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Química Analítica / JCM

HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência

� HPLC� High Performance (pressure) Liquid Chromatography

☺ nas colunas de enchimemto o fluxo é baixo mesmo para granulometrias elevadas (150-200 µµµµm)

� < granulometria < HEPT - exige pressões muito elevadas☺ mistura de nucleosidos - 1967 - 60 min / 10-20 psig

1969 - 24 min / 400 psig1970 - 1,25 min / 5000 psig

� Condições actuais:☺ colunas de 5 a 25 cm com enchimento de 3 a 10 µµµµm☺ 5000 - 10 000 psig / 40 000 - 100 000 pratos / m

� Constituíntes

1 psig = 108 kPa

HPLC - tipo de cromatoografia que emprega uma fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida e que,para ter um fluxo razoável, opera a pressões elevadas

BombasSistema de solventes

DetectorColunaInjectorAquisição e

trat. de dados


Validação

� Num laboratório de cromatografia com dois analistas f oram realizados vários testes para verificar se o método em uso para a dete rminação por GC de etanol em hiclato de doxiciclina (valor teórico: 4,5%) poderi a ser considerado vá lido. Foram obtidos os seguintes resultados:� tempos de retenção relativos: metanol: 0,3 / acetona : 0,6 / etanol 1,0

☺ Metanol e acetona são possíveis impurezas

� solução amostra: 12345 / 12450 / 11950 / 12456 / 12100� Soluções de etanol a: 20%: 3120 / 40%: 4980 / 60%: 7305 / 80%: 9850 / 100%: 12300 / � 120%: 14650

� solução amostra (repetição): 12245 / 12650 / 12405 / 12158 / 12250� solução amostra (outro dia /analista): 11900 / 13070 / 12347 / 11250 / 12440

☺ Nota: as percentagens indicadas dizem respeito ao v alor teórico: 4,5%.

� O método é selectivo?� Qual o valor obtido?� Que conclusões poderá tirar quanto à validade do métod o e à destreza dos

analistas envolvidos na determinação? � Que sugeria para melhorar a confiança no resultado?

Enviar até 11.04.07 para: [email protected]


Resolução

� Desconhecendo a resolução dificilmente se pode dize r se um método é selectivo� Se 4,5 % é a percentagem teórica, corresponde à soluç ão a 100%!!

� Por isso se indicam soluções acima e abaixo deste valor

� Não se pode confundir o significado dos 4,5% e da % das soluções padrão

� A maioria dos alunos retirou a solução a 20% que ne ste caso não seria preciso� A área foi mudada de 3500 para 3120

� Claramente um dos analistas tem falta de formação� Nota: os resultados de ambos os analistas são exactos mas um deles pouco preciso

� A repetibilidade pode ser boa mas não a reproductibilidade� A solução não é colocar o bom analista a fazer sempre o método mas dar formação ao outro

analista

� Resultado� Quando se indica que o valor teórico é de 4,5 % significa que se admite que o erro esteja no 5!

☺ Não tem valor indicar um resultado com 3 algarismos significativos☺ Seria diferente se o valor teórico fosse de 4,50 %


HPLC

� Sistema de solventes� desgaseificação / vácuo - hélio (sparging)

� Bombas☺ bombas de duplo pistão☺ válvulas proporcionais☺ câmara de mistura

� eluição isocrática - composição da FM é constante

� eluição de gradiente - composição da FM varia ao longodo cromatograma☺ Bombas isocráticas☺ Bombas binárias☺ Bombas quaternárias


Bombas

� Bombas� pressão elevada (> 6000 psig) - riscos de fugas

� saída contínua (sem pulsação) / pistão

� fluxos de 0,1 a 10 ml/min� reproductibilidade de fluxo de 0,5% !!


Injector

� Injector� o uso de septum é limitado a cerca de 1500 psig

� injecção em loop de volume fixo ( 5 - 500 µl)☺ típico 20 µµµµl

� Autoinjector☺ Capacidade de preparação de amostras


HPLC - colunas

� Enchimento� sílica (aglomeração de partículas altamente regulares

☺ eventualm. cobertas por filme orgânico

� alumina / polímeros porosos / resinas permutadoras de iões

colunas de aço com 10 a 30 cm de comprimento e 4 a 10 mm de diâmetro internoenchimento de 5 a 10 µµµµm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m

colunas de aço com 10 a 30 cm de comprimento e 4 a 10 mm de diâmetro internoenchimento de 5 a 10 µµµµm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m

Micro: 3 a 7,5 cm de comprimento / DI = 1 a 4,6 mm / <10 000 psig / 3 ou 5 µµµµm / até 100 000 pratos / mVantagens: velocidade elevada e baixo consumo de solventes

3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System™HPLC Columns


HPLC - enchimentos

� A cromatografia de partição representa a maioria da s aplicações� líquido-líquido: fase estacionária é um solvente adsorvido no suporte (apenas usado

ocasionalmente)� fase ligada: fase estacionária orgânica está ligada à superfície do suporte por ligações

covalentes (> estabilidade - > uso)

� Enchimentos de fase ligada

� outros grupos funcionais: aminas alifáticas / éteres / nitrilos / hidroc. aromáticos

� maior estabilidade / apresenta alguma limitação na capacidade de amostra

� Cromatografia de fase normal� fase estacionária polar / fase móvel não polar - o soluto menos polar elui primeiro

☺ água; trietilenoglicol; CN / hexano, éter isopropíl ico

� Cromatografia em fase reversa (+ de 75 % das aplicações)� fase estacionária não polar / fase móvel polar / soluto mais polar elue primeiro

☺ C8; C18 / soluções aquosas de metanol, acetonitrilo , THF; soluções tamponadas

/ / CH3 / / CH3

- Si -- OH + Cl - Si -- R --Si -- O -- Si -- R ; R = octil (C(8) / octadecil (C18)\ \ CH3 \ \ CH3


Pré-colunas + forno

� Pré-colunas� aumento da vida das colunas

☺ mesma (similar) composição da fase estacionária / m aior granulometria☺ remoção de partículas e contaminantes dos solventes☺ saturação da fase móvel com a fase estacionária

� Forno de colunas� TA - 150 C (temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - na maioria das

aplicações)☺ Maior a temperatura menores os tempos de retenção☺ Maiores temperaturas causam maior degradação da col una

� para a quantificação a termostatização é essencial (± 0,1 C)☺ A identificação é essencialmente feita com base nos tempos de retenção


HPLC


Detectores HPLC


Espectro electromagnético

� Espectro electromagnético

� Espectroscopia / espectrometria - informação geral / informação quantitativa� a espectroscopia está na base do grande desenvolvimento da ciência actual,

desde a química à astronomia

A espectroscopia - estudo da interacção da radiação electromagnética com a matéria

Espectro - representação bidimensional da força da interacção vs. energia

transiçõesnucleares

excitaçãoelectrónica

vibraçãomolecular

rotação molecularspin electrónico RMN

raioscósmicos

raios gama raios x UV VIS IV micro ondas ondas rádio

λ, cm

e- internos


Fenómenos associados à absorção da luz

� R - Relaxação vibracional� A - Absorção� F - Fluorescência (mesmo spin)� P - Fosforescência (spins dif.)� IC - Conversão Interna (mesmo spin)� ISC - conversão intersistema (spins

dif.)

� P aparece sempre a maiores comprimentos de onda (< E) que F� Ambos os fenómenos são raros devido

aos tempos de vida muito curtos


HPLC - detectores

� Os detectores de absorção (UV + Vis) são usados na maioria das aplicações� células analíticas� detector de foto-diodos (diode array)

0.98 - 1.02Response Index

5 x 10-8 to 5 x 10-4 g/mlLinear Dynamic Range

5x 10-8 g/mlSensitivity (toluene)

0.97 - 1.03Response Index

5 x 10-7 to 5 x 10-4 g/mlLinear Dynamic Range

1 x 10-7g/mlSensitivity


UV – comprimento de onda 360nm


DAD


Comparação de espectros UV


Fluorescência vs. UV


HPLC

� Critérios de escolha� uma boa separação representa sempre um balanço entre as forças intramoleculares que se

estabelecem entre amostra e fases estacionária e móvel� usar uma fase estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma fase móvel de

polaridade muito diferente☺ o contrário é possível mas menos eficaz (tr geralmente muito curtos)☺ polaridades idênticas (amostra e fase estacionária) pode levar a tr muito longos

� alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separação

� Aspectos experimentais� temperatura estável para trr reproductíveis

� desgaseificação dos solventes

� 2-3 réplicas e soluções padrão☺ limite de detecção - menor concentração detectável (3x acima do ruído de fundo) ☺ limite de quantificação - menor concentração determinada sem ambiguidade (10x vezes o ruído de

fundo)☺ Tailing - arrastamento do pico (coeficientes de partilha não lineares)

Cs

Cm

Cs

Cm

Cs

Cm


Trabalho

� Descreva de forma breve o funcionamento de um detec tor ELSD� Entregar por mail até 11 de Maio


Tratamento de amostras

� Amostras puras� apenas necessitam do solvente apropriado (solubilização seguida de filtração)

☺ o solvente deverá ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase móvel☺ usar THF ou metanol em fase reversa (água) pode pr ovocar perdas de resolução☺ a escolha do solvente pode ser condicionada pelo de tector utilizado

� Amostras compostas� a presença de impurezas não dissolvidas exige, no mínimo, uma filtração

� extração da matriz (excipientes) ☺ necessidade de determinar a % de recuperação

� uso de solventes diferentes do usado na injecção exige reconstituição da amostra☺ extração / concentração / reconstituição

� pré-colunas / separação de componentes de diferentes polaridades (Sep-Pak )

� Amostras biológicas� caracterizadas por concentrações muito baixas� precipitação das proteínas (acetonitrilo + centrifugação) / concentração / reconstituição


SPE


LLE


Derivatização

� Aminoácidos☺ Reagente:6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl

carbamate� Liberta: N-hydroxysuccinimide (NHS)

☺ Reacção completa num minuto☺ Derivados estáveis (+ de 1 semana)☺ Fluorescem a 395 nm

AccQTag column 3.9 x 150mm (waters) Fluorescence detection with 250 nm excitation, 395 nm emission UV detection at 248 nm

A 140mM NaAC, 6.9mM Triethylamine, EDTA (1ml of a 1mg/ml solution per liter) pH to 5.8 w / 5 - 10% phosphoric acid solutionB AcetonitrileC Water


Cromatografia preparativa


Aquisição e tratamento de dados

� Automação� o uso de computadores veio aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos

� preparação da amostra / injecção / controlo / aquisição / tratamento de dados☺ sistemas de optimização de separações cromatográfic as

� Aquisição de dados� 20 - 200 Hz ( > 8 pontos por pico)

☺ para definir um pico são precisos pelo menos3 pontos a “subir” e 3 a “descer”

� armazenagem (identificação)

� Tratamento de dados� acumulação / “smoothing” / integração / derivatização� determinação de tempos (tr) e intensidades (áreas / alturas)

☺ integração - definição do princípio e fim do pico ☺ picos mal definidos (falta de resolução e “tailing ”)

� correção da linha de base

� tratamento à posteriori☺ utilizando novos parâmetros (“threshold” / integraçã o)

� não melhora a separação!!

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