RESUMO: Podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras técnicas

instrumentais de análise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os

métodos analíticos modernos, devido a facilidade em efetuar a separação,

identificação e quantificação de espécies químicas. Trata-se de um método físico-

químico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma

mistura, devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis (fase móvel e

estacionária). Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das técnicas de

separação, a cromatografia líquida de alta eficiência utiliza pequenas colunas, nas

quais uma fase móvel líquida que é bombeada a alta pressão e elui sobre a fase

estacionária que está em seu interior, esta é formada de partículas com diâmetro de 3

a 10μm, assim, os solutos com maior afinidade com a fase móvel serão eluídos

primeiro e posteriormente os que têm maior afinidade com a fase estacionária.

Quanto menor o tamanho da partícula, maior será a eficiência da coluna e maior a

resistência à vazão. O método dispõe de diferentes mecanismos de separação

podendo ser de: partição, adsorção, troca iônica ou exclusão de tamanho. Pode ser

efetuada em fase normal, fase estacionária polar e fase móvel apolar, ou em fase

reversa, fase estacionária apolar e fase móvel polar.

1. Introdução:

Desde o início de século passado a cromatografia vem sendo utilizada como técnica

analítica, para a separação, identificação e quantificação de substâncias químicas. Essa

técnica pode ser cromatografia em coluna, ocorrendo dentro de um tubo, ou

cromatografia planar ocorrendo em uma superfície plana.

A cromatografia de alta eficiência (CLAE) é um tipo de cromatografia líquida que

emprega pequenas colunas recheadas de materiais especialmente preparados e uma

fase móvel que é eluida sobre altas pressões. Ela tem capacidade de realizar

separações e analises quantitativas de uma grande quantidade de compostos

presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com

alta resolução, eficiência e sensibilidade.

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O consumo de tabaco representa a segunda maior causa de mortes no mundo. Nos

casos de tabagismo, podem ser dosados os componentes da fumaça proveniente do

cigarro, entre eles a nicotina, que é o principal composto presente. Grande

porcentagem de nicotina absorvida é biotranformada em cotinina, seu principal

metabolito.

A cotinina pode ser determinada por diversos métodos, entre eles

espectrofotometria, imunoensaios, cromatografia gasosa (CG), cromatográfica liquida

de alta eficiência (CLAE) e CG ou CLAE acoplada à espectrometria de massas. A

especificidade e a sensibilidade da CLAE são adequadas para avaliar exposição ao

tabaco tornando este método o mais empregado.

2. Objetivo:

Validar um método por CLAE precendida por extração líquido-líquido para

mensurar os níveis de cotinina na urina, com a finalidade de monitorar a exposição

ao tabaco, incluindo a exposição ambiental.

3. Materiais e Métodos:

Todos os reagentes utilizados neste estudo foram de grau analítico. Foram

utilizados os padrões de cotinina, nicotina e 2-fenilimidazol. Hidróxido de sódio,

diclorometano, metanol, acetonitrila, acido cítrico, trietilamina e acetato de sódio.

Para certificar a ausência de cotinina nestas amostras, foram realizadas analises

cromatográfica deste analito e foram empregadas apenas as amostras nas quais não

foi detectada cotinina.

3.1. Parâmetros cromatográficos

A separação cromatográfica foi realizada em cromatógrafo de alta eficiência,

equipado com um detector ultravioleta. Como fase móvel foi utilizada água Milli-Q:

metanol:acetato de sódio 0,1M: acetonitrila contendo 1 mL de acido cítrico 0,034M e

5,0 mL de trietilamina para cada litro de solução. O pH foi ajustado a 4,4 com acido

acético. A fase móvel, o comprimento de onda do detector, o tipo de coluna e o

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volume de extrato injetado foram selecionados através da realização de testes com

parâmetros citados por vários autores.

3.2. Procedimento de Extração

Foram pipetados 2,0 mL de urina centrifugada. Posteriormente adicionado

25µL de hidróxido de sódio 10M, 100µL de padrão interno e 4,0 mL de diclorometano.

Posteriormente esta solução sofreu agitação por 40 minutos em um homogeneizador e

centrifugada por 10 minutos a 3000rpm (revoluções por minuto). Dois mililitros de fase

orgânica foram transferidos para um frasco evaporador e colocados em termobloco,

sob corrente de nitrogênio e temperatura ambiente, até secura. A seguir o resíduo foi

reconstituído com 00µL de fase móvel e injetado na CLAE.

3.3. Validação analítica

A linearidade foi determinada pela analise dos calibradores (em triplicata),

utilizando urina de indivíduos não expostos ao tabaco, com os quais se criou uma curva

de calibração com as concentrações de 10,0; 25,0; 50,0;100,0; 250,0; 500,0 e 1000,0

ng/mL. A linearidade foi determinada através do calculo de regressão linear pelo

método dos mínimos quadrados, e expressa pelo coeficiente de correlação ( r2).

Para determinar a precisão inter-ensaio, foram utilizadas amostras adicionadas

com três níveis de concentração de cotinina, as quais foram analisadas seis vezes cada.

A precisão foi expressa com desvio padrão relativo.

A exatidão foi calculada a partir da diferença entre o valor real presente em

amostras de urina branco adicionadas com três níveis de concentração de cotinina e o

valor obtido na análise.

Para a verificação da estabilidade, dez alíquotas de três amostras com

concentrações baixas, medias e altas de cotinina urinária foram mantidas a 4ºC, em

frascos de polietileno, durante três dias.Após este período as amostras foram

submetidas à nova determinação de cotinina e os resultados foram comparados

àqueles obtidos com as amostras frescas.

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A aplicabilidade do método foi avaliada por meio da análise de cerca de 20

amostras reais de fumantes e de indivíduos não expostos ou com exposição ambiental.

4. Resultados e discussões:

No cromatograma de uma amostra branco adicionada de padrão de cotinina, o

tempo de retenção foi em torno de 6 minutos e o do padrão interno de 5 minutos.

Foram apresentados os resultados para os pontos 50, 500 e 1000ng/mL

respectivamente, de precisão(11,2%;12,3%; 8,1%), exatidão(107%; 101,7%; 97%), e

estabilidade(-8,1%; -6,0%;-2,7%). O limite de detecção do método foi 5 ng/mL e o

quantificação foi 10 ng/mL.

O coeficiente de correlação linear encontrado foi r2=0,9979 no intervalo de 10 a

1000ng/mL, confirmando a linearidade.

A partir da análise da amostra de urina de individuo sem exposição ao tabaco, o

cromatograma resultante não apresentou pico de cotinina, já na amostra de individuo

fumante o cromatograma detectou o pico da cotinina.

Existem diversos marcadores sugeridos para avaliar a exposição ao tabaco

entre eles o tiocianato, monóxido de carbono,carboxiemoglobina, hidroxiprolina e

animas aromáticas. No entanto nenhum desses biomarcadores é um bom indicador da

exposição ao tabaco, devido a sua falta de especificidade ou sensibilidade (MAN ET

AL.2006). Como a nicotina é biotransformada a diversos metabolitos, por isso não é

indicada como indicador de exposição ao tabaco. analisando a meia vida, a

estabilidade e o fato de ser o metabolito mais importante, a cotinina foi o

biomarcador mais adequado para determinar a exposição ao tabaco.

Antigamente, a determinação de nicotina e seus metabolitos eram realizadas

por analises espectrofotométricas. Este é um método rápido e de baixo custo. Os

métodos espectrofotométricos foram empregados no monitoramento do consumo de

tabaco por serem simples e fornecerem uma estimativa da quantidade total de

metabolitos da nicotina inalada durante a exposição ao tabaco. Entretanto,

substancias contendo núcleo piridínico podem interferir nos resultados, o que tornam 4

o método menos especifico. Consequentemente, a concentração urinaria resultante é

maior do que aquela obtida por cromatografia gasosa ou liquida e, por este motivo, os

métodos colorimétricos deixaram de ser considerados seguros para o monitoramento

da exposição ao tabaco. Radioimunoensaio e imunoensaio de absorção ligado à

enzima, também podem ser usados para a estimativa dos níveis de cotinina, mas esses

métodos têm custo elevado e estão relacionados a ocorrência de reações cruzadas

durante o processo.

Devido principalmente à interferência de muitos componentes presentes na

urina, os quais podem influenciar nas reações colorimétricas, e a possibilidade dos

métodos imunológicos apresentarem reações cruzadas, a cromatografia liquida de alta

eficiência é o método mais apropriado para a quantificação de cotinina nos fluidos

biológicos. O método validado no presente trabalho apresenta maior especificidade e

sensibilidade do que os métodos espectrofotométricos e imunoensaios, e melhor

relação custo e beneficio quando comparado a métodos cromatográficos acoplados a

espectrômetros de massa.

A CLAE exige um pré-tratamento das amostras por extração liquido-liquido ou

extração em fase solida. Devido ao menor e a boa qualidade dos resultados obtidos

com extração liquido-liquido, foi empregado diclorometano como solvente de

extração.

Quando aplicado a amostras a amostras reais foi possível diferenciar as amostras

de indivíduos não expostos de indivíduos expostos ao tabaco, seja por exposição

ambiental ou habito tabágico.

5. Conclusão:

A cromatografia líquida de alta eficiência é um dos mais modernos métodos

cromatográficos, que se destaca entre os demais devido ao fato de ser capaz de

quantificar uma ampla variedade de compostos que, por exemplo, não poderiam ser

analisados utilizando a cromatografia gasosa, devido ao fato de que estes necessitam

apenas ser solúveis na fase móvel, o que o torna de fato extremamente vantajoso na

análise de alimentos. Ela vem sendo aprimorada com o passar dos anos a fim de se

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tornar um método cada vez mais eficaz na separação e quantificação de compostos.

Seus equipamentos são de alto custo, mas se for levado em consideração à quantidade

de análises que se pode efetuar, é um investimento que trás retorno, sendo assim seu

emprego em vários laboratórios vem se tornando indispensável.

6. REFERECIAS BIBLIOGRAFICAS: ( é so a do artigo)

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