MESTRANDO:

ALDO LUIS BORGES XAVIER

ORIENTADOR:

PROF. DR. WAGNER FÉLIX PEREIRA

Titulo: IDENTIFICAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LECTINAS PRESENTES

EM ESPÉCIES DE CURCUBITACEAS NATIVAS DO BIOMA CAATINGA.

Identificar e Caracterizar lectinas em espécies cucurbitáceas do gênero Apodonthera.

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TEMA

Quais dentre as espécies de cucurbitáceas pré-

selecionadas contém quantidade de lectinas

significante e quais métodos podem ser empregados

para isola-las?

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Pergunta:

De acordo com a literatura e pesquisas em outras espécies de

cucurbitáceas é comum a presença da proteína lectina.

Levando-se em consideração os presentes estudos, espera-se

obter êxito nas espécies do gênero Apodonthera e obter

quantidade significante de lectinas.

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Hipótese

Identificar, isolar, purificar e caracterizar

parcialmente lectinas de espécies de cucurbitáceas

nativas do bioma caatinga do gênero Apodanthera.

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Objetivo Geral

1. Determinação da concentração de proteínas pelo método de

BRADFORD;

2. Purificação da lectina por Cromatografia de Afinidade e

determinar a concentração da proteína por espectrometria;

3. Determinação da pureza da proteína por Eletroforese em Gel

de Poliacrilamida (SDS-PAGE);

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Objetivo Específicos

4. Determinação da massa molecular por Espectrometria de

Massa (SM);

5. Determinar a atividade hemaglutinante;

6. Determinar a inibição da atividade hemaglutinante por

açúcares;

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Objetivo Específicos

7. Determinar o efeitos: do calor, do pH e do EDTA e de cátions

divalentes sobre a atividade hemaglutinante;

8. Determinação de concentração inibitória mínima (CIM) contra

microrganismos patógenos;

9. Avaliação de presença de glicídios constituintes.

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Objetivo Específicos

Métodos e Técnicas

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PPRNSA 10

Para iniciar a purificação,

inicialmente é necessário extrair

a proteína de interesse para um

meio líquido, exceto se ela já

estiver naturalmente presente em

um meio líquido.

Material Vegetal Glicina 0,1 M

pH 2,6

Homogeinização

Extração com Tampões

Acetato de

sódio 0,1M pH

5,0

Fosfato de sódio

0,1M pH 6,55

Borato de sódio

0,1M pH 10,0

Tris-HCl 0,1M

pH 7,8

Filtração/ Centrifugação

Testes Hemaglutinante

Precipitação (Sulfato de Amônio, 90%)

Centrifugação (10.000xg)

Solubilizado em Tris- HCl 50mM pH 7,8

Fração 0/90% (F0/90).

Etapa de Purificação

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DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

Os métodos geralmente mais utilizados são: • Biureto; • Lowry; • “Coomassie brilliant blue” BG-250 ou

reagente de Bradford; • BCA ou reagente de Smith. • Ultravioleta absorção a 280 nm

Método de Bradford: • Determinação de proteínas totais • proteínas que contém aminoácidos

de cadeias laterais básicas ou aromáticas;

• Absorve fortemente em 595 nm. • como padrão a albumina sérica

bovina (BSA).

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CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Fração 0/90% (F0/90).

Cromatografia de

Afinidade

Coluna de galactomanana de

Adenanthera pavonina L. reticulada

com epicloridrina e equilibrada com

Tris- HCl 50mM pH 7,8

PICO I PICO II

Medida da Concentração Espectrofotômetro 280 nm

Fração Não Retida

Eluição

Fração Retida

Dializar com água e Liofiliza

Purificação da Lectina

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

ESPECTROMETRIA DE MASSA

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Determinação da Pureza da Proteína

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE)

Proteína Liofilizada

Tampão Padrão +

fervura

Gel com malha 15% com Marcador

Molecular

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Verificar sua pureza;

Determinar sua massa molecular.

ESPECTROMETRIA DE MASSA

Lectina

Diluição: Água + ácido Fórmico 0,1 %

Alíquota: Reduzida com Ditiotreitol + Iodoacetamida

Espectrofotometria

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Determinação Da Atividade Hemaglutinante

Lectina

• Serão empregadas amostras de eritrócitos; • Diluições seriadas em tubos de ensaio

segundo; • Expresso em unidade de hemaglutinação

(UH.mL-1)

Titer = 32 HA units/ml

1:8

1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

8 16 32 64 128 256

Lectina

Diluição Seriada

Mistura com celulas

vermelhas do

sangue

Vista lateral

Vista superior

Unidade HA : quantidade minima de lectina capaz de provocar

completa aglutinação da celulas vermelhas do sangue.

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A ausência de aglutinação é indicador de uma reação positiva;

INIBIÇÃO DA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE POR AÇÚCARES

1:8

1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

8 16 32 64 128 256

Açúcares

Diluição Seriada

Mistura com

eritrócitos

Vista lateral

Vista

superior

A especificidade de ligação da lectina a carboidrato será determinada pelo ensaio de inibição utilizando as seguintes soluções de açúcares (concentração inicial de 500 mM): D-galactose, D-lactose, D-manose, D-glucose, D-frutose, D-sacarose, D-lactulose, D-trealose e D-maltose.

(+) (+) (+) (-) (-) (-)

Incubação da lectina em banho-maria por 30 min no intervalo de 20 °C

a 100 °C, com incremento de 10 ºC;

Após incubação, as amostras são resfriadas em banho de gelo e

usadas para ensaios de hemaglutinação.

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EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE

Será incubando 100 μL da lectina obtida (1,0 mg.mL-1) com 100 μL dos

seguintes tampões:

Acetato de sódio 100 mM (pH 5,0), citrato de sódio 100 mM (pH 6,5),

fosfato de sódio 100 mM (pH 7,5), Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) e borato de

sódio 100 mM (pH 10,0) por 30 min a 37 ºC.

Em seguida adiciona-se a mesma quantidade de suspensão de

eritrócitos 2%(v/v), incuba-se novamente e os resultados são

observados macroscopicamente.

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EFEITO DO PH NA ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE

A dependência de cátions divalentes (Ca2+ e Mn2+) para a

atividade hemaglutinante da lectina deverá ser determinada

pelo método da dupla diluição seriada usando EDTA como

agente quelante, conforme PAJIC et al. (2002).

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EFEITO DO EDTA E DE CÁTIONS DIVALENTES SOBRE A ATIVIDADE HEMAGLUTINANTE

A presença de carboidratos neutros na lectina isolada será

determinada pelo método de Dubois et al. (1956).

Utiliza-se como padrão solução de D-glucose (1μg.mL-1) e 100 μL

da substância (1mg.mL-1), com leitura em espectrofotômetro.

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AVALIAÇÃO DE PRESENÇA DE GLICÍDIOS CONSTITUINTES

A CIM será determinada pelo método de microdiluição em caldo de cultura Brain Heart Infusion

(BHI) de acordo com a metodologia descrita pelo CLSI, 2009.

Culturas microbianas puras mantidas em ágar sob refrigeração, serão repicadas para caldo infusão (caldo BHI) e incubadas a 37ºC até atingirem fase exponencial de crescimento (4-6h).

Após esse período, as culturas terão sua densidade celular ajustada em meio BHI estéril, de modo a se obter uma turbidez equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1,5 × 108 UFC.mL-1). A suspensão obtida será diluída 100 vezes, em solução salina 0,15M estéril, seguida de contagem de cultura. Aos poços da microplaca adiciona-se 100 μL de caldo BHI, 50 μL da lectina em diferentes concentrações e por fim, 50 μL da suspensão microbiana.

Logo após, as microplacas deverão ser incubadas durante 24h em estufa bacteriológica a 37°C para posterior inspeção visual do crescimento microbiano e a leitura das absorbâncias em leitora de Elisa Bio-Tek a 620 nm. A CIM é considerada a menor concentração da substancia (lectina) capaz de inibir o crescimento das cepas testadas, constatado pela ausência de turvação visível do crescimento microbiano ou pelas leituras de absorbância quando a amostra por si só gera turvação quando em contato com o meio.

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DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) CONTRA MICRORGANISMOS PATÓGENOS

Os dados serão analisados utilizando uma análise de uma via de variância

(ANOVA) (General Linear Models).

Um teste de Tukey será usado para identificar os meios que diferiam quando

a ANOVA indicou significância estatística. Para este teste, os valores de

p<0,05 serão considerados significativos.

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Estatisticas

Espera-se com a purificação e caracterização desta nova lectina

apresente atividade biológica para uma diversidade de

aplicações, tais como: antibacteriana, anticâncer, anti-

inflamatório e da biotecnologia e ao seu posterior uso como

drogas para doenças.

PPRNSA 24

Resultados Esperados