Apoio:

I Simpósio de Biotecnologia Ambiental e III Encontro de Graduandos e Pós-Graduandos em Biotecnologia

MISSÃO

O 1º Simpósio de Biotecnologia Ambiental & III Encontro de Graduandos e Pós-Graduandos de Biotecnologia apresentou uma visão geral das potencialidades inovadoras da biotecnologia no Brasil, enfatizando e disseminando a multidisplinaridade da biotecnologia por meio de palestras e sessões coordenadas. As aplicações atuais e futuras da biotecnologia em diferentes setores como na agricultura, indústria, medicina, meio ambiente e no desenvolvimento de novos produtos serão mostradas pela divulgação dos resultados que estão sendo obtidos em pesquisas, desenvolvidas por órgãos especializados e nas IES com projetos de iniciação científica, especialização, mestrado e doutorado. O objetivo deste evento também será promover uma interface para favorecer o contato dos participantes com pesquisadores de diversas instituições, bem como com profissionais de diferentes segmentos na área biotecnológica, visando o intercâmbio, a expansão do conhecimento e de experiências referentes a metodologias para desenvolvimento de novas pesquisas na área. Os participantes de universidades públicas ou particulares do Paraná e de diferentes estados do Brasil tiveram, a oportunidade de discutir o campo de atuação de profissionais da área de Biotecnologia.

Responsável pelo evento:

Profa. Dra. Claudete Aparecida Mangolin (UEM) – Coordenadora do Evento e Coordenadora do curso de Tecnologia em Biotecnologia.

Equipe Organizadora:

Profa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki (UEM)

Profa. Dra. Satiko Nanya (UEM)

Profa. Dra. Luciana Andréia Borin de Carvalho (UEM)

Comissão Científica:

Profa. Dra. Claudete Aparecida Mangolin (UEM)

Profa. Dra. Ana Luiza de Brito Portela Castro (UEM)

Profa. Dra. Liriana Belizário Cantagalli (UEM) Profa. Dra. Eliane Papa Ambrosio Albuquerque (UEM) Profa. Dra. Michele Cristina Heck (UEM)

Apoio:

Comissão Organizadora:

Pós-graduandos dos cursos de Genética e Melhoramento (PGM) e da Biotecnologia

Ambiental (PBA)

Adrieli Rodrigues da Costa Nunes

Ana Clara de Sousa Meirelles

Andrea Florindo das Neves

Daiani Rodrigues Moreira

Danuza Kelly Strioto

Franciele

Julio Cesar Polonio

Katlin Fernanda de Araujo

Naiara Climas Pereira

Raquel Barel Matos

Tamiris de Oliveira Diniz

Vanessa Neves de Azevedo Fernandes

Secretaria: Merci Mikie Inazava

Analista de informática: Norma Kiyoko Murace Derissio

Instituição: Universidade Estadual de Maringá (UEM). Av. Colombo, 5790 – Maringá, PR

Apoio:

PROGRAMAÇÃO DO EVENTO

23/11/2016 19:00 – 20:00 horas – Entrega de Material aos participantes. 20:00 - 21:00 horas – Sessão de abertura do evento 21:00 – 21:50 horas - Palestra 1: Prof. Msc. Thiago Yuiti Castilho Massuda (Chefe da Divisão de Laboratórios da Polícia Científica do Paraná) Palestra: Genética Forense Prof. MscThiago Yuiti Castilho Massuda é graduado em Biomedicina e Mestre em Patologia Experimental pela Universidade Estadual de Londrina. Especialista em Criminalística pela Universidade de Guarulhos. Atualmente é Doutorando em genética pela UFPR e Perito Oficial da Polícia Científica do Paraná, onde atua como Chefe da Divisão de laboratórios. Professor do Curso de Biomedicina da FACEAR e da UNIBRASIL, professor dos cursos de pós-graduação em Análises Clínicas do IBPEX, Ciências Forenses da Universidade Tuiutí do Paraná. É Coordenador do Curso de Pós-graduação em Biologia, Genética e Toxicologia Forense do Instituto Equilibra. Membro efetivo do Comitê de Ética da FACEAR. 21:50 – 22:00 horas - Coffee Break 22:00 – 23:00 – Palestra 2: Dr. Antonio Luiz Cerdeira – (EMBRAPA Meio Ambiente) Palestra: Plantas Transgênicas Resistentes a Herbicidas e Meio Ambiente Dr. Antonio Luiz Cerdeira, é agronomo e possui doutorado em Biochemistry pela Mississippi State University. Atualmente é pesquisador da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA). Tem experiência na área de Agronomia, com ênfase em Defesa Fitossanitária, atuando principalmente nos seguintes temas: Herbicidas e Meio Ambiente, Água, Plantas Transgênicas Resistentes a Herbicidas.

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24/11/2016

Sessão coordenada

Mediadora: Profa. Dra. Luciana Andréia Borin de Carvalho.

19:00 – 21:45 horas

Palestra 1:

Prof. Dr. Vinicius Farias Campos – (UFPel)

Palestra: Biotecnologia e Genômica Aplicada à Aquicultura: Inovação e

Sustentabilidade

Prof. Dr. Vinicius Farias Campos - Biólogo e Doutor em Biotecnologia pela Universidade

Federal de Pelotas (UFPel). Professor da UFPel no curso de Graduação em

Biotecnologia e orientador dos Programas de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB)

e Bioquímica e Bioprospecção (PPGBBio) da UFPel.

Palestra 2:Prof. Dr. Anderson Luís Alves – (EMBRAPA)

Palestra: Biotecnologia na Produção de Peixes Nativos

Prof. Dr. Anderson Luís Alves - Graduado em Ciências Biológicas pela Universidade

Estadual de Maringá e doutor em Ciências Biológicas (Genética) pela Universidade

Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP. Pesquisador A da EMBRAPA e

orientador no Programa de Pós-Graduação em Ecologia de Ecótonos da Universidade

Federal do Tocantins (UFT).

Palestra 3:

Prof. Dr. Sidinei Magela Thomaz – (UEM)

Palestra: Macrófitas Aquáticas como Bioindicadores da Qualidade Ambiental Prof. Dr. Sidinei Magela Thomaz - graduado em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de São Carlos e doutor em Ecologia pela UFSCar. Professor da Universidade Estadual de Maringá, credenciado no Progrma de pós-graduação em Ecologia de Ambientes Aquáticos Continentais, no Progrma de Pós-Graduação em Biologia Comparada (UEM) e no Progrma de pós-graduação em Ecologia e Recursos Naturais (UFSCar). 21:30 – 21:45 horas - Discussões com a Plenária 21:45 horas - Coffee Break 21:45 – 23:00 horas - Sessão de Painéis

Apoio:

25/11/2016 19:00 – 20:10 horas Palestra 1: Profa. Dra. Carla Porto da Silva (UEM) Palestra: Mapeamento Tridimensional da Diversidade Metabólica e Microbiana da Pele Humana Profa. Dra. Carla Porto da Silva graduada pela Universidade Federal de Santa Maria,

Doutora em Ciências pela Unicamp, onde avaliou o potencial enzimático da microbiota da

pele humana e sua ação sobre ingredientes de fragrâncias. Trabalhou por 8 anos como

Pesquisadora na Natura, na Diretoria de Ciência e Tecnologia onde atuou no

desenvolvimento de novos ingredientes para fragrâncias, ingredientes naturais e

biotecnológicos para formulações cosméticas. Recentemente, ela realizou um estágio de

pós-doutoramento na Universidade da Califórnia em San Diego nas áreas de Biologia de

Sistemas e metabolômica, onde realizou um estudo do ecossistema da pele humana

usando ferramentas avançadas de espectrometria de massas e bioinformática.Tem

experiência nas áreas de Química dos Produtos Naturais, Biocatálise, Metabolômica,

Espectrometria de Massas.

20:10 - 20:50 horas Palestra 2: MSc. Valério Américo Balani (Diretor Executivo do Aliança Biotecnologia Ltda) Palestra: Soluções em Diagnósticos Moleculares MSc. Valério Américo Balani possui graduação em Ciências Biológicas com Ênfase em

Biotecnologia, é mestre em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá.

Atualmente é Diretor Executivo da Aliança Biotecnologia Ltda. Tem experiência na área

de Bioquímica, com ênfase em Biologia Molecular.

20:50 – 21:30 horas Palestra 3: Prof. Titular Rafael Campos Bezerra (UEM) Palestra: Transplante: Muitas Vezes a Única forma de Salvar

Prof. Titular Rafael Campos Bezerra é graduado em Farmácia e mestrado em Biologia

(Imunologia) pela Universidade Estadual de Campinas. Atualmente é professor titular da

Universidade Estadual de Maringá. Tem experiência na área de Imunologia, com ênfase

em Imunogenética.

21:30 – 21:50 horas - Coffee Break

Apoio:

21:50 – 22:50 horas – Palestra 4: Prof. Dr. Marcos Pileggi – (UEPG) Palestra: Diversidade e Prospecção Biotecnológica de Endófitos.

Prof. Dr. Marcos Pileggi é graduado em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual

de São Carlos, é mestre pela Universidade Federal do Paraná e possui doutorado pela

Universidade Federal do Paraná Ohio State University. Possui pós-doutorado pela

University of Minnesota. É livre docente na Universidade Estadual de Ponta Grossa.

Atualmente é professor Associado nível C da Universidade Estadual de Ponta Grossa.

Atua nos Programas de pós-graduação em Biologia Evolutiva – UEPG e Biotecnologia

Ambiental – PBA – UEM. Tem experiência na área da Microbiologia, com ênfase em

Microbiologia Ambiental, atuando principalmente nos seguintes temas: biorremediação e

biodegradação de herbicidas, alterações em estrutura de microbiotas de solo e

ambientes aquáticos, identificação e caracterização molecular de linhagens bacterianas

de solo e água.

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RESUMOS

Área: Biotecnologia Geral

1-

ESTUDO SOBRE OS INCENTIVOS FISCAIS NA LEI DO BEM: COMO USAR EM PROJETOS PESQUISAS NAS EMPRESAS DE SEGMENTO

BIOTECNOLÓGICO

Clenivaldo Pires da Silva1*; Simone Letícia R. Sanches2; Diogo Luís do Anjos2

1Faculdade Metropolitana de Maringá. 2Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: clenivaldo2015@gmail.com.

A biotecnologia (bio – vida, tecnos – uso da “ciência”, logos – conhecimento), representa um corpo de conhecimentos e técnicas que usam seres vivos em um processo produtivo particular, e está presente no cotidiano da vida do homem desde a antiguidade. Contudo, na última década surgiram novas empresas que são dedicadas à Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (P, D&I), que tem o seu foco na consolidada biotecnologia moderna. A Lei do Bem (Lei nº 11.196/2005, cap. III, art. 17 a 26), possui a finalidade de promover a inovação tecnológica no país, entre estes, o da biotecnologia, o qual inclusive integra as áreas estratégicas de crescimento segundo o Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (MCTI). O presente estudo tem como objetivo identificar a partir do último Relatório Anual de Benefícios Fiscais da Lei do Bem (ano base 2014), quais são as empresas de base biotecnológica que foram beneficiadas, traçar um perfil simplificando do segmento, e demonstrar quais as vantagens dos incentivos fiscais da Lei do Bem

em novos empreendimentos de P, D&I. Neste estudo apresentamos uma análise das 1.206 empresas beneficiada pelo incentivo fiscal, na qual foram agrupados por setores de atividade

econômica (CNAE). Em seguida, foram isoladas as empresas de interesse, por áreas setoriais (saúde humana, agropecuária, industrial e ambiental), conforme o Decreto nº 6.41/2016 (art. 01, § 1). Para identificar, foi realizado buscas em anúncio, revista e sítio web, a citação do uso de técnicas de biotecnologia em processos de produção. Ao final, apenas 1% (18 empresas), declaram ser biotecnológicas. Após, foi montado um perfil das empresas com as seguintes variáveis: Biotecnologia Aplicada, Média de Idades, Distribuição Regional e os Incentivos Fiscais. O estudo aponta que as empresas do tipo Biotecnologia Verde são as dominantes (50%). Sendo que a maior concentração das empresas biotecnológicas se encontra na região sudeste e sul (78%). A maioria iniciou as suas atividades mais de 15 anos no Brasil, e sendo em maioria de capital estrangeiro. No entanto, a variável de incentivos fiscais, foi simulada hipótese em base das informações coletadas anteriormente, que demonstrou a possibilidade recuperação de 13,40% (R$ 160.800,00) do investimento inicial de R$ 1.200.000,00 reais, através de renúncias fiscais, como exemplo: Alíquota zero de IRRF “Imposto de Renda Retido na Fonte” em remessa de registro e patentes ao exterior, Redução de 50% do IPI “Imposto sobre produto industrializados” na compra de novos equipamentos, etc. O presente trabalho não foi somente averiguar a existência do setor biotecnologia no Brasil, mas propor uma discussão no uso dos benefícios fiscais em projetos de pesquisa. Apesar da Lei do Bem ainda ser desconhecida por muitos, tem na sua essência a geração de novas riquezas, principalmente ativos de propriedades intelectuais, que o país tanto necessita. Palavras-chave: Renúncia fiscal. Capacidade inovativa. Biociências.

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Área: Biotecnologia Ambiental

2-

SELEÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DA PLANTA MEDICINAL Mikania glomerata (Spreng.) COM POTENCIAL DE

DESCOLORAÇÃO PARA O CORANTE TÊXTIL AZUL REATIVO 19.

Elisângela Maria Gonçalves Santos Rocha1; Julio Cesar Polonio1; Verci Alves de Oliveira

Junior 1; Adriana Garcia2; Cíntia Zani Fávaro¹; João Lúcio Azevedo3; João Alencar

Pamphile1*

1Universidade Estadual de Maringá - UEM. 2Programa de Pós-Graduação em Física, Universidade Estadual de Maringá - UEM 3Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – ESALQ/USP. *E-mail do autor para correspondência: prof.pamphile@gmail.com

O ecossistema aquático sofre uma grande degradação devido aos efluentes industriais, os quais correspondem a mais de 700 mil toneladas de 10 mil tipos de corantes e pigmentos produzidos anualmente em todo o planeta. A poluição de corpos de água com estes compostos provoca, além da poluição visual, alteração em ciclos biológicos e afeta principalmente o processo de fotossíntese. Com isso, a possibilidade de um tratamento com micro-organismos tem sido uma alternativa por promover a remoção de efluentes com um custo reduzido. Os micro-organismos endofíticos estabelecem uma intrínseca relação com suas plantas hospedeiras, exercendo diversas funções essenciais aos vegetais. Consequentemente, este micro-habitat se torna um grande nicho de exploração biotecnológica devido ao potencial genético destes micro-organismos, como por exemplo, na descoloração dos corantes de efluentes de indústrias têxteis. Diante dessa problemática ambiental, objetivamos neste estudo a avaliação do potencial de micro-organismos endofíticos isolados da planta medicinal Mikania glomerata Spreng. (Asteraceae), no processo de descoloração do corante têxtil Azul reativo 19. Foram testadas 28 linhagens de fungos endofíticos em meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA) acrescidos de 0,1g.L-1 de corante azul reativo 19, dos quais 14 linhagens obtiveram resultados positivos. Estas linhagens foram testadas em Meio Mínimo com e sem glicose, acrescidos de 0,1 g.L-1 do corante têxtil. A linhagem G-51 apresentou descoloração total em apenas 7 dias em todos os tratamentos. Destaca-se a sua atividade de descoloração quando inoculada em meio mínimo na ausência de glicose, o que indica que o fungo pode estar utilizando o corante como fonte de carbono. São necessários futuros estudos com a finalidade de identificação taxonômica e de análises químicas para maiores informações sobre a atividade desta linhagem. Palavras-chave: Corantes Têxteis; Endófitos; Atividade de descoloração.

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3-

UTILIZAÇÃO in vitro DO FUNGO ENDOFÍTICO G51 NA AVALIAÇÃO DO

POTENCIAL DE DESCOLORAÇÃO DOS CORANTES TÊXTEIS AZUL E

PRETO EM MEIO LÍQUIDO

Verci Alves de Oliveira Junior 1; Adriana Garcia 2; Julio Cesar Polonio1; Thais Oliveira Chaves1; Raquel Dosciatti Bini 2; Luiz Fernando Cótica 2; Ivair Aparecido dos Santos 2;

João Alencar Pamphile 1*

1Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular – DBC , Universidade Estadual de Maringá – UEM – Maringá. 2 Departamento de Física, Programa de Pós-Graduação em Física, Universidade Estadual de Maringá – UEM – Maringá. *prof.pamphile@gmail.com Microrganismos endofíticos são aqueles que vivem no interior de plantas, em tecidos como raízes caules e folhas, entre outros, sem causar aparentemente qualquer dano aos seus hospedeiros. Eles distinguem-se dos patogênicos, que causam doenças nas plantas, e dos epifíticos que vivem na superfície dos vegetais. Fungos endofíticos tem se mostrado capazes de produzir substâncias de interesse biotecnológico, entre elas algumas enzimas que possuem aplicações em processos industriais. Destacam-se também os processos de biorremediação utilizando-se microrganismos com a finalidade de minimizar danos ambientais gerados, por exemplo, por corantes têxteis. Contaminação ambiental por compostos tóxicos é um dos maiores problemas enfrentados em todo o mundo, esses poluentes incluindo corantes têxteis se tornam uma ameaça à saúde e ao ecossistema, devido aos processos industriais e também a quantidade produzida de resíduos que é muito grande. Os corantes sintéticos são poluentes químicos que se originam principalmente de indústrias têxteis e são substâncias químicas persistentes. A preocupação com a qualidade do ambiente reforça a necessidade de buscar novas alternativas eficazes e viáveis economicamente de descontaminação e descoloração dos efluentes, utilizando métodos ecologicamente corretos. A biorremediação é o processo de tratamento que utiliza a ocorrência natural de microrganismos para degradar substâncias tóxicas, transformando-as em substâncias menos ou não tóxicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial do fungo endofítico G51 isolado de folhas do Guaco (Mikania glomerata) na descoloração dos corantes têxteis Reativo Preto 5 e o corante Têxtil Reativo Azul 19. O fungo endofítico foi cultivado em caldo Batata-Dextrose (BD), posteriormente ele foi adicionado em erlenmeyers contendo meio BD com 0,1 g.L-1 de cada corante. Foi avaliado por 30 dias em espectrofotômetro com o comprimento de onda específico para cada corante. De acordo com as análises dos resultados obtidos no período de 30 dias, nos intervalos de 1, 3, 7, 10, 15, 20, 25, 30 dias, para o corante preto, o maior percentual de descoloração foi de 99% com 25 dias, já para o corante azul foi de 96% em 20 dias. O fungo avaliado mostrou resultados promissores para a descoloração de corantes têxteis. Estudos futuros poderão indicar com maior precisão o potencial biorremediador dessa linhagem. Palavras-chave: Fungo endofítico; Corantes têxteis; Biorremediação.

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4-

DESENVOLVIMENTO DE NANOBIOCOMPÓSITOS UTILIZANDO O FUNGO ENDOFÍTICO Paecilomyces sp. COM ATIVIDADE NA DESCOLORAÇÃO DO CORANTE TÊXTIL REATIVO PRETO 5

Adriana Garcia 2*; Verci Alves de Oliveira Junior1; Raquel Dosciatti Bini 2 ; Julio Cesar

Polonio1; Thais Oliveira Chaves1; Ivair Aparecido dos Santos 2; João Alencar Pamphile1; Luiz Fernando Cótica 2

1Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular – DBC, Universidade Estadual de

Maringá – UEM – Maringá. 2Departamento de Física, Programa de Pós-Graduação em Física,

Universidade Estadual de Maringá – UEM – Maringá. *E-mail do autor para correspondência:

adrianagarcia.biologa@gmail.com

A contaminação ambiental por compostos tóxicos é um dos maiores problemas enfrentados em todo mundo. Esses poluentes incluindo corantes têxteis se tornaram uma ameaça a saúde e ao ecossistema, devido aos processos industriais e também a quantidade muito grande de resíduos produzidos. Os corantes sintéticos são poluentes químicos, que se originam principalmente de indústrias têxteis, são substâncias químicas persistentes. A busca por novas técnicas como métodos alternativos e mais viáveis economicamente no tratamento de efluentes contendo corantes ainda é intensa. Uma estratégia alternativa é a biorremediação, por meio da qual pode haver uma degradação completa do poluente. Micro-organismos como os fungos filamentosos são muito utilizados no processo de biorremediação. Com o advento da nanotecnologia novas técnicas são propostas para acelerar ou melhorar esse processo de biorremediação por micro-organismos, entre elas a junção de fungos com nanopartículas formando sistemas biológicos únicos chamados nanobiocompósitos (NBC). Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi obter um NBC por meio da interação entre as nanopartículas de óxidos de ferro (Fe3O4) com o fungo endofítico Paecilomyces sp. e avaliar o processo de descoloração do corante têxtil preto utilizando o NBC e o fungo selvagem. O fungo endofítico foi cultivado em caldo Batata-Dextrose modificado (BD), posteriormente o fungo selvagem e o NBC foram adicionados em Erlenmeyers contendo meio BD com 0,1 g.L-1 do corante. O processo e degradação foi avaliado por 30 dias em espectrofotômetro com o comprimento de onda específico para cada corante. Análises via Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foram utilizadas para estudar a formação do NBC. Por meio destas análises foi possível observar as nanopartículas de Fe3O4 na superfície do fungo. A comprovação da existência das nanopartículas na superfície do fungo foi feita por meio da Espectrometria de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS), capaz de identificar diferentes elementos químicos contidos na amostra. Na atividade de descoloração do corante preto tanto o fungo selvagem como o nanobiocompósito tiveram resultados promissores, sendo que os maiores percentuais de descoloração obtidos foram de 84% e de 62%, respectivamente. A utilização desta tecnologia, obtendo um nanobiocompósito para ser utilizado no processo de biorremediação de corantes tem a vantagem de ser removido da água a partir de filtragem magnética. A união de nanopartículas (Fe3O4) com o fungo endofítico Paecilomyces sp. na descontaminação da água com corante industrial pode fornecer alternativas ecológicas sustentáveis no processo de descontaminação da água. Palavras-chave: Nanopartículas (Fe3O4); Fungo endofítico; Biorremediação.

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Área: Biotecnologia Animal

5-

EXPRESSÃO DO mRNA DE HSPs EM Apis mellifera L. (Hymenoptera:

Apidae) CONTAMINADAS COM UM NEONICOTINOIDE

Katlin Fernanda de Araujo1*; Juliana Mosconi Magro1; Daiani Rodrigues Moreira1; Fabiana

Castelani Andreotti1; Eliane Gasparino2; Maria Claudia Colla Ruvolo-Takasusuki3

1Departamento Agronomia, 2Departamento de Zootecnia, 3Departamento Biotecnologia, Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá (UEM), Av. Colombo, 5790, CEP 87020-900, Maringá, PR, Brasil. *E-mail do autor para correspondência: katlin_pink@hotmail.com).

A expansão agrícola no Brasil está diretamente ligada à ampla disponibilidade de terras, que permite expandir a produção rapidamente, ao mesmo tempo em que exerce forte pressão sobre o meio ambiente e difundi o uso de agroquímicos. As abelhas não são insetos alvos das aplicações de pesticidas, entretanto normalmente entram em contato quando efetivam coletas de pólen e néctar das flores de culturas agrícolas e resinas de plantas expostas a estes agroquímicos. Os principais inseticidas de ação neurotóxica são dos grupos dos carbamatos, oganofosforados, piretroides e os neonicotinoides. O thiamethoxam é um neonicotinoide de ação sistêmica, que dificulta a ação da acetilcolinesterase e consequentemente causa super estimulação com tremores e paralisia. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi realizar a análise de toxicidade do princípio ativo do thiamethoxam através da expressão do mRNA das HSPs 70 e 90 após intoxicação por contato de operárias adultas de A. mellifera. As operárias foram coletadas no apiário da fazenda experimental da UEM e transportadas até o laboratório de genética animal, onde foram realizados os bioensaios em triplicata com a concentração subletal de 0,000426 g i.a/ ml e 0 g i. a/ml para o controle. Vinte operárias foram submetidas ao tratamento que disponibilizava o alimento Cândi, água e um papel filtro embebido em 1mL de solução do principio ativo do inseticida e papel filtro com apenas 1 ml de solução água/acetonitrila para o controle. O experimento foi mantido por 24 horas em Câmara BOD. Após este período de contato com o inseticida, as abelhas mortas foram descartadas e as vivas foram utilizadas para a extração do RNA total que foi extraído usando TRIzol® (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante (1 ml/ 100 mg de tecido). O DNA complementar foi sintetizado utilizando o Kit SuperScript™ (Invitrogen) e a reação de PCR em tempo real foram conduzidas no equipamento StepOnePlus™. As análises estatísticas foram realizadas a partir do método 2-Δct através do procedimento GENMOD do SAS (SAS Institute, Inc.) e as médias de expressão gênica comparadas por contrastes utilizando-se o teste de T de Student (P<0,05). Os resultados de expressão do mRNA das HSPs de A. mellifera expostas ao thiamethoxam, quando comparadas entre a concentração e o controle mostrou-se significativa, apresentando um valor de T = 0.0387 (HSP70) e T= 0.0012 (HSP90). Esta expressão significativa pode estar relacionada ao mecanismo de defesa do inseto, em concentrações subletais do neonicotinoide o inseto detecta a presença do inseticida thiamethoxam e aciona algum sistema metabólico capaz de detoxificar o organismo da abelha. Entretanto são necessários estudos aprofundados sobre o metabolismo do inseto submetido ao thiamethoxam para contribuir com resultados já expostos deste inseticida. Palavras-chave: Expressão gênica; Abelhas; Thiamethoxam. Agradecimentos: Capes e PGM.

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6- PERFIL DE ESTERASES EM OVOS DE Diatraea saccharalis

(LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE)

Daniele Araujo Canazart1*; Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli1; Samantha Godoy1; Daiani Rodrigues Moreira1; Maria Claudia Colla RuvoloTakasusuki1; Helio Conte1.

1Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular. *E-mail do autor para correspondência: danycanazart@hotmail.com Diatraea saccharalis Fabr., 1794 (Lepidoptera: Cambridae) conhecida como broca da cana-de-açúcar, é um inseto holometábolo. A postura dos ovos ocorre sobre as folhas da cana e, após eclosão, as larvas abrem galerias no interior do colmo resultando na redução do fluxo de seiva, secamento, morte das gemas apicais, enraizamento aéreo, aumentando a susceptibilidade ao acamamento por ação de intempéries climáticas. Além disso, essas aberturas favorecem a penetração de microrganismos fitopatogênicos como os fungos, que invertem o açúcar ou contaminam o caldo, comprometendo a produção sucroalcooleira. O emprego de inseticidas químicos é o método mais utilizado no controle desta praga, o uso intensivo destes compostos altera a expressão ou atividade de enzimas de detoxificação metabólica, tais como as esterases. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar o padrão das esterases em ovos de D. saccharalis. Para tanto, aproximadamente 15 casais de insetos adultos foram mantidos em câmara de acasalamento e lotes contendo 15 ovos foram coletados 24, 48 e 72 horas após a oviposição, congelados em tampão de extração e submetidos a eletroforese vertical em gel de poliacrilamida a 10%.O sistema PAGE permitiu a identificação das esterases EST-6, 8, 9, 10 e 11 atribuídas a expressão de 5 locos gênicos. De acordo com a especificidade aos substratos, EST-6, 9, 10 e 11 foram classificadas como α-esterases, e, a EST-8, como β-esterase. O padrão de bandas permitiu determinar que EST-6, 8, 10 e 11 são monoméricas, e, EST-9, uma enzima de estrutura dimérica. Em relação às diferentes idades, podemos observar que EST-6, 8 e 11 são expressas em ovos de 24, 48 e 72 horas. Contudo, EST-10 aparentemente expressa em ovos de 24 e 72 horas, não aparece em ovos de 48 horas. Da mesma forma, a EST-9, não é expressa em todas as amostras analisadas, e, predominam em poucos lotes de ovos com 48 e 72 horas. O padrão de expressão diferencial observado em ovos de diferentes idades, bem como, as variações observadas entre lotes de ovos da mesma idade, indicam a existência de mecanismos regulatórios que aumentam ou inibem expressão das esterases, mediante as funções metabólicas que elas desempenham durante desenvolvimento embrionário nos diferentes períodos. Além disso, esses dados preliminares serão necessários para monitorarmos o desenvolvimento de resistência mediado por essas isoenzimas e, avaliarmos a efetividade de diferentes compostos no controle da broca da cana, ainda no estágio de ovos, para minimizarmos os danos causados a cultura e os prejuízos da infestação a agroindústria brasileira. Palavras-chave: Inseto praga; cana de açúcar; isoenzimas.

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7- EFEITO DO EXTRATO OLEOSO DE ALHO, Allium sativum

(LILIACEAE), EM OVOS DA DIATRAEA SACCHARALIS (Fabricius, 1794) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE)

Daniele Araujo Canazart*; Larissa Carla Lauer Schneider; Samantha Godoy; Adriana

Aparecida Sinópolis Gigliolli; Richard Henrique Siebra Bergamo; Hélio Conte.

Universidade Estadual de Maringá*E-mail do autor para correspondência: danycanazart@hotmail.com.

Diatraea saccharalis Fabr. 1794 (Lepidoptera: Cambridae), é a principal praga da cultura de cana de açúcar. As lagartas recém eclodidas causam prejuízos diretos pois alimentam-se, inicialmente, das folhas para depois penetrar pelas partes mais moles do colmo. Abrem galerias de baixo para cima, que podem ser longitudinais ou transversais, causando perda de massa da cana-de-açúcar e possíveis tombamentos pela ação dos ventos o que provoca danos econômicos à lavoura. Considerando os danos causados na agricultura canavieira, e a utilização indiscriminada dos agrotóxicos, os bioinseticidas são utilizados como alternativa eficaz no controle biológico. Inseticidas botânicos são compostos resultantes do metabolismo secundário das plantas, que compõem a própria defesa química contra os insetos herbívoros. Os princípios ativos inseticidas podem derivar de toda a planta ou partes dela. O óleo de alho Allium sativum (Liliaceae) é um bioinseticida utilizado no controle biológico de diversos insetos-pragas. Sua composição inclui óleos essenciais, carboidratos, proteínas, sais minerais e vitaminas. A parte mais utilizada do vegetal é o bulbo, pelo fato de conter grande quantidade dos constituintes ativos. O objetivo do presente estudo foi analisar o efeito do extrato de óleo de alho na viabilidade de ovos da D. saccharalis em diferentes estágios do seu desenvolvimento embrionário. Aproximadamente 15 casais de mariposas adultas foram colocadas em câmaras de acasalamento revestidas com lamínulas de vidro; após 12 horas de oviposição os ovos eram retirados e separados em 24h, 48h e 72h. Posteriormente mergulhados durante um minuto e meio em soluções de extrato de óleo de alho contendo concentrações de 0,1%, 0,5% e 1,0%. Na sequência permaneciam em caixas plásticas forradas com papel absorvente contendo algodão umedecido com água destilada para manter a umidade. As análises foram realizadas em microscopia de luz e documentadas com câmera digital. Foi possível observar que ovos da D. saccharalis nas idades de 24h, 48h e 72 horas, submetidos as concentrações de 0,1%, 0,5% e 1,0%, apresentaram anomalias semelhantes na sua morfologia externa. As alterações morfológicas encontradas no ovo de D. saccharalis, foram pontuações pretas no córion (membrana que envolve o ovo), redução no tamanho do embrião, córion rompido, atraso no desenvolvimento embrionário havendo um retardo na eclosão e no ciclo de vida do inseto. Os resultados obtidos permitem concluir que o efeito do óleo de alho em ovos da D. saccharalis, além de retardar o desenvolvimento embrionário, diminuiu a longevidade do inseto-praga pois larvas de primeiro instar não progrediam no desenvolvimento demonstrando a eficiência do óleo de alho no controle da D. saccharalis. No entanto, mais estudos devem ser realizados para confirmar a utilização do extrato de óleo de alho nas diferentes fases de vida do inseto praga. Palavras chaves: Controle biológico, bioinseticida, cana-de-açúcar.

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8- EFEITO DA ALIMENTAÇÃO COMPLEMENTAR COM CAFEÍNA NO FORRAGEAMENTO DE Tetragonisca angustula (Latreille, 1811)

Francieli das Chagas1*; Fabiana Castelani Andreotti1; Diogo Rossoni1; Vagner Alencar Arnaut de Toledo1; Maria Claudia Colla Ruvolo-Takasusuki1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: franci_chagas@hotmail.com

A alimentação complementar pode ser fornecida em períodos de baixa florada visando estimular o crescimento e reprodução da colônia no início da primavera. A cafeína presente no néctar floral de diversas plantas tem promovido o aumento do forrageamento e recrutamento de operárias da espécie Apis mellifera. É possível que os diferentes efeitos desse composto sobre o comportamento das abelhas estejam relacionados com sua concentração disponível na flor. Assim, a cafeína tem sido utilizada na suplementação alimentar de A. mellifera para aumentar a produção de mel. Novas técnicas utilizadas para a apicultura podem ser aplicáveis à meliponicultura para promover melhorias na produtividade e longevidade das colmeias de T. angustula. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da cafeína fornecida na alimentação complementar de T. angustula a partir da contagem de abelhas que saíram do ninho para o forrageamento. Foram utilizadas cinco caixas racionais da espécie T. angustula, a alimentação complementar foi preparada utilizando como base o cândi e fornecida à vontade nas caixas denominadas T4 que receberam 2,5 g de cândi puro, enquanto as caixas T1, T2 e T3 receberam 2,5 g de cândi contendo 0,0113; 0,0226 e 0,0339mM de cafeína, respectivamente. A caixa T5 não recebeu alimentação complementar. A contagem foi realizada com um contador digital durante 50 dias no período entre Abril e Maio de 2015, temperatura média de 20,15 ºC. Nos tratamentos T1, T2 e T3 os valores de forrageamento foram próximos entre si e inferiores ao dos controles T4 e T5. As colmeias T4 e T5 também apresentaram maior variação individual intra-colônial para o forrageamento do que as operárias das colmeias tratadas com cafeína. O decréscimo do forrageamento em T1, T2 e T3 foi observado após o fornecimento da alimentação complementar com cafeína, incluindo a perda de vigor da caixa T2 (0,0226 mM), falência de T3 (0,0339mM) e T1 (0,0113mM) em Junho de 2015. Possivelmente, a redução do forrageamento tenha sido influenciada pelo complemento alimentar contendo cafeína, pois nas colmeias controle T4 e T5 foi observado a realização de atividades externas, além do aumento de cria disponibilizando forrageadoras para a próxima florada. Estudos sobre os efeitos da cafeína em meliponíneos ainda são escassos. A partir dos dados obtidos no presente estudo é possível sugerir que as diferentes concentrações de cafeína testadas afetaram negativamente o forrageamento de T. angustula seguido da falência das caixas T1 e T3, fator que impede o uso desse composto na alimentação complementar quando se busca melhorias no desempenho da colônia. Palavras-chave: Trimetilxantina; Meliponicultura; Meliponíneos.

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9-

EXPRESSÃO DO GENE MITOCONDRIAL COXIII NO BAÇO DE FRANGOS DE CORTE SUBMETIDOS AO ESTRESSE POR CALOR,

SUPLEMENTADOS COM METIONINA

Daniela Rodrigues Barcos1*; Angélica de Souza Khatlab1; Eliane Gasparino1; Ana Paula Del Vesco2

1Universidade Estadual de Maringá.2Universidade Federal de Sergipe. *E-mail do autor para correspondência: danieladrzag@hotmail.com A conversão alimentar animal está atrelada à eficiência na produção de energia pelo organismo. Estudos demonstram que algumas aves podem apresentar pior capacidade na produção de energia em razão de déficit na função mitocondrial durante a produção de ATP a partir de substratos. Para uma eficiente produção de energia, é necessário que os sistemas da cadeia respiratória estejam funcionando adequadamente. No caso de falhas nesses sistemas pode ocorrer excesso na formação de radicais livres e desta forma, provocar danos em estruturas celulares, como o DNA. Nosso objetivo nesse trabalho foi avaliar a expressão do gene mitocondrial citocromo c oxidase subunidade III (COXIII) no baço de frangos de corte, alimentados com duas dietas, com e sem suplementação de metionina. Foram utilizados frangos de corte machos com 42 dias de idade que receberam água e ração ad libitum. As aves foram abatidas aos 42 dias de idade por deslocamento cervical e tiveram o baço coletado para análises de expressão gênica. Foi verificado efeito significativo entre o ambiente e a suplementação com metionina (P<0,05). Em animais sob conforto térmico, alimentados com dieta suplementada com metionina, houve maior expressão do gene COXIII (0,62 UA), sendo que em animais sob estresse térmico recebendo dieta suplementada com metionina, houve menor expressão do gene COXIII (0,20 UA). A maior expressão desse gene em animais sob conforto térmico mostra que este ambiente é favorável ao desempenho animal por estar relacionado à melhor expressão dos genes da cadeia respiratória, e a suplementação de metionina pode favorecer os mecanismos moleculares envolvidos com o sistema antioxidante no baço de frangos de corte. Esses mecanismos integrados podem melhorar a conversão alimentar, tornando os animais mais eficientes na produção e utilização da energia, o que favorece o desempenho. Palavras chave: eficiência alimentar; genes da cadeia respiratória; radicais livres.

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10-

ANÁLISE MORFOMÉTRICA DE GLÂNDULAS HIPOFARINGEANAS EM ABELHAS Apis mellífera SUBMETIDAS A SUPLEMENTAÇÃO PROTEICA

Fabiana Castelani Andreotti1*; Daiani Rodrigues Moreira1 Franciele Chagas1; Katlin Fernanda Araújo1; Adriana Sinópolis Gigliolli1; Maria Claudia Colla Ruvolo

Takasusuki1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: fabianacast2011@hotmail.com

A geléia real é um dos produtos mais valorizados de colmeias. Por apresentar composição química rica em vitaminas, ácidos orgânicos essenciais, entre outros nutrientes, sendo capaz de proporcionar inúmeros benefícios funcionais à saúde humana. Nesse sentido cada vez mais estudos são direcionados para otimização da produção da geleia, pois é produzida em pequenas quantidades pelas glândulas hipofaringeana e mandibular e cada vez mais sua produção vem sofrendo pela quantidade insuficiente de pólen na natureza, que é a matéria prima da geleia real. O pico de produção dessas glândulas ocorre entre o quinto e vigésimo dias de idade das nutrizes. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo fazer medições de área da glândula hipofaringeana de abelhas tratadas com duas rações proteicas, uma de baixo e outra de alto percentual de proteínas. Assim, quinhentos e quarenta abelhas de mesma origem genética foram colocadas em nove gaiolas, cada uma contendo sessenta indivíduos de um dia de idade. As gaiolas foram distribuídas em dois tratamentos e um controle. O controle, beebread, conhecido como pão da abelha, continha 26,5% de proteína total, o tratamento um, 30% (alto valor), e o dois com baixo valor proteico, 18,76%. Foram coletadas abelhas no sétimo dia de idade e de cada nutriz retirada da gaiola foi feita a dissecção das glândulas hipofaringeanas, sob estereomicroscópio e com solução fisiológica para insetos. Foram estendidas as glândulas sob lâminas histológicas e retiradas as fotos. As fotos foram realizadas com uma medida padrão em mm. A área de cada glândula, previamente registrada pela fotografia, foi mensurada com a ajuda do software ImageJ 1,49v. Que se baseia na medida padrão em mm, informada previamente e calcula a área desejada em mm². Os valores médios mensurados de área das glândulas hipofaringeanas das nutrizes com sete dias mostraram diferenças significativas entre o controle e os tratamentos. Para o controle, as 26 amostras analisadas apresentaram área média de 3,44

mm², com desvio padrão de ±0,721. Já o tratamento 1 com baixo teor de proteínas, as 21

amostras mensuradas apresentaram área média de 2,87 mm² e desvio padrão de ±0,65. O último tratamento, com alto teor de proteínas, apresentou área média de 2,79 mm², nas 30 amostras analisadas, com desvio padrão de ±0,62. De acordo com os resultados obtidos, foram constatadas diferenças significativas entre o controle e os dois tratamentos (F= 2; 75 = 7,039; p= 0,00158**). Não sendo detectadas diferenças entre os dois tratamentos em área glandular (CTLE- Trat1 p= 0,00198**; CTLE- Trat2 p= 0,0160319*; Trat1- Trat2 p= 0,8933416). Mostrando que teores proteicos semelhantes ao pólen são indicados, não sendo detectadas diferenças em área glandular quando esse valor é aumentado. Palavras-chave: área glandular; geleia real; pão da abelha.

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ANÁLISE DA MORTALIDADE E ESTERASES EM ABELHAS SEM FERRÃO Scaptotrigona bipunctata Lepeletier, 1836 (HYMENOPTERA:

APINAE) INTOXICADAS COM ACEFATO

Tamiris de Oliveira Diniz¹*; Naiara Climas Pereira1; Raquel Barel Matos1; Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki1.

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: tamirisc.biologicas@hotmail.com.

As abelhas são agentes polinizadores de diversos cultivares de interesse econômico e também de plantas silvestres. Entretanto, esses insetos estão sendo submetidos a grandes concentrações de inseticidas utilizados nas áreas agrícolas, acarretando alterações comportamentais e muitas vezes levando à morte. O inseticida acefato pertencente ao grupo dos organofosforados, classe II (altamente tóxico) é utilizado em diversas culturas agrícolas. Scaptotrigona bipunctata são abelhas sem ferrão popularmente conhecidas como tubuna. Essa espécie é encontrada em áreas neotropicais com ampla distribuição no Brasil, inclusive no Paraná. Seu mel tem alto valor comercial, incentivando o desenvolvimento de práticas de manejo na meliponicultura. Devido a importância das abelhas sem ferrão para a polinização de áreas de matas nativas e agriculturáveis, é importante avaliar os efeitos do uso de agrotóxicos e potencial declínio desses polinizadores. O objetivo do presente estudo foi examinar a mortalidade e alteração da expressão das isoenzimas esterases em abelhas S. bipunctata após contaminação por ingestão com acefato. Nesse estudo 252 abelhas adultas foram coletadas na entrada de caixa comercial de S. bipunctata. As abelhas foram divididas em seis grupos de 15 indivíduos, mantidas por 72 horas em frascos de vidros fechados com voil e mantidas em câmara de criação (a 28±2°C, UR 70±10% e fotofase de 12h). Após o período de intoxicação as abelhas sobreviventes foram contadas e submetidas a eletroforese PAGE para análise das iosenzimas esterases. A intoxicação por ingestão foi realizada com inseticida comercial acefato misturado a alimento cândi nas concentrações de 1, 1.5, 2, 2.5, 5 e 25 mg i.a./mL. O grupo controle foi alimentado com cândi sem inseticida. O grupo controle apresentou 2% de mortalidade. O grupo de intoxicados apresentou mortalidade em todas as concentrações, nas seguintes proporções: 3%, 1.6%, 4.4%, 1.6%, 4.8% e 4.4% em ordem crescente de concentrações. Os resultados observados mostraram que após a intoxicação por ingestão de S. bipunctata com o inseticida acefato não houve alteração na atividade relativa das esterases quando comparadas com as amostras controle. Apesar de terem sido empregadas concentrações subletais de acefato, há mortalidade de abelhas S. bipunctata, permitindo sugerir que o uso indiscriminado desse inseticida organofosforado pode contribuir com o declínio de populações dessas abelhas sem ferrão. Palavras-chave: Toxicologia genética, organofosforado, declínio de polinizadores

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INTERAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS COM EXTRATO OLEOSO DE NIM (Azadirachta indica A. Juss.) EM CORPORA ALLATA DE Diatraea saccharalis) (Fabr., 1794) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE)

Karina Midori Endo1; Raquel Dosciatti Bini1; Paula Nunes Oliveira1; Luiz Fernando Cótica1; Hélio Conte1

1Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular, Universidade Estadual de Maringá. Maringá, PR, Brasil. Avenida Colombo, 5.790, Jardim Universitário, Bloco H-57. *E-mail do autor para correspondência: karinaendo@gmail.com

A broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis (Fabr., 1794) (Lepidoptera: Crambidae) é o inseto-praga que ocasiona significativa redução da produtividade e qualidade na cultura da cana-de-açúcar. Os corpos alados, corpora allata (CA), são estruturas sólidas compostas por células glandulares secretoras do hormônio juvenil (HJ) que tem a propriedade de suprimir ou controlar a metamorfose até que o crescimento larval seja completado. O conhecimento das funções desempenhadas pelas glândulas endócrinas é importante para a compreensão de diversos processos biológicos. O extrato de Azadirachta indica (nim) é considerado uma alternativa potencial ao controle devido às suas propriedades tóxicas contra pragas e segurança à saúde humana e ao ambiente. As nanopartículas magnéticas (NPMs) são ferramentas tecnológicas que possibilitam desenvolvimento de formulações conjuntas que otimizem a eficácia de agentes botânicos desenvolvendo sistemas integrados de sensoriamento e monitoramento de pragas. O objetivo do trabalho foi avaliar a interação de NPMs com o extrato oleoso de nim em CA das larvas de terceiro instar em D. saccharalis. As larvas foram obtidas de criação própria em laboratório, acondicionadas em placas de petri em dieta artificial e desenvolvidas em BOD (26±1ºC, umidade relativa de 70±10% e foto fase de 14 h). As NPMs foram fornecidas pelo Grupo de Desenvolvimento de Dispositivos Multifuncionais, UEM. O experimento foi dividido em dois grupos, G1 com uso de nim e G2 com nanopartícula magnética pura (NPM), e 6 tratamentos (Controle, N0 5%, N1 5%, NPMControle, NPM0, 5%Nim e NPM1, 5%Nim). Triplicatas (10 lagartas) foram nebulizadas por 20 minutos em cada tratamento. Foram realizadas análises de EDS e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A investigação por MEV em CA do G1 do tratamento controle evidenciou uma superfície irregular, rugosa, provavelmente resultante da eliminação de secreção hormonal. Para N0 5% houve o rompimento e extravasamento do conteúdo interno dos CA, a superfície mostrou-se bem rugosa com depressões mais expressivas. Em N1 5% foi observada a formação de uma fossa sem extravasamento de material interno. No G2, agregados de partículas de diversos tamanhos foram observados no NPMControle e partículas conglomeradas na região glandular supostamente de NPMs. Em NPM 0,5%NIM, a superfície mostrou-se mais lisa, os materiais particulados se aglomeraram muito mais e visualizou-se uma fissura com material particulado. Já em NPM 1,5%Nim, observou-se concentrações destas partículas de diversos tamanhos estendendo-se pela glândula e formação de fossas bem diferenciadas. O EDS evidenciou a presença de 0,01% do elemento ferro, sugerindo a presença de NPMs na glândula. Em conclusão, os estudos mostraram que o nim causa alterações morfológicas mostrando efeitos citotóxicos em CA e que NPMs podem funcionar como marcadores em amostras biológicas. No entanto, são necessários mais estudos que demonstrem a combinação das funções biológicas com as propriedades desejáveis dos dispositivos magnéticos. Palavras-chave: Broca da cana-de-açúcar; corpos alados; nanotecnologia.

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PERFIL ELETROFORÉTICO DE PROTEINAS TOTAIS E ESTERASES DE Nannotrigona testaceicornis E Scaptotrigona depilis

Raquel Barel Matos1*; Naiara Climas Pereira1; Tamiris de Oliveira Diniz1; Maria Claudia Colla Ruvolo-Takasusuki1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: rbmatos2@gmail.com.

As abelhas sem ferrão tem importante papel como polinizadores dos mais variados ecossistemas neotropicais. Além disso, recentemente, tem atraído o interesse dos produtores de mel, visto que o mel por elas produzido é de sabor agradável e preço elevado. Porém, os estudos com tais abelhas são esparsos. O presente trabalho teve como objetivo contribuir com o conhecimento de tal grupo por meio da determinação do perfil eletroforético de duas espécies: Nannotrigona testaceicornis (Lepeletier), popularmente conhecida como iraí e Scaptotrigona depilis (Moure, 1942), conhecida como canudo. N. testaceicornis tem distribuição geográfica que inclui os estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo, sendo que a sua identificação no estado do Paraná está em fase de confirmação. S. depilis é encontrada nos estados de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Paraná, Rio Grande do Sul e São Paulo. Para este estudo foram utilizadas operarias coletadas de ninho na Universidade Estadual de Maringá. Foram realizadas eletroforeses em géis de poliacrilamida para o perfil de esterases e de proteínas totais. Para a eletroforese de esterase foram utilizados géis a 10% e coloração com α e β-naftil e para as proteínas totais foram utilizados géis a 12% e coloração com nitrato de prata. Foi encontrado um loco de esterase para N. testaceicornis, sendo ela uma α-esterase e dois locos para S. depilis, sendo uma α-esterase (de menor tamanho) e uma β-esterase. Nas eletroforeses de proteínas totais foram encontradas 15 regiões no gel para N. testaceicornis e 17 para S. depilis. Para as duas espécies as regiões peptídicas encontradas variaram entre 20 e 220 kDa. A região de maior visibilidade nos géis foi a encontrada na proximidade dos 50 kDa. Não existem muitos estudos para estas espécies, sendo que este é um passo inicial para a caracterização de marcadores moleculares e bioquímicos que podem ser utilizados com diversas finalidades, entre elas o monitoramento do ambiente para a presença de contaminantes e estudos de estrutura de populações. Palavras-chave: Abelhas sem ferrão; proteínas totais; eletroforese.

Apoio financeiro: CNPq, CAPES e Fundação Araucária.

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EFEITO INSETICIDA DO ÓLEO DE ALHO Allium sativum (LILIACEAE) EM LAGARTAS DE PRIMEIRO INSTAR DA Diatraea saccharalis

(Fabricius 1794) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE)

Samantha Godoy1*; Daniele Araújo Canazart1; Gabriel Agostini Tonelli1; Hélio Conte1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: godoy.samy@hotmail.com A broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis Fabr., 1794 (Lepidoptera: Cambridae) é a principal praga da cana-de-açúcar. As lagartas recém-eclodidas se alimentam do parênquima celular das folhas e caminham em direção da bainha da folha. Após a primeira ecdise (troca da pele que permite o desenvolvimento dos insetos), as lagartas penetram pela parte mais tenra do colmo e o perfuram fazendo galerias, tornando-a mais suscetível ao tombamento pela ação do vento e chuvas e favorecendo a penetração de microrganismos fito patogênicos no seu interior. O controle biológico consiste no equilíbrio de plantas e insetos pragas, podendo ser realizado por outros insetos (predadores e parasitoides, por exemplo) ou ainda com inseticidas botânicos. O metabolismo secundário das plantas fornece esses compostos (inseticidas botânicos). O extrato oleoso de alho, Allium sativum (Liliaceae) possui compostos com alto potencial para ser utilizado, dentre estes o dialil-disulfito (alicina) é o principal. A alicina, um composto sulfurado, o que fornece o aroma típico ao alho. A fim de reduzir o uso indiscriminado de agrotóxicos, o objetivo desse trabalho foi aplicar o extrato oleoso de alho em lagartas de primeiro instar da Diatraea saccharalis. Para isso, aproximadamente 15 casais de insetos adultos foram mantidos em câmara de acasalamento e após 12 horas de ovoposição, os lotes de ovos foram coletados, lavados e realocados em caixa plástica contendo dieta artificial, após a eclosão foi borrifado 0,7 mL de solução de alho a 0,5% por cinco minutos e em seguida as lagartas foram colocadas em placas de Petri contendo dieta artificial, sendo analisadas diariamente. Ao acompanhar o desenvolvimento das lagartas, observamos alterações morfológicas, como estrangulamento por não conseguir completar a ecdise, falta de apetite resultando em atraso no ciclo de vida e morte. Os dados obtidos permitiram concluir que a solução à base de alho demonstrou sua eficácia como bioinseticida, causando um atraso no desenvolvimento da Diatraea saccharalis. Porém mais estudos devem ser feitos para averiguar a efetividade do mesmo em todas as etapas do ciclo de vida da praga. Palavras-chave: Bioinseticida; Controle biológico; broca da cana-de-açúcar.

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MORTALIDADE DE Tribolium castaneum (COLEOPTERA: TENEBRIONIDAE) EXPOSTOS AO PIRETRÓIDE DELTAMETRINA

Maria Paula Martins Januário1*; Fernanda Moura Calderón1; Daiani Rodrigues Moreira1; Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli1; Ana Silvia Lapenta1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: mariapaula.mjanuario@gmail.com

A espécie Tribolium castaneum infesta grãos e subprodutos armazenados, gerando perdas qualitativas e quantitativas na produção e, consequentemente, um grande prejuízo econômico para produtores e comerciantes. As condições climáticas e infraestruturas inadequadas de armazenamento principalmente nas pequenas propriedades do nosso país favorecem a rápida disseminação de diferentes pragas em grãos e subprodutos armazenados. Dentre as várias espécies, Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) é de grande importância porque, tem elevado potencial biótico e causa danos aos grãos tanto na fase larval quanto na fase adulta. Desta forma, o controle desse inseto praga é uma das operações mais importantes durante o armazenamento de grãos e alimentos. O método de controle mais utilizado é o químico, porém, o uso intensivo de inseticidas tem contribuído para o desenvolvimento de resistência, por meio de mecanismos fisiológicos, comportamentais e bioquímicos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a taxa de mortalidade e a susceptibilidade de uma linhagem natural de T. castaneum (Lab-S) ao piretróide Deltametrina. Para tanto, as linhagens foram criadas em laboratório a temperatura de 30º ± 2º C no escuro e mantidos em recipientes de vidro contendo farinha de trigo como dieta alimentar. Para os bioensaios, 25 insetos adultos não sexados e sem idade definida foram colocados em uma placa de Petri sobre um papel filtro (150 mm diâmetro) impregnado com concentrações subletais de Deltametrina previamente diluída em água (0,0125 g.i.a/mL, 0,025 g.i.a/mL e 0,05 g.i.a/mL). A mortalidade foi avaliada após 24 h de exposição ao inseticida, sendo considerados mortos apenas os insetos estáticos. O delineamento do experimento ocorreu em triplicatas, totalizando 75 indivíduos por tratamento. O teste de Shapiro-Wilk apresentou W = 0.9033, p-value = 0.1752, confirmando a normalidade dos erros. Já por meio do teste de Bartllet confirmou-se a homogeneidade das variâncias com um Bartlett's K-squared = 7.3599 e p-value = 0.06127. Quando comparados os tratamentos, a análise por Tukey confirmou maior mortalidade (88%) na concentração de 0,05 g.i.a/mL, diferindo e superando os demais. As concentrações 0,025 g.i.a/mL e 0,0125 g.i.a/mL também apresentaram alto nível de mortalidade, 57,33% e 58,66%, respectivamente. O controle não apresentou diferença significativa. Isso é explicado por meio da Correlação de Pearson, que apontou um valor de r=0,761, classificada como moderada positiva, ou seja, existe correlação entre tratamento e mortalidade. Deste modo, pode-se concluir que na medida que os valores das concentrações se elevam a mortalidade consequentemente aumenta. No entanto, diante da possibilidade do desenvolvimento de resistência, os resultados obtidos serão utilizados em estudos futuros, para avaliarmos mecanismos bioquímicos que poderiam comprometer a efetividade do inseticida no controle deste inseto praga. Palavras-chave: T. castaneum; Inseticida; Mortalidade. Apoio: Fundação Araucária.

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CARACTERIZAÇÃO DE ISOENZIMAS ESTERASES EM IMATUROS DE Chrysomya megacephala COM INTERESSE FORENSE

Stefany Rodrigues de Oliveira1*; Ronaldo Roberto Tait Caleffe1; Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli1; Helio Conte1; Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki1

1 Universidade Estadual de Maringá - UEM. *E-mail do autor para correspondência: s.r.oliveira@outlook.com. A Entomologia Forense é o estudo de insetos e outros artrópodos associados a diversas questões criminais. As espécies de Chrysomya são as encontradas com maior frequência em estudos de Entolomologia Forense por serem as pioneiras na colonização. As esterases são isoenzimas presentes em praticamente todos os organismos vivos. Essas enzimas estão relacionadas com o desenvolvimento de insetos, podem ainda, contribuir com a identificação de diferentes espécies. Portanto o objetivo deste trabalho foi comparar o padrão eletroforético de esterases de adultos de Chrysomya megacephala com o de larvas da mesma espécie, com o intuito de observar diferenças do padrão durante os estágios de vida. Os insetos foram obtidos de criação estabelecida no Laboratório de Morfologia de Insetos do Departamento de Biologia Celular, Genética e Biotecnologia - DBC da Universidade Estadual de Maringá, os adultos e imaturos foram sacrificados em baixas temperaturas. Em seguida, os adultos tiveram a cabeça/tórax isolados e homogeneizados individualmente. As larvas foram homogeneizadas inteiras e individualmente. A homogeneização foi realizada em 80 µL da solução de β-mercaptoetanol (0,1%), glicerol a 10% e 20 µL de tetracloreto de carbono. Após as eletroforeses PAGE 10%, os géis foram corados com uma solução contendo α- e β-naftil acetato para a detecção das Isoenzimas esterases. As larvas de C. megachephala apresentaram cinco regiões de esterases. As EST-1 e EST2 foram denominadas de β-esterases, devido a coloração com β-naftil acetato, diferente das EST-1 e EST-2 de adultos que foram classificadas com α- β-esterases. As EST-3 e EST-4 de larvas apresentaram coloração de α-esterases, como os adultos. Nos imaturos não foram detectadas as EST-5 e EST-6 que aparecem nos adultos, contudo, foi identificada uma nova β-esterase com migração próxima à EST-4. Esses resultados permitem concluir que os locos EST-1 e EST-2 não são os mesmos observados nos adultos e que, juntamente com a nova esterase (próxima à EST-4 de adultos) devem exercer um papel durante o desenvolvimento larval. Assim, serão necessárias novas análises para uma melhor identificação, classificação e entendimento do papel dessas Isoenzimas em C. megachephala. Palavras-chave: Diptera; Entomologia Forense; desenvolvimento.

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CRIAÇÃO DE Chrysomya megacephala (DIPTERA: CALLIPHORIDAE) EM LABORATÓRIO PARA EXTRAÇÃO DE GLÂNDULAS SALIVARES EM

LARVAS

Ronaldo Roberto Tait Caleffe1*; Stefany Rodrigues de Oliveira1; Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli1; Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki1; Helio Conte1

1Universidade Estadual de Maringá, DBC. *E-mail do autor para correspondência:

ronaldo_caleffe@hotmail.com.

Algumas espécies da família Calliphoridae (Diptera) apresentam interesse biotecnológico por sua aplicação na Terapia Larval, onde as larvas destes insetos auxiliam na cicatrização de feridas, e também pela produção de substâncias antimicrobianas, principalmente pelas glândulas salivares e intestino. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estabelecer a criação de Chrysomya megacephala (Calliphoridae), e descrever a morfologia das glândulas salivares de larvas em terceiro instar. A criação foi iniciada a partir da coleta de adultos de C. megacephala, utilizando armadilhas apropriadas. Após identificação da espécie por meio de chave morfológica, os adultos foram transferidos para caixas plásticas (39cmx29cmx29cm) com dieta elaborada contendo açúcar, leite em pó integral e levedo de cerveja (1:1:1) homogeneizados em água destilada até obter um preparado pastoso. Os ovos foram obtidos após a disposição de 50g de fígado bovino na caixa de criação, e transferidos para potes plásticos (450 mL) contendo 1g de fígado para cada larva. As larvas em terceiro instar foram retiradas e sacrificadas em baixas temperaturas, para serem dissecadas em solução fisiológica com auxilio de microscópio estereoscópico Zeiss. Foi observado em larvas de terceiro instar um par de glândulas salivares, de formato tubular, iniciando na cabeça do inseto a partir de um ducto deferente, o qual apresenta bifurcação em dois ductos eferentes. Na porção terminal, o órgão apresenta células diferenciadas, realizando a união do par de glândulas. A saliva produzida e secretada tem a função de lubrificar as estruturas bucais, e realizar a digestão inicial do alimento, a partir de enzimas digestivas. Na espécie Lucilia sericata (Calliphoridae) o par de glândulas salivares produz e secreta diferentes enzimas digestivas e proteolíticas, como colagenases, amilases, peptidases e fatores antimicrobianos. A caracterização da morfologia das glândulas salivares de C. megacephala se faz necessária para identificar o potencial biotecnológico da espécie visando seu uso na terapia larval bem como na produção de substâncias antimicrobianas. Concluímos que a criação de insetos em laboratório é uma etapa fundamental e básica para obtenção de um número suficiente de indivíduos necessários para o prosseguimento dos experimentos. Palavras-chave: Glândulas salivares; Chrysomya megacephala; Criação de insetos.

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ALTERAÇÃO NA ESTRUTURA DA CROMATINA DE Apis mellifera AFRICANIZADA TOLERANTE A INSETICIDA NEONICOTINOIDE

William Cristian da Silva Pizzaia1*; José Ricardo Penteado Falco1; Vagner de Alencar

Arnaut de Toledo1; Maria Claudia Ruvolo Colla Takasusuki1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: wilbiologia@hotmail.com

Um grupo de inseticidas muito utilizados são os neonicotinoides, por serem eficientes para o controle de insetos que se tornam pragas nas lavouras, contudo afetam os polinizadores, em especial as abelhas causando a CCD (Colony Collapse Disorder), que é um distúrbio multifatorial levando estes insetos a morte. O presente estudo teve como objetivo, avaliar as alterações na estrutura da cromatina de abelhas A. mellifera tolerantes ao neonicotinoide tiametoxam submetidas à contaminação crônica por contato, após período de 12 meses. As três colmeias de A. mellifera tolerantes ao neonicotinoide são mantidas no apiário da Fazenda Experimental Iguatemi-UEM desde março de 2015. As análises de CEC foram realizadas com 10 operárias coletadas diretamente nas colmeias tolerantes da geração F3 núcleo A, geração F4 núcleo B e geração F3 núcleo C, no período de janeiro-fevereiro de 2016. Como controle, foram utilizadas 10 abelhas coletadas em colmeia não tratada com o inseticida. Após a coleta as abelhas foram sacrificadas e dissecadas. As glândulas hipofaríngeanas e cérebros foram submetidos à técnica de CEC (Concentração Crítica de Eletrólitos). A análise citoquímica mostrou que o ponto de CEC nas amostras de cérebro controle ocorreu na concentração de 0,30M, enquanto a geração F3 do núcleo A ocorreu na concentração de 0,15M. Esses resultados mostraram que houve descondensação da cromatina e aumento da expressão gênica. As amostras de glândula hipofaringeana da geração F3 do núcleo C apresentaram ponto de CEC na concentração de 0,30M e de glândula hipofaringeana da geração F4 do núcleo B, apresentaram ponto de CEC na concentração de 0,20M. Portanto, houve descondensação da cromatina. As colmeias tolerantes ao neonicotinoide tiametoxam apresentam expressão gênica diferenciada dependendo da geração avaliada. Palavras-chave: Toxicologia genética; tiametoxam; Concentração Crítica de Eletrólitos.

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ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE ENZIMAS ESTERASES E MORTALIDADE

EM Scaptotrigona bipunctata (HYMENOPTERA: APINAE) INTOXICADAS

COM CIPERMETRINA

Naiara Climas Pereira1*; Tamiris de Oliveira Diniz1; Raquel Barel Matos1; Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki1

1Universidade Estadual de Maringá. *naiaraclimas@gmail.com.

Os meliponíneos ou abelhas sem ferrão caracterizam-se por serem abelhas sociais que possuem o ferrão atrofiado, impossibilitando seu uso e constitui um grupo formado por mais de 300 espécies, sendo muitas nativas do Brasil. Seus ninhos são construídos por uma grande variedade de estruturas, formatos e materiais e suas colônias são formadas por um número variado de indivíduos. Scaptotrigona bipunctata (Lepeletier, 1836) (Hymenoptera: Apidae: Meliponinae) é uma espécie de abelha sem ferrão, popularmente conhecida como tubuna ou canudo, que constrói grandes ninhos e grandes colônias dentro de troncos de árvores. Possuem importância ecológica como polinizadores, sendo relevantes na manutenção da diversidade florística e do equilíbrio ecológico, podendo funcionar ainda como bioindicadores da qualidade ambiental. Entretanto, estudos apontam que as abelhas vêm diminuindo drasticamente ao longo dos anos devido à destruição de habitats e uso intensivo de agrotóxicos. Altas concentrações de agrotóxicos podem ocasionar a morte das abelhas, porém baixas concentrações podem promover alterações comportamentais que afetam todo funcionamento da colmeia e, consequentemente, seus serviços ao ecossistema e às culturas agrícolas. Do total de inseticidas consumidos no Brasil, cerca 40% deles são considerados tóxicos para as abelhas. O inseticida cipermetrina, pertencente ao grupo dos piretroides é largamente utilizado, por apresentar características favoráveis, como baixa toxicidade em mamíferos, baixo impacto ambiental, efetividade contra um largo espectro de insetos e necessidade de baixas quantidades para exercer sua ação. O objetivo do presente estudo foi investigar a mortalidade e alteração da expressão das isoenzimas esterases em abelhas S. bipunctata após contaminação por ingestão com cipermetrina. Foram coletadas 270 abelhas adultas de S. bipunctata na entrada de caixas comerciais e intoxicadas por ingestão com cipermetrina nas concentrações 0,25 µg i.a./mL, 0,5 µg i.a./mL, 1 µg i.a./mL, 2 µg i.a./mL, 4 µg i.a./mL e um grupo controle não intoxicado. Cada tratamento continha três repetições contendo 15 indivíduos. A concentração de 0,25 µg i.a./mL apresentou maior mortalidade, sendo estatisticamente diferente dos outros tratamentos pelo teste Skott-Knott 0,5%. Extratos individuais de cabeça/tórax foram preparados, utilizando-se como solução de extração glicerol 10% com β-mercaptoetanol 0,1%. A visualização das esterases foi feita por meio de eletroforese PAGE. Os resultados observados mostraram que após a intoxicação de S. bipunctata por 72 horas com o inseticida cipermetrina houve inibição das isoenzimas esterases quando intoxicadas na concentração de 0,25 µg i.a./mL. Palavras-chave: meliponíneos; piretróide; esterases. Apoio financeiro: CNPq, CAPES e Fundação Araucária.

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ALTERAÇÕES NA ESTRUTURA DA CROMATINA DE ABELHAS SEM FERRÃO Scaptotrigona bipunctata Lepeletier,1836

(HYMENOPETRA:APIDAE) CONTAMINADAS COM O INSETICIDA REGULADOR DE CRESCIMENTO NEEM

Eloísa Magalhães Pereira*1; José Ricardo Penteado Falco1; Juliana Mosconi Magro1;

Maria Claudia Colla Ruvolo-Takasusuki1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: elo.magape@gmail.com Natuneem® é um inseticida regulador de crescimento (IGR), originado de extrato de Neem (Azadirachta indica) e controla várias pragas agrícolas. Os IGRs são inseticidas utilizados principalmente na agricultura orgânica e por pequenos produtores. Atualmente a Desordem de Colapso de Colônia (CCD), ou o desaparecimento de abelhas é considerado uma consequência da utilização indiscriminada de inseticidas. A utilização dos IGR seria uma alternativa para a sustentabilidade de pequenos agricultores. No estado do Paraná (Brasil) a produção de mel de abelhas nativas sem ferrão como a Scaptotrigon abipunctata tem apresentado grande desenvolvimento. Essas abelhas realizam coletas de pólen e néctar tanto em regiões de áreas agriculturáveis, quanto nas suas proximidades em remanescentes de matas nativas. Assim, essas abelhas podem estar se contaminando com quantidades subletais de agrotóxicos. Uma forma de verificar possíveis alterações em nível de cromatina pode ser feita por meio da análise citoquímica da Concentração Crítica de Eletrólitos (CEC). Assim, o objetivo deste estudo foi detectar a CEC

após contaminação por contato com concentrações subletais do inseticida Natuneem (azadiractina). Operárias adultas foram coletadas dentro de colmeias racionais localizadas no apiário central da Fazenda Experimental de Iguatemi da Universidade Estadual de Maringá e submetidas à bioensaios com o inseticida. Cada tratamento foi realizado por 24 horas com 20 operárias de S. bipunctata, acondicionadas em placas de Petri (150x20 mm) contendo alimento (Cândi) e papel filtro (15 cm de diâmetro) embebido em 1 mL do inseticida a 25%. Nas placas controle o papel filtro foi embebido apenas com 1 mL de água. As análises de CEC foram realizadas com os túbulos de Malpighi das abelhas sobreviventes do bioensaio. As colorações foram utilizadas em oito cubetas com diferentes concentrações de magnésio (0,02; 0,05; 0,08; 0,10; 0,12; 0,15; 0,20 e 0,30M) mais o corante azul de toluidina. A cubeta-controle, continha apenas azul de toluidina. A análise citoquímica realizada em S. bipunctata, submetidas à concentração de 25% de Natuneem® por 24 horas apresentou aumento no ponto de CEC. A condensação da heterocromatina foi maior que o limite de AT+0,30 MgCl2, indicado no grupo controle. A condensação da eucromatina aumentou de AT+0,05 MgCl2 para AT+0,15 MgCl2. Estes aumentos demonstram que pode ter ocorrido uma inativação de genes nestas regiões, devido a exposição ao inseticida. Apesar de o inseticida neem ser considerado como não prejudicial às abelhas polinizadoras, os resultados obtidos permitem concluir de maneira contrária, que esse IGR pode ter efeito nas abelhas S. bipunctata em nível de cromatina, levando a inativação gênica. Palavras-chave: Abelha sem ferrão; Concentração Crítica de Eletrólitos; Azadiractina.

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MORTALIDADE DE Scaptotrigona bipunctata Lepeletier, 1836

(HYMENOPETRA: APIDAE) POR INGESTÃO DO INSETICIDA

THIAMETHOXAM

Daiani Rodrigues Moreira1*; Adriana Aparecida Sinopolis Gigliolli1; Fabiana Castelani Andreotti1; Katlin Fernanda de Araujo1; Heloísa Magalhães Pereira1; Maria Claudia Colla

Ruvolo-Takasusuki1. 1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: daianibiogeo@hotmail.com

Inúmeras espécies de vegetais necessitam da polinização das abelhas para sobrevivência, processo esse essencial para diversificação da maioria das espécies vegetais existentes. O emprego de agroquímicos de forma desenfreada tem sido um dos fatores que tem promovido o abandono e morte de colônias, causando o declínio de polinizadores. No presente trabalho foi avaliada a mortalidade e comportamento de abelhas sem ferrão Scaptotrigona bipunctata após contaminação por ingestão por 72 horas com o neonicotinoide thiamethoxam em concentrações subletais. As abelhas foram coletas na Fazenda Experimental de Iguatemi – FEI, Maringá/PR, sendo transportadas para o Laboratório de Biotecnologia Animal da Universidade Estadual de Maringá – UEM. Os bioensaios foram realizados em laboratório a 28±2°C, UR 70±10% e fotofase de 12h, utilizando as concentrações 2,5 x 10-8 g.ia./ml, 1,25 x 10-8 g i.a./ml, 1 x 10-8 g i.a./ml, 7,5 x 10-9 g i.a./ml e 5 x 10-9 g i. a./ml do agroquímico thiamethoxam no alimento, mais controle contendo somente o alimento (cândi). O modelo experimental foi DIC (Delineamento Inteiramente Casualizado), em triplicata, totalizando 45 abelhas por tratamento, sendo oferecido alimento e água suficientes para consumo. Após 72 horas de exposição às diferentes concentrações do inseticida foi contabilizada a mortalidade. O comportamento foi analisado 2, 12, 24, 48 e 72 horas após a montagem do bioensaio. Os resultados comportamentais nas primeiras 24 horas foram os mais relevantes, em que o pesticida promoveu desorientação e agitação constante dos insetos. No intervalo de 48 a 72 horas foram observados tremores corporais contínuos dos indivíduos até a morte. Os resultados de normalidade dos dados obtidos por meio do teste de Shapiro-Wilk mostraram um valor de W = 0.9285, p-value = 0.1831 apresentando normalidade dos erros. Com o teste de Bartlett foi verificado homogeneidade das variâncias (Bartlett's K-squared = 0.7235, p-value = 0.9817). Quando comparado os tratamentos, por meio do teste Tukey foi verificado que a mortalidade na concentração 7,5 x 10-9 g.ia./ml difere e supera as demais, pois apresentou maior mortalidade (42,22%). Nas concentrações 2,5 x 10-8 g.ia./ml e 5 x 10-9 g i.a./ml foi observada mortalidade de 31,11% e 22,22% respectivamente. O controle não apresentou taxa de mortalidade significativa. Por meio do teste de Correlação Pearson identificou-se o valor de r=0,263 com correlação fraca positiva, significando que há fraca relação entre mortalidade e as concentrações de thiamethoxam utilizadas. Apesar da baixa correlação concentração-mortalidade, os resultados obtidos permitiram verificar que as abelhas sem ferrão S. bipunctata são suscetíveis ao inseticida neonicotinoide thiamethoxam. Palavras-chave: Abelhas sem ferrão; monitoramento ambiental; declínio de polinizadores.

Apoio Financeiro: CAPES

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COMPARAÇÃO VISUAL DE MÉTODOS PARA A CONSERVAÇÃO DE ÁCIDO RIBONUCLÉICO (RNA)

Angélica de Souza Khatlab1*; Eliane Gasparino1; Ana Paula Del Vesco2; Elenice Souza

dos Reis Goes3

1Universidade Estadual de Maringá. 2Universidade Federal de Sergipe. 3Universidade Federal da Grande Dourados. *E-mail do autor para correspondência: angelicakhatlabuem@gmail.com

A análise de expressão gênica tem sido amplamente utilizada em pesquisas que visam compreender melhor os mecanismos moleculares envolvidos com diferentes rotas metabólicas. Embora os resultados obtidos nas análises de expressão sejam confiáveis, os procedimentos que antecedem as análises, como a coleta e o armazenamento dos tecidos, podem comprometer os resultados. A qualidade e a quantidade dos ácidos nucleicos (DNA/RNA) podem ser fortemente afetadas pelo meio de conservação das amostras, sendo então um aspecto de vital importância a ser considerado, uma vez que RNAs com alto grau de pureza e integridade são necessárias para a análise de expressão gênica. Como pode ocorrer degradação enzimática nos tecidos, métodos mais eficientes de armazenamento das amostras são imprescindíveis. Dentre os métodos de armazenamento, podemos citar o uso de protetores de RNA, que são soluções aquosas não tóxicas, que permeia rapidamente a amostra para estabilizar e proteger o RNA celular. Outro método bastante utilizado é o congelamento das amostras em nitrogênio líquido. Assim, nosso objetivo foi verificar a integridade do RNA extraído do fígado de frangos de corte, coletado e armazenado em solução protetora e nitrogênio líquido. Para isto, seis frangos de corte (Cobb 500) (Gallus gallus) com 42 dias foram utilizados. As aves foram abatidas por deslocamento cervical, e em seguida o tecido foi coletado e armazenados em 3 mL de solução protetora e mantidos em freezer -20ºC até o momento da extração do RNA, e/ou foram armazenados em tubos criogênicos congelados em nitrogênio líquido; e posteriormente armazenado em freezer -80ºC. O RNA foi extraído com o uso do reagente Trizol de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de RNA obtida na extração foi quantificada no Picodrop e a integridade do RNA foi visualizada em gel de agarose 1% corado com SYBR Safe DNA Gel Stain e visualizado sob luz ultra violeta. Observamos através da intensidade luminosa das bandas; e da formação das bandas de RNA subunidades ribossômicas 28S, 18S e 5S no gel de agarose, que tanto os RNAs extraídos a partir das amostras armazenadas em solução protetora como em nitrogênio líquido, apresentaram boa qualidade e integridade, não sendo observado nenhum sinal de degradação. A partir destes resultados, podemos concluir que ambos os processos de armazenamento são eficientes para a conservação de amostras, uma vez que os RNAs não apresentaram sinal de degradação. Palavras-chave: solução protetora; nitrogênio líquido; RNA.

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MORTALIDADE EM ABELHA CANUDO Scaptotrigona bipunctata (HYMENOPETRA, APIDAE, MELIPONINI) EXPOSTA AO INSETICIDA

CIPERMETRINA

Daiani Rodrigues Moreira1*; Fernanda Moura Calderón1; Adriana Aparecida Sinopolis

Gigliolli1; Maria Paula Martins Januário1; Daniele Araujo Canazart1; Maria Claudia Colla Ruvolo-Takasusuki1.

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: daianibiogeo@hotmail.com As abelhas sem ferrão são nativas do Brasil e se destacam pela grande atividade de suas colônias, bem como por possuir uma alimentação variada. Apresentam essa denominação por possuírem o ferrão atrofiado e sem uso para defesa. Estas abelhas estão agrupadas na superfamília Apoidea, as quais possuem ninhos dispostos em troncos de árvores, galhos, ou até mesmo no solo. Pesquisas sobre essas espécies são escassas, diferente do que acontece com abelhas do gênero Apis. No presente trabalho, foi avaliada a mortalidade da espécie sem-ferrão Scaptotrigona bipuntacta expostas ao inseticida Piretróide Cipermetrina. As abelhas foram coletas na Fazenda Experimental de Iguatemi – FEI, Maringá/PR e transportadas para o Laboratório de Biotecnologia Animal da Universidade Estadual de Maringá – UEM. O experimento foi desenvolvido em laboratório (28±2°C, UR 70±10% e fotofase de 12h) utilizando as concentrações 0,20 g.i.a/ml, 0,15 g.i.a/ml, 0,10 g.i.a/ml e 0,05 g.i.a/ml do agroquímico cipermetrina, e o controle somente com o alimento (xarope de sacarose). Foram distribuídas pelo Modelo DIC - Delineamento Inteiramente Casualizado, em triplicatas, totalizando sessenta abelhas por tratamento, sendo oferecidos alimento (1:1 de sacarose/cipermetrina) e água suficientes para consumo. Após 24, 48 e 72 horas de exposição nas diferentes concentrações do inseticida foi contabilizada a mortalidade e os indivíduos sobreviventes armazenados para análises posteriores. Os resultados de normalidade dos dados obtidos por meio do teste de Shapiro-Wilk mostraram um valor de W = 0.9705, p-value = 0.8653 apresentando normalidade dos erros. Já o teste de Bartlett revela um Bartlett's K-squared = 1.9811, p-value = 0.7392 com homogeneidade das variâncias. Quando comparado os tratamentos, o teste Tukey constatou que a concentração 0,20 g.i.a/ml difere e supera as demais, visto que esta apresentou maior mortalidade. As concentrações 0,15 g.i.a/ml, 0,10 g.i.a/ml e 0,05 g.i.a/ml também apresentaram alta taxa de mortalidade, onde por meio do teste de Correlação de Pearson identificou-se o valor de r=0,895 com correlação forte positiva, significando que a mortalidade esta relacionada com os diferentes tratamentos pelo inseticida Cipermetrina. O controle não apresentou dados de mortalidade significativos, evidenciando a influência deste agroquímico na mortandade das abelhas. Deste modo, a exposição as diferentes concentrações subletais ao inseticida Piretróide Cipermetrina confirmam à alta susceptibilidade das abelhas sem ferrão S. bipunctata. Assim, é importante compreender como os defensivos agrícolas afetam direta e indiretamente insetos alvo benéficos. Palavras chave: Abelhas sem ferrão; mortalidade; inseticida.

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Área: Biotecnologia de Microrganismos

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IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ISOLADAS DE Mikania glomerata (Spreng.) COM BASE NO SEQUENCIAMENTO DO GENE 16S

DE rRNA

Aline Maria Bulla1; Angela Aparecida da Silva1; Halison Correia Golias1; Julio Cesar

Polonio1; João Alencar Pamphile1*

1 Universidade Estadual de Maringá (UEM). *E-mail do autor para correspondência: prof.pamphile@gmail.com

Bactérias endofíticas são aquelas isoladas do interior de tecidos vegetais e que não causam danos aparentes ao hospedeiro. Existe uma grande diversidade de gêneros de bactérias endofíticas presentes no interior de tecidos vegetais. Este trabalho teve como objetivo identificar três bactérias endofíticas (Mg-04, Mg-06, Mg-13) isoladas de folhas de Mikania glomerata com base na comparação de sequências dos genes 16S de rRNA com outras depositadas no banco de dados internacional Genbank (NCBI), seguida de análise filogenética. Foi realizada a extração de DNA com metodologia de fenol e clorofórmio, procedida de amplificação do gene 16S RNAr via reação de PCR utilizando os seguintes primers (Invitrogen 10pMol) (R1378: 5'- GGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3' e PO27F:5'- GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'). A purificação dos produtos de amplificação foi realizada com a combinação de duas enzimas, Shrimp Alkaline Phosphate (SAP), e a Exonuclease I (EXO). As amostras foram sequenciadas pela empresa ACTGene Análises Moleculares LTDA (Ludwigbiotec). Para a identificação dos isolados, as sequências nucleotídicas encontradas foram comparadas com aquelas depositadas no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information Website) utilizando a ferramenta BLAST. A identificação foi determinada baseando-se no melhor valor obtido quanto à similaridade. Para a análise filogenética, as sequências do banco de dados que apresentaram alta similaridade com as sequências obtidas, foram então resgatadas e alinhadas utilizando o ClustalW no software MEGA (versão 6.05) juntamente com as sequências dos isolados. A árvore filogenética foi construída com grupamento pelo método neighbor-joining, usando p-distance para nucleotídeos com a opção “the pairwise gap deletion” e bootstrap com 10.000 repetições. Foram identificados com alto valor de identidade e confirmados filogeneticamente os gêneros bacterianos dos isolados Mg-04, Mg-06 e Mg-13 como pertencentes aos gêneros Curtobacterium sp., Pseudomonas sp. e Streptomyces sp. respectivamente. Estes gêneros bacterianos apresentam-se como endófitos em diversas culturas sendo relatadas diversas funções como promotoras de crescimento, produção de hormônios e de antibióticos. A utilização de técnicas microbiológicas e moleculares permite melhores caracterizações da comunidade bacteriana endofítica, possibilitando estudos específicos voltados para cada gênero descrito. Este resultado demonstra que existe um potencial para a exploração da biodiversidade bacteriana endofítica da planta medicinal M. glomerata. Palavras-chave: bioinformática; diversidade microbiana; taxonomia molecular.

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INTERAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE FERRO (Fe3O4) COM O FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO Metarhizium sp. PARA A OBTENÇÃO

DE NANOBIOCOMPÓSITOS

Thais Oliveira Chaves1; Adriana Garcia2; Raquel Dosciatti Bini2; Verci Alves de Oliveira Junior1; Andressa Domingos Polli1; João Alencar Pamphile1; Ivair Aparecido dos Santos2;

Luiz Fernando Cótica2*

1Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular – DBC, Universidade Estadual de

Maringá – UEM – Maringá. 2Departamento de Física, Programa de Pós-Graduação em Física,

Universidade Estadual de Maringá – UEM – Maringá. *E-mail do autor para correspondência:

lfcotica@yahoo.com.br

A nanotecnologia tem o potencial de revolucionar as tecnologias utilizadas em vários setores, incluindo a agricultura, melhorando a qualidade de vida e ajudando a preservar o meio ambiente. Ela pode ter soluções concretas contra muitos problemas encontrados na agricultura, como o controle de insetos praga evitando o uso de métodos tradicionais, bem como prevenindo os efeitos químicos adversos dos pesticidas. As nanopartículas metálicas possuem maior magnetização comparada aos óxidos metálicos, porém são pouco estáveis quimicamente quando em atmosfera livre. Dentre os óxidos magnéticos, as nanopartículas de óxidos de ferro (Fe3O4) têm sido aplicadas em sistemas biológicos. O controle microbiano de insetos-praga utilizando fungos entomopatogênicos têm aumentado devido a algumas características de ação desses patógenos, por exemplo, o fungo entomopatogênico Metarhizium sp., tem sido utilizado no controle biológico devido à facilidade de aplicação em condições de campo, o baixo custo decorrido de sua utilização e, principalmente, a redução do impacto ambiental. O presente trabalho teve como objetivo obter um nanobiocompósito (NBC) por meio da interação entre as nanopartículas de óxidos de ferro (Fe3O4) com o fungo Metarhizium sp. O fungo entomopatogênico foi cultivado sob agitação em meio mínimo para fungos com modificações. Após seu crescimento o micélio obtido foi lavado com água deionizada a fim de obter o peso úmido e, posteriormente o fungo foi novamente inoculado em meio mínimo de cultura com as nanopartículas de (Fe3O4). Os resultados se mostraram eficientes, a partir da obtenção de imagens da morfologia do fungo por microscopia eletrônica de varredura (MEV), do fungo selvagem e do nanobiocompósito (fungo com nanopartículas). Foi possível observar que as nanopartículas de Fe3O4 ficaram distribuídas aleatoriamente pela superfície do fungo. A comprovação da existência das nanopartículas no fungo foi feita por meio da Espectrometria de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS), capaz de verificar diferentes elementos químicos contidos na amostra. Contudo é possível concluir que os fungos filamentosos podem realizar novas ligações químicas com metais, isso porque a parede celular desses micro-organismos possui uma elevada capacidade de ligação e de absorção de metal para o interior da célula. Palavras-chave: Nanobiocompósitos; Nanopartículas; Metarhizium sp.

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FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO POR BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ISOLADAS DE Sapindus saponaria

Vinicius Paiva Mota 1; Andressa Domingos Polli1; Aline Maria Bulla1; Adriana Garcia2, João Alencar Pamphile1*, João Lúcio de Azevedo3

1Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular - Universidade Estadual de Maringá - UEM. 2Departamento de Física - Universidade Estadual de Maringá - UEM. 3Departamento de Genética - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" - ESALQ/USP. *E-mail do autor para correspondência: prof.pamphile@gmail.com. Microrganismos endofíticos são fungos e bactérias que habitam o interior de tecidos vegetais, sem causar danos ao seu hospedeiro. As bactérias endofíticas podem participar de diversos processos, como síntese de hormônios vegetais, captação e repasse de nutrientes para a planta hospedeira, síntese de enzimas, solubilização de fosfato e fixação de nitrogênio. A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é o processo pelo qual a maior parte do nitrogênio atmosférico é incorporado à matéria viva, ao longo da evolução do nosso planeta. Ainda hoje, este processo constitui a principal via de incorporação de nitrogênio ao ecossistema, que constantemente é reciclado para a atmosfera principalmente pela ação de organismos decompositores de matéria orgânica do solo. A fixação biológica de nitrogênio é muito importante para a planta hospedeira, pois esse elemento atua como fator limitante no crescimento vegetal. Com o aumento da demanda por novas tecnologias, o estudo da FBN traz uma alternativa para o uso mais racional de insumos agrícolas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar, quanto a relação à capacidade de realizar a fixação biológica de nitrogênio, 9 linhagens de bactérias endofíticas isoladas da planta Sapindus saponaria L., uma árvore cuja casca, raiz e fruto são utilizados na medicina popular como calmante, adstringente, diurético, expectorante, tônico, depurativo do sangue e contra a tosse. Para o teste de verificação de FBN pelas bactérias endofíticas, as linhagens endofíticas foram previamente crescidas em placas com meio TSA. Posteriormente foram cultivadas em tubos de vidro contendo 5 mL de meio específico para FBN (Nfb semi-sólido), sem nitrogênio, e incubadas a 28ºC por 72h. A capacidade de fixar nitrogênio foi indicada pela formação de película de crescimento no meio. Entre as linhagens avaliadas, cinco apresentaram resultado positivo para FBN: SS23 (Staphylococcus sp.), SS30 (Staphylococcus sp.), SS73 (Paenibacillus sp.), SS88 (Curtobacterium sp.) e SS93 (Pseudomonas sp.). Estudos comprovaram a capacidade das bactérias endofíticas, assim como das bactérias micorrízicas, de fixarem nitrogênio atmosférico tanto no solo como na planta. Assim, as linhagens de bactérias endofíticas de S. saponaria podem ser utilizadas na promoção do crescimento de plantas de interesse econômico. Palavras chave: Bactérias endofíticas; Fixação biológica de nitrogênio; Promoção de crescimento.

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ANÁLISE DAS COMUNIDADES BACTERIANAS ASSOCIADAS A SUPERFÍCIES DE FOLHAS DE DUAS CULTIVARES DE SOJA

Katiúscia Kelli Montanari Coelho¹; Alessandra Tenório Costa¹; Julio Cesar Polonio¹; João

Alencar Pamphile¹; Renata Fuganti Pagliarini2; Alexandre Lima Nepomuceno2; Silvana

Rockenbach Marin2; Liliane Mertz Henning2. ¹Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular. 2Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro Nacional de Pesquisa de Soja (EMBRAPA/Soja). *E-mail do autor para correspondência: katimontanari@outlook.com As folhas das plantas (filosfera) tem um grande potencial de colonização e de crescimento microbiano, essa associação entre folha e micro-organismo pode trazer grandes benefícios, pois o habitat associado com a planta é um ambiente dinâmico, onde vários fatores podem interferir com a estrutura microbiana. No cenário atual de mudanças climáticas, com o aumento da população mundial e crescente demanda por alimentos, os organismos geneticamente modificados (OGM) vem introduzindo várias características na agricultura, com a obtenção de plantas mais tolerantes a estresse ambientais, tais como a seca, que provocam perdas financeiras significativas. A cultura da soja (Glycine max L. Merrill) é uma das mais importantes do mundo, sendo o Brasil o segundo maior produtor mundial. Na produção de soja, o impacto do estresse hídrico tem ocasionado problemas que limitam severamente o crescimento e a produtividade das plantas. O presente trabalho teve como objetivo explorar o microbioma foliar de bactérias endofíticas presentes em plantas de soja transgênica, evento (1Ea2939) (resistente à seca) e soja convencional (BR 16) por meio do método independente de cultivo. Para isso, amostras de folhas foram coletadas de cada cultivar, misturadas para a obtenção de um pool de folhas, lavadas e desinfectadas superficialmente, para a remoção de resíduos e microrganismos epifíticos. Após o DNA bacteriano presente nessas amostras de plantas foi extraído com o uso de kit comercial. A análise da diversidade microbiana foi realizada pelo sequenciamento do gene 16S rRNA (RNA ribossômico), com o uso de oligonucleotídeos específicos para a região hiper-variável V3-V4 do gene para o domínio Bactéria, utilizando a plataforma MiSeq Illumina. Os resultados obtidos revelaram uma imensa quantidade de dados gerados pela plataforma de sequenciamento utilizada. A análise preliminar de uma parte desses dados mostrou que a diversidade microbiana nas folhas das plantas de soja evento (1Ea2939) e (BR 16) apresentaram constituição semelhante em nível de filo com predomínio de Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes e Acidobacteria. Este resultado é consistente com o observado em outros estudos realizados tanto por método independente de cultivo, como pelo método dependente na filosfera de folhas verdes. Diante deste resultado, podemos sugerir uma homogeneidade taxônomica nas comunidades microbianas encontradas na filosfera das plantas de soja evento (1Ea2939) e soja BR 16, entretanto, outros dados também devem ser analisados para podermos assegurar que o evento de transgenia não teve impacto adverso na riqueza e diversidade microbiana presentes nessas plantas. Palavras Chave: microbioma; Glycine max; método independente de cultivo.

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USO DO SABUGO DE MILHO PARA A PRODUÇÃO DE α-AMILASE POR FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE Piper hispidum

Ravely Casarotti Orlandelli1,2*; Mariana Sanches Santos3; Julio Cesar Polonio1; João Lúcio de Azevedo4, João Alencar Pamphile1

1Universidade Estadual de Maringá (UEM). 2Universidade Estadual do Paraná – câmpus Paranavaí (UNESPAR). 3Universidade Estadual de Londrina (UEL). 4Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo (ESALQ/USP). *E-mail do autor para correspondência: ravelycasarotti@gmail.com Em 2014, o Brasil produziu cerca de 80 milhões de toneladas de milho, gerando uma grande quantidade de resíduos agroindustriais, como o sabugo de milho (SM), a partir do processamento dessa matéria-prima agrícola. Esses resíduos podem ser utilizados como substrato para a fermentação microbiana visando à redução dos custos do processo de obtenção enzimática. As α-amilases microbianas representam cerca de 33% do mercado mundial de enzimas, sendo utilizadas nas indústrias de alimentos, detergentes, tecidos, bebidas, medicamentos, produtos químicos e etanol. Fungos endofíticos, que colonizam os espaços intra e extracelulares de tecidos vegetais sadios sem causar-lhe danos, permanecem ainda pouco explorados quanto à produção dessas enzimas. Assim, o presente trabalho comparou a produção de α-amilase, utilizando amido de milho Maizena® (AM) e SM como substratos, por oito endófitos isolados da planta medicinal Piper hispidum (falso-jaborandi). Para a fermentação submersa, três discos de colônias de Bipolaris sp. JF767001, Colletotrichum sp. JF766996, Diaporthe sp. JF766998, Marasmius cladophyllus JF767003, Phlebia sp. JF766997, Phoma herbarum JF766995, Phyllosticta capitalensis JF766988 e Schizophyllum commune JF766994 foram transferidos para Erlenmeyers contendo 50 mL de solução de Manachini acrescida (0,5% p/v) de AM ou SM previamente lavado, seco e triturado (1-2 mm). As culturas foram mantidas em shaker (140 rpm) a 28±2 ºC por 144 h; em seguida, filtradas e centrifugadas, e o sobrenadante foi reservado. Para a determinação da atividade de α-amilase, em tubos de ensaio, foram adicionados 80 μL de tampão acetato de sódio (500 mM, pH 6.0), 20 μL de sobrenadante e 100 μL de solução de amido (0,5%). Após 20 min a 50 ºC, foram adicionados 200 μL de solução iodo-iodeto e 200 μL de ácido acético 1 M. O volume foi completado para 10 mL com água destilada, com leitura em espectrofotômetro a 660 nm. Uma unidade enzimática (U) foi considerada como a quantidade de enzima requerida para hidrolisar 1 mg de amido por minuto. Como resultado, apenas Colletotrichum sp. JF766996 e Diaporthe sp. JF766998 não produziram α-amilase. Quando AM foi utilizado, as médias obtidas variaram entre 2,99±0,05 e 3,61±0,02 U/mL. Já com o uso do SM, a produção enzimática variou entre 2,53±0,02 e 3,90±0,05 U/mL. Para os fungos M. cladophyllus JF767003, Phlebia sp. JF766997 e S. commune JF766994 houve um aumento na atividade de α-amilase na presença do SM. Assim, os dados obtidos indicam que, principalmente para os três basidiomicetos acima citados, o SM foi considerado um substrato eficiente para a produção enzimática. Palavras-chave: enzima microbiana; fermentação submersa; resíduo agroindustrial.

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ATIVIDADE ANTAGONISTA DOS ENDÓFITOS Trichoderma spp. CONTRA Fusarium solani

Rodrigo Pawloski Schoffen1*; Amanda da Silva Ribeiro1; João Lúcio Azevedo2; João Alencar Pamphile1

1Universidade Estadual de Maringá. 2Universidade de São Paulo, ESALQ. *E-mail do autor para correspondência: rps_ro@hotmail.com Endófitos são todos os microrganismos capazes de colonizar internamente os tecidos da planta, sem causar doenças, podendo acarretar diversos benefícios aos seus hospedeiros como promoção do crescimento e inibição de fitopatógenos, além da produção de diversos compostos de interesse biotecnológico. O objetivo do trabalho foi avaliar a atividade antagonista das linhagens endofíticas de Trichoderma sp. contra o fungo fitopatogênico Fusarium solani. Os fungos endofíticos utilizados (linhagens 164b e 36b) foram isolados das folhas de Coffea arabica e identificados como Trichoderma sp. A atividade antagonista foi avaliada contra o fitopatógeno Fusarium solani. Discos com 6 mm de diâmetro do endófito e do fitopatógeno foram inoculados em polos opostos da placa de Petri contendo meio BDA com uma distância de 4 cm um do outro, as placas foram incubadas a 28°C por 7 dias. Os testes foram realizados em triplicata, bem como o controle negativo, com o fitopatógeno crescendo isoladamente em um dos polos da placa. A área de crescimento do fitopatógeno foi avaliada utilizando o software ImageJ (v 1.51f). Os valores obtidos foram avaliados estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05) utilizando o programa Sisvar 5.6. Para o índice de inibição percentual (Im%) foi realizado o cálculo: Im% = (1-MT/MC)x100, onde MT = Média da área da triplicata aferida para o tratamento em cm2, e MC = Média da área da triplicata do controle em cm2. As duas linhagens testadas foram capazes de inibir significativamente o fitopatógeno. A média da área de crescimento no controle foi de 33,96 cm2 e no tratamento de 4,82 e 10,35 cm2

para as linhagens 36b e 164b respectivamente. Para o isolado 36b o índice de inibição percentual foi de 85,81% enquanto para a linhagem 164b foi de 69,52%. No primeiro caso houve crescimento completo do endofítico sobre o fitopatógeno depois de bloqueio inicial com contato micelial, já com o isolado 164b houve crescimento parcial sobre o fitopatógeno. O gênero Trichoderma tem a habilidade de parasitar outros fungos, isso explica sua habilidade em inibir fitopatógenos. Além disso, como o endófito pode aumentar a taxa de crescimento e estimular a resposta de defesa das plantas. Estas linhagens têm grande potencial como agente de controle biológico. Palavras-chave: controle biológico; atividade antifúngica.

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PRODUÇÃO DE ÁCIDO INDOLACÉTICO (AIA) POR BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ISOLADAS DE Sapindus saponaria L.

Andressa Domingos Polli1; Adriana Garcia2; Julio Cesar Polonio1; João Alencar Pamphile1, João Lúcio de Azevedo3

1Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular - Universidade Estadual de Maringá - UEM. 2Departamento de Física - Universidade Estadual de Maringá - UEM. 3Departamento de Genética - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" -ESALQ/USP. *E-mail do autor para correspondência: prof.pamphile@gmail.com.

Microrganismos endofíticos são principalmente fungos e bactérias que habitam o interior de plantas sem causar danos aos hospedeiros. Sapindus saponaria L. (Sapindaceae) é uma árvore utilizada na medicina popular. Estudos indicam a relação entre propriedades terapêuticas de plantas medicinais e bactérias endofíticas, e determinam as diferentes funções desses micro-organismos no interior das plantas, como o controle biológico de inúmeras doenças, a promoção do crescimento vegetal (produção de fitohormônios), a disponibilização de nutrientes para a planta e fixação de nitrogênio atmosférico. Hormônios vegetais são substâncias orgânicas que desempenham papel fundamental na regulação do crescimento. Há cinco classes principais de hormônios vegetais: auxinas (ácido indolacético - AIA), citocininas, giberelinas, ácido abscísico e etileno. Bactérias endofíticas que promovem o crescimento vegetal (PGPB – plant growth-promoting bacteria), principalmente por meio da produção de fitohormônios, podem ser utilizadas para uma possível aplicação no campo, objetivando o aumento da produção agrícola. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de produção de AIA por duas linhagens de bactérias endofíticas SS73 (Paenibacillus sp.) e SS93 (Pseudomonas sp.), isoladas de S. saponaria. As bactérias endofíticas foram cultivadas em meio TSB (Tripticase Soy Broth) 10% contendo L-triptofano (5mM), e incubadas no escuro a 28ºC por 72 h. Após esse período, foram centrifugadas por 5 min. a 15.000×g, coletados 1 mL dos sobrenadantes e adicionados 2 mL do Reagente de Salkowski, e incubando-se por 30 min. à temperatura ambiente no escuro. Para verificação do resultado, foram realizadas leituras em Espectrofotômetro com comprimento de onda de 520 nm, normalizando as leituras por meio da curva padrão (R²=0,987) obtida com diferentes concentrações do padrão comercial do ácido 3-indolacético (Sigma-Aldrich). As linhagens SS73 e SS93 apresentaram produção do ácido indolacético nas concentrações de 0,56 µg.ml-1 e 0,88 µg.ml-1, respectivamente. A produção de auxinas por bactérias endofíticas nas plantas hospedeiras torna essa relação mutualística extremamente benéfica, na qual as bactérias fornecem auxinas que promovem o crescimento das plantas e, assim, terão mais exudatos e nutrientes da planta disponíveis para sua proliferação. Com isso, do ponto de vista biotecnológico e econômico, a aplicação de bactérias endofíticas produtoras de fitohormônios em culturas importantes pode contribuir para o crescimento rápido, proteção contra ataques de patógenos e aumento da produtividade. Desta forma, estes resultados demonstram a possibilidade de utilização destas bactérias endofíticas como inoculantes agrícolas, visando à promoção do crescimento vegetal. Palavras-chave: Auxinas; Bactérias endofíticas; Promoção de crescimento vegetal.

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ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE AMPLO ESPECTRO DO FUNGO ENDOFÍTICO Diaporthe sp (G62) ISOLADO DE Mikania glomerata

Spreng.

Cíntia Zani Fávaro1; Julio Cesar Polonio1; Amanda da Silva Ribeiro1; João Lucio de Azevedo2; João Alencar Pamphile1*

1Universidade Estadual de Maringá - UEM. 2Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – ESALQ/USP. *E-mail do autor para correspondência: prof.pamphile@gmail.com

A Mikania glomerata, conhecida popularmente como ”guaco”, é uma planta trepadeira pertencente à família Asteraceae, sendo utilizado na medicina popular com atividade contra problemas respiratórios, antinflamatórios e antialérgicos. A M. glomerata é uma das espécies mais estudadas e utilizadas para fins medicinais, sendo oficializada como fitofármaco em 1929. O estudo da microbiota natural endofítica de plantas medicinais e seus possíveis compostos secundários tem se mostrado como uma área promissora na prospecção de novos compostos de origem natural. Estes microrganismos endofíticos são um grupo diversificado que habitam o interior de plantas, na qual esta associação planta-endófito não causa nenhum dano ao seu hospedeiro. Esta interação pode resultar em benefícios para ambos no qual os endófitos podem fornecer proteção e fatores de desenvolvimento para a planta hospedeira. Dentre as principais aplicações dos produtos naturais obtidos destes microrganismos, destacam-se as com atividade inibidora de organismos patogênicos, contrastando com a necessidade de soluções alternativas de origem natural para problemas como os causados por bactérias. As bactérias que causam doenças em seres humanos são diversas, entre elas estão Staphylococcus aureus causadora de simples a graves infecções como pneumonia e meningite, Shigella flexneri principal causadora de shigelose endêmica em países em desenvolvimento e Escherichia coli causadora de infecção do trato urinário. O presente trabalho teve como objetivo verificar a ação antibacteriana do extrato bruto de metabólitos secundários da linhagem endofítica Diaporthe sp. isolado de M. glomerata, contra as bactérias patogênicas à humanos S. aureus, S. flexneri e E. coli e a fitopatogênica X. citri, em testes de microdiluição. O extrato metabólito apresentou atividade inibitória contra todas as bactérias analisadas. Os resultados mais promissores foram observados para X. citri, onde a Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi de 1000 µg/mL-1, sendo nesta concentração capaz de reduzir o crescimento bacteriano quando comparado ao controle negativo. A Concentração Bactericida Mínima (CBM) foi 2000 µg/mL, ou seja, nesta concentração não houve crescimento bacteriano, sendo o melhor resultado encontrado. Em contrapartida, para as outras bactérias a CIM e a CBM foram de 2000 µg/mL e 4000 µg/mL respectivamente. A CIM e CBM para tetraciclina foi de 0.49 e 31.25 µg/mL respectivamente. Estes resultados apontam para o potencial dos compostos presentes no extrato bruto de metabólitos secundários da linhagem G-62, sendo necessários maiores estudos sobre a composição e purificação de compostos bioativos produzidos por este fungo. Palavras-chave: Guaco; Endófitos; Concentração Inibitória Mínima.

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Biotecnologia Vegetal

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ESTUDO DE SIMPLES SEQUÊNCIAS REPETITIVAS DO GENOMA DE UVAS FINAS DE MESA (Vitis vinifera L.)

Mayara Destro Passere1; Danuza Kelly Strioto1*; Claudete Aparecida Mangolin1; Maria de Fátima Pires da Silva Machado1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: danuzak-s@hotmail.com A cultivar Itália foi desenvolvida pelo melhorista Ângelo Pirovano, na Itália, por meio do cruzamento entre Bicane com Moscatel de Hamburgo, realizado em 1911. No Paraná, o cultivo da uva Itália teve início na década de 60, e os primeiros parreirais plantados foram no município de Marialva-PR. Nestas regiões, o surgimento das cultivares de cor a partir da cultivar Itália, foi explicado pela ocorrência de mutações somáticas. As mutações somáticas em plantas de uva Itália geraram as cultivares Rubi e Benitaka. Mutação somática em plantas da cultivar Benitaka, originou a cultivar Brasil. E mais recentemente a uva Black Star surgiu a partir da cultivar Brasil. As análises moleculares de DNA são essenciais para a identificação de variações e para investigar diferenças genéticas entre clones de cultivares de Vitis vinifera L. Os marcadores microssatélites ou SSR foram considerados como marcadores universalmente utilizados para a identificação das variedades de videiras. Nesse sentido, a proposta no presente estudo foi analisar o polimorfismo em locos SSR para detectar a variabilidade genética nas uvas finas de mesa, Itália, Rubi, Benitaka, Brasil e Black Star. As amostras de nove plantas de cada uma das cinco cultivares de Vitis vinifera L. foram coletadas em uma propriedade rural do município de Marialva. As 45 amostras foram preparadas individualmente e o DNA foi extraído de acordo com o protocolo descrito por Thomas et al., (1993). O DNA extraído de cada amostra foi quantificado utilizando o equipamento Picodrop. Para a escolha dos marcadores microssatélites polimórficos foram testados 38 pares de primers previamente mapeados para uva e que fazem parte do banco de primers do Laboratório de Cultura de Tecidos e Eletroforese de Vegetais. Dos 38 pares de primers testados, foram selecionados 13 que amplificaram regiões específicas e com indícios de polimorfismo. Destes, utilizamos 10 para amplificar o genoma das 45 amostras. O maior número de alelos foi observado na região amplificada pelo primer Udv-032 (5 alelos). Os primers Udv-011, Udv-074, Vvmd6 e Scuvv-14 amplificaram um só alelo e foram caracterizados como monomórficos. A proporção de locos microssatélites polimórficos avaliados no genoma das cultivares de uvas Itália, Rubi, Benitaka, Brasil e Black Star foi de 60%. A despeito da divergência de coloração dos frutos das 5 variedades, há evidências de uma similaridade genética alta, e indicações de baixa divergência molecular entre as cinco cultivares nos 10 locos microssatélites analisados no presente estudo. Palavras-chave: Vitis vinifera L.; uvas finas de mesa; microssatélite.

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EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DE Cereus sp.

Vanessa Neves de Azevedo Fernandes1*, Andréa Florindo das Neves1, Claudete Aparecida Mangolin1, Maria de Fátima Pires da Silva Machado1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: vanessa_neves17@hotmail.com Cereus é um cacto ornamental, popularmente chamado de "mandacaru" no Brasil, cultivado em jardins e em áreas de preservação biológica. A espécie é ecológica, econômica e industrialmente importante devido à grande variedade de compostos que produz. A família Cactaceae é representada por indivíduos arborescentes, arbustivos ou rastejantes, e podem possuir caules lenhosos ou suculentos. O caule pode ser articulado, plano, cilíndrico ou em forma globosa, com espinhos distribuídos uniformemente em torno do caule ou formando costelas longitudinais. A classificação da família foi desenvolvida pelo Grupo Internacional de Sistemática de Cactaceae e reconhece quatro subfamílias: Pereskioideae, Maihuenioideae, Opuntioideae, e Cactoideae (Hunt et al., 2006). Cactoideae é a maior subfamília, com sete tribos (Hunt et al., 2006). A maioria dos cactos encontra-se nesta subfamília. As flores, frutos e a morfologia dos caules são frequentemente utilizados para discriminar gêneros e espécies dentro da família Cactaceae (Taylor & Zappi, 2004). Contudo, existe uma grande plasticidade de características morfológicas, tornando inconveniente uma classificação baseada exclusivamente na morfologia. As três morfologias comumente encontradas são ereto, monstruosus e tortuosus, que se diferenciam quanto a distribuição de suas costelas. Em relação as proteínas elas exercem um papel fundamental em quase todos os fenômenos biológicos, como produção de energia, defesa imunológica, contração muscular, atividade neuroquímica e reprodução (De Sousa et al., 2003). As moléculas de proteínas são co-polímeros de condensação de até 20 aminoácidos de ocorrência natural distintos apenas pelas suas cadeias laterais. Existem bilhões de combinações possíveis e milhares de diferentes tipos de proteínas, sendo cada com uma função especifica a desempenhar no organismo (Atkins & Jones, 2001). A proposta do presente estudo é a extração de proteínas totais de Cereus sp das três morfologias encontradas, para posterior análise e uma possível solução taxonômica da espécie. A metodologia aplicada para a extração de proteínas totais foi adaptada de He & Wang, 2008. Esta se mostrou mais eficiente quando utilizado o protocolo (A) precipitação com TCA-acetona, em comparação ao protocolo (B) extração com fenol e (C) método de extração com fenol melhorada. O protocolo (C) não se mostrou satisfatório na extração não obtendo nenhuma banda no gel de poliacrilamida SDS-Page 12%. A metodologia de extração deve ser escolhida conforme os objetivos da análise proteômica que será realizada (Isaacson et al., 2006). De acordo com He & Wang, 2008 o método (C) resultou em uma produção de proteínas mais elevada, ao contrário dos autores, nosso trabalho em Cereus sp o protocolo (A) é simples e de fácil execução sendo o mais eficiente na extração de proteínas totais. O fato deve-se a grande quantidade de etapas do protocolo (C) onde há o favorecimento da perda de proteínas durante as etapas. Palavras chave: Cereus sp; morfologia; proteínas.

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ESTUDO DE RETROTRANSPOSONS EM CULTIVARES DE UVAS FINAS DE MESA (Vitis vinifera L.)

William Seiji Lemes Nagata1; Danuza Kelly Strioto1*; Claudete Aparecida Mangolin1; Maria de Fátima Pires da Silva Machado1; Sandra Collet1

1Universidade Estadual de Maringá.*danuzak-s@hotmail.com

Entre as plantas mais antigas cultivadas pelo homem encontra-se a videira. A cultivar Itália (Vitis vinifera L.), foi desenvolvida pelo melhorista Ângelo Pirovano, na Itália, através do cruzamento de Bicane com Moscatel de Hamburgo, realizado em 1911. Na década de 60 iniciou-se o cultivo da cultivar Itália no Norte e Noroeste do Paraná, essa cultivar foi introduzida no noroeste do estado pela colônia japonesa, e o município de Marialva ficou conhecido como a Capital da Uva Fina de Mesa. Em Marialva são cultivadas as variedades Itália, Rubi, Benitaka, Brasil e Black Star. O surgimento de cultivares de cor a partir da Itália é explicado pela ocorrência de mutações somáticas. Os Elementos Transponíveis apresentam um importante papel na domesticação e melhoramento genético da videira. Devido a estas propriedades, os retrotransposons têm sido utilizados para a análise da variabilidade genética. Os marcadores baseados em retrotransposons (IRAP e REMAP) são uma importante ferramenta no estudo de instabilidade genética e evolução genômica. Nesse sentido, a proposta do presente trabalho foi estimar a diversidade genética em nível de DNA e inferir se as variações para cor estão associadas com mutações promovidas pelos processos de corte e colagem, portanto, se estas alterações estão envolvidas com a geração das cultivares Itália, Rubi, Benitaka, Brasil e Black Star. As folhas jovens de 18 plantas das cinco cultivares foram coletadas do município de Marialva. O DNA foi extraído de acordo com o protocolo descrito por Thomas et al. (1993) e quantificado utilizando o Picodrop. As amostras de DNA foram diluídas para 10 ng/μL e utilizadas para amplificar as sequências específicas. Para seleção dos marcadores IRAP foram testados 24 primers de LTR. Os géis foram expostos a um campo elétrico de 80 Volts, por 5 horas, e corados em solução de brometo de etídio 0,5 µg/mL. Dos 24 primers testados 14 foram selecionados e 10 apresentaram regiões polimórficas (71,43%) e amplificaram 192 fragmentos. Para a análise das cinco cultivares de uva foram utilizadas 8 combinações dois a dois entre os 14 primers LTR desde que os primers apresentaram a mesma temperatura de anelamento. Estes amplificaram regiões específicas e com indícios de polimorfismo. Apesar dos 14 primers amplificados individualmente apresentarem 71,43% de polimorfismo, e das 8 combinações dos primers apresentarem 37,50% de polimorfismo, os 192 fragmentos amplificados com os primers LTR e os 118 amplificados com a combinação dos primers LTR (IRAP) não estão associados diretamente com regiões que determinam a coloração das uvas finas de mesa, isto é com a produção do pigmento antocianina. Palavras-chave: Vitis vinifera L.; retrotransposons.

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CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE CLADÓDIOS DE

Cereus peruvianus Mill. (CACTACEAE)

Adrieli Rodrigues da Costa Nunes1*; Rafaela Takako Ribeiro de Almeida1; Alexandre da

Silva Avincola1; Eduardo Jorge Pilau1; Arildo José Braz de Oliveira1; Claudete Aparecida

Mangolin1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência:

adrielirodriguess@gmail.com

Cereus peruvianus é um cacto colunar, nativo do sudeste da América do Sul. Esta espécie pertence à família Cactaceae e é conhecida popularmente no Brasil como Mandacaru. As plantas desta família, assim como de outras, produzem compostos fenólicos, uma classe de metabólitos envolvidos em uma vasta gama de papéis fisiológicos. Esses metabólitos podem ser usados como impressões digitais de genótipos para fins taxonômicos ou bioquímicos, controle de qualidade e determinações de atividades de plantas medicinais. Além de apresentarem propriedades antioxidantes com aplicações na indústria de alimentos, de cosméticos e de fármacos. Na literatura não há estudos sobre o perfil de compostos fenólicos de C. peruvianus e diante disso, nosso objetivo foi investigar a composição destes compostos em cladódios desta espécie utilizando a técnica analítica UHPLC-HR-MS. Essa metodologia é utilizada para separação e elucidação estrutural de compostos químicos em solução, e é comumente aplicada em estudos de metabolômica de plantas para analisar uma grande variedade de metabólitos. Neste trabalho, o procedimento de extração dos compostos fenólicos foi realizado conforme descrito por Wiczkowski et al., (2013), com modificações. O extrato foi ressuspendido em metanol, uma alíquota foi centrifugada e analisada por UHPLC-HR-MS utilizando um cromatógrafo de ultra-alta performance (UHPLC) acoplado a um espectrômetro de massas Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight), com fonte de ionização por electrospray em modo positivo de aquisição na faixa de 70 – 1300 m/z. A separação dos analitos se deu através de uma coluna cromatográfica de fase reserva (C18) sob eluição com gradiente linear de água e acetonitrila ambos com 0,1% de ácido fórmico. Dentre os diversos íons observados no extrato, destacou-se a presença do íon protonado 741.2200 m/z. Com base em seu perfil de fragmentação, comparação com bancos de dados específicos para espectrometria de massas e um erro de 5.70 ppm, este íon foi caracterizado como sendo o flavonoide glicosilado Kaempferol-O-robinoside-7-O-rhamnoside (Robinin). Estudos demonstram que este flavonoide possui atividade anti-inflamatória e natureza cardioprotetora. Desta forma, os resultados obtidos sugerem que Cereus peruvianus possui uma diversidade química de metabólitos não descritos na literatura até o momento para a espécie. Sendo portanto, uma fonte potencial de princípios ativos ainda pouco explorados. Palavras-chave: Cactaceae; Flavonoides; UHPLC-HR-MS. Agradecimentos: CAPES; COMCAP-UEM.

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AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE GERMINAÇÃO in vitro DE Astrophytum myriostigma E Ferocactus latispinus

Anderson Emmer1; Andréa Florindo das Neves1; Claudete A. Mangolin1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: e.mm.mer@hotmail.com A família Cactaceae, com mais de 1300 espécies, representa a segunda família em ordem de tamanho entre as plantas vasculares endêmicas das Américas, a família Bromeliaceae sendo classificada em primeiro lugar. No continente americano as Cactaceae possuem três principais centros de diversidade. Mais de 300 espécies de cactos são cultivadas mundialmente como ornamentais e comercializadas em lojas, supermercados e viveiros. A reprodução in vivo ou in vitro, por meio da germinação de sementes, é uma alternativa para a multiplicação de cactáceas ornamentais, proporcionando a manutenção da variabilidade genética e aumento da disponibilidade de mudas tanto para os viveiristas como também para os produtores e pesquisadores que visam os programas de conservação, O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento do processo de germinação das espécies de cacto ornamental Astrophytum miryostigma e Ferocactus latispinus. A avaliação foi realizada utilizando duas concentrações de hipoclorito de sódio (NaClO), para desinfestação das sementes, buscando elaborar um protocolo de desinfestação adequado para essas duas espécies. Além do hipoclorito de sódio, em um terceiro tratamento foi utilizado ácido sulfúrico (H2SO4) para escarificação das sementes, numa tentativa de proporcionar maior rapidez no processo de germinação. Para as sementes de A. miryostigma e F. latispinus somente o processo de desinfestação com NaClO não forneceu bons resultados. Resultados eficazes de germinação foram obtidos quando se realizou a escarificação com ácido sulfúrico. Para as duas espécies de cactáceas avaliadas neste trabalho foram necessários os procedimentos de esterilização e de escarificação para a obtenção de plântulas, a fim de estabelecer uma cultura asséptica para posterior micropropagação. A germinação in vitro é um passo fundamental para o estabelecimento dos processos de micropropagação para algumas espécies de cactáceas, e as plântulas obtidas poderão servir como explantes assépticos para as etapas posteriores da micropropagação. Palavras-chave: Cactaceae; desinfestação; escarificação.

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SELEÇÃO DE PRIMERS PARA LOCOS MICROSSATÉLITES PARA CONSTRUIR UM MAPA DE LIGAÇÃO, E ESTIMAR OS EFEITOS GENÉTICOS DE QTLS ASSOCIADOS COM A RESISTÊNCIA À

Cercospora zeina NA CULTURA DO MILHO PIPOCA (Zea mays L.)

Laura Ivana Ramos1; Pedro Igor Ferrari1; Liriana B. Cantagalli1; Maria de Fátima da Silva Pires Machado1.

Universidade Estadual de Maringá, Departamento Biotecnologia, Genética e Biologia Celular. *E-mail do autor para correspondência: lirianabc3@gmail.com O milho é um cereal rico em vitaminas e sais minerais cultivado no mundo todo. Além disso, o interesse no aumento da produção do milho é devido a sua produção de amido, proteína e óleo, essênciais para a alimentação e nutrição de seres humanos e de animais, além de ser matéria prima para a produção de etanol. Entretanto, a cultura do milho é muito afetada por diversas doenças, as quais causam danos significativos no rendimento e na qualidade dos grãos. A cercosporiose (mancha cinza foliar), ocasionada pelo fungo Cercospora spp, pode destruir grande parte do tecido foliar. O controle da cercosporiose pode ser realizado com a utilização de fungicida ou com o desenvolvimento de híbridos de milho com resistência à doença. O presente estudo teve como objetivo selecionar primers microssatélites polimórficos, que serão utilizados na construção de um mapa de ligação na geração F2 de milho-pipoca e que poderão estar associados a genes que conferem resistência à Cercosporazeína. Para a extração do DNA genômico foram coletadas duas folhas jovens de plantas parentais (linhagens endogâmicas CML 23 resistente e CML 19 suscetível), F1 e F2 que deram origem às progênies F2:3. Estas folhas coletadas correspondem à aproximadamente 300 mg de tecido vegetal e foram rapidamente congeladas e pulverizadas em nitrogênio líquido para extração do DNA genômico. O DNA extraído foi diluído em tampão TE (Tris/HCl 10mM e EDTA 1mM pH8,0) e estocado à 4°C. Os DNAs das plantas F2 e das progênies F2:3 foram amplificados com os pares de primers selecionados para microssatélites. Para a escolha desses marcadores polimórficos, 400 microssatélites já mapeados serão testados, procurando adicionar um marcador a cada bin ao longo de cada cromossomo, usando para isso a informação de localização disponível na Maize Genome Database. O produto da amplificação foi separado em gel de poliacrilamida 10%, com o tampão TBE 0,5 X (Tris/Borato 0,045M e EDTA 0,001M pH 8,3), por 3 horas à 180V. O gel foi corado em solução de nitrato de prata. Foram testados até o momento 72 primers localizados nos cromossomos 1 e 2 e destes, 7 primers (Umc 1331,Umc 1906, Umc 1917, Umc 2047, Umc 1737, Umc 1383, Umc 1598) foram polimórficos e serão empregados na construção do mapa de ligação para resistência à cercosporiose, contribuindo na produção de híbridos resistentes à essa doença. Palavras-chave: milho; cercosporiose; microssatélite.

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Biotecnologia Aplicada a Saúde

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ANÁLISE DE PERMEAÇÃO CUTÂNEA POR ESPECTROSCOPIA FOTOACÚSTICA EM FERIDAS TRATADAS COM EXTRATO BRUTO DE

Poincianella pluviosa INCORPORADO EM FILME POLIMÉRICO

Ana Carolina Guidi¹; Gustavo Cesar Abreu Soares2*; Daniela C. Medeiros¹; Gutierrez Rodrigues de Morais3; Mauro Luciano Baesso3; Mariana N. de Paula¹; João Carlos P. de

Mello¹; Eneri Vieira de Souza Leite Mello4 ¹Departamento de Farmácia - Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Brasil. 2 Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular - Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Brasil. 3Departamento de Física - Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Brasil. 4Departamento de Ciências Morfológicas - Universidade Estadual de Maringá, Maringá, Brasil. *E-mail do autor para correspondência: gustavo_casoares@hotmail.com.

A utilização de plantas como medicamento pela humanidade é tão antiga quanto a história do homem. Muitas pesquisas estão relacionadas às diversas ações de produtos naturais, como alternativas mais econômicas para o controle de patologias. A utilização de fitoterápicos na cicatrização de feridas tem sido bastante estudada com a finalidade de buscar princípios ativos que acelerem a reparação tissular. Entre esses fitoterápicos está a Poincianella pluviosa, uma árvore popularmente conhecida como sibipiruna, com ação comprovada para tratamento de disenteria, malária e cicatrização de feridas. Para auxiliar no processo de cicatrização, extratos de plantas podem ser incorporados em formas farmacêuticas, como os filmes poliméricos. Para a eficácia do tratamento tópico, é necessário que a droga presente na formulação, consiga penetrar a pele e chegar às camadas internas. A Espectroscopia Fotoacústica (PAS) é uma medida direta da absorção e permite avaliar a penetração das substâncias aplicadas topicamente. O objetivo do trabalho foi avaliar a permeação do extrato bruto (EB) das cascas de P. pluviosa incorporada em filme polimérico, na cicatrização de feridas cutâneas de ratos. Para essa avaliação, o filme polimérico foi preparado a partir de um gel de carboximetilcelulose 2% e incorporado 1% de EB. Essa mistura foi adicionada em um molde de espessura fixa e levada à estufa (36ºC) por 24h. Outro filme sem o extrato, preparado nas mesmas condições, serviu como controle negativo. Após a secagem os filmes foram cortados (1 cm²). Foram utilizados 12 ratos Wistar machos divididos em 4 grupos (n=3) de acordo com o período de tratamento. Foram feitas duas feridas (de 1 cm² cada) no dorso dos animais, uma foi tratada com o filme com EB e outra com o controle negativo. As feridas foram tratadas durante 4, 7, 10 e 14 dias. No final de cada período, os fragmentos de pele foram removidos e encaminhados imediatamente ao laboratório de fotoacústica. As amostras de pele foram analisadas na porção dermal. Os espectros fotoacústicos dos fragmentos de pele tratados foram subtraídos dos controles negativos, resultando um espectro que é a permeação do EB. O EB, o filme com EB e filme controle foram avaliados previamente para verificar a região espectral de absorção. Com a análise, observou-se uma permeação do EB atingindo a derme, em todos os períodos de tratamento (4, 7, 10 e 14 dias). Nos tratamentos de 4 e 7 dias, quando a ferida ainda estava maior e o filme polimérico fixava-se melhor, foi observado picos maiores no espectro, sugerindo uma melhor absorção. Palavras-chave: Poincianella pluviosa; cicatrização; filme polimérico.

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AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CITOTÓXICO E CITOPROTETOR DO ÁCIDO VANÍLICO EM CÉLULAS DE HEPATOMA HUMANO (HepG2/C3A)

Mariana Yoshimoto1*; Matheus Gimenez Buzo1; Michele Cristina Heck1; Igor Vivian de Almeida1; Mariane Aparecida Franco de Godoy1; Veronica Elisa Pimenta Vicentini1

1Universidade Estadual de Maringá – UEM. *E-mail do autor para correspondência: mariana.yoshimoto@gmail.com

Os ácidos fenólicos estão amplamente distribuídos nos vegetais e possuem diversas atividades biológicas de interesse. O Ácido Vanílico é um derivado fenólico encontrado naturalmente e/ou produzido pela oxidação do aldeído vanilina (popularmente conhecido como baunilha), mas que também pode ser encontrado em diversas frutas e vegetais comestíveis. Este composto é muito utilizado na indústria como flavorizante, conservante ou aditivo alimentar e de perfumaria, e possui diversas funções biológicas, como anti-inflamatória, antibacteriana, quimiopreventiva, antioxidante, entre outras. Desta forma, considerando o potencial terapêutico descrito para o Ácido Vanílico, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico e citoprotetor desse composto por meio do Ensaio do MTT, em células de hepatoma humano (HepG2/C3A). Para ambos os ensaios, foram semeadas 105 células HepG2/C3A por poço em placas de cultura celular de 96 poços. Os grupos avaliados, foram: Controle (meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal); agente citotóxico Metilmetanossulfonato (MMS, 150µM); Ácido Vanílico, nas concentrações de 100, 200 e 400 µM. Para o Ensaio de Citoproteção, o Ácido Vanílico (100, 200 e 400 µM) foi associado a 150µM de MMS. Após 24, 48 e 72 horas de exposição, foi realizado a leitura da absorbância em leitor de microplacas a 550nm. Três experimentos independentes foram realizados e os resultados da absorbância foram submetidos à análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey (α=0,05, p<0,05, n=3) com auxílio do programa GraphPad INSTAT. Os resultados obtidos no Ensaio de Citotoxicidade (MTT) indicaram que nenhuma das concentrações de Ácido Vanílico avaliadas, em todos os tempos de exposição, foram citotóxicas para as células HepG2/C3A, visto que não houveram diferenças estatisticamente significativas dos tratamentos com o composto fenólico em relação ao Controle. Os dados obtidos no Ensaio de Citoproteção (MTT) demonstraram que apenas a concentração de 100µM, no tempo de 48 e 72 horas, apresentou atividade citoprotetora (p<0,01) contra os danos induzidos pelo MMS, pois houve uma maior atividade mitocondrial quando comparado ao tratamento realizado apenas com o agente citotóxico. Desta forma, podemos inferir que, nas condições analisadas, o Ácido Vanílico não é citotóxico e possui potencial citoprotetor frente ao MMS em células HepG2/C3A. No entanto, estudos adicionais sobre este composto devem ser realizados para se definir com propriedade o potencial citotóxico e citoprotetor dessa substância em outras linhagens celulares. Palavras-chave: Composto nutracêutico; citotoxicidade; citoproteção.

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AVALIAÇÃO in vitro DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DO ESTEROIDE OXIMETOLONA EM CULTURA DE CÉLULAS HEPÁTICAS TUMORAIS

(Hepg2/C3A)

Mariane Aparecida Franco de Godoy1; Michele Cristina Heck1; Mariana Yoshimoto1; Veronica Elisa Pimenta Vicentini1*

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: mariane_afg@hotmail.com

Os esteroides anabólicos androgênicos são responsáveis por manter as características sexuais masculinas e a atividade anabólica dos tecidos somáticos. Os esteroides sintéticos possuem aplicação terapêutica, sendo empregados em quadros de deficiência de testosterona, certos tipos de anemias, dentre outras aplicações, além do uso indiscriminado para obtenção de massa muscular. A Oximetolona é um dos anabolizantes de via oral mais utilizados, este composto é comercializado no Brasil como Hemogenin® e indicado no tratamento de anemias causadas pela produção deficiente de eritrócitos, porém, possui caráter extremamente hepatotóxico. Com base nos dados apresentados, este trabalho buscou avaliar o potencial citotóxico do composto Oximetolona, por meio do ensaio de citotoxicidade - MTT, utilizando células de hepatoma humano HepG2/C3A. Neste ensaio, uma suspensão de 104 células foram semeadas em placas de cultura celular de 96 poços. Em cada placa, os grupos avaliados foram: o agente citotóxico, Doxorrubicina (DOX) 18µM; o controle, meio de cultura DMEM suplementado com soro bovino fetal (10%); e as concentrações de 10, 50, 100, 500 e 1000ng/mL de Oximetolona. Após o tratamento, as placas foram incubadas por 24, 48 e 72 horas, e ao final de cada período, os tratamentos foram substituídos por meio de cultivo com MTT na concentração de 0,15mg/mL. As células foram incubadas por mais 4 horas, e então o MTT foi descartado, e foi adicionado dimetilsulfóxico (DMSO) para diluição dos cristais de formazan. A leitura da absorbância foi realizada em leitor de microplacas a 550nm. Foram realizados três experimentos independentes e os resultados da absorbância foram submetidos à análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey (α=0,05). Os resultados estatísticos demonstraram que os valores de absorbância de todas as concentrações do composto foram semelhantes ao controle, a DOX porém, apresentou declínio na absorbância devido a sua ação citotóxica, o que confirma a responsividade das células HepG2/C3A neste ensaio. Além disso, o tratamento com a DOX exibiu diminuição substancial de viabilidade celular conforme o tempo de exposição, com 84%, 55% e 34% respectivamente, enquanto que, todos os tratamentos com a Oximetolona apresentaram percentuais maiores que 95%, demonstrando que os tratamentos com o composto, não interferiram significativamente na viabilidade celular. Portanto, apesar da conhecida ação hepatotóxica da Oximetolona, os resultados do ensaio demonstraram que este composto, nas concentrações avaliadas, não possui ação citotóxica em células hepáticas tumorais HepG2/C3A. Palavras-chave: Esteroides anabolizantes; Células de hepatoma humano; Ensaio do MTT.

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CITOTOXICIDADE DO FLAVONOIDE TAXIFOLINA EM CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA RENAL HUMANO (786-O)

Paulo Hallef Schneider Syritiuk1*; Lilian Capelari Soares1; Veronica Elisa Pimenta Vicentini1

1Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: paulosyritiuk@gmail.com As plantas possuem um vasto número de metabólitos secundários que possuem alto potencial biológico, e dentre estes se encontram os flavonoides, um grupo de compostos orgânicos que apresentam uma grande variedade de benefícios à saúde, atuando como antioxidantes, antienvelhecimento, reguladores do colesterol e auxiliando na regulação cardiovascular. A Taxifolina é um flavonoide da família das flavanonols comumente encontrado em frutas cítricas, alguns vegetais e nas folhas do pinheiro Pseudotsuga taxifolia. As propriedades farmacológicas da Taxifolina incluem a ação anti-inflamatória, antioxidante, antibacteriana, ação protetora do sistema cardiovascular, regulação do colesterol, entre outras. Atualmente, esta substância vem sendo muito pesquisada devido a sua capacidade antioxidante e citoprotetora, visto que ela atua estabilizando os radicais livres, evitando, assim, que eles sejam prejudiciais para a célula. Com o objetivo de analisar o efeito citotóxico da Taxifolina em células não metabolizadoras 786-O (adenocarcinoma renal humano), foi realizado o ensaio do MTT, que avaliou a atividade mitocondrial e a viabilidade celular. As células foram semeadas na concentração 0,4x104/poço em placas de 96 poços para o ensaio do MTT, nos tempos de exposição de 24 e 48 horas, avaliando-se as concentrações de 50, 100 e 200 µM do flavonoide diluídos em meio de cultura DMEM contendo 1% de DMSO para auxiliar na diluição; como agente citotóxico, foi utilizada a doxorrubicina (DOX 7 µM); e como Controle, utilizou-se meio de cultura DMEM enriquecido com soro bovino fetal (10%) e DMSO 1%. Foram realizados três experimentos independentes e os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey (α=0,05). A leitura da absorbância foi realizada em leitor de microplacas a 550 nm. A análise dos dados demonstrou que a Taxifolina não apresentou redução na viabilidade celular em nenhuma das concentrações avaliadas e em nenhum dos tempos analisados, demonstrando, assim, não possuir efeito citotóxico sobre essa linhagem celular. Estes resultados corroboram com os dados encontrados na literatura, onde o flavonoide foi testado em diferentes linhagens celulares e em concentrações semelhantes e não apresentou ação citotóxica. Desta forma, podemos inferir que a Taxifolina não apresenta ação citotóxica sobre a linhagem celular 786-O, nas concentrações testadas. Palavras-chave: Metabólitos secundários; viabilidade celular; antioxidantes.

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AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS EM CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS DE RIM (786-0)

Elisa Parcero Hernandes1; Karina Midori Endo1; Raquel D. Bini2; Michele Cristina Heck1; Mariana Yoshimoto1; Veronica Elisa Pimenta Vicentini1; Luiz Fernando Cotica2

1Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular, Universidade Estadual de Maringá.2Departamento de Física, Universidade Estadual de Maringá. *E-mail do autor para correspondência: elisaparcero@gmail.com A nanotecnologia é uma área de pesquisa interdisciplinar e multidisciplinar utilizada em diversas áreas biomédicas. Na busca de alternativas que possam melhorar a eficiência e minimizar os efeitos colaterais em células saudáveis causados pelo uso de drogas em tratamentos quimioterápicos para o câncer, as nanopartículas magnéticas (NPM) são as candidatas mais promissoras podendo ser funcionalizadas como nanocarreadores de fármacos em alvos específicos. A maioria dos estudos de análise da toxicidade destas NPM é feita em culturas de células, as quais são vantajosas devido à facilidade de padronização das condições experimentais. O ensaio colorimétrico do MTT e o teste de viabilidade celular pelo azul de trypan indicam atividade mitocondrial e a determinação das células viáveis, respectivamente. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade citotóxica das NPM de magnetita (Fe3O4) sem recobrimento (grupo A) e Fe3O4 recoberta com sílica (grupo B) por meio do ensaio de citotoxicidade (MTT) e do teste de viabilidade celular em linhagem tumoral renal (786-0). No ensaio do MTT, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 104/poço e tratadas com as NPM do grupo A e B separadamente nas sete concentrações (50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000µg/ml) e incubadas por 24, 48 e 72 h. Para o teste de viabilidade do azul de trypan, foram semeadas 0,2.105/poço e também foram utilizadas as sete concentrações já citadas nos tratamentos A e B. A leitura foi feita após 72 horas adicionando corante azul de trypan e contagem em câmara de neubauer das células viáveis e não viáveis. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados foram submetidos à análise estatística de Variância (ANOVA) seguida pelo teste de Turkey (MTT). Os resultados indicaram que as NPM não recobertas não apresentaram efeitos citotóxicos significativos nas exposições de 24, 48 e 72 horas. Já as NPM recobertas com sílica indicaram maior toxicidade no período de 48h (50, 100, 200, 800µg/ml). A análise dos dados sugere que pode ter ocorrido interferência devido à aglomeração e maior precipitação destas nanopartículas no fundo das placas de cultura. No teste de viabilidade celular no período de 72 horas, a citotoxicidade das NPM do grupo B aparentemente foi maior que as NPM do grupo A. Houve uma redução da quantidade de células vivas conforme o aumento da concentração de NPM, indicando, assim, nos dois casos, maior morte celular a partir de concentrações maiores que 600µg/ml, onde a proporção de células viáveis foi menor que 60%. Em conclusão, este estudo mostrou que, em geral, as NPM puras, sem recobrimento, não apresentaram citotoxicidade significativa no ensaio do MTT em comparação com aquelas recobertas por sílica em células tumorais de rim (786-0). No entanto, devem ser conduzidos outros estudos para demonstrar os efeitos destas nanopartículas magnéticas em outros tipos de células tumorais humanas. Palavras-chave: magnetita; cultura de células; nanotecnologia.