UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS

DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer,

Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência.

• De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.

• Teste qualitativo/semi-quantitativo.

• Método de alta sensibilidade e alta especificidade.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o FLUOROCROMOS:

• Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.

• 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos.

• Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o FLUOROCROMOS:

• São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência.

• Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:

• A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).

• Para deixar passar somente a emissão

secundária desejada, devem-se utilizar filtros

apropriados dependendo da cor

do fluorocromo.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

DIRETA INDIRETA

Detecção de Ag Detecção de AcDetecção de Ag

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o TIPOS DE REAÇÃO:

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

O anticorpo não ligado é removido por lavagens.

O preparado é observado em microscópio de fluorescência.

Y YY

YY

Y

YAntígeno pesquisado

Conjugado

o VANTAGENS

• Alta especificidade e sensibilidade

• Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.

o DESVANTAGENS

• Alto custo do microscópio de fluorescência

• Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou localizar

• Subjetividade da leitura

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

o APLICAÇÕES

• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

• Em bacteriologia, um dos poucos métodos de IFD ainda usados em laboratória clínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo.

Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente.

O preparado é observado em microscópio de fluorescência.

YY YYYYA preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal.

Y Y YYAntígeno pesquisado

Conjugado

Anticorpo Monoclonal

YY

Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS

Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados.

O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo.

A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência.

YYY Y YYYY YY

Antígeno padronizado

Conjugado

Anticorpo pesquisado

YY

o VANTAGENS• Sensibilidade

• Especificidade

• Reprodutibilidade

• De simples padronização e execução

• O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes

• Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos

o DESVANTAGENS• Necessidade de microscópio de fluorescência

• Subjetividade na leitura

• Não-automação

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

o APLICAÇÕES

• Medicina humana

• Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.

• Medicina Veterinária

• Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo

gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à

necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação.

CONSIDERAÇÕES FINAIS