HOLOTYPE HLA™ 96/7 CONFIGURAÇÃO A E CE C B CE …CE+User+Manuals... · PASSO 3 –...

0086PreparaADNparaanálisede

sequenciaçãonoIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™96/7CONFIGURAÇÃOAECEECONFIGURAÇÃOBECE(REF:H32EREF:H34)INSTRUÇÕESDEUTILIZAÇÃO

VERSÃO1002-05-2018

OmixonBiocomputingLimited

OmixonHolotype96/7CONFIGURAÇÃO|ConfiguraçãoAeCEeConfiguraçãoBeCE|Instruçõesdeutilização,v10.ParautilizaçãoemdiagnósticoinvitroCopyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Confidencialepatenteado

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ÍndiceINFORMAÇÕESDOFABRICANTE...........................................................................................................................8

LEGENDADOSSÍMBOLOS.....................................................................................................................................8

CONTEÚDODOKITHOLOTYPEHLA-96/7CONFIGURAÇÃOAECE(REF:H32)OUCONFIGURAÇÃOBECE(REF:H34)9

CAIXADECOMPONENTEINICIADOR..................................................................................................................................9CAIXADECOMPONENTEDEREAGENTESDEPREPARAÇÃODEBIBLIOTECA..................................................................................9PLACAADAPTADORADE96POÇOS...................................................................................................................................9LIVRODOEXCEL.........................................................................................................................................................10SOFTWARE–OMIXONHLATWIN.................................................................................................................................10

EXPEDIÇÃOEARMAZENAMENTO.......................................................................................................................10

AVISOSEPRECAUÇÕES.......................................................................................................................................10

LIMITAÇÕESCONHECIDASDOPRODUTO..........................................................................................................................11

INFORMAÇÕESDESEGURANÇA..........................................................................................................................11

PARÂMETROSDEDESEMPENHO........................................................................................................................12

ASSISTÊNCIATÉCNICA........................................................................................................................................12

Suporteportelefone:.......................................................................................................................................12

EQUIPAMENTO,REAGENTESECONSUMÍVEIS.....................................................................................................13

RECOMENDAÇÕESTÉCNICASESOBREOEQUIPAMENTO......................................................................................................13RECOMENDAÇÕESRELATIVASAREAGENTESASSOCIADOS....................................................................................................13

CapacidadedokitdereagenteMiSeq..............................................................................................................14CONSUMÍVEISRECOMENDADOS.....................................................................................................................................14

AVISOLEGAL......................................................................................................................................................15

UTILIZAÇÃOPREVISTA........................................................................................................................................15

NOTAIMPORTANTEANTESDECOMEÇAR..........................................................................................................16

ISOLAMENTODEADNGENÓMICORECOMENDADO...........................................................................................................16

PRINCÍPIODOMÉTODO.....................................................................................................................................17

RESUMODEPASSOS...........................................................................................................................................18

GLOSSÁRIO/DEFINIÇÕES....................................................................................................................................19

PASSO1–PREPARAÇÃODAMISTURAPRINCIPALDEAMPLIFICAÇÃODEHLA....................................................20

LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................20PROTOCOLO..............................................................................................................................................................20

Misturaprincipal:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1........................................................................................21Misturaprincipal:HLA-DQB1Conjunto3.........................................................................................................21

PASSO2–AMPLIFICAÇÃOHLACLASSESIEII......................................................................................................22


MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1........................................23MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-DQB1Conjunto3.........................................................23AmplificaçãoclasseI(HLA-A,BeC).................................................................................................................23AmplificaçãoclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1eDQB1).................................................................................24


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Tamanhosprevistosdeamplicon.....................................................................................................................24

PASSO3–QUANTIFICAÇÃOENORMALIZAÇÃODEAMPLICON(UTILIZANDOUMFLUORÓMETRODEPLACAS)...25


Agrupamentodeamplicon...............................................................................................................................27PurificaçãoPCRdeExoSAP-iTExpress..............................................................................................................27

PASSO4–PREPARAÇÃODABIBLIOTECA............................................................................................................28


Misturaprincipaldefragmentação.................................................................................................................29Programadefragmentação.............................................................................................................................29Misturaprincipaldereparaçãofinal................................................................................................................30Programadereparaçãofinal...........................................................................................................................30Misturaprincipaldeligação.............................................................................................................................31Programadeligação........................................................................................................................................31Purificaçãodebibliotecaeagrupamento........................................................................................................32

PASSO5–SELEÇÃODOTAMANHODABIBLIOTECA............................................................................................34


PASSO6–QUANTIFICAÇÃODEBIBLIOTECAATRAVÉSDEUMINSTRUMENTOQPCR...........................................35


MisturadeiniciadorqPCR................................................................................................................................35MisturaprincipalqPCR.....................................................................................................................................36

PASSO7–SEQUENCIAÇÃONOILLUMINAMISEQ...............................................................................................38

LISTADEREAGENTES...................................................................................................................................................38CapacidadedokitdereagenteMiSeq..............................................................................................................38

PROTOCOLO..............................................................................................................................................................38

PASSO8–ANÁLISEDEDADOSDESEQUENCIAÇÃOHLA......................................................................................40

PROTOCOLOAUTOMATIZADO........................................................................................................................................40InstalaçãoeconfiguraçãodeTI.......................................................................................................................40Protocoloporanálise.......................................................................................................................................40

PROTOCOLODESERVIDORMANUAL................................................................................................................................40InstalaçãoeconfiguraçãodeTI.......................................................................................................................40Protocoloporanálise.......................................................................................................................................40

PROTOCOLODEAMBIENTEDETRABALHOMANUAL............................................................................................................41InstalaçãoeconfiguraçãodeTI.......................................................................................................................41Protocoloporanálise.......................................................................................................................................41

VALORESCOMPLEMENTARES.............................................................................................................................42

EXEMPLODEPLACAPARAPLACADEAMPLICON,PLACADEAMPLIFICAÇÃO,PLACADEDILUIÇÃO,PLACADEQUANTIFICAÇÃODEAMPLICON(PARAUMLÓCUSINDIVIDUAL)EPLACADEREAÇÃO............................................................................................................42EXEMPLODEPLACADEQUANTIFICAÇÃODEPADRÕES.........................................................................................................42EXEMPLODEPLACAQPCRDEQUANTIFICAÇÃODEBIBLIOTECAKAPA...................................................................................43

ANEXO1:PIPPINPREP........................................................................................................................................44

PROGRAMAROPIPPINPREP.........................................................................................................................................44


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EXECUTAROPIPPINPREP.............................................................................................................................................44

ANEXO2:QUANTIFICAÇÃODEAMPLICONUTILIZANDOUMINSTRUMENTOQPCR.............................................47


ANEXO3:QUANTIFICAÇÃODEBIBLIOTECA,UTILIZANDOUMCORANTEFLUORESCENTEDSADNINTERCALAR....49



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Históricododocumento–Notaseatualizaçõesimportantes

Versão Data Autor Resumodealterações Autorizadopor

Datadeemissão

V1 05-12-2015 Robert

PollockProjetodaprimeiraversão Gergely

Tölgyesi05-12-2015

V2 18-01-2016 RobertPollock

Segundoprojeto,pequenascorreções GergelyTölgyesi

18-01-2016


Terceiroprojeto,atualizaçãodaexplicaçãodossímbolos,atualizaçãodarecomendaçãodociclodecongelamento/descongelamento,atualizaçãodautilizaçãoprevista

GergelyTölgyesi

10-02-2016


Quartoprojeto,atualizaçõesdasecçãodeinformaçõesdesegurança

GergelyTölgyesi

26-02-2016


Quintaversão,recomendaçãoalternativaparaquantificaçãodeamplicon

EfiMelista 05-04-2016

V6 09-04-2016 EfiMelista

Pequenaalteraçãonaredaçãode«enzimaLR-PCR»para«Taqpolimerase»,combaseemalteraçãodadocumentaçãodaQiagen

GergelyTölgyesi

09-04-2016

V7 23-04-2016 EfiMelista

AtualizaçãodedeclaraçãoDQB1conjunto1econjunto2

GergelyTölgyesi

23-04-2016

V8 30-05-2016 GergelyTölgyesi

Atualizaçãodasmétricasdedesempenho,Atualizaçãodosvolumesdereagentesdepreparaçãodebiblioteca,AtualizaçãodasconfiguraçõesdeprodutoparaplacasadaptadorasindexadasA2/A3/A4


V9 21-08-2017 GergelyTölgyesi

Configuraçãodeplacaadaptadoraindexada96/7ConfiguraçãoBadicionada



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V10 14-12-2017 TündeVágó

Remoçãode«DQB»dosintensificadoresDQB,verificaçãodegelapósLR-PCRtornadaopcional,simplificaçãodaquantificaçãodeamplicon,alteraçãodovolumeporamostraemkitsde11lócus,substituiçãoExoSAP-ITporExoSAP-ITExpress,utilizaçãodeQubitparaquantificaçãodebiblioteca,misturadeiniciadoresDQB1conjunto1econjunto2substituídaporDQB1conjunto3,reduçãodotempodereaçãodereparaçãofinal,atualizaçãodométododequantificaçãodebibliotecadereduçãodotempodereaçãodeligação,fichadeamostrasremovidadosAnexos

EfiMelista 02/05/2018


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Isençãoderesponsabilidade

AOmixonenvidoutodososesforçosparagarantirqueestasInstruçõesdeutilização(IFU)sejamexatas.AOmixonnãoseresponsabilizaporquaisquerimprecisõesouomissõesquepossamterocorrido.Asinformaçõescontidasnestasinstruçõesdeutilizaçãoestãosujeitasaalterações,semavisoprévio.AOmixonnãoassumenenhumaresponsabilidadeporquaisquerimprecisõesquepossamexistirnestasinstruçõesdeutilização.

A Omixon reserva-se o direito de efetuarmelhorias nestas instruções de utilização e/ou aosprodutosnelasdescritos,aqualquermomento,semavisoprévio.

Casoencontreinformaçõesincorretas,inexatasouincompletasnestemanual,agradecemosquenosenvieosseuscomentáriosesugestõesparaoendereço:[email protected].


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InformaçõesdofabricanteNomedaempresa:OmixonBiocomputingLtd

Endereçoparavisitantes:Fehérváriút50-52/6

Cidade:Budapeste

Códigopostal:H-1117

País:Hungria

Legendadossímbolos

LOTE/númerodecarregamento

Referência/númerodecatálogo

Consultarasinstruçõesdeutilização

ContémreagenteparanúmeroNdeteste

Fabricantelegal.Adataassociadaaestesímbolorefere-seàdatadefabrico

Temperaturadearmazenamentorecomendada

Datadevalidade

Dispositivomédicodediagnósticoinvitro

ContémcomponentedesubstituiçãoComponentedesubstituição


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ConteúdodokitHolotypeHLA-96/7ConfiguraçãoAeCE(REF:H32)ouConfiguraçãoBeCE(REF:H34)

CaixadecomponenteiniciadorO componente iniciador fornece soluções de iniciador específicas, prontas a utilizar, paraamplificaçãoPCRdelongoalcancedirecionadadegenesHLAA,B,C,DPB1,DQA1eDQB1,eDRB1.Adicionalmente,tambémcontémdoistiposdeaditivosPCR(Intensificador1eIntensificador2).

Misturadeiniciador REF# Rxns Vol/tubo #Tubos CódigodecorHLA-A P012 96 220µl 1 AmareloHLA-B P022 96 220µl 1 VermelhoHLA-C P032 96 220µl 1 CordelaranjaHLA-DRB1 P042 96 220µl 1 VerdeHLA-DQB1(Conjunto3) P122 96 220µl 1 AzulHLA-DQA1 P072 96 220µl 1 CastanhoHLA-DPB1 P082 96 220µl 1 RoxoIntensificador1 E01 96 1100µl 1 TransparenteIntensificador2 E02 96 300µl 1 Transparente

CaixadecomponentedereagentesdepreparaçãodebibliotecaA caixa de componente de preparação de biblioteca fornece reagentes para a preparação dabiblioteca (fragmentação, extremidade romba e adenilato das extremidades dos amplicons,ligando-lhessequênciasadaptadorasindexadas)dosampliconsHLA.

Reagente REF# Rxns Vol/tubo #Tubos CódigodecorEnzimadefragmentação(A) R11 96 278µl 1 AmareloTampãodefragmentação(B) R21 96 278µl 1 VermelhoEnzimadereparaçãodeextremidade(C) R31 96 162µl 1 VerdeTampãodereparaçãodeextremidade(D) R41 96 324µl 1 CordelaranjaEnzimadeligação(E) R51 96 324µl 1 AzulTampãodeligação(F) R61 96 1800µl 2 Preto

Placaadaptadorade96poçosOcomponentedeplacaadaptadoraindexadade96poçoscontémadaptadoresNGSindexados(oligonucleótidos de ADN de cadeia dupla) em solução de 5 µl, prontos a utilizar, para gerarbibliotecas de NGS individuais. A placa adaptadora indexada de 96 poços contém um tiposuficiente de adaptadores indexados para geração de 96 bibliotecas NGS individuais e paraidentificaçãodeamostrasajusante.


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Versãodokit Reagente REF# Rxns Vol/poço #PlacasH32 PlacaadaptadoraA(i1-96) N1 96 5µl 1H34 PlacaadaptadoraB(i97-192) N2 96 5µl 1

LivrodoExcelÉfornecidoumlivrodoExcelparaapoiodoprotocoloHolotypeHLA96/7comcálculos,esquemasdeplacas,manutençãoderegistos,geraçãodefichadeamostrasMiSeqemuitomais.Casonãopossuaumacópia,[email protected].

Software–OmixonHLATwinContacte [email protected] para obtenção de créditos Omixon HLA Twin associados à suacompradokitHolotypeHLA96/7.

Notaimportante:UtilizarostrêscomponentesdokitOmixonHolotypeHLA96/7eosoftwareOmixonHLATwinnomesmofluxodetrabalhoparaconstituirumfluxodetrabalhoparautilizaçãoemdiagnósticoinvitro.ConsulteasecçãodeAvisoseprecauçõesparalimitaçõesdeutilizaçãodoproduto.

Os componentes de substituição encontram-se disponíveis mediante pedido específico doutilizador. Tenha em atenção que a Omixon substitui caixas de componentes e não [email protected]ções.

ExpediçãoearmazenamentoEnviadoempacotesdegelo secona caixade transportedepoliestirenoextrudidoedeve serarmazenadoa-20°Capóschegaraodestino.Valideoseucontrolodetemperaturaeprocessodemonitorizaçãodosseuscongeladores,procedendoregularmenteàmanutençãonecessária.

Oskitsnãoabertosmantêm-seestáveisatéàdatadevalidadedokit(indicadanaetiquetadokit),searmazenadosa-20°C.

Apósaaberturadoproduto,recomenda-seummáximodequatro(4)ciclosdecongelamento/descongelamento,paragarantiraestabilidadedoproduto.Oskitsabertosmantêm-seestáveisaté3meses,quandoarmazenadosa-20°C.

AvisoseprecauçõesLimitaçõesdeutilizaçãodoprodutoPara obter o melhor desempenho, utilize o fluxo de trabalho do kit Holotype HLA 96/7e o software Omixon HLA Twin para a tipificação HLA por NGS com os materiais, reagenteseequipamentosrecomendadosnasecção«Equipamentosereagentes».


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A utilizaçãodemateriais diferentes dos especificados na secção «Equipamentos e reagentes»deveserconfirmadaevalidadapeloutilizador.

Nãoreconstituirnemdiluirosreagentesemvolumesdiferentesdosdescritosnestasinstruçõesdeutilização.Nãoutilizarumvolumedosreagentesinferioraoespecificadonestasinstruçõesdeutilização.Estasaçõespodemprovocarerrosdedesempenho.

A Omixon não pode fornecer suporte técnico para nenhuns problemas resultantes do nãocumprimentodospassosdoprotocolodescritosnestasinstruçõesdeutilização.

Nãoutilizaroprodutoemcasodedanosdetetáveisnoscomponentes(frascosquebrados,placa,tampassoltas,etc.).

LimitaçõesconhecidasdoprodutoConsultar o documento Product Known Limitations Guide (Guia de limitações conhecidas doproduto), relativamente a ambiguidades conhecidas e limitações de software conhecidas doprodutoHolotypeHLA.OGuiaédistribuídocomasinstruçõesdeutilização,mastambémpodeser encontrado no Web site da Omixon em MyHolotype/Support and Services/HLA TwinInstructionsforUse,[email protected].

InformaçõesdesegurançaAntesdecomeçar,leiaassecções«Informaçõesdesegurança»e«Notasimportantes»relativasatodososreagentesoukitsespecificadosnasecção«Equipamento,reagenteseconsumíveis».

Ao trabalhar com produtos químicos, usar sempre bata de laboratório adequada, luvasdescartáveiseóculosdeproteção.Paraobtermaisinformações,consulteasFichasdedadosdesegurança(FDS)adequadas,disponíveisnofornecedordoprodutorespetivo.

Podeencontrar-seumadescriçãogeraldoscomponentesquímicosdosreagentesdoprodutonasFDSdokitHolotypeHLA96/7,estandodisponíveismediantepedido.

Eliminaroscomponentesdoprodutocomolixomédicogeral.


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ParâmetrosdedesempenhoParâmetros de desempenho principais, determinados em conformidade com a validação doproduto.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensibilidade 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Especificidade 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Precisão 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Exatidão 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Reprodutibilidade 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Repetibilidade 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

AssistênciatécnicaParaobterassistênciageralrelativaaesteprotocolo,[email protected]

Suporteportelefone:EstadosUnidos|+1(617)500-0790Europa|+36705748001Restodomundo|+1(617)500-0790


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Equipamento,reagenteseconsumíveisRecomendaçõestécnicasesobreoequipamento

§ Termocicladorcomformatode96poços§ Fluorómetrodeplacas (ouqualquer instrumentocapazdedeteçãode fluorescênciaem

formatodeplacade96poços,parautilizaçãocomosistemaQuantiFluordsADNdaPromega)§ PippinPrep(n.ºcat.PIP0001)ouBluePippin(n.ºcat.BLU0001)daSAGEScience§ InstrumentoqPCRcomformatodeplacade96ou384poços§ FluorómetroQubit(n.ºcat.Q33216,ThermoFisherScientific)(opcional)§ IlluminaMiSeq(n.ºcat.SY-410-1003)§ Computadorde64bits,nomínimo,4coreecom16GBdeRAM§ Armazenamentodedadosalongoprazo(aproximadamente2TBdedadosporMiSeqporano)

Recomendaçõesrelativasareagentesassociados§ KitsLongRangePCRdaQiagen(n.ºcat.206401,206402ou206403)

§ Cadaamostranecessitade3,2µldeTaqpolimerase§ N.ºcat.206401KitLongRangePCR(20)contém8µldeTaqpolimerase§ N.ºcat.206402KitLongRangePCR(100)contém40µldeTaqpolimerase§ N.ºcat.206403KitLongRangePCR(250)contém100µldeTaqpolimerase

§ ExoSAP-ITdaAffymetrix(n.ºcat.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLou75001-10ML)§ Cadaamostracompostanecessitade4µldeenzimaExoSAP-IT§ N.ºcat.75001-200contém200µldeenzimaExoSAP-ITExpress§ N.ºcat.75001-1-MLcontém1mldeenzimaExoSAP-ITExpress§ N.ºcat.75001-4X-1MLcontém4mldeenzimaExoSAP-ITExpress§ N.ºcat.75001-10MLcontém10mldeenzimaExoSAP-ITExpress

§ Kitdequantificaçãodebiblioteca–Illumina/UniversaldaKAPABiosystems(n.ºcat.KK4824)§ KitdeexameQubitdsADNBR(n.ºcat.Q32850ouQ32853)(opcional)

§ N.ºcat.Q32850contém100exames§ N.ºcat.Q32853contém500exames

§ SistemaQuantiFluordsADNdaPromega(n.cat.E2670)§ GrânulosAgencourtAMPureXPdaBeckmanCoulter(n.ºcat.A63880,A63881ouA63882)

§ Cada execução do Holotype HLA necessita de ummáximo de 900 µl de grânulosAMpureXP

§ N.ºcat.A63880contém5mldegrânulosAMPureXP§ N.ºcat.A63881contém60mldegrânulosAMPureXP§ N.ºcat.A63882contém450mldegrânulosAMPureXP

§ Cassetedegel,1,5%deagarose,semcorantescompadrãointerno(marcadorK/R2),paraoPippinPrep/BluePippin(n.ºcat.CDF1510paraPippinPrepeBDF1510paraBluePippin)

§ Etanoldegraumolecular(álcoolanidro)§ Águadegraumolecular(semDNasenemRNase)§ Hidróxidodesódio§ 1×tampãoTE(pH8,0)§ KitdereagenteMiSeqdaIllumina


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CapacidadedokitdereagenteMiSeq

KitdereagenteIlluminaMiSeq

PeríododetempoHoras

Amostras96/7

Ciclo500Std(MS-102-2003)

~39 96


~24 96

Microciclo300(MS-103-1002)

~19 28

Nanociclo500(MS-103-1003)

~28 12


~17 6

Consumíveisrecomendados§ Tubosdemicrocentrifugação1,5ml§ Tubosdemicrocentrifugação1,5mldebaixaligação§ Tubosdemicrocentrifugação2,0mldebaixaligação(recomendadoEppendorfDNALoBind

n.ºcat.022431048)§ Tubosdeparede finade0,5mlpara instrumentoQubit (recomendado tubosdeexame

Qubitn.ºcat.Q32856)§ Pipetasdevolumeajustável(capacidadede1,0–1000µl)§ Pipetasdevolumeajustávelde8canais(capacidadede1,0–100µl)§ Placasde96poçoscompatíveiscomotermociclador§ Placasóticasde96poçoscompatíveiscomofluorómetrodeplacas§ Placasde96poçoscompatíveiscomoinstrumentoqPCR§ Vedantesdeplacaparautilizaçãogeral§ Vedantes de placas compatíveis com os termocicladores (testados para PCR de longo

alcance)§ VedantesdeplacasóticascompatíveiscomoinstrumentoqPCR(opcional)§ Suportemagnéticocompatívelcomtubosdemicrocentrifugaçãode2ml§ Suporterefrigeradorde96poços(2peças)§ Tuboscónicosde50ml§ Reservatóriosde50ml


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AvisoLegalAs instruções de utilização do Holotype HLA 96/7 e todos os conteúdos são propriedade daOmixonBiocomputingLimited(“Omixon”),edestinam-seexclusivamenteàutilizaçãocontratualpelorespetivocliente,relativamenteao(s)produto(s)descrito(s)eparanenhumoutrofim.Estedocumento e o respetivo conteúdonãodevem ser utilizados nemdistribuídos para qualqueroutra finalidade e/ou comunicados, divulgados ou reproduzidos de qualquer forma, semconsentimentoprévioporescritodaOmixon.AOmixonnãoconcedenenhumalicençasobosseusdireitosdepatentes,marcascomerciais,direitosdeautoroudireitoscomuns,nemdireitossemelhantesdequaisquerterceirosatravésdestedocumento.

OOmixonHLATwin(“software”)élicenciadoparaoclientesobostermosecondiçõesdoEULAdoOmixonHLATwin(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Casonãoconcordecomosrespetivostermosecondições,aOmixonnãolicenciaoSoftwareparasi,nãodevendooutilizadorusarneminstalaroSoftware.

As instruções incluídas neste documento devem ser rigorosa e explicitamente seguidas porpessoalqualificadoedevidamenteformado,afimdeassegurarautilizaçãocorretaesegurado(s)produto(s)aquidescrito(s).Antesdeutilizartaisprodutos,todooconteúdodestedocumentodeveserlidoecompreendidointegralmente.

A FALHA NA LEITURA COMPLETA E NO SEGUIMENTO EXPLÍCITO DE TODAS AS INSTRUÇÕESINCLUÍDAS NESTE DOCUMENTO PODE RESULTAR EM DANOS PARA O(S) PRODUTO(S),FERIMENTOSPARAPESSOAS, INCLUINDOPARAOSUTILIZADORESOUTERCEIROS,BEMCOMODANOSAPROPRIEDADESDETERCEIROS.

A OMIXON NÃO ASSUME QUALQUER RESPONSABILIDADE DECORRENTE DE UTILIZAÇÃOINADEQUADA DO(S) PRODUTO(S) DESCRITO(S) (INCLUINDO PEÇAS OU SOFTWARE) OUQUALQUERUTILIZAÇÃODESTE(S)PRODUTO(S)FORADOÂMBITODASLICENÇASOUPERMISSÕESEXPRESSAS POR ESCRITO CONCEDIDAS PELA OMIXON, ASSOCIADAS À AQUISIÇÃO DESTE(S)PRODUTO(S)PELOCLIENTE.

PARAUTILIZAÇÃOEMDIAGNÓSTICOINVITRO©2017OmixonBiocomputingLtd.Todososdireitosreservados.

UtilizaçãoprevistaO produto Holotype HLA 96/7 – Configuração A e CE e Configuração B e CE (designado por«HolotypeHLA»)éumacombinaçãodereagentesdeexamedediagnósticoinvitrocomsoftwaredeanálisededados(OmixonHLATwin™),concebidoparaaidentificaçãoedefiniçãodeantígenosleucocitárioshumanos(HLA)declasseIeII,destinando-seautilizaçãonatipificaçãoHLA,atravésdautilizaçãodaplataformadadosdesequenciaçãodenovageraçãoIllumina®MiSeq.OHolotypeHLA disponibiliza informação de histocompatibilidade humana de loci HLA Classe I (A, B e C)eClasseII(DPB1,DQA1,DQB1eDRB1),atravésdeADNgenómicohumano.


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OsoftwareOmixonHLATwin™incluídonoprodutoHolotypeHLAestáconcebidoparainterpretarefazercorresponderdadosdesequenciaçãogeradosnosistemaIllumina®MiSeq,resultandoemtipificaçãoHLAdeníveldealelodepassagemúnica,dealtaprecisão,comtaxadeambiguidademuitobaixanoníveldecampo2.

O produto Holotype HLA está concebido para utilização em diagnóstico in vitro por pessoalprofissional de cuidados de saúde como, por exemplo, laboratórios técnicos e médicos, quetenhamtidoformaçãoemtipificaçãoHLAemlaboratóriosdediagnósticocomacreditaçãoEFIouASHIoulaboratórioscomcompetênciaparatrabalharemconformidadecomasespecificaçõesEFIouASHI.

Notaimportanteantesdecomeçar

IsolamentodeADNgenómicorecomendadoOADNgenómicohumanodeveserpreparadoemkitsdepreparaçãodeADNcomercialmentedisponíveisebemtestados,paragarantiraconsistênciadapreparação.Independentementedaabordagem,énecessáriaadeterminaçãoexatadeconcentraçãoepurezaparaumdesempenhorobustodoexame.

OADNdeveestarisentodecontaminantesquepossamafetarpassosposterioresdeamplificação,preparação da biblioteca e sequenciação (por exemplo, álcool, sais, detergentes, formaldeídoeheparina).Osanguenãodevesercolhidoemtubosheparinizados,nãodevendoserutilizadasamostrasdesanguedepacientessubmetidosaterapiacomheparina,nemamostraslipémicasouhemolisadas.

OADNgenómicopreparadopodeserutilizadodeimediatosepreparadoemáguasemnuclease,ouarmazenadoduranteperíodoslongosa-20°Coumenos.RecomendamosautilizaçãodeáguaparapreparaçãodegADN,poisoEDTAnotampãoTEpodeinibirreaçõesdePCRdelongoalcance.Deveserevitadoodescongelamentorepetidodecongelados,parareduziradegradação.

Éaltamenterecomendadaumaconcentraçãode20-30ng/µldeADNparafornecer100-150ngdeentradadeADNgenómicoporamplificaçãoPCR.ÉextremamenterecomendávelutilizarummétododequantificaçãobaseadoemfluorescênciaparadeterminaraconcentraçãodegADN.

Arelaçãodeabsorvênciade260nm/280nme260nm/230nmvaloresde1,7–2éaltamenterecomendada.

ParaaamplificaçãodeHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1eHLA-DQB1,sãonecessários0,8-1,2µgdegADN.


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PrincípiodométodoDurantemuitosanos,acomunidadeHLAtemtrabalhadoparaaobtençãodeummétodoqueidentificará com precisão o extenso polimorfismo dos genes HLA e dos respetivos produtosgénicos.OadventodoPCR,combinadocomoutrastecnologias(sequenciaçãoSanger,SSOP,SSP,Luminex),forneceuumafórmulaparamelhorarsignificativamenteadeteçãodepolimorfismosHLA,porémcomvárias limitaçõesquecontinuama inibirnossacapacidadedecaracterizarosgenes HLA, de forma abrangente. As tecnologias desenvolvidas ao longo dos últimos anos,cumulativamentedesignadaspordadosdesequenciaçãodenovageração(NGS,NextGenerationSequencing),proporcionaramnovasoportunidadesquepermitemacompletacaracterizaçãodosgenes HLA demaneira haplóide. ANGS possui duas características distintas: 1) sequenciaçãoclonal de fragmentos de ADN e 2) capacidade de produção tremendamente alta. A NGSproporciona a capacidade de fasear polimorfismos, eliminando assim todas as ambiguidades,efornecetipificaçãoHLAnoníveldecampodetrêsaquatro,semtestesreflexivos,introduzindoassimumasoluçãopotencialmentecompletaparaoproblemadetipificaçãoHLA.OprotocoloaquidescritotirapartidodestatecnologiaecombinaaamplificaçãoporPCRdelongoalcancedosgenesHLAcomasequenciaçãonaplataformaIlluminaMiSeq.Maisespecificamente,osgenesHLAA,B,C,DQA1eDQB1sãoamplificadosemtodooseucomprimentodecodificação,incluindoelementosdasregiões5é3ńãoconvertidas,enquantoDRB1éamplificadodointrão1aointrão4eDPB1éamplificadoapartirdo intrão1paraaregião3ńãoconvertida.Osampliconssãoentãoprocessadosatravésdeumasériedepassosque:

1. Fragmentam os amplicons para um tamanho adequado para sequenciação na plataformaIllumina,

2. Fazem uso de extremidades planas e com adenilato na extremidades dos ampliconsfragmentados

3. Sequências adaptadoras de ligação que são utilizadas em todo o processo noMiSeq paracaptar,amplificaresequenciaroADN.Osadaptadorestambémincluemumíndicequeéumasequência curta, exclusiva para cada adaptador, que identifica as origens da biblioteca(amostra/lócus).

Depois de agrupar as bibliotecas indexadas, selecionar o tamanho e quantificação, a amostraécarregadanoMiSeqparasequenciação.Oprocessocompletodemora3a5dias,dependendoda seleção da célula de fluxo na plataforma Illumina. O resumo dos passos do protocoloéapresentadonafiguraabaixo:


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Resumodepassos


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Glossário/Definições§ Placaamplicon–nomealternativoparaplacadeamplificação§ Placadequantificaçãodeamplicon–placade96poçoscompatívelcomofluorómetrode

placas,noqualosampliconsdiluídossãoquantificados§ Placadeamplificação–placade96poçosPCRutilizadaparaamplificaroslociHLA§ Bibliotecafinal–bibliotecaqueincluitodasasbibliotecasdeamostrasprontasparaserem

sequenciadasnumaexecuçãoúnicadeMiSeq§ Placa de reação – placa onde são realizadas as reações sequenciais que fragmentam,

terminamareparaçãoeligamosadaptadoresindexadosàsbibliotecasdeamostras§ Placa de reagente – placa utilizada para alíquotas de vários reagentes, utilizados para

preparaçãodasbibliotecas§ Bibliotecadeamostras–umabibliotecapreparadaparacombinar(agrupar)todososloci

HLAparaumadeterminadaamostra§ Placadeampliconsagrupados–placaqueincluiumabibliotecadeamostras(todososloci

combinados)porpoço§ Placadequantificaçãodepadrões–placade96poçoscompatívelcomofluorómetrode

placas,noqualospadrõesdeADNsãocolocadosparapermitiraquantificaçãodeamplicon


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Passo1–PreparaçãodamisturaprincipaldeamplificaçãodeHLADuração:~1hora45minutosO objetivo deste passo é preparar asmisturas principais específicas de lócus para amplificarindividualmentecadalócusHLAdeterminado.OslociamplificadoporesteprotocolosãoHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DPB1,HLA-DQA1eHLA-DQB1.

Nota:Asmisturasprincipaispreparadasnestepassoincluemtodososreagentesnecessáriosparaamplificação,excetoaTaqpolimerase.

ListadereagentesItem Armazenamento Fornecidopor

MisturadeiniciadorHLA-A -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-B -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-C -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DRB1 -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DPB1 -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DQA1 -20°C OmixonMisturadeiniciadorHLA-DQB1(Conjunto3) -20°C OmixonIntensificador1 -20°C OmixonIntensificador2 -20°C OmixonTampãoLongRangePCR(10×) -20°C QiagendNTPs(10mMcada) -20°C QiagenGraumolecularH2O -20°C Qiagen

Protocolo1.1 –Removertodasasmisturasdeiniciadores,Intensificador1e2,osdNTPeotampãoPCR

delongoalcance(10×)doarmazenamentoedescongelaràtemperaturaambiente.

1.2 – Preparar o intensificador combinado: adicionar 132µl de Intensificador 2 no tubodoIntensificador1.MudaronomedaetiquetadotubodoIntensificador1paraIntensificadorcombinado.

1.3 –Prepararumamisturaprincipalparacadamisturadeiniciador,deacordocomastabelasabaixo:


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Misturaprincipal:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1

Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócusMisturadeiniciador 2µl 204µlTampãoLongRangePCR(10×) 2,5µl 255µlMisturadNTP(10mMcada) 1,25µl 127,5µlGraumolecularH2O 13,85µl 1412,7µlVolumetotal 19,6µl 1999,2µl

Misturaprincipal:HLA-DQB1Conjunto3

Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócusMisturadeiniciador 2µl 204µlTampãoLongRangePCR(10×) 2,5µl 255µlMisturadNTP(10mMcada) 1,25µl 127,5µlIntensificadorcombinado 5,6µl 571,2µlGraumolecularH2O 7,85µl 800,7µlVolumetotal 19,2µl 1958,4µl

1.1 – Agitar e centrifugar cada mistura principal durante 1 segundo. Colocar as misturasprincipaisemgelo.

1.2 –DiluirtodoogADNnumaconcentraçãode30ng/µl(ovolumemínimoé45µl).

Nota:OHolotypeHLAincluireagentessuficientespara96reaçõesmaisvolumeadicionalparaperdadepipetagemefalhanaamplificação.


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Passo2–AmplificaçãoHLAClassesIeIIDuração:~7horas50minutosOobjetivodopasso2éamplificaros lociHLA.AsamplificaçõesHLAclasse Ieclasse II foramotimizadas,utilizandodoisconjuntosseparadosdecondiçõesPCR.ApósasreaçõesPCRestaremconcluídas,aamplificaçãoéconfirmadaporeletroforeseemgeldeagarose(opcional).

Sugestão breve – A eletroforese em gel de agarose (passo 2.5), emborarecomendada,nãoénecessáriaparaconcluircomêxitooprotocoloHolotypeHLA.Quandoosampliconssãoquantificados(Passo3),qualquerconcentraçãoacimade50ng/µléconsideradaumaamplificaçãobem-sucedida.Aeletroforeseemgelde agaroseéumpassode controlodequalidade importante, nãodevendo serignoradasemexperiênciasuficientecomoprotocoloHolotypeHLAcompleto.


MisturaprincipalHLA-A -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-B -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-C -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DRB1 -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DPB1 -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DQA1 -20°C Passo1MisturaprincipalHLA-DQB1(Conjunto3) -20°C Passo1Taqpolimerase -20°C QiagengADN 4°C UtilizadorGraumolecularH2O 20°C Utilizador

Protocolo2.1 –RemoveraTaqpolimerasedoarmazenamento,centrifugá-laeadicioná-laacadamistura

principal, de acordo com as tabelas abaixo, enxaguando as pontas das pipetasexaustivamentenapipetagem:


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MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1

Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócusMisturaprincipaldopasso1 19,6µl 1999,2µlTaqpolimerase 0,4µl 40,8µlTotal 20µl 2040µl

MisturaprincipalcarregadadeTaqpolimerase:HLA-DQB1Conjunto3Reagente Volume/amostra/lócus Volume/96amostras/lócus

Misturaprincipaldopasso1 19,2µl 1958,4µlTaqpolimerase 0,8µl 81,6µlTotal 20µl 2040µl

2.2 – Agitar e centrifugar brevemente todas as misturas principais carregadas com Taqpolimerase.Alíquotade20µldecadamisturaprincipalcarregadacomTaqpolimeraseempoçosseparadosdeplacasde96poçosPCR.

Nota: As amplificações de classe I e classe II foram otimizadas utilizando duascondiçõesPCRdiferentes,por issoasmisturasprincipais classe Ieclasse IInãodevemestarnamesmaplaca.

2.3 –Adicionar5µldecadagADNdiluídonopoçoadequadodasplacaspreparadasnopassoanterior.Misturarporpipetagem.Vedá-loscomvedaçãotérmicaeinspecionarvisualmentecadapoço.Centrifugartodasasplacasdeamplificaçãonumacentrifugadora.

2.4 – Colocar as placas de amplificação nos termocicladores e executar os programas paraamplificaçãoclasseIeclasseII,deacordocomastabelasabaixo:

AmplificaçãoclasseI(HLA-A,BeC)

Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 95°C 3minutos 95°C 15segundos

35 65°C 30segundos 68°C 5minutos1 68°C 10minutos1 4°C ∞


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AmplificaçãoclasseII(HLA-DRB1,DPB1,DQA1eDQB1)

Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 95°C 3minutos 93°C 15segundos

35 60°C 30segundos 68°C 9minutos1 68°C 10minutos1 4°C ∞

Nota:Oêxitodaamplificaçãopodeserverificadoatravésdaaplicaçãode2µldecada amplicon em gel de agarose a 2% padrão a 250 V, durante 30 minutos.(Opcional)

Tamanhosprevistosdeamplicon

LócusHLA Tamanhosprevistosdeamplicon(kb)HLA-A,BeC ~3HLA-DRB1 ~4,3HLA-DPB1 ~6,7HLA-DQA1 ~6

HLA-DQB(Conjunto3) ~6,6

Pontodeparagemsegura.Osampliconspodemserarmazenadosa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.


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Passo 3 – Quantificação e normalização de amplicon(utilizandoumfluorómetrodeplacas)Duração:~1hora50minutosAquantificaçãoeanormalizaçãodeampliconsãorecomendadasparagarantirumaentradaexatanopassodepreparaçãodabiblioteca(opcional).AconcentraçãodeampliconémedidaatravésdosistemaQuantiFluordsADN,queincluiumcorantefluorescentedeligaçãoaoADNepadrãoADNparaquantificaçãosensíveldepequenasporçõesdeADNdecadeiadupla(dsADN).ConsultaroAnexo2paraobter instruçõessobrecomofazeraquantificaçãodeampliconutilizandoumamáquinaqPCR.

Sugestão breve – A quantificação de amplicon, embora recomendada, nãoénecessáriaparaconcluircomêxitooprotocoloHolotypeHLA.Anormalizaçãodeamplicon não necessita de medição exata da concentração de amplicon. Emalternativa,podeserutilizadaumaestimativadaconcentraçãodeamplicon,combase na experiência ou na eletroforese em gel de agarose. A quantificação deamplicon não deve ser ignorada sem experiência suficiente com o protocoloHolotypeHLAcompleto.


PlacadeamplificaçãoclasseI 4°C Passo2PlacadeamplificaçãoclasseII 4°C Passo2PadrãoLambdaADN(100ng/µl) 4°C PromegaCoranteQuantiFluordsADN(200×) 4°C Promega20×tampãoTE(pH7,5) 4°C PromegaGraumolecularH2O 20°Ca25°C UtilizadorExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix

Protocolo3.1 – Preparar padrões ADN por diluição em série do padrão Lambda ADN (100 ng/µl),

fornecidonokitQuantiFluor,deacordocomatabeladediluiçãoabaixo:


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Etiquetanotubo EntradadeADN VolumeADN(µl) Volume1xTE(µl) Conc.Final(ng/µl)Padrão1 LambdaADN 7,5µl 492,5µl 1,5ng/µlPadrão2 Padrão1 250µl 250µl 0,75ng/µlPadrão3 Padrão2 250µl 250µl 0,38ng/µlPadrão4 Padrão3 250µl 250µl 0,19ng/µlPadrão5 Padrão4 250µl 250µl 0,09ng/µlPadrão6 Padrão5 250µl 250µl 0,05ng/µlVazio Vazio 0µl 250µl 0ng/µl

3.2 – Preparar as placas de quantificação de amplicon (consultar valores complementares).Alíquotade99µl1xtampãoTEnospoçosdeumaplacaóticade96poçosparaonúmerototaldeampliconsaseremquantificados.

3.3 –Adicionar1µldeampliconsdospoçoscorrespondentesnasplacasdeampliconparaospoçosindividuaisnasplacasdequantificaçãodeamplicon.Misturarporpipetagem.

3.4 –Preparar1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluor,utilizandoaseguintefórmula:0,5µlcoranteQuantiFluor(200X)+99,5µl1×tampãoTE.Preparar1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorsuficiente,deformaaquecadaamostra(dototaldeamostrasnasplacasdeamplicon)epadrão(14nototal)recebamumaalíquotade100µl.

3.5 –Prepararumaplacadequantificaçãodepadrõeseplacasdequantificaçãodeamplicon.Alíquotade100µlde1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorparapoçosdaplacaótica de 96 poços, que será a placa de quantificação de padrões, e para as placas dequantificaçãodeamplicondopasso3.2.

3.6 –Utilizandoospadrõespreparadosacima,adicionar100µldecadapadrão,emduplicado,nospoçosindividuaisnaplacadequantificaçãodepadrões(14poçosnototal).Misturarporpipetagem.

3.7 –Agitarbemparamisturarecentrifugar.

3.8 –Executaraplacadequantificaçãodepadrõesnofluorómetrodeplacase,emseguida,asplacasdequantificaçãodeamplicon.

3.9 –CalcularaconcentraçãodeADNnasplacasdequantificaçãodeamplicon,utilizandoosdadosRFUgeradospelofluorómetrodeplacas.Paraobterajudaparaoscálculos,consultaratabeladediluiçãonolivrofornecido.

3.10 –DiluiroADNnasplacasdeampliconcomgraumolecularH2O,paraqueaconcentraçãofinaldeADNsejaaproximadamentede67ng/µl.

§ SeaconcentraçãodeADNforigualousuperiora150ng/µl:adicionar25µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNsesituarentre100-150ng/µl:adicionar10µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNforinferiora100ng/µl:nãoadicionarH2O


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Agrupamentodeamplicon3.11 – Agrupar todos os loci de cada amostra numa única placa de amplicons agrupados.

Combinarosvolumesindicadosparacadalócus,conformeindicadonatabelaaseguir,paraobterumvolumefinalde35µl:

LócusHLA VolumeagrupadoA 5µlB 5µlC 5µl

DRB1 5µlDPB1 5µlDQA1 5µl

DQB1Conjunto3 5µl

3.12 –Adicionar4µldeExoSAP-iTExpressemcadabibliotecadeamostra.Enxaguaraspontesdaspipetas,parapipetagem.Vedaraplacacomvedantetérmicoecentrifugar.

3.13 – Colocar a placa de amplicons agrupados num termociclador e executar o seguinteprograma:

PurificaçãoPCRdeExoSAP-iTExpress

Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 37°C 4minutos1 80°C 1minuto1 4°C ∞

Pontodeparagemsegura.Osampliconspodemserarmazenadosa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.


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Passo4–PreparaçãodabibliotecaDuração:~3horasDurante este passo, os amplicons agrupados são preparados para sequenciação no IlluminaMiSeq. Os amplicons são fragmentados enzimaticamente, as extremidades são reparadaseadeniladaseosadaptadoresindexadossãoligadosàsextremidades.Asbibliotecassãoentãoagrupadas,seguindo-seumúnicopassodelimpezaeconcentração,realizadoutilizandogrânulosAMPureXP.

Nota:AOmixonrecomendavolumessuperioresaonecessáriopara96amostras,porquemuitasdasenzimasetampõessãoviscosos,resultandoemperdaexcessivaporpipetagem.


Placadeampliconsagrupados 4°C Passo3Enzimadefragmentação(A) -20°C OmixonTampãodefragmentação(B) -20°C OmixonEnzimadereparaçãodeextremidade(C) -20°C OmixonTampãodereparaçãodeextremidade(D) -20°C OmixonEnzimadeligação(E) -20°C OmixonTampãodeligação(F) -20°C OmixonPlacaadaptadora -20°C OmixonGrânulosAMPureXP 4°C BeckmanCoulter80%etanol(preparadonomomento) 20°Ca25°C UtilizadorGraumolecularH2O 20°Ca25°C Utilizador

Protocolo4.1 –Ligarotermociclador.Verificarseatampaaquecidaestáaaquecer.

Nota:Antesdautilização,certifique-sedequeagitaexaustivamenteaenzimadefragmentação(A).

4.2 –Prepararamisturaprincipaldefragmentaçãodeacordocomatabelaabaixo:


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Misturaprincipaldefragmentação

Reagente Volumeporbiblioteca(µl)

Volumesrecomendadospara96bibliotecas(µl) Códigodecor

Enzimadefragmentação(A) 2µl 220,8µl AmareloTampãodefragmentação(B) 2µl 220,8µl VermelhoVolumetotal 4µl 441,6µl

4.3 –Prepararumaplacadereagente:colocarumanovaplacaPCRde96poçosnumsuportede refrigeração PCR, bem como alíquota e quantidade igual da mistura principal defragmentaçãoemcadapoçodeumaúnicacoluna.

Nota:AreaçãodefragmentaçãofoiconcebidaparafornecerADNdetamanhoidealpara sequenciação no IlluminaMiSeq. É importantemanter os reagentes frios atécomeçarareaçãonotermociclador,paraevitarfragmentaçãoexcessiva.Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais, para minimizar as probabilidades defragmentaçãoexcessiva.

4.4 –Centrifugaraplacadeampliconsagrupadosdurante10segundosecolocá-laemgeloounumblocofrio.

4.5 –Prepararumaplacadereação:colocarumaplacade96poçosPCRnumblocofrioPCR.

4.6 –Adicionar4µldemisturaprincipaldefragmentaçãodaplacadereagentenospoçosdaplaca de reação, correspondentes às amostras na placa de amplicons agrupados.Recomenda-seautilizaçãodepipetasmulticanais.

4.7 – Transferir 16 µl de cada amplicon da placa de amplicons agrupados para o poçocorrespondente na placa de reação, utilizando uma pipeta multicanal. Misturar porpipetagem.

4.8 –Cobriraplacadereaçãocomovedantetérmicoecentrifugardurante10segundos.

4.9 –Deixarincubaraplacadereaçãonumtermocicladorcomoseguinteprograma:

Programadefragmentação

Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 37°C 10minutos1 70°C 15minutos1 4°C ∞

Pontodeparagemsegura.Asbibliotecapodemserarmazenadasa4°Cdeumdiaparaooutrooua-20°Cduranteperíodosmaiores.

4.10 –Prepararamisturaprincipaldereparaçãofinaldeacordocomatabelaabaixo:


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Misturaprincipaldereparaçãofinal

Reagente Volumeporbiblioteca(µl)

Volumesrecomendadospara96bibliotecas(µl)

Códigodecor

GraumolecularH2O 1,25µl 139,2µl Enzimadereparaçãodeextremidade(C) 1,25µl 139,2µl VerdeTampãodereparaçãodeextremidade(D) 2,5µl 278,4µl CordelaranjaVolumetotal 5µl µl

4.11 –Colocar alíquotanumaquantidade igualdemisturaprincipalde reparação finalnumacolunaúnicanãoutilizadadaplacadereagente.

4.12 – Centrifugar a placa de reação (que contém as amostras fragmentadas) durante10segundos.–Adicionar5µldemisturaprincipaldereparaçãofinadaplacadereagenteem cada poço da placa de reação. Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais.Misturarporpipetagem.


4.14 –Deixarincubaraplacadereaçãonumtermocicladorcomoseguinteprograma:

Programadereparaçãofinal



4.15 – Remover a placa de adaptadores indexados do armazenamento e descongelaràtemperaturaambiente,apósoiníciodoprogramadereparaçãofinalnotermociclador.Quando a placa adaptadora estiver à temperatura ambiente, centrifugá-la durante3minutosa3000rpm.

4.16 –Puxarcomcuidadoavedaçãodaplacaadaptadora.Nãoagitaraplacaadaptadoradepoisdeavedaçãotersidoremovida,paraevitarcontaminaçãocruzada.

4.17 – Transferir todo o volume de cada poço da placa de reação (25 µl) para o poçocorrespondentenaplacaadaptadora.


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Nota:CasoNÃOsejautilizadaatotalidadedaplacaadaptadora,épossívelutilizarapenasonúmeronecessáriodeadaptadores.Cortaravedaçãodaplacaentreospoços a serem utilizados e os poços a serem mantidos. Puxar com cuidadoavedaçãodaplacaadaptadora,mantendoavedaçãosobreospoçosaconservar.

a. Transferir25μldecadaamostradeextremidadereparadadaplacadereaçãoparaumpoçonaplacaadaptadora,misturandobemcomumapipeta.

b. Transferiratotalidadedecadaamostradaplacaadaptadoraparaopoçooriginaldaplacadereação.

c. Voltaravedaraplacaadaptadoraevoltaracolocá-laa-20°C.Utilizaraplacadereação em vez da placa adaptadora para os passos restantes indicados nomanual.

4.18 –Prepararamisturaprincipaldeligação.Prepararmisturaprincipaldeligaçãosuficienteparacadaamostra.

Misturaprincipaldeligação

Reagente Volume(µl) Volumesrecomendadospara96bibliotecas(µl) Códigodecor

Enzimadeligação(E) 2,5µl 252,5µl AzulTampãodeligação(F) 30µl 3030µl PretoVolumetotal 32,5 3282,5µl

4.19 –Colocaralíquotadamisturaprincipaldeligaçãoem3colunasnãoutilizadasdaplacadereagente.Recomenda-seautilizaçãodepipetasmulticanais.

4.20 – Adicionar 32,5 µl de mistura principal de ligação em cada poço da placa de reação.Recomenda-seautilizaçãodepipetasmulticanais.Misturarporpipetagem.


4.22 –Incubaraplacadereaçãonotermocicladorcomoseguinteprograma:

Programadeligação




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Purificaçãodebibliotecaeagrupamento4.23 –PermitirqueosgrânulosAMPureXPatinjamatemperaturaambiente.Garantirquesão

homogéneos(semgrumosnempéletes).Prepararnomomento,com5mlde80%deetanol(4mlEtOH+1mlH2O).

4.24 – Criar a biblioteca, combinando uma alíquota de cada amplicon agrupado, agora umabibliotecaespecíficadeamostra,numtubodemicrocentrifugaçãoúnicode2,0mldebaixaligação.

I. Para 16 oumais amostras – calcular a quantidade de cada biblioteca de amostraaagrupar conjuntamentecomoumabibliotecaúnicacomvolume totalde900µl.Dividir900µlpelonúmerodebibliotecasdeamostra.Esteéovolumedealíquotaaextrairdecadabibliotecadeamostraeapipetarnabiblioteca.

II. Paramenosde16amostras–Transferir60µldecadabibliotecadeamostraparaumabiblioteca.

4.25 –Adicionar900µldegrânulosAMPureXPaotubodabiblioteca.Misturarexaustivamenteporagitaçãoecentrifugarbrevemente.Nãopermitirqueosgrânulosseseparem.Incubarabibliotecadurante10minutos,àtemperaturaambiente.

Nota:Casohajamenosde900µldebibliotecanoagrupamentofinal,adicionarumaquantidadeequivalentedegrânulosAMPureXP.Deveexistirumaproporção1:1deagrupamentofinaledegrânulosAMPureXP.

4.26 –Colocarotubodabibliotecanumsuportemagnéticoeincubardurante10minutos.

4.27 – Mantendo o tubo no suporte magnético, remover cuidadosamente e eliminarosobrenadantedotubodabiblioteca,semtocarnosgrânulos.

4.28 –Mantendootubonosuportemagnético,adicionar~1,5–2mlde80%deetanol,preparadonomomento,aotubodabiblioteca.Ovolumedeetanoladicionadodevesersuficienteparacobrirosgrânulos.

Nota:Aplicaroetanolnoladodotubosemgrânulos.

4.29 –Incubarotubodabibliotecaatemperaturaambientedurante30segundos;emseguida,removercuidadosamenteeeliminarosobrenadante.

4.30 –Repetirospassos4.28e4.29.

4.31 – Centrifugar brevemente o tubo de biblioteca e colocá-lo novamente no suportemagnético,comatampaaberta.Removeroetanolresidualcomumapipeta.Nãotocarnosgrânulos.


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Nota:Devecertificar-sedequeapéletedegrânulosnãocontémetanolresidual.Istopodeexigirarotaçãodotubonosuportemagnético,pararemoveroetanolsemperturbarapéletedegrânulos.

4.32 –Permitequeosgrânulossequemaoardurante5-8minutosnosuportemagnéticoatéqueapéletedegrânulosfiqueseca.

4.33 –Removerotubodebibliotecadosuportemagnéticoeeluirabibliotecacom31µldeáguadegraumolecular.Nãopermitirqueapipetatoquenosgrânulos,poisficarãoagarradosnela.

4.34 –Agitarabibliotecaparaqueosgrânulosfiquemdenovocompletamenteemsuspensão.Centrifugarbrevemente,casofiquemalgunspingosnasparedeslaterais.Garantirqueosgrânulospermanecememsuspensão.

4.35 –Incubarabibliotecaàtemperaturaambientedurante2minutos.

4.36 –Colocarabibliotecanosuportemagnéticodurante2minutos.

4.37 –Colherabiblioteca:mantendootubodabibliotecafinalnosuportemagnético,recolher31µldosobrenadantenumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.

Pontodeparagem segura.Asbibliotecaspodem ser armazenadas a -20 °Cduranteperíodosprolongados.


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Passo5–SeleçãodotamanhodabibliotecaDuração:~1horaOpasso5adotaabibliotecadopasso4e realizaaseleçãodo tamanho,utilizandoométodoPippin Prep. O Pippin Prep pode selecionar automaticamente um intervalo de tamanhos defragmentosdeADN,eluindo-osnumacâmaradecolheita.Nota:PodeserutilizadooBluePippin,emalternativaaoPippinPrep.ConsultaroAnexo1paraobterinstruçõesdeutilizaçãodoPippinPrep.


Cassetede1,5%degeldeagarose,semcorante 20°Ca25°C SageScienceSoluçãocarregadadePippin/misturademarcador(cometiquetaK)

4°C SageScience

Bibliotecaagrupada 4°C Passo4

Nota:OmarcadorKéutilizadocomoPippinPrep.OBluePippinutilizaomarcadorR2.

Protocolo5.1 –ColocarasoluçãocarregadadomarcadorKàtemperaturaambiente.

5.2 –Combinar31µldoagrupamentocom10µldesoluçãocarregadadomarcadorK.

5.3 –Misturarporagitaçãoecentrifugação.

5.4 –ConfiguraroPippinPreppararecolherfragmentosdeADNentre650e1300bps.Carregara amostra de 40 µl na porta de amostra e executar. O tempo de execução é de45-50minutos.

5.5 –Recolhertodooconteúdo(aproximadamente40µl)daportadeeluiçãodoPippinPrepetransferi-loparaumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixa ligaçãode1,5ml.Estaéabibliotecaselecionadaportamanho.

Pontodeparagem segura.Asbibliotecaspodem ser armazenadas a -20 °Cduranteperíodosprolongados.


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Passo 6 – Quantificação de biblioteca através de uminstrumentoqPCRDuração:~1hora15minutosÉnecessárioquantificarabibliotecaselecionadaportamanhoparautilizarotimamenteasaídadosequenciadorIlluminaMiSeq.AconcentraçãodabibliotecaselecionadaportamanhopodesermedidacomexatidãopeloqPCR.Como opção, pode utilizar o kit Qubit dsADN BR e uma máquina Qubit para a medição daconcentraçãodabiblioteca.ConsultaroAnexo3,relativamenteaesteprotocolo.


10×pré-misturadeiniciadorIllumina -20°C KAPABiosystems2×misturaprincipalKAPASYBRFASTqPCR -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsPadrõesADNIllumina -20°C KAPABiosystemsGraumolecularH2O 20°Ca25°C Utilizador1×tampãoTE(pH8,0) 20°Ca25°C UtilizadorBibliotecaselecionadaportamanho 4°C Passo5

Protocolo1 –PrepararamisturadeiniciadorqPCRutilizando10xpré-misturadeiniciadorIlluminae2×

misturaprincipalKAPASYBRFASTqPCR:

Nota: Os reagentes do kit KAPA SYBR FAST qPCR (mistura principal qPCR, pré-misturadeiniciadoresoluçõesROX)sãocombinadosduranteaprimeirautilizaçãodokit.Estasoluçãocombinadamantém-seestáveldurante,pelomenos,30ciclosde congelamento/descongelamento. Seguir a documentação KAPA paradeterminarseoROXérecomendadoparaorespetivoinstrumentoqPCR.

MisturadeiniciadorqPCR

Reagente Volume(ml)10×pré-misturadeiniciadorIllumina 1ml2×misturaprincipalKAPASYBRFASTqPCR 5mlVolumetotal 6ml


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2 –PrepararamisturaprincipalqPCR.

MisturaprincipalqPCR

Reagente Volume(µl)MisturadeiniciadorqPCR 228µlGraumolecularH2O 76µlVolumetotal 304µl

3 –Prepararumadiluiçãoemsériedabibliotecaselecionadapelotamanho.

a. Preparar uma diluição 1:1000, adicionando 1 µl da biblioteca selecionada pelotamanhoa999µlde1×tampãoTE(pH8,0),enxaguandoexaustivamenteapontadapipeta.Agitarecentrifugar.

b. Preparar uma diluição 1:2000, adicionando 100 µl da diluição 1:1000 a 100 µl 1×tampãoTE(pH8,0).Agitarecentrifugar.

4 – Preparar uma placa de quantificação qPCR numa placa PCR nova, compatível comorespetivosistemaqPCR.

5 – Colocar alíquota de 16 µl damistura principal qPCR em triplicado para padrões 1-4,adiluição1:1000eadiluição1:2000(consultarvalorescomplementares).

6 –Colocaralíquotade4µldepadrões1-4,adiluição1:1000eadiluição1:2000nospoçoscorrespondentes.

7 –VedaraplacadequantificaçãoqPCRecentrifugá-ladurante10segundos.

Nota: Evitar a criação de bolhas nos poços da placa de quantificação qPCR.Centrifugarconformenecessárioparaeliminarasbolhas.

8 –Definirostriplicados1:1000e1:2000comoamostras-alvoedefiniropadrões(pontos:4,concentraçãoinicial:20pM,diluição:1:10).ExecutaroseguinteprogramanamáquinaqPCRparadeterminaraconcentraçãodeADNdabibliotecaselecionadaportamanho:

Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 95°C 5minutos25

(semcurvadefusão)95°C 30segundos60°C 90segundos(aquisiçãodedados)

9 –ParaconverteroresultadodeqPCRdeconcentraçãopMparanM,introduzirosresultadosde «Quantidademédia» das duas réplicas de biblioteca no separador do livro Omixondesignadopor«LibraryQuantitation»(Quantificaçãodebiblioteca).

10 –Utilizandoosvolumesdolivro,diluir10µldabibliotecaselecionadaportamanhoparaumaconcentraçãode2nMcomH2Oesterilizada,numnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.Armazenaraparterestantedabibliotecaselecionadaportamanhoa-20°C.


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Pontodeparagem segura.Asbibliotecaspodem ser armazenadas a -20 °Cduranteperíodosprolongados.Nocasodearmazenamentodelongaduração,éextremamenterecomendávelumanovaquantificaçãodabibliotecaantesdeaprocessarnoMiSeq.


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Passo7–SequenciaçãonoIlluminaMiSeqDuração:~24–40horasO Illumina MiSeq é um instrumento NGS automatizado, que pode sequenciar a bibliotecaselecionada por tamanho preparada nos passos anteriores. A desmultiplexação das amostrasindexadaséefetuadaautomaticamenteapósaconclusãodaexecuçãodesequenciação.

Sugestão breve – Pode utilizar um pico PhiX de 1% como controlo adicional paramonitorizarareaçãodesequenciação.ConsultaradocumentaçãoIlluminaparaobterinformaçõesadicionaissobreocontroloPhiX.


Cartuchodereagente -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaCéluladefluxoMiSeq 4°C IlluminaBibliotecaa2nM 4°C Passo6NaOH1Nou2N 20°Ca25°C UtilizadorGraumolecularH2O 20°Ca25°C Utilizador

CapacidadedokitdereagenteMiSeq

KitdereagenteIlluminaMiSeq

PeríododetempoHoras

Amostras96/7


~39 96


~24 96

Microciclo300(MS-103-1002)

~19 28


~28 12


~17 6

Protocolo7.1 –PrepararoMiSeqemconformidadecomosprotocolosIlluminapadrão.


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7.2 –Prepararumabibliotecadesnaturada1nM:Combinar10μlde0,2NdeNaOHrecém-preparadoe10µldadiluiçãode2nMdabibliotecaselecionadaportamanhonumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.Agitarecentrifugar.Incubarestabibliotecadesnaturadade1nMàtemperaturaambiente,durante5minutos.

7.3 –Prepararumabibliotecadesnaturadade20pM:Adicionar980µldeHT1refrigeradoaos20µldabibliotecadesnaturadade1nM.Agitarecentrifugar.

7.4 – Preparar uma biblioteca desnaturada de 9 pM: Adicionar 550 µl de HT1 refrigeradoe450µldabibliotecadesnaturadade20nMnumnovotubodemicrocentrifugaçãodebaixaligaçãode1,5ml.Agitarecentrifugar.

7.5 – Transferir 600µl dabibliotecadesnaturadade9pMparao reservatóriode amostrascarregadasdocartuchodereagenteMiSeq.

Sugestãobreve–ÉaconselhávelutilizarolivrofornecidoparacriarafichadeamostrasqueénecessáriaparaoMiseq.


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Passo8–AnálisededadosdesequenciaçãoHLAOIlluminaMiSeqprocessaabibliotecaagrupadade9pM,gerandodadosdesequenciaçãocomoficheirosfastq.ConsultaromanualdoHLATwinparaobterauxílioparaainstalaçãocorretadoHLATwin,bemcomoparaobterinformaçõessobreainterpretaçãodaanálisedegenotipificaçãodos respetivos dados de sequenciação. Para implementar o protocolo automatizadoe relativamente a questões sobre a instalação ou à análise de dados, [email protected].

Protocoloautomatizado

InstalaçãoeconfiguraçãodeTI1. InstalaroHLATwinServernoservidor.

§ InstalaroHLATwinClientnumcomputadorcliente–podemserligadosváriosHLATwinClientsaoservidor.

§ Paraobterinstruçõesdeinstalaçãopersonalizadasparaautomatização,contactarosuportetécnicodaOmixon([email protected]).

Protocoloporanálise1. IniciaroHLATwinClienteiniciarsessão.

2. Osdadosjáestãoprocessadosouestãoaserprocessados.Reverosresultados,utilizandoosistemadesemáforonoHLATwin.

3. Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conformenecessário.

Protocolodeservidormanual

InstalaçãoeconfiguraçãodeTI§ InstalaroHLATwinServernoservidor.§ InstalaroHLATwinClientnumcomputadorcliente.

Protocoloporanálise§ IniciaroHLATwinClienteiniciarsessão.§ SelecionarosdadosMiSeqemformatofastqoufastq.gzeiniciaraexecuçãodetipificação

HolotypeHLA.§ ApósterconcluídoatipificaçãoHolotypeHLA,reverosresultados,utilizandoosistemade

semáforonoHLATwin.§ Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conforme

necessário.


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Protocolodeambientedetrabalhomanual

InstalaçãoeconfiguraçãodeTI§ InstalaroambientedetrabalhoHLATwin.

Protocoloporanálise6 IniciaroHLATwineiniciarsessão.

7 SelecionarosdadosMiSeqemformatofastqoufastq.gzeiniciaraexecuçãodetipificaçãoHolotypeHLA.

8 ApósterconcluídoatipificaçãoHolotypeHLA,reverosresultados,utilizandoosistemadesemáforonoHLATwin.

9 Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conformenecessário.


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Valorescomplementares

Exemplodeplacaparaplacadeamplicon,placadeamplificação,placade diluição, placa de quantificação de amplicon (para um lócusindividual)eplacadereação

Exemplodeplacadequantificaçãodepadrões


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ExemplodeplacaqPCRdequantificaçãodebibliotecaKAPA


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Anexo1:PippinPrep

ProgramaroPippinPrep1. ClicarnoseparadorEditordeprotocoloseclicarnobotão«New»(Novo).

2. Clicar no íconedapasta juntodo campoCassete e selecionar «1.5%DFMarker K»paraoPippinPrepou«1.5%DFMarkerR2»paraoBluePippin.

3. Nafaixaqueestáaprogramar:

a. Realçarocampo«Range»(Intervalo).b. Definira«RefLane»(Faixadereferência)paracorresponderaonúmerodefaixaem

queestiveratrabalhar.c. Definirocampo«Start*»(Iniciar)para650.d. Definirocampo«End*»(Terminar)para1300.

4. NocampoFaixadereferência,selecionarafaixaemqueestáatrabalhar.

5. Clicarnobotão«SaveAs»(Guardarcomo)eatribuirumnomeaoprograma.

ExecutaroPippinPrep1. AtivaroPippinPrep,premindoobotãodeligar/desligarnaparteposteriordodispositivo.

2. InspecionarvisualmenteoPippinPrep.Devecertificar-sedequeos5LEDseencontramligadosedequeointeriordodispositivoestálimpoeseco.

3. ClicarnologótipoSageScience,naparteinferiordireitadoecrã.Istopermitiraoutilizadorintroduzirumapalavra-passe.Apalavra-passepredefinidadefábricaé«pips».

4. ClicarnoseparadorConfiguraçãodefábricaecertificar-sedequeovalorbase-para-limiteestádefinidopara0,02.

5. ColocaroacessóriodecalibragemnointeriordoPippinPrep,certificando-sedequeafaixaescuraestávoltadaparabaixoesobreasluzesLED.

6. NoseparadorPrincipal,clicarnobotão«Calibration»(Calibragem).

7. NajanelaCalibragem,devecertificar-sedequeocampo«TargetIpHmA»estádefinidopara0,80(0,60paraBluePippin)e,emseguida,premirobotão«Calibrate»(Calibrar).

8. AcederaoseparadorProtocolos.Clicarnobotão«Load»(Carregar)eselecionaroprogramaparaHolotypeHLAeafaixaespecíficaquevaiutilizar.Certifique-sedeque:

a. Estáligadaafaixacorretab. Oindicadordeseleçãodeespetroamploestáativadoc. Afaixadereferênciaéamesmafaixaquevaiserexecutada.

9. AcederaoseparadorPrincipal.Certifique-sedeque:

a. Oprogramaquecarregouéoqueestáselecionado.


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b. Estáselecionadaafaixadereferênciaadequadaequesetratatambémdafaixaemqueaamostravaiserexecutada.

10. Inspecionaracassete.Antesderetirarafitadevedaçãodospoços,verificarsehábolhaspor trás da porta de eluição. Se houver bolhas por trás da porta de eluição, batersuavementeefazerdeslizaracassetenamãoparadesfazerasbolhas.

11. Colocaracassete,comafitaaindacolocadasobreospoços,dentrodoPippinPrep.

12. Retirarcuidadosamenteafita,certificando-sederemoverafitaapartirdoladolimpodacassete(faixa5)paraoladousadodacassete(faixa1).Tercuidadoparanãofazersalpicarlíquidoquandoafitaforremovida,paraevitarcontaminação.

13. Removertodoovolumedotampãodaportadeeluição,dafaixaquevaiutilizar,eadicionar40µldetampãodeeletroforeserecém-preparadonessaportadeeluição.

14. Adicionarumatirafinadefitanasportasdeeluição.

15. Osreservatórioscommenosde3/4deenchimentodevemserreabastecidoscomtampãodeeletroforese.Nãoencherospoçosexcessivamente!Abordadotampãodevealcançaroapenas plástico, não ultrapassando, para evitar arrastamento quando a tampa deslizar.Aplicarotampãoapartirdospoçoslimpos(faixa5)paraospoçososusados(faixa1).

16. Certificar-sedequecadaumdospoçosdecarregamento(poçoscomagarose)estejacheiocom tampão de eletroforese. O tampão deve encontrar-se «mesmo» sobre a agarose,parecendocompletamenteplano.

17. FecharoPippinPreplentamente,tendoematençãoquenenhumtampãoestejaatocarnatampaenquantoestiverafecharodispositivo.

18. Realizarotestedecontinuidade.Quandoossensoressecamligeiramente,écomumqueotestedecontinuidadefalheumavez.Seotestedecontinuidadefalhar,executá-lomaisumavez.Quandootestedecontinuidadeterminar,abriroPippinlentamente.Certificar-sedequenenhumfluidoestáaserpuxadoatravésdacassete,pelatampadoPippinPrep.

19. Agitarbrevementea soluçãocarregadadomarcadorKecentrifugar.Adicionar10µldasoluçãocarregadadomarcadorKàrespetivabibliotecade~30µl.

20. Agitarbrevementeabibliotecaecentrifugar.

21. Remover40µldotampãodopoçodaamostraqueseráutilizado.

22. Adicionar~40µldabibliotecacarregadacommarcadorKparaopoçodaamostraqueseráutilizado.

23. Marcarafaixaqueestáaserutilizadacomasiniciaisdotécnicoeadata.

24. FecharoPippinPrepeclicarnobotão«Start»(Iniciar).Certificar-sedequefoiativadaafaixacorreta.Aamostradeveserprocessadadurante45minutos.

25. Apósaconclusãodoprocessamento,abrircuidadosamenteoPippinPrep.Terematençãoseatampaarrastaqualquerlíquidoatravésdacassete.


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26. Removerafitasobreasportasdeeluição,tendocuidadoparanãofazersalpicarnenhumlíquido.

27. Transferirtodoovolumedaportadeeluiçãoparaumnovotubode1,5mldebaixaligação.

28. Cobrirtodosospoçosabertoscomdoispedaçosdefitadevedaçãodaplaca.Lembre-sededeixarumaabanoladolimpo.Istofacilitaráaremoçãodafitadoladolimpoparaousado.

29. Colocaracassetevedadanosacorespetivoeguardá-la.

30. Pegarnacassetedelavagemeenchê-lacomáguaMiliQ.FecharsuavementeatampadoPippin Prep, tendo em atenção se é derramado algum líquido através da cassete delavagem.

32. DeixaroPippinPrepfechadodurantealgunssegundos.

33. AbriroPippinPrep,tendoematençãoseéderramadoalgumlíquidoatravésdacassetedelavagem.

34. Removeracassetedeágua,esvaziá-laedeixá-lasecar.

35. LimpartodaaáguadoPippinPrepefechá-losuavemente.

36. Selecionarobotão«ShutDown»(Encerrar)nomenuPippinPrep.


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Anexo 2: Quantificação de amplicon utilizando uminstrumentoqPCRDuração:1hora50minutos


20×tampãoTE(pH7,5) 4°C PromegaPadrãoLambdaADN(100ng/µl) 4°C Promega200×coranteQuantiFluordsADN 4°C PromegaH2Oesterilizada 20°Ca25°C UtilizadorPlaca(s)deamplificaçãoclasseI 4°C Passo2Placa(s)deamplificaçãoclasseII 4°C Passo2

Protocolo1. Criarumadiluiçãoemsérie,utilizandotubosdemicrocentrifugaçãode1,5mleopadrão

QuantiFluorLambdaADN(100ng/µl).Seguiratabeladediluiçãoabaixo:

Etiquetanotubo EntradadeADN VolumeADN(µl) Volume1xTE(µl) Conc.Final(ng/µl)Padrão1 LambdaADN 7,5µl 492,5µl 1,5ng/µlPadrão2 Padrão1 250µl 250µl 0,75ng/µlPadrão3 Padrão2 250µl 250µl 0,38ng/µlPadrão4 Padrão3 250µl 250µl 0,19ng/µlPadrão5 Padrão4 250µl 250µl 0,09ng/µlPadrão6 Padrão5 250µl 250µl 0,05ng/µlPadrão7,vazio Vazio 0µl 250µl 0ng/µl

2. Preparar as placas de quantificação de amplicon (consultar valores complementares).Alíquotade49,5µl1xtampãoTEnospoçosdeumaplacade96poçoslimpaparaonúmerototaldeampliconsaseremquantificados.

3. Adicionar0,5µldeampliconsdospoçoscorrespondentesnasplacasdeampliconparaospoçosindividuaisnasplacasdequantificaçãodeamplicon.Misturarporpipetagem.

4. Preparar 1× solução de trabalho de coranteQuantiFluor, utilizando a seguinte fórmula:0,25µlcoranteQuantiFluor(200X)+49,75µl1×tampãoTE.Preparar1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorsuficiente,deformaaquecadaamostra(dototaldeamostrasnasplacasdeamplicon)epadrão(14nototal)recebamumaalíquotade50µl.

5. Prepararumaplacadequantificaçãodepadrõeseplacasdequantificaçãodeamplicon.Alíquotade50µlde1×soluçãodetrabalhodecoranteQuantiFluorparapoçosdaplacaóticade96poços,utilizandooformatodaplacadequantificaçãodepadrõeseasplacasdequantificaçãodeamplicon(consultarvalorescomplementares).


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6. Utilizandoospadrõespreparadosacima,adicionar50µldecadapadrão,emduplicado,nospoçosindividuaisnaplacadequantificaçãodepadrões(14poçosnototal).

7. Agitarparamisturarbemecentrifugar.

8. Colocar cada placa de quantificação na máquina qPCR, uma de cada vez, e executaroseguinteprograma:

Númerodeciclos Temperatura Períododetempo1 25°C 10segundos 25°C 15segundos2 25°C 30segundos(aquisiçãodedados)

9. Calcular a concentração deADNnas placas de quantificação de amplicon, utilizando osdadosRFUbrutosgeradospeloinstrumentoqPCR.

10. –DiluiroADNnasplacasdeampliconcomH2Oesterilizada,paraqueaconcentraçãofinaldeADNsejaaproximadamentede67ng/µl.

§ SeaconcentraçãodeADNforigualousuperiora150ng/µl:adicionar25µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNsesituarentre100-150ng/µl:adicionar10µldeH2O§ SeaconcentraçãodeADNforinferiora100ng/µl:adicionar0µldeH2O


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Anexo 3: Quantificação de biblioteca, utilizando umcorantefluorescentedsADNintercalarDuração:~15minutosAconcentraçãodabibliotecaselecionadaportamanhopodesermedidacomexatidãoatravésdeumcorantefluorescentededsADNintercalarcomo,porexemplo,SYBRverdeouequivalente.Oskitseinstrumentoscomercialmentedisponíveisparaestefimincluem,porexemplo,oleitorQubitdaThermoFisher(utilizaokitdeexameQubitBroad-RangedsADN),oleitorQuantusdaPromega(utilizaocorantefluorescenteQuantifluordsADN),entreoutros.Aqui,ométodoQubitédescritocomooinstrumentomaisutilizado.Casosejautilizadooutroinstrumentoekit,sigaasinstruçõespadrãodofabricante.

Nota: Estemétodo fluorométricodsADNéuma forma rápida, porémexata, dedeterminaraconcentraçãodabibliotecafinalselecionadapelotamanho.PermitemediratotalidadededsADNpresentenabiblioteca.


KitdeexameQubitdsADNBR temperaturaambiente ThermoFisherPadrõesQubitdsADNBR 4°C ThermoFisherBibliotecaselecionadaportamanho 4°C Passo5

Protocolo6.1 – Colocar os padrões Qubit Standards à temperatura ambiente. Preparar tubos de

ensaioQubit(500µl,deparedefina)paraasuabibliotecaemduplicadoeosdoispadrões.Agitarecentrifugarospadrõeseabiblioteca.

6.2 –Adicionar995µldetampãoe5µldecorantenumtubodecentrifugaçãode1,5ml.Agitarecentrifugar.

6.3 – Transferir 190µl damistura de reagentes paraos tubosQubit, para os dois padrões.Transferir198µldamisturadereagentesparaosdoistubosQubit,paraosduplicadosdabiblioteca.

6.4 –Adicionar10µldopadrão1aotuboQubitcorrespondenteeagitardurante2segundos.Repetiroprocessoparaopadrão2.

6.5 –Adicionar 2 µl da biblioteca aos dois tubosQubit correspondentes e agitar durante 2segundos.

6.6 –IncubarostubosQubitàtemperaturaambientedurante2minutos.

6.7 –LigaramáquinaQubiteescolheroprotocoloBR.


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6.8 – Colocar o padrão 1 no tubo Qubit e premir GO (Acionar). Repetir o processo paraopadrão2.

6.9 –Colocaro tubodabibliotecanoQubitepremirGO (Acionar).Repetiroprocessoparaaréplica.

6.10 – Para converter o resultado de Qubit de concentração ng/µl para nM, introduzira concentração média das duas réplicas de biblioteca no separador do livro Omixondesignadopor«LibraryQuantitation»(Quantificaçãodebiblioteca).

6.11 – Utilizando os resultados damediçãoQubit, diluir 10 µl da biblioteca selecionada portamanho para uma concentração de 2 nM com H2O esterilizada, num novo tubo demicrocentrifugaçãodebaixa ligaçãode1,5ml.Armazenaraparterestantedabibliotecaselecionadaportamanhoa-20°C.

Pontodeparagemsegura.Asbibliotecaspodemserarmazenadasa-20°Cduranteperíodos prolongados. No caso de armazenamento de longa duração,é extremamente recomendável uma nova quantificação da biblioteca antes deaprocessarnoMiSeq.

HOLOTYPE HLA™ 96/7 CONFIGURAÇÃO A E CE C B CE …CE+User+Manuals... · PASSO 3 –...

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