Hoffpauir et al, 2006

1. MSc. Monica Gomes Lima
Doutoranda em Neurocincias e Biologia Celular
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Agosto- 2011

2. Amcrinas:
Retina interna: coneces com bipolares, ganglionares e outras amcrinas influenciam diretamente sobre o sinal de sada da retina;
Funcionamento e regulao de clulas amcrinas crtico para o entendimento do processamentodo sinal pela retina.
3. Introduo
NO a molcula sinalizadora mais difundida encontrada na retina:
Imunomarcao para NOS-1: fortemente marcada em clulas amcrinas (Ding & Weinberg, 2007);
Influncia fisiolgica:NO ativa a guanilato ciclase solvel (GCs) para promover a sntese de GMPc.
4. Introduo
NO e a retina interna:
Reduz o acoplamento, via junes gap, entre AII e bipolares dos cones e dos bastonetes (Mills & Massey; 1995);
NO diminui a funo do receptor GABAA em cultura de amcrinas (Wexler et al., 1998) NO diminui a funo dos receptores GABAA, pois PKG diminui as correntes de GABA;
Funo do NO na retina: ???
Essa inibio dependente da concentrao de NO? Influencia no potencial de reverso do GABA (EGABA)?
5. MATERIAIS E MTODOS
Cultura de Clulas:
Cultura de Retina
6-14 dias (EE 14 PE 1)
Madura aps 6 dias de plaqueadas:
Canais controlados por ligante e por voltagem + sinapses GABAergicas com outras amcrinas.
Embrio de galinha
8 dias
Dissociao: 0,1% tripsina
Tratadas com 0,1mg poly-L-ornithine/ml
Cultivadas em DEMEM + 5% soro bovino fetal,
penicilina,
estreptomicina e
2mM de glutamina
Alimentadas: 2-3 dias Neurobasal Medium
(B-27, penicilina,
estreptomicina e glutamina)
Cultura de Clulas:
Embrio de rato
18 dias
Cultura de hipocampo
Dissociao: 0,1% tripsina
Tratadas com 0,1mg poly-L-ornithine/ml
Cultivadas em DEMEM + 5% soro bovino fetal,
penicilina,
estreptomicina e
2mM de glutamina
Alimentadas: 2-3 dias Neurobasal Medium
(B-27, penicilina,
estreptomicina e glutamina)
4-7 dias
(EE 22 EE 25)
Eletrophysiology:
Amplificador Axopatch 1-D;
Na pipeta de vidro havia 3 M KCl contato com a cultura;
Resistncia da pipeta:
Rompimento: 3-5 - SUCO;
Perfurao: 5-10 anfotericina B ou gramicidina (formam pequenas perfuraes na membrana);
Rompimento x Perfurao -efeitos na mudana de EGABA: P = 0.999;
Os dados do Voltage ramp eram subtrados da corrente de vazamento.
Solues:
Aplicaes de GABA: 10-20 ms (controlado por computador);
Diferenas nas solues internas e externas s clulas:
Ruptura:
Interna: Cs+ + creatina fosfocinase + sal de dipotssio de ATP + sal de disdio de ATP + fosfocreatina + sal dedisdio de GTP;
Externa: TTX (300 nM bloqueia canais de Na+) e LaCl3 (25-50 M bloqueia canais de Ca2+) voltage clamp.
Perfurao: anfotericina B ou gramicidina soluo interna.
SNAP: doador de NO;
NOC-12: doador de NO potente;
NOC-18: doador de NO lentamente;
CARBOXY-PTIO: sal que elimina NO da reao;
ODQem 10 mM de DMSO: inibidor da sGC e compete com NO pelos mesmos stios de ligao;
Furosemida e bumetanidaem 300 mM de DMSO;
NO-bubbled: quantificar NO
Solues com SNAP:
15 min em soluo com argnio > filtrado em soda lime (Hidrxido de sdio, potssio e clcio e gua) > protegida da luz
ISO-NO meter (NOMK2 system) com eletrodo ISO-NOP (World Precision Instrument, Sarasota, FL);
Soluo com 250 M SNAP=~ 100 nM de NO;
Injees 10-50 l promovia mudanas de 15-35 mV duravam de 1-3s com a maior parte do No chegando nos primeiros 500 ms.
Solues de NO expostas ao ar: NO-bubbled exposta ao ar por 10-30 min;
Solues livre de NO eram usadas como controle.
10. RESULTADOS E DISCUSSO
3 efeitos do NO nas correntes ativadas por GABA:
1) Moderadas concentraes de doadores de NO promovem moderados aumentos nas correntes ativadas por GABA;
Aumenta a funo do receptor GABAA maior inibio
No capaz de reverter EGABA
Ruptura da membrana: canais de Na+ (soluo externa) e K+ bloqueados (TEA e Cs+)
2) Em altas concentraes de NO (centenas de nM ou M) produz uma mudana temporria (1-3 s) no EGABA;
Efeito sinrgico NO + GABA
NO +O2= N2O4
(tetrxido de dinitrognio)
N2O4 + gua = cido ntrico
Ruptura da membrana: K+ bloqueados (TEA e Cs+)
3) Altas concentraes de NO alteram a funo dos receptores GABAA:
de inibio para excitao.
Corrente dependente de NO e independente de GABA em altas concentraes de NO
mudana = 24.8 4.2 mV
3) Altas concentraes de NO alteram a funo dos receptores GABAA.
Aumento de EGABA seguido pelo aumento na amplitude da corrente.
3) Altas concentraes de NO alteram a funo dos receptores GABAA:
de inibio para excitao.
GCs no tem atividade relacionada com a mudana EGABA induzida por NO.
NO induz mudanas no EGABA devido elevao do Cl- citoslico
Por que o NO induz mudana na EGABA?
H mudana na seletividade ions pelos receptores GABAA?
nions internos: Cl- e acetato
Troca acetato por metanosulfonato.
NO induz mudanas no EGABA devido elevao do Cl- citoslico
2) H o mesmo efeito na administrao de GABA e Glicina?
Inibitrios;
Ligados Cl-
NO aumenta a funo do receptor de glicina
NO promove uma despolarizao do Vm
A mudana promovida por NO capaz de ser transmitida por sinapses
Sinapses de clulas amcrinas GABArgicas so normalmente inibitrias
Para fora
Para dentro - excitatria
Produz tanto a corrente como a despolarizao
Despolarizao
NKCC no media o aumento no Cl- citoslico
Qual o mecanismo que sustenta o aumento de Cl- citoslico (ECl-)? Qual o papel do NKCC e KCC2 no efeito induzido por NO?
Co-transportadores de Cl-: NKCC (1Na+, 1K+, 2Cl-) e KCC2 (1K+ e 1Cl-) > NKCC KCC2
Perfurao: inibidores do co-transporte bumetanida (NKCC) e furosemida (KCC2)
ECl- mais negativo
Participao de outros ons que possam ser co-transpostados por NKCC e KCC2 e participem da mudana do ECl-
Reverso rpida do controle para 0 K+
A mudana ocorre na mesma magnitude ons no influenciam na mudana.
Participao de outros ons que possam ser co-transpostados por NKCC e KCC2 e participem da mudana do ECl-
Os outros ons no participam da mudana no ECl-
Mudanas no ECl- so independentes do Cl- extracelular
Endossomos: altas concentraes Cl- > matm alta a amplitude da corrente para dentro
Esse Cl- armazenado o responsvel por mudanas nos ECl-?
reduzir concentraes de Cl- externo igualar s concentraes internas
ECl- = 0 mV
NO induz a redistribuio de Cl- na ausncia de gradiente eletroqumico
Correntes de GABA dependem do Cl- externo, mas de NO no.
Mudanas no ECl- so independentes do Cl- extracelular
Em 0 Cl-
A mudana no ECl- resultado da ao do NO
NO promove a liberao de ECl- de uma fonte interna
A fora de que direciona Cl- diminui
Igualou concentraes de Cl- internas s externas
A mudana do ECl- ocorre por um mecanismo exclusivo das clulas amcrinas?
Clulas do hipocampo de rato
0 Cl- externo
0 Cl- externo durante aplicao de NO
Corrente para dentro dependente de NO.
Papel do NO na retina
Outras Amcrinas
Bipolares
GABArgica ou Glicinrgica
Altas concentraes
Consistente com Wang et al. (2003) diminuio da resposta de clulas ganglionares luz se d por por alteraes no sinal de entrada (possivelmente vindos das clulas amcrinas.
26. http://www.slideshare.net/monica_lima/hoffpauir-et-al-2006
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