Identificando a programação genética da célula através do uso dos microchips de DNA Ana...

Identificando a programação genética da célula através do

uso dos microchips de DNA

Ana Carolina DeckmannLaboratório de Genômica e Expressão

Depto. Genética e Evolução - Instituto de Biologia - Unicamp

Minicurso “Da Genômica à Biotecnologia” - Minicurso “Da Genômica à Biotecnologia” - IV Semana de Química/ 2004IV Semana de Química/ 2004

Projetos Genoma: o que nos dizem?

• Projetos Genoma: deciframento das sequências de DNA, sua organização e estrutura.

• Ao decifrar um genoma, resta a dúvida: se todas as células de um organismo carregam o mesmo genoma, O QUE as torna diferentes umas das outras???

Estudos funcionais

Introdução aos chips de Introdução aos chips de DNADNA

• Os chips de DNA fornecem um método conveniente para explorar o genoma em um nível molecular.

• Análise de milhares de informações genéticas em um único experimento.

• A utilização desta técnica suporta muitas possibilidades e novas aplicações surgem diariamente.

Os Biochips e sua importância

Atualmente, as principais aplicações são:

• Genômica funcional (um genoma)

• Genômica comparativa (vários genomas)

• Genotipagem (SNPs)

• Estudo da cromatina (ChIP-ON-CHIP)

Os Biochips e sua importância

Fundamentos teóricosFundamentos teóricos

•PROPRIEDADE 1) a estrutura em dupla hélice é mantida unida pela complementariedade entre as bases nucleotídicas.

Fundamentos Teóricos


• Consequência: hibridização

DNA fita dupla

DNA desnaturado

hibridização

• PROPRIEDADE 2) a produção de proteínas depende de etapas intermediárias em que o DNA é transcrito em moléculas de RNAm COMPLEMENTARES à sequência do gene!


DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

• Consequência: a função gênica pode ser estudada através das etapas de transcrição!

• COMO?

• Medindo quantos híbridos se formam entre DNA e mRNA, e assim quantificando a expressão gênica numa situação de interesse, p.ex., câncer!

• COMO QUANTIFICAR A FORMAÇÃO DE HÍBRIDOS?


transcrição reversa na presença de bases marcadas

CGATTAGC

cDNA marcado

genoma

gene A

transcrição

expressão do gene A

DNACGATTAGC

RNAmGCUAAUCG

transcrição reversa

cDNACGATTAGC

tradução

Proteína A


célula

• DNA marcado por radioatividade

Estudos clássicos de expressão gênica (caso a caso). Ex: Northern blotting.


1) isolar as mensagens produzidas em uma célula (mRNA) e imobilizá-las em um suporte sólido.

2) marcar a sequência do gene de interesse durante a reação de polimerização.

3) Hibridizar!

C 1h 3h 6h 12h 48h

Gene -MHC

rRNA 28S

rRNA 18S

Northern blotting


1) isolar um grande número de genes (BIBLIOTECA DE cDNA) e organizá-los lado a lado em um suporte sólido.

2) marcar as mensagens produzidas em uma célula com radioatividade ou fluorescência durante a reação de transcrição reversa.

3) Hibridizar!


• DNA marcado por fluorescência: macro- e microarrays

Chip Cp Chip Rn


Fabricação dos biochips Fabricação dos biochips de DNAde DNA

BIBLIOTECA DE cDNA

Placas 384 fita molde

fita molde

produtos

X ciclos

AMPLIFICAÇÃO

Eletroforese dos insertos da biblioteca de cDNA de coração de rato.

PRODUÇÃO DOS MICROARRANJOS

Fonte: Genomics Solutions. http://www.genomicsolutions.com

Flexys Robot (Perkin Elmer)

Deposição automatizada dos clones em posições pré-determinadas.

ESPOTAGEM

Organização da biblioteca em microplacas 384.


SÍNTESE DAS SONDAS FLUORESCENTES

MARCAÇÃO DAS SONDAS

C 1 3 6 12 48

RNA total

RNA[controle]

Cy3

Cy5

x RNA[exp]


MICROARRANJO

HIBRIDAÇÃO

SPOT

DNA fita simples Hibridação com as sondas

desnaturadas

SCANNER

GeneTAC 2000 (Perkin Elmer)Fonte: Genomics Solutions. http://www.genomicsolutions.com

GRADE


EXCITAÇÃO DAS SONDAS E CAPTURA DOS SINAIS

fonte de luz

570nm

670nm

absorção emissão

550nm

Cy3

649nm

Cy5


Esquema do endereçamento dos pontos na imagem.

abcd

ef

gh

ij

k

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4PROCESSAMENTO DA IMAGEM

A1.a2

Estimativa computacional das intensidades de fluorescência emitidas por Cy3 e por Cy5 e cálculo da razão.

Address

Total Intensity (Cy3)

Total Intensity (Cy5) Ratio

Plate Name

Plate Well

A1.a1 40032 44144 1.86 1 A1A1.a10 1355840 537744 0.67 2 I17A1.a11 17600 38712 3.71 1 A1A1.a2 1309408 329272 0.42 2 I17A1.a3 106576 29248 0.46 2 A21A1.a5 35560 33472 1.59 1 A1A1.a6 1269856 505080 0.67 2 I17A1.a7 117472 5912 0.08 2 A21A1.a8 64224 18032 0.47 3 I17A1.a9 107552 20904 0.33 2 A21

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

A1.a7


Geração de dados de Expressão Gênica

intensidade Cy5 intensidade Cy3 = razão de expressão

Razão > 1(gene induzido Cy5)

Razão = 1 Razão < 1(gene induzido Cy3)

Geração de dados de Expressão Gênica

Data miningData mining

• Ao considerar cada um dos n chips produzidos como uma das n observações para um dado gene, é possível aplicar técnicas de análise multivariada para extrair significados biológicos dos experimentos de microarranjos de DNA.

• Clustering algorithms: reconhecer padrões nas distribuições de dados, normalmente através de métricas de distância.

• Tipos:• Aglomerativos: Hierarchical• Divisivos: k-means, SOMs• Outros: Principal Component Analysis (PCA)

Data mining

Data mining

• A representação gráfica assume a forma de uma curva normal. • A transformação logarítmica permite representar repressões e induções de igual magnitude como valores numericamente iguais mas de sinais diferentes.•Eisen e col. (1998): LOG positivo = vermelho (gene induzido) LOG negativo = verde (gene reprimido)

Razão 0,5 ------ Log0,5 = -1 Razão 1,0 ------ Log1 = 0

Razão 2,0 ------ Log2 = 1

Distância=0,5

Distância=1,0

Distância=1,0

Distância=1,0

Data mining

Gen

e 1

Gen

e 2

Gen

e 3

Gen

e 4

Gen

e 5

Gen

e 6

Gene1 0 1.5 1.2 0.25 0.75 1.4

Gene2 1.5 0 1.3 0.55 2.0 1.5 Gene3 1.2 1.3 0 1.3 0.75 0.3Gene4 0.25 0.55 1.3 0 0.25 0.4 Gene5 0.75 2.0 0.75 0.25 0 1.2 Gene6 1.4 1.5 0.3 0.4 1.2 0

• Após o cálculo da distância, o ponto de partida dos algoritmos de clustering é gerar uma matriz de distância.

• Os elementos da matriz são distâncias entre pares (pairwise distance).

Aplicações

Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.

PNAS, 95 (1998)

Michael B. Eisen, Paul T. Spellman, Patrick O. Brown, and David Botstein

The Transcriptional Program of Sporulation

in Budding Yeast

Science, 282 (1998)

S. Chu, J. DeRisi, M. Eisen, J. Mulholland, D. Botstein, P. O. Brown, I. Herskowitz

Aplicações

Molecular Classification of

Cancer: Class Discovery and Class Prediction by Gene

Expression Monitoring.

Science, 286 (1999)

T. R. Golub, D. K. Slonim, P. Tamayo, et al.

Aplicações

Biochips de Biochips de oligonucleotídeosoligonucleotídeos

• Principais áreas em que a aplicação dos chips de oligonucleotídeos podem acelerar os estudos em genômica:

•Expressão gênica

•Genotipagem

•Mapeamento de bibliotecas genômicas

Biochips de Oligonucleotídeos

Técnica de microimpressão: Técnica de microimpressão: FOTOLITOGRAFIAFOTOLITOGRAFIA

• Esta técnica de fabricação in situ foi desenvolvida pela empresa americana Affymetrix, que utiliza para fabricar os GeneChips.



• Diferenciais:

1) alta densidade permite representação de genomas completos.

2) refinamento da técnica de microimpressão permite criar mutações (mismatchs) de sequências conhecidas.

3) quantificações mais precisas/ alta sensibilidade.


Extração DNA

cromossômico

Gene A

Amplificação por PCR na presença de fluoróforo

Cópias marcadas do

gene AHibridização com chip de

oligos


Gene A

MISMATCH SINALMISMATCH SINAL1A 1A C G G T A C T C G G T A C T aa G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T gg G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T cc G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T tt G A G G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++

1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T T aa A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T T gg A G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T T cc A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T T tt A G A G G C T A G C T A 1 1 + +

1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G T G aa G G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G T G gg G G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G T G cc G G G C T A G C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G T G tt G G G C T A G C T A 1 1 + +

1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A aa G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A gg G C T A G C T A 0 0 ++ ++1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A cc G C T AG C T A 1 1 + +1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A tt G C T A G C T A 1 1 + +

Padrão normalPadrão afetado

1 2 3 4

AGCT

Pessoa 1: normal


Gene A

MISMATCH SINALMISMATCH SINAL1A 1A C G G T A C T C G G T A C T aa G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T gg G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T cc G A G G A G G C T A G C T A 0 0 ++ ++1T 1T C G G T A C T C G G T A C T tt G A G G A G G C T A G C T A 1 1 + +

1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T T aa A G A G G C T A G C T A 2 2 - -1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T T gg A G A G G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T T cc A G A G G C T A G C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T T tt A G A G G C T A G C T A 2 2 - -

1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G T G aa G G G C T A G C T A 1 1 + +1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G T G gg G G G C T A G C T A 2 2 - -1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G T G cc G G G C T A G C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G T G tt G G G C T A G C T A 2 2 - -

1A 1A C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A aa G C T A G C T A 2 2 - -1G 1G C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A gg G C T A G C T A 1 1 + +1C 1C C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A cc G C T AG C T A 2 2 - -1T 1T C G G T A C T C G G T A C T T G A T G A tt G C T A G C T A 2 2 - -

Padrão normalPadrão afetado

AGCT

1 2 3 4

Pessoa 2: afetada

ChIP-on-CHIPChIP-on-CHIP

Chromatin Chromatin Imunnoprecipitation Imunnoprecipitation

microarraysmicroarrays

Chromatin Imunnoprecipitation microarrays

• Normalmente, nos biochips estão representadas as partes codificantes do genoma (ESTs, cDNAs).


• Objetivo: identificar no DNA genômico os sítios de ligação a TFs, histonas e polimerases.

• Biochips de oligonucleotídeos longos (60 pb) de ORFs e regiões intergênicas.• Representação de genomas completos (~40Mb)• Sondas: DNA imunoprecipitado x controle (precipitação sem anticorpo)

Maior sinalconfirmação

da especificidade

da ligação!

mais fragmentos do DNA

correpondente ligados nas proteína de interesse


(~1kb)(~1kb)

Projetos em andamento

LGE

Estudo do perfil da expressão gênicaglobal em leucemias linfóides agudas de

linhagens de células B e T

Aluna : Diana Azevedo QueirozOrientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira

Laboratório de Genômica e Expressão – Departamento de Genética e Evolução – Instituto de Biologia - Unicamp

Dissertação de Mestrado em Biologia Funcional e Molecular

Análise do Perfi l de ExpressãoGênica de Mediadores

I nflamatórios em CélulasMononucleares de Pacientes

com Trombose Venosa Prof undaAlunaAluna: Michelle: Michelle Servais Rubin Servais Rubin

OrientadoraOrientadora: J oyce Maria: J oyce Maria Annichino Annichino--BizzachiBizzachi

HEMOCENTRO

UNICAMP

ESTUDO DA EXPRESSAO GENICAGLOBAL ENVOLVIDA NA PROTECAO

CARDIACA INDUZIDA PORPRECONDICIONAMENTO

ISQUEMICO E PORCOMPOSTOS QUINAZOLINICOS

Aluna : Ana Carolina Deckmann *Orientador: Prof. Dr. Kleber Gomes Franchini

* Laboratório de Genômica e Expressão – Departamento de Genética e Evolução – IB/ Unicamp Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Ciências Médicas – Unicamp;

GeneProjects - interface microarrays

Perspectivas LGE

Implementar ferramenta que faça o caminho inverso.

Consolidar procedimentos para produção de chips para screening e chips para investigação direcionada.

Definir protocolos alternativos para marcação das sondas.

Implementar sistema de Facility.

E-mail: [email protected]: [email protected]

LGE/Unicamp - Inst. Biologia

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