tsé. Sequências do gene CATL de T. theileri foram caracterizadas e empregadas para o desenvolvimento de um

método diagnóstico (TthCATL-PCR) aplicado em estudos de populações de T. theileri em ruminantes

domésticos e selvagens. Sequências parciais de CATL permitiram também definir genótipos dessas espécies na

Venezuela, Brasil, Moçambique e Tailândia, em concordância com os genótipos estabelecidos com marcadores

de genes ribossômicos.

O emprego do método TviCATL-PCR permitiu avaliar a ocorrência de surtos de infecção por T. vivax em

ovelhas, bois e cavalos de regiões não endêmicas do Brasil e, em conjunto com marcadores de microssatélites e

sequências dos espaçadores internos transcritos dos genes ribossômicos (ITS rDNA), caracterizar os genótipos

presentes nestes surtos. Também foi possível avaliar a diversidade e comparar os genótipos de áreas

endêmicas da Venezuela, Brasil e países do Oeste e Leste da África e efetuar análises filogeográficas que

13

suportaram a introdução dos isolados de T. vivax na América do Sul a partir do Oeste da África, assim como

entender melhor o relacionamento entre isolados do leste e oeste da África. O mesmo ensaio de PCR provou ser

uma ferramenta valiosa na detecção de DNA dos parasitas em diversos tecidos, o que permitiu elucidar alguns

aspectos da patogênese da tripanossomose por T. vivax.

Para o estudo de T. theileri e espécies relacionadas, foram empregadas sequências dos genes

gGAPDH e citocromo b em inferências filogenéticas de genes isolados e combinados com sequências de SSU

rRNA, ITS rDNA, Spliced Leader (SL), 5S rRNA e CATL. As análises filogeográficas efetuadas em populações

simpátricas e alopátricas de T. theileri de bovinos e T. theileri-“like” de búfalos, comparadas com espécies do

subgênero Megatrypanum parasitas de cervos, antílopes e ovelhas, determinaram duas linhagens filogenéticas

principais nesse subgênero (TthI e TthII). Essas análises também definiram dez genótipos associados aos

hospedeiros vertebrados que evidenciam a existência de grande restrição de hospedeiros, sugerindo a

existência de processos de seleção de espécies/genótipos nos hospedeiros ruminantes. Abordagem semelhante

foi empregada no posicionamento filogenético de T. melophagium, parasita exclusivo de ovelhas transmitido por

hipoboscídeos, como uma espécie separada, embora fortemente relacionada com as demais do subgênero

Megatrypanum. Análises realizadas com amostras de sangue, evitando assim a seleção de genótipos em

culturas, revelaram uma ampla diversidade de sequências de CATL em bois da Tailândia, revelando a existência

de novos genótipos, infecções mistas e uma complexa diversidade genética no subgênero Megatrypanum.

Análises de polimorfismo de genes que codificam o receptor da transferrina (ESAG6) em tripanossomas

do subgênero Trypanozoon indicaram um importante polimorfismo em isolados de T. evansi de animais

domésticos e selvagens do Brasil e da Venezuela, que foram comparados com sequências do Egito e Tailândia.

Foram definidas 55 variantes alélicas, algumas descritas pela primeira vez e agrupadas em clados separados,

enquanto outras variantes foram agrupadas nos clados já definidos. O estudo realizado com isolados

venezuelanos e brasileiros de T. evansi mostrou, pela primeira vez, um maior número de alelos nas amostras de

animais selvagens, não submetidas a seleção por drogas ou seleção em modelos experimentais. O amplo

repertório de sequências dos genes ESAG6 nas populações de T. evansi concorda com a ampla diversidade de

espécies de mamíferos que podem ser infectados por essa espécie.

Palavras-chave: Trypanosoma. Diagnóstico. Ungulados. Genes ribossômico. gGAPDH. ESAG6.

Catepsina. Filogeografia. Mini-exon. Citocromo b. Epidemiologia. Genótipos.

14

ABSTRACT

Garcia HA. Diagnosis, molecular characterization and epidemiology of trypanosomes from ungulates. [Thesis (Ph.D. Parasitology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2012.

The species of the Trypanosoma genus are heteroxeneous parasites with a worldwide distribution and

wide host range. Domestic and wild ungulates can be infected by several species of trypanosomes. Several

factors influence eco-biogeographic distribution, diversity, and density of populations of vectors and hosts by

modulating interactions with trypanosomes. T. vivax, T. evansi, T. equiperdum, T. congolense, T. b. brucei, and

T. simiae are of African origin and pathogenic for cattle, buffalo, sheep, goats, horses and pigs. With the

exception of T. vivax, T. evansi, and T. equiperdum, these species are restricted to Africa, where they circulate

among wild ungulates and are transmitted cyclically by tsetse flies, or mechanically by several bloodsucking flies.

Worldwide occurring T. theileri and related species also infect ruminants. Despite limited pathogenicity, some

factors associated with immune status of the host may lead to severe infections.

Understanding the epidemiology and interactions between vectors, hosts, and trypanosomes requires a

comprehensive study of population structure, phylogeography, diversity, and phylogenetic relationships among

isolates. Molecular epidemiology studies that aim to identify and better understand the geographical distribution

and associations with species and genotypes require the development of specific and sensitive diagnostic tests.

To that end, we developed and evaluated methods for molecular diagnosis and genotyping based on DNA

sequences, protein-coding or not and presenting different rates of evolution, and microsatellite markers. These

markers were used in studies of genetic diversity and phylogeography of trypanosomes in blood samples from

domestic and wild animals in natural and experimental infections. Sequences of the gene encoding cathepsin L-

like (CATL) were successfully employed as targets in PCR reactions for the specific diagnosis of T. vivax

(TviCATL-PCR) in blood samples from sheep, cattle, horses, buffaloes, goats, antelopes, and also in tsetse flies.

Sequences of CATL genes from T. theileri were also characterized and used to develop a diagnostic method

(TthCATL-PCR) for studies of T. theileri populations in domestic and wild ruminants. Partial sequences of CATL

genes also allowed us to define genotypes of these trypanosome species in Venezuela, Brazil, Mozambique, and

Thailand, in agreement with genotypes defined using ribosomal markers.

The use of the TviCATL-PCR method allowed us to evaluate the occurrence of outbreaks of T. vivax

infection in sheep, cattle, and horses from non-endemic regions of Brazil and, in conjunction with microsatellite

markers and sequences of the ribosomal genes internal transcribed spacers (ITS rDNA), to characterize the

genotypes present in these outbreaks. It was also possible to evaluate and compare the diversity of genotypes in

endemic areas of Venezuela, Brazil, and countries of West and East Africa and construct phylogeographic

analyses that supported the introduction of the isolates of T. vivax in South America from West Africa, as well as

better understand the relationship between isolates of eastern and western Africa. The same PCR assay proved

to be a valuable tool for the detection of DNA from parasites in various tissues, allowing us to elucidate some

aspects of the pathogenesis of trypanosomosis by T. vivax.

15

To study T. theileri and related species, sequences of gGAPDH and cytochrome b genes were used in

phylogenetic inferences using single genes or combining them with sequences of SSU rRNA, ITS rDNA, spliced

Leader (SL), 5S rRNA, and CATL. The phylogeographic analyses performed in sympatric and allopatric

populations of T. theileri from cattle and T. theileri-like from buffalo, compared with other species of the subgenus

Megatrypanum parasitizing deer, antelope and sheep, led to the definition of two major phylogenetic lineages

(TthI and TthII). These analyses also defined ten genotypes associated with vertebrate hosts, which shows

evidence of severe host restriction, suggesting the existence of species/genotype selection mechanisms in

ruminant hosts. A similar approach was used in the phylogenetic positioning of T. melophagium, a parasite

exclusive of sheep and transmitted by hippoboscids, as a separate species, although closely related to other

species of the Megatrypanum subgenus. Analyses performed with blood samples, thus avoiding the selection of

genotypes in culture, revealed a wide diversity of CATL sequences in cattle from Thailand, revealing the

existence of new genotypes, mixed infections, and a complex genetic diversity and population structure of the

subgenus. Polymorphism analysis of genes encoding the transferrin receptor (ESAG6) in trypanosomes of the

subgenus Trypanozoon reveled an important polymorphism in strains of T. evansi from domestic and wild

animals from Brazil and Venezuela, which were compared with sequences from Africa and Thailand. Fifty five

allelic variants were identified, some newly described and grouped into separate clades, while other variants were

grouped in previously defined clades. The study of Venezuelan and Brazilian isolates of T. evansi showed, for the

first time in wild animals, a large number of alleles in samples not submitted to selection by drugs or experimental

models. The wide repertoire of ESAG6 gene sequences in T. evansi populations agrees with the broad diversity

of mammalian species that can be infected by this trypanosome.

Keywords: Trypanosoma. Diagnosis. Ungulates. Ribosomal genes. gGAPDH. ESAG6. Cathepsin.

Phylogeography. Mini-exon. Cytochrome b. Epidemiology. Genotypes.

20

1 INTRODUÇÃO

1.1 O gênero Trypanosoma

O gênero Trypanosoma (Gruby, 1843) pertence à Família Trypanosomatidae (Doflein, 1901), que

compreende protozoários flagelados pertencentes à classe Kinetoplastea. Os cinetoplastídeos,

conjuntamente com díplonemideos (classe Diplonemea) e euglenóides (classe Euglenoidea), formam o

filo Euglenozoa do infra-reino Euglenozoa, sub-reino Eozoa, reino Protozoa (Cavalier-Smith, 2010). A

classe Kinetoplastea agrupa as subordens Trypanosomatina, que alberga na família Trypanosomatidae

parasitas monoxênicos ou heteroxênicos de plantas e animais invertebrados e vertebrados (Simpson et

al., 2006; Stevens, 2008), assim como a subordem Bodonina que compreende parasitas de peixes e

organismos de vida livre adaptados a diversos ambientes aquáticos e terrestres.

A família Trypanosomatidae representa um agrupamento monofilético de parasitas obrigatórios de

ampla prevalência, distribuição geográfica e nichos ecológicos, extensa diversidade de hospedeiros

(incluindo vertebrados, invertebrados e plantas) e grande interesse médico e veterinário. Ao mesmo

tempo, por representarem eucariotos unicelulares muito ancestrais, constituem importantes modelos

nos estudos da evolução desse grupo. Nesta família se agrupam nove gêneros de tripanossomatídeos:

Blastocrithidia, Crithidia, Herpetomonas, Leptomonas, e Rynchoidomonas, parasitas monoxênicos de

insetos; Endotrypanum, Leishmania, e Trypanosoma, protozoários heteroxênicos com ciclo biológico

alternante entre hospedeiros vertebrados e invertebrados; e o gênero Phytomonas, parasita

heteroxênico de insetos e plantas. Foram propostos os gêneros Wallaceina e Sergeia (Podlipaev, 2001;

Svobodová et al., 2007), albergando protozoarios monoxênicos de insetos, e os gêneros Angomonas e

Strigomonas, com endosimbiontes bacterianos (Teixeira et al., 2011).

O gênero Trypanosoma alberga espécies que abrangem uma ampla diversidade de hospedeiros,

com espécies descritas em todas as classes de vertebrados: peixes, répteis, anfíbios, aves e

mamíferos. Isto, juntamente com a ampla distribuição geográfica, nichos ecológicos, variedade de

ecótopos e mecanismos de transmissão, reflete a imensa diversidade biológica do gênero, embora a

maior parte dos estudos nesta área têm se restringido a tripanossomatídeos patogênicos de interesse

médico humano e veterinário. No entanto, a maior parte das espécies de tripanossomas desenvolve

seus ciclos de transmissão entre hospedeiros naturais silvestres, que agem como reservatórios, e

hospedeiros invertebrados, que atuam como vetores, sendo a maioria das espécies não patogênicas

para o homem.

Os tripanossomas são parasitas com complexos ciclos de vida, com alternância entre hospedeiros

vertebrados e invertebrados hematófagos. O desenvolvimento, a diferenciação e o tamanho das

21

populações de parasitas em cada um dos sistemas biológicos que representam os hospedeiros,

envolve complexas interações, determinantes para a sobrevivência e o sucesso dos ciclos de

transmissão. Fatores que influenciam a diversidade biológica, densidade populacional dos vetores e

resposta imune dos hospedeiros vertebrados são também importantes nessas interações, sendo

possível evidenciar ciclos de transmissão enzoótico com relevantes associações entre vetores,

hospedeiros vertebrados e nichos ecológicos. A diversidade biológica do gênero Trypanosoma é

refletida também na diversidade de seus vetores hematófagos. Estes incluem organismos das ordens

Díptera (moscas e mosquitos), Hemíptera (triatomíneos), Siphonaptera (pulgas), Parasitiforme

(carrapatos) e anelídeos (sanguessugas) (Hoare, 1972; Simpson et al., 2006; Hamilton et al., 2007).

Ao longo do ciclo de vida nos hospedeiros vertebrados e invertebrados, as espécies de

tripanossomas podem se apresentar sob a forma amastigota, epimastigota, tripomastigota e,

raramente, promastigota. Morfologias são definidas com base na posição do cinetoplasto em relação

ao núcleo do parasita e da presença ou não de flagelo livre, assim como a existência e grau de

desenvolvimento da membrana ondulante (Hoare, 1972; Wallace, 1979; Vickerman, 1994).

Tradicionalmete, as espécies de Trypanosoma eram descritas empregando-se critérios taxonômicos

tradicionais: morfologia do parasita no sangue e no vetor, aspectos biológicos, hospedeiro e origem

geográfica. Com base nesses critérios, os tripanossomas de mamíferos foram classificados em

subgêneros e centenas de espécies foram descritas em mamíferos, com muitas infecções mistas

devido ao fato que mais de uma espécie de tripanossoma pode infectar o mesmo hospedeiro.

No ciclo de vida dos tripanossomas, as formas “infectantes” denominadas tripomastigotas

sanguíneos são ingeridas pelos vetores, nos quais sofrem transformações morfológicas e bioquímicas

para se adaptar as condições no microambiente do hospedeiro invertebrado e garantir o

desenvolvimento dos estágios de replicação para, finalmente, se diferenciar em tripomastigotas

metacíclicas que representam as formas infectantes para o vertebrado. O local de desenvolvimento e

diferenciação das formas infectantes no invertebrado determina a via de transmissão dos

tripanossomas. Estes processos podem se suceder no tubo digestivo ou nas glândulas salivares do

vetor, determinando transmissão por contaminação ou inoculação, respectivamente (Hoare, 1972).

Características biológicas particulares do processo de hematofagia dos diversos vetores contribuem ao

sucesso da transmissão dos tripanossomas. Um fato importante é que, com a exceção de

Trypanosoma rangeli, a maioria dos tripanossomas emprega apenas uma destas vias de transmissão

(D’Alessandro, Saraiva, 1999).

Em uma tentativa de reorganizar a taxonomia de diversas espécies descritas como tripanossomas

de mamíferos, Hoare (1964), adicionou aos critérios tradicionais de classificação, informações

relacionadas ao local de desenvolvimento e diferenciação dos tripanossomas no hospedeiro

22

invertebrado e via de eliminação das formas metacíclicas como critérios taxonômicos para dividir o

gênero Trypanosoma nas Secções Stercoraria e Salivaria.

A Secção Salivaria alberga os subgêneros Duttonella, Trypanozoon, Pycnomonas e Nannomonas,

tripanossomas de origem africana. As espécies desses subgêneros são consideradas patogênicas para

seus hospedeiros mamíferos, embora nos ciclos naturais circulem como enzootias nos reservatórios

silvestres. As espécies desta Secção têm como vetor biológico dípteros do gênero Glossina (mosca

tsétsé), as quais se distribuem numa ampla região da África sub-sahariana, com grupos de espécies

associadas aos diversos ecótopos da região. Nesses vetores, embora os tripanossomas possam se

desenvolver no tubo digestivo, glândulas salivares, probóscide ou simultaneamente em algumas destas

porções do vetor, a transmissão acontece com a inoculação das formas tripomastigotas metacíclicas

durante o processo de repasto sanguíneo. Os tripanossomas desta Secção, com exceção de T. evansi

e T. equiperdum, passam por diferentes estágios de desenvolvimento no vetor. Para as duas espécies

acima citadas, a transmissão é exclusivamente mecânica, envolvendo vetores hematófagos (T. evansi)

ou ausência de vetores (T. equiperdum). Na ausência da mosca tsétsé, apenas os tripanossomas

africanos mecanicamente transmitidos podem se propagar. Neste sentido, além das duas espécies

anteriores, T. vivax também tem se adaptado a transmissão mecânica, sendo estas três espécies as

únicas que se difundiram fora do continente africano: T. evansi apresenta uma distribuição que abrange

America do Sul, Ásia e Europa; T. vivax está amplamente difundido na America do Sul e Central e T.

equiperdum nas Américas e na Ásia (Hoare, 1972; Stevens et al., 2001; Hamilton et al., 2007; Stevens,

2008). Provavelmente, essas espécies foram introduzidas nas Américas com animais trazidos do norte

e oeste da África pelos colonizadores europeus.

Mamíferos de grande interesse econômico, especialmente ungulados, podem ser infectados por

diversas espécies de tripanossomas em todo o mundo. T. vivax, T. evansi, T. equiperdum, T.

congolense, T. b. brucei e T. simiae são agentes de doenças importantes para esses animais na África,

Ásia e Américas Central e do Sul. Essas espécies são patogênicas para bovinos, bufalinos, ovinos,

caprinos, equinos e suínos, sendo todas de origem Africana, onde circulam entre ungulados selvagens

que agem como reservatórios e raramente apresentam sinais clínicos de doença. A distribuição está

diretamente associada à presença de vetores hematófagos.

A Secção Stercoraria compreende os subgêneros Schizotrypanum, Herpetosoma e Megatrypanum,

sendo as espécies-tipo: T. cruzi, T. lewisi e T. theileri, para cada um dos subgêneros, respectivamente

(Hoare, 1964, 1972). Estes parasitas se desenvolvem exclusivamente no tubo digestivo do vetor

biológico e são transmitidas pela contaminação com formas tripomastigotas metacíclicas eliminadas

com as fezes do vetor. As espécies desta Secção apresentam distribuição geográfica variável;

cosmopolita para T. theileri e espécies relacionadas, que infectam ruminantes em todo o mundo

23

(Hoare, 1972, Rodrigues et al., 2003, 2006; Lee et al., 2010), enquanto algumas espécies como T. cruzi

e T. rangeli são encontradas apenas nas Américas Central e do Sul (Hoare, 1972; Guhl, Vallejo, 2003;

Vallejo et al., 2009). Com a exceção de T. cruzi, as espécies desta Secção não infectam o homem é

geralmente não são patogênicas para seus hospedeiros vertebrados, com a exceção de alguns poucos

casos recentemente relatados em humanos de infecção por T. lewisi-“like” (Sarataphan et al., 2007).

1.2 Filogenia e evolução dos tripanossomas

As espécies do gênero Trypanosoma pertencem ao filo Euglenozoa, que alberga organismos cujo

posicionamento na árvore filogenética universal sugere que estejam entre os eucariotos mais

primitivos, tendo provavelmente, divergido logo após a separação dos eucariotos da linhagem

procariótica. O filo Euglenozoa constitui um dos maiores grupos de eucariotos, albergando organismos

unicelulares flagelados com grande diversidade morfológica, genética e ecológica, além de

representarem importantes modelos para o estudo da evolução da linhagem eucariota devido a sua

divergência ancestral. Neste filo se agrupam organismos que apresentam múltiplos estilos de vida,

abrangendo tanto espécies de vida livre como parasitas de todas as classes de vertebrados,

invertebrados e plantas (Busse, Preisfeld, 2003; von der Heyden et al., 2004; Simpson et al., 2004,

2006).

Em uma recente revisão taxonômica efetuada por Cavalier-Smith (2010), o filo Euglenozoa foi

separado do infrareino Excavata, onde estava posicionado (Cavalier-Smith, 2003, 2004; Moreira et al.,

2007), e reclassificado no infrareino Euglenozoa. Esta reorganização foi baseada em filogenias

multigênicas e análises ultraestruturais que mostraram grande divergência entre o filo Euglenozoa e os

outros três filos do infrareino Excavata.

Análises filogenéticas baseadas no estudo de caracteres morfológicos e moleculares permitiram

identificar autapomorfias que sustentaram a monofilia do filo Euglenozoa. No entanto, ainda são

necessários muitos estudos que abranjam representantes das diversas classes do filo, a fim de melhor

compreender o posicionamento do filo em relação aos outros protozoários e as relações filogenéticas

entre os principais grupos (euglenoides, diplonemídeos e cinetoplastídeos) (Simpson, Roger, 2004).

Estudos recentes baseados em filogenia molecular permitiram dividir o filo Euglenozoa em três classes:

Euglenoidea, Diplonemea e Kinetoplastea (Preisfeld et al., 2001; Moreira et al., 2001; Busse, Preisfeld,

2002, 2003; Breglia et al., 2007). Estudos filogenéticos baseados em análises de proteínas e código

genético mitocondrial sustentaram a hipótese de uma maior proximidade filogenética entre

cinetoplastídeos e diplonemídeos, contrastando com inferências baseadas em caracteres morfológicos

que sugeriram maior proximidade entre diplonemídeos e euglenideos. Porem, análises baseadas em

24

filogenia molecular podem refletir diferentes histórias evolutivas dependendo tanto dos organismos e

genes analisados, métodos de inferência usados e grupos externos escolhidos nas análises (Maslov et

al., 1996, 2001; Lukes et al., 2002; Stevens, Rambaut, 2001; Busse, Preisfeld, 2002, 2003; Hughes,

Piontkivska, 2003a; Von der Heyden et al., 2004; Simpson, Roger, 2004; Moreira et al., 2001, 2004). As

análises mais aprimoradas, que têm considerado os diversos fatores antes citados, mostraram que os

tripanossomatídeos constituem um grupo monofilético que evoluiu dos bodonídeos de vida livre

(Hughes, Piontkivska, 2003b; Simpson, Roger, 2004; Moreira et al., 2004; Simpson et al., 2006;

Deschamps et al., 2011).

Recentemente foi sugerido segregar os cinetoplastídeos em duas subordens: Prokinetoplastina,

contendo as espécies basais Ichtyobodo necator e Perkinsiella amoebae, e Metakinetoplastina,

albergando três clados de bodonídeos (Neobodonida, Parabodonida e Eubodonida) e o clado dos

tripanossomatídeos (Trypanossomatida), formado por parasitas da família Trypanosomatidae (Moreira

et al., 2004; Simpson et al., 2006).

A origem dos tripanossomatídeos e do parasitismo na família Trypanosomatidae é também um

assunto muito controverso. Muitas hipóteses têm sido propostas para elucidar se estes organismos

infectaram inicialmente invertebrados e com o surgimento da hematofagia tornaram-se parasitas de

vertebrados, ou se estes organismos eram inicialmente parasitas de vertebrados e então passaram a

infectar insetos hematófagos. A discussão deste tema é ainda um debate aberto e, no cenário

biológico, muito provavelmente o processo de adoção de hospedeiros invertebrados e vertebrados por

parte dos parasitas, assim como também o surgimento do ciclo heteroxênico, ocorreu como um

fenômeno independente diversas vezes ao longo da evolução deste grupo (Vickerman, 1994; Maslov,

Simpson, 1995; Haag et al., 1998; Wright et al., 1999; Dolezel et al., 2000; Stevens et al., 2001; Lukes

et al., 2002; Hamilton et al., 2007). Entretanto, como não existem fósseis de tripanossomatídeos, todas

as hipóteses evolutivas são fundamentadas em reconstrução da história evolutiva baseadas em

filogenia molecular. Quanto maior o numero de táxon e genes avaliados, com topologias congruentes

independentemente do método de reconstrução filogenética ou genes escolhidos, maior robustez terá a

hipótese sugerida. Neste sentido, diversos estudos filogenéticos moleculares sugerem que os

tripanossomatídeos divergiram de bodonídeos de vida livre (Simpson et al., 2002; Simpson, Roger,

2004; Moreira et al., 2004; Deschamps et al., 2011), permitindo a hipótese de que um bodonídeo

aquático adaptado ao parasitismo no ambiente intestinal após ser ingerido por insetos, dando origem

aos tripanossomatídeos de insetos. Posteriormente, com o advento da hematofagia, alguns destes

tripanossomatídeos monexênicos de insetos se adaptaram ao parasitismo em vertebrados ao serem

transmitidos durante o repasto sanguíneo, surgindo assim os ciclos de transmissão heteroxênicos e o

desenvolvimento de espécies que se adaptaram a este modo de vida.

25

Estudos iniciais visando avaliar a monofilia dos tripanossomas mediante reconstruções

filogenéticas baseadas em sequências da subunidade menor do gene ribossômico (SSUrRNA),

sugeriram que este gênero era polifilético (Maslov et al., 1996). Porém, análises posteriores

empregando o mesmo gene e incluindo um maior número de táxons, demonstraram a monofilia do

gênero Trypanosoma (Haag et al., 1998; Stevens et al., 1999b; 2001). A hipótese da origem

monofilética foi corroborada como a mais provável em um estudo efetuado por Piontkivska, Hughes

(2005), embora esses mesmos autores tenham sugerido a polifilia do gênero em um estudo prévio

baseado em sequências ribossômicas (Hughes, Piontkivska, 2003b). Estas situações refletem a

importância da seleção dos grupos externos ou “outgroups”, do número e representatividade dos

diversos táxons analisados e dos diferentes métodos de inferências filogenéticas escolhidos para as

análises.

Similarmente, sequências codificadoras de proteínas (Wiemer et al., 1995; Hashimoto et al., 1995;

Alvarez et al., 1996; Hannaert et al., 1998; Simpson et al., 2002; Lukes et al., 2002; Hamilton et al.,

2007) e filogenias baseadas em análises independentes ou combinadas de genes ribossomais e

codificadores (gGAPDH), incluindo um amplo número de espécies representativas dos diversos grupos

do gênero, também sustentaram a monofilia do gênero Trypanosoma (Stevens et al., 2001; Hamilton et

al., 2004, 2005a, 2007; Ferreira et al., 2007; Viola et al., 2009a,b). Esses estudos indicam um ancestral

comum de todas as espécies de tripanossomas de mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes (Hollar,

Maslov, 1997; Stevens, Gibson, 1999; Wright et al., 1999; Haag et al., 1998; Stevens et al., 1998,

1999b, 2001; Lukes et al., 2002; Simpson et al., 2002; Hamilton et al., 2004). A monofilia do gênero

Trypanosoma, fortemente apoiada em diversas análises moleculares, sugere que este gênero esteja

mais relacionado com espécies do gênero Blastocrithidia (Hamilton et al., 2004, 2007).

Os agrupamentos de espécies de tripanossomas evidenciados durante as análises filogenéticas

moleculares foram definidos como “clados”. Análises iniciais permitiram definir três grandes clados no

gênero Trypanosoma: clado T. brucei, clado T. cruzi e o clado Aquático (Stevens et al., 1998; 1999b;

2001; Hamilton et al., 2004; 2007). Posteriormente, análises filogenéticas abrangentes com grande

número de táxons permitiram estabelecer novos agrupamentos de espécies, alguns com análises muito

robustas, como os clados T. theileri (ruminantes) e T. lewisi (principalmente roedores); outros clados

precisam ainda de reavaliações incluindo maior número de isolados de diversas origens geográficas:

clado T. cyclops, T. avium/T. corvi, clado de lagartos/serpentes e clado de crocodilianos (Hamilton et

al., 2004, 2005a, 2007; Rodrigues et al.,2006; Ferreira et al., 2008; Viola et al., 2009a,b) (Figura 1).

No clado T. brucei estão posicionados os tripanossomas de origem africana que infectam

mamíferos, incluindo o homem, pertencentes à Seção Salivaria (Hoare, 1972). Este grupo apresenta

um alto grau de divergência das demais espécies de tripanossomas que sugerem uma historia

26

evolutiva singular, muito provavelmente confinada a África e associada à presença de seus vetores

naturais, as moscas tsétsé. Estima-se que a divergência entre T. cruzi e T. brucei seja próxima a 100

milhões de anos, no Cretáceo médio, coincidindo com a separação da África e América do Sul. A

diversidade de espécies de moscas tsétsé, assim como dos tripanossomas africanos que estas

transmitem é muito maior nas áreas de abundante densidade e diversidade de hospedeiros selvagens

(reservatórios), particularmente em toda a região da África subsahariana, nas regiões de maior

preservação ambiental (Hamilton et al., 2008; Van den Bossche et al., 2010). O clado T. brucei

(subgênero Trypanozoon) representa um agrupamento monofilético altamente suportado posicionado

em um grande clado junto com outas espécies de origem africana dos subgêneros Duttonella,

Pycnomonas e Nannomonas (Stevens et al., 1999b, 2001; Hamilton et al., 2004; 2007). Apesar destas

espécies se apresentarem como enzootias nos ciclos naturais de transmissão, geralmente são

patogênicas para ungulados domésticos de interesse econômico.

Atualmente, T. cruzi pertence ao clado Schizotrypanum, constituído pelas espécies do subgênero

Schizotrypanum (T. cruzi e tripanossomas exclusivos de morcegos: T. c. marinkellei, T. dionisii, T.

vespertilionis e T. erneyi) (Lima et al., 2012). Esse clado está posicionado no clado principal designado

clado T. cruzi, que também incluí a clado T. rangeli, além de tripanossomas de morcegos, T. conorhini

de ratos e um tripanossoma de canguru isolado na Austrália (Stevens et al., 1999; Hamilton et al.,

2007). Nos primeiros trabalhos sobre esse grupo de espécies, foi sugerido que a origem deste clado

teria sido no super-continente América do Sul/ Antártica/ Austrália em um ancestral dos marsupiais,

após a separação da África (Stevens et al., 1999b; 2001). Entretanto, um estudo posterior descreveu

novos tripanossomas em macacos e carnivoros da África, que foram posicionadoa nesse grande clado.

Recentemente, uma nova espécie de tripanossoma do subgênero Schizotrypanum, T. erneyi, foi

descrita em morcegos do leste da África (Lima et al., 2012). Esses estudos apoiam uma nova hipótese

evolutiva para a origem do clado T. cruzi, possivelmente, associada a um tripanossoma ancestral

parasita de morcegos, que deu origem a espécies restritas de morcegos, como também a espécies que

adquiriam a capacidade de infectar maiferos de outras ordens. Estudos de relacionamento filogéticos e

tempo de divergência entre tripanossomas de morcegos, considerando a evolução e dispersão desses

animais, sugerem que a origem de T. cruzi pode ser bem mais recente (Lima et al., 2012; Hamilton et

al., 2012a,b).

T. rangeli, que foi incluído no clado T. cruzi, é mais relacionado filogenéticamente com espécies do

subgênero Schizotrypanum do que com qualquer outro grupo. T. rangeli e T. cruzi são espécies

restritas as Ámericas, compartilham hospedeiros mamíferos e espécies de vetores, sendo comumente

encontrados em infecções mistas. No entanto, existem grandes diferenças biológicas destas espécies

tanto no hospedeiro vertebrado como no hemíptero vetor. Investigações recentes têm demonstrado que

27

T. rangeli representa um aglomerado monofilético com diversas linhagens filogenéticas sem aparente

relação com os hospedeiros vertebrados, porém, com uma segregação espacial similar àquela

observada com os complexos das espécies de vetores (Maia da Silva et al., 2004a,b; 2007; Urrea et al.,

2011).

O Clado aquático é formado por tripanossomas de vertebrados aquáticos e anfíbios, incluindo um

isolado de ornitorrinco e um isolado de tartaruga. Aparentemente, este clado está relacionado com

sanguessugas aquáticas, as quais podem ter um importante papel em eventos de troca de hospedeiros

(Jakes et al., 2001a,b). A inclusão de novos isolados de anuros nas análises filogenéticas sugere a

subdivisão do clado nos subclados polifiléticos de peixes e anuros (Hamilton et al., 2007; Ferreira et al.,

2007).

O Clado T. theileri foi recentemente proposto por Rodrigues et al. (2006), após uma revisão

filogenética baseada em marcadores moleculares filogeneticamente informativos, onde foi confirmada a

polifilia do subgênero Megatrypanum. Análises baseadas em sequências do gene ribossômico

mostraram que este clado era por T. theileri (espécie-tipo do subgênero Megatrypanum) e espécies

relacionadas (T. theileri-“like”), parasitas exclusivamente de ungulados da ordem artiodátila (Rodrigues

et al., 2003, 2006). Espécies que inicialmente foram incluídas no clado por critérios taxonômicos

tradicionais, pertencentes a diversas ordens de mamíferos (Chiroptera, Monotremata,

Didelphiamorphia, Primata, Rodentia, Xenarthra e Carnívora) (Hoare, 1972; Weinman, 1972), tais como

T. fretasi, T. minasense, T. cyclops, T. legeri, T. conorhini, T. pestanai e T. binneyi, foram excluídas

desse clado devido ao posicionamento em diferentes clados (Rodrigues et al., 2006; Hamilton et al.,

2004, 2007). A espécie filogeneticamente mais relacionada foi T. cyclops, parasita de macaco da Ásia,

posicionado como grupo irmão do clado T. theileri.

As espécies do clado T. theileri são consideradas não patogênicas, apesar de alguns estudos

sugerirem uma patogenicidade potencial para bovinos (Seifi, 1995; Braun et al., 2002). T. theileri é um

parasita comum de bovinos domésticos com distribuição mundial e transmissão cíclica por tabanídeos

(Hoare, 1972; Wells, 1976). Após estudos que reavaliaram a monofilia do subgênero Megatrypanum, T.

theileri e outras espécies/isolados filogeneticamente muito relacionadas encontradas em bovídeos

domésticos (bois, búfalos, ovelhas), silvestres (antílopes) e em cervídeos, foram posicionadas neste

subgênero, constituído exclusivamente por parasitas de ruminantes (Rodrigues et al., 2006; Hatama et

al., 2007; Hamilton et al., 2009).

28

Figura 1 - Árvore de máxima verossimilhança (ML) baseada no gene de SSU rDNA (1986 caracteres) utilizando sequências de tripanossomas e tripanossomatídeos. Os números correspondem aos valores de suporte por “bootstrap” em ML e parcimônia, e probabilidade a posteriori (Bayesiana). (*) corresponde a valores iguais a 100% em todos os testes e (-) a valores menores que 50%.

Fonte: Modificada de Hamilton et al. (2007).

29

Diferente dos tripanossomas africanos patogênicos que infectam diversas espécies de

hospedeiros, os tripanossomas do clado T. theileri são exclusivos de ruminantes e apresentam uma

aparente restrição ao hospedeiro espécie-específica ou por espécies muito relacionadas (Hoare, 1972,

Wells, 1976; Rodrigues et al., 2003; 2006). Entretanto, o elevado grau de relacionamento genético, o

pequeno número de isolados caracterizados e os raros estudos com infecções experimentais são

insuficientes para sustentar hipóteses de restrição aos hospedeiros (Rodrigues et al., 2006; Hamilton et

al., 2009).

O clado T. cyclops apresenta certo grau de complexidade por reunir um tripanossoma de macaco

da Malásia (T. cyclops) (Weinman, 1972), um de marsupial Australiano Wallabia bicolor, um isolado de

anuro e alguns isolados de sanguessugas terrestres da família Haemadipsidae, também da Austrália

(Hamilton et al., 2005a).

O clado T. lewisi representa o grupo de tripanossomas do subgênero Herpetosoma, cuja descrição

inicial, baseada em caracteres tradicionais (Hoare, 1972), incluiu tripanossomas não patogênicos para

seus hospedeiros mamíferos arranjados em dois gruposs: T. lewisi (parasita de roedores transmitidos

por pulgas) e T. rangeli, parasita de mamíferos de diversas ordens, transmitido por hemípteros

hematófagos. No entanto, análises filogenéticas baseadas em sequências ribossômicas e no gene

gGAPDH mostraram a polifilia deste subgênero, que após estudos de revisão taxonômica, T. rangeli e

espécies relacionadas foram excluídas deste clado (Stevens et al., 1999a,b; 2001; Maia da Silva et al.,

2004; 2010), como sugerido por Añez (1982) com base no desenvolvimento em triatomíneos. T. lewisi

(espécie-tipo do subgênero) e espécies relacionadas formaram um agrupamento monofilético que

constituiu o clado T. lewisi, parasitas principalmente de roedores, transmitidos por pulgas e que

apresentam grande especificidade pelo hospedeiro vertebrado. Outros hospedeiros incluem coelhos e

primatas (Hamilton et al., 2005b, 2007; Maia da Silva et al., 2010) e, recentemente, infecções em

humanos foram relatadas (Sarataphan et al., 2007).

Os clados T. avium / T. corvi, incluem a maioria dos isolados de aves, exceto T. benetti (Votýpka et

al., 2002, 2012; Votýpka, Svobodová, 2004) e, juntamente com os clados de isolados de serpentes,

lagartos e crocodilianos (tripanossomas de répteis) (Viola et al., 2008, 2009a,b), são grupos que ainda

precisam estudos abrangentes, que analisem um maior numero de isolados, de diversos hospedeiros e

origens geográficas, a fim de melhor elucidar as relações e posicionamento filogenéticas em relação

aos outros clados de tripanossomas.

30

1.3 Subgênero Megatrypanum

O subgênero Megatrypanum foi criado por Hoare (1964) para agrupar tripanossomas de mamíferos

cujas características morfológicas de maior relevância consistiam na presença de um cinetoplasto mais

próximo do núcleo do que da região posterior do corpo e grandes formas tripomastigotas sangúineas

(31.6µm - 81µm), representando as maiores formas de tripanossomas encontradas em mamíferos (até

130 µm). Com base nos critérios taxonômicos tradicionais (morfologia e hospedeiro de origem),

tripanossomas de praticamente todas as ordens de mamíferos foram classificadas neste subgênero,

com espécies das ordens Artiodactyla e Chiroptera sendo os hospedeiros mais comuns (Hoare, 1972).

A ubiquidade de algumas das espécies descritas no subgênero, como T. theileri (espécie-tipo) e T.

melophagium, foi associada à presença cosmopolita dos hospedeiros vertebrados naturais (boi e

ovelhas, respectivamente. A diversidade de espécies incluídas neste subgênero, proveniente de uma

enorme variedade de hospedeiros vertebrados, apresentava diversos vetores, como pulgas

(Siphonaptera), cimicídios e triatomíneos (Hemíptera), tabanídeos e mosquitos (Díptera), “sandflies”

(Psychodidae) e Hippoboscidae. Estas características já indicavam uma grande complexidade entre as

espécies posicionadas no subgênero Megatrypanum. Os tripanossomas deste subgênero foram

considerados não patogênicos para os seus hospedeiros vertebrados com os quais pareciam ter

estreitas associações (Hoare, 1972).

O subgênero Megatrypanum apresenta T. theileri como espécie-tipo e tem sido a espécie mais

estudada deste grupo, juntamente com T. melophagium, nos aspectos morfológicos, comportamento

em cultura, ciclo biológico e de transmissão (Hoare, 1972; Lu, 1975).

1.3.1 Trypanosoma (Megatrypanum) theileri, espécies associadas e Clado T. theileri.

T. theileri possui distribuição cosmopolita, diretamente relacionada à presença dos seus

hospedeiros naturais, bovinos domésticos, no sangue dos quais as formas epimastigotas se

diferenciam em tripomastigotas que multiplicam se por fissão binária. Geralmente, as parasitemias nas

infecções naturais por este parasita possuem caráter críptico, e as infecções somente são reveladas

por métodos de hemocultura (Herbert, 1964; Hoare, 1972; Wells, 1976). Estudos iniciais do

desenvolvimento desta espécie em bovinos demonstraram distintos estágios de multiplicação por fissão

binária desigual no sangue de hospedeiros com doenças concomitantes, onde os tripanossomas

podem se multiplicar intensamente. No entanto, o curso natural das infecções é geralmente crônico e

assintomático, aparentemente permanecendo assim durante anos sem necessidade de reinfecções,

com parasitas raramente detectados no sangue e sem resistência a infecções posteriores, que são

muito comuns em ambientes naturais. Infecções experimentais em bezerros (Wells, 1976) mostraram

31

variável período de incubação (1-3 semanas), com o sangue do animal permanecendo infectante para

outros animais por períodos muito prolongados. Os baixos níveis de parasitemias indicam tanto

eficientes mecanismos de defesa dos hospedeiros (Townsend et al., 1982; Townsend, Duffus, 1982;

Doherty et al., 1993) quanto mecanismos de evasão da resposta imune por parte dos parasitas,

sugerindo processos de associações parasita/hospedeiros muito antigos.

Ainda é um tema controverso a existência de estágios intracelulares para T. theileri. Formas

intracelulares dessa espécie já foram descritas em linfonodos e em células fagocíticas do baço de

bovinos infectados (Woo et al., 1970; Moulton, Krauss, 1972; Wells, 1976). Além disso, diversas

observações de T. theileri nos linfonodos, baço, rins e cérebro sugerem que este possa ter sítios de

desenvolvimento extravascular (Wells, 1976; Tizard et al., 1980) que poderiam desempenhar um papel

muito importante na sobrevivência dos parasitas em hospedeiros imunocompetentes, uma vez que os

parasitas podem permanecer “sequestrados” em órgãos imunologicamente “ocultos” evadindo, assim,

da resposta imune do hospedeiro. Embora sejam considerados não patogênicos, estes parasitas

possuem uma patogenicidade potencial em vacas prenhes e animais com infecções concomitantes

com outros hemoparasitas, parasitas gastrointestinais ou hospedeiros submetidos a severo estresse

físico ou nutricional, nos quais as parasitemias se tornam elevadas e as infecções podem resultar em

abortos e/ou morte do recém-nascido, observando se uma ampla disseminação dos parasitas em

diversos órgãos, incluindo o sistema nervoso central (Mansfield, 1977; Ward et al., 1984; Seifi, 1995;

Braun et al., 2002; Villa et al., 2008).

As espécies do subgênero Megatrypanum são consideradas altamente restritas aos seus

hospedeiros mamíferos. Infecções experimentais e observações de campo mostraram que estes

tripanossomas não são infectantes para não ruminantes. Tentativas de infecções cruzadas e análises

com marcadores bioquímicos e moleculares corroboraram a restrição de algumas espécies aos seus

hospedeiros mamíferos. Neste sentido, tentativas de infectar ovelhas e cervos com T. theileri isolado de

boi não tiveram sucesso, como também não aquelas de infectar bezerros com tripanossomas de

cervídeos (Hoare, 1972; Wells, 1976; Kingston, Morton, 1975; Böse et al., 1987). Parasitas

morfologicamente indistinguíveis de T. theileri (T. theileri-“like”) foram descritos em uma grande

variedade de hospedeiros da ordem Ruminantia. No entanto, somente T. melophagium (ovinos) e T.

theodori (caprinos) foram validadas como espécies distintas (Hoare, 1972) devido à alta restrição pelos

hospedeiros vertebrados, associadas à alta especificidade dos vetores hipobosídeos (Melophagus

ovinus e Lipoptena capreoli, respectivamente). Outras espécies relacionadas (T. tragelaphi e T.

cephalophi, de antílopes), possivelmente transmitidas por dípteros hematófagos, foram consideradas

espécies sinônimas de T. theileri, enquanto T. mazamarum, um tripanossoma de cervos

32

morfologicamente indistinguível de T. theileri e com transmissão associada a dípteros hematófagos,

também foi mantido como espécie distinta de T. theileri (Hoare, 1972).

A taxonomia das espécies do subgênero Megatrypanum sempre foi baseada exclusivamente em

características morfológicas, hospedeiros de origem e origem geográfica. As inferências sobre restrição

de hospedeiros de T. theileri e T. theileri-“like” se basearam em poucos ensaios de infecções cruzadas.

O advento de marcadores moleculares e estudos filogenéticos tem resultado em avanços significativos

na taxonomia e entendimento das relações entre as espécies desse subgênero. Neste sentido,

Rodrigues et al. (2006), fizeram uma revisão filogenética do subgênero Megatrypanum, que passou a

ser constituído exclusivamente por parasitas de ruminantes agrupados num clado único que continha a

espécie-tipo T. theileri.

Embora T. theileri seja um parasita cosmopolita de bois, a diversidade de hospedeiros do clado T.

theileri é muito abrangente, variando de animais de interesse econômico (bois, búfalos de água, ovinos

e caprinos) a diversos animais silvestres, tais como bovídeos africanos (búfalo africano e antílopes:

“duikers”, “sitatunga”, “nyala”, “kudu” e “eland”), bovídeos Europeus e da América do Norte (“bison”,

“elk”, “moose”, “pronghorn” e “caribou”) e cervídeos nestes mesmos continentes (“fallow”, “red”, “rein”,

“roe” e “mule deer”, entre outros), na América do Sul (“brocket deer”) e na Ásia (“sika deer”) (Reid et al.,

1970; D’Alessandro, Wells, 1971; Hoare, 1972; Mattews et al., 1977; Wells, 1976; Hoffmann et al.,

1984; Kingston et al., 1982; Böse et al., 1993; Lefebvre et al., 1997; Hatama et al., 2007; Johnson et

al., 2010). Os tripanossomas de bovídeos e cervídeos, com as exceções de T. melophagium e T.

theodori, são, aparentemente, transmitidos por espécies de tabanídeos com formas tripomastigotas

sanguíneas serem morfologicamente indistinguíveis de T. theileri. Devido a inúmeros relatos de

sinonímia, Wells (1976) sugeriu que todos os tripanossomas de bovídeos diferentes de bois (Bos

taurus) fossem classificados como T. theileri-“like”.

As similaridades morfológicas, epidemiológicas e ecológicas entre T. theileri e espécies associadas

no subgênero Megatrypanum têm outorgado aos ensaios de infecção cruzada, que avaliam a

potencialidade do parasita de trocar de hospedeiros, um papel fundamental na delimitação de espécies

deste clado. No entanto, classificar tripanossomas provenientes de diferentes espécies de hospedeiros

ruminantes em uma única espécie (T. theileri) ou, ainda, validar mais espécies dentro do clado T.

theileri, exige uma profunda compreensão do relacionamento destes parasitas. Embora infecções

naturais e experimentais tenham sugerido uma forte associação entre T. Megatrypanum e seus

hospedeiros vertebrados (restrição de hospedeiros), os raros estudos com infecções experimentais são

insuficientes para sustentar hipóteses de restrição de hospedeiros (Rodrigues et al., 2006; Hamilton et

al., 2009).

33

A especificidade de hospedeiro é um fenômeno muito complexo que resulta das interações entre

os componentes desse sistema (parasita - hospedeiro) e determina o grau com o qual um parasita

existe em associação com uma determinada espécie de hospedeiro. Depende tanto de características

particulares de cada um dos integrantes da associação, quanto de um conjunto de correlações

evolutivas e ecológicas entre estes. Além disso, nos casos de parasitas transmitidos por vetores, estas

interações podem criar “padrões” nos quais grupos de linhagens de parasitas estreitamente

relacionados mostram especificidade pelo vetor. Porém, esta especificidade é o resultado das

associações vetor / hospedeiro mais do que entre vetor e parasita (Hellgren et al., 2008). O nível de

especificidade que um parasita possui é um fator determinante na dinâmica populacional e

epidemiologia, além de representar um fator “chave” nos processos de evolução e possuir importantes

implicações ao determinar a habilidade do parasita para trocar de hospedeiros.

Diversos padrões observados em espécies de tripanossomas podem se associar tanto com os

hospedeiros vertebrados como com os vetores. Poucas espécies de tripanossomas possuem uma

ampla diversidade de hospedeiros vertebrados (exemplo: T. cruzi, T. rangeli, T. evansi e T. brucei),

enquanto diversas espécies podem se associar a somente um hospedeiro ou a hospedeiros muito

relacionados. Além dos hospedeiros vertebrados, distintos vetores (moscas tsétsé, tabanídeos,

hipoboscídeos, triatomíneos, cimicídeos, pulgas, etc.) podem ser associados a espécies de

tripanossomas muito relacionadas (Rodrigues et al., 2003, 2006; Hamilton et al., 2007, 2009; Viola et

al., 2008; Cavazzana et al., 2010; Maia da Silva et al., 2010).

Elucidar o relacionamento entre parasitas do clado T. theileri exige o emprego de marcadores

moleculares que permitam entender melhor as relações existentes entre estes, fenômenos de restrição

de hospedeiros e ainda detectar de modo confiável a sua presença em amostras de sangue e/ou

culturas. Estudos iniciais baseados em análises de zimodema e características de crescimento de

isolados de boi e búfalo africano sugeriram que um isolado de búfalo fosse uma espécie diferente de T.

theileri (Dirie et al., 1990). Do mesmo modo, padrões de cariótipo e isoenzimas distinguiram isolados de

cervo da Europa e América do Norte, além de separar estes isolados daqueles de boi (Dirie et al.,

1990; Böse et al., 1993). Mais recentemente, sequências de nucleotídeos das regiões do transcrito do

gene do mini-exon (SL) (Gibson et al., 2000) e do espaçador interno transcrito (ITS) do cístrom

ribossômico (Desquesnes et al., 2001) permitiram distinguir T. theileri de outras espécies de

tripanossomas.

Análises de variabilidade genética baseados em perfis de RAPD de isolados de T. theileri de

hospedeiros muito relacionados (boi e búfalo asiático) mostraram uma forte consistência do grupo de

isolados de bovídeos, que foram segregados em dois subclados de acordo com o hospedeiro de

origem, sustentando a idéia da especificidade de hospedeiro para espécies deste subgênero

34

(Rodrigues et al., 2003). Posteriormente, análises filogenéticas baseadas em sequências ribossômicas

(V7V8SSU rDNA) de T. theileri e espécies relacionadas, confirmaram um grupo monofilético fortemente

suportado e exclusivo para espécies da ordem Artiodactyla (clado T. theileri), enquanto análises da

variabilidade intraespecífica baseados em sequências polimórficas das regiões V7V8 SSU rDNA e do

ITS1 rDNA, sugeriram a existência de 5 linhagens filogenéticas (A-E) associadas com hospedeiros

vertebrados, indicando que, embora muito relacionados, isolados de diferentes espécies de

hospedeiros são grupos filogenéticos distintos: Linhagem A: representada por genótipos de búfalo

asiático do Brasil; Linhagem B e C: contendo dois genótipos divergentes de isolados de boi do Brasil;

Linhagem D e E: formados por genótipos encontrados em isolados de boi e cervo europeus,

respectivamente.

T. theileri de bois (Bos taurus) de regiões geográficas diversas (Brasil, USA, Escócia, Alemanha e

Japão), se mostraram filogeneticamente muito relacionados e agruparam junto com isolados de T.

theileri-“like” de búfalo asiático do Brasil, cervos (Europa e Ásia) e Antílopes (África), em um

agrupamento monofilético fortemente suportado em filogenias baseadas nos genes SSU rRNA e

gGAPDH. Todas as análises posicionaram o clado T. theileri muito distante de outras espécies de

tripanossomas, morfologicamente classificadas como T. Megatrypanum, encontradas em espécies

diferentes de artiodátilos (Stevens et al., 1999b; Rodrigues et al., 2006; Hatama et al., 2007; Hamilton

et al., 2007, 2009).

A diversidade molecular dentro do clado T. theileri foi ampliada em um trabalho recente baseado

em sequências da região V7V8 rDNA (Hamilton et al., 2009), com a inclusão de três novos isolados de

antílopes da África. Um isolado de sitatunga foi considerado como uma nova Linhagem (F), enquanto

dois isolados de duiker foram considerados como Linhagens C e E, embora com só um genótipo para

cada uma das linhagens (Hamilton et al., 2009). Porém, o relacionamento obtido baseado

exclusivamente em sequências de V7V8 SSUrDNA não se mostrou bem resolvido, refletindo que essa

região gênica não é um marcador adequado para mostrar relações entre organismos filogeneticamente

muito próximos.

Embora os avanços no entendimento das relações entre isolados de T. theileri de boi e T. theileri-

“like” de espécies relacionadas (búfalos, cervos, antílopes) tenham sido relevantes nos últimos anos,

ainda são necessários estudos adicionais explorando novos marcadores moleculares suficientemente

polimórficos para distinguir associações entre parasitas muito próximos filogeneticamente e para

identificar genótipos crípticos não detectados com as análises de genes conservados. Do mesmo

modo, genes codificadores de proteínas de relevância para a sobrevivência e ciclo biológico dos

parasitas e genes com diferentes taxas de evolução e mecanismos de herança (mitocondriais)

poderiam permitir um melhor entendimento das associações sugeridas com os genes até agora

35

avaliados. Além disso, a restrição de hospedeiros vertebrados deve ser confirmada incluindo isolados

provenientes de áreas geográficas distantes e avaliando condições de simpatria e alopatria de

hospedeiros. Estes análises poderiam melhor resolver questões sobre especificidade de hospedeiros e

variabilidade intraespecífica, permitindo analisar a distribuição espacial de isolados e efetivar estudos

filogeográficos, como tem sido demonstrado em outras espécies de tripanossomas (Fernandes et al.,

1998a; Maia da Silva et al., 2007; Ortiz et al., 2009; Cavazzana et al., 2010).

Recentemente, novos isolados de diferentes hospedeiros foram filogeneticamente posicionados no

clado T. theileri, permitindo melhor avaliar o relacionamento intra clado. Entre estes isolados estão um

isolado de cervo (Cervus nippon yesoensis) do Japão (Hatama et al., 2007), três isolados de antílopes

(Tragelaphus speki e Cephalophus monticola) da África (Hamilton et al., 2009) e um isolado de T.

theileri de boi (Bos taurus) de Taiwan (Lee et al., 2010). Estudos recentes descreveram sequências de

SSUrRNA de T. melophagium isolado a partir do trato digestivo do vetor Melophagus ovinus na

Inglaterra, que apresentou uma alta similaridade de sequencias com T. theileri, sugerindo que essa

espécie represente uma linhagem de T. theileri que se adaptou à transmissão pelo vetor hipoboscídeo

tornado-se, assim, um parasita específico de ovelhas (Gibson et al., 2010).

1.4 Tripanossomas africanos: Subgêneros Duttonella, Trypanozoon, Pycnomonas e

Nannomonas

Desde os primeiros anos da década de 1900 que já se sabia que T. brucei gambiense, o agente

causal da doença do sono, era transmitido pela mosca tsé-tsé (Cox, 2004; Steverding, 2008).

Similarmente, espécies de tripanossomas associados a doenças em bovinos (T. vivax, T. congolense,

T. brucei) foram relacionadas à transmissão por esses dípteros hematófagos obrigatórios (Cox, 2004).

A existência de diferentes espécies de tripanossomas transmitidas por tsé-tsé conduziu ao

desenvolvimento de métodos para sua diferenciação, os quais inicialmente estiveram baseados no sítio

de desenvolvimento no vetor e na morfologia dos parasitas. Nesse sentido, Lloyd e Johnson (1924),

designaram para as espécies T. vivax, T. congolense e T. brucei s.l. os sítios de desenvolvimento

probóscide, probóscide e intestino meio, e glândulas salivares e intestino meio, respectivamente.

Posteriormente, esses sítios de desenvolvimento, conjuntamente com a morfologia e hospedeiro de

origem, foram empregados como critérios de base para a revisão taxonômica dos tripanossomas de

mamíferos proposta por Hoare (1972). Nessa revisão foram definidos os subgêneros Duttonella,

Trypanozoon, Pycnomonas e Nannomonas. No subgênero Duttonella foram agrupadas as espécies

Trypanosoma vivax (espécie-tipo) e T. uniforme; no subgênero Trypanozoon: T. brucei (espécie-tipo),

T. evansi e T. equiperdum, enquanto T. suis constituiu a espécies-tipo do subgênero Pycnomonas. T.

congolense e T. simiae foram agrupados no subgênero Nannomonas, sendo a primeira considerada

36

espécie-tipo. Todos esses parasitas são patogênicos para os hospedeiros vertebrados e possuem um

significativo e reconhecido impacto na saúde humana e veterinária.

Embora os caracteres morfológicos comparativos empregados na diferenciação de espécies

nesses tripanossomas sejam limitados, alguns aspectos da biologia do parasita e da epidemiologia das

doenças geradas permitiram sugerir a existência de subespécies em alguns dos subgêneros. Nesse

sentido, T. vivax vivax, T. v. viennei e T. v. ellipsiprymni foram consideradas subespécies de T. vivax,

enquanto T. brucei brucei, T. b. gambiense e T. b. rhodesiense foram considerados subespécies de T.

brucei. Com a exceção de T. equiperdum, todos estes parasitas tem dípteros hematófagos como

vetores, apresentam um grande número de hospedeiros vertebrados e uma ampla distribuição

geográfica. Na África, são abundantes tanto nas áreas de influência de Glossina spp., quanto nas áreas

livres, onde a transmissão é atribuída a outros hematófagos, principalmente da família Tabanidae. Fora

da África, somente T. evansi e T. vivax estão amplamente distribuídos em regiões com tabanídeos e

outros hematófagos da família Muscidae, como Stomoxys calcitrans e Haematobia irritans (Hoare,

1972). Recentes estudos filogenéticos confirmaram o agrupamento de todos estes subgêneros de

tripanossomas em um grupo monofilético altamente suportado (Stevens et al., 2001; Hamilton et al.,

2004; Adams et al., 2010a) formado apenas por tripanossomas africanos transmitidos por moscas tsé-

tsé.

Em termos epidemiológicos, a ocorrência e disseminação dos tripanossomas do clado T. brucei na

África está fortemente relacionada com a presença das moscas tsé-tsé e suas fontes naturais de

alimentação, constituídas, até umas décadas atrás, fundamentalmente por ungulados e suínos

selvagens, em infecções geralmente assintomáticas (Hoare, 1972). Todas as espécies do gênero

Glossina possuem um comportamento estritamente hematófago e requerem alimentação frequente

(Solano et al., 2010), tendo desenvolvido durante milhões de anos uma estreita associação com as

suas fontes naturais de alimentação (hospedeiros selvagens). Provavelmente, interações recentes

entre vetor-parasita-hospedeiro, com novas espécies servindo com fonte alimentar, modificaram

padrões de transmissão, patogenicidade e impacto na saúde animal. Animais selvagens agindo como

reservatórios de tripanossomas em toda a extensão da área de influência da mosca tsé-tsé, que

abrange aproximadamente 10 milhões km2 na África sub-sahariana (Van den Bossche et al., 2010).

Modificações antropogénicas no meio ambiente natural na área de ação das moscas tsé-tsé têm

gerado importantes mudanças na epidemiologia, dinâmica e impacto dos tripanossomas do clado T.

brucei. O significativo aumento demográfico e a consequente necessidade de fontes de alimentação

humana têm gerado uma forte pressão ambiental e substituição de ambientes naturais por áreas

cultiváveis e de criação de animais de interesse econômico, especialmente ungulados, para os quais as

espécies do clado T. brucei são patogênicas. O nível de impacto na saúde e produtividade depende do

37

grau de adaptação do vetor e dos tripanossomas ao novo ciclo de transmissão, majoritariamente

dependente de animais domésticos como fonte de alimentação das moscas tsé-tsé e como

reservatórios de tripanossomas (Ducheyne et al., 2009; Van den Bossche et al., 2010; Solano et al.,

2010).

Das espécies de tripanossomas do clado T. brucei, apenas T. vivax, T. evansi e T. equiperdum são

encontrados fora da África e, provavelmente, foram introduzidos nas Américas com animais trazidos

desse continente pelos colonizadores europeus, onde se dispersaram devido à adaptação à

transmissão mecânica. T. vivax e T. evansi ocorrem na América Central e do Sul, com diversos graus

de endemia influenciados por características climáticas, demográficas, densidade de vetores

mecânicos, desenvolvimento da agricultura e criação de animais de interesse econômico e

fragmentação do hábitat (Jones, Davila, 2001; Osório et al., 2008; Oliveira et al., 2009 ).

O impacto negativo na saúde e produtividade de animais domésticos infectados por estas espécies

patogênicas têm gerado grande interesse no estudo de seus tripanossomas visando o entendimento da

distribuição geográfica, vetores e dinâmica de transmissão, associações com determinadas espécies

de hospedeiros e vetores, estrutura populacional e diversidade genética. Esses estudos têm revelado

marcadores moleculares úteis para diagnóstico diferencial de espécies, epidemiologia molecular,

desenvolvimento de vacinas e quimioterápicos.

1.4.1 Tripanossomíases por Trypanosoma vivax, considerações epidemiológicas.

Trypanosoma vivax constitui uma das principais espécies transmitidas por moscas tsé-tsé com

impacto negativo na saúde e produtividade de animais de interesse econômico na África. O interesse

no estudo dessa espécie é ainda maior por ser a única das três espécies de tripanossomas de

importância em ungulados na África (T. vivax, T. brucei brucei, T. congolense), que saiu desse

continente, se adaptando a novos hospedeiros e mecanismos de transmissão na ausência do vetor

natural (Moloo et al., 2000; Desquesnes, Dia, 2003, 2004) e se disseminando com grande sucesso no

continente americano (Sul e Centro América). T. vivax possui uma ampla diversidade de hospedeiros

ungulados, fundamentalmente na família Bovidae, no entanto, a presença do parasita no sangue de

equídeos é frequentemente reportada na África (Hoare, 1972, Dhollander et al., 2006; Pinchbeck et al.,

2008; Duffy et al., 2009).

Trypanosoma vivax foi introduzido nas Américas provavelmente nas importações de bois trazidos

da Europa entre dois e quatro séculos atrás (Jones, Dávila, 2001, Osório et al., 2008). Nesse novo

continente, o parasita se adaptou à transmissão mecânica por insetos hematófagos presentes nessas

regiões e se disseminou entre animais domésticos e silvestres nunca antes expostos ao patógeno. O

primeiro relato de tripanossomíases por T. vivax no continente americano foi em gado da Guiana

38

Francesa em 1919 (Leger, Vienne, 1919) e, posteriormente, foram feitos relatos do parasita na

Venezuela (1920), Ilha de Guadalupe e Martinica (1926 e 1929, respectivamente), Colômbia (1931),

Suriname (1938), Panamá (1941), Guiana (1952), no Pantanal da Bolívia (Gonzales et al., 2007) e

recentemente na Costa Rica (Oliveira et al., 2009). No Brasil, o primeiro relato do parasita foi feito em

um búfalo de água nas regiões alagadiças perto de Belém, estado do Pará (Shaw, Lainson, 1972).

Posteriormente, ao final da década de 1970, o protozoário foi relatado em ovinos e bovinos nos estados

de Amapá e Pará (Serra-Freire, 1981) e só uma década depois foi relatado fora da região norte do

país, em bovinos de Poconé no Pantanal brasileiro de Mato Grosso (Silva et al., 1995b, 1996). A

doença foi logo descrita no Pantanal do estado de Mato Grosso do Sul (Paiva et al., 1997), e

possivelmente, esses surtos eram relacionados ao aumento no comércio de gado e deslocamento de

animais e vetores entre as regiões Norte e Centro-Oeste do Brasil. No resto do continente existem

relatos por evidência sorológica da presença de tripanossomíases em El Salvador, Equador, Peru e

Paraguai (Jones, Dávila, 2001; Osório et al., 2008).

Uma característica epidemiológica importante da tripanossomíase por T. vivax refere-se ao fato

que animais domésticos presentes nas regiões endêmicas possuem um nível importante de proteção,

que determina ausência de sinais clínicos nos animais infectados ou uma doença sem risco para a

saúde animal, embora possa ter repercussões na produtividade do rebanho. A exposição prévia ao

parasita parece ser responsável por conferir este nível de proteção, já que animais de regiões não

endêmica são altamente susceptíveis e manifestam doença clínica severa durante uma infecção

primária (Batista et al., 2007). No entanto, fatores inerentes ao hospedeiro (raça, idade, sexo, prenhês,

estado nutricional, estresse de produção, infecções intercorrentes), fatores ambientais (sazonais) e de

manejo animal (deslocamento, vacinação, introdução de animais de regiões endêmicas a regiões livres

da doença), são todos de grande interesse epidemiológico na prevalência e na severidade das

manifestações clínicas da doença.

A tripanossomíase por T. vivax possui diferentes situações epidemiológicas nas diversas regiões

do continente americano. A doença exibe um caráter enzoótico nas principais regiões de criação de

gado bovino e bubalino na Venezuela (García et al., 2005, 2006), assim como nas terras baixas da

Colômbia (Otte et al., 1994), onde o parasita alterna seu ciclo de transmissão entre hospedeiros

ungulados domésticos (ovinos, caprinos, bovinos e bubalinos) (Garcia et al., 2009) e animais silvestres

(Fernandez, 1931; Fiasson et al., 1948). Uma situação epidemiológica similar ocorre atualmente no

Pantanal e na Amazônia brasileira, assim como em algumas regiões da Bolívia, nas quais existe um

equilíbrio enzoótico entre hospedeiros e parasitas, provavelmente alcançado após a ocorrência de

surtos com doença severa (Silva et al., 1995b, 1996, 1998a,b; Paiva et al., 1997). Possivelmente, esse

equilíbrio enzoótico tem sido mantido no tempo por reinfecções frequentes em ciclos de transmissão

39

garantidos pelos vetores mecânicos (Desquesnes et al., 2009). Nessas regiões endêmicas, os animais

infectados são assintomáticos e a mortalidade e morbidade são muito baixas.

Uma situação contrária à acima descrita tem ocorrido nos últimos anos em diversas regiões não

endêmicas para T. vivax no Brasil, com a presença de surtos de doença clínica severa e alta

mortalidade e morbidade, provavelmente associados à introdução do parasita em rebanhos

susceptíveis ou relacionados a condições sazonais específicas que determinam altas taxas de

transmissão por vetores hematófagos e/ou redução da resposta imune dos hospedeiros. Têm sido

descritos surtos com alta morbidade e mortalidade em bovinos em Tocantins (Linhares et al., 2006), em

bovinos, ovinos e caprinos no Semiárido da região Nordeste do Brasil (Paraíba, Batista et al., 2007,

2009; Pernambuco, de Souza Pimentel et al., 2012), no estado de Maranhão (de Candanedo et al.,

2008; de Araujo et al., 2011), em bovinos da região Sudeste no estado de Minas Gerais (Carvalho et

al., 2008; Cuglovici et al., 2010) e na região Sul (Rio Grande do Sul, Da Silva et al., 2009).

A hipótese mais provável da ocorrência dos surtos está baseada na introdução de animais

infectados por T. vivax em áreas livres com animais susceptíveis e alta abundancia sazonal de vetores

mecânicos. No entanto, a severidade das manifestações clínicas que incluem alterações

hematológicas, sinais nervosos, abortos e morte (Batista et al., 2007; de Candanedo et al., 2008; Da

Silva et al., 2009; Cuglovici et al., 2010), sugere importantes questões sobre a susceptibilidade dos

animais infectados, a presença de genótipos de parasitas mais virulentos, e um importante debate a

emergência da tripanossomíase por T. vivax nessas regiões.

A questão da existência de genótipos de T. vivax com diferente grau de virulência e patogenicidade

foi sido sugerida previamente e associada à morfologia dos parasitas. Isolados de menor tamanho

encontrados em bois no oeste africano foram relacionados com doença aguda, enquanto isolados de

maior tamanho foram associados com doença crônica em bois, ovinos e animais selvagens no leste da

África (Losos, Ikede, 1972; Hoare, 1972; Gardiner, Mahmoud, 1992). Elucidar esses aspectos requer o

desenvolvimento de adequados métodos de diagnóstico e genotipagem, assim como caracterizar

isolados de diversos hospedeiros e regiões geográficas e estudos de epidemiologia molecular.

Em geral, nas regiões de estabilidade enzoótica a tripanossomíase por T. vivax é considerada uma

doença crônica, com animais assintomáticos ou com sinais clínicos inespecíficos. A doença somente

adquire interesse nas regiões não endêmicas, nas quais a introdução de animais com infecções

assintomáticas constitui um sério risco para a saúde e produtividade dos animais nunca expostos.

Similarmente, animais domésticos de regiões não endêmicas podem ser severamente afetados quando

introduzidos em áreas endêmicas para a doença, como tem sido observado no Brasil (Batista et al.,

2007, 2009; Osório et al., 2008).

40

A dificuldade de obter parasitas em quantidades suficientes para análises moleculares tem limitado

significativamente o estudo de T. vivax. Porém, muito recentemente, um modelo murino for bem

estabelecido (Blom-Potar et al., 2010; Chamond et al., 2010) e foi descrito o cultivo “in vitro” de T. vivax

(D´Archivio et al., 2011). Esses avanços prometem auxiliar os estudos desta espécie em vários

aspectos de seu desenvolvimento biológico, resposta imune, patologia, testes de drogas e vacinas,

além de permitir a obtençao de DNA e RNA dos parasitas para análises moleculares.

Estudos epidemiológicos de T. vivax em animais domésticos e silvestres são fortemente

restringidos pelas baixas parasitemias nos animais cronicamente infectados, dificultando o diagnóstico

que é comumente efetuado por métodos parasitológicos pouco sensíveis ou por métodos sorológicos

pouco específicos. No entanto, o advento de métodos moleculares mais sensíveis resultou em grandes

avanços no diagnóstico, compreensão da epidemiologia e patologia, risco de transmissão, diversidade

e relacionamento entre isolados da África e América do Sul (Dickin, Gibson, 1989; Dirie et al., 1993a,b;

Ventura et al., 2001; Cortez et al., 2006; Duffy et al., 2009; Adams et al., 2010a).

Investigações recentes têm sugerido uma grande complexidade genética de T. vivax e do

subgênero Duttonella em geral, particularmente na África. Sequências do gene gGAPDH permitiram

posicionar dois novos genótipos de T. vivax, obtidos de moscas tsé-tsé da Tanzânia, no subgênero

Duttonella; porém, em dois grupos distintos, ambos fora do clado principal de T. vivax da África e

América do Sul. Esses parasitas se mostraram geneticamente muito distantes de todos os genótipos

conhecidos, inclusive de um isolado de boi do Quênia (Adams et al., 2010a,b). Nosso grupo tem

participado ativamente desses estudos já que, elucidar a diversidade biológica e o relacionamento

entre genótipos demanda a comparação de isolados Africanos e Sul Americanos, não apenas para

identificar e caracterizar novos genótipos/espécies, mais também para a definição de parâmetros

taxonômicos (Adams et al., 2010b).

A comparação entre isolados visa também avaliar e ajudar a esclarecer a homogeneidade dos

isolados da América do Sul em relação aos isolados da África. Não existem estudos genéticos

específico de T. vivax realizados para avaliar a existência de fenômenos de diversificação genética,

tanto no vetor quanto no hospedeiro vertebrado. Porém, a presença de genes meióticos foi

recentemente confirmada (Duffy et al., 2009). A ocorrência hipotética de recombinações no vetor

biológico deveria se corresponder também com a existência de grande diversidade genética nos

isolados do oeste africano (transmitidos ciclicamente pelas moscas tsé-tsé), assim como uma ampla

homogeneidade genética em regiões de transmissão mecânica. A presença de diversas populações

clonais em simpatria circulando entre hospedeiros silvestres, amplamente difundidos no leste africano,

é também uma hipótese provável. No entanto, elucidar esses aspectos, demanda a análise de grande

número de isolados de diferentes hospedeiros, vetores e regiões geográficas, de animais com

41

diferentes formas clínicas da doença, com diferentes mecanismos de transmissão (mecânica e cíclica),

de áreas endêmicas ou não, empregando-se marcadores moleculares polimórficos que permitam

diferenciar parasitas muito relacionados.

1.4.2 Tripanossomíases por Trypanosoma evansi, considerações epidemiológicas.

Trypanosoma evansi está incluído no subgênero Trypanozoon, juntamente com outras espécies

muito relacionadas: T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, T. brucei brucei e T. equiperdum (Hoare,

1972). Essas espécies constituem um grupo muito homogêneo de parasitas, indistinguíveis

morfologicamente, embora com importantes diferenças epidemiológicas, de distribuição geográfica e

preferências de hospedeiros, mecanismos de transmissão e patogenicidade (Godfrey et al., 1990;

Queiroz et al., 2000; Stevens et al., 2001; Ventura et al., 2002; de Menezes et al., 2004). Este

subgênero compreende espécies patogênicas para o homem e para animais domésticos e silvestres,

responsáveis pelas doenças conhecidas como Nagana em bovinos (T. b. brucei), doença do sono em

humanos (T. b. gambiense, T. b. rhodesiense), Surra ou Mal de Cadeiras em mamíferos domésticos e

silvestres (T. evansi) e Durina em equinos (T. equiperdum) (Hoare, 1972). Com a exceção de T. evansi

e T. equiperdum, os tripanossomas desse subgênero são transmitidos ciclicamente pelas moscas tsé-

tsé na África, onde encontram-se muito difundidos. T. evansi e T. equiperdum são exclusivamente

transmitidos mecanicamente, o primeiro mediante dípteros hematófagos e o último diretamente através

do coito, sem necessidade de vetores.

T. evansi e T. brucei são considerados espécies distintas baseado, principalmente, na ausência de

maxicírculos do DNA cinetoplástico (kDNA) no primeiro deles, situação que impossibilita seu

desenvolvimento em artrópodes vetores e determina a transmissão exclusivamente mecânica. Porém,

diversos fatores associados a vários mecanismos de transmissão têm lhe permitido se difundir

amplamente em diferentes continentes e hospedeiros: (1) a pouca restrição no uso de dípteros

hematófagos como vetores mecânicos, especialmente moscas da família Tabanidae e do gênero

Stomoxys (Hoare, 1972; Krinsky, 1976; Lun, Desser, 1995; Dávila et al., 1999); (2) a existência de um

mecanismo oral de transmissão que pode ocorrer em carnívoros ao se alimentar de carcaça de animais

infectados (Wiesenhutter, 1975; Ramirez et al., 1979, Raina et al., 1985; Herrera et al., 2004, 2005) e

(3) a transmissão mediante o morcego hematófago Desmodus rotundus, que pode desempenhar um

importante papel na transmissão nas Américas (Hoare, 1972).

Trypanosoma evansi possui não só a maior diversidade de hospedeiros vertebrados, como

também a maior distribuição geográfica entre os tripanossomas patogênicos, com presença na Europa,

Ásia, Oriente Médio, Américas Central e do Sul, além da África. A diversidade de hospedeiros inclui

mamíferos de várias ordens, tanto domésticos quanto silvestres. São comuns os relatos em camelos na

42

África (Diall et al., 1993; Amer et al., 2011) e na Europa (Gutierrez et al., 2005, 2010; Desquesnes et

al., 2008; Tamarit et al., 2010) e em bois, búfalo asiático, cavalos, capivaras, suínos e veados em

diferentes regiões do mundo (Hoare, 1972; Franke et al., 1994a,b; Silva et al., 1995a; Arias et al., 1997;

Reid et al., 1999; Herrera et al., 2004, 2005, 2008; Garcia et al., 2005; Gonzales et al., 2007; Laha,

Sasmal, 2009; Shahzad et al., 2010; Adrian et al., 2010; Hagos et al., 2010; Milocco et al. 2012). A

ampla distribuição geográfica e a diversidade de hospedeiros de T. evansi, em conjunto com as

características da doença nos animais infectados, refletem a necessidade de efetuar estudos

epidemiológicos para compreender a dinâmica e estrutura populacional e diversidade das populações

desse parasita, assim como determinar seus reservatórios.

O curso da infecção por T. evansi varia desde uma doença aguda com alta mortalidade em animais

susceptíveis como cavalos e cães (Silva et al., 1995a; Franciscato et al., 2007), até doenças crônicas

caracterizados por distúrbios motores e fraqueza progressiva (Hörchner et al., 1983; Monzon et al.,

1984; Rodrigues et al., 2005; 2009; Zanette et al., 2008; Berlin et al., 2009) na maioria dos outros

animais de interesse econômico (Luckins, 1988). Na forma crônica da doença, são observadas

alterações reprodutivas, perda generalizada da condição corporal, neuropatia, supressão do sistema

imune, anemia e morte, tanto em animais domésticos como silvestres, com importantes alterações

histopatológicas (Damayanti et al., 1994; Holland et al., 2001; Rodrigues et al., 2009). No entanto,

fatores inerentes ao parasita e hospedeiros e fatores de manejo animal, influem na severidade das

formas clínicas da doença, de forma similar ao descrito na tripanossomíase por T. vivax.

Na América Latina, T. evansi tem sido descrito desde a América Central até a Argentina,

mostrando uma alta prevalência e distribuição na Venezuela, Brasil, Bolívia e Colômbia. No Brasil, foi

descrito pela primeira vez em 1838 em cavalos na ilha de Marajó no Pará (Shaw, 1977). Na Venezuela,

o primeiro relato foi feito em 1905 (Ceferino, 1973), em cavalos de regiões alagadiças do centro do

país, embora desde 1898, relatos de surtos em cavalos de diversos estados do país já sugeriam a

presença do parasita (Ceferino, 1973).

T. evansi é endêmico em diversas regiões da América Latina, causando sérios prejuízos à saúde

animal e, inclusive, morte dos animais mais susceptíveis (cavalos e cachorros). Essa situação possui

um significativo impacto econômico, uma vez que esses animais desempenham papel indispensável no

manejo dos rebanhos de ruminantes de interesse econômico. O parasita é endêmico no Pantanal

brasileiro, uma das principais regiões de criação de rebanhos bovinos no Brasil (Silva et al., 1995a),

gerando importantes perdas econômicas (Seidl et al., 1998) associadas a presença de surtos focais em

animais domésticos e silvestres, principalmente na época de maior presença de vetores (Herrera et al.,

2004, 2005, 2007, 2008).

43

Nas regiões alagadiças da Venezuela, a infecção causada por T. evansi possui um perfil endêmico

similar ao observado no Pantanal brasileiro, com alta prevalência sorológica em equinos (Reyna-Bello

et al., 1998) e capivaras silvestres atuando como reservatórios (Rivera et al., 1996; Arias et al., 1997;

Garcia et al., 2003). Enquanto nessas regiões se desconhece o papel dos cães na epidemiologia da

doença, essa situação tem sido bem caracterizada no Brasil (Franke et al., 1994a; Colpo et al., 2005;

Franciscato et al., 2007). Similarmente, embora relatado no Pantanal brasileiro (Dávila et al., 2003;

Herrera et al., 2004) e em duas localidades no Peru e na Bolívia (Mekata et al., 2009), o papel dos

ruminantes (boi, búfalo e ovelha) na epidemiologia da tripanossomíases por T. evansi é desconhecido

na América Latina. Na Indonesia, Filipinas e outros países da Asia T. evansi e muito prevalente em

ruminantes (Payne et al., 1991a,b; Laha, Sasmal, 2009; Shahzad et al., 2010; McInnes et al., 2012).

No Brasil e na Venezuela, uma ampla diversidade de hospedeiros selvagens pode agir como

reservatório de T. evansi, com ausência e/ou limitada patogenicidade (Arias et al., 1997; Ventura et al.,

2002; Herrera et al., 2001, 2004, 2005, 2007, 2008; Garcia et al., 2003; Rademaker et al., 2009;

Perrone et al., 2009). Esses animais são de grande importância na epidemiologia de T. evansi,

podendo albergar variantes genéticas não encontradas nos animais domésticos, assim como variantes

não expostas a quimioterápicos. Analisar a diversidade e o relacionamento genético entre populações

de animais silvestres e domésticos pode contribuir ao entendimento de diferenças na patogenicidade e

virulência. Estudos têm sido realizados a fim de encontrar diferenças genéticas entre T. evansi, T.

brucei spp. e T. equiperdum, espécies muito relacionadas filogeneticamente embora com diferentes

ciclos de transmissão e causadoras de patologias distintas, de difícil diferenciação mesmo com

marcadores moleculares (Lun, Desser, 1995; Ventura et al., 2002; Lai et al., 2008).

Apesar de relevante heterogeneidade biológica, populações de T. evansi de diversos hospedeiros

e origens geográficas têm se mostrado geneticamente mais homogêneas (micro-heterogeneidade

genética) do que os outros tripanossomas africanos. Essa homogeneidade tem sido atribuída à

transmissão mecânica dessa espécie. Detectar variantes genéticas (genótipos) entre parasitas muito

relacionados demanda o uso de marcadores altamente polimórficos. Diversos marcadores têm

sido utilizados a fim de avaliar a diversidade entre isolados de T. evansi. Duas populações foram

estabelecidas com base no gene da VSG RoTat1.2, ausente em uma população Africana (Ngaira et al.,

2005; Njiru et al., 2010) ou em minicírculos de kDNA (Njiru et al., 2006; Li et al., 2007), ausentes nos

isolados sul americanos e chineses (Ventura et al., 2000; Lai et al., 2008). Genes associados aos sítios

de expressão de VSGs (ESAGs) têm se mostrado de grande potencial na detecção de polimorfismo

entre isolados de T. evansi (Witola et al., 2005; Amer et al., 2011). Polimorfismo no gene ESAG6

permitiu distinguir isolados de bovinos do Peru e Bolívia (Mekata et al., 2009).

44

1.5 Genes e sequências empregadas nas análises moleculares de polimorfismo e

relacionamento genético

1.5.1 Gene ribossômico

Sequências do gene ribossômico têm sido tradicionalmente empregadas nos estudos da

reconstrução filogenética dos organismos da ordem Kinetoplastida (Stevens et al., 1999b, 2001;

Deschamps et al., 2011). Os genes ribossômicos dos tripanossomatídeos possuem uma estrutura

característica conformada por unidades de repetição compostas por unidades de transcrição (cistrons

ribossômicos) separadas por um espaçador intergênico (IGS), que se repetem em "tandem" no genoma

dos parasitas em mais de 100 vezes. Durante o processo de transcrição gênica dirigido pela enzima

RNA Polimerase I, cada unidade de transcrição origina um pré-rRNA que é processado para dar origem

a três moléculas de rRNA maduro, denominadas, segundo a sua velocidade de sedimentação: 18S

(SSU ou subunidade menor), 5.8S e 24S (LSU ou subunidade maior). Nos tripanossomatídeos, a

subunidade maior está constituída por duas moléculas de alto peso molecular denominadas 24Sα e

24Sβ, e por quatro subunidades de rRNAs de baixo peso molecular: S1, S2, S4 e S6. A subunidade S1

se encontra separando as subunidades 24Sα e 24Sβ, enquanto S2, S4 e S6 se encontram no extremo

5’ da subunidade 24Sβ. Em termos de sequência nucleotídica, as subunidades 18S e 24S estão

constituídas por sequências altamente conservadas intercaladas por espaçadores internos transcritos

(ITS) que possuem um grau intermediário de conservação (ITS 1-4). O espaçador ITS 1 separa a SSU

do 5.8S, o espaçador ITS 2 separa o 5.8S do 24Sα, ITS 3 separa 24Sα e o fragmento de baixo peso

molecular S1 da subunidade maior, enquanto o espaçador ITS 4 separa o S1 da subunidade 24Sβ. Os

espaçadores ITS 5-7 se encontram em direção 5’ e separam o 24Sβ e as subunidades S2, S4 e S6 do

LSU. Existe também um espaçador externo transcrito ou ETS que flanqueia o extremo 3’ do SSU e que

o separa do espaçador intergênico (IGS). As sequências do ETS são altamente variáveis. As diferentes

regiões dos cístrons ribossômico possuem diferentes graus de conservação, pelo qual têm sido

utilizadas para identificar gêneros, espécies e isolados de tripanossomatídeos (Figura 2).

Figura 2 - Representação esquemática do cistron ribossômico de rRNA precursores de tripanossomatídeos

45

Os genes ribossômicos têm se revelado ótimos marcadores para inferências de relacionamento

filogenético devido a sua presença universal em todos os organismos conhecidos e a similaridade na

função. Esse tipo de estudos em tripanossomatídeos geralmente é baseado nas analises de

sequências destes genes, tanto porque eles têm mostrado refletir a historia evolutiva de muitos outros

organismos eucariotas, quanto porque na atualidade existem já depositadas em bancos de dados um

número importante de sequências ribossômicas de distintos organismos relacionados, permitindo

efetuar comparações mais aprimoradas ao incluir maior número de táxons e obter reconstruções

filogenéticas mais confiáveis (Sogin et al., 1986). Diversas vantagens fazem dos genes ribossômicos

bons marcadores para inferências de relacionamentos filogenéticos em tripanossomatídeos. A

presença de diferentes graus de variabilidade exibida pelas diversas regiões do gene confere um

adequado grau de polimorfismo aos cístrons ribossômicos, salientando a sua utilidade como ferramenta

na identificação e análises filogenéticas desse grupo de parasitas. Particular utilidade possuem as

sequências da subunidade menor (SSU), toda vez que têm sido descritas oito regiões conservadas

(U1-U8) que permitem o desenho de oligonucleotídeos que podem ser empregados como “primers” nas

reações de PCR, e nove regiões variáveis (V1-V9) algumas das quais possuem informação filogenética

que permite reconstruções similares àquelas obtidas das analises do SSU inteiro (Hernández et al.,

1990, Maia da Silva et al., 2004b; Rodrigues et al., 2006). As regiões variáveis estão flanqueadas pelas

regiões conservadas, facilitando o desenho e padronização das PCR.

Por conter sequências nucleotídicas com variável grau de conservação, as diversas regiões dos

cístrons ribossômicos possuem muita utilidade em termos de permitir inferir diversos graus de

relacionamento entre organismos. Nesse sentido, os espaçadores IGS e ITS são muito variáveis

quando comparados às regiões SSU e LSU, diferindo inter e intra-específicamente. Esse alto grau de

variabilidade nessas sequências faz destas regiões excelentes alvos para análises de organismos

filogenéticamente muito próximos, assim como alvos para diagnóstico e como marcadores

taxonômicos. A variabilidade no tamanho e na sequência nucleotídica do espaçador interno transcrito

(ITS), tem sido amplamente utilizada no estudo de espécies do gênero Leishmania, mostrando grande

polimorfismo inter e intra-específico, de grande utilidade na identificação de espécies e taxonomia

(Cupolillo et al., 1995, 2000; Schönian et al., 2000). Similarmente, estudos em T. cruzi têm mostrado

não só grande polimorfismo entre espécies (Marcili et al., 2009b; Mendonça et al., 2002), como também

tem permitido mostrar polimorfismo intra linhagem e elucidar padrões filogeográficos com agrupamento

dos isolados de uma linhagem específica (TCIIc) de acordo a origem geográfica (Marcili et al.,

2009a,b,c).

Sequências dos ITS são também consideradas excelentes marcadores moleculares para

diferenciação inter específica em T. rangeli (Maia da Silva et al., 2004b; Beltrame-Botelho et al., 2005),

46

para diferenciar entre espécies de tripanossomas africanos (Desquesnes et al., 2001; Njiru et al., 2005;

Cortez et al., 2006) e recentemente para mostrar o alto grau de relacionamento genético entre isolados

de T. lewisi de ratos e macacos, dando suporte a hipóteses de troca de hospedeiros nesta espécie de

tripanossoma (Maia da Silva et al., 2010). Dentro do subgênero Megatrypanum, os ITS têm permitido

estabelecer diferentes genótipos na espécie T. theileri e sugerir a existência de populações

geograficamente estruturadas em hospedeiros bovinos (Rodrigues et al., 2003, 2006). Analises de

sequências inteiras ou parciais do SSU têm sido recentemente empregadas para sugerir que T.

melophagium representa uma linhagem de T. theileri que adaptou se como parasita específica das

ovelhas ao se adaptar ao vetor hipoboscídeo (Gibson et al., 2010); na descrição de novas linhagens

filogenéticas de tripanossomas de anuros (Ferreira et al., 2008) e na descrição e posicionamento

filogenético de novas espécies de tripanossomas em serpentes, morcegos e répteis (Viola et al., 2008,

2009a,b; Cavazzana et al., 2010).

Recentemente tem se desenvolvido um método para a identificação precisa e genotipagem de

tripanossomas baseado na amplificação por PCR de segmentos parciais dentro do SSU e LSU. O

“fluorescent fragment length barcode” ou FFLB está baseado na determinação precisa do tamanho dos

fragmentos amplificados por PCR e marcados com fluorocromos, mediante o emprego de um

sequenciador de fluorescência e eletroforeses capilar. A combinação dos tamanhos amplificados dentro

do SSU e LSU origina padrões espécie/genótipo específicos com grande poder discriminatório

(Hamilton et al., 2008). Esta metodologia tem sido validada para “barcoding” de tripanosomas africanos

(Hamilton et al., 2008; Adams, Hamilton, 2008; Adams et al., 2010b) e tripanossomas da América do

Sul (Hamilton et al., 2011), mostrando a utilidade das regiões variáveis dos cístrons ribossômico na

identificação e caracterização de espécies de tripanossomas.

1.5.2 Gene gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase glicosomal - gGAPDH

De modo similar ao que acontece com sequências da SSUrRNA, sequências do gene gGAPDH

(Figura 3) são recomendadas para analises filogenéticas e posicionamento taxonômico dos

tripanossomatídeos e têm se mostrado úteis para efetuar “barcoding” desses organismos (Hughes,

Piontkivska, 2003a; Hamilton et al., 2004, 2007). No entanto, o número de sequências deste gene nas

diversas espécies de tripanossomatídeos, embora com notável aumento na última década, é ainda

limitante para efetuar análises muito abrangentes, já que só recentemente estão sendo utilizado nas

filogenias destes parasitas.

O metabolismo da glicose em parasitas da família Tripanosomatidae é muito particular e acontece

em uma organela chamada glicosoma. O processo envolve um grande número de enzimas que se

encontram compartimentalizadas nessas organelas e que atuam na conversão de glicose e glicerol em

47

3-fosfoglicerato. A enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase glicosomal (gGAPDH) é uma enzima

glicolítica essencial aos cinetoplastídeos (Hannaert et al., 1992). Nos genomas de tripanossomas foram

encontradas três genes de GAPDH. Dois deles codificam uma enzima glicossômica (gGAPDH) e outro

codifica uma enzima citosólica (cGAPDH), sendo mais relacionado com genes bacterianos. No resto

dos eucariotos, as enzimas envolvidas no metabolismo da glicose são citosólicas.

Figura 3 - Representação esquemática dos genes de GAPDH.

Os genes de gGAPDH possuem muitas vantagens na inferência de relações filogenéticas nos

tripanossomatídeos. São genes de cópia única o que confere grande confiabilidade as sequências e

nos alinhamentos; são genes codificadores de proteínas, estão sujeitos a diferentes pressões seletivas

e apresentam taxas de evolução diferentes comparadas àquelas dos genes ribossômicos. Os

alinhamentos das sequências do gene gGAPDH não possuem “gaps”, pelo qual são muito confiáveis e

sem regiões ambíguas, mesmo utilizando sequências de organismos muito distantes permitindo que o

gene inteiro possa ser empregado nas análises filogenéticas. Análises filogenéticas baseadas em

SSUrRNA e gGAPDH geram topologias muito congruentes, o que têm permitido efetuar análises

concatenando ambos grupos de sequências, que tem resultado em topologias mais robustas (Hamilton

et al., 2004, 2005a,b, 2007, Viola et al., 2009a,b).

Os primeiros estudos filogenéticos com sequências do gene gGAPDH em tripanossomatídeos

sugeriram a monofilia do gênero Trypanosoma e permitiram segregar os tripanossomas analisados nos

clados T. brucei, T. cruzi e clado aquático, mostrando congruência com os resultados obtidos em

análises similares utilizando o gene SSUrRNA (Hamilton et al., 2004). Estudos recentes têm permitido

expandir a base de dados de sequências desses genes, existindo atualmente disponibilidade de

sequências para tripanossomas de todas as classes de vertebrados (Hamilton et al., 2004, 2005a).

Mais recentemente, sequências de gGAPDH em análises independentes e/ou combinadas têm sido de

grande utilidade na descrição de gêneros, subgêneros e espécies de tripanossomatídeos (Hamilton et

al., 2004, 2005a, 2009; Viola et al., 2009b; Cavazzana et al., 2010; Maslov et al., 2010; Teixeira et al.,

2011), assim como na descrição de novos genótipos ou linhagens filogenéticas ainda sem uma posição

taxonômica definida (Hamilton et al., 2005a, 2008; Adams et al., 2010a). O grau de conservação tanto

dos genes ribossômicos quanto do gene gGAPDH faz com que a informação obtida nas analises

desses genes seja de grande utilidade na resolução de questões de posicionamento dos

tripanossomatídeos nas árvores filogenéticas e na identificação das espécies. No entanto, o estudo do

48

polimorfismo intra espécies e o estudo do relacionamento entre espécies de recente divergência,

geneticamente muito relacionadas, demanda o uso de marcadores moleculares mais polimórficos para

poder obter topologias bem resolvidas e com alto suporte estatístico.

1.5.3 Gene de mini-exón ou “Spliced Leader”

O processo de transcrição dos genes dos cinetoplastídeos difere do resto dos eucariotos e constitui

uma característica distinta deste grupo de organismos. Durante a transcrição são gerados RNAs

policistrônicos a partir de genes que, em geral, não apresentam introns. Esses RNAs imaduros são

submetidos a mecanismos pós-transcricionais ("trans-splicing") responsáveis pela maturação em

mRNAs unitários, em um processo que envolve, entre outros eventos, a adição de uma sequência de

39 nucleotídeos na extremidade 5' dos mRNAs maduros (sequência "spliced leader" RNA ou "mini-

exon derived” RNA) (Agabian, 1990; Gibson et al., 2000; Yu et al., 2002; Mayer, Floeter-Winter, 2005;

Günzl, 2010).

Cada unidade de repetição do gene SL pode ser dividida em três partes: um exon altamente

conservado de 39 nucleotídeos; um intron de ~ 50-100 nucleotídeos, moderadamente conservado, e

uma região intergênica espaçadora que possui variações de tamanho e sequência entre as espécies e

linhagens filogenéticas de tripanossomatídeos (Agabian, 1990) (Figura 4). Em algumas espécies de

tripanossomatídeos existe uma copia do gene 5S rRNA inserido na região intergênica do gene SL. O

5S geralmente é composto por sequências muito conservadas (Aksoy et al., 1992; Roditi, 1992;

Stevens et al., 1999a; Gibson et al., 2000; Ventura et al., 2001; Grisard et al., 2003; Maia da Silva et al.,

2007).

O gene SL tem sido amplamente empregado no desenvolvimento de marcadores moleculares com

utilidade taxonômica. Além da presença de regiões com diferentes graus de conservação, a existência

de ~ 200 cópias no genoma dos tripanossomatídeos, repetidas “in tandem”, tornam este gene um

excelente alvo para o desenvolvimento de métodos diagnóstico altamente sensíveis e para inferências

de variabilidade genética dentro de espécies ou linhagens (Agabian 1990; Donelson, Zeng, 1990;

Davis, 1996). No entanto, a aplicabilidade das sequências do gene SL em estudos filogenéticos e de

relacionamento entre espécies de tripanossomas é limitada a parasitas muito relacionados, uma vez

que existem importantes limitações referentes à confiabilidade dos alinhamentos entre organismos de

espécies diferentes (Fernandes et al., 1998a,b; Serrano et al., 1999, Ventura et al., 2001). Estudos em

diversas espécies de tripanossomas têm revelado que só aquelas sequências dos exons e introns de

parasitas filogeneticamente muito relacionados podem ser alinhadas sem ambiguidades (Gibson et al.,

2000; Ventura et al., 2001; Maia da Silva et al., 2007). Além disso, a existência de polimorfismo entre

as copias do gene de um mesmo isolado representa outra importante limitação, toda vez que as

49

análises de variabilidade genética demandam o emprego de organismos previamente classificados com

outros marcadores moleculares e exige o sequenciamento de muitos clones para poder avaliar a

variabilidade intra isolado (Gibson et al., 2000).

Figura 4 - Representação esquemática da unidade de repetição do gene “Spliced leader” ou mini-exon.

Apesar das limitações citadas, o gene SL constitui uma ferramenta de grande utilidade para

elucidar a existência e estrutura das populações de tripanossomatídeos, permitindo revelar linhagens

filogenéticas e genótipos em estudos populacionais de diversas espécies de tripanossomas (Souto et

al., 1996; Fernandes et al., 1998a,b; Grisard et al., 1999; Ventura et al., 2001; O’Connor et al., 2007;

Maia da Silva et al., 2007; Herrera et al., 2011; Falla et al., 2009). Esse gene vem sendo utilizado na

identificação de espécies e linhagens de Leishmania (Fernandes et al., 1994; Katakura et al., 1998;

Sturm et al., 1998; Harris et al., 1998; Sukmee et al., 2008), Endotrypanum (Fernandes et al., 1993),

Crithidia (Fernandes et al., 1997; Yurchenko et al., 2009), Phytomonas (Teixeira et al., 1996; Serrano et

al., 1999; Teixeira et al., 2000; Godoi et al., 2002), Leptomonas e Herpetomonas (Podlipaev et al.,

2004a,b; Westenberger et al., 2004; Yurchenko et al., 2006).

1.5.4 Genes de cisteíno proteases: Catepsina L-“like”.

As proteases, enzimas que catalisam a hidrolise de ligações peptídicas de moléculas protéicas, são

muito abundantes em diversos sistemas biológicos onde podem representar ~ 2% dos genes

expressos (Sajid, McKerrow, 2002; Mottram et al., 2003; Rudenskaya, Pupov, 2008). Essas enzimas

são sintetizadas como formas inativas ou pro-enzimas, as quais devem ser submetidas a diversas

etapas de processamento para originar as formas maduras, enzimaticamente ativas. As proteases

podem se subdividir em exopeptidases e endopeptidases. O primeiro grupo inclui enzimas que clivan

ligações peptídicas próximas das porções amino ou carboxi terminal (aminopeptidase ou

carboxipeptidase), enquanto as endopeptidases clivan ligações peptídicas localizadas na região interna

da cadeia polipeptídica (cisteíno-proteases, metalo-proteases, serino-proteases e aspártico-proteases,

de acordo com o sítio catalítico) (Sajid, McKerrow, 2002).

A atividade das cisteíno-proteases depende da existência de resíduos de cisteína e histidina no

sítio catalítico da enzima, sendo a ordem dos resíduos empregada para classificar este grupo de

50

proteases em diversos clãs: O Clã CA (Cys-His) e Clã CD (His-Cys) são os de maior importância em

protozoários parasitas. A maioria das cisteíno-proteases descritas pertencem ao Clã CA, quem

representa um agrupamento de famílias de proteínas relacionadas bioquímica e evolutivamente e que

compartilham regiões peptídicas conservadas. A característica distintiva é a presença dos resíduos

catalíticos Cisteína, Histidina e Asparagina no domínio catalítico da enzima (Sajid, McKerrow, 2002;

Mottram et al., 2003).

Diversos estudos têm revelado o envolvimento de enzimas proteolíticas em eventos cruciais no

desenvolvimento dos protozoários, tanto no hospedeiro vertebrado quanto no invertebrado (McKerrow

et al., 1993; Klemba, Goldberg, 2002). Diferentes peptidases envolvidas tanto em funções metabólicas

e regulatórias como na patogenicidade de doenças foram estudadas em protozoários dos gêneros

Plasmodium, Cryotosporidium, Leishmania, Trypanosoma, entre outros de interesse médico e

veterinário (Sajid, McKerrow, 2002), com diversos genes codificadores já identificados e descritos no

gênero Trypanosoma (Eakin et al., 1990, 1992; Rosenthal, 1999). Especial atenção tem recebido as

cisteíno peptidases da Família C1 agrupadas dentro do Clã CA (Sajid, McKerrow, 2002; Atkinson et al.,

2009). Nesta família estão agrupadas as catepsinas de mamíferos (B, C, K, L, S) e a peptidase

arquétipo das plantas, a Papaína. Parasitas cinetoplastídeos expressam duas peptidases da família C1

relacionadas com as catepsinas B e L dos mamíferos, pelo qual são referidas como catepsina B e

catepsina L - “like” peptidases (Caffrey, Steverding, 2009; Caffrey et al., 2011).

Diversos estudos mostraram que os tripanossomatídeos expressam cisteíno-proteases em

abundância e sugeriram funções cruciais em eventos como evasão da resposta imune, diferenciação

celular, invasão de células, apoptoses, virulência e patogenicidade (Authié et al., 2001; Lalmanach et

al., 2002; Sajid, McKerrow, 2002), conferindo assim, um grande interesse no estudo destas moléculas

(McKerrow et al., 1993, 2006; Doyle et al., 2007; 2011). No entanto, ao contrário do que ocorre nos

tripanossomas patogênicos, em parasitas como T. theileri e T. rangeli, considerados não patogênicos

para os seus respectivos hospedeiros vertebrados, os mecanismos nos quais estas cisteíno proteases

modulam as interações parasitas - hospedeiros devem ser diferentes, embora as funções de estas

enzimas nestas espécies de tripanossomas não têm sido elucidadas.

Nos tripanossomatídeos, as principais atividades proteolíticas relacionadas à cisteíno-proteases

são atribuídas as catepsinas L-“like”, as quais são secretadas pelos parasitas desde sua localização

nos lisossomos e compartimentos intracelulares. Estudos iniciais realizados com T. cruzi mostraram a

sequência, organização e expressão da principal cisteíno protease desta espécie (cruzipaína =

TcrCATL), assim como a identificação do gene codificador da isoforma menor, cruzipaína 2 (Eakin et

al., 1992; Campetella et al., 1992; Lima et al., 1994). TcrCATL é considera o arquétipo de uma família

multigênica de isoformas relacionadas, com genes homólogos já descritos em T. b. brucei, T. b.

51

rhodesiense, T. congolense, T. rangeli e T. carassii. Essas moléculas compartilham a triade catalítica

no sítio ativo da enzima, resíduos que se encontram em motivos peptídicos altamente conservados.

Quando comparada com a catepsina L humana, as catepsinas dos cinetoplastídeos mostram identidade

de sequências entre 34% e 40%; enquanto entre as enzimas de tripanossomas este valor varia de 53%

a 70%. No entanto, quando espécies muito relacionadas são comparadas, estes valores são superiores

a 90% (Caffrey, Steverding, 2009).

De um ponto de vista estrutural, as enzimas catepsina L-“like” dos cinetoplastídeos apresentam

quatro domínios principais: pré-domínio (peptídeo sinal), pro-domínio, domínio central ou catalítico e

extensão C-terminal. No pro-domínio, as catepsinas L compartilham os motivos conservados ERFININ-

“like” e GNFD-“like”; no domínio central compartilham a triade catalítica e o motivo conservado

GCNGG-“like” (Sajid, McKerrow, 2002; Ruszczyk et al., 2008; Caffrey,Steverding, 2009). O domínio

catalítico é importante para a atividade da enzima e é estruturalmente e funcionalmente muito

conservado. Do ponto de vista biológico, as catepsinas são inibidas pelo E-64 (L-trans-epoxisuccinil-

leucil-amido -4-guanidino- butano) e a especificidade pelo substrato é definida pelo subsítio S2.

No genoma, as enzimas catepsina L-“like” se distribuem em “tandem”, com as unidades de

repetição constituídas pelas regiões codificadoras dos quatro domínios principais separadas por uma

região intergênica (Figura 5) (Eakin et al., 1992; Campetella et al., 1992). Estudos sugerem que todas

as cisteíno peptidases similares com catepsina L descendem de um gene ancestral e divergiram logo

da especiação (Sajid, McKerrow, 2002), se espalhando por processos de duplicação gênica

(sequências parálogas), pelo qual estas moléculas estão presentes no genoma dos tripanossomas

como múltiplas copias organizadas como repetições em “tandem” variáveis nas suas sequências e

número de acordo as isoformas e espécies de tripanossoma, constituindo uma família multigênica. A

enzima arquétipo TcrCATL é codificada por até 130 genes polimórficos, enquanto em T. brucei e T.

rangeli tem se identificado ~20 e ~75 copias do gene, respectivamente (Eakin et al., 1992; Campetella

et al., 1992).

Figura 5 - Representação do gene da Catepsina L – “like” em tripanossomas.

O fato de serem genes em múltiplas cópias, organizados em “tandem” e de funções vitais na

sobrevivência dos parasitas, sendo portanto, ótimos alvos para o desenvolvimento de ensaios

diagnósticos altamente sensíveis. Além disso, acredita-se que as múltiplas sequências parálogas dos

52

genes codificadores destas enzimas estejam submetidas à evolução em concerto, pelo qual estes

genes poderiam ser apropriados para inferências filogenéticas (Jackson, 2007). Análises restritas a um

pequeno número de sequências de cisteíno proteases CATL-“like” em uns poucos cinetoplastídeos tem

mostrado congruência entre as filogenias obtidas com SSU rDNA e com genes de CATL-“like”,

sugerindo fortemente uma potencial aplicabilidade na avaliação do relacionamento entre tripanossomas

e estudos filogenéticos (Sakanari et al., 1997; Jesudhasan et al., 2007; Kuru et al., 2007; Ruszczyk et

al., 2008).

As duplicações de genes ou de segmentos cromossômicos são mecanismos fundamentais na

geração de variabilidade e na evolução de espécies. Famílias multigênicas como os genes que

codificam as enzimas CatL-“like”, envolvidas nos processos de interação parasita-hospedeiro, exibem

um importante polimorfismo entre sequências que pode ter sido gerado e selecionado com a adaptação

dos parasitas aos seus diversos hospedeiros e ciclos de vida, refletindo as histórias evolutivas desses

organismos. Durante os eventos de duplicação gênica, os genes parálogos gerados podem

experimentar processos de homogeneização ou de diversificação. Os estudos nos genes de CatL-“like”

em alguns tripanossomatídeos tem mostrado processos de homogeneização de sequências de DNA,

possivelmente associado a processos de conversão gênica. Essa situação faz que os genes parálogos

que formam a família multigênica das CatL-“like” apresentem maior similaridade de sequências entre

copias de uma mesma espécie do que entre genes homólogos de espécies diferentes, sendo isso uma

indicação de evolução em concerto, ao refletir que os membros dessa família de genes não evoluem

independentemente uns de outros (Zaja et al., 2003; El-Sayed et al., 2005; Jackson, 2007; Cerqueira et

al., 2008).

Eventos de evolução em concerto têm sido descritos em diversas famílias multigênicas, como RNA

ribossômico e histonas (Jackson, 2007). Análises filogenéticas baseadas em genes que evoluem em

concerto provavelmente refletem as histórias evolutivas das espécies. Mais ainda, a presença de

múltiplas cópias em famílias como as CatL-“like” outorga as análises um grande potencial adicional

para estudos de estrutura populacional e relações filogenéticas, mesmo entre organismos muito

relacionados (Jackson, 2007; Cerqueira et al., 2008).

A aplicabilidade dos genes de CATL no tripanossoma não patogênico T. rangeli, foi recentemente

demonstrada por Ortiz et al. (2009), tanto no que refere à aplicabilidade no diagnóstico específico e

sensível, como no relacionamento entre isolados e posicionamento filogenético. Similarmente, análises

filogenéticas de genes de CATL-“like” em várias espécies de cinetoplastídeos, como Leishmania spp.,

T. brucei, T. congolense, T. carassi e nos bodonídeos parasitas de peixes Cryptobia salmositica e

Trypanoplasma borreli, tem mostrado o grande potencial destes genes para efetuar inferências

filogenéticas (Sakanari et al., 1997; Kuru et al., 2007; Jesudhasan et al., 2007; Ruszczyk et al., 2008).

53

Elucidar as relações evolutivas entre catepsinas homólogas a TcrCATL presentes em espécies de

tripanossomas patogênicos e não patogênicos é um primeiro passo no estudo das funções dessas

enzimas na modulação da relação parasita – hospedeiro, no envolvimento delas na patogênese das

doenças e no desenvolvimento de ensaios diagnóstico para estudos de epidemiologia molecular.

1.5.5 Genes mitocondriais - citocromo b (Cyb)

Outra característica distintiva dos cinetoplastídeos é a presença do cinetoplasto, uma região

especializada da mitocôndria constituída por moléculas de DNA dupla-fita circulares, concatenadas

(kDNA) em uma única rede (Simpson, 1987). O DNA do cinetoplasto corresponde ao DNA mitocondrial

dos tripanossomatídeos e representa ~25% do DNA total do protozoário. Cada parasita contém de

5.000-10.000 minicírculos e entre 40-50 maxicírculos, fortemente concatenados. Os minicírculos são

altamente heterogêneos em termos de tamanho e sequências. No entanto, possuem três pequenos

blocos conservados, um dos quais se corresponde à origem de replicação, formado por 12

nucleotídeos praticamente invariáveis nos tripanossomatídeos. Os maxicírculos correspondem ao DNA

mitocondrial dos eucariotos, codificando as proteínas necessárias para a atividade mitocondrial (Figura

6) (Stuart, Feagin, 1992; Simpson et al., 2003). As moléculas de kDNA encontram-se concatenadas

não apenas estruturalmente, mas também em termos de função, toda vez que os minicírculos

codificam as moléculas dos RNAs-guias que atuam nos processos de edição dos transcritos dos

maxicírculos (Simpson, 1987).

O DNA mitocondrial nos tripanossomatídeos possui características relevantes que fazem dessas

moléculas importantes alvos para o desenvolvimento de marcadores moleculares com fins

diagnósticos. O grande número de copias (~104) altamente polimórficas entre espécies exibido pelas

moléculas de minicírculos tem sido explorado com grande sucesso no diagnostico por PCR e como

ferramenta de segregação de linhagens e genótipos em tripanossomatídeos (Morel et al., 1980; Morel,

Simpson, 1980; Sturm et al., 1989; Avila et al., 1993; Junqueira et al., 1996). Embora

intraespecíficamente essas moléculas possuam tamanhos similares, suas sequências nucleotídicas

são altamente polimórficas, permitindo distinguir entre linhagens e genótipos mediante sequenciamento

direito o por métodos de restrição enzimática (Morel et al., 1980; Torres et al., 2004).

54

Figura 6 - Representação esquemática do maxicírculo de kDNA com o gene de citocromo b (Cyb) em destaque.

Análises filogenéticas sugerem que a origem da rede de kDNA ocorreu no ancestral da família

Trypanosomatidae, uma vez que os minicírculos dos bodonídeos não são concatenados (Simpson et

al., 2003; Liu, Englund, 2007). Esses genes possuem taxas de evolução maiores àquelas de genes de

copia única nuclear (Meyer, 1993) e, devido à ausência de recombinação, as mutações são

determinantes na origem da variabilidade genética. Em geral, as taxas de evolução destes genes são

muito heterogêneas, com alguns deles acumulando mutações mais rapidamente (genes codificadores

das subunidades da NADH desidrogenase, citocromo c oxidase e genes dos RNAs transportadores),

enquanto outros são mais conservados (citocromo b) (Meyer, 1993). Os genes Cyb, citocromo oxidase

II e NADH desidrogenase, encontram-se entre os mais utilizados em análises de relacionamento

genético de T. cruzi, gerando agrupamentos de parasitas congruentes com aqueles obtidos em

análises baseados em genes ribossômicos (Machado, Ayala, 2001; Barnabé et al., 2003, Brisse et al.,

2003; de Freitas et al., 2006; Marcili et al., 2009b,c; Ramirez et al., 2011). No entanto, esses genes têm

sido pouco explorados com esses fins em tripanossomas africanos e ainda menos no tripanossoma

não patogênico T. theileri, espécie que possui uma estrutura populacional complexa, com pelo menos

quatro genótipos definidos por sequências dos genes ribossômicos (Rodrigues et al., 2006). Analisar o

relacionamento genético entre isolados desta espécie de tripanossoma de artiodátilos e comparar a

congruência com filogenias obtidas com genes tradicionais, como os genes ribossômicos, permitirá dar

maior solidez nas inferências quando confrontadas e suportadas por genes nucleares e mitocondriais.

1.5.6 Sequências repetitivas de DNA: microssatélites.

Uma importante proporção das sequências no genoma dos tripanossomatídeos está constituída

por sequências repetitivas que podem se distribuir de modo agrupado ou disperso ao longo do genoma.

Entre estas sequências encontram se os microssatélites ou SSTR, “simple sequence tandem repeats”

55

(Subirana, Messeguer, 2008). Os microssatélites são loci polimórficos presentes no DNA nuclear que

consistem de repetições de motivos de 1 a 6 nucleotídeos, arranjados em “tandem”. Geralmente se

encontram em regiões não codificadoras, são neutros (apresenta herança mendeliana simples), são co-

dominantes (permitindo diferençar homozigotos dos heterozigotos) e possuem uma alta taxa de

mutação, condição que faz dessas sequências ótimos alvos como marcadores moleculares para

estudos de genética populacional e nas análises de relacionamento entre espécies muito próximas.

SSTRs são classificadas pelo motivo repetido e pelo tipo de sequência repetitiva. O alto grau de

polimorfismo do número de repetições decorre das altas taxas de mutação nestes loci. SSTRs são

flanqueadas por sequências únicas e conservadas, permitindo desenvolver ensaios de PCR para sua

amplificação e análises, sendo extremamente úteis em estudos genéticos e taxonômicos (Requena et

al., 1996). As altas taxas de mutação das sequências de microssatélites são explicadas

fundamentalmente pelo modelo de “slippage”. Quando o DNA é replicado na meiose, a enzima DNA

polimerase pode deslizar para frente ou para trás sobre as unidades de repetição, acrescentando ou

subtraindo unidades de repetição à fita de DNA filha. As sequências dos microssatélites evoluem por

um mecanismo similar ao descrito.

Durante as análises de sequências de microssatélites o número das unidades de repetição é

determinado para cada alelo de um determinado lócus. Os perfis obtidos ao analisar a combinação dos

tamanhos de alelos para diferentes lócus, geralmente resultam em picos únicos e permitem segregar

espécies, subespécies, linhagens ou genótipos. Análises de microssatélites têm sido amplamente

utilizados na caracterização do polimorfismo genético e definição de linhagens e genótipos baseados

em análises multilócus em populações de T. cruzi (Oliveira et al., 1998; Macedo et al., 2001; de Freitas

et al., 2006, Zafra et al., 2011; Llewellyn et al., 2011, Yeo et al., 2011), na detecção e diferenciação de

genótipos associados a diferentes formas clinicas da doença em pacientes infectados (Valadares et al.,

2008) e em análises filogenéticas e filogeográficas que visam elucidar aspectos epidemiológicos de

genótipos que representam um risco potencial na saúde humana (Llewellyn et al., 2009). Polimorfismo

de microssatélites foi também detectado na região intergênica do gene do mini-exon em T. rangeli

(Grisard et al., 1999; Maia da Silva et al., 2007) e, embora esses marcadores ainda não tenham sido

empregados em estudos populacionais nessa espécie, tem se mostrado úteis em populações de T.

cruzi (Cura et al., 2010). O sequenciamento de genomas inteiros de diversas espécies de

tripanossomas permitirá futuramente dispor de marcadores SSTRs para estudos populacionais mais

robustos.

As análises de microssatélites em estudos populacionais de tripanossomas africanos têm sido

realizadas com maior ênfase para as espécies de importância na saúde pública (subgênero

Trypanozoon) e, em menor extensão, de interesse veterinário (Koffi et al., 2007). No primeiro caso,

56

devido à severidade e variação clínica das doenças em humanos e necessidade de métodos que

permitam distinguir entre parasitas geneticamente muito relacionados, indistinguíveis com diversos

métodos moleculares, embora com acentuadas diferenças epidemiológicas, ecológicas e de

patogenicidade e virulência (Hoare, 1972; Lun et al., 2004; Li et al., 2005a,b; 2007). Sequências de

microssatélites de isolados de T. evansi, T. equiperdum, T. brucei brucei, T. b. gambiense e T. b.

rhodesiense permitiram definir genótipos específicos de grupo e inclusive segregar em um padrão

particular T. b. gambiense grupo 1 (Gibson, 1986, Biteau et al., 2000; Salim et al., 2011), assim como

mostrar que isolados sul americanos de T. evansi estão muito relacionados com isolados chineses

(Biteau et al., 2000).

Recentemente, SSTRs foram empregadas em um estudo filogeográfico de populações de T.

brucei. O poder de resolução desses marcadores, em conjunto com análises de sequências dos gene

COI (cinetoplasto) e o gene nuclear associado à resistência a infecção em humanos (SRA), permitiu

não somente distinguir T. b. gambiense grupos 1 e 2, como também mostrar que T. b. gambiense

grupo 2 era geneticamente mais relacionado à T. b. brucei. Além disso, foi mostrado que T. b.

rhodesiense e T. b. brucei estão mais relacionados entre eles do que com qualquer outra espécie do

subgênero (Balmer et al., 2011).

SSTRs tem permitido efetuar estudos abrangentes da estrutura genética populacional nestas

mesmas espécies concluindo que, enquanto T. b. brucei possui uma ampla diversidade em diferentes

regiões geográficas, populações de T. b. rhodesiense podem variar de alta a limitada diversidade,

dependendo da localização do foco. Finalmente, isolados de T. b. gambiense exibem baixos níveis de

diversidade dentro dos focos, no entanto, isolados de focos diferentes apresentam uma alta divergência

(Simo et al., 2010; Tait et al., 2011). Esses resultados tem sido congruentes com outros previamente

estabelecidos empregando AFLP e MGE-PCR, indicando diferentes formas de estrutura populacional

para estas subespécies (Li et al., 2005b; Simo et al., 2005, 2008; Tait et al., 2011).

Estudos baseados em sequências de microssatélites em tripanossomas de animais de interesse

econômico são bastante limitados. (Biteau et al., 2000; Njiru et al., 2007). Marcadores de

microssatélites permitiram demonstrar a presença de recombinações genéticas em uma população

subestruturada de T. congolense Savannah, com grande número de genótipos baseados (Morrison et

al., 2009). Sequências de microssatélites desenvolvidas para genotipagem multilocus (MLG) de

populações de T. vivax sugeriram uma estrutura populacional clonal característica, com altas taxas de

heterozigotos, altos níveis de desequilíbrio de ligação, limitado número de genótipos e falta de

congruência entre as frequências de genótipos observadas para cada alelo e as frequências preditas

para populações com recombinações ao acaso (Duffy et al., 2009). A maioria destes estudos que

avaliou a diversidade genética e estrutura populacional com marcadores de microssatélites foi realizada

57

em populações simpátricas e geograficamente restritas. Com isso, fica claro a necessidade de investir

em estudos filogeográficos abrangentes que visem entender a diversidade e relacionamento genético e

a estrutura populacional destas espécies, em diferentes situações epidemiológicas (Tait et al., 2011).

1.5.7 Genes associados a sítios de expressão das VSGs (ESAG6)

Genes associados aos sítios de expressão das VSGs (ESAGs) têm se mostrado de grande

potencial na detecção de polimorfismo em espécies do subgênero Trypanozoon (Isobe et al., 2003;

Witola et al., 2005). Esses genes estão envolvidos nos mecanismos de captação do ferro requerido

para a sobrevivência dos tripanossomas em geral, os quais captam o mineral mediante um processo

mediado por receptor, incorporando a transferrina do hospedeiro vertebrado (Schell et al., 1991).

Os receptores de transferrina dos tripanossomas são heterodímeros codificados por dois genes

associados aos sítios de expressão das VSG: ESAG6 e ESAG7 (Figura 7) (Steverding, 2000, 2003;

Kabiri, Steverding, 2001), com aproximadamente 20 variantes descritas em T. brucei (Isobe et al.,

2003; Witola et al., 2005). Estudos sugerem que a variabilidade nos receptores da transferrina em T.

brucei possui uma função crucial na multiplicação e na sobrevivência do parasita ao dispor de um

amplo repertório de fenótipos de receptor que garante um adequado consumo da transferrina do

hospedeiro, ainda na presença de anticorpos para transferrina que concorrem pelo receptor (Bitter, et

al., 1998; Steverding, 2003). A base genética desse polimorfismo de receptores reside nos genes

ESAG6 e ESAG7, cuja expressão está associada à expressão das VSGs na região telomérica dos

cromossomos. Tripanossomas com maior número de variantes de receptores (alto polimorfismo no

ESAG6-7) e capacidade de troca das VSGs (e consequentemente dos ESAGs), poderão se

estabelecer em um maior número de hospedeiros distintos e garantir o consumo do ferro requerido

para multiplicação e sobrevivência, já que diferentes fenótipos de receptores possuem também

diferentes afinidades pelas moléculas de transferrina polimórficas dos diferentes hospedeiros (Young et

al., 2008).

Análises dos genes ESAG6-7 em membros do subgênero Trypanozoon têm revelado pouca

variabilidade em espécies como T. equiperdum, com limitado número de hospedeiros e acentuada

variabilidade em T. brucei e T. evansi, espécies que possuem uma ampla diversidade de hospedeiros

(Isobe et al., 2003; Witola et al., 2005; Mekata et al., 2009). Nesse sentido, tem-se sugerido que o

polimorfismo nas sequências desses genes em T. evansi poderia ser uma ferramenta valiosa nas

análises de genética populacional e identificação de genótipos (Witola et al., 2005). Porém, estudos

desses genes em populações sul-americanas de T. evansi são muito limitados.

58

Figura 7 - Estrutura de um sitio de expressão de VSG no telómero do cromossoma, salientando os genes que codificam para o receptor de transferrina e as regiões hipervariável (HV) e de enlace a transferrina (I-IV): ESAG6 e ESAG7.

Análises da variabilidade no gene ESAG6 demostraram um alto polimorfismo nas cópias de

isolados de T. evansi de bois na Ásia (Tailândia e Filipinas) e América do Sul (Peru), assim como em

isolados de camelos da África (Egito) (Witola et al., 2005; Mekata et al., 2009, Amer et al., 2011).

Entretanto, isolados de T. equiperdum mostraram um limitado repertório de alelos comparado com o

repertório encontrado em T. b. brucei (Isobe et al., 2003; Young et al., 2008), que demonstram uma

associação entre o número de hospedeiros e a heterogeneidade nas sequências de ESAG6.

O estudo de polimorfismo de cópias do gene ESAG6 em populações sul-americanas de T. evansi

está limitado a dois isolados, do Peru e Bolívia (Mekata et al., 2009), ambos obtidos de boi doméstico.

O repertório de cópias do gene ESAG6 em isolados de T. evansi do Brasil e da Venezuela ainda não

foi avaliado, assim como também não foi ainda avaliado o polimorfismo de ESAG6 em isolados de

animais silvestres. Considerando o amplo número de espécies de hospedeiros e distribuição geográfica

exibida por T. evansi, o entendimento da real diversidade genética nesses genes e sua utilidade em

estudos de estrutura populacional demandam estudos mais abrangentes, que comparem um grande

número de isolados provenientes de diversas espécies de hospedeiros domésticos e silvestres, assim

como de diferentes origens geográficas.

68

4 CONSIDERAÇÕES GERAIS

Os resultados obtidos durante o trabalho desenvolvido para essa tese estão resumidamente

apresentados e discutidos abaixo. Optamos por apresentar os artigos já publicados, ou em fase de

publicação, que constituem os anexoss apresentados no final da tese e resumidamente apresentados

abaixo.

4.1 Trypanosoma vivax na África e América do Sul. Relacionamento genético, estrutura

populacional e epidemiologia molecular.

Anexo 1 - Phylogenetic analysis of Trypanosoma vivax supports the separation of South

American/West African from East African isolates and a new T. vivax-like genotype infecting a

nyala antelope from Mozambique.

Rodrigues, A.C., Neves, L., Garcia, H.A., Viola, L.B., Marcili, A., Da Silva, F.M., Sigauque, I., Batista, J.S., Paiva, F.,

Teixeira, M.M.G. Parasitology, 2008; 135: 1317-1328

O subgênero Trypanosoma (Duttonella), pertencente à Seção Salivaria do gênero Trypanosoma,

tem sido considerado monotípico, representado somente por Trypanosoma vivax. No entanto, critérios

taxonômicos tradicionais incluíram nesse subgênero a T. uniforme com distribuição na África Central, e

as subespécies T. v. vivax e T. v. ellipsiprymni, no continente africano, todas com transmissão cíclica

por moscas tsé-tsé (Glossina spp.). T. v. viennei, considerada uma espécie diferente restrita ao

continente Americano (América do Sul e Central) mecanicamente transmitida por dípteros das famílias

Tabanidae e Stomixidae, também foi incluída nesse subgênero. Entretanto, essas espécies não

validada por filogenias moleculares (Ventura et al., 2001; Cortez et al., 2006).

Apesar das diferenças no modo de transmissão, evidencias molecularers, isoenzimática e

filogenéticas sugeriram uma estreita associação entre os isolados do oeste africano e isolados

americanos, os quais se diferenciam dos isolados do leste da África por diversos critérios: morfológicos,

patológicos, de comportamento em hospedeiros vertebrados e moscas tsé-tsé e, recentemente, por

marcadores moleculares, Os isolados dessa região tem sido classificados como T. vivax-“like” (Adams

et al., 2010a.b). A ausência de amostras destas espécies tem impedido a realização de estudos

moleculares, dificultado a compreensão da diversidade biológica e genética do subgênero T.

(Duttonella), cuja revisão requer a avaliação de características morfológicas, biológicas e moleculares

das espécies descritas.

As correlações filogenéticas e taxonômicas de T. vivax e tripanossomas relacionados agrupados no

subgênero T. (Duttonella), foi avaliada mediante uma combinação de análises filogeográfica e

69

morfológica. Neste estudo, caracterizamos um isolado de tripanossoma proveniente de um antílope

nyala (Tragelaphus angasi) de Moçambique, diagnosticado como T. vivax-“like” segundo critérios

morfológicos, biológicos e moleculares. As divergências genéticas, padrões filogeográficos e

associações filogenéticas estiveram baseadas em sequencias da subunidade menor do gene

ribossômico (SSUrDNA) e do espaçador interno transcrito (ITS rDNA) de isolados de T. vivax da

América do Sul (Brasil e Venezuela), oeste da África (Nigéria) e isolados do leste africano

(Moçambique, Quênia e Tanzânia), considerados como T. vivax-“like”. Apesar do isolado do antílope

nyala ter agrupado no clado T. vivax, mostrou-se altamente divergente dos outros isolados avaliados,

incluindo dos T. vivax-“like” do leste africano. Considerando o seu hospedeiro de origem, as

características morfológicas, o comportamento parasitológico em caprinos experimentalmente

infectados, o posicionamento filogenético, assim como as divergências genéticas em relação ao resto

dos membros do subgênero T. (Duttonella) analisados, o isolado do nyala foi proposto como um novo

genótipo de tripanossoma filogeneticamente muito relacionado com T. vivax, corroborando a grande

complexidade genética do subgênero e a existência de diversos genótipos ainda não descritos.

Anexo 2 - Cathepsin L-like genes of Trypanosoma vivax from Africa and South America -

characterization, relationships and diagnostic implications.

Cortez, A.P., Rodrigues, A.C., Garcia, H.A., Neves, L., Batista, J.S., Bengaly, Z., Paiva, F., Teixeira, M.M.G. Molecular

and Cellular Probes, 2009; 23: 44-51.

Diversos estudos têm demonstrado que as cisteíno-proteases expressas por tripanossomatídeos

tem papel fundamental no desenvolvimento desses protozoários nos hospedeiros vertebrados e

invertebrados. As principais atividades proteolíticas desse grupo de enzimas são atribuídas as

catepsinas L-“like”, uma família multigênica com diferentes isoformas relacionadas que possui genes

homólogos já descritos em tripanossomas africanos (T. b. brucei, T. b. rhodesiense, T. congolense),

americanos (T. cruzi, T. rangeli), tripanossomas de peixe (T. carassii), espécies do gênero Leishmania

e bodonídeos parasitas de peixes. Estes estudos têm mostrado o grande potencial dos genes de

catepsina L- “like” em análises filogenéticas e como alvos para métodos diagnósticos, devido ao

polimorfismo das sequências, organização gênica, número de copias, filogenia e tipo de evolução e

expansão desses genes.

As sequências dos genes que codificam catepsina L-“like” em isolados africanos e sul-americanos

de Trypanosoma vivax e T. vivax-“like” foram caracterizadas a fim de avaliar a aplicabilidade como

marcadores genéticos para análise de diversidade e como ferramenta diagnóstica de alta sensibilidade

e especificidade. As análises filogenéticas de sequências correspondentes ao domínio catalítico dos

70

genes de catepsina L–“like” revelaram um polimorfismo substancial e o agrupamento das sequências

em nove grupos (TviCATL 1-9) separados por grandes distancias genéticas. Os clados TviCATL 1-4

foram compostos por sequências de isolados da Nigéria e Burquina Faso (oeste da África) e América

do Sul (Brasil e Venezuela), isolados que pertencem ao mesmo genótipo de T. vivax, baseado em

sequências de genes ribossômicos. Os genótipos T. vivax–“like” do leste africano mostraram

sequências muito divergentes, que foram incluídas nos clados TviCATL 5-7 (isolados de Moçambique)

e TviCATL 8-9 (isolado do Quênia). As análises filogenéticas desses genes corroboraram as relações

entre espécies de tripanossomas refletidas em filogenias inferidas empregando sequências de SSU

rRNA. Além disso, o encontro de diferentes sequências para cada genótipo previamente definido com

sequências ribossômicas indicaram que sequências dos genes de catepsina L–“like” representam

ótimos alvos para estudos epidemiológicos e de genética populacional em T. vivax. Sequências destes

genes compartilhadas por todos os genótipos de T. vivax e ausentes em outras espécies de

tripanossomas permitiram o desenvolvimento de um ensaio de PCR diagnóstico e de alta sensibilidade

e especificidade para estudos epidemiológicos na América do Sul e África.

Anexo 3 - Horses naturally infected by Trypanosoma vivax in southern Brazil.

Da Silva, A.S., Garcia, H.A., Costa, M.M., França, R.T., De Gasperi, D., Zanette, R.A., Amado, J.A., Lopes, S.T.,

Teixeira, M.M.G., Monteiro, S.G. Parasitology Research, 2011; 108: 23-30.

T. vivax possui uma ampla diversidade de hospedeiros ungulados, especialmente ruminantes

(Artiodactyla) e equinos (Perissodactyla). Em geral, a tripanossomíase por T. vivax é uma doença

endêmica de curso clínico crônico, com animais assintomáticos ou com sinais clínicos inespecíficos.

Porém, fatores associados ao parasita e a espécie e raça do animal infectado podem determinar

infecções graves com alterações hematológicas e nervosas. Animais domésticos de regiões não

endêmicas introduzidos em áreas endêmicas, assim como rebanhos livres desses tripanossomas após

a introdução de animais infectados, também podem exibir manifestações severas da doença. Neste

trabalho, reportamos o primeiro surto de infecção por T. vivax em cavalos no Brasil, que ocorreu na

região Sul do Brasil, uma região não endêmica onde apenas recentemente foi reportada a presença

desse parasita em bovinos naturalmente infectados. Foram avaliados 12 cavalos de uma fazenda na

região Sul, quatro com sinais clínicos inespecíficos que incluíram membranas mucosas pálidas, febre,

perda de peso, inchação da região abdominal, prepucial ou vulvar. O diagnóstico de T. vivax foi

confirmado em quatro cavalos, com base nos parâmetros morfológicos de formas tripomastigotas em

esfregaços sanguíneos e por PCR específica para T. vivax. Todos os animais infectados por T. vivax

apresentaram anemia, e a maior parte deles apresentou incremento nos níveis de beta-1, beta-2 e

71

gama globulinas. Apesar de todos os animais terem sido tratados com aceturato de diminazeno, a cura

não foi alcançada e houve uma recaída da doença poucas semanas após o tratamento. Os dados

mostrados sugerem que os isolados de T. vivax do Brasil, previamente reportados em infecções em

bois, búfalos, ovinos e caprinos, podem ser altamente patogênicos para cavalos, causando doença

severa e morte de animais devida à recorrência da infecção.

Anexo 4 - Association of Trypanosoma vivax in extracellular sites with central nervous system

lesions and changes in cerebrospinal fluid in experimentally infected goats.

Batista, J.S., Rodrigues, C.M., Garcia, H.A., Bezerra, F.S., Olinda, R.G., Teixeira, M.M.G., Soto-Blanco, B. Veterinary

Research, 2011; 42: 63-75

A tripanossomíase por T. vivax é, em geral, uma doença de caráter endêmico, curso clínico crônico

e sinais inespecíficos que incluem anemia, febre, perda de peso e morbidade variável. Porém, apesar

de nas regiões endêmicas a doença possui um impacto de leve a moderado na saúde dos animais

infectados, diversos fatores inerentes tanto ao isolado parasitário como ao hospedeiro podem

determinar infecções graves com severas alterações hematológicas e nervosas, como recentemente

reportado no Paraíba, Brasil, onde a introdução de animais portadores assintomáticos em uma região

não endêmica (animais nunca expostos ao parasita) desencadeou um surto com alta mortalidade,

morbidade e severas manifestações neurológicas que sugeriram a presença do parasita no sistema

nervoso. Além disso, a recorrência da doença semanas após o tratamento é um fato comumente

observado, sugerindo a presença do parasita em sítios “protegidos” no hospedeiro.

Neste estudo, avaliamos as alterações anatômicas, histopatológicas e na composição do líquido

cérebro-espinhal em caprinos experimentalmente infectados com Trypanosoma vivax. A presença do T.

vivax no sistema nervoso central (SNC) foi avaliada mediante um ensaio de PCR (TviCatL-PCR). Com

esses fins, doze caprinos adultos de sexo masculino foram aleatoriamente distribuídos em três grupos

(G): G1, animais infectados com T. vivax e avaliados durante a fase aguda da infeção; G2, animais

infectados avaliados durante a fase crónica da infeção e G3, consistente de animais não infectados.

Cada animal dos grupos G1 e G2 foi inoculado com 1.25x105 tripomastigotas. Tanto a análises do

líquido cérebro espinhal (LCE) como a pesquisa de T. vivax foram realizadas 15 dias após a infecção

(dpi) nos animais do grupo G1 e no quinto dia após o inicio de manifestações neurológicas, sugestivas

de infecção no sistema nervoso, no grupo G2. Todos os animais foram sacrificados e fragmentos do

SNC dos animais dos grupos experimentais foram processados e avaliados por PCR específico para T.

vivax. Os animais inoculados (G1 e G2) mostraram hipertermia e anemia desde o quinto dpi,

conjuntamente com presença de parasitas detectáveis no sangue, com pico de parasitemia entre o

72

sétimo e o vigésimo primeiro dpi. Sinais clínicos sugestivos da infecção do sistema nervoso foram

observados em três animais do G2, grupo onde foi diagnosticada meningite e meningoencefalite. Os

resultados do PCR específico para T. vivax foram positivos em todas as amostras avaliadas dos grupos

G1 e G2. Esses resultados permitiram concluir que o T. vivax pode alcançar o tecido nervoso, o que é a

principal causa da progressiva instauração de manifestações patológicas associadas ao SNC nos

animais experimentalmente infectados.

Anexo 5 - High mortality and lesions of the central nervous system in trypanosomosis by

Trypanosoma vivax in Braziliam hair sheep.

Galiza, G.J., Garcia, H.A., Assis, A.C., Oliveira, D.M., Pimentel, L.A., Dantas, A.F., Simões, S.V., Teixeira, M.M.G., Riet-

Correa, F. Veterinary Parasitology, 2011; 182: 359-363.

A infecção por T. vivax pode se mostrar tanto como doença crônica e assintomática quanto

como doença aguda severa, dependeddo de certas situações epidemiológicas. Uma das características

de animais de regiões endêmicas é a existência de uma resposta imune induzida pelo contato com o

parasita, que geralmente é mantida ou reforçada por continuas reinfecções em regiões com

transmissão ativa. Uma situação contrária é observada em animais de regiões não endêmicas, os quais

carecem de proteção imune pela ausência de contato com esse tripanossoma. Assim, animais

domésticos de regiões não endêmicas introduzidos em áreas endêmicas, assim como rebanhos livres

desses tripanossomas após a introdução de animais infectados, podem exibir manifestações severas

da doença.

Neste estudo, reportamos um surto de tripanossomoses por Trypanosoma vivax em ovelhas

(raça Santa Inês) em uma fazenda da Paraíba, região não endêmica do Nordeste brasileiro. Do total do

rebanho, constituído por 306 ovelhas, 240 apresentaram manifestações clínicas e 216 morreram da

infecção. Os sinais clínicos incluíram anorexia, letargia, anemia, pelo áspero, perda de peso, edema

submandibular, abortos e, em alguns dos animais severamente afetados, foi observada presença de

sinais neurológicos tais como decúbito lateral, movimentos de pedalagem, cabeça pressionada contra

superfícies sólidas, e tremores musculares. A confirmação da infeção por T. vivax foi efetuada em

esfregaços sanguíneos e por PCR específico para T. vivax. Na necrópsia, os animais exibiram sangue

aguado, coloração pálida dos tecidos e presença de abundante líquido na cavidade peritoneal e saco

pericárdico. Histologicamente, foram observadas miocardite não supurativa e meningoencefalite com

áreas de malácia. Depois do tratamento, os animais foram negativos na avaliação parasitológica de

esfregaços sanguíneos e PCR. Bovinos e bubalinos que compartilharam as mesmas pastagens com as

ovelhas também resultaram infectados, no entanto, não manifestaram sinais clínicos da doença. Os

dados epidemiológicos sugerem que T. vivax foi introduzido no rebanho susceptível por búfalos

73

portadores assintomáticos da infecção e que o parasita foi transmitido ao rebanho tanto por picadas de

tabanídeos como por via iatrogênica.

Anexo 6 - Trypanosoma vivax: polymorphisms of ITS rDNA sequences and microsatellites

support high genetic diversity in East Africa and diversity reducing events shaping populations

that infect livestock in West Africa and South America.

Garcia, H.A., Rodrigues, A.C., Bengaly, Z., Neves L., Minervino, A.H., Teixeira, M.M.G.

Nesse estudo, avaliamos a variabilidade genética de isolados de T. vivax visando investigar se

diferentes modos de transmissão a que estão submetidos isolados dessa espécie na África

(ciclicamente transmitidos por tsé-tsé) e na América do Sul (mecanicamente transmitidos por moscas

hematófagas) pode desempenhar papel importante no tamanho do repertório genético. Em estudos

anteriores, mostramos que isolados brasileiros são geneticamente similares a um isolado da Nigéria

(Oeste da África), todos agrupados no genótipo América do Sul/Oeste da África. Esse genótipo foi

separado por grande distância genética de três novos genótipos de T. vivax detectados em antílope

(Nyala) e bois no Leste da África (Quênia e Moçambique). Genótipos ainda mais divergentes foram

encontrados em moscas tsé-tsé capturadas na Tanzânia.

Embora a homogeneidade genética seja atribuída ao modo mecânico de transmissão de T. vivax, a

ausência de estudos moleculares comparativos de populações africanas e sul americanas não permite

confirmar essa hipótese. O estudo de uma amostragem abrangente é indispensável para investigar a

existência de genótipos associados com: determinadas áreas geográficas; espécies de hospedeiros;

regiões endêmicas e surtos; formas clínicas, etc. Com esse objetivo, comparamos 60 novos isolados

de T. vivax de origens distantes na África (Moçambique, Gana, Benin, Nigéria, Gâmbia e Burkina Faso

– áreas com tsé-tsé) e América do Sul (Brasil, Venezuela e Guiana Francesa). Foram caracterizados

isolados de T. vivax de bois, cabras, moscas tsé-tsé e de um antílope da África, e de bois, búfalos,

cabras, ovelhas e cavalos do Brasil, Venezuela e Guiana. Para evitar uma possível seleção de

genótipos, comparamos isolados de infecções primárias e expandidos em animais experimentais.

Comparamos isolados de animais assintomáticos de áreas endêmicas (Brasil: Pantanal e Pará;

Venezuela: Apure, Cojedes Guárico e Anzoátegui) com isolados de animais infectados em surtos

ocorridos fora de área endêmica, apresentando tripanossomíase grave com diferentes formas clínicas

(Brasil: São Paulo, Rio Grande do Sul, Paraíba e Rio Grande do norte).

Para o estudo de polimorfismo utilizamos duas abordagens: análises de sequências de ITSrDNA e

de polimorfismo de loci de microssatélites. Os dados obtidos indicam a propagação, no Brasil e Oeste

da África, de isolados de T. vivax geneticamente homogêneas, independentemente das diversas

74

condições avaliadas. Apenas um micropolimorfismo foi observado entre alguns isolados primários em

relação aos mantidos em animais experimentais. A análise genética populacional baseada em

sequencias de microssatélite revelou pequena diversidade genética (número de alelos por lócus e

riqueza de alelos), excesso de heterozigosidade, significativo desacordo com o equilíbrio de Hardy-

Weinberg, significativos níveis de desequilíbrio de união entre as diversas combinações de pares de

loci e muitos isolados pertencentes a poucos genótipos sugerindo, assim, expansão clonal de

genótipos. O grau de polimorfismo se revelou mais acentuado nas análises de loci de microssatélites,

com relevante polimorfismo entre isolados da África comparado aos isolados sul americanos. Porém, o

limitado número de isolados africanos caracterizados por microssatélite (14) impediu uma análise mais

confiável.

A grande homogeneidade nas sequências de ITS rDNA entre isolados americanos de T. vivax

indica um processo de homogeneização genética relacionada ao modo de transmissão mecânico

adotado na América do Sul. O limitado polimorfismo encontrado entre os isolados do Oeste da África

corrobora a evolução clonal das populações de T. vivax em toda essa região, apesar da transmissão

por tsé-tsé, como recentemente mostrado em isolados de jumentos, cavalos e bois na Gâmbia.

Os resultados aqui descritos baseados na análise de polimorfismo de sequências de ITS rDNA de

T. vivax corroboram trabalhos prévios no Leste da África (Moçambique e Tanzânia), onde genótipos

altamente divergentes têm sido observados circulando em uma mesma região. Neste estudo avaliamos

três novos isolados de mosca tsé-tsé que se mostraram altamente divergentes de todos os genótipos,

com sequências que agruparam em um só clado, mais relacionado com um isolado de boi do Quênia

(6% divergência). Não existem estudos genéticos de T. vivax nessa região que permitam avaliar a

origem da diversidade genética. É provável que algum processo de recombinação ocorra na mosca tsé-

tsé como demonstrado para T. brucei e T. congolense. Não foi possível realizar um estudo

populacional baseado em sequências de microssatélites nos isolados do Leste da África devido ao

limitado número de isolados (2) caracterizados dessa região, e disponíveis para estudos moleculares.

Os marcadores moleculares desenvolvidos nesse estudo podem ser úteis em estudos epidemiológicos

visando avaliar o repertorio genético de T. vivax na América do Sul e na África, a diversidade das

populações em diversos hospedeiros com diferentes sinais clinicos da doença, os genótipos que

circulam em áreas endêmicas e de surtos, a estrutura populacional e como marcador para o

seguimento da origem geográfica e dispersão do T. vivax.

75

4.2 Trypanosoma theileri e espécies relacionadas do subgênero Trypanosoma (Megatrypanum):

diagnóstico e epidemiologia molecular, estrutura populacional e dispersão espacial de

genótipos, análises eco-biogeográficas e filogeográficas.

Anexo - 7. Cysteine proteases of Trypanosoma (Megatrypanum) theileri: cathepsin L-like gene

sequences as targets for phylogenetic analysis, genotyping diagnosis.

Rodrigues, A.C., Garcia, H.A., Ortiz, P.A., Cortez, A.P., Martinkovic, F., Paiva, F., Batista, J.S., Minervino, A.H.,

Campaner, M., Pral, E.M., Alfieri, S.C., Teixeira, M.M.G. Parasitology International, 2010; 59: 318-25.

T. theileri é um parasita comum de bovinos domésticos com distribuição mundial, ciclicamente

transmitido por tabanídeos e considerado não patogênico para os seus hospedeiros mamíferos. As

cisteíno-proteases similares à enzima catepsina L (CatL-like) têm sido indicadas como bons alvos para

estudos evolutivos de tripanossomas uma vez que desempenham funções vitais no desenvolvimento

desses parasitas e nos ciclos biológicos nos hospedeiros vertebrados e vetores, contribuindo não só

para a infectividade e patogênese, como também para o controle da infecção. Tanto a enzima

arquétipo das CatL de tripanossomatídeos (cruzipaína), quanto enzimas homólogas descritas em

tripanossomas africanos (brucipaína, rhodesaína e congopaínas), são importantes fatores de virulência,

patogenicidade e estão envolvidas em processos de invasão celular (cruzipaína), diferenciação dos

parasitas nas moscas tsé-tsé e na modulação da resposta imune. No entanto, seu papel em

tripanossomas não patogênicos para seus hospedeiros vertebrados não foi investigado. Recentemente,

foi demonstrada a expressão dos genes de CatL em T. rangeli, espécie não patogênica, e sua

aplicação no diagnóstico e análise de relacionamento entre isolados. Embora T. theileri e espécies

relacionadas constituem os tripanossomas de maior distribuição geográfica em bovinos, o

conhecimento sobre enzimas proteolíticas nessas espécies é muito limitado.

Neste trabalho, caracterizamos genes que codificam cisteíno proteases CatL em isolados de

bovinos, búfalos asiáticos e cervo. A análise de 78 sequências do domínio catalítico das CatL de 22

isolados de T. theileri revelou seis genótipos estreitamente agrupados no clado T. theileri. Os genes de

CatL nesses tripanossomas estão organizados em arranjos em “tandem” de 1.7 kb, localizados em dois

cromossomos de tamanhos aproximados de 600-720 Mpb. As análises das sequências de CatL de

diversas espécies de tripanossomas permitiu identificar regiões de sequências exclusivas de T. theileri

e suas espécies relacionadas, a partir das quais foi possível desenvolver um ensaio de PCR que

permitiu detectar isolados de T. theileri de todos os genótipos que têm sido descritos em bois, búfalos e

cervos, assim como T. theileri em vetores tabanídeos.

A expressão das cisteíno proteases de T. theileri foi demonstrada avaliando a atividade proteolítica

em géis de gelatina e por hidrólises do substrato Z-Phe-Arg-AMC. Os resultados deste trabalho

76

estiveram em concordância com dados prévios baseados em genes ribossômicos e mini-exon,

demonstrando que sequências dos genes de CatL são ótimos alvos para diagnóstico, genotipagem

populacional e estudos evolutivos de tripanossomas do clado T. theileri. A caracterização dos genes

que codificam para CatL e a comparação com homólogos de outros tripanossomas e atividade

proteolítica, constituem o primeiro passo no conhecimento dessas enzimas de T. theileri.

Anexo 8 - High genetic diversity in field isolates of Trypanosoma theileri assessed by analysis of

cathepsin L-like sequences disclosed multiple and new genotypes infecting cattle in Thailand.

Garcia, H.A., Kamyingkird, K., Rodrigues, A.C., Jittapalapong, S., Teixeira, M.M.G, Desquesnes, M. Veterinary

Parasitology, 2011; 180: 363-367.

Embora mundialmente distribuído em diversas espécies de hospedeiros vertebrados da Ordem

Ruminantia, estudos envolvendo T. theileri e espécies relacionadas são muito limitados, como também

é limitada a disponibilidade de sequências de genes informativos em termos da elucidação da estrutura

populacional, diagnóstico e análise filogenética. Análises prévias de isolados brasileiros empregando

genes ribossômicos, mini-exon e cisteíno proteases catepsina L (CatL) têm permitido definir quatro

genótipos de T. theileri de boi, distribuídos em duas linhagens, TthI e TthII. No entanto, nesses estudos,

as origens dos isolados não são representativas da ampla distribuição geográfica de T. theileri é

espécies relacionadas do subgênero Trypanosoma (Megatrypanum); só um isolado de cada país,

Japão, Escócia, Alemanha e Estados Unidos. Além disso, a maioria dos isolados analisados vem de

diversas regiões do Brasil. Neste estudo, caracterizamos T. theileri de bois da Tailândia, confirmando a

ampla prevalência e distribuição geográfica dessa espécie. Foram avaliadas, por métodos

parasitológicos de concentração (microhematócrito: MH) um total de 210 amostras sanguíneas de bois

provenientes de seis fazendas em diversos Distritos da Tailândia. Dessas, 14 amostras revelaram

infecções por parasitas morfologicamente similares a T. theileri. Amostras adicionais foram

diagnosticadas por PCR (TthCATL-PCR), se revelando positivas para T. theileri embora os resultados

por MH tenham sido negativos, revelando a existência de infecções crípticas. Os resultados revelaram

uma prevalência de infecções por T. theileri de 26 ± 15% (95% IC). Além disso, doze amostras

adicionais positivas foram detectadas em bois de outras 11 fazendas em diversos Distritos. Do total de

30 amostras positivas para T. theileri, por MH e/ou PCR, nas 17 fazendas avaliadas, sete amostras

foram selecionadas para a avaliação do polimorfismo genético através da análise de sequências

parciais dos genes da CatL amplificados por PCR.

Todas as sequencias de CatL de T. theileri da Tailândia avaliadas neste estudo agruparam com

sequencias das linhagens filogenéticas TthI e TthII, descritas em trabalhos prévios com genes

77

ribossômicos, mini-exon e catepsina L, dando forte suporte à existência de duas linhagens principais de

T. theileri em bois ao redor do mundo. No entanto, 11 das 29 sequencias de CatL analisadas diferiram

das demais, demonstrando um amplo e polimórfico repertório genético até agora não descritos em

outros países, com múltiplos genótipos de T. theileri circulando nos bois da Tailândia.

Anexo 9 - Characterization of spliced leader genes of Trypanosoma (Megatrypanum) theileri:

phylogeographical analysis of Brazilian isolates from cattle supports spatial clustering of

genotypes and parity with ribosomal markers.

Rodrigues, A.C., Garcia, H.A., Batista, J.S., Minervino, A.H., Góes-Cavalcante, G., Maia da Silva, F., Ferreira, R.C.,

Campaner, M., Paiva, F., Teixeira, M.M.G. Parasitology, 2010; 137: 111-122.

Trypanosoma theileri é a espécie tipo do subgênero Trypanosoma (Megatrypanum), o qual inclui

espécies relacionadas que segundo critérios tradicionais possuem em comum a existência de grandes

tripomastigotas sanguíneos, restrição de hospedeiros mamíferos, ampla distribuição mundial,

patogenicidade muito limitada e transmissão por contaminação por tabanídeos ou hipoboscídeos. Em

trabalhos prévios baseados em marcadores moleculares ribossomicos demostramos que T. theileri de

boi da América (Brasil e USA), Europa (Escócia e Alemanha) e Ásia (Japão) possuíam uma estreita

associação filogenética, agrupando em um clado homogêneo e fortemente suportado, exclusivo de

isolados provenientes de hospedeiros da ordem Artiodactyla e bem resolvido no gênero Trypanosoma.

Embora nesses estudos tenham sido definidas linhagens e genótipos, ficou evidente que o alto grau de

conservação dos genes avaliados e o limitado número de isolados eram um fator limitante na resolução

das associações dentro do subgênero, devido ao alto grau de relacionamento genético existente entre

os organismos que o compõem. Resolver essa situação requer análises de sequências polimórficas de

um importante número de novos isolados, de diversas espécies e origens geográficas. Neste estudo

determinamos as sequências do gene “spliced leader” (SL ou mini-exon) de 21 isolados de T. theileri de

boi e dois de búfalo de regiões geográficas muito afastadas do Brasil. A análise da unidade de

repetição do gene de SL revelou que o gene 5S rRNA estava inserido dentro da região intergênica. Os

padrões filogeográficos inferidos com as sequências do gene SL revelaram ao menos cinco genótipos

principais de T. theileri distribuídos em duas linhagens bastante divergentes. A linhagem TthI

compreende os genótipos IA e IB de búfalo e boi, respectivamente, isolados que provem das regiões

Central e Sudeste. Enquanto o genótipo IC está restrito a bois da região do Sul. A linhagem TthII incluiu

os genótipos de boi IIA, restrito a região Norte e Nordeste, e o genótipo IIB, encontrado na região

Central, Oeste, Norte e Nordeste. Visando facilitar o processo de genotipagem de isolados foi

padronizado um ensaio de PCR-RFLP do gene SL, o qual se mostrou uma ferramenta muito valiosa no

processo de definição de genótipos, sem necessidade de sequenciar as repetições do gene SL. Os

78

resultados deste estudo enfatizam a complexa estrutura genética das populações de T. theileri e

corroboram a estrutura geográfica de genótipos de T. theileri encontrados em boi.

Anexo 10 - Multilocus phylogeographical analysis of Trypanosoma (Megatrypanum) genotypes

from sympatric cattle and water buffalo populations supports evolutionary host constraint and

close phylogenetic relationships with genotypes found in other ruminants.

Garcia, H.A., Rodrigues, A.C., Martinkovic, F., Minervino, A.H., Campaner, M., Nunes, V.L., Paiva, F., Hamilton, P.B.

and Teixeira, M.M.G. International Journal for Parasitology, 2011; 41: 1385-1396.

Trypanosoma theileri é um parasita comum de bovinos domésticos com distribuição mundial.

Espécies/isolados filogeneticamente muito relacionados encontradas em bovídeos domésticos (bois,

búfalos e ovelhas) e silvestres (antílopes) e em cervídeos foram posicionadas no subgênero T.

(Megatrypanum), que após revisão filogenética passou a ser constituído exclusivamente por parasitas

de ruminantes posicionados no clado T. theileri. Ao contrário dos tripanossomas africanos patogênicos,

os tripanossomas do clado T. theileri, além de exclusivos de ruminantes, apresentam uma aparente

restrição espécie-específica ou por espécies de hospedeiros muito relacionados. Porém, o elevado

grau de relacionamento genético e o limitado número de isolados caracterizados são insuficientes para

sustentar hipóteses filogenéticas de restrição de hospedeiros. Em um estudo prévio com isolados

brasileiros de T. theilerii, demonstramos a existência de, pelo menos, quatro genótipos infectando boi

(Bos taurus) e somente um genótipo em búfalo (Bubalus bubalis). Porém o limitado número de isolados

de búfalos, todos provenientes de áreas próximas, têm impedido a avaliação da diversidade genética

desses isolados, de associações parasita-hospedeiro e da análise da estruturação geográfica das

populações de T. theileri de búfalo e bois. Para abordar esta questão, avaliamos a diversidade genética

e os padrões filogeográficos de 25 isolados provenientes de búfalos e 28 de bois, de quatro regiões

muito afastadas do Brasil e Venezuela.

As análises filogeográficas realizadas nesse estudo foram baseadas nas sequências da

subunidade menor do gene ribossômico (ssrRNA), espaçador interno transcrito (ITSrDNA), 5SrRNA,

enzima glicosomal gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase (gGAPDH), Citocromo b mitocondrial (Cyt b),

mini-exon (SL) e catepsina L-“like” (CatL). Todos os isolados de búfalos, de populações simpátricas e

alopátricas, foram agrupados no genótipo TthIA, enquanto os isolados de bois foram atribuídos a três

diferentes genótipos, todos distintos de TthIA. O polimorfismo em todas as sequencias dos genes

avaliados permitiu a separação dos isolados de tripanossomas que infectam búfalo dos de boi, ovelha,

antílope e cervo, sugerindo que correspondem a espécies diferentes. Filogenias congruentes inferidas

com todos os genes avaliados indicam uma estrutura clonal dos genótipos. A análise multilocus revelou

um agrupamento monofilético formado exclusivamente por tripanossomas de ruminantes, o qual

79

corresponde ao subgênero Trypanosoma (Megatrypanum). O alto grau de especificidade de

hospedeiro, refletido por genótipos exclusivos de cada espécie de ruminante, e a ausência de

genótipos compartilhados por diferentes espécies de hospedeiro, sugerem que a história evolutiva dos

tripanossomas do subgênero Trypanosoma (Megatrypanum) foi fortemente influenciada pelos

ruminantes. No entanto, incongruências entre as filogenias dos ruminantes e dos tripanossomas não

suportam um processo de co-evolução parasita-hospedeiro, sugerindo a ocorrência de processos de

troca de hospedeiros entre tripanossomas de ruminantes, seguido de divergências que deram origem a

novos genótipos de tripanossomas adaptados exclusivamente a uma espécie de ruminante.

Anexo 11 - Trypanosoma (Megatrypanum) melophagium in the sheep ked Melophagus ovinus

from organic farms in Croatia: Phylogenetic inferences support restriction to sheep and sheep

keds and close relationship with trypanosomes from other ruminant species.

Martinkovic F, Matanović K, Rodrigues AC, Garcia HA, Teixeira MMG. J Eukaryot Microbiol, 2012; 59: 134-44.

Trypanosoma (Megatrypanum) melophagium é um parasita não patogênico das ovelhas

transmitido pelo hipoboscídeo Melophagus ovinus (Diptera: Hippoboscidae), ectoparasita restrito a

esses hospedeiros e comumente conhecidos como “sheep ked”. T. melophagium possui uma

distribuição geográfica que se superpõe a de seu hipoboscídeo vetor. Provavelmente, infecções

crípticas ocorrem em todo o mundo onde ovelhas estejam infectadas pelos hipoboscídeo. Atualmente,

as práticas de controle de ectoparasitas em fazendas de ovelhas tem reduzido drasticamente as

populações do hipoboscídeo, hoje restrito às áreas de uso limitado de inseticidas ou à fazendas

orgânicas onde o emprego dessas substancias é proibido. Acredita-se que T. melophagium possui uma

estreita relação com outros parasitas do subgênero Megatrypanum, transmitidos por tabanídeos ou por

outros hipoboscídeos. Estudos morfológicos, ensaios de infecção cruzada entre tripanossomas de

ruminantes e a restrição de hospedeiros exibida pelos hipoboscídeos de ovinos e caprinos

(Melophagus ovinus e Lipotena caprioli, respectivamente) permitiu a separação das espécies T.

theodori (transmitido pelo hipoboscídeo do caprino), T. cervi (por hipoboscídeos de cervos), T.

melophagium e T. theileri, todas posicionadas no subgênero Megatrypanum. A distribuição, prevalência

e as associações parasitas – hipoboscídeo – hospedeiro vertebrado baseiam-se, fundamentalmente,

em dados morfológicos e de desenvolvimento desses tripanossomas no vetor. Dados moleculares de

T. melophagium são muito restritos, o que tem limitado o estudo da diversidade genética, associações

entre genótipos e as correlações filogenéticas dessa espécie com parasitas associados do subgênero

Megatrypanum.

Recentemente, a caracterização molecular de um isolado de T. melophagium da Escócia

mostrou uma estreita associação com T. theileri, sugerindo-se que o primeiro fosse considerado uma

80

linhagem filogenética de T. theileri que se adaptou a transmissão por hipoboscídeos. Neste estudo,

avaliamos a prevalência de T. melophagium em cinco fazendas orgânicas da Croácia. Foi encontrada

uma alta prevalência (86%) de tripanossomas morfologicamente compatíveis no intestino dos

hipoboscídeos. Análises filogenéticas multilocus, baseadas em sequências de SSUrRNA, gGAPDH, SL

e ITS1rDNA, permitiu distinguir T. melophagium de todos os outros tripanossomas de ruminantes

incluídos nas análises e posicionar esse parasita, pela primeira vez incluído na filogenia dos

tripanossomas, no subgênero Megatrypanum. T. melophagium da Croácia mostrou idênticas

sequências às de um isolado da Escócia. As inferências filogenéticas e biológicas do isolado de T.

melophagium da Croácia suportam a restrição pelo hospedeiro ovino e, fundamentalmente, pelo

hipoboscídeo vetor. As análises comparativas de tripanossomas de ovelha, boi e cervo de uma mesma

região na Croácia suportam a especificidade da restrição de hospedeiros dos tripanossomas do

subgênero Megatrypanum. Nossos resultados indicam que com a expansão das fazendas orgânicas

pode ocorrer uma re-emergência das parasitoses de ovelhas, tanto por T. melophagium como pelos

hipoboscídeos.

4.3 Trypanosoma evansi na América do Sul. Variabilidade genética de isolados de animais

domésticos e silvestres.

Anexo 12- High variability of South American Trypanosoma evansi populations from domestic

and wild hosts based on expression-site-associated gene 6 (ESAG6) support the association

between the range of host species and the large repertoire of ESAG6 variants

Garcia, HA., Rodrigues, AC., Nunes. V. L; Desquesnes, M & Teixeira, MMG.

Trypanosoma evansi é uma espécie patogênica de origem africana que compreende isolados

altamente relacionados filogeneticamente que infectam uma gama de espécies hospedeiras em todo o

mundo e são exlusivamente transmitidos mecanicamente por moscas hematófagas. Formas

sanguíneas de tripanossomas africanos aquirem o ferro necessário para a sua propagação através de

receptores de transferrina codificados pelos genes ESAGs6 e 7. Receptores de transferrina com

diferentes afinidades permitem a sobrevivência em diferentes espécies de mamíferos. Em

concordância com a capacidade de infectar várias espécies hospedeiras, grande repertório de

variantes de ESAG6 tem sido descrito em T. evansi enquanto o repertório em T. equiperdum é bastante

limitado.

T. evansi em conjunto com T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, T. b. brucei e T. equiperdum

formam um grupo de parasitas patogênicos (subgênero Trypanozoon) geneticamente muito

81

relacionados embora com marcantes diferenças epidemiológicas, de distribuição geográfica,

preferências de hospedeiros, mecanismos de transmissão e patogenicidade. Com a exceção de T.

evansi e T. equiperdum, tripanossomas desse subgênero são transmitidos ciclicamente por moscas

tsé-tsé na África. T. evansi e T. equiperdum são transmitidos mecanicamente, respectivamente, por

dípteros hematófagos e por via sexual. T. evansi possui a mais ampla distribuição geográfica entre os

tripanossomas patogênicos e o mais amplo espectro de espécies de hospedeiros mamíferos. Essa

espécie causa patologias que variam na severidade e sinais clínicos na América, África, Ásia e Europa,

o que sugere heterogeneidade genética. Entretanto, para o estudo de diversidade genética em T.

evansi são ainda necessários estudos epidemiológicos e de dinâmica e estrutura populacional, análises

de um grande numero de isolados de diversas origens geográfica e hospedeiros, com marcadores

genéticos altamente polimórficos. Com esse objetivo, neste trabalho comparamos 16 isolados de T.

evansi de diversas regiões da Venezuela e Brasil, submetidos ou não a seleção por expansão em

animais experimentais e provenientes de hospedeiros domésticos e silvestres, a fim de avaliar o

polimorfismo de sequências do gene associado a sítios de expressão das VSG (ESAG6). Sequências

do gene ESAG6 vêm se mostrando muito informativas na avaliação da diversidade genética em

isolados do subgênero Trypanozoon.

Neste estudo, clonamos e sequenciamos cópias dos genes ESAG6 de populações de T.

evansi de animais domésticos (cavalo, burro e cão) e silvestre (capivaras e quatis) obtidos em

localidades endêmicas e geograficamente distantes da Venezuela (10 isolados) e Brasil (6 isolados).

Foram utilizadas amostras coletadas no campo e expandidas em camundongos. Avaliamos a

variabilidade genética intra-e inter-isolados comparando as seqüências obtidas com outras disponíveis

no GenBank. As análises das sequências do gene ESAG6 obtidas revelaram um importante

polimorfismo genético nos isolados avaliados, revelando 55 diferentes variantes alélicas, em geral,

independentemente se as amostras eram de campo ou expandidas em laboratórios.

O polimorfismo encontrado nos isolados de T. evansi da Venezuela e do Brasil concorda com

outros estudos prévios de isolados de T. evansi de bois da Ásia (Tailândia e Filipinas) e América do Sul

(Peru e Bolívia) e de isolados de camelos da África (Egito). Isolados de T. equiperdum mostraram um

limitado repertorio de alelos comparado com o repertorio encontrado em T. evansi e T. b. brucei. Os

resultados sugerem uma associação entre a ubiquidade de hospedeiros do parasita e o repertorio de

sequências do gene. Foram identificadas variantes alélicas muito prevalentes, previamente

identificadas na Ásia, África e América do Sul e, também, novas variantes até agora não descritas em

T. evansi. As genealogias efetuadas com sequências de nucleotídeos ou aminoácidos permitiram

revelar, além dos dez clados de variantes alélicas já definidas, 4 novos clados formados basicamente

82

por novas variantes de isolados do Brasil e Venezuela mais relacionadas com sequências de isolados

da Egito.

Os resultados deste estudo confirmam que o repertório de variantes de ESAG6 em T. evansi é

extenso, especialmente nas populações da América do Sul analisadas, em comparação com T. brucei

ssp. e T. equiperdum. Portanto, os dados corroboram a associação entre diversidade de hospedeiros e

heterogeneidade de sequências de ESAG6. Este estudo também sugere que populações de T. evansi

de hospedeiros domésticos e silvestres que vivem em simpatria podem exibir os maiores repertórios de

ESAG6.

83

REFERÊNCIAS 1 Adams ER, Hamilton PB, Gibson WC. African trypanosomes: celebrating diversity. Trends Parasitol. 2010a;26:324-8. Adams ER, Hamilton PB, Rodrigues AC, Malele II, Delespaux V, Teixeira MMG, Gibson W. New Trypanosoma (Duttonella) vivax genotypes from tsetse flies in East Africa. Parasitol. 2010b;137:641-50. Adams ER, Hamilton PB. New molecular tools for the identification of trypanosome species. Future Microbiol. 2008;3:167-76. Adrian MS, Sani RA, Hassan L, Wong MT. Outbreaks of trypanosomiasis and the seroprevalence of T. evansi in a deer breeding centre in Perak, Malaysia. Trop Anim Health Prod. 2010;42:145-50. Agabian N.Trans splicing of nuclear pre-mRNAs. Cell. 1990;61:1157-60. Aksoy S, Shay G L, Villanueva M S, Beard CB, Richards FF. Spliced leader RNA sequences of Trypanosoma rangeli are organized within the 5S rRNA-encoding genes. Gene. 1992;113:239-43. Alvarez F, Cortinas MN, Musto H. The analysis of protein coding genes suggests monophyly of Trypanosoma. Mol Phylogenet Evol. 1996;5:333-43. Amer S, Ryu O, Tada C, Fukuda Y, Inoue N, Nakai Y. Molecular identification and phylogenetic analysis of Trypanosoma evansi from dromedary camels (Camelus dromedarius) in Egypt, a pilot study. Acta Trop. 2011;117:39-46. Añez N. Studies on Trypanosoma rangeli Tejera, 1920. IV - A reconsideration of its systematic position. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1982;77:405-15. Arias JF, García F, Rivera M, López R. Trypanosoma evansi in capybara from Venezuela. J Wildl Dis. 1997;33:359-61. Atkinson HJ, Babbitt PC, Sajid M. The global cysteine peptidase landscape in parasites. Trends Parasitol. 2009;25:573-81. Authié E, Boulangé A, Muteti D, Lalmanach G, Gauthier F, Musoke AJ. Immunisation of cattle with cysteine proteinases of Trypanosoma congolense: targetting the disease rather than the parasite. Int J Parasitol. 2001;31:1429-33. Avila HA, Pereira JB, Thiemann O, De Paiva E, DeGrave W, Morel CM, Simpson L. Detection of Trypanosoma cruzi in blood specimens of chronic chagasic patients by polymerase chain reaction amplification of kinetoplast minicircle DNA: comparison with serology and xenodiagnosis. J Clin Microbiol. 1993;31:2421-6. Balmer O, Beadell JS, Gibson W, Caccone A. Phylogeography and taxonomy of Trypanosoma brucei. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5:e961. Barnabé C, Brisse S, Tibayrenc M. Phylogenetic diversity of bat trypanosomes of subgenus Schizotrypanum based on multilocus enzyme electrophoresis, random amplified polymorphic DNA, and cytochrome b nucleotide sequence analyses. Infect. Genet Evol. 2003;2:201-8. _____________________________________________

1 De acordo com: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal: sample references. Available from: http://www.icmje.org [2007 May 22].

84

Batista JS, Oliveira AF, Rodrigues CM, Damasceno CA, Oliveira IR, Alves HM, Paiva ES, Brito PD, Medeiros JM, Rodrigues AC, Teixeira MMG. Infection by Trypanosoma vivax in goats and sheep in the Brazilian semiarid region: from acute disease outbreak to chronic cryptic infection. Vet Parasitol. 2009;165:131-5. Batista JS, Riet-Correa F, Teixeira MMG, Madruga CR, Simões SD, Maia TF. Trypanosomiasis by Trypanosoma vivax in cattle in the Brazilian semiarid: description of an outbreak and lesions in the nervous system. Vet Parasitol. 2007;143:174-81. Beltrame-Botelho IT, Gaspar-Silva D, Steindel M, Dávila AM, Grisard EC. Internal transcribed spacers (ITS) of Trypanosoma rangeli ribosomal DNA (rDNA): a useful marker for inter-specific differentiation. Infect. Genet Evol. 2005;5:17-28. Berlin D, Loeb E, Baneth G. Disseminated central nervous system disease caused by Trypanosoma evansi in a horse. Vet Parasitol. 2009;161:316-9. Biteau N, Bringaud F, Gibson W, Truc P, Baltz T. Characterization of Trypanozoon isolates using a repeated coding sequence and microsatellite markers. Mol Biochem Parasitol. 2000;105:187-202. Bitter W, Gerrits H, Kieft R, Borst P. The role of transferrin-receptor variation in the host range of Trypanosoma brucei. Nature. 1998;391:499-502. Blom-Potar MC, Chamond N, Cosson A, Jouvion G, Droin-Bergère S, Huerre M, Minoprio P. Trypanosoma vivax infections: pushing ahead with mouse models for the study of Nagana. II. Immunobiological dysfunctions. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4. e793. Böse R, Petersen K, Pospichal H, Buchanan N, Tait A. Characterization of Megatrypanum trypanosomes from European Cervidae. Parasitol. 1993;107:55-61. Böse R, Friedhoff KT, Olbrich S, Büscher G, Domeyer I. Transmission of Trypanosoma theileri to cattle by Tabanidae. Parasitol Res. 1987;73:421-4. Braun U, Rogg E, Walser M. Trypanosoma theileri in the cerebrospinal fluid and brain of a heifer with suppurative meningoencephalitis. Vet Rec. 2002;150:18-9. Breglia SA, Slamovits CH, Leander BS. Phylogeny of phagotrophic euglenids (Euglenozoa) as inferred from hsp90 gene sequences. J Eukaryot Microbiol. 2007;54:86-92. Brisse S, Henriksson J, Barnabé C, Douzery EJ, Berkvens D, Serrano M, De Carvalho MR, Buck GA, Dujardin JC, Tibayrenc M. Evidence for genetic exchange and hybridization in Trypanosoma cruzi based on nucleotide sequences and molecular karyotype. Infect. Genet Evol. 2003;2:173-83. Busse I, Preisfeld A. Systematics of primary osmotrophic euglenids: a molecular approach to the phylogeny of Distigma and Astasia (Euglenozoa). Int J Syst Evol Microbiol. 2003;53:617-24. Busse I, Preisfeld A. Phylogenetic position of Rhynchopus sp. and Diplonema ambulator as indicated by analyses of euglenozoan small subunit ribosomal DNA. Gene. 2002;284:83-91. Caffrey CR, Lima AP, Steverding D. Cysteine peptidases of kinetoplastid parasites. Adv Exp Med Biol. 2011;712:84-99. Caffrey CR, Steverding D. Kinetoplastid papain-like cysteine peptidases. Mol Biochem Parasitol. 2009;167:12-9. Camargo EP. Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic trypanosomes in liquid media. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1964;6:93-100.

85

Campetella O, Henriksson J, Aslund L, Frasch AA, Pettersson U, Cazzulo JJ. The major cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi is encoded by multiple polymorphic tandemly organized genes located on different chromosomes. Mol Bichem Parasitol. 1992;50:225-34. Carvalho AU, Abrão DC, Facury Filho EJ, Paes PR, Ribeiro MFB. Ocorrência de Trypanosoma vivax no estado de Minas Gerais. Arq Bras Med Vet Zootec. 2008;60:769-71. Cavalier-Smith T. Kingdoms Protozoa and Chromista and the eozoan root of the eukaryotic tree. Biol Lett. 2010;6:342-5. Cavalier-Smith T. Only six kingdoms of life. Proc Biol Sci. 2004;271:1251-62. Cavalier-Smith T. The excavate protozoan phyla Metamonada Grassé emend. (Anaeromonadea, Parabasalia, Carpediemonas, Eopharyngia) and Loukozoa emend. (Jakobea, Malawimonas): their evolutionary affinities and new higher taxa. Int J Syst Evol Microbiol. 2003;53:1741-58. Cavazzana Jr. M, Marcili A, Lima L, Maia da Silva F, Junqueira AC, Veludo HH, Viola LB, Campaner M, Nunes VL, Paiva F, Coura JR, Camargo EP, Teixeira MMG. Phylogeographical, ecological and biological patterns shown by nuclear (ssrRNA and gGAPDH) and mitochondrial (Cyt b) genes of trypanosomes of the subgenus Schizotrypanum parasitic in Brazilian bats. Int J Parasitol. 2010;40:345-55. Ceferino A. La Parasitología en Venezuela. In: Historia de la medicina venezolana. Venezuela: Universidad Central de Venezuela; 1973. cap. 27, p. 5-61. Cerqueira GC, Bartholomeu DC, Da Rocha WD, Hou L, Freitas-Silva DM, Machado CR, El-Sayed NM, Teixeira SM. Sequence diversity and evolution of multigene families in Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 2008;157:65-72. Chamond N, Cosson A, Blom-Potar MC, Jouvion G, D'Archivio S, Medina M, Droin-Bergère S, Huerre M, Goyard S, Minoprio P. Trypanosoma vivax infections: pushing ahead with mouse models for the study of Nagana. I. Parasitological, hematological and pathological parameters. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4:e792. Colpo CB, Monteiro SG, Stainki DR, Braccini ET, Henriques GB. Infecção natural por Trypanosoma evansi em cães. Ciên Rural. 2005;35:717-9. Cortez AP, Ventura RM, Rodrigues AC, Batista JS, Paiva F, Añez N, Machado RZ, Gibson WC, Teixeira MMG. The taxonomic and phylogenetic relationships of Trypanosoma vivax from South America and Africa. Parasitol. 2006;133:159-69. Cox FE. History of sleeping sickness (African trypanosomiasis). Infect Dis Clin North Am. 2004;18:231-45. Cuglovici DA, Bartholomeu DC, Reis-Cunha JL, Carvalho AU, Ribeiro MF. Epidemiologic aspects of an outbreak of Trypanosoma vivax in a dairy cattle herd in Minas Gerais state, Brazil. Vet Parasitol. 2010;169:320-6. Cupolillo E, Medina-Acosta E, Noyes H, Momen H, Grimaldi Jr G. A revised classification for Leishmania and Endotrypanum. Parasitol Today. 2000;16:142-4. Cupolillo E, Grimaldi JR, Momem H, Beverley SM. Intergenic region typing (IRT): A rapid molecular approach to the characterization and evolution of Leishmania. Mol Biochem Parasitol. 1995;73:145-55. Cura CI, Mejía-Jaramillo AM, Duffy T, Burgos JM, Rodriguero M, Cardinal MV, Kjos S, Gurgel-Gonçalves R, Blanchet D, De Pablos LM, Tomasini N, da Silva A, Russomando G, Cuba CA, Aznar C, Abate T, Levin MJ, Osuna A, Gürtler RE, Diosque P, Solari A, Triana-Chávez O, Schijman AG. Trypanosoma cruzi I genotypes in different geographical regions and transmission cycles based on a microsatellite motif of the intergenic spacer of spliced-leader genes. Int J Parasitol. 2010;40:1599-607.

86

D’Alessandro A, Saraiva NG. Trypanosoma rangeli. Gilles, HM (ed). In: “Protozoal diseases”. London; Arnold; 1999. p.398-412. D’Alessandro A, Wells EA. Trypanosome infections in the family Cervidae. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1971;65:845-6. D'Archivio S, Medina M, Cosson A, Chamond N, Rotureau B, Minoprio P, Goyard S. Genetic engineering of Trypanosoma (Dutonella) vivax and in vitro differentiation under axenic conditions. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5:e1461. Da Silva AS, Costa MM, Polenz MF, Polenz CH, Teixeira MMG, Dos Anjos Lopes ST, Monteiro SG. Primeiro registro de Trypanosoma vivax em bovinos no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Ciên Rural. 2009;39:2550-4. Damayanti R, Graydon RJ, Ladds PW. The pathology of experimental Trypanosoma evansi infection in the Indonesian buffalo (Bubalus bubalis). J Comp Pathol. 1994;110:237-52. Dávila AM, Herrera HM, Schlebinger T, Souza SS, Traub-Cseko YM. Using PCR for unraveling the cryptic epizootiology of livestock trypanosomosis in the Pantanal, Brazil. Vet Parasitol. 2003;117:1-13. Dávila AM, Souza SS, Campos C, Silva RA. The seroprevalence of equine trypanosomosis in the pantanal. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1999;94:199-202. Davis RE. Spliced leader RNA trans-splicing in Metazoa. Parasitol Today. 1996;12:33-40. De Araujo Melo S, Barros AC, Costa FB, de Carvalho Neta AV, de Candanedo Guerra Rde M, Abreu-Silva AL. Bovine trypanosomiasis an emerging disease in Maranhão State-Brazil. Vector Borne Zoonotic Dis. 2011;11: 853-6. De Candanedo Guerra Rde M, Feitosa Jr. AB, Santos HP, Abreu-Silva AL, Gomes dos Santos AC. Biometry of Trypanosoma vivax found in a calf in the state of Maranhão, Brazil. Ciên Rural. 2008;38: 833-5. De Freitas JM, Augusto-Pinto L, Pimenta JR, Bastos-Rodrigues L, Gonçalves VF, Teixeira SM, Chiari E, Junqueira AC, Fernandes O, Macedo AM, Machado CR, Pena SD. Ancestral genomes, sex, and the population structure of Trypanosoma cruzi. PLoS Pathog. 2006;2: e24. De Menezes VT, Queiroz AO, Gomes MA, Marques MA, Jansen AM. Trypanosoma evansi in inbred and Swiss-Webster mice: distinct aspects of pathogenesis. Parasitol Res. 2004;94:193-200. de Souza Pimentel D, do Nascimento Ramos CA, Ramos RA, de Araújo FR, Borba ML, da Gloria Faustino MA, Alves LC. First report and molecular characterization of Trypanosoma vivax in cattle from state of Pernambuco, Brazil. Vet Parasitol. 2012;185:286-9. Deschamps P, Lara E, Marande W, López-García P, Ekelund F, Moreira D. Phylogenomic analysis of kinetoplastids supports that Trypanosomatids arose from within bodonids. Mol Biol Evol. 2011;28:53-8. Desquesnes M, Biteau-Coroller F, Bouyer J, Dia ML, Foil L. Development of a mathematical model for mechanical transmission of trypanosomes and other pathogens of cattle transmitted by tabanids. Int J Parasitol. 2009;39:333-46. Desquesnes M, Bossard G, Patrel D, Herder S, Patout O, Lepetitcolin E, Thevenon S, Berthier D, Pavlovic D, Brugidou R, Jacquiet P, Schelcher F, Faye B, Touratier L, Cuny G. First outbreak of Trypanosoma evansi in camels in metropolitan France. Vet Rec. 2008;162: 750-2. Desquesnes M, Dia ML. Mechanical transmission of Trypanosoma vivax in cattle by the African tabanid Atylotus fuscipes. Vet Parasitol. 2004;119:9-19.

87

Desquesnes M, Dia ML. Trypanosoma vivax: mechanical transmission in cattle by one of the most common African tabanids, Atylotus agrestis. Exp Parasitol. 2003;103:35-43. Desquesnes M, McLaughlin G, Zoungrana A, Davila AM. Detection and identification of Trypanosoma of African livestock through a single PCR based on internal transcribed spacer 1 of rDNA. Int J Parasitol. 2001;31:610-4. Dhollander S, Jallow A, Mbodge K, Kora S, Sanneh M, Gaye M, Bos J, Leak S, Berkvens D, Geerts S. Equine trypanosomosis in the Central River Division of The Gambia: a study of veterinary gate-clinic consultation records. Prev Vet Med. 2006;75:152-62. Diall O, Bocoum Z, Diarra B, Sanogo Y, Coulibaly Z, Waïgalo Y. Epidemiology of trypanosomiasis caused by T. evansi in camels in Mali: results of parasitological and clinical survey. Rev Elev Med Vet Pays Trop. 1993;46: 455-61. Dickin SK, Gibson WC. Hybridisation with a repetitive DNA probe reveals the presence of small chromosomes in Trypanosoma vivax. Mol Biochem Parasitol. 1989;33:135-42. Dirie MF, Murphy NB, Gardiner PR. DNA fingerprinting of Trypanosoma vivax isolates rapidly identifies intraspecific relationships. J Eukaryot Microbiol. 1993a;40:132-4. Dirie MF, Otte MJ, Thatthi R, Gardiner PR. Comparative studies of Trypanosoma (Duttonella) vivax isolates from Colombia. Parasitol. 1993b;106:21-9. Dirie MF, Bornstein S, Wallbanks KR, Stiles JK, Molyneux DH. Zymogram and life-history studies on trypanosomes of the subgenus Megatrypanum. Parasitol Res. 1990;76:669-74. Doherty ML, Windle H, Voorheis HP, Larkin H, Casey M, Clery D, Murray M. Clinical disease associated with Trypanosoma theileri infections in a calf in Ireland. Vet Rec. 1993;26:653-6. Dolezel D, Jirků M, Maslov DA, Lukes J. Phylogeny of the bodonid flagellates (Kinetoplastida) based on small-subunit rRNA gene sequences. Int J Syst Evol Microbiol. 2000;50:1943-51. Donelson JE, Zeng WA. Comparison of trans-RNA splicing in trypanosomes and nematodes. Parasitol Today. 1990;6:327-34. Doyle PS, Zhou YM, Hsieh I, Greenbaum DC, McKerrow JH, Engel JC. The Trypanosoma cruzi protease cruzain mediates immune evasion. PLoS Pathog. 2011;7:e1002139. Doyle PS, Zhou YM, Engel JC, McKerrow JH. A cysteine protease inhibitor cures Chagas' disease in an immunodeficient-mouse model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 2007;51:3932-9. Ducheyne E, Mweempwa C, De Pus C, Vernieuwe H, De Deken R, Hendrickx G, Van den Bossche P. The impact of habitat fragmentation on tsetse abundance on the plateau of eastern Zambia. Prev Vet Med. 2009;91:11-8. Duffy CW, Morrison LJ, Black A, Pinchbeck GL, Christley RM, Schoenefeld A, Tait A, Turner CM, MacLeod A. Trypanosoma vivax displays a clonal population structure. Int J Parasitol. 2009;39:1475-83. Eakin AE, Mills AA, Harth G, MacKerrow JH, Craik CS. The sequence, organization, and expression of the major cysteine protease (cruzain) from Trypanosoma cruzi. J Biol Chem. 1992;267:7411-20. Eakin AE, Bouvier J, Sakanari JA, Craik CS, McKerrow JH. Amplification and sequencing of genomic DNA fragments encoding cysteine proteases from protozoan parasites. Mol Biochem Parasitol. 1990; 9:1-8. El-Sayed NM, Myler PJ, Blandin G, Berriman M, Crabtree J, Aggarwal G, Caler E, Renauld H, Worthey EA, Hertz-Fowler C, Ghedin E, Peacock C, Bartholomeu DC, Haas BJ, Tran AN, Wortman JR, Alsmark UC, Angiuoli

88

S, Anupama A, Badger J, Bringaud F, Cadag E, Carlton JM, Cerqueira GC, Creasy T, Delcher AL, Djikeng A, Embley TM, Hauser C, Ivens AC, Kummerfeld SK, Pereira-Leal JB, Nilsson D, Peterson J, Salzberg SL, Shallom J, Silva JC, Sundaram J, Westenberger S, White O, Melville SE, Donelson JE, Andersson B, Stuart KD, Hall N. Comparative genomics of Trypanosomatid parasitic protozoa. Science. 2005;309:404-9. Falla A, Herrera C, Fajardo A, Montilla M, Vallejo GA, Guhl F. Haplotype identification within Trypanosoma cruzi I in Colombian isolates from several reservoirs, vectors and humans. Acta Trop. 2009;110:15–21. Fernandes O, Souto RP, Castro JA, Pereira JB, Fernandes NC, Junqueira AC, Naiff RD, Barrett TV, Degrave W, Zingales B, Campbell DA, Coura JR. Brazilian isolates of Trypanosoma cruzi from humans and triatomines classified into two lineages using mini-exon and ribosomal RNA sequences. Am J Trop Med Hyg. 1998a;58:807-11. Fernandes O, Sturm NR, Derre R, Campbell DA. The mini-exon gene: a genetic marker for zymodeme III of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 1998b;95:129-33. Fernandes O, Teixeira MMG, Sturm NR, Sousa MA, Camargo EP, Degrave WM, Campbell DA. Mini-exon gene sequences define six groups within the genus Crithidia. J Eukaryot Microbiol. 1997;44:535-9. Fernandes O, Murthy VK, Kurath U, Degrave WM, Campbell DA. Mini-exon gene variation in human pathogenic Leishmania species. Mol Biochem Parasitol. 1994;66:261-71. Fernandes O, Degrave W, Campbell DA. The mini-exon gene: a molecular marker for Endotrypanum schaudinni. Parasitol. 1993;107:219-24. Fernandez AJ. Tripanosomiasis de los bovídeos de Venezuela. Gac Med Caracas. 1931;38:17-21. Ferreira RC, De Souza AA, Freitas RA, Campaner M, Takata CS, Barrett TV, Shaw JJ, Teixeira MMG. A phylogenetic lineage of closely related trypanosomes (Trypanosomatidae, Kinetoplastida) of anurans and sand flies (Psychodidae, Diptera) sharing the same ecotopes in Brazilian Amazonia. J Eukaryot Microbiol. 2008;55:427-35. Ferreira RC, Campaner M, Viola LB, Takata CS, Takeda GF, Teixeira MMG. Morphological and molecular diversity and phylogenetic relationships among anuran trypanosomes from the Amazonia, Atlantic Forest and Pantanal biomes in Brazil. Parasitol. 2007;134:1623-38. Fiasson R, Mayer M, Pifano F. Le cariacou (Odoceileus gymnotis) porteur de Trypanosoma vivax en Venezuela. Bull Soc Path Exot. 1948;41:206-8. Franciscato C, dos Anjos LST, Teixeira MMG, Monteiro SG, Wolkmer P, Garmatz BC, Paim CB. Cão naturalmente infectado por Trypanosoma evansi em Santa Maria, RS, Brasil. Ciên Rural. 2007;37:288-91. Franke CR, Greiner M, Mehlitz D. Investigations on naturally occurring Trypanosoma evansi infections in horses, cattle, dogs and capybaras (Hydrochaeris hydrochaeris) in Pantanal de Poconé (Mato Grosso, Brazil). Acta Trop. 1994a;58:159-69. Franke CR, Greiner M, Mehlitz D. Monitoring of clinical, parasitological and serological parameters during an experimental infection of capybaras (Hydrochaeris hydrochaeris) with Trypanosoma evansi. Acta Trop. 1994b; 58:171-4. García HA, Rangel-Rivas A, Contreras I, García ME, García F, Perrone T. Caracterización molecular de Trypanosoma vivax en ovinos naturalmente infectados en dos hatos de los municipios San Fernando y Biruaca, estado Apure, Venezuela. Rev Cien LUZ. 2009;19:230-7.

89

García HA, García ME, Pérez G, Bethencourt A, Zerpa E, Pérez H, Mendoza-León A. Trypanosomiasis in Venezuelan water buffaloes: association of packed-cell volumes with seroprevalence and current trypanosome infection. Ann Trop Med Parasitol. 2006;100:297-305. García HA, Garcia ME, Perez H, Mendoza-Leon A. The detection and PCR-based characterization of the parasites causing trypanosomiasis in water-buffalo herds in Venezuela. Ann Trop Med Parasitol. 2005;99:359-70. García HA, García ME, Zerpa HA, Pérez G, Contreras CE, Pivat I, Mendoza-León, A. Detección parasitológica y molecular de infecciones naturales por Trypanosoma evansi y Trypanosoma vivax en búfalos de agua (Bubalus bubalis) y chigüires (Hydrochoerus hydrochaeris) en los estados Apure, Cojedes y Guárico, Venezuela. Rev Fac Cienc Vet Univ Cent Venez. 2003;44:131-44. Gardiner, PR, Mahmoud MM. Salivarian trypanosomes causing disease in livestock outside sub-saharan Africa. In: Kreier, JP, Baker, JR, (eds). Parasitic Protozoa. London: Academic Press; 1992. p. 277-313. Gibson WC, Pilkington JG, Pemberton JM. Trypanosoma melophagium from the sheep ked Melophagus ovinus on the island of St Kilda. Parasitol. 2010;137:1799-804. Gibson WC, Bingle L, Blendeman W, Brown J, Wood J, Stevens J. Structure and sequence variation of the trypanosome spliced leader transcripts. Mol Biochem Parasitol. 2000;107:269-77. Gibson WC. Will the real Trypanosoma b. gambiense please stand up. Parasitol Today. 1986;2:255-7. Godfrey DG, Baker RD, Rickman LR, Mehlitz D. The distribution, relationships and identification of enzymic variants within the subgenus Trypanozoon. Adv Parasitol. 1990;29:1-74. Godoi MM, Serrano MG, Teixeira MMG, Camargo EP. A PCR-based survey on Phytomonas (Euglenozoa: Trypanosomatidae) in phytophagous hemipterans of the Amazon region. J Eukaryot Microbiol. 2002;49:275-9. Gonzales JL, Chacon E, Miranda M, Loza A, Siles LM. Bovine trypanosomosis in the Bolivian Pantanal. Vet Parasitol. 2007;146:9-16. Grisard EC, Sturm NR, Campbell DA. A new species of trypanosome, Trypanosoma desterrensis sp. n., isolated from South American bats. Parasitol. 2003;127:265-71. Grisard EC, Campbell DA, Romanha AJ. Mini-exon gene sequence polymorphism among Trypanosoma rangeli strains isolated from distinct geographical regions. Parasitol. 1999;118:375-82. Guhl F, Vallejo GA. Trypanosoma (Herpetosoma) rangeli Tejera, 1920: an updated review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2003;98:435-42. Günzl A. The pre-mRNA splicing machinery of trypanosomes: complex or simplified? Eukaryot Cell. 2010;9:1159-70. Gutierrez C, Desquesnes M, Touratier L, Büscher P. Trypanosoma evansi: recent outbreaks in Europe. Vet Parasitol. 2010;174:26-9. Gutierrez C, Corbera JA, Juste MC, Doreste F, Morales I. An outbreak of abortions and high neonatal mortality associated with Trypanosoma evansi infection in dromedary camels in the Canary Islands. Vet Parasitol. 2005;130:163-8. Haag J, O'h Uigin C, Overath P. The molecular phylogeny of trypanosomes: evidence for an early divergence of the Salivaria. Mol Bioch Parasitol. 1998;91:37-49.

90

Hagos A, Degefa G, Yacob H, Fikru R, Alemu T, Feseha G, Claes F, Goddeeris BM. Seroepidemiological survey of trypanozoon infection in horses in the suspected dourine-infected Bale highlands of the Oromia region, Ethiopia. Rev Sci Tech. 2010;29:649-54. Hamilton PB, Teixeira MMG, Stevens JR. The evolution of Trypanosoma cruzi: the 'bat seeding' hypothesis. Trends Parasitol. 2012a [in press]. Hamilton PB, Cruickshank C, Stevens JR, Teixeira MM, Mathews F. Parasites reveal movement of bats between the New and Old Worlds. Mol Phylogenet Evol. 2012b;63:521-6. Hamilton PB, Lewis MD, Cruickshank C, Gaunt MW, Yeo M, Llewellyn MS, Valente SA, Maia da Silva F, Stevens JR, Miles MA, Teixeira MMG. Identification and lineage genotyping of South American trypanosomes using fluorescent fragment length barcoding. Infect Genet Evol. 2011;11:44-51. Hamilton PB, Adams ER, Njiokou F, Gibson WC, Cuny G, Herder S. Phylogenetic analysis reveals the presence of the Trypanosoma cruzi clade in African terrestrial mammals. Infect Genet Evol. 2009;9:81-6. Hamilton PB, Adams ER, Malele II, Gibson WC. A novel, high-throughput technique for species identification reveals a new species of tsetse-transmitted trypanosome related to the Trypanosoma brucei subgenus, Trypanozoon. Infect Genet Evol. 2008;8:26-33. Hamilton PB, Gibson WC, Stevens JR. Patterns of co-evolution between trypanosomes and their hosts deduced from ribosomal RNA and protein-coding gene phylogenies. Mol Phylogenet Evol. 2007;44:15-25. Hamilton PB, Stevens JR, Gidley J, Holz P, Gibson WC. A new lineage of trypanosomes from Australian vertebrates and terrestrial bloodsucking leeches (Haemadipsidae). Int J Parasitol. 2005a;35:431-43. Hamilton PB, Stevens JR, Holz P, Boag B, Cooke B, Gibson WC. The inadvertent introduction into Australia of Trypanosoma nabiasi, the trypanosome of the European rabbit (Oryctolagus cuniculus), and its potential for biocontrol. Mol Ecol. 2005b;14:3167-75. Hamilton PB, Stevens JR, Gaunt MW, Gidley J, Gibson WC. Trypanosomes are monophyletic: evidence from genes for glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and small ribosomal RNA. Int J Parasitol. 2004;34:1393-404. Hannaert V, Opperdoes FR, Michels PA. Comparison and evolutionary analysis of the glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from different Kinetoplastida. J Mol Evol. 1998;47:728-38. Hannaert V, Blaauw M, Kohl L, Allert S, Opperdoes FR, Michels PA. Molecular analysis of the cytosolic and glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in Leishmania mexicana. Mol Biochem Parasitol. 1992;55:115-26. Harris E, Kropp G, Belli A, Rodriguez B , Agabian N. Single-step multiplex PCR assay for characterization of New World Leishmania complexes. J Clin Microbiol. 1998;36:1989-95. Hashimoto T, Nakamura Y, Kamaishi T, Adachi J, Nakamura F, Okamoto K, Hasegawa M. Phylogenetic place of kinetoplastid protozoa inferred from a protein phylogeny of elongation factor 1 alpha. Mol Biochem Parasitol. 1995;70:181-5. Hatama S, Shibahara T, Suzuki M, Kadota K, Uchida I, Kanno T. Isolation of a Megatrypanum trypanosome from sika deer (Cervus nippon yesoensis) in Japan. Vet Parasitol. 2007;149:56-64. Hellgren O, Bensch S, Malmqvist B. Bird hosts, blood parasites and their vectors-associations uncovered by molecular analyses of blackfly blood meals. Mol Ecol 2008;17:1605-13. Herbert IV. Trypanosoma theileri, Laveran, 1902. A cosmopolitan parasite of cattle. Vet Bull. 1964;34:563-70.

91

Hernández R, Rios P, Valdés AM, Piñero D. Primary structure of Trypanosoma cruzi small-subunit ribosomal RNA coding region: comparison with other Trypanosomatids. Mol Biochem Parasitol. 1990;41:207-12. Herrera HM, Rocha FL, Lisboa CV, Rademaker V, Mourão GM, Jansen AM. Food web connections and the transmission cycles of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma evansi (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) in the Pantanal Region, Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2011;105:380-7. Herrera HM, Abreu UG, Keuroghlian A, Freitas TP, Jansen AM. The role played by sympatric collared peccary (Tayassu tajacu), white-lipped peccary (Tayassu pecari), and feral pig (Sus scrofa) as maintenance hosts for Trypanosoma evansi and Trypanosoma cruzi in a sylvatic area of Brazil. Parasitol Res. 2008;103: 619-24. Herrera HM, Rademaker V, Abreu UG, D'Andrea PS, Jansen AM. Variables that modulate the spatial distribution of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma evansi in the Brazilian Pantanal. Acta Trop. 2007;102:55-62. Herrera HM, Norek A, Freitas TP, Rademaker V, Fernandes O, Jansen AM. Domestic and wild mammals infection by Trypanosoma evansi in a pristine area of the Brazilian Pantanal region. Parasitol Res. 2005;96:121-6. Herrera HM, Dávila AM, Norek A, Abreu UG, Souza SS, D'Andrea PS, Jansen AM. Enzootiology of Trypanosoma evansi in Pantanal, Brazil. Vet Parasitol. 2004;125: 263-75. Herrera HM, Aquino LP, Menezes RF, Marques LC, Moraes MA, Werther K, Machado RZ. Trypanosoma evansi experimental infection in the South American coati (Nasua nasua): clinical, parasitological and humoral immune response. Vet Parasitol. 2001;102:209-16. Hoare CA. The Trypanosomes of Mammals. In: A zoological monograph. Part 2: Systematic. Oxford: Blackwell Scientific Publications; 1972. 500p. Hoare CA. Morphological and taxonomic studies on Mammalian Trypanosomes. X. Revision of the Systematics. J. Protozool. 1964;11:200-7. Hoffmann M, Büscher G, Friedhoff KT. Stercorarian trypanosomes from deer (Cervidae) in Germany. J Protozool. 1984;31:581-4. Holland W, Claes F, My L, Thanh N, Tam P, Verloo D, Büscher P, Goddeeris B, Vercruysse J. A comparative evaluation of parasitological tests and a PCR for Trypanosoma evansi diagnosis in experimentally infected water buffaloes. Vet Parasitol. 2001;97:23-33. Hollar L, Maslov DA. A phylogenetic view on the genus Phytomonas. Mol Biochem Parasitol. 1997;89: 295-9. Hörchner F, Schönefeld A, Wüst B. Experimental infection of horses with Trypanosoma evansi. I. Parasitological and clinical results. Ann Soc Belg Med Trop. 1983;63:127-35. Hughes AL, Piontkivska H. Molecular phylogenetics of Trypanosomatidae: contrasting results from 18S rRNA and protein phylogenies. Kinetoplastid Biol Dis. 2003a;2:e15. Hughes AL, Piontkivska H. Phylogeny of Trypanosomatidae and Bodonidae (Kinetoplastida) based on 18S rRNA: evidence for paraphyly of Trypanosoma and six other genera. Mol Biol Evol. 2003b;20:644-52. Huson DH, Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Mol Biol Evol. 2006; 23:254-67. Isobe T, Holmes EC, Rudenko G. The transferrin receptor genes of Trypanosoma equiperdum are less diverse in their transferrin binding site than those of the broad-host range Trypanosoma brucei. J Mol Evol. 2003;56:377-86. Jackson AP. Tandem gene arrays in Trypanosoma brucei: comparative phylogenomic analysis of duplicate sequence variation. BMC Evol Biol. 2007; 47-54.

92

Jakes KA, O'Donoghue PJ, Adlard RD. Phylogenetic relationships of Trypanosoma chelodina and Trypanosoma binneyi from Australian tortoises and platypuses inferred from small subunit rRNA analyses. Parasitol. 2001a;123:483-7. Jakes KA, O'Donoghue P, Munro M, Adlard R. Hemoprotozoa of freshwater turtles in Queensland. J Wildl Dis. 2001b;37:12-9. Jesudhasan PR, Tan CW, Hontzeas N; Woo PT. A cathepsin L-like cysteine proteinase gene from the protozoan parasite, Cryptobia salmositica. Parasitol. Res. 2007; 100: 881-6. Johnson D, Harms NJ, Larter NC, Elkin BT, Tabel H, Wei G. Serum biochemistry, serology, and parasitology of boreal caribou (Rangifer tarandus caribou) in the Northwest Territories, Canada J Wildl Dis. 2010;46:1096-107. Jones TW, Dávila AM. Trypanosoma vivax-out of Africa. Trends Parasitol. 2001;17: 99-101. Junqueira AC, Chiari E, Wincker P. Comparison of the polymerase chain reaction with two classical parasitological methods for the diagnosis of Chagas disease in an endemic region of north-eastern Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1996;90:129-32. Kabiri M, Steverding D. Trypanosoma evansi: demonstration of a transferring receptor derived from expression site-associated genes 6 and 7. J Parasitol. 2001;87:1189-91. Katakura K, Kawazu SI, Naya T, Nagakura K, Ito M, Aikawa M, Guan LR, Zuo XP, Chai JJ, Chang KP, Matsumoto Y. Diagnosis of Kala-azar by nested PCR based on amplification of the Leishmania mini-exon gene. J Clin Microbiol. 1998;36:2173-7. Kingston N, Morton JK, Dietrich R. Trypanosoma cervi from Alaskan reindeer, Rangifer tarandus. J Protozool. 1982;29:588-91. Kingston N, Morton JK. Trypanosoma cervi sp. n. from elk (Cervus canadensis) in Wyoming. J Parasitol. 1975;61:17-23. Klemba M, Goldberg DE. Biological roles of proteases in parasitic protozoa. Annu Rev Biochem. 2002;71:275-305. Koffi M, Solano P, Barnabé C, de Meeûs T, Bucheton B, Cuny G, Jamonneau V. Genetic characterisation of Trypanosoma brucei s.l. using microsatellite typing: new perspectives for the molecular epidemiology of human African trypanosomiasis. Infect. Genet Evol. 2007;7:675-84. Krinsky WL. Animal disease agents transmitted by horse flies and deer flies (Diptera: Tabanidae). J Med Entomol. 1976;13:225-75. Kuru T, Jirata D, Genetu A, Barr S, Mengistu Y, Aseffa A, Gedamu L. Leishmania aethiopica: identification and characterization of cathepsin L-like cysteine protease genes. Exp Parasitol. 2007;115:283-90. Laha R, Sasmal NK. Detection of Trypanosoma evansi infection in clinically ill cattle, buffaloes and horses using various diagnostic tests. Epidemiol Infect. 2009;137:1583-5. Lai DH, Hashimi H, Lun ZR, Ayala FJ, Lukes J. Adaptations of Trypanosoma brucei to gradual loss of kinetoplast DNA: Trypanosoma equiperdum and Trypanosoma evansi are petite mutants of T. brucei. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:1999-2004. Lalmanach G, Boulangé A, Serveau C, Lecaille F, Scharfstein J, Gauthier F, Authié E. Congopain from Trypanosoma congolense: drug target and vaccine candidate. Biol Chem. 2002;383:739-49. Lee YF, Cheng CC, Lin NN, Liu SA, Tung KC, Chiu YT. Isolation of Trypanosoma (Megatrypanum) theileri from dairy cattle in Taiwan. J Vet Med Sci. 2010;72:417-24.

93

Lefebvre MF, Semalulu SS, Oatway AE, Nolan JW. Trypanosomiasis in woodland caribou of northern Alberta. J Wildl Dis. 1997;33:271-77. Leger M, Vienne M. Epizoootie à trypanosomes ches les boidés de la Guyiane Francaise. Bull Soc Pathol Exot. 1919;12:258-66. Li FJ, Gasser RB, Lai DH, Claes F, Zhu XQ, Lun ZR. PCR approach for the detection of Trypanosoma brucei and T. equiperdum and their differentiation from T. evansi based on maxicircle kinetoplast DNA. Mol Cell Probes. 2007;21:1-7. Li FJ, Gasser RB, Zheng JY, Claes F, Zhu XQ, Lun ZR. Application of multiple DNA fingerprinting techniques to study the genetic relationships among three members of the subgenus Trypanozoon (Protozoa: Trypanosomatidae). Mol Cell Probes. 2005a;19: 400-7. Li FJ, Zheng JY, Jia WZ, Lun ZR. Analysis of molecular profiles among Trypanozoon species and subspecies by MGE-PCR method. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi. 2005b;23:277-82. Lima AP, Tessier DC, Thomas DY, Scharfstein J, Storer AC, Vernet T. Identification of new cysteine protease gene isoforms in Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 1994;67:333-8. Lima L, Silva FM, Neves L, Attias M, Takata CS, Campaner M, de Souza W, Hamilton PB, Teixeira MMG. Evolutionary Insights from Bat Trypanosomes: Morphological, Developmental and Phylogenetic Evidence of a New Species, Trypanosoma (Schizotrypanum) erneyi sp. nov., in African Bats Closely Related to Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi and Allied Species. Protist. 2012; [in press]. Linhares GF, Dias Filho FC, Fernandes PR, Duarte SC. Triponossomíase em bovinos no município de Formoso do Araguaia, Tocantins (relato de caso). Ciên Animal Brasileira. 2006;7:455-60. Liu Y, Englund PT. The rotational dynamics of kinetoplast DNA replication. Mol Microbiol. 2007;64:676-90. Llewellyn MS, Rivett-Carnac JB, Fitzpatrick S, Lewis MD, Yeo M, Gaunt MW, Miles MA. Extraordinary Trypanosoma cruzi diversity within single mammalian reservoir hosts implies a mechanism of diversifying selection. Int J Parasitol. 2011;41:609-14. Llewellyn MS, Lewis MD, Acosta N, Yeo M, Carrasco HJ, Segovia M, Vargas J, Torrico F, Miles MA, Gaunt MW. Trypanosoma cruzi IIc: phylogenetic and phylogeographic insights from sequence and microsatellite analysis and potential impact on emergent Chagas disease. PLoS Negl Trop Dis. 2009;3:e510. Lloyd LL, Johnson WB, The trypanosome infections of tsetse flies in northern Nigeria and a new method of estimation. Bull Entomol Res. 1924;14:265-88. Losos GJ, Ikede BO. Review of pathology of disease in domestic and laboratory animals caused by Trypanosoma congolense, T. vivax, T. brucei, T. rhodesiense and T. gambiense. Vet Pathol. 1972;9:71 p. Lu SC. Culture and morphological observations on Trypanosoma melophagium. Chinese J Microbiol. 1975;8:20-35. Luckins A. Trypanosoma evansi in Asia. Parasitol Today. 1988;4:137-42. Lukes J, Guilbride DL, Votypka J, Zikova A, Benne R, Englund PT. Kinetoplast DNA network: evolution of an improbable structure. Eukaryot Cell. 2002;1:495-502. Lun ZR, Li AX, Chen XG, Lu LX, Zhu XQ. Molecular profiles of Trypanosoma brucei, T. evansi and T. equiperdum stocks revealed by the random amplified polymorphic DNA method. Parasitol Res. 2004;92:335-40. Lun ZR, Desser SS. Is the broad range of hosts and geographical distribution of Trypanosoma evansi attributable to the loss of maxicircle kinetoplast DNA? Parasitol Today. 1995;11:131-3.

94

Macedo AM, Pimenta JR, Aguiar RS, Melo AI, Chiari E, Zingales B, Pena SD, Oliveira RP. Usefulness of microsatellite typing in population genetic studies of Trypanosoma cruzi. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2001;96: 407-13. Machado CA, Ayala FJ. Nucleotide sequences provide evidence of genetic exchange among distantly related lineages of Trypanosoma cruzi. Proc Natl Acad Sci USA. 2001;98:7396-401. Maia da Silva F, Marcili A, Ortiz PA, Epiphanio S, Campaner M, Catão-Dias JL, Shaw JJ, Camargo EP, Teixeira MMG. Phylogenetic, morphological and behavioural analyses support host switching of Trypanosoma (Herpetosoma) lewisi from domestic rats to primates. Infect Genet Evol. 2010;10:522-9. Maia da Silva F, Junqueira AC, Campaner M, Rodrigues AC, Crisante G, Ramirez LE, Caballero ZC, Monteiro FA, Coura JR, Añez N, Teixeira MMG. Comparative phylogeography of Trypanosoma rangeli and Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae) supports a long coexistence of parasite lineages and their sympatric vectors. Mol Ecol. 2007;16:3361-73. Maia da Silva F, Rodrigues AC, Campaner M, Takata CS, Brigido MC, Junqueira AC, Coura JR, Takefa GF, Shaw JJ, Teixeira MMG. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of Trypanosoma rangeli and allied species from human, monkeys and other sylvatic mammals of the Brazilian Amazon disclosed a new group and a species-specific marker. Parasitol. 2004a;128:283-94. Maia da Silva F, Noyes H, Campaner M, Junqueira AC, Coura JR, Añez N, Shaw JJ, Stevens JR, Teixeira MMG. Phylogeny, taxonomy and grouping of Trypanosoma rangeli isolates from man, triatomines and sylvatic mammals from widespread geographical origin based on SSU and ITS ribosomal sequences. Parasitol. 2004b;129: 549-61. Mansfield JM. Non pathogenic trypanosomes of mammals. In: Kreier JP, Ed. Parasitic protozoa. London: Academic Press; 1977. v.1, p. 297-327. Marcili A, Lima L, Cavazzana M, Junqueira AC, Veludo HH, Maia da Silva F, Campaner M, Paiva F, Nunes VL, Teixeira MMG. A new genotype of Trypanosoma cruzi associated with bats evidenced by phylogenetic analyses using SSU rDNA, cytochrome b and Histone H2B genes and genotyping based on ITS1 rDNA. Parasitol. 2009a;136:641-55. Marcili A, Lima L, Valente VC, Valente SA, Batista JS, Junqueira AC, Souza AI, da Rosa JA, Campaner M, Lewis MD, Llewellyn MS, Miles MA, Teixeira MMG. Comparative phylogeography of Trypanosoma cruzi TCIIc: new hosts, association with terrestrial ecotopes, and spatial clustering. Infect Genet Evol. 2009b;9:1265-74. Marcili A, Valente VC, Valente SA, Junqueira AC, da Silva FM, Pinto AY, Naiff RD, Campaner M, Coura JR, Camargo EP, Miles MA, Teixeira MMG. Trypanosoma cruzi in Brazilian Amazonia: Lineages TCI and TCIIa in wild primates, Rhodnius spp. and in humans with Chagas disease associated with oral transmission. Int J Parasitol. 2009c;39:615-23. Maslov DA, Yurchenko VY, Jirků M, Lukes J. Two new species of Trypanosomatid parasites isolated from Heteroptera in Costa Rica. J Eukaryot Microbiol. 2010;57:177-88. Maslov DA, Podlipaev SA, Lukes J. Phylogeny of the kinetoplastida: taxonomic problems and insights into the evolution of parasitism. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2001;96:397-402. Maslov DA, Lukes J, Jirku M, Simpson L. Phylogeny of trypanosomes as inferred from the small and large subunit rRNAs: implications for the evolution of parasitism in the trypanosomatid protozoa. Mol Biochem Parasitol. 1996;75:197-205. Maslov DA, Simpson L. Evolution of parasitism in Kinetoplastid protozoa. Parasitol Today. 1995;11:30-2. Matthews MJ, Kingston N, Morton JK. Trypanosoma cervi Kingston and Morton, 1975 from mule deer, Odocoileus hemionus, in Wyoming. J Wildl Dis. 1977;13: 33-9.

95

Mayer MG, Floeter-Winter LM. Pre-mRNA trans-splicing: from kinetoplastids to mammals, an easy language for life diversity. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100:501-13. McInnes LM, Dargantes AP, Ryan UM, Reid SA. Microsatellite typing and population structuring of Trypanosoma evansi in Mindanao, Philippines. Vet Parasitol. 2012.[in press] McKerrow JH, Caffrey C, Kelly B, Loke P, Sajid M. Proteases in parasitic diseases. Annu Rev Pathol. 2006;1:497-536. McKerrow JH, Sun E, Rosenthal PJ, Bouvier J. The proteases and pathogenicity of parasitic protozoa. Annu Rev Microbiol. 1993;47:821-53. Mekata H, Konnai S, Witola WH, Inoue N, Onuma M, Ohashi K. Molecular detection of trypanosomes in cattle in South America and genetic diversity of Trypanosoma evansi based on expression-site-associated gene 6. Infect Genet Evol. 2009;9:1301-5. Mendonça MB, Nehme NS, Santos SS, Cupolillo E, Vargas N, Junqueira A, Naiff RD, Barrett TV, Coura JR, Zingales B, Fernandes O. Two main clusters within Trypanosoma cruzi zymodeme 3 are defined by distinct regions of the ribosomal RNA cistron. Parasitol. 2002;124:177-84. Meyer A. Evolution of mitochondrial DNA in fishes. Hochchka, HN, Mommsen, GT (eds). In: Biochemistry and molecular biology of fishes. Amsterdam: Elsevier Science Publishers BV Academic Publishing Division; 1993. vol. 2.p.1-38. Miles MA, Llewellyn MS, Lewis MD, Yeo M, Baleela R, Fitzpatrick S, Gaunt MW, Mauricio IL. The molecular epidemiology and phylogeography of Trypanosoma cruzi and parallel research on Leishmania: looking back and to the future. Parasitol. 2009;136:1509-28. Milocco C, Kamyingkird K, Desquesnes M, Jittapalapong S, Herbreteau V, Chaval Y, Douangboupha B, Morand S. Molecular Demonstration of Trypanosoma evansi and Trypanosoma lewisi DNA in Wild Rodents from Cambodia, Lao PDR and Thailand. Transbound Emerg Dis. 2012; [in press]. Moloo SK, Kabata JM, Gitire NM. Study on the mechanical transmission by tsetse fly Glossina morsitans centralis of Trypanosoma vivax, T. congolense or T. brucei brucei to goats. Acta Trop. 2000; 74: 105-8. Monzon CM, Mancebo OA, Dágostinho BI. Consideraciones clínicas de La tripanosomiasis eqüina experimental (Trypanosoma equinum, Vóges 1901). Ver Med Vet. 1984;65:13-18. Moreira D, von der Heyden S, Bass D, López-García P, Chao E, Cavalier-Smith T. Global eukaryote phylogeny: Combined small- and large-subunit ribosomal DNA trees support monophyly of Rhizaria, Retaria and Excavata. Mol Phylogenet Evol. 2007;44: 255-66. Moreira D, López-García P, Vickerman K. An updated view of kinetoplastid phylogeny using environmental sequences and a closer outgroup: proposal for a new classification of the class Kinetoplastea. Int J Syst Evol Microbiol. 2004;54:1861-75. Moreira D, López-García P, Rodríguez-Valera F. New insights into the phylogenetic position of diplonemids: G+C content bias, differences of evolutionary rate and a new environmental sequence. Int J Syst Evol Microbiol. 2001;51:2211-9. Morel C, Chiari E, Camargo EP, Mattei DM, Romanha AJ, Simpson L. Strains and clones of Trypanosoma cruzi can be characterized by pattern of restriction endonuclease products of kinetoplast DNA minicircles. Proc Natl Acad Sci USA. 1980;77:6810-4.

96

Morel C, Simpson L. Characterization of pathogenic Trypanosomatidae by restriction endonuclease fingerprinting of kinetoplast DNA minicircles. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1980;29:1070-4. Morrison LJ, Tweedie A, Black A, Pinchbeck GL, Christley RM, Schoenefeld A, Hertz-Fowler C, MacLeod A, Turner CM, Tait A. Discovery of mating in the major African livestock pathogen Trypanosoma congolense. PLoS One. 2009;4:e5564. Mottram JC, Helms MJ, Coombs GH, Sajid M. Clan CD cysteine peptidases of parasitic protozoa. Trends Parasitol. 2003;19:182-7. Moulton JE, Krauss HH. Ultraestructure of Trypanosoma theileri in bovine spleen culture. Corn Veterinarian. 1972;62:124-37. Ngaira JM, Olembo NK, Njagi EN, Ngeranwa JJ. The detection of non-RoTat 1.2 Trypanosoma evansi. Exp Parasitol. 2005;110:30-8. Nicholas KB, Nicholas HB, Deerfield DW. GeneDOC: Analysis and visualization of genetic variation. EMBNEW News. 1997;4:14. Njiru ZK, Ouma JO, Enyaru JC, Dargantes AP. Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) test for detection of Trypanosoma evansi strain B. Exp Parasitol. 2010;125: 196-201. Njiru ZK, Constantine CC, Gitonga PK, Thompson RC, Reid SA. Genetic variability of Trypanosoma evansi isolates detected by inter-simple sequence repeat anchored-PCR and microsatellite. Vet Parasitol. 2007;147:51-60. Njiru ZK, Constantine CC, Masiga DK, Reid SA, Thompson RC, Gibson WC. Characterization of Trypanosoma evansi type B. Infect Genet Evol. 2006;6:292-300. Njiru ZK, Constantine CC, Guya S, Crowther J, Kiragu JM, Thompson RC, Dávila AM. The use of ITS1 rDNA PCR in detecting pathogenic African trypanosomes. Parasitol Res. 2005;95:186-92. O’Connor O, Bosseno M-F, Barnabé C, Douzery EJ, Brenière SF. Genetic clustering of Trypanosoma cruzi I lineage evidenced by intergenic miniexon gene sequencing. Infect. Genet Evol. 2007.7:587-93. Oliveira JB, Hernández-Gamboa J, Jiménez-Alfaro C, Zeledón R, Blandón M, Urbina A. First report of Trypanosoma vivax infection in dairy cattle from Costa Rica. Vet Parasitol. 2009;163:136-9. Oliveira RP, Broude NE, Macedo AM, Cantor CR, Smith CL, Pena SD. Probing the genetic population structure of Trypanosoma cruzi with polymorphic microsatellites. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:3776-80. Ortiz PA, Maia da Silva F, Cortez AP, Lima L, Campaner M, Pral EM, Alfieri SC, Teixeira MMG. Genes of cathepsin L-like proteases in Trypanosoma rangeli isolates: markers for diagnosis, genotyping and phylogenetic relationships. Acta Trop. 2009;112:249-59. Osório AL, Madruga CR, Desquesnes M, Soares CO, Ribeiro LR, Costa SC. Trypanosoma (Duttonella) vivax: its biology, epidemiology, pathogenesis, and introduction in the New World-a review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2008;103:1-13. Otte MJ, Abuabara JY, Wells EA. Trypanosoma vivax in Colombia: epidemiology and production losses. Trop Anim Health Prod. 1994;26:146-56. Paiva F, Lemos RA, Oshiro ET, Salvador SC, Nakazato L. Ocorrência de Trypanosoma vivax em bovinos no Estado de Mato Grosso do Sul. Rev Bras Parasitol Vet. 1997;6:349-51. Payne RC, Sukanto IP, Djauhari D, Jones TW. Trypanosoma evansi infection in bovine and buffalo calves in Indonesia. Vet Parasitol. 1991a;38:253-6.

97

Payne RC, Sukanto IP, Djauhari D, Partoutomo S, Wilson AJ, Jones TW, Boid R, Luckins AG. Trypanosoma evansi infection in cattle, buffaloes and horses in Indonesia. Vet Parasitol. 1991b;38:109-19. Perrone TM, Gonzatti MI, Villamizar G, Escalante A, Aso PM. Molecular profiles of Venezuelan isolates of Trypanosoma sp. by random amplified polymorphic DNA method. Vet Parasitol. 2009;161:194-200. Pinchbeck GL, Morrison LJ, Tait A, Langford J, Meehan L, Jallow S, Jallow J, Jallow A, Christley RM. Trypanosomosis in The Gambia: prevalence in working horses and donkeys detected by whole genome amplification and PCR, and evidence for interactions between trypanosome species. BMC Vet Res. 2008;4:e7. Piontkivska H, Hughes AL. Environmental kinetoplastid-like 18S rRNA sequences and phylogenetic relationships among Trypanosomatidae: paraphyly of the genus Trypanosoma. Mol Biochem Parasitol. 2005;144: 94-9. Podlipaev S, Votýpka J, Jirků M, Svobodová M, Lukes J. Herpetomonas ztiplika n. sp. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae): a parasite of the blood-sucking biting midge Culicoides kibunensis Tokunaga, 1937 (Diptera: Ceratopogonidae). J Parasitol. 2004a;90:342-7. Podlipaev SA, Sturm, NR, Fiala I, Fernandes O, Westenberger SJ, Dollet M, Campbell DA, Lukes J. Diversity of insect Trypanosomatids assessed from the spliced leader RNA and 5S rRNA genes and intergenic regions. J Eukaryot Microbiol. 2004b;51:283-90. Podlipaev S. The more insect Trypanosomatids under study-the more diverse Trypanosomatidae appears. Int. J. Parasitol. 2001; 31: 648-52. Preisfeld A, Busse I, Klingberg M, Talke S, Ruppel HG. Phylogenetic position and inter-relationships of the osmotrophic euglenids based on SSU rDNA data, with emphasis on the Rhabdomonadales (Euglenozoa). Int J Syst Evol Microbiol. 2001;51:751-8. Queiroz AO, Cabello PH, Jansen AM. Biological and biochemical characterization of isolates of Trypanosoma evansi from Pantanal of Matogrosso-Brazil. Vet Parasitol. 2000;92:107-18. Rademaker V, Herrera HM, Raffel TR, D'Andrea PS, Freitas TP, Abreu UG, Hudson PJ, Jansen AM. What is the role of small rodents in the transmission cycle of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma evansi (Kinetoplastida Trypanosomatidae)? A study case in the Brazilian Pantanal. Acta Trop. 2009;111:102-7. Raina AK, Kumar R, Rajora VS, Sridhar, Singh RP. Oral transmission of Trypanosoma evansi infection in dogs and mice. Vet Parasitol. 1985;18:67-9. Ramírez JD, Duque MC, Guhl F. Phylogenetic reconstruction based on Cytochrome b (Cytb) gene sequences reveals distinct genotypes within Colombian Trypanosoma cruzi I populations. Acta Trop. 2011;119:61-5. Ramirez LE, Wells EA, Betancourt A. La tripanosomiasis en los animales domésticos en Colombia. Colombia: Centro Internacional de Agricultura Tropical. 1979. 62p. Reid S, Husein A, Hutchinson G, Copeman D. A possible role for rusa deer (Cervus timorensis russa) and wild pigs in spread of Trypanosoma evansi from Indonesia to Papua New Guinea. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1999;94:195-7. Reid HW, Burridge MJ, Pullan NB, Sutherst RW, Wain EB. Survey for trypanosome infections in domestic cattle and wild animals in areas of East Africa. IV. Stercorarian trypanosome infections in cattle and wild animals in East Africa. Br Vet J. 1970;126:642-7. Requena JM, López MC, Alonso C. Genomic repetitive DNA elements of Trypanosoma cruzi. Parasitol Today. 1996;12:279-83.

98

Reyna-Bello A, García FA, Rivera M, Sansó B, Aso PM. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of anti-Trypanosoma evansi equine antibodies. Vet Parasitol. 1998;80:149-57. Rivera M. Trypanosomiasis. In: Hemoparasitosis Bovinas. Caracas. Venezuela: CDCH-UCV Anauco Ediciones; 1996. p. 13-84. Roditi I. Trypanosoma vivax: linkage of mini-exon (spliced leader) and 5S ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res. 1992;20:1995. Rodrigues A, Fighera RA, Souza TM, Schild AL, Barros CS. Neuropathology of naturally occurring Trypanosoma evansi infection of horses. Vet Pathol 2009;46:251-8. Rodrigues A, Fighera RA, Souza TM, Schild AL, Soares MP, Milano J, Barros CSL. Surtos de tripanossomíase por Trypanosoma evansi em eqüinos no Rio Grande do Sul: aspectos epidemiológicos, clínicos, hematológicos e patológicos. Pesq Vet Bras. 2005;25:239-249. Rodrigues AC, Paiva F, Campaner M, Stevens JR, Noyes HA, Teixeira MMG. Phylogeny of Trypanosoma (Megatrypanum) theileri and related trypanosomes reveals lineages of isolates associated with artiodactyl hosts diverging on SSU and ITS ribosomal sequences. Parasitol. 2006;132:215-24. Rodrigues AC, Campaner M, Takata CS, Dell' Porto A, Milder RV, Takeda GF, Texeira MMG. Brazilian isolates of Trypanosoma (Megatrypanum) theileri: diagnosis and differentiation of isolates from cattle and water buffalo based on biological characteristics and randomly amplified DNA sequences. Vet Parasitol. 2003;116:185-207. Ronquist F, Huelsenbeck JP. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics. 2003;19:1572-4. Rosenthal PJ. Proteases of protozoan parasites. Adv Parasitol. 1999;43:105-59. Rudenskaya GN, Pupov DV. Cysteine proteinases of microorganisms and viruses. Biochem. 2008;73: 1-13. Ruszczyk A, Forlenza M, Savelkoul HF, Wiegertjes GF. Molecular cloning and functional characterisation of a cathepsin L-like proteinase from the fish kinetoplastid parasite Trypanosoma carassii. Fish Shellfish Immunol. 2008;24:205-14. Sajid M, McKerrow JH. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 2002;120:1-21. Sakanari JA, Nadler SA, Chan VJ, Engel JC, Leptak C, Bouvier J. Leishmania major: comparison of the cathepsin L- and B-like cysteine protease genes with those of other Trypanosomatids. Exp Parasitol. 1997;85:63-76. Salim B, de Meeûs T, Bakheit MA, Kamau J, Nakamura I, Sugimoto C. Population genetics of Trypanosoma evansi from camel in the Sudan. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5:e1196. Sarataphan N, Vongpakorn M, Nuansrichay B, Autarkool N, Keowkarnkah T, Rodtian P, Stich RW, Jittapalapong S. Diagnosis of a Trypanosoma lewisi-like (Herpetosoma) infection in a sick infant from Thailand. J Med Microbiol. 2007;56:1118-21. Schell D, Borowy NK, Overath P. Transferrin is a growth factor for the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Parasitol Res. 1991;77:558-60. Schönian G, Akuffo H, Lewin S, Maasho K., Nylén S, Pratlong F, Eisenberger CL, Schnur LF , Presber W. Genetic variability within the species Leishmania aethiopica does not correlate with clinical variations of cutaneous leihmaniasis. Mol Biochem Parasitol. 2000;106: 239-48.

99

Seidl A, Moraes AS, Aguilar R, Silva MS. A financial analysis of treatment strategies for Trypanosoma evansi in the Brazilian Pantanal. Prev Vet Med 1998;33:219-34. Seifi HA. Clinical trypanosomosis due to Trypanosoma theileri in a cow in Iran. Trop Animal Health Prod. 1995;27:93-4. Serra-Freire, NM. Oiapoque-outro foco de Trypanosoma vivax no Brasil. Rev Bras Med Vet 1981;4: 30-1. Serrano MG, Nunes LR, Campaner M, Buck GA, Camargo EP, Teixeira MMG. Trypanosomatidae: Phytomonas detection in plants and phytophagous insects by PCR amplification of a genus-specific sequence of the spliced leader gene. Exp Parasitol. 1999;91:268-79. Shahzad W, Munir R, Khan MS, Ahmad MD, Ijaz M, Ahmad A, Iqbal M. Prevalence and molecular diagnosis of Trypanosoma evansi in Nili-Ravi buffalo (Bubalus bubalis) in different districts of Punjab (Pakistan). Trop Anim Health Prod. 2010;42:1597-9. Shaw J.J. The epizootiology of American Surra with special reference to the Lower Amazon Region. Protozool. 1977;3:119-28. Shaw JJ, Lainson R. Trypanosoma vivax in Brazil. Ann Trop Med Parasitol. 1972;66:25-32. Silva RA, Egüez A, Morales G, Eulert E, Montenegro A, Ybañez R, Seidl A, Martín A, Dávila R, Ramirez L. Bovine trypanosomiasis in Bolivian and Brazilian lowlands. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1998a;93:29-32. Silva RA, Morales G, Eulert E, Montenegro A, Ybañez R. Outbreaks of trypanosomosis due to Trypanosoma vivax in cattle in Bolivia. Vet Parasitol. 1998b;76:153-7. Silva RA, Da Silva JA, Schneider RC, De Freitas J, Mesquita D, Mesquita T, Ramirez L, Dávila AM, Pereira ME. Outbreak of trypanosomiasis due to Trypanosoma vivax (Ziemann, 1905) in bovines of the Pantanal, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1996;91:561-2. Silva RA, Arosemena NA, Herrera HM, Sahib CA, Ferreira MS. Outbreak of trypanosomosis due to Trypanosoma evansi in horses of Pantanal Mato-grossense, Brazil. Vet Parasitol. 1995a;60:167-71. Silva RA, Silva JA, Shneider RC, Freitas J, Mesquita T, Ramirez L, Dávila AM, Pereira ME. Bovine Trypanosomiasis due to Trypanosoma vivax in the Northern subregion of Pantanal, Brasil. Trynews. 1995b;4:1-2. Simo G, Njiokou F, Tume C, Lueong S, de Meeûs T, Cuny G, Asonganyi T. Population genetic structure of Central African Trypanosoma brucei gambiense isolates using microsatellite DNA markers. Infect Genet Evol. 2010;10:68-76. Simo G, Cuny G, Demonchy R, Herder S. Trypanosoma brucei gambiense: study of population genetic structure of Central African stocks using amplified fragment length polymorphism (AFLP). Exp Parasitol. 2008;118:172-80. Simo G, Herder S, Njiokou F, Asonganyi T, Tilley A, Cuny G. Trypanosoma brucei s.l.: characterisation of stocks from Central Africa by PCR analysis of mobile genetic elements. Exp Parasitol. 2005;110:353-62. Simpson AG, Gill EE, Callahan HA, Litaker RW, Roger AJ. Early evolution within kinetoplastids (Euglenozoa), and the late emergence of Trypanosomatids. Protist. 2004;155:407-22. Simpson AG, Roger AJ. Protein phylogenies robustly resolve the deep-level relationships within Euglenozoa. Mol Phyl Evol. 2004;30:201-12. Simpson AG, Stevens JR, Lukes J. The evolution and diversity of kinetoplastid flagellates. Trends Parasitol. 2006;22:168-74.

100

Simpson AG, Lukes J, Roger AJ. The evolutionary history of kinetoplastids and their kinetoplasts. Mol Biol Evol. 2002;19:2071-83. Simpson L, Sbicego S, Aphasizhev R. Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosome mitochondria: a complex business. RNA. 2003;9:265-76. Simpson L. The mitochondrial genome of kinetoplastid protozoa: genomic organization, transcription, replication, and evolution. Annu Rev Microbiol. 1987;41:363-82. Sogin ML, Elwood HJ, Gunderson JH. Evolutionary diversity of eukaryotic small-subunit rRNA genes. Proc Natl Acad Sci USA. 1986;83:1383-7. Solano P, Ravel S, de Meeûs T. How can tsetse population genetics contribute to African trypanosomiasis control? Trends Parasitol. 2010;26:255-63. Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbell DA, Zingales B. DNA markers define two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 1996;83:141-52. Stamatakis A. RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics. 2006;22:2688-90. Stevens JR, Noyes HA, Schofield CJ, Gibson WC. The molecular evolution of Trypanosomatidae. Adv Parasitol. 2001;48:1-56. Stevens JR. Kinetoplastid phylogenetics, with special reference to the evolution of parasitic trypanosomes. Parasite. 2008;15: 226-32. Stevens JR, Rambaut A. Evolutionary rate differences in trypanosomes. Infect Genet Evol. 2001;1:143-50. Stevens JR, Teixeira MMG, Bingle LE, Gibson WC. The taxonomic position and evolutionary relationships of Trypanosoma rangeli. Int J Parasitol. 1999a;29:749-57. Stevens JR, Noyes HA, Dover GA, Gibson WC. The ancient and divergent origins of the human pathogenic trypanosomes, Trypanosoma brucei and T. cruzi. Parasitol. 1999b;118:107-16. Stevens JR, Gibson WC. The molecular evolution of trypanosomes. Parasitol Today. 1999;15:432-7. Stevens J, Noyes H, Gibson WC. The evolution of trypanosomes infecting humans and primates. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1998;93: 669-76. Steverding D. The history of African trypanosomiasis. Parasit. Vectors. 2008; 1:e3. Steverding D. The significance of transferrin receptor variation in Trypanosoma brucei. Trends Parasitol. 2003;19:125-7. Steverding D. The transferrin receptor of Trypanosoma brucei. Parasitol Int. 2000;48:191-8. Stuart K, Feagin JE. Mitochondrial DNA of kinetoplastids. Int Rev Cytol. 1992;141:65-88. Sturm NR, Murthy VK, Garside L, Campbell DA. The mini-exon gene of Trypanosoma (Nannomonas) simiae: sequence variation between isolates and a distinguishing molecular marker. Acta Trop. 1998;71:199-206. Sturm NR, Degrave W, Morel C, Simpson L. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol Biochem Parasitol. 1989;33:205-14. Subirana JA, Messeguer X. Structural families of genomic microsatellites. Gene. 2008;408:124-32.

101

Sukmee T, Siripattanapipong S, Mungthin M, Worapong J, Rangsin R, Samung Y, Kongkaew W, Bumrungsana K, Chanachai K, Apiwathanasorn C, Rujirojindakul P, Wattanasri S, Ungchusak K, Leelayoova S. A suspected new species of Leishmania, the causative agent of visceral leishmaniasis in a Thai patient. Int J Parasitol. 2008;38:617-22. Svobodová M, Zídková L, Cepicka I, Oborník M, Lukes J, Votýpka J. Sergeia podlipaevi gen. nov., sp. nov. (Trypanosomatidae, Kinetoplastida), a parasite of biting midges (Ceratopogonidae, Diptera). Int J Syst Evol Microbiol. 2007;57:423-32. Swofford DL. PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony: and other methods. version 4. Sunderland MA: Sinauer Associates; 2002. [s.p.] Tait A, Morrison LJ, Duffy CW, Cooper A, Turner CM, Macleod A. Trypanosome genetics: Populations, phenotypes and diversity. Vet Parasitol. 2011;181:61-8. Tamarit A, Gutierrez C, Arroyo R, Jimenez V, Zagalá G, Bosch I, Sirvent J, Alberola J, Alonso I, Caballero C. Trypanosoma evansi infection in mainland Spain. Vet Parasitol. 2010;167:74-6. Teixeira MMG, Borghesan TC, Ferreira RC, Santos MA, Takata CS, Campaner M, Nunes VL, Milder RV, de Souza W, Camargo EP. Phylogenetic validation of the genera Angomonas and Strigomonas of trypanosomatids harboring bacterial endosymbionts with the description of new species of trypanosomatids and of proteobacterial symbionts. Protist. 2011;162:503-24. Teixeira MMG, Serrano MG, Camargo EP. New data from old Trypanosomatid preparations. Parasitol Today. 2000;16:261-3. Teixeira MMG, Serrano MG, Nunes LR, Campaner M, Buck GA, Camargo EP. Trypanosomatidae: a spliced-leader-derived probe specific for the genus Phytomonas. Exp Parasitol. 1996;84:311-9. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 1997;25:4876-82. Tizard IR, Mittal KR, Nielsen K. Depressed immunoconglutinin responses in calves experimentally infected with Trypanosoma congolense. Res Vet Sci. 1980;28:203-6. Torres JP, Ortiz S, Muñoz S, Solari A. Trypanosoma cruzi isolates from Chile are heterogeneous and composed of mixed populations when characterized by schizodeme and Southern analyses. Parasitol. 2004;128:161-8. Townsend J, Duffus WP, Glavert AM. An ultraestructural study of the interation in vitro between Trypanosoma theileri and bovine leucocytes. J Cell Sci. 1982;56:389-407. Townsend J, Duffus WP. Trypanosoma theileri: antibody-dependent killing by purified populations of bovine leucocytes. Clin Exp Immunol. 1982;48:289-99. Urrea DA, Guhl F, Herrera CP, Falla A, Carranza JC, Cuba-Cuba C, Triana-Chávez O, Grisard EC, Vallejo GA. Sequence analysis of the spliced-leader intergênica region (SL-IR) and random amplified polymorphic DNA (RAPD) of Trypanosoma rangeli strains isolated from Rhodnius ecuadoriensis, R. colombiensis, R. pallescens and R. prolixus suggests a degree of co-evolution between parasites and vectors. Acta Trop. 2011;120:59-66. Valadares HM, Pimenta JR, de Freitas JM, Duffy T, Bartholomeu DC, Oliveira Rde P, Chiari E, Moreira Mda C, Filho GB, Schijman AG, Franco GR, Machado CR, Pena SD, Macedo AM. Genetic profiling of Trypanosoma cruzi directly in infected tissues using nested PCR of polymorphic microsatellites. Int J Parasitol. 2008;38:839-50. Vallejo GA, Guhl F, Schaub GA. Triatominae - Trypanosoma cruzi / T. rangeli: Vector-parasite interactions. Acta Trop. 2009;110:137-47.

102

Van den Bossche P, de La Rocque S, Hendrickx G, Bouyer J. A changing environment and the epidemiology of tsetse-transmitted livestock trypanosomiasis. Trends Parasitol. 2010;26:236-43. Ventura RM, Takeda GF, Silva RA, Nunes VL, Buck GA, Teixeira MMG. Genetic relatedness among Trypanosoma evansi stocks by random amplification of polymorphic DNA and evaluation of a synapomorphic DNA fragment for species-specific diagnosis. Int J Parasitol. 2002;32:53-63. Ventura RM, Paiva F, Silva RA, Takeda GF, Buck GA, Teixeira MMG. Trypanosoma vivax: characterization of the spliced-leader gene of a Brazilian stock and species-specific detection by PCR amplification of an intergenic spacer sequence. Exp Parasitol. 2001;99:37-48. Ventura RM, Takata CS, Silva RA, Nunes VL, Takeda GF, Teixeira MMG. Molecular and morphological studies of Brazilian Trypanosoma evansi stocks: the total absence of kDNA in trypanosomes from both laboratory stocks and naturally infected domestic and wild mammals. J Parasitol. 2000;86:1289-98. Vickerman K. The evolutionary expansion of the Trypanosomatid flagellates. Int J Parasitol. 1994;24:1317-31. Villa A, Gutierrez C, Garcia E, Moreno B, Chacón G, Sanz PV, Büscher P, Touratier L. Presence of Trypanosoma theileri in Spanish Cattle. Ann New York Acad Sci. 2008;1149:352-4. Viola LB, Attias M, Takata CS, Campaner M, De Souza W, Camargo EP, Teixeira MMG. Phylogenetic analyses based on small subunit rRNA and glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes and ultrastructural characterization of two snake trypanosomes: Trypanosoma serpentis n. sp. from Pseudoboa nigra and Trypanosoma cascavelli from Crotalus durissus terrificus. J Eukaryot Microbiol. 2009a;56:594-602. Viola LB, Almeida RS, Ferreira RC, Campaner M, Takata CS, Rodrigues AC, Paiva F, Camargo EP, Teixeira MMG. Evolutionary history of trypanosomes from South American caiman (Caiman yacare) and African crocodiles inferred by phylogenetic analyses using SSU rRNA and gGAPDH genes. Parasitol. 2009b;136:55-65. Viola LB, Campaner M, Takata CS, Ferreira RC, Rodrigues AC, Freitas RA, Duarte MR, Grego KF, Barrett TV, Camargo EP, Teixeira MMG. Phylogeny of snake trypanosomes inferred by SSU rDNA sequences, their possible transmission by phlebotomines, and taxonomic appraisal by molecular, cross-infection and morphological analysis. Parasitol. 2008;135:595-605. von der Heyden S, Chao EE, Vickerman K, Cavalier-Smith T. Ribosomal RNA phylogeny of bodonid and diplonemid flagellates and the evolution of euglenozoa. J Eukaryot Microbiol. 2004;51:402-16. Votýpka J, Szabová J, Rádrová J, Zídková L, Svobodová M. Trypanosoma culicavium sp. nov., an avian trypanosome transmitted by Culex mosquitoes. Int J Syst Evol Microbiol. 2012;62:745-54. Votýpka J, Svobodová M. Trypanosoma avium: experimental transmission from black flies to canaries. Parasitol Res. 2004;92:147-51. Votýpka J, Oborník M, Volf P, Svobodová M, Lukes J. Trypanosoma avium of raptors (Falconiformes): phylogeny and identification of vectors. Parasitol. 2002;125:253-63. Wallace FG. Biology of the Kinetoplastida of Arthropods. In: Lumsden WHR, Evans DA (eds). Biology of the Kinetoplastida. New York: Academic Press; 1979. p. 213-40. Ward, WH, Hill MW, Mazlin ID, Foster CK. Anaemia associated with a high parasitaemia of Trypanosoma theileri in a dairy cow. Vet J. 1984;61:324. Weinman D. Trypanosoma cyclops n. sp.: a pigmented trypanosome from the Malaysian primates Macaca nemestrina and M. ira. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1972;66:628-36.

103

Wells EA. Subgenus Megatrypanum. Biology of the kinetoplastida. In: Lumsden, W HR, Evans, D A (eds), London: Academic Press; 1976. cap. 1, p. 257-75. Westenberger SJ, Sturm NR, Yanega D, Podlipaev SA, Zeledón R, Campbell DA, Maslov DA. Trypanosomatid biodiversity in Costa Rica: genotyping of parasites from Heteroptera using the spliced leader RNA gene. Parasitol. 2004;129:537-47. Wiemer EA, Hannaert V, van den IJssel PR, Van Roy J, Opperdoes FR, Michels PA. Molecular analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in Trypanoplasma borelli: an evolutionary scenario of subcellular compartmentation in kinetoplastida. J Mol Evol. 1995;40:443-54. Wiesenhutter E. Trypanosoma evansi infections of dogs in Malaysia and considerations of their epidemiology. South East Asian. J Trop Med Public Health. 1975;6:445. Witola WH, Sarataphan N, Inoue N, Ohashi K, Onuma M. Genetic variability in ESAG6 genes among Trypanosoma evansi isolates and in comparison to other Trypanozoon members. Acta Trop. 2005;93:63-73. Woo P, Soltys MA, Gillick AC. Trypanosomes in cattle in southern Ontario. Can J Comp Med. 1970;34: 142-7. Wright AD, Li S, Feng S, Martin DS, Lynn DH. Phylogenetic position of the kinetoplastids, Cryptobia bullocki, Cryptobia catostomi, and Cryptobia salmositica and monophyly of the genus Trypanosoma inferred from small subunit ribosomal RNA sequences. Mol Biochem Parasitol. 1999;99:69-76. Yeo M, Mauricio IL, Messenger LA, Lewis MD, Llewellyn MS, Acosta N, Bhattacharyya T, Diosque P, Carrasco HJ, Miles MA. Multilocus sequence typing (MLST) for lineage assignment and high resolution diversity studies in Trypanosoma cruzi. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5:e1049. Young R, Taylor JE, Kurioka A, Becker M, Louis E, Rudenko G. Isolation and analysis of the genetic diversity of repertoires of VSG expression site containing telomeres from Trypanosoma brucei gambiense, T. b. brucei and T. equiperdum. BMC Genomics. 2008;9:e385. Yu MC, Orlando TC, Sturm NR, Zhou L, Saito RM, Floeter-Winter LM, Campbell DA. Two distinct functional spliced leader RNA gene arrays in Leishmania tarentolae are found in several lizard Leishmania species. Int J Parasitol. 2002;32:1411-22. Yurchenko VY, Lukes J, Jirku M, Maslov DA. Selective recovery of the cultivation-prone components from mixed Trypanosomatid infections: a case of several novel species isolated from Neotropical Heteroptera. Int J Syst Evol Microbiol. 2009;59:893-909. Yurchenko V, Lukes J, Xu X, Maslov DA. An integrated morphological and molecular approach to a new species description in the Trypanosomatidae: the case of Leptomonas podlipaevi n. sp., a parasite of Boisea rubrolineata (Hemiptera: Rhopalidae). J Eukaryot Microbiol. 2006;53:103-11. Zafra G, Mantilla JC, Jácome J, Macedo AM, González CI. Direct analysis of genetic variability in Trypanosoma cruzi populations from tissues of Colombian chagasic patients. Hum Pathol. 2011;42:1159-68. Zaja A, Ferreira E, Passaglia L. Biologia molecular básica. 3 ed. Porto Alegre: Editorial Mercado Aberto; 2003. 102p. Zanette RA, Da Silva AS, Costa MM, Monteiro SG, Santurio JM, Lopes ST dos A. Ocorrência de Trypanosoma evansi em eqüinos no município de Cruz Alta, RS, Brasil. Cienc Rural. 2008;38:1468-71.