HIDRÓLISIS DEL ALMIDON EXITO

7/27/2019 HIDRLISIS DEL ALMIDON EXITO

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METABOLISMO MICROBIANO

(Pruebas Bioqumicas)

INTRODUCCIN

Los estudios sobre las actividades bioqumicas de los microorganismos, en las

que se basan todas sus dems actividades, hubieron de esperar el nacimiento

de la bioqumica, en la ltima mitad del siglo XIX. No obstante, a partir de

entonces, el inters sobre las actividades bioqumicas de los microorganismos

ha crecido a un ritmo impresionante y hoy se reconoce a la bioqumica

microbiana como un sujeto de amplio estudio.Lo que el bioqumico a la larga se propone cuando estudia las actividades de

los microorganismos es la explicacin en trminos moleculares de los procesos

vitales de estos organismos. Paulatinamente se han acumulado datos sobre el

comportamiento bioqumico de los microorganismos. Los primeros

microbilogos no podan hacer otra cosa que estudiar estas poblaciones mixtas

de microorganismos. Despus de los trabajos de LORD JOSEPH LISTER Y

ROBERT KOCH, se hizo posible el estudio de los grmenes en cultivo puro,pero aunque esto simplific notablemente la tarea de observarlos y

clasificarlos, tambin tuvo como consecuencia el estudiarlos en condiciones

muy diferentes de las que reinan en los ambientes naturales.

Los primeros experimentos sobre las actividades bioqumicas de los

microorganismos estaban relacionados principalmente con la capacidad de los

grmenes en crecimiento, de cambiar la composicin qumica de su medio

ambiente realizando la separacin de algunos de los componentes y la

excrecin de otros. Desde la dcada pasad, los microbilogos se han

interesado cada vez ms por los aspectos fisiolgicos de la actividad

microbiana, se obtuvieron xitos espectaculares por los zimlogos al disear

los sistemas metablicos para la obtencin de fermentos tiles industrialmente;

en la actualidad con la manipulacin gentica se estn obteniendo productos

de origen animal y vegetal en grandes cantidades mediante fermentacin

bacteriana a escala industrial.


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OBJETIVOS

Mediante esta prctica el alumno lograra:

Relacionar la actividad metablica de los M.O con los sustratos, los

cambios producidos en los medios de cultivo y la aparicin de diferentes

metablicos en los mismos.

Interpretar adecuadamente pruebas especficas y relacionarlas con las

caractersticas metablicas de diversos M.O

Aplicar los conocimientos adquiridos para la caracterizacin de M.O

problemas


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HIDRLISIS DEL ALMIDN:

FUNDAMENTO:

La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio delmismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan

mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la

degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas

distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para completar el proceso.

Las tres primeras enzimas son una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa.

Al parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo

que cuando participan la -amilasa y la almidn fosforilasa, es probable queacten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La -amilasa

ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y

amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y

liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no

ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido

que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede

atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la

amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando aun quedan

dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son

activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un

elemento esencial.

OBJETIVO: Buscar La Presencia De La Enzima Am ilasa.

MATERIAL:

Lpiz graso

mechero

Asa y porta asa

Gradilla

Una caja petri con agar almidn

Cultivos puros de 24 horas de desarrollo.


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PREPARACIN DEL AGAR ALMIDON. AL 1%

Ingredientes por litro.

Extracto de carne...........................3 g Almidn Soluble, Difco.................10 g

Agar..............................................12 g

pH final: 7.5 0.2 a 25 C.

1. Suspender 25 g en 1 litro de agua

destilada o desmineralizada.

2. Calentar a ebullicin para disolver

completamente.

3. Esterilizar en autoclave por 15

minutos a 15 libras de presin (121 C).

4. Distribuir en la forma deseada.

METODOLOGIA DE SIEMBRA:

1. Con un lpiz graso o con un marcador, dividir la parte externa de la caja

en cuatro sectores.

2. Identificar los sectores 1 y 2 con el nombre de los microorganismos, el

sector 3 con el problema y el 4 con el control.

3. En condiciones de asepsia, tomar una

asada del cultivo e inocular el sector 1

sembrado por estra recta empezando por el

borde de la caja.

4. Repetir el procedimiento, inoculando los

sectores 2 y 3 con los microorganismos

adecuados.

5. El sector 4 se deja sin sembrar y se utiliza como control de esterilidad

del medio, as como testigo.

6. Invertir las cajas e incubar a 37 C durante 48 horas.


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7. Despus de la incubacin, cubrir la

superficie de la caja con la solucin de lugol.

8. Consultar la gua de observacin y

anotar los resultados obtenidos en la tabla

correspondiente.

RESULTADOS:

LECTURA

En la metodologa dice que Una prueba positiva se revela aadiendo solucin

de lugol, por la aparicin de zonas incoloras alrededor de las colonias; si la

prueba es negativa el medio se tie totalmente de azul-prpura.. Esto fueron

los resultados de las sepas a estudiar.

CEPAS RESULTADOS

5.- Staphylococcusaereus

NEGATIVO

6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO8.-problema NEGATIVO

NO FUE CONSUMIDO EL ALMIDN.


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HIDRLISIS DE LA CASENA

FUNDAMENTO:

El hidrolizado cido de casena es una base nutritiva obtenida mediante unahidrlisis no especfica con cido clorhdrico, la cual transcurre hasta convertir

la casena en componentes de una simplicidad qumica relativa. El cido

clorhdrico acta sobre las uniones peptdicas y degrada la protena y

polipptidos a cadenas cortas y aminocidos. Este hidrolizado se caracteriza

por presentar un elevado contenido de nitrgeno amnico y un bajo contenido

de aminocidos sulfurados.1-3

OBJETIVO: buscar la presencia de la enzima caseinasa.

MATERIAL:

Lpiz graso

mechero

Asa y porta asa

Gradilla Una caja petri con agar casena.



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PREPARACIN DEL AGAR CASENA:

FRMULA (EN GRAMOS POR

LITRO)

INSTRUCCIONES

Agar nutritivo a doble

concentracin

Tomar 125ml de agar nutritivo a

doble concentracin y mezclarlos

con a125 ml de agua destilada por

13 minutos

Tomar 125ml de leche y mezclarla

con la solucin anterior por 10

minutos

Esterilizar preparado en la

autoclave.

Vaciar en los tubos

correspondientes

.

Leche descremada y

deslactosada

125ml

Agua destilada 125ml

TECNICA DE SIMBRA

METODOLOGIA DE SIEMBRA:

1. Repetir el procedimiento

adecuado en los incisos 1 al 6 del

ejercicio anterior.

2. Despus de la incubacin

consultar la gua de observacin y

registrar los resultados en la tabla

correspondiente.


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RESULTADOS

LECTURA

CEPAS RESULTADOS5.- Staphylococcusaereus

POSITIVO

6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO8.-problema POSITIVO

EN LAS CEPAS 5 Y 6 EL

RESLUTADO FUE POSITIVO, SI

SE ENCONTRO LA ENZIMA

CASEINASA

HIDRLISIS DE LA GELATINA

La gelatina es una protena que se mantiene en un estado de gel mientras la

temperatura sea menor de 25C, cuando la temperatura aumenta la gelatina

se inocula; es decir que pasa de estado liquido permaneciendo en este

mientras la temperatura se mantenga alrededor de los 25C.

La mayora de los polmeros son demasiados grandes para ser transportados

dentro de la clula. Las bacterias excretan enzimas extrace1u1ares que se

hidro1izan unos polmeros transportando al interior de la clula en monmeros

que les servir para crecer.

La produccin de proteasa es elevada por incorporacin de una protena


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(gelatina) en un medio slido en placa. La placa se inunda en un medio cido

que precipita la protena no hidroliza.

OBJETIVO: Buscar La Presencia De La Enzima Gelatinasa

MATERIAL:

Lpiz graso

Mechero

Asa y porta asa

Gradilla

4 tubos de ensayo de 5ml de gelatina.

Cultivos puros de enterobacterias aerogenes Staphilococcus aureus y

una cepa problema.

PREPARACIN DEL MEDIO GELATINA NUTRITIVA.

FRMULA (EN GRAMOS POR

LITRO)

INSTRUCCIONES

Extracto de carne 3 Rehidratar 128 g del medio en unlitro de agua destilada.

Reposar 10 a 15 minutos.

Calentar agitando frecuentemente

hasta el punto de ebullicin durante 1

minuto para disolverlo por completo.

Distribuir en tubos de ensayo.

Esterilizar en autoclave a 121C (15lbs de presin) durante 15 minutos.

Enfriar en posicin vertical.

Conservar en refrigeracin de 2 a

8C.

Gelatina 120

Peptona de Gelatina 5

pH final: 6 + 0.2


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TCNICA DE SIEMBRA

I. 1.- colocar los tubos con gelatina nutritiva en el hielo para mantenerlo

a una temperatura baja y evitar la licuefaccin del medio.

II. 2.- identificar cada

tubo con el nombre de cada uno

de los microorganismos, el 4 tubosirve para control.

III. 3.- en condiciones de

asepsia. Incubar cada uno de los

tres tubos con el microorganismo

correspondiente, sembrando por

picadura con el asa recta.

IV. 4.-Incubaratemperatura ambiente de 2 a 7 das.

V. 5.- despus de la

incubacin, colocar los tubos en hielo,

teniendo cuidado de no agitarlos;

esperar a que el contenido del tubo

control se solidifique. Sacar los otrostres tubos y observar los resultados.


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RESULTADO

Lectura:

Una prueba es positiva si se identifican las caractersticas del cono de

licuefaccin producido por las diferentes bacterias, y al comparar la hidrlisis,

algunas bacterias hacen que el medios solidifique y otras hacen que se

hidrolicen (presencia de gelatinaza).

CEPAS RESULTADOS

5.- Staphylococcus aereus NEGATIVO6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO

8.-problema NEGATIVO


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FERMENTACIN DE AZUCARES

FUNDAMENTO:

Se entiende por fermentacin a reacciones de mantenimiento que norequieren la participacin de una cadena de transporte de electrones, aunque

en ciertos casos stas pueden jugar papeles auxiliares. En el caso de

azcares se trata de procesos de xido-reduccin capaces de regenerar NAD

y que comnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol,

isopropanol, n-butanol, etc.), cidos (actico, frmico, lctico, etc.)

acompaados o no por la formacin de gases.

Adems de su inters bioqumico, la capacidad para fermentar diferentes

azcares es una propiedad utilizada muy frecuentemente en taxonoma. En

nuestro caso utilizaremos un procedimiento clsico para ensayar la

capacidad de fermentacin de tres azcares: Glucosa, Sacarosa y Lactosa.

La produccin de cidos se observar por el viraje a amarillo del Prpura de

Bromocresol. La produccin de gas por su acumulacin en las Campanas

Durham, de donde habr desplazado parte del lquido inicialmente includo.

Ambas determinaciones se efectuarn a las 24 y 48 horas de incubacin

para as tener una idea de la rapidez de su produccin. Asmismo, se har

una cuantificacin en funcin de la extensin del viraje del indicador y de la

cantidad de gas producida.

OBJETIVO: Observacin De La Descarboxilacion De Los Azucares

MATERIAL

Lpiz graso

Mechero, asa y porta asa y gradilla

16 tubos de 13X100 con tubos Durham conteniendo caldo rojo de fenol

mas un carbohidrato (4 con lactosa, 4 con maltosa, 4 con glucosa y 4

con sacarosa).

Cultivos puros.


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PREPARACIN DE MEDIOS PARA LA PRUEBA DE CARBOHIDRATOS

CALDO ROJO DE FENOL

1. Prehidratar 15 g del medio de cultivo en un litro de agua destilada.2. Agregar carbohidratos si se desea.

CLCULOS

CALDO ROJO DE FENOL AZCAR

15 g-------------------1000ml 100%-----------------300g

X---------------------300ml 1%----------------------X

X=4.5 g x=3g

METODO

I. 1.- colocar los tubos con gelatina nutritiva en el hielo para mantenerlo a

una temperatura baja y evitar la licuefaccin del medio.

II. 2.- identificar cada tubo

con el nombre de cada uno de los

microorganismos, el 4 tubo sirve

para control.


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III. 3.- en condiciones de asepsia.

Incubar cada uno de los tres tubos

con el microorganismo

correspondiente, sembrando por

picadura con el asa recta.

IV. 4.-Incubara temperatura

ambi

ente

de 2

a 7 das.

V. 5.- despus de la incubacin, colocar

los tubos en hielo, teniendo cuidado de

no agitarlos; esperar a que el contenido

del tubo control se solidifique. Sacar los

otros tres tubos y observar los

resultados.

LACTOSA 1%

1. Pesar 4.5 g de caldo rojo de fenol

2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para

disolver el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al

matraz.

3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y

vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campanadebe de llenarse de medio.

GLUCOSA 1%




matraz.


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3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y

vaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana

debe de llenarse de medio.

SACAROSA 1%


2. En un matraz de 500 ml agregar 300 ml de agua destilada para disolver

el medio de cultivo. Pesar 3g del azcar y adicionrselos al matraz.

3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida y vaciar

10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana debe de

llenarse de medio.

MANITOL 1%




matraz.

3. Colocar dentro de tubos con rosca 1 campana Durham invertida yvaciar 10 ml del medio de cultivo fijndose que tambin la campana

debe de llenarse de medio.

RESULTADOS

CEPAS:

5.- Staphylococcus aereus 6.-Enterobacteria sp 3.-Proteus sp 8.-problema


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La metodologa indica que la prueba positiva da un cambio de coloracin

De rojo amarillo.

Azucares Cepa 8 Cepa 3 Cepa 6 Cepa 5Glucosa Positivo negativo positivo Dudosa

Sacarosa Positiva negativa positiva Negativa

Manitol Positivo negativo positivo Negativo

Lactosa positivo negativo positivo Negativo

PRUEBA DE CATALASA

FUNDAMENTO:

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra

en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen

citocromo. El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido

de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser

ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la

produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2).

OBJETIVO: buscar la presencia de la enzima catalasa.


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MATERIAL

1 caja de petri con agar nutritivo

Agua oxigenada al 3.0%

1 Mechero

Asa de siembra

Cultivos de 24 horas de los microorganismos indicados por el

profesor.

PREPARACIN DE LAS PLACAS DEL MEDIO AGAR NUTRITIVO

Peptona de Gelatina

5.0

Mtodo:

Extracto de Carne 3.0 Suspender 23 g del medio en un litro de

agua purificada. Calentar con agitacin

suave hasta su completa

Agar Bacteriolgico

15.0

Disolucin y hervir durante un minuto.

Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras

de presin) durante 15

pH 6.8 0.2 Minutos. Dejar enfriar a una temperatura

entre 45-50C y vaciar en placas de Petri

estriles.

METODOLOGA DE SIEMBRA:

1. Con un lpiz graso o con un

marcador, dividir la parte externa de la caja

en cuatro sectores2. Identificar los sectores 1 y 2 con el

nombre de los microorganismos, el sector 3

con el problema y el 4 es el control.

3. Sembrar con estra recta inoculado

un microorganismo en cada sector

4. Invertir las cajas he incubar a 37 C durante 24 horas

5. Agregar unas gotas de perxido de hidrogeno sobre el desarrollomicrobiano.


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6. Consultar la gua de observacin y tratar de interpretar la reaccin que

se produce

7. Registrar los datos en la tabla correspondiente.

RESULTADOS:

La metodologa es buscar la presencia de la enzima catalasa el perxido de

hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser

ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la

produccin de la enzima catalasa (h2o2 -> h2o + o2).

LECTURA


POSITIVO

6.-Enterobacteria sp POSITIVO3.-Proteus sp POSITIVO

8.-problema POSITIVO


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PRUEBA UREASA

FUNDAMENTO:

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dosmolculas de amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad

enzimtica es caracterstica de todas las especies de Proteus y se usa sobre

todo para diferenciar este gnero de otras enterobacterias que dan negativo o

positivo retardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio

se complementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser

degradada por aquellos microorganismos capaces de producir el enzima

ureasa. Esta degradacin produce amoniaco que har variar el color del

indicador de amarillo a rosa mexicano, ponindose as de manifiesto la

actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el

tiempo de incubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio

poco despus de la inoculacin y sus resultados deben ser ledos en lasprimeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundiiy Klebsiella pneumoniae

tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubacin.

OBJETIVO: Determinacin de la enzima ureasa

MATERIAL:

4 tubos de 12 x 75 con 3 ml de agar urea Cultivos puros de 24 horas.


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PREPARACIN DE AGAR UREA.

Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad

uresica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como

Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.En el medio de cultivo, la

triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de

microorganismos.

El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el

indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima

ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el

medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, lafermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del

metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como

especies de Enterobacterias o Klebsiella.

FRMULA (EN GRAMOS POR LITRO) INSTRUCCIONES

Triptena 1.0 Suspender 24 g de polvo en 950

ml de agua destilada.

Dejar reposar 2 minutos.

Esterilizar en autoclave a 121C

durante 15 minutos.

Enfriar a 50C y agregar 50 ml

de una solucin de urea al 40%previamente esterilizada por

filtracin o cloroformo.

Fraccionar en tubos de hemlisis

y solidificar en pico de flauta con

fondo profundo.

Glucosa 1.0

Cloruro de sodio 5.0

Fosfato monopotsico 2.0

Rojo de fenol 0.012

Agar 15.0

pH final: 6.8 0.2


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UTILIZACIN DEL CITRATO

FUNDAMENTO:

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citratocomo nica fuente de carbono y compuestos amoniacales como nica fuente

de nitrgeno en su metabolismo, provocando una alcalinizacin del medio.

Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes

gneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobactery algunas especies de

Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhiy Salmonella

paratyphison incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene

citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrgeno

respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias

capaces de metabolizar el citrato podrn multiplicarse en este medio y liberarn

iones amonio lo que, junto con la eliminacin del citrato (cido), generar una

fuerte basificacin del medio que ser aparente por un cambio de color del

indicador de pH, de verde a azul.

OBJETIVO:Determinacin De La Util izacin De Citrato Com o nicaFuente De Carbono

MATERIAL:

Mechero, asa y porta asa

Gradilla

4 tubos de 16 x 150 conteniendo el medio citrato de Simmons

(inclinado).

Cultivos puros de 24 horas de desarrollo de los microorganismos

indicados en ejercicios anteriores.


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PREPARACIN DEL MEDIO CITRATO DE SIMMONS

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la

capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa. En el

medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el

citrato de sodio es la nica fuente de carbono.

Ambos componentes son necesarios para el

desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato

forman un sistema buffer, el magnesio es

cofactor enzimtico.

El cloruro de sodio mantiene el balanceosmtico, y el azul de bromotimol es el indicador

de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El

medio de cultivo es diferencial en base a que los

microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono,

usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente

produccin de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras

de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El

desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato.

Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos

orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos

y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de

la produccin de citrato permeasa.


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Citrato de sodio 2.0 Suspender 24,2 g del medio

deshidratado por litro de agua

destilada.

Dejar reposar 5 minutos y

mezclar calentando a ebullicin

durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en

autoclave a 121C durante 15

minutos. Enfriar en posicin

inclinada.


Fosfato dipotsico 1.0

Fosfato monoamnico 1.0

Sulfato de magnesio 0.2

Azul de bromotimol 0.08

Agar 15.0

pH final: 6.9 0.2

METODOLOGA DE SIEMBRA:

1. Identificar los tubos con el

nombre de los microorganismos

a inocular.

2. Inocular por picadura y

estra el medio

3. Incubar a 35 C de 24 a

48 horas.

4. Despus de la incubacin,

observar si hubo desarrollo, consultar la gua de observacin y anotar

sus datos en la tabla correspondiente.


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RESULTADOS:

En la metodologa dice que una coloracin de color verde cambia a azul en elmedio nos indica una prueba positiva. Esto fueron los resultados


NEGATIVO

6.-Enterobacteria sp NEGATIVO3.-Proteus sp NEGATIVO8.-problema NEGATIVO

NEGATIVO

OBSERVACIN DE CIDO SULFRICO

FUNDAMENTO

La protelisis de la protena produce a.a. individuales; ciertas bacterias

heterotrficas pueden liberar enzimticamente el azufre de los diversos a.a.

azufrados, produciendo H2S gaseoso peptona, cistena, cistina, metionina y

tiosulfato son fuentes de azufre, pero las especies utilizan diferentes

compuestos o a.a. azufrados para producir H2S. Las enzimas responsables de

esta actividad son la cistena, desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa.

OBJETIVO: identificacin de cistena, desulfhidrasa y la tiosulfato reductasa.


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MATERIAL:

4 tubos de 12 x 75 con agar hierro de Kligler.

Cultivos puros de 24 horas de desarrollo

PREPARACION DEL MEDIO KLIGLER:

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa

de alimentos para la diferenciacin de enterobacterias, en

base a la fermentacin de glucosa y lactosa, y a la produccin

de cido sulfhdrico.

En el medio de cultivo, la peptona de carne y la

triptena, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo

bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono

fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario

para la produccin de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y

amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el cido

sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el

indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar esel agente solidificante.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por

medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido.

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego

con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.


Peptona de carne 13.0 Suspender 54.8 g del polvo por

litro de agua destilada.

Mezclar bien y calentar con

agitacin frecuente, hervir 1 o 2


Lactosa 10.0

Tripteina 10.0

Glucosa 1.0


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Citrato de hierro y amonio 0.5 minutos hasta disolucin total.

Llenar hasta la tercera parte de

los tubos de ensayo.

Esterilizar a 121C por 15minutos. Enfriar en pico de flauta

profundo.

Tiosulfato de sodio 0.3

Rojo de fenol 0.025

Agar 15.0

pH final: 7.3 0.2

METODOLOGA DE SIEMBRA (PICADURA Y ESTRIA):

1. Identificar los tubos con la cepa

correspondiente

2. Inocular tres tubos, cada uno

con el microorganismo marcado

3. Incubar los tubos 35 C durante

24 horas

4. Despus de la incubacin, efectuar las observaciones correspondientes

y consultar la gua de observacin.


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RESULTADOS:

KLIGLER

Lecturas Cepa 5 Cepa 3 Cepa 6 Cepa 8

pH negativo negativo positivo Positivo

H2S Negativo positivo negativo Negativo

Lactosa positivo positivo positivo positivo

Glucosa positivo positivo positivo Positivo

Gas positivo negativo negativo positivo


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PRUEBA DEL INDOL:

FUNDAMENTO

La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especiesbacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper el indol del

aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de

enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con

frecuencia triptofanasa.

Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la

molcula intermediaria cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la

reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de

la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol,

cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se

requiere al fosfato de piridoxal.

MATERIAL:

4 tubos por alumno de 12 x 75 con medio MIO o SIM.

Cultivo puros de 24 horas de desarrollo

PREPARACION DE MEDIOS MIO Y SIM:

MEDIO MIO:

El Medio MIO es utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en

base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la produccin de

indol. Este medio tambin es conocido como Medio para Movilidad, Indol yOrnitina.
http://es.wikipedia.org/wiki/Bioqu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/Especiehttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Organismohttp://es.wikipedia.org/wiki/Indolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidohttp://es.wikipedia.org/wiki/Tript%C3%B3fanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Desaminaci%C3%B3n&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Aminohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_pir%C3%BAvicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Amon%C3%ADacohttp://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Coenzimahttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fosfato_de_piridoxal&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fosfato_de_piridoxal&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Coenzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADahttp://es.wikipedia.org/wiki/Amon%C3%ADacohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_pir%C3%BAvicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Aminohttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Desaminaci%C3%B3n&action=edit&redlink=1http://es.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://es.wikipedia.org/wiki/Tript%C3%B3fanohttp://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cidohttp://es.wikipedia.org/wiki/Indolhttp://es.wikipedia.org/wiki/Organismohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriahttp://es.wikipedia.org/wiki/Especiehttp://es.wikipedia.org/wiki/Bioqu%C3%ADmica


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Edered y Clark as como Oberhofer y Hajkowsky desarrollaron el Medio

MIO para poder observar las reacciones de movilidad, produccin de indol y

descarboxilacin de la lisina simultneamente. Estas reacciones son

determinantes para la identificacin de enterobacterias.

En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y

nitrgeno. El extracto de levadura provee las vitaminas y cofactores requeridos

para el desarrollo. La dextrosa proporciona la fuente de energa. El agar es

adicionado para demostrar la movilidad. El prpura de bromocresol acta como

indicador de cambios de pH facilitando la deteccin de la descarboxilacin de la

lisina.

PREPARACION DEL MEDIO MIO:

Suspender 31 g del medio en un litro de agua purificada.

Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y

hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y

esterilizar en autoclave a

121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar

enfriar en posicin vertical.

MEDIO SIM:

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de

indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo.

Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Peptona de Gelatina 10.0 L-Ornitina 5.0

Peptona de Casena 10.0 Dextrosa 1.0Extracto de Levadura 3.0 Prpura de

Bromocresol 2.0

Agar Bacteriolgico 2.0pH 6.5 0.2


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El triptfano es un aminocido

constituyente de muchas peptonas, y

particularmente de la triptena, que puede ser

oxidado por algunas bacterias para formar indol.

En el proceso interviene un conjunto de enzimas

llamadas triptofanasa. El indol producido se

combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs

o de Erlich, para originar un compuesto de color

rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en

este medio, por la turbidez que producen

alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras

de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro

de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH

mayor a 7.2.

PREPARACION DEL MEDIO SIM


Triptena 20.0 Suspender 30 g del polvo por litro

de agua destilada. Mezclar hasta

disolver; calentar agitando y hervir

durante un minuto.

Distribuir unos 4 ml en tubos de

hemlisis y esterilizar en autoclave

a 121C durante 15 minutos.

Solidificar en posicin vertical.

Peptona 6.1

Sulfato de hierro y amonio 0.2


Agar 3.5

pH final: 7.3 0.2


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METODOLOGIA DE SIEMBRA (AMBOS MEDIOS POR PICADURA):

1. Identificar los tubos con la cepa correspondiente

2. Inocular tres tubos, cada uno con el microorganismo marcado

3. Incubar los tubos 35 C durante 24 horas.

4. Despus de incubacin, efectuar las observaciones correspondientes y

consultar gua de observacin.

RESULTADOS:

MEDIO SIM

LECTURA CEPA 5 CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8

MOVILIDAD Negativo negativo positivo Negativo

INDOL negativo negativo negativo Negativo

H2S negativo negativo positivo negativo


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MEDIO MIO SE LE AGREGA REACTIVO DE ERLICH PARA PRUEBA DE

INDOL.

LECTURA CEPA 5VO CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8

MOVILIDAD NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO

INDOL NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

ORNITINA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO

PRUEBA LCD (MEDIO LIA):

FUNDAMENTO:

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente

Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la

produccin de cido sulfhdrico.

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura

aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el

hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado

para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y

deaminasa.

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los

indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de


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bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a

5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza

el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de lalisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea

previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son

fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al

amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al

consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.

La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento delmedio debido a la formacin de sulfuro de hierro.

Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella,

desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de

hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

MATERIAL:

4 tubos con agar LIA



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PREPARACIN DEL AGAR LIA


Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio

deshidratado en un litro de agua

destilada. Dejar embeber unos 15

minutos.

Calentar cuidadosamente,agitando con frecuencia y hervir

durante un minuto hasta la

disolucin completa.

Distribuir y esterilizar a 121C

durante 15 minutos. Enfriar en

pico de flauta dejando un fondo

vertical apto para la puncin.

Extracto de levadura 3.0

Glucosa 1.0

Lisina 10.0

Citrato de hierro y amonio 0.5


Prpura de bromocresol 0.02

Agar 15.0

pH final: 6.7 0.2

METODOLOGIA DE LA SIEMBRA

(PICADURA Y ESTRIA):

1. Identificar los tubos con la

cepa correspondiente.

2. Inocular tres tubos, cada uno

con el microorganismo marcado.


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3. Incubar los tubos a 35 C durante 24 horas.

4. Despus de la incubacin, efectuar las observaciones correspondientes

y consultar la gua de observacin.

RESULTADOS:

LECTURA CEPA 5 CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8

LDA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

LDL DUDOSA NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO


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PRUEBA ODC:

FUNDAMENTO:

El Medio MIO es utilizado para la diferenciacin de enterobacterias en

base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la produccin de

indol. Este medio tambin es conocido como Medio para Movilidad, Indol y

Ornitina.

MATERIAL:

4 tubos de 12 x 75 con medio MIO.

Cultivos puros de 24 horas de desarrollo

NOTA:La preparacin del medio MIO se vio previamente.

METODOLOGIA DE LA SIEMBRA (PICADURA):

1. Identificar los tubos con la

sepa correspondiente.

2. Inocular tres tubos, cada

uno con el microorganismo

marcado.

3. Incubar los tubos a 35 C

durante 24 horas.

4. Despus de la incubacin,

efectuar las observaciones correspondientes y consultar la gua de

observacin.


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RESULTADOS:

LECTURA CEPA 5VO CEPA 6 CEPA 3 CEPA 8

MOVILIDAD NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO


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CUADRO REFERENCIAL:

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON EXITO

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