IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE SUSCETIBILIDADE A ...

i

ADENILZA CRISTINA DA SILVA FONSECA

IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE SUSCETIBILIDADE A

ANTIFÚNGICOS DE AGENTES CAUSAIS DE MUCORMICOSE

UNICAMP

2014

iii

UNICAMP

2014

vii

DEDICO ESTE TRABALHO...

Á Deus por todos os acontecimentos durante este caminho....

A minha família pelos ensinamentos de coragem, pelos conselhos e por sempre

estarem do meu lado mesmo distantes....

Ao meu marido Douglas pelo amor, incentivo e apoio incondicional....

A todos os meus amigos, especialmente meus amigos de pós-graduação, sempre

prontos a me ajudar.

Compartilho esta conquista com vocês.

ix

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais pelo amor, confiança, apoio e compreensão nesta

jornada;

Ao meu marido Douglas pela força e apoio nos momentos de

dificuldade de forma incondicional;

À minha orientadora Profa. Dra. Angélica Zaninelli Schreiber pelos

conselhos, ensinamentos, compreensão, paciência e pela grande oportunidade de

minha vida de trabalhar ao seu lado e de tantas pessoas exemplares. Agradeço

imensamente por toda a orientação concedida contribuindo tanto para o meu

crescimento científico quanto pessoal.

À profa. Dra. Fernanda Simas Correa pelos ensinamentos iniciais e pela

paciência.

À Profa. Dra. Ana Beatriz Alkmim Teixeira-Loyola que me ajudou

sempre em todos os momentos que eu mais precisava, principalmente com os

experimentos realizados com o Biocell - Tracer®, no esclarecimento de dúvidas e

ensinamentos transmitidos. Agradeço muito pela co-orientação na elaboração do

artigo e deste trabalho.

A todos os docentes do Mestrado em Ciências Médicas/FCM/

UNICAMP pela dedicação e conhecimentos transmitidos.

Aos todos os meus colegas de graduação e pós-graduação pelo

companheirismo e troca de informações durante as disciplinas do curso e em

especial Michela Ferrari, Franqueline Reichert, Marcela Souza, Isabela Hadadd,

Laís e Pâmela, pela amizade, pela ajuda e apoio.

A todos os funcionários da Pós-Graduação em Ciências Médicas/FCM/

UNICAMP e do Departamento de Patologia Clínica pelo apoio e orientações.

A todos os meus colegas do Laboratório de Microbiologia e do

Laboratório de Investigação em Fungos, do Departamento de Patologia

Clínica/FCM/UNICAMP, em especial Luzia Lyra e Edson, pela amizade,

ensinamento, ajuda, disponibilidade, paciência e sábios conselhos. Agradeço a

todos pelo apoio durante a execução deste trabalho.

xi

A todos os funcionários e colegas do Laboratório de Epidemiologia

Molecular e Doenças Infecciosas da FCM/UNICAMP, em especial Érivan Ribeiro,

Ariane Fidelis Busso e Cibele Tararam, pela paciência, amizade, companheirismo

e ajuda constante durante a execução deste trabalho. Agradeço também a profa.

Dra. Maria Luiza Moretti.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –

CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.

A Fundação de Amparo a Pesquisa do estado de São Paulo - FAPESP,

pela concessão do auxílio ao projeto de pesquisa.

Á Japan International Corporation Agency – JICA, pelo apoio financeiro

para realização desta pesquisa.

Ao Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicosis da

Universidade de Chiba, Chiba – Japão pela colaboração.

Enfim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a

realização deste trabalho.

Muito obrigada!

xiii

"Não importa onde você

parou... em que momento da

vida cansou... o que importa é

que sempre é possível e

necessário recomeçar”

(Carlos Drummond de Andrade)

xv

RESUMO

Introdução: Mucormicose é uma infecção oportunista invasiva causada por fungos

filamentosos denominados de Mucorales, antes Zygomycetes, de difícil tratamento e, com

mau prognóstico em pacientes imunocomprometidos, caracterizada por manifestações

rinocerebrais, pulmonares ou disseminadas. Espécies dos gêneros Rhizopus, Mucor,

Absidia (Lichtheimia) e Rhizomucor, são os Mucorales mais isolados de pacientes. São

micro-organismos resistentes a voriconazol e equinocandinas in vitro e in vivo. A terapia

inclui a reversão dos fatores predisponentes, retirada cirúrgica da área infectada e

administração de antifúngicos, em geral, anfotericina B, de atividade terapêutica limitada e

muitos efeitos colaterais. Objetivos: Identificação dos isolados de Mucorales

selecionados para o estudo por metodologia clássica e técnicas moleculares;

padronização da técnica de microdiluição em caldo para avaliação de suscetibilidade aos

antifúngicos isolados: anfotericina B; 5-fluorocitosina; fluconazol; micafungina; itraconazol;

voriconazol; miconazol e terbinafina de outros gêneros de Mucorales que não Rhizopus

spp.; avaliação da Concentração Inibitória Fracional para determinação do tipo de

interação que ocorre entre as combinações de antifúngicos anfotericina B x itraconazol;

anfotericina B x voriconazol; terbinafina x itraconazol; terbinafina x voriconazol e

terbinafina x anfotericina B; padronização da metodologia de avaliação dinâmica de

crescimento para o gênero Rhizopus sp. e Rhizopus oryzae (LIF 1832), para possível

estabelecimento de correlação clínico-laboratorial já que este foi isolado de um paciente

em tratamento de mucormicose. Metodologia: Estudo realizado com 10 isolados clínicos

de Mucorales com identificação morfológica prévia de gênero. A identificação molecular

foi realizada com os iniciadores ITS1/ITS4; ITS4/ITS5 e NL1/NL4. Os testes de

suscetibilidade aos antifúngicos isolados, in vitro, foram realizados pelo método de

microdiluição em caldo (CLSI M38-A2). Os antifúngicos combinados foram analisados de

acordo com a metodologia do “tabuleiro de xadrez”. Já a avaliação dinâmica de

crescimento de hifas frente aos antifúngicos anfotericina B, itraconazol e terbinafina para

o isolado Rhizopus oryzae (LIF 1832) foi realizada através do sistema Biocell-Tracer.

Resultados: As identificações morfológica e molecular foram discordantes para os

isolados LIF 1237 e 1832, classificados morfologicamente como Absidia (Lichtheimia) sp.

e Rhizomucor sp. e identificados como Rhizopus oryzae após sequenciamento de DNA.

Considerando todos os isolados, as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram de: 8

a ≥ 16 µg/mL para micafungina, de 0,25 a 8 µg/mL para anfotericina B, ≥ 64 µg/mL para

xvii

5-fluorocitosina, de 16 a ≥ 64 µg/mL para fluconazol, de 1 a > 8 µg/mL para itraconazol, >

8 µg/mL para voriconazol; de 0,25 a 4 µg/mL para miconazol e de 0,031 a > 128 µg/mL

para terbinafina. As interações resultantes da combinação de antifúngicos foram de: 100%

de sinergismo entre anfotericina B x voriconazol e anfotericina B x itraconazol; 90% de

sinergismo entre terbinafina x itraconazol; 80% de sinergismo entre terbinafina x

voriconazol e 100% de sinergismo para a combinação de terbinafina x anfotericina B. As

taxas de inibição de crescimento das hifas do isolado Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente

aos valores de CIMs obtidos pelo método de microdiluição em caldo foram: 88.25% para

anfotericina B; 0% para itraconazol e 98,70% para terbinafina. O teste com a combinação

de concentrações séricas de itraconazol e terbinafina resultaram em 49,8% de taxa de

inibição. Conclusões: Foi observada divergência entre identificação morfológica e

molecular para dois isolados. Perfis diferentes de sensibilidade aos antifúngicos foram

observados dependendo das espécies. Os antifúngicos mais ativos contra a maioria dos

isolados foram anfotericina B e itraconazol. Valores de CIM bem baixos para terbinafina

foram observados para Cunninghamella bertholletiae e Syncephalastrum racemosum e

todos os isolados foram altamente resistentes a micafungina, 5-fluorocitosina, fluconazol e

voriconazol. Os testes de antifúngicos combinados mostraram redução da CIM dos

antifúngicos em associação. CIMs elevadas para terbinafina foram observadas para os

isolados de R. oryzae e R. stolonifer enquanto que no teste de combinação valores baixos

de CIMs foram encontrados, o que ressalta a importância da combinação de antifúngicos

no manejo de mucormicose. A taxa de inibição do crescimento das hifas para o isolado

LIF 1832 frente aos antifúngicos isolados sugere que hifas podem ser mais suscetíveis

que esporos frente aos antifúngicos avaliados. Apesar de não muito alta, a taxa de

inibição de crescimento das hifas frente à anfotericina B e à combinação das

concentrações séricas de terbinafina e itraconazol pode estar favoravelmente relacionada

ao desfecho clínico do paciente em tratamento de mucormicose.

Palavras-Chave (DECS): Mucormicose, antifúngicos, hifas, esporos fúngicos, biologia

molecular

xix

ABSTRACT

Introduction: Mucormycosis is an invasive opportunistic infection caused by filamentous

fungi called Mucorales (formerly Zygomycetes), difficult to treat, and with poor prognosis in

immunocompromised patients, characterized by rhino-cerebral, pulmonary or

disseminated manifestations. Species of the genera Rhizopus, Mucor, Absidia

(Lichtheimia) and Rhizomucor are the Mucorales most commonly isolated from patients

and show resistance to voriconazole and echinocandins in vitro and in vivo. Therapy

includes to reverse predisposing factors, surgical removal of the infected area and

administration of antifungal agents, in general, Amphotericin B, with limited therapeutic

activity and many side effects. Objectives: identification of selected Mucorales isolates by

morphological and molecular methods; standardization of broth microdilution for antifungal

susceptibility assessment of other Mucorales genera except Rhizopus to the alone

antifungals: amphotericin B, fluorocytosine, fluconazole, Itraconazole, voriconazole ;

miconazole and terbinafine; establish Fractional Inhibitory Concentration to determine the

type of interaction that occurs between combinations of Amphotericin B/Itraconazole;

Amphotericin B/Voriconazole; Terbinafine/Itraconazole; Terbinafine/Voriconazole and

Terbinafine/Amphotericin B; standardization of the dynamic growth methodology for

evaluation Rhizopus sp. and study of isolate Rhizopus oryzae (LIF 1832), for possible

establishment of clinical-laboratory correlation this was isolated from a patient undergoing

treatment for mucormycosis. Material and Methods: This study evaluated 10 clinical

Mucorales isolates with previous morphological gender identification. The molecular

identification was performed with primers ITS1/ITS4; ITS4/ITS5 and NL1/NL4. The

antifungal susceptibility in vitro was performed by broth microdilution method (CLSI M38-

A2). Antifungal combinations were analyzed according to the "chessboard" methodology .

The dynamic evaluation of hyphal growth for the isolate Rhizopus oryzae (LIF 1832) for

the antifungals amphotericin B, terbinafine and itraconazole, was carried through the

BioCell-Tracer system. Results: The morphological and molecular identifications were

discordant for LIF 1237 and LIF 1832 isolates, classified morphologically as Absidia

(Lichtheimia) sp. and Rhizomucor sp. and after DNA sequencing both as Rhizopus oryzae.

Considering all isolates, the minimum inhibitory concentrations (MICs) were 8 to ≥ 16

µg/mL for Micafungin; from 0.25 to 8 µg/mL for Amphotericin B , ≥ 64 µg/mL for 5 –

Fluorocytosine; of 16 to ≥ 64 µg/mL for Fluconazole; 1 to > 8 µg/mL for Itraconazole; > 8

µg/mL for Voriconazole ; 0.25 to 4 µg/mL for Miconazole and from 0.031 to > 128 µg/mL

xxi

for Terbinafine. Interactions resulting from the combination of antifungals were: 100%

synergism for Amphotericin B/Voriconazole and Amphotericin B/Itraconazole; 90%

synergism between Terbinafine/Itraconazole; 80% synergism between

Terbinafine/Voriconazole and 100% synergism for the combination Terbinafine/

Amphotericin B. The hyphae growth inhibition rates obtained for microdilution method MIC

values for Rhizopus oryzae (LIF 1832) were 88.25%, for Amphotericin B; 0% for

itraconazole and 98.70% to terbinafine. Combined Itraconazole and Terbinafine serum

concentrations showed 49.8% of growth inhibition rate. Conclusions: Divergence

between morphological and molecular identification for two isolates was observed.

Different antifungal susceptibility profiles were observed depending on the species. The

most active antifungal agents were Amphotericin B and Itraconazole. MICs for Terbinafine

very low were observed to the Syncephalastrum racemosum and C.bertholletiae and all

isolates were highly resistant to Micafungin, 5- Fluorocytosine, Fluconazole and

Voriconazole. It was possible to observe antifungal MIC reduction in combined tests. MICs

high for terbinafine alone were observerd to the Rhizopus oryzae and Rhizopus stolonifer

while in the combo test low MIC values were observed, which highlights the importance of

combining antifungal drugs in the management of mucormycosis. The hypha growth

inhibition rates obtained for Rhizopus oryzae (LIF 1832) against antifungal isolates

suggest that hyphae may be more susceptible to antifungal agents against spores.

Although not too high, the hyphae growth inhibition rate obtained for the combination

serum achievable concentrations of Terbinafine and Itraconazole can probably be related

to the clinical outcome.

Key words: Mucormycosis, antifungals, hyphae, spores, molecular biology.

xxiii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Regiões do rRNA: subunidade ribossomal pequena (SSU)

subunidade ribossomal grande (LSU)

53

FIGURA 2: Esquema representativo do sistema BioCell-Tracer 57

FIGURA 3: Fotografia do aparelho BioCell-Tracer 58

FIGURA 4: Monitorização do crescimento da hifa 59

FIGURA 5: Elementos utilizados para o cálculo do crescimento de hifas 59

FIGURA 6: Esquema de preparo da placa de microtitulação para o teste 71

FIGURA 7: Esquema representativo da montagem e leitura da placa de

microdiluição no teste de combinação de antifúngicos pelo

método do “tabuleiro de xadrez”

75

FIGURA 8: Estruturas características da morfologia do isolado de

Cunninghamella bertholletiae (LIF 299, 300 e 301)

81


Rhizopus sp. (LIF 1046, 1143 e 1455 e 1820)

82

FIGURA 10: Estruturas características da morfologia do isolado de Absidia

(Lichtheimia) sp. (LIF 1237)

82


Rhizomucor sp. (LIF 1832)

83


Syncephalastrum sp. (LIF 1834)

83

FIGURA 13: Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos obtidos pela

amplificação pela PCR

85

xxv

FIGURA 14: Filogenia e comparação entre identificação morfológica e

molecular para os isolados em estudo

86

FIGURA 15: Acompanhamento de crescimento de hifas de Rhizopus

oryzae (LIF 1832) frente ao antifúngico anfotericina B nas

concentrações de 0,5; 0,25; 0,125 e 0,06 µg/mL

95


oryzae (LIF 1832) frente ao antifúngico terbinafina nas

concentrações de 128; 64 e 32 µg/mL

95

FIGURA 17: Porcentagem de inibição de crescimento de hifas de

Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente ao antifúngico anfotericina

B nas concentrações de 0,5; 0,25; 0,125 e 0,06 µg/mL

96


Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente ao antifúngico terbinafina

nas concentrações de 128; 64 e 32 µg/mL

96


oryzae (LIF 1832) frente aos antifúngicos anfotericina B,

itraconazol e terbinafina nas concentrações de 0,25; 1,0 e

128 µg/mL, respectivamente

97


Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente as CIMs de anfotericina B,

itraconazol e terbinafina

98

FIGURA 21: Acompanhamento de crescimento do isolado Rhizopus

oryzae (LIF 1832) frente a combinação de itraconazol na

concentração de 0,25 µg/mL e terbinafina na concentração

de 1 µg/mL.

99

xxvii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Micro-organismos selecionados para o estudo 64

TABELA 2: Quantificação do DNA extraído dos micro-organismos em

estudo

84

TABELA 3: Similaridade dos resultados entre bancos de dados

disponíveis

85

TABELA 4: Valores da concentração inibitória mínima (CIM) dos

antifúngicos micafungina, anfotericina B, 5-fluorcitosina,

fluconazol, itraconazol, voriconazol, miconazol e terbinafina

frente aos isolados selecionados para o estudo

87

TABELA 5: Suscetibilidade dos isolados de Mucorales frente a

combinação de anfotericina B X itraconazol

89


combinação de anfotericina B X voriconazol

90


combinação de terbinafina x itraconazol

91


combinação de terbinafina x voriconazol 92


combinação de terbinafina x anfotericina B 93

TABELA 10: Padronização do teste no sistema automatizado Biocell-

Tracer para Rhizopus oryzae (LIF 1832) 94

xxviii

xxix

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

μL Microlitro

°C Grau Celsius

µg/mL Micrograma por mililitro

5FC 5-fluorocitosina

A Antagonismo

AMB Anfotericina B

ATCC American Type Culture Collection

BCT BioCell-Tracer®

BLAST Basic Local Alignment Tool

CCD Change Coupled Device

CIF Concentração Inibitória Fracional

CIM Concentração Inibitória Mínima

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

DNA Ácido desoxirribonucléico

Exp Exposição ao antifúngico

FCM Faculdade de Ciências Médicas

FCZ Fluconazol

h Hora

I Indiferença

xxxi

IC 100 Leitura de 100% de inibição de crescimento

IC 80

IC50

Leitura de 80% de inibição do crescimento

Leitura de 50% de inibição de crescimento

ISAV Isavuconazol

ISHAM Internacional Society for Human and Animal Mycology

ITS Internal Transcribed Spacer

ITC Itraconazol

L Valor do crescimento da hifa

L-AMB Anfotericina B liposomal

LEM Laboratório de Epidemiologia Molecular

LIF Laboratório de Investigação em Fungos

LSU Subunidade ribossomal grande

M Molar

MCF

MCZ

Micafungina

Miconazol

MEC

MEGA 5.05

Concentração Efetiva Mínima

Molecular Evolutionary Genetics Analysis versão 5

mg Miligramas

min Minutos

NaOH Hidróxido de sódio

ng/µL Nanograma por microlitro

nm Nanômetros

xxxiii

PCR Polimerase Chain Reaction

PLL Poli-L-Lisina

POS Posaconazol

Pré-Exp Pré-exposição ao antifúngico

rDNA DNA ribossomal

rRNA RNA ribossomal/ribossômico

S Sinergismo

SNC Sistema Nervoso Central

SSU Subunidade ribossomal pequena

T Tipo de Interação

t0 Tempo inicial

t1 Tempo final

TERB Terbinafina

UFC/mL Unidades formadoras de colônia/mL

VOR Voriconazol

w/v % Massa por volume %

xxxv

SUMÁRIO

Pág

RESUMO........ .............................................................................................. XV

ABSTRACT.... .............................................................................................. XIX

LISTA DE FIGURAS .................................................................................... XXIII

LISTA DE TABELAS. .................................................................................. XXVII

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. ..................................................... XXIX

1. INTRODUÇÃO. ........................................................................................ 43

1.1. Taxonomia dos Mucorales ............................................................. 43

1.1.1. Nomenclatura da doença Mucormicose. ............................... 44

1.2. Mucormicose. ................................................................................... 46

1.2.1. Tratamento de Mucormisose. ................................................ 48

1.2.2. Diagnóstico laboratorial da Mucormicose. ............................. 50

1.2.2.1. Identificação morfológica .......................................... 51

1.2.2.2. Identificação molecular............................................. 52

1.3. Testes de suscetibilidade aos antifúngicos para fungos

filamentosos .................................................................................... 55

1.3.1. Técnica de microdiluição em caldo ........................................ 55

1.3.2. Testes de suscetibilidade aos antifúngicos in vitro em

combinação ........................................................................... 55

1.3.3. Avaliação da suscetibilidade a antifúngicos utilizando

hifas (Sistema automatizado Biocell-Tracer). ........................ 56

2. OBJETIVOS. ............................................................................................ 61

3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................... 63

3.1. Local de trabalho. ............................................................................. 63

xxxvii

3.2. Micro-organismos selecionados para o estudo ................................ 63

3.2.1. Reativação dos micro-organismos ......................................... 64

3.3. Identificação morfológica .................................................................. 64

3.4. Identificação molecular. .................................................................... 64

3.4.1. Extração do DNA. .................................................................. 65

3.4.2. Amplificação pela PCR utilizando Taq DNA Polimerase ....... 66

3.4.3. Amplificação pela PCR utilizando DNA Polimerase

MigthyAmp ............................................................................. 66

3.4.4. Reação de sequenciamento. ................................................. 67

3.4.5. Análise dos dados: alinhamento e construção da árvore

filogenética ............................................................................ 68

3.5. Avaliação da suscetibilidade aos antifúngicos isolados in vitro

pelo método de microdiluição em caldo. .......................................... 68

3.5.1. Preparação do inóculo ........................................................... 68

3.5.2. Preparação do meio de cultura. ............................................. 69

3.5.3. Preparação dos antifúngicos. ................................................ 69

3.5.4. Preparação da placa do teste de suscetibilidade aos

antifúngicos isolados in vitro. ........................................................... 70

3.5.5. Controle de qualidade. ........................................................... 71

3.5.6. Leitura da concentração inibitória mínima (CIM). .................. 71

3.6. Avaliação da suscetibilidade in vitro aos antifúngicos em

combinação ....................................................................................... 73

3.6.1. Preparo do inóculo ................................................................. 73

3.6.2. Meio de cultura. ..................................................................... 73

3.6.3. Preparação dos antifúngicos ................................................. 73

3.6.4. Preparação da placa de combinação de antifúngicos. .......... 74

xxxviii

xxxix

3.6.5. Leitura do teste de combinação de antifúngicos e

determinação da Concentração Inibitória Fracional (CIF). .... 75

3.7. Avaliação da suscetibilidade a antifúngicos pela técnica de

avaliação dinâmica de crescimento através do sistema

automatizado Biocell-Tracer .............................................................. 76

3.7.1. Micro-organismo avaliado. ..................................................... 76

3.7.2. Antifúngicos avaliados ........................................................... 76

3.7.3. Placas de cultura ................................................................... 76

3.7.4. Preparação do inóculo e monitoramento do crescimento. ..... 77

3.7.5. Avaliação da suscetibilidade aos antifúngicos in vitro pelo

método de avaliação dinâmica de crescimento ..................... 77

3.7.6. Análise dos dados obtidos ..................................................... 79

4. RESULTADOS. ........................................................................................ 81

4.1. Identificação dos isolados de Mucorales ........................................... 81

4.1.1. Identificação morfológica ....................................................... 81

4.1.2. Identificação molecular ......................................................... 84

4.1.2.1. Extração do DNA. .................................................... 84

4.1.2.2. Amplificação pela PCR ............................................. 84

4.1.3. Identificação molecular e construção da árvore

filogenética ............................................................................ 85


pelo método de microdiluição em caldo (CLSI, M38-A2) .................. 86


combinação ....................................................................................... 88



automatizado Biocell - Tracer® ......................................................... 93

xli

5. DISCUSSÃO ............................................................................................ 101

5.1. Identificação dos isolados de Mucorales .......................................... 101

5.2. Testes de suscetibilidade ................................................................. 105

5.2.1. Avaliação da suscetibilidade aos antifúngicos isolados in

vitro pelo método de microdiluição em caldo (CLSI, M38-

A2) ......................................................................................... 105

5.2.2. Avaliação da suscetibilidade in vitro aos antifúngicos em

combinação . .......................................................................... 108

5.2.3. Avaliação da suscetibilidade a antifúngicos pela técnica

de avaliação dinâmica de crescimento através do

sistema automatizado Biocell - Tracer® ................................ 112

6. CONCLUSÕES ........................................................................................ 117

7. REFERÊNCIAS ........................................................................................ 119

8. ANEXOS..... ............................................................................................. 129

43

1. INTRODUÇÃO

1.1. Taxonomia dos Mucorales

A taxonomia dos agentes causais de mucormicose passou por algumas

alterações nas últimas décadas com os avanços de técnicas de biologia molecular

e estudos taxonômicos. Antes do estabelecimento do reino Fungi em 1969 por

Whittaker, os agentes causais de mucormicose, entomoftoromicose e outros

fungos que produziam hifas cenocíticas (asseptadas) e esporos sexuais

chamados “zigósporos” eram classificados na classe dos Phycomycetes

(ficomicetos). Baseando-se na similaridade morfológica das estruturas sexuais

reprodutivas, três classes eram reconhecidas: Phycomycetes, Ascomycetes e

Basidiomycetes (1).

Com o conhecimento sobre ciclo de vida, modos nutricionais, ultraestrutura

e com base nas características evolucionárias mais próximas, os taxonomistas

agruparam os fungos em seu próprio Reino (Reino Fungi) e como resultado das

mudanças significativas na classificação, a classe dos ficomicetos foi abolida,

sendo os membros dos ficomicetos reclassificados nas seguintes classes:

Zygomycetes, Chytridiomycetes, Hypochytridiomycetes, Trichomycetes e

Oomycetes. Posteriormente uma nova classificação aceita até a última década

delimitou o reino dos fungos nos seguintes filos: Chytridiomycota, Zygomycota,

Ascomycota e Basidiomycota, sendo o filo Zygomycota constituído por Mucorales

e Entomophthorales (2,3).

Nos últimos 15 anos, na tentativa de compreender as relações evolutivas,

os taxonomistas começaram a aplicar técnicas moleculares para elucidar as

linhagens fúngicas e como resultado a classificação filogenética de cada filo vem

sendo revista. A primeira mudança taxonômica no filo Zygomycota foi baseada na

filogenia molecular realizada em 2001 com a construção de uma árvore

filogenética reclassificando o filo Zygomycota como filo Glomeromycota (4).

44

Em 2007, o filo Zygomycota sofreu mais mudanças taxonômicas, quando

taxonomistas internacionais publicaram uma nova classificação filogenética do

Reino Fungi, propondo realmente a eliminação do filo Zygomycota substituindo por

Glomeromycota com os seguintes subfilos: Mucoromycotina,

Entomophthoromycotina, Kickxellomycotina e Zoopagomycotina, já que a maioria

dos estudos anteriores com a linhagem de Mucorales não tinha sido descrito

validamente, sendo agora os Mucorales pertencentes ao filo Mucoromycotina (5).

1.1.1. Nomenclatura da doença Mucormicose

O nome correto da doença é ainda questionado na literatura, uma vez que

novas classificações dos agentes causais foram propostas com base nas revisões

taxonômicas. O primeiro caso documentado de doença causada por membros de

Mucorales foi publicado em 1885 pelo patologista alemão Paltauf, o qual

correspondia a uma infecção sistêmica com envolvimento gástrico e rinocerebral,

que Paltauf descreveu como “Micose Mucorina”. No entanto, embora não

conclusiva, a morfologia do agente etiológico apresentou-se mais semelhante à

espécie de Rhizopus do que a espécie de Mucor. Posteriormente, o termo

“Mucormicose” foi utilizado pelo patologista americano R.D. Baker para definir uma

micose causada por certos membros dos Mucorales de acordo com Baker apud

(1).

Quando vários membros de ficomicetos foram relatados como patogênicos

para seres humanos, o nome de “Ficomicose” foi proposto para denominar

micoses causadas por qualquer uma das várias espécies de ficomicetos. O termo

foi útil para micoses em que o agente etiológico não foi cultivado e apenas

identificado como uma espécie desconhecida de Phycomycetes em seções

histopatológicos. ‘’Ficomicose’’ tornou-se amplamente aceito como um nome

conveniente de doença, independentemente da sua diversidade no curso clínico e

etiologia (6).

45

No entanto, Clark (7), propôs o uso do termo “Mucormicose” para as

doenças causadas por espécies de Mucorales para distinguir da “ficomicose

subcutânea” causada por fungos pertencentes aos Entomophthorales, propondo

também o termo “Entomoftoromicose” para ficomicose subcutânea.

Como o reino Fungi foi estabelecido e Phycomycetes foram reclassificados

em Zygomycetes e outras séries de novas classes, o nome da doença

“ficomicose’’ tornou-se obsoleto. Para concordar com as mudanças taxonômicas,

Ajello (8), propôs substituir o nome por ‘’ zigomicose’’. A doença foi definida como

qualquer micose causada por espécies de duas ordens: Mucorales (Actinomucor,

Apophysomyces, Cokeromyces, Mortierella, Rhizopus, Rhizomucor, Mucor,

Absidia, Cunninghamella, Syncephalastrum e Saksenaea) e Entomophthorales

(Basidiobolus e Conidiobolus). Absidia corymbifera, a principal espécie patogênica

do gênero Absidia, foi recentemente transferida para o gênero Mycocladus como

Mycocladus corymbiferus e, posteriormente reclassificada como Lichtheimia

corymbifera (9).

No entanto, verifica-se que o termo “zigomicose”, tem sido cada vez mais

usado como sinônimo de mucormicose ignorando a definição original por dois

motivos: (a) mucormicose leva a crer que a doença é causada por Mucor spp.,

porém não é a causa mais comum da doença, e (b) algumas infecções causadas

pelas espécies de Entomophthorales, embora raras, não são clinicamente

distinguíveis de mucormicose clássica (1). Contrariando tal nomenclatura,

“mucormicose” foi definida como doença causada por qualquer membro de

Mucorales e não por organismos do gênero Mucor conforme explica Baker apud

(1).

Alguns pesquisadores têm sugerido que o termo “mucormicose” seja

denominado de “Mucoralomicosis”, para denotar que o nome representa a ordem

Mucorales e não o gênero Mucor. A ordem Mucorales já esta no subfilo

Mucoromycotina de acordo com a nova classificação taxonômica. Assim

questiona-se o fato do termo “mucoralomycosis” ser alterado novamente para

“Mucoromycosis” uma vez que este considera o novo subfilo. Independentemente

46

da classificação de “Mucorales” ou “Zygomycota”, ressalta-se que as primeiras

cinco letras do nome da doença mucormicose irão suportar as futuras revisões

taxonômicas (1).

1.2. Mucormicose

Mucormicose é um termo usado para definir uma infecção potencialmente

fatal causada por fungos filamentosos pertencentes ao Filo

Glomeromycota/Subfilo Mucoromycotina, anteriormente classificados como

zigomicetos, ordem Mucorales, sendo espécies de Rhizopus, a causa mais

comum de infecção (1).

Os agentes da mucormicose são agentes causais de infecções oportunistas

que afetam, quase uniformemente, hospedeiros imunocomprometidos. Pacientes

com cetoacidose diabética são particularmente susceptíveis a murcomicose.

Pacientes imunossuprimidos por quimioterapia citotóxica ou terapia por

corticosteróides também são suscetíveis a mucormicose, e também são

significativas causas de risco de vida em pacientes com infecções angioinvasivas

com uma ampla faixa de condições imunossupressoras. Um aumento significativo

na incidência de mucormicose tem ocorrido nas últimas duas décadas e verifica-se

que mais estudos são necessários na tentativa de contribuir para o direcionamento

do tratamento adequado, uma vez que algumas espécies de Mucorales

apresentam perfis diferentes de suscetibilidade. Dada a crescente prevalência de

diabetes, câncer, transplante de órgãos e envelhecimento da população dos

Estados Unidos, o aumento da incidência de mucormicose não tem previsão de

diminuição para um futuro próximo (10).

É uma infecção rara e altamente invasiva. O comprometimento em rins

primitivos ou transplantados é raro e geralmente ocorre após infecção

disseminada. Cetoacidose diabética, imunossupressão por quimioterapia

citotóxica ou terapia por corticosteróide são fatores predisponentes. Quase todo

paciente tem fatores predisponentes, sendo mais frequentes a infecção pelo vírus

47

da imunodeficiência adquirida humana, terapêutica com corticóides, diabetes

mellitus, uso de antifúngicos intravenosos, etilismo e traumatismo. Também tem

sido descrita em pacientes leucopênicos com doenças linfoproliferativas e após

transplante de medula óssea, principalmente nas formas com comprometimento

pulmonar ou forma disseminada. É encontrada em 0,5% a 1 % dos receptores de

transplantes (10).

A apresentação mais frequente é na forma de doença rinoencefálica

fulminante ou pneumonia necrozante com hemoptise maciça. Nas formas mais

raras, como no comprometimento gastrointestinal, as manifestações variam de

úlcera péptica colonizada pelo fungo até a doença infiltrativa com invasão

vascular, causando trombose, infarto e colite isquêmica (11).

Considerada uma infecção incomum, mucormicose vem emergindo como o

segundo modelo mais comum de infecção oportunista invasiva, após aspergilose,

em pacientes com neoplasias hematológicas e receptores de transplantes

apresentando um mau prognóstico nesses pacientes, com taxas de mortalidade

de 90% na infecção disseminada. Espécies de Rhizopus causam a maioria das

infecções por Mucorales, considerando que Mucor, Rhizomucor, e

Cunninghamella bertholletiae são patógenos menos encontrados, sendo a espécie

de C. bertholletiae considerada a mais patogênica. Ao contrário de outros fungos

de importância médica, a epidemiologia e imunopatogenia da infecção são pouco

compreendidas (12).

Antes de 1960 era quase sempre fatal, mas, após a descoberta da

anfotericina B e sua ampla utilização associada ao debridamento cirúrgico, a taxa

de mortalidade foi reduzida a 40%. Esta evolução potencialmente fatal se deve a

uma característica específica destes fungos que é o tropismo vascular,

inicialmente invadindo artérias, onde suas hifas crescem rapidamente ao longo

das paredes e invadem o lúmen, causando trombose e lesões isquêmicas.

Posteriormente invadem veias e vasos linfáticos. A ocorrência de mucortrombose

em artérias responsáveis pela irrigação do Sistema Nervoso Central (SNC), com

desenvolvimento de sinais neurológicos detectáveis no exame físico, ensombrece

48

o prognóstico, com rápida deterioração e morte do paciente. Frequentemente o

primeiro sinal de mucormicose é uma rinorréia, geralmente unilateral, abundante,

saguinolenta e com grumos (13).

Defeitos quantitativos e funcionais em células imunes efetoras, associados

com diabetes mellitus mal controlada e administração de corticosteróide ou outros

tratamentos imunossupressores são os principais fatores predisponentes para

mucormicose. Além disso, o metabolismo do ferro desempenha um papel central

na patologia de mucormicose e pacientes com níveis séricos elevados de ferro

tem um risco aumentado para mucormicose. O tratamento com deferoxamina, um

agente quelante de ferro que age como um sideróforo e oferece suprimento de

ferro para os Mucorales, promove o desenvolvimento de graves infecções

disseminadas em modelos animais e humanos (12).

Do ponto de vista clínico, o termo mucormicose descreve infecções

caracterizadas por uma ou mais manifestações de uma tríade de doenças:

rinocerebral, pulmonar e doença disseminada. Características clínicas clássicas

são edemas faciais, com comprometimento ocular que frequentemente evolui para

doença cerebral e qualquer uma pode ser complicada por infecção pulmonar ou

disseminada. Lesões necróticas também podem ocorrer. No entanto, a

apresentação de mucormicose pulmonar, muitas vezes se assemelha a da

aspergilose invasiva, em pacientes imunossuprimidos como os receptores de

transplantes de células-tronco hematopoiéticas. Comparação de características da

imagem tomográfica de mucormicose e aspergilose invasiva mostrou que

múltiplos nódulos do pulmão e derrame pleural são preditores independentes de

mucormicose (14).

1.2.1. Tratamento de Mucormicose

Mucorales são conhecidos por serem resistentes a voriconazol (VOR) e

equinocandinas in vitro e in vivo. Estudo publicado por Perkhofer et al.,(15)

mostrou que isavuconazol (ISAV) apresentou efeitos antifúngicos limitados contra

49

Mucorales. Em comparação com itraconazol, ravuconazol e voriconazol,

isavuconazol demonstrou atividade parcial contra Mucorales apresentando

Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 2 µg/mL para 11 % dos isolados de

Rhizomucor spp. e 28% de Rhizopus spp. Dados semelhantes foram observados

por outros autores utilizando os critérios do Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI, M38-A2, 2008).

Os antifúngicos anfotericina B (AMB), anfotericina B lipossomal (L-AMB) e

posaconazol (POS) mostraram-se satisfatórios nas atividades in vitro contra

Mucorales. O antifúngico mais ativo foi L-AMB, mas que falhou contra alguns

isolados de Rhizopus spp. e Cunninghamella spp. que se mostraram suscetíveis

ao POS. POS mostrou pouca atividade contra alguns isolados de Rhizomucor

spp., Rhizopus spp. e Mucor spp. demonstrando boa atividade contra Absidia spp.

O significado desses achados in vitro não é totalmente claro, uma vez que ainda

não foram definidos os pontos de corte para o teste e também são relatados

estudos anteriores que demonstram que a resistência micológica in vitro nem

sempre significa fracasso terapêutico. Nenhum dos outros azóis avaliados ou

caspofungina mostraram atividade contra os Mucorales (16).

O tratamento da mucormicose baseia-se em cinco princípios: controle das

condições mórbidas subjacentes, AMB endovenosa, desbridamento cirúrgico,

oxigenioterapia hiperbárica e utilização de fatores estimuladores de colônias

granulocíticas. O controle das condições mórbidas subjacentes é importante, na

medida em que a correção da cetoacidose e o restabelecimento da condição

imunológica do paciente são fatores fundamentais na inibição da proliferação do

fungo e da progressão da doença (13).

AMB continua a ser o único agente antifúngico mais indicado para o

tratamento da mucormicose invasiva. Uma vez que o fungo é relativamente

resistente à AMB, altas doses são necessárias, o que frequentemente resulta em

nefrotoxicidade (10).

Alguns trabalhos relatam a utilização in vivo da combinação de antifúngicos

com sucesso no tratamento de mucormicose, como por exemplo, as combinações

50

de AMB e terbinafina (TERB); AMB e itraconazol (ITC); AMB e voriconazol (VOR) ;

TERB e ITC; TERB e VOR (17-19).

Recentemente a terapia empregando a combinação de poliênicos lipídicos

e equinocandinas tem se mostrado a mais promissora. A combinação de L-AMB

com micafungina (MCF) ou anidulofungina tem apresentado bons resultados.

Outras opções incluem a combinação de poliênicos lipídicos com deferasirox ou

POS. Combinações de TERB com POS e de caspofungina com anfotericina B,

posaconazol ou itraconazol também têm sido estudadas (10, 20-23).

Equinocandinas têm atividade mínima frente a Mucorales em testes in vitro,

no entanto, o teste de sensibilidade padrão pode não refletir a verdadeira atividade

de equinocandinas quando combinada tanto que Ogawa (24) relata caso de

sucesso terapêutico no tratamento de mucormicose rino-orbital causada por

Rhizopus oryzae em paciente diabético em diálise com a combinação de L-AMB e

MCF.

1.2.2. Diagnóstico laboratorial da Mucormicose

O diagnóstico de uma infecção fúngica tem como base a combinação de

dados clínicos e laboratoriais e inclui a demonstração do fungo no material

examinado pela microscopia e cultura; detecção de resposta imunológica à

presença do agressor e detecção de antígenos e metabólitos de fungos nos

líquidos corpóreos ou tecidos (25).

A identificação correta dos Mucorales é um dos principais questionamentos

levantados na literatura uma vez que o diagnóstico não é simples, sendo

necessária a detecção em fragmentos de biópsias de tecidos infectados e

isolamento do micro-organismo para posterior identificação por métodos

morfológicos e moleculares. O diagnóstico pode ser confirmado por biópsia de

tecidos afetados, quando acessíveis, onde a presença de hifas largas não-

septadas é demonstrada. Culturas podem ser negativas. Na maioria dos

laboratórios a identificação de gênero e espécies é realizada a partir de cultura de

51

organismo e documentação das características morfológicas próprias sem

confirmação por métodos moleculares. Lamentavelmente, o diagnóstico é muitas

vezes realizado apenas na autópsia e o atraso no diagnóstico pode levar à

progressão da infecção, às vezes com necessidade de desbridamentos extensos

e repetidos, e cirurgias mutiladoras (14).

1.2.2.1. Identificação morfológica

A metodologia clássica de identificação utiliza a combinação de

características macroscópicas e micromorfológicas com realização do exame

macroscópico e microscópico das culturas, além de microcultivo em lâmina

(26,27).

O exame microscópico de amostras clínicas, utilizando estudos

histopatológicos ou exames diretos permite a detecção rápida, no entanto, estes

métodos permitem apenas uma identificação preliminar. Identificação definitiva

exige o crescimento do organismo em cultura, sendo ainda considerado o método

padrão ouro para o diagnóstico laboratorial de infecções fúngicas atualmente.

Embora a cultura possa demonstrar uma excelente sensibilidade e especificidade,

o crescimento do agente etiológico pode levar dias ou semanas, retardando o

diagnóstico e o início do tratamento apropriado. Além disso, a recuperação e a

identificação precisa de fungos no laboratório clínico requer profissional experiente

(28).

A histopatologia e cultura de amostras de tecido são comumente

empregados para determinar o diagnóstico laboratorial de Mucormicose, mas

estes métodos têm limitações significativas. O exame histopatológico do tecido

infectado é subjetivo, falta sensibilidade e a identificação dos isolados em cultura é

demorada. Em adição, não é incomum resultarem culturas fúngicas negativas,

mesmo quando os resultados histopatológicos sugerem uma infecção por

Mucorales, pois o processamento de amostras de tecido antes da cultura podem

romper as hifas do micro-organismo, evitando assim seu crescimento. Apesar da

52

necessidade de métodos rápidos e sensíveis para detectar Mucorales em

espécimes clínicos, o desenvolvimento de métodos moleculares para este grupo

de fungos tem sido limitado (28).

Muitos laboratórios não identificam além do nível de gênero e a designação

das espécies é frequentemente omitida na literatura médica. Alguns laboratórios

consideram esta tarefa difícil principalmente quando as observações não

correspondem com as descrições ou ilustrações disponíveis na literatura (29).

1.2.2.2. Identificação molecular

A introdução de métodos moleculares para o laboratório de microbiologia

clínica tem levado a avanços significativos no diagnóstico das doenças infecciosas

com as recentes aplicações disponíveis para a detecção e identificação de

agentes fúngicos patogênicos, especialmente para aqueles micro-organismos que

não são facilmente identificados por técnicas convencionais (30).

Nos últimos anos, tem sido demonstrado que a análise de sequências de

acido desoxirribonucleico (DNA), particularmente de RNA ribossômico (rRNA)

fúngico, é muito útil para a identificação de Mucorales (31).

As espécies de Mucorales possuem diferenças importantes em suas

respostas aos antifúngicos e sua correta identificação em infecções humanas é de

grande importância. No entanto, o agente etiológico de mucormicose, em

numerosos casos clínicos, não é identificado quanto à espécie, sendo comumente

nomeado apenas como Mucor spp. (32).

A identificação molecular com a utilização de Polimerase Chain Reaction

(PCR) ou de primers específicos não é facilmente adaptável à rotina nos

laboratórios apenas com fins diagnósticos (33).

Na última década, a amplificação e sequenciamento de ácidos nucléicos de

patógenos fúngicos evoluíram de apenas um aplicativo de pesquisa para

tornarem-se valiosas ferramentas de diagnóstico clínico. As técnicas tradicionais

de sequenciamento de DNA têm sido analisadas, em detalhe, em várias

53

publicações (28). Para identificar o micro-organismo por sequenciamento de DNA,

o gene alvo deve conter as regiões altamente conservadas que podem servir

como locais de ligação de iniciadores, e estas regiões conservadas devem conter

regiões com variabilidade de sequência suficiente para permitir a discriminação ao

nível de gêneros e espécies. Além disso, o gene alvo deve estar presente em um

elevado número de cópias sempre que possível para aumentar a sensibilidade da

amplificação por PCR antes da análise da sequência (28).

Para fins de diagnóstico a estrutura geral da região gênica do rRNA fúngico

consiste de quatro genes ribossomais (subunidade pequena 18S, subunidade

5.8S, subunidade grande 25-28S e subunidade 5S) separados por regiões Internal

Transcribed Spacer (ITS). Via de regra, as regiões comumente utilizadas são as

regiões ITS por meio do rRNA. Os alvos mais comumente empregados nos

métodos de sequenciamento são as regiões ITS1 e ITS2, entre as subunidades

ribossomais 18S e 28S e a região D1-D2 (aproximadamente 600 pares de bases),

constituinte da subunidade ribossomal 25-28S (34) (Figura 1).

Figura 1. Regiões do rRNA: subunidade ribossomal pequena (SSU); subunidade ribossomal

grande (LSU) (28).

54

Em alguns casos, estas regiões podem não oferecer variabilidade suficiente

entre as espécies ou gêneros de fungos, e alvos alternativos têm sido utilizados.

Mudanças na taxonomia dos fungos, limitações das sequências fúngicas

atualmente disponíveis e falta de um consenso sobre a porcentagem de

identidade necessária para identificar as amostras ao nível de gênero ou espécie

tornam a identificação do fungo por meio de análise de sequência um pouco

menos precisa do que a identificação de bactérias usando esta técnica (34).

Estudo com 190 isolados clínicos de Mucorales realizado no laboratório de

ensaios fúngicos na Universidade do Texas correlacionando a identificação

morfológica e a identificação molecular após o seqüenciamento do ITS do rRNA,

utilizando os primers ITS5 e ITS4, evidenciou que o agente mais prevalente de

mucormicose foi Rhizopus oryzae (44,7%) seguido por Rhizopus microspurus

(22,1%), Mucor circinelloides (9,5%), Mycocladus corymbifera (5,3%), Rhizomucor

pusillus (3.7%), Cunninghamella bertholletiae (3.2%), Mucor indicus (2.6%),

Cunninghamella echinulata (1%), e Apophysomyces elegans (0.5%), não sendo

possível a identificação no nível de espécie de 7,4% dos isolados. A correlação

entre morfologia e métodos moleculares em nível de espécie foi de 92,6% e em

nível de gênero foi de 100%. A análise filogenética deste estudo foi realizada

através do programa MEGA 4.0 e a identificação final usando o Basic Local

Alignment Tool (BLAST). Devido ao elevado grau de variabilidade nas sequências

das regiões ITS, não foi possível o alinhamento de todos os genes com 100 % de

confiabilidade, sendo utilizado nesta análise apenas as sequências do gene de

rRNA 5.8S. Na árvore filogenética foram observadas seis clades principais

representando os seguintes gêneros: Mucor, Rhizopus, Mycocladus,

Apophysomyces, Rhizomucor e Cunninghamella (31).

Em seu trabalho Voigt et al, (35) construiu uma base de dados moleculares

para 42 isolados de Mucorales clinicamente importantes a partir de sequências de

nucleotídeos da subunidade pequena 18S do rRNA e regiões D1 e D2 da

subunidade grande 28S do rRNA. Todos os pares de primers utilizados

55

demonstraram potencial para identificação rápida e precisa para espécies

causadoras de mucormicoses.

A introdução de métodos moleculares no laboratório tem conduzido a

avanços significativos na detecção e identificação do agente etiológico, pois reduz

o tempo de identificação, aumenta a sensibilidade e contribui para o tratamento

clínico adequado uma vez que, dependendo da espécie, os Mucorales respondem

de forma diferente ao tratamento. No entanto, mais estudos são necessários na

tentativa de validar e padronizar estes métodos para implantação na rotina de um

laboratório para diagnóstico de infecções fúngicas (16).

1.3. Testes de suscetibilidade aos antifúngicos para fungos

filamentosos

1.3.1. Técnica de microdiluição em caldo

Recentemente, um método para o teste de suscetibilidade a antifúngicos

pelo método de macrodiluição e microdiluição em caldo, específico para formas de

conídios de alguns fungos filamentosos, foi estabelecido pelo CLSI (Clinical and

Laboratory Standards Institute M38-A2, 2008). O teste de suscetibilidade foi

padronizado para as seguintes espécies de fungos filamentosos: Fusarium sp.,

Aspergillus sp., Rhizopus sp., Pseudallescheria boydii e Sporothrix schenkii em

fase filamentosa (36).

1.3.2. Testes de suscetibilidade aos antifúngicos in vitro em combinação

A associação de antifúngicos tem por objetivo a redução de toxicidade de

dosagens individuais e aumentar a eficácia no tratamento dependendo do tipo de

interação resultante entre os antifúngicos avaliados, podendo ser sinergismo

(interação positiva), antagonismo (interação negativa) e indiferença (a combinação

56

produz o mesmo resultado que o antifúngico mais ativo avaliado produz

individualmente) (17).

O teste de suscetibilidade aos antifúngicos in vitro em combinação é

realizado através da metodologia do "tabuleiro de xadrez" (16) para determinação

da Concentração Inibitória Fracional (CIF) que define o tipo de interação entre os

antifúngicos em combinação da seguinte forma: sinergismo (S) se CIF ≤ 0,5;

indiferença (I) se 0,5 < CIF ≤ 4 e antagonismo (A) CIF > 4 (17,37-39).

1.3.3. Avaliação da suscetibilidade a antifúngicos utilizando hifas

(Sistema automatizado Biocell-Tracer)

Dentro das controvérsias em torno da avaliação de suscetibilidade a

antifúngicos, para fungos filamentosos, há questionamentos sobre se a forma

conidial seria a mais adequada para esta avaliação. Os conídios são formas de

resistência dos fungos filamentosos, encontrados no ar em tamanhos pequenos e

em altas concentrações, fáceis de serem inalados e de germinar. Considerando

que a hifa é predominante e, praticamente, a forma exclusiva em tecidos de

indivíduos infectados, a relevância dos dados obtidos dos testes de crescimento

conidial, em comparação com aqueles obtidos em testes de crescimento com hifas

permanece uma pergunta ainda sem resposta (40).

São poucos os relatos que correlacionam os dados da CIM e a evolução

clínica dos pacientes com infecção/colonização fúngica. A determinação da CIM

para fungos filamentosos poderia ser mais adequada com a utilização de um

método que permitisse a quantificação do crescimento das hifas (40-47).

O sistema automatizado “Biocell-Tracer” (BCT) permite verificar a ação do

agente antifúngico diretamente sobre as hifas de Mucorales em tempo real,

possibilitando observar o que realmente acontece no organismo humano, uma vez

que a forma de hifas é a forma predominante em tecidos de indivíduos infectados.

Este conhecimento é importante, tanto para embasamento da terapêutica empírica

57

e avaliação de falhas terapêuticas, quanto para testes de novos antifúngicos ou

produtos afins.

O método BCT propõe a análise do estágio de emergência da hifa, bem

como os estágios subsequentes, para determinação da atividade antifúngica e

permite o acompanhamento do crescimento, conjuntamente com registros e

gráficos que são automaticamente gerados para melhor avaliação (46-50).

O sistema automatizado “Biocell-Tracer” (Figuras 2 e 3) é constituído por

uma base para as placas, um microscópio (Olympus; IMT2), uma câmara de vídeo

CCD (Change Coupled Device) que capta a imagem das placas e as envia para

um digitalizador de imagem (Flovel), um microcomputador que monitora todo o

desenvolvimento do experimento e um aparelho de vídeo. A imagem da hifa,

formada na placa, é visualizada ao microscópio e filmada pela câmara que envia a

imagem para o vídeo, onde é possível observar o crescimento da estrutura em

detalhes. A resolução da imagem tem alta definição e precisão analítica de 0,01

m/min-1(45,46).

Figura 2. Esquema representativo do sistema Biocell-Tracer: 1. Microscópio; 2. Câmara CCD; 3. Junção imagem-memória; 4. Monitor de vídeo; 5. Teclado; 6 e 7. Microcomputador e monitor; 8. Disco rígido; 9. Controle automático dos estágios; 10. Impressora; 11. Controle da temperatura; 12. Distribuidor; 13. Microcalibrador.

58

Figura 3. Fotografia do aparelho BioCell-Tracer. O equipamento é constituído de um microscópio

com base para as placas, uma câmera de vídeo, um televisor com aparelho de vídeo, um

digitalizador de imagens e um microcomputador. No detalhe da foto, a imagem da placa que irá ser

analisada dentro da câmara do equipamento.

O sistema possui ainda uma câmara de incubação onde a temperatura

interna é ajustada de 10 a 50ºC. Com o auxílio do computador é possível escolher

as melhores hifas a serem analisadas, bem como monitorar seu crescimento.

Depois de observar o crescimento uniforme da hifa, é adicionada a concentração

do antifúngico a ser avaliado. As informações obtidas geram gráficos, que podem

ser analisados sozinhos ou em conjunto com outros gerados por análises

posteriores (45-47). A figura 4 exemplifica a monitorização do crescimento de uma

única hifa.

59

Figura 4. Monitorização do crescimento da hifa: período pré-exposição: crescimento da hifa

sem a adição do antifúngico a ser testado. Período de exposição: exposição da hifa ao

antifúngico em determinada concentração. Período de pós-exposição: crescimento da hifa após a

retirada da concentração do antifúngico a ser avaliada.

O aparelho automaticamente calcula a média de crescimento das hifas

selecionadas para o teste. Ao final, gera o gráfico da média de crescimento das

hifas analisadas. O cálculo da taxa de crescimento da hifa pelo modelo BCT ® é

automático e consiste na subtração dos tempos final (t1) menos inicial (t0), a cada

3 min. O intervalo de medição depende do crescimento do fungo filamentoso em

estudo [L1 = (t1- t0), L2= (t2- t1),...] (Figura 5).

t0 t1 t2

Figura 5. Elementos utilizados para o cálculo do crescimento de hifas L: valor do crescimento da

hifa a cada 3 minutos; t0: tempo inicial dos 3 minutos, t1: tempo final dos 3 minutos.

A vantagem de utilizar o sistema BCT esta na rapidez das análises e o

sistema tem uma aplicação fundamental em pesquisa no que se refere a

3 min 3 min

L1 L2

60

determinação da CIM, a determinação da atividade fungicida, em que o valor de

crescimento da hifa durante o período de exposição ao antifúngico subtraído do

valor de crescimento da hifa durante o período após a retirada do antifúngico é

igual a zero (Pós-Expo = 0 ) e a determinação da atividade fungistática, em que o

valor de crescimento da hifa durante o período de exposição ao antifúngico

subtraído do valor de crescimento da hifa durante o período após a retirada do

antifúngico é maior que zero (Pós-Expo > 0). Uma desvantagem do sistema é que

somente um isolado pode ser testado por vez (44).

Existem poucos artigos na literatura sobre a avaliação dinâmica do

crescimento de fungos e sua taxa de inibição de crescimento em contato com

agentes antifúngicos. Alguns estudos publicados utilizaram a metodologia BCT para

alguns isolados de Aspergillus sp., Fusarium sp., Candida sp., fungos demáceos e

dermatófitos, mostrando que a forma de hifas pode responder a concentrações mais

baixas de agentes antifúngicos do que os conídios, podendo ter uma melhor relação

com o efeito do tratamento antifúngico nas infecções (47-53).

Todavia até o momento não há relatos na literatura sobre a padronização do

monitoramento de crescimento pelo sistema BCT para isolados de Mucorales, sendo

importante a realização da avaliação dinâmica de crescimento principalmente para

espécie de Rhizopus oryzae devido a alta prevalência do gênero Rhizopus em casos

de Mucormicose, sendo capaz de contribuir para a indicação do tratamento médico

adequado.

61

2. OBJETIVOS

Identificação dos isolados de Mucorales selecionados para o estudo por

metodologia clássica e identificação molecular;

Padronização do inóculo e tempo de leitura para realização da

suscetibilidade pela técnica de microdiluição em caldo frente aos

antifúngicos micafungina; anfotericina B; 5-fluorocitosina; fluconazol;

itraconazol; voriconazol; miconazol e terbinafina, frente a outros gêneros de

Mucorales que não Rhizopus spp. ;

Avaliação da Concentração Inibitória Fracional para determinação do tipo

de interação que ocorre entre as combinações dos antifúngicos anfotericina

B x itraconazol; anfotericina B x voriconazol; terbinafina x itraconazol;

terbinafina x voriconazol e terbinafina x anfotericina B;

Padronização da metodologia de avaliação dinâmica de crescimento de

hifas para o gênero Rhizopus , visto que até o momento não existe nenhum

trabalho na literatura e existe uma alta prevalência de Mucormicose por

este agente etiológico.

Avaliação dinâmica de crescimento utilizando o isolado de Rhizopus oryzae

(LIF 1832), para possível estabelecimento de correlação clínico-laboratorial

uma vez que este micro-organismo foi isolado recentemente de uma

paciente com mucormicose.

63

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Local de trabalho

O trabalho experimental foi desenvolvido no Laboratório de Investigação em

Fungos da Faculdade de Ciências Médicas/Universidade Estadual de Campinas

(LIF - FCM–UNICAMP) e no Laboratório de Epidemiologia Molecular e Doenças

infecciosas da Disciplina de Moléstias Infecciosas da Faculdade de Ciências

Médicas da Unicamp (LEM-FCM-UNICAMP), com assessoria do Medical

Mycology Research Center – Chiba – Japão, tendo sido aprovado pelo Comitê de

Ética da Faculdade de Ciências Médicas / Universidade Estadual de Campinas

com o número de protocolo 936/2011.

3.2. Micro-organismos selecionados para o estudo

Foram selecionados 10 isolados clínicos de Mucorales (Tabela 1)

identificados morfologicamente, de acordo com a literatura disponível, como:

Cunninghamella bertholletiae (LIF 299, 300, 301), Rhizopus sp. (LIF 1046, 1143,

1455, 1820), Syncephalastrum sp. (LIF 1834), Absidia (Lichtheimia) sp. (LIF 1237)

e Rhizomucor sp. (LIF 1832) obtidos a partir dos exames de rotina encaminhados

para o Setor de Micologia do Laboratório de Microbiologia da Divisão de Patologia

Clínica do Hospital de Clínicas da UNICAMP. Todos os isolados foram mantidos

utilizando-se o método de Castellani, sendo, portanto, conservados à temperatura

ambiente em frascos de vidro estéreis contendo água destilada (54).

64

Tabela 1. Micro-organismos selecionados para o estudo.

LIF no Isolado *

Dados do paciente

Nº lab Data Clínica Espécime clínico

299 C.bertholletiae 3855/02 09/09/2006 Medicina Interna escarro

300 C.bertholletiae 3908/02 11/09/2006 Medicina Interna escarro

301 C.bertholletiae 4039/02 18/09/2006 Medicina Interna lavado broncoalveolar

1046 Rhizopus sp. 2185/07 15/06/2007 Medicina Interna lavado broncoalveolar

1143 Rhizopus sp. 4108/07 08/11/2007 Pneumologia escarro

1237 Absidia (Lichtheimia) sp. 1364/08 06/04/2008 Dermatologia unha dedo mão direita

1455 Rhizopus sp. 2534/09 03/07/2010 Pneumologia escarro

1820 Rhizopus sp. 2583/11 30/06/2011 Otorrinolaringologia secreção fossas nasais

1832 Rhizomucor sp. 565/11-

ob 27/01/2011 Pronto Socorro abscesso retroorbitário

1834 Syncephalastrum sp. 3325/11 17/08/2011 Oftalmologia córnea receptora

* Resultado da identificação morfológica realizada a partir dos exames de rotina. Posteriormente

estes isolados foram identificados também pela técnica de sequenciamento.

3.2.1. Reativação dos micro-organismos

Os isolados foram repicados em tubos com Ágar Sabouraud Dextrose

(Difco, Sparks, Maryland, USA) à temperatura ambiente, com posterior repique em

tubos com Ágar Batata Dextrose (Difco, Sparks, Maryland, USA), para avaliação

de pureza e estimulação de esporulação.

3.3. Identificação morfológica

A identificação até gênero foi realizada de acordo com metodologia clássica

desenvolvida no Setor de Micologia do Laboratório de Microbiologia-DPC- HC-

UNICAMP, utilizando a combinação de características macroscópicas e

micromorfológicas com realização do exame macroscópico e microscópico das

culturas, além de microcultivo em lâmina (26,27).

3.4. Identificação molecular

Inicialmente a identificação molecular realizada pelo sequenciamento dos

isolados LIF 1046, 1143, 1237, 1455, 1820, 1832 e 1834 foi realizada através da

65

amplificação do DNA fúngico diretamente das culturas utilizando tanto os

iniciadores universais forward ITS1 e reverse ITS4 quanto os iniciadores

universais forward ITS4 e reverse ITS5.

A identificação molecular dos micro-organismos em estudo foi também

realizada por sequenciamento da região D1/D2 constituinte do DNA 28S e que

codifica rRNA utilizando os iniciadores NL1 e NL4, cujo protocolo está descrito a

seguir. Na figura 1, a região em destaque representa a região D1/D2 utilizada

também para o sequenciamento em nosso estudo.

3.4.1. Extração do DNA

A extração do DNA foi realizada em culturas com 48 h de crescimento em

Ágar Batata Dextrose (Difco, Sparks, Maryland, USA). Uma alçada da colônia foi

transferida para 200 µL de água destilada e a mistura resultante foi submetida à

extração de DNA com o kit High Pure PCR Template Preparation (Roche Applied

Science, Alemanha), de acordo com as especificações do fabricante. Brevemente,

adicionou-se 3 µL de Lyticase 4 mg/mL (Sigma-Aldrich, USA) ao tubo contendo os

isolados diluídos e estes foram incubadas a 37º C por 30 minutos. Em seguida,

foram adicionados ao lisado 200 µL de Binding Buffer e 40 µL de proteinase K. As

amostras foram incubadas a 70˚C por 10 min e 100 µL de isopropanol gelado

foram adicionados. O volume total foi transferido para uma coluna posicionada em

um tubo coletor. Foi realizada a centrifugação a 8.000g por 1min e o conteúdo do

tubo coletor foi descartado. Adicionou-se 500 µL de Inhibitor Removal Buffer e

centrifugou-se a 8.000g por 1 min. Após nova remoção do líquido do tubo coletor,

a lavagem foi realizada com 500 µL de Wash Buffer e posterior centrifugação a

8.000 g por 1 min. Por fim, 50 µL de Elution Buffer pré-aquecido a 70ºC foram

adicionados à coluna e os tubos foram centrifugados a 8.000g por 1 min para

recolhimento da amostra de DNA. O DNA extraído foi quantificado utilizando o

espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA). As amostras foram

armazenadas a -20˚C para posterior utilização na reação de PCR.

66

Para preparação da reação de amplificação por PCR (reação em cadeia da

polimerase) foram avaliados dois procedimentos (itens 3.4.2 e 3.4.3) descritos

abaixo.

3.4.2. Amplificação pela PCR utilizando Taq DNA Polimerase

A amplificação do DNA fúngico extraído foi realizada com os iniciadores

universais forward NL1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e reverse NL4

(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’), os quais permitem amplificar a região D1/D2

constituinte do DNA 28S de fungos. A reação de PCR foi realizada em um tubo

contendo 12,5 µL de PCR Master Mix (Promega, USA), 1,25 µL de cada iniciador,

100 ng/µL de DNA e água milli-Q para um volume final de 25 µL. Cada ciclo de

reação de amplificação realizada consistiu na desnaturação inicial a 95˚C por

5min, 30 ciclos de desnaturação a 95˚C por 45 s, anelamento a 55˚C por 45 s e

extensão a 72˚C por 1min, além de uma extensão final a 72˚C por 2 min. Estas

reações de amplificação foram realizadas em termociclador Veriti 96 Well Thermal

Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os produtos da reação foram

submetidos à eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio e

as bandas foram visualizadas em iluminação ultravioleta.

3.4.3. Amplificação pela PCR utilizando DNA Polimerase

MigthyAmp

Além da realização da PCR a partir de DNA extraído de culturas, foi

verificada a possibilidade de amplificação do material genético diretamente a partir

das culturas fúngicas. Essa abordagem permite maior agilidade na obtenção dos

resultados, além de redução nos custos para identificação molecular por

sequenciamento. Para tal finalidade, utilizou-se a enzima DNA Polimerase

MigthyAmp (Takara Bio Inc, Tóquio, Japão), em busca de maior rapidez e

eficiência nas reações de ligação para amplificação do material genético (55, 56).

Foram utilizadas culturas fúngicas de 3 a 5 dias de crescimento em ágar

batata dextrose (Difco, Sparks, Maryland, USA). Uma alçada de cada colônia foi

67

transferida para 200 µL de água destilada e 2 µL desta solução foram utilizados na

reação de PCR. Os iniciadores universais foram os mesmos utilizados no item

anterior. A amplificação pela PCR foi realizada em uma reação contendo 5 µL de

MightyAmp Buffer, 0,3 µL de cada iniciador NL1 e NL4, 0,2 µL da enzima

MightyAmp, 2 µL de amostra e água milli-Q para um volume final de 10 µL. Cada

ciclo de reação de amplificação realizada consistiu na desnaturação inicial a 98˚C

por 2 min, 30 ciclos de desnaturação a 98˚C por 10 s e 55ºC por 15 s, anelamento

a 68˚C por 45 s e extensão final do fragmento amplificado a 68˚C por 5 min. Estas

reações de amplificação foram realizadas em termociclador Veriti 96 Well Thermal

Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os produtos da reação foram

submetidos à eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio e

visualizados em iluminação ultravioleta.

3.4.4. Reação de sequenciamento

Após a detecção de DNA em gel de agarose, o produto final da PCR foi

utilizado para o sequenciamento em sequenciador automático ABI-3100 (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA). Inicialmente, foi realizada a purificação das

amostras pela adição de 2 µL da enzima Exosap-IT (USB®Corporation, Cleveland,

OHIO, EUA) a cada 5 µL de produto de PCR. A mistura foi mantida a 37ºC por 15

min, seguida a 80ºC para inativar a enzima em termociclador Veriti 96 Well

Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

Em seguida, as amostras foram submetidas à reação de sequenciamento

utilizando o Big DyeTM Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA,

EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Foram preparadas reações

contendo 1µL de Big Dye Terminator, 1 µL de tampão, 1 µL do iniciador NL1 ou

NL4 1,6 pmol, 2 µL do produto de PCR purificado e água milli-Q para um volume

final de 10 µL. A amplificação consistiu na desnaturação a 95oC por 3 min e 35

ciclos de 95°C por 5 s, 55°C por 10 s e 60oC por 4 min em termociclador Veriti 96

Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

68

3.4.5. Análise dos dados: alinhamento e construção da árvore

filogenética

As sequências de DNA forward e reverse obtidas para cada amostra foram

alinhadas no programa ATSQ (Japan Software Inc., Japão) e a homologia com

outras sequências disponíveis foi avaliada nos seguintes bancos de dados: BLAST

(Basic Local Aligment Search Tool, disponível em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov);

Biolomics (www.cbs.knaw.nl) e ISHAM (www.mycology.lab.org). Isolados com

homologia acima de 99% foram considerados da mesma espécie; para valores

inferiores a 99% foi considerada somente a classificação do gênero.

A análise evolutiva entre os 10 isolados de Mucorales em estudo foi

realizada pela construção de árvore filogenética. Inicialmente, as sequências

foram alinhadas pelo software Clustal W (57) e esses dados serviram de entrada

para a geração da árvore filogenética pelo software MEGA 5.05 (Molecular

Evolutionary Genetics Analysis versão 5/National Institutes of Health, Maryland,

USA e Japan Society for the Promotion of Science, Tokyo, Japan) para análises

de máxima verossimilhança utilizando 1.000 replicações de inicialização para

originar a árvore filogenética de consenso.


pelo método de microdiluição em caldo

Foi realizada de acordo com o documento M38-A2 estabelecido pelo CLSI

(2008)para determinação de CIM (36).

3.5.1. Preparação do inóculo

Após o crescimento fúngico de aproximadamente 3 a 5 dias, a 35o C, em tubos

contendo o meio de cultura ágar batata dextrose (Difco, Sparks, Maryland, USA), o

inóculo foi preparado adicionando-se 5 mL de salina 0,85%, ou água destilada estéril,

ao tubo até encobrir toda a colônia. Os esporos foram suavemente suspendidos com

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.cbs.knaw.nl/

http://www.mycology.lab.org/

69

a ajuda de uma alça em anel. Transferiu-se a suspensão para um tubo estéril e

aguardou-se por 5 minutos a separação das hifas dos esporos que, por serem mais

leves, ficam no sobrenadante. O sobrenadante foi transferido para outro tubo estéril.

A partir desta suspensão, foi feita uma diluição de 1/50 em água destilada estéril ou

salina 0,85% e em seguida foi realizada a contagem dos esporos no retículo central

de uma câmara de Neubauer. O objetivo foi a obtenção de um inóculo final de 0,4 a

5,0 x 104 UFC/mL (unidades formadoras de colônia/mL), podendo-se obter este valor

com a aplicação da fórmula:

N x 104 x 1/N = 1 x 10

4 células

onde “N” é igual ao número de células contadas e 1/N é a diluição a ser realizada.

Para os Mucorales foi padronizado o inóculo final de 4 x 104 UFC/mL para a

realização dos testes de suscetibilidade.

3.5.2. Preparação do meio de cultura

Foi utilizado o meio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)

com L-glutamina e glicose sem bicarbonato de sódio tamponado com 0,165 M de

ácido morfolinopropanossulfônico (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) com

pH ajustado para 7.0 com NaOH 1N e a esterilização da solução realizada por

filtragem a vácuo, em filtro 0,45 m (Millex-HV, Millipore, França).

3.5.3. Preparação dos antifúngicos

Foram avaliados os seguintes antifúngicos isolados: anfotericina B (AMB)

(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA); 5-fluorocitosina (5FC) (Dry-plates –

Eiken Japan); fluconazol (FCZ) (Dry-plates – Eiken Japan); micafungina (MCF)

(Dry-plates – Eiken Japan); itraconazol (ITC) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO,

USA); voriconazol (VOR) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA); miconazol

(MCZ) (Dry-plates – Eiken Japan) e terbinafina (TERB) (Sigma Chemical Co., St

Louis, MO, USA). Para preparação da solução estoque foi pesado 12,8 mg de

cada antifúngico (solução-mãe de 1280 µg/mL) de acordo com a ficha de

70

especificação do fabricante ajustando-se na concentração desejada. A solução foi

armazenada em microtubos de polipropileno com tampa, mantidos a -5oC por até

6 meses. Posteriormente a solução estoque de cada antifúngico foi utilizada para

realizar a diluição dos antifúngicos nas concentrações desejadas.

As concentrações dos antifúngicos utilizadas para execução dos testes

foram: de 16 a 0,015 µg/mL para micafungina; de 16 a 0,03 µg/mL para

anfotericina B e miconazol; de 64 a 0,125 µg/mL para 5-fluorocitosina e fluconazol;

de 8 a 0,015 µg/mL para itraconazol e voriconazol e de 1 a 128,0 µg/mL para

terbinafina. Os antifúngicos micafungina, anfotericina B, 5-fluorocitosina,

fluconazol, itraconazol, voriconazol e miconazol também foram avaliados em

placas previamente prontas (Dry-plates – Eiken Japan) para fins de validação e

comparação dos resultados obtidos, assim como para avaliação da micafungina.

3.5.4. Preparação da placa do teste de suscetibilidade aos

antifúngicos isolados in vitro

O teste para determinação de CIM foi realizado em placas de

microtitulação, com fundo em “U” estéril, para onde foram transferidos todos os

componentes preparados anteriormente da seguinte forma: 20 μL do antifúngico

diluído nas diferentes concentrações até a 10 ª fileira; 160 μL do meio de RPMI

1640 em todas as fileiras e mais 20 μL de inóculo em todas as fileiras, exceto a

11ª que corresponde ao controle negativo. Na 12ª fileira, por se tratar do controle

positivo de crescimento, não foi adicionado o antifúngico. O teste também pode

ser realizado considerando a 11ª fileira como controle positivo e a 12ª fileira como

controle negativo. Totalizou-se um volume final de 200 μL, resultando em uma

concentração do inóculo de 4,0 x 104 UFC/ml. Todos os testes foram realizados

em duplicata (Figura 6).

71

Figura 6. Esquema de preparo da placa de microtitulação para o teste

3.5.5. Controle de qualidade

Para validação dos testes, foram utilizadas as cepas de Candida

parapsilosis ATCC 22019, Candida krusei ATCC 6852 e Aspergillus flavus ATCC

204304. Para cada diluição de antifúngicos realizou-se o teste de suscetibilidade

com as cepas padrão, tendo seus resultados de CIM comparados com os valores

estabelecidos pelo (CLSI M38-A2). Não havendo concordância com os valores

estabelecidos, a diluição de antifúngicos foi desprezada preparando-se uma nova

diluição até estar de acordo com os parâmetros estabelecidos.

3.5.6. Leitura da concentração inibitória mínima (CIM)

As placas foram incubadas na temperatura de 35°C com exceção da cepa

LIF 1820 em que o teste foi realizado na temperatura de 25°C, sendo a leitura de

cada placa realizada após 24 e 48 horas de incubação comparando-se o

crescimento fúngico de cada poço com o do controle positivo, sendo esta leitura

realizada com o auxílio de um espelho de leitura. Este crescimento foi

numericamente determinado, de acordo com os seguintes critérios:

72

- número 4: quando não houve nenhuma redução no crescimento, ou seja

100% de crescimento.

- número 3: quando ocorreu leve redução no crescimento, apenas 80% de

crescimento em comparação ao do obtido no controle positivo, sendo 20 % de

inibição de crescimento.

- número 2: quando houve significante redução no crescimento, isto é 50%

de crescimento em comparação com o controle positivo do teste.

- número 1: quando ocorreu pouco crescimento, apenas 20% em

comparação com o controle positivo, sendo 80% de inibição de crescimento.

- número 0 (zero): para ausência total de crescimento.

A CIM para a anfotericina B, itraconazol e voriconazol é determinada, como

sendo a menor concentração do antifúngico que permite crescimento igual a zero,

ou seja, nenhum sinal de crescimento fúngico com 100% de inibição de

crescimento (IC100), uma vez que estes possuem mecanismo de ação

considerado fungicida.

Para antifúngicos com mecanismo de ação fungistática a leitura do teste é

feita atribuindo-se notas: 0 para ausência de crescimento visível (controle

negativo); 1 quando ocorre 80% de inibição de crescimento em comparação ao

crescimento obtido no controle positivo (IC 20); 2 ocorre 50% de inibição de

crescimento fúngico em relação ao controle positivo (IC 50); 3 sendo

correspondente a 20% de inibição de crescimento fúngico (IC 80) e 4 quando há

0% de inibição de crescimento, observando 100% de crescimento (controle

positivo). Para terbinafina a CIM é determinada, como sendo a menor

concentração que permite uma redução em 80% ou mais no crescimento fúngico

(IC 20). (36).

Para o antifúngico micafungina pertencente a classe das equinocandinas,

se faz a leitura da Concentração Mínima Efetiva (MEC), que corresponde ao

parâmetro com melhor correlação clínica, que é a mais baixa concentração do

antifúngico capaz de permitir o crescimento de hifas anormais, pequenas e

73

redondas em contraste ao crescimento do controle positivo que apresenta hifas

longas e não ramificadas (36).


combinação

Foi realizado de acordo com a metodologia do “tabuleiro de xadrez”,

possibilitando a combinação de dois antifúngicos em concentrações diferentes de

forma que tanto a maior quanto a menor concentração de um agente antifúngico

combina com as respectivas concentrações de outro antifúngico a ser testado (56).

3.6.1. Preparo do inóculo

O inóculo foi preparado conforme descrito no item 3.5.1 sendo padronizado

também um inóculo final de 4 x 104 UFC/mL.

3.6.2. Meio de cultura

Foi utilizado o meio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)

com L-glutamina e glicose sem bicarbonato de sódio tamponado com 0,165 M de

ácido morfolinopropanossulfônico (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) com

pH ajustado para 7.0 com NaOH 1N e a esterilização da solução realizada por

filtragem a vácuo, em filtro 0,45 m (Millex-HV, Millipore, França).

3.6.3. Preparação dos antifúngicos

A combinação de antifúngicos foi realizada entre os seguintes

antifúngicos: anfotericina B x itraconazol; anfotericina B x voriconazol;

terbinafina x voriconazol; terbinafina x anfotericina B. As concentrações

utilizadas dos antifúngicos na execução do teste foram: de 4 a 0,03125 µg/mL

para anfotericina B; de 15 a 0,125 µg/mL para itraconazol; de 64 a 0,5 µg/mL e

74

de 16 a 0,125 µg/mL para voriconazol; 1 a 128,0 µg/mL; de 16 a 0,125 µg/mL e

de 0,0625 a 0,00048 µg/mL para terbinafina. A preparação dos antifúngicos foi

realizada de acordo com o item 3.5.3.

3.6.4. Preparação da placa de combinação de antifúngicos

Para a execução do teste coloca-se na vertical 20 μL do antifúngico A em

suas diferentes concentrações em todos os poços da placa de microtitulação

até a fileira 8; coloca-se na horizontal 20 μL do antifúngico B em todos os poços

até a fileira 8; 140 μL do meio de cultura é adicionado em todos os poços da

placa e em seguida adiciona-se 20 μL do inóculo em todos os poços com

exceção da fileira 9 que corresponde ao controle negativo do teste. Para testar

os antifúngicos individualmente pode-se colocar 20 μL do antifúngico A sozinho

em todos os poços da fileira 9 e em todos os poços da fileira 10 coloca-se 20

μL antifúngico B. Em busca de uma maior agilidade na execução dos testes

neste trabalho a avaliação dos antifúngicos isolados foi realizada em placas

individuais não sendo portanto adicionados na placa de combinação preparada

(Figura 7).

75

Figura 7. Esquema representativo da montagem e leitura da placa de microdiluição no teste de

combinação de antifúngicos pelo método do “Tabuleiro de xadrez”.

3.6.5. Leitura do teste de combinação de antifúngicos e

determinação da concentração inibitória fracional (CIF)

A leitura tanto visual com auxílio de espelho de leitura quanto realizada por

espectrofotômetro foi realizada após 24 e 48 horas de incubação determinando

assim o tipo de interação existente (58).

As placas foram incubadas na temperatura de 35°C com exceção da cepa

LIF 1820 em que o teste foi realizado na temperatura de 25°C. A leitura das placas

foi realizada também com auxílio de um espelho de leitura e com

espectrofotômetro (λ= 490 nm) após 24 e 48 horas de incubação.

Após a leitura das placas o coeficiente de interação entre os antifúngicos

testados foi avaliado por meio da determinação da Concentração Inibitória

Fracional baseando-se na seguinte fórmula: CIF = [CIMA em combinação/ CIMA

sozinha] + [CIMB em combinação/ CIMB sozinha].

76

As interações entre os antifúngicos foram definidas da seguinte forma:

sinergismo (S) se CIF ≤ 0,5; indiferença (I) se 0,5 < CIF ≤ 4 e antagonismo (A)

CIF > 4 (37-39,58,59).



automatizado Biocell-Tracer

3.7.1. Micro-organismo avaliado

A padronização dos testes de avaliação de crescimento dinâmico pelo BCT

foi realizada utilizando-se o isolado clínico Rhizopus oryzae (LIF 1832),

recentemente isolado de um paciente no intuito de estabelecer correlação clínico-

laboratorial, uma vez que foi observado sucesso terapêutico, com paciente em alta

como desfecho clínico.

3.7.2. Antifúngicos avaliados

Os antifúngicos avaliados foram anfotericina B, terbinafina e itraconazol,

uma vez que, estes foram antifúngicos utilizados para o tratamento da

mucormicose causada pelo isolado LIF 1832. A definição das concentrações de

antifúngicos analisadas derivam das concentrações séricas dos antifúngicos e no

resultado da CIM obtida no teste de microdiluição em caldo.

3.7.3. Placas de cultura

Para a análise do crescimento fúngico pelo BCT, foram utilizadas placas

plásticas de cultura estéreis 35 x 10 mm (Corning® CellBIND, NY, USA), onde

foram distribuídos 2mL da solução de poli-L-Lisina (PLL) (Sigma Chemical Co.,

Ltd., St. Louis, Mo., U.S.A.) na concentração ideal padronizada de 0,02%. Após 1

hora, a solução foi retirada por aspiração e as placas permaneceram abertas até

secagem e logo em seguida em luz ultravioleta por 15 minutos. Após isto estas

77

foram utilizadas para preparar o inóculo a ser utilizado na monitorização do

crescimento (47).

3.7.4. Preparação do inóculo e monitoramento do crescimento

Após o crescimento fúngico de três dias a temperatura ambiente em tubos

contendo meio de cultura Ágar Batata Dextrose (Difco, Sparks, Maryland, USA), o

inóculo foi preparado adicionando-se 5,0 ml de salina 0,85%, ou água destilada

estéril, ao tubo até encobrir toda a colônia. Os esporos foram suavemente

suspendidos com a ajuda de uma alça em anel. Transferiu-se a suspensão para

um tubo estéril aguardou-se, por 5 minutos, a separação das hifas, dos esporos

que, por serem mais leves, ficam no sobrenadante. O sobrenadante foi transferido

para outro tubo estéril e a partir deste foi feita uma diluição em água destilada

estéril ou salina 0,85%, realizando-se em seguida a contagem dos esporos no

retículo central de uma câmara de Neubauer obtendo-se um inóculo na

concentração de 1 x 105 UFC/mL, inóculo padronizado para a realização dos

experimentos no equipamento.

O inóculo de conídios (1µL) preparado foi depositado no centro das placas

preparadas com Poli-L-Lisina (PLL) na concentração de 0,02%. Após o depósito

do inóculo, as placas permaneceram em repouso por 60 minutos com intuito de

promover a secagem do inóculo sendo em seguida lavadas com 250 µL de RPM

1640 ou água destilada estéril RPMI 1640 com intuito de promover a remoção dos

conídios não aderidos à placa. Em seguida foi adicionado 2mL de RPMI 1640 em

cada placa e as mesmas foram incubadas a 35º C durante 18 à 24 horas para o

crescimento inicial das hifas que ficam aderidas no centro da placa. Após este

período, uma placa foi transferida para o equipamento, onde aproximadamente 10

hifas foram selecionadas para avaliação do crescimento em µm com intervalo de

leitura correspondente a 3 minutos (µm/3min) no sistema automatizado BioCell -

Tracer® (Hidan Co. Ltd., Kashiwa, Japan).

3.7.5. Avaliação da suscetibilidade aos antifúngicos in vitro pelo

método de avaliação dinâmica de crescimento

78

Nos experimentos iniciais utilizando o isolado LIF 1832 o tempo de

experimento no Biocell-Tracer foi padronizado em 76 minutos. Assim, o controle

do crescimento fúngico sem a utilização do antifúngico foi realizado trocando-se 2

mL da solução de RPMI 1640 sem antifúngico após o período de 15 minutos do

crescimento inicial da hifa (Pré-Exposição) e adicionando-se 2 mL de RPMI 1640

com antifúngico acompanhando-se o crescimento durante o período de 60 minutos

(Exposição) do experimento. Após este período houve a troca novamente do

RPMI 1640 com antifúngico por 2 mL de RPMI 1640 sem antifúngico e

observação do crescimento das hifas por mais 30 minutos (Pós-Exposição).

A avaliação da suscetibilidade in vitro pelo método de avaliação dinâmica

de crescimento frente ao antifúngico anfotericina B e terbinafina em suas

diferentes concentrações foi realizada trocando-se o meio de cultura RPMI 1640

após o período de 15 minutos de crescimento inicial das hifas selecionadas (Pré-

Exposição) por 2 mL de antifúngico preparado com RMPI 1640 na concentração a

ser testada e acompanhando-se o crescimento no período de 60 minutos

(Exposição). Assim, o experimento para estes antifúngicos ficou da seguinte

forma: 15 minutos iniciais considerados como controle de crescimento e 60

minutos com adição da solução do antifúngico preparado com RPMI 1640, sendo

o período de exposição. Com esta padronização, foram realizados testes parciais

de avaliação dinâmica de crescimento na ausência ou presença dos antifúngicos

anfotericina B, terbinafina e itraconazol.

Para a combinação dos antifúngicos terbinafina com itraconazol utilizando

a concentração sérica destes, os testes de avaliação dinâmica de crescimento

para os isolados de Mucorales foram realizados com um tempo maior de

experimento devido ao mecanismo de ação destes antifúngicos e concentrações

reduzidas a serem testadas. Neste caso o tempo de experimento no Biocell-

Tracer foi padronizado em 2h e 30 minutos sendo 15 minutos iniciais de

avaliação do crescimento inicial das hifas selecionadas (Pré-Exposição) e 135

minutos com a presença do antifúngico (Período de exposição).

79

3.7.6. Análise dos dados obtidos

Para realização da curva controle de crescimento foi necessário calcular a

mediana e média de crescimento de todas as hifas a cada 3 minutos para cada

experimento padronizado realizando-se os cálculos da média e mediana de todos

os dados gerados pelo BCT através do sistema de análise de dados do Microsoft

Excel.

Para os cálculos das taxas de inibição foram obtidas as medianas dos

valores de crescimento do período de pré-exposição (0 – 15 min) e exposição (15

– 60 min) para cada hifa no caso dos antifúngicos anfotericina B, terbinafina e

itraconazol. Para a combinação dos antifúngicos terbinafina com itraconazol

foram obtidas as medianas dos valores de crescimento do período de pré-

exposição (0 – 15 min) e exposição 135 minutos (15 – 130 min) para cada hifa. As

taxas de inibição do antifúngico testado (anfotericina B) em suas diferentes

concentrações foram calculadas pela diferença percentual entre o 1o período e o

2º período. Para isto, comparou-se as medidas obtidas no período de 3 a 15 min

com o período de 15 a 60 min juntamente com o experimento controle (meio de

RPMI 1640) de 3 a 15 min com o período de 15 a 130 min.

O cálculo do efeito do antifúngico se deu pelo crescimento inicial chamado

pré-exposição (Pré-Exp) subtraído pelo crescimento durante a exposição do

antifúngico (Exp) dividido pelo crescimento inicial (Pré-Exp) multiplicado por 100.

(Pré-Exp – Exp) / (Pré-Exp) x 100% (47).

81

4. RESULTADOS

4.1. Identificação dos isolados de Mucorales

4.1.1. Identificação morfológica

Pela metodologia clássica utilizando a combinação de características

macroscópicas e com base nas estruturas características da morfologia

encontradas nas lâminas preparadas das culturas, os isolados LIF 299, 300 e 301

foram identificados como Cunninghamella bertholletiae (Figura 8) LIF 1046, 1143 e

1455 e 1820 identificados como Rhizopus sp. (Figura 9) enquanto LIF 1237 como

Absidia sp. (Figura 10) e LIF 1832 como pertencente ao gênero Rhizomucor sp.

(Figura 11) e LIF 1834 como Syncephalastrum sp. (Figura 12).

Figura 8. Estruturas características da morfologia do isolado de Cunninghamella bertholletiae (LIF

299, 300 e 301). Figuras (A) e (B): LARONE (2002); Figuras (C), (D), (E) e (F): Acervo do LIF- FCM

– UNICAMP.

A B C

D E F

Esporangiósporo

Esp

ora

ngi

ófa

ro

Vesícula

82

Figura 9. Estruturas características da morfologia do isolado de Rhizopus sp. (LIF 1046, 1143 e

1455 e 1820). Figuras (A) e (B): LARONE (2002); Figuras (C), (D) e (E): Acervo do LIF- FCM –

UNICAMP.

Figura 10. Estruturas características da morfologia do isolado de Absidia (Lichtheimia) sp. (LIF

1237). Figuras (A) e (B): LARONE (2002); Figuras (C), (D) e (E): Acervo do LIF- FCM – UNICAMP.

A A

A A

B C

D

D E

B C

E

Esp

ora

ngi

ófa

ro

Riz

óid

e

Esporangio

83

Figura 11. Estruturas características da morfologia do isolado de Rhizomucor sp. (LIF 1832).

Figuras (A) e (B): LARONE (2002); Figuras (C), (D) e (E): Acervo do LIF- FCM – UNICAMP.

Figura 12. Estruturas características da morfologia do isolado de Syncephalastrum sp. (LIF 1834).

Figuras (A) e (B): LARONE (2002); Figuras (C), (D), (E) e (F): Acervo do LIF- FCM – UNICAMP.

A A

A A

B

B

C

C

D E

D E F

Rizóide lateral Es

po

ran

gió

faro

Vesícula

Vesícula em formação

Esporangio tubular (cadeia de esporos)

Esporangio

84

4.1.2. Identificação molecular pela técnica de sequenciamento

4.1.2.1. Extração do DNA

A quantificação do DNA extraído dos isolados em estudo utilizando o

espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) resultou em

concentrações finais entre 6,9 e 227,1 ng/µL. As amostras foram armazenadas a -

20˚C para posterior utilização na reação de PCR (Tabela 2).

Tabela 2. Quantificação do DNA extraído dos micro-organimos em estudo

299 C.bertholletiae

300 C.bertholletiae

301 C.bertholletiae

1046 Rhizopus sp.

1143 Rhizopus sp.

1237 Absidia (Lichtheimia) sp.

1455 Rhizopus sp.

1820 Rhizopus sp.

1832 Rhizomucor sp.

1834 Syncephalastrum sp.

Quantificação de DNA extraído

227,1 ng/µL

61,2 ng/µL

48 ng/µL

19,4 ng/µL

9,3 ng/µL

10,3 ng/µL

82,5 ng/µL

8,1 ng/µL

LIF

número Isolado *Quantificação do

DNA extraído

7,31 ng/µL

6,9 ng/µL

* Nomenclatura dos isolados conforme a identificação morfológica.

4.1.2.2. Amplificação pela PCR

A amplificação pela PCR utilizando a região D1/D2 foi realizada para todos

os isolados de Mucorales apresentando entre 600 e 900 pares de bases na região

amplificada do rRNA (Figura 13).

85

Figura 13. Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos obtidos pela amplificação pela PCR.

4.1.3. Identificação molecular e construção da árvore filogenética

A comparação das sequências obtidas pela técnica de biologia molecular

com outras sequências disponíveis em banco de dados revelou que os isolados

LIF 299, 300 e 301 correspondem a espécie de Cunninghamella bertholletiae, os

isolados LIF 1046, 1143, 1237, 1455 e 1832 correspondem a espécie de Rhizopus

oryzae, o isolado LIF 1820 corresponde a Rhizopus stolonifer e o isolado LIF 1834

corresponde a Syncephalastrum racemosum. A similaridade das sequências com

os bancos de dados disponíveis está demonstrada na Tabela 3.

Tabela 3. Similaridade dos resultados entre bancos de dados disponíveis

homologia %acesso

(07/04/2014)homologia %

acesso

(07/04/2014)homologia %

acesso

(07/04/2014)

299 C.bertholletiae 100 JN206600.1 100 693.68 ______ * ______ *



1046 Rhizopus oryzae 100 HQ435000.1 100 120.12 ______ * ______ *

1143 Rhizopus oryzae 100 AY213625.1 100 330.53 ______ * ______ *

1237 Rhizopus oryzae 100 JN939196.1 100 120.12 ______ * ______ *

1455 Rhizopus oryzae 100 JN939196.1 100 330.53 ______ * ______ *

1820 Rhizopus stolonifer 100 JN938904.1; 100 609.82 ______ * ______ *

1832 Rhizopus oryzae 100 JQ745263.1; 100 120.12 ______ * ______ *

1834 Syncephalastrum racemosum 96,2 HM849718.1 100 348.35 ______ * ______ *

* Parâmetros de identificação não encontrados

LIF

número

ISHAM ITS - Blast search

( MYCOLOGY LAB)Biolomics (CBS)

Banco de dados

Genbank ( NCBI)Identificação

86

O esquema ilustrando os eletroferogramas obtidos no sequenciamento

encontram-se no anexo 1, já a árvore filogenética para os isolados em estudo está

representada na figura 14, sendo dividida em duas clades: a clade 1 tem um

subgrupo formado por Rhizopus oryzae. Já a clade 2 é formada por dois

subgrupos, um subgrupo formado por Rhizopus stolonifer e Syncephalastrum

racemosum e outro subgrupo formado por Cunninghamella bertholletiae (Figura

14).

Figura 14. Filogenia e comparação entre identificação morfológica e molecular para os isolados em estudo. - os números presentes na árvore filogenética indicam similaridade das sequências; - (*) isolados em que o sequenciamento permitiu a identificação de espécie; - os quadrados indicam isolados com resultados discordantes entre as duas metodologias.


pelo método de microdiluição em caldo (CLSI, M38-A2)

Os resultados dos testes de concentração inibitória mínima (CIM) dos

antifúngicos frente aos 10 isolados em estudo comparando-se as leituras

realizadas com tempo de incubação de 24 e 48 h foram de 8 a ≥ 16 µg/mL para

micafungina, de 0,25 a 8 µg/mL para anfotericina B, ≥ 64 µg/mL para 5-

fluorocitosina, de 16 a ≥ 64 µg/mL para fluconazol, de 1 a > 8 µg/mL para

itraconazol, > 8 µg/mL para voriconazol; de 0,25 a 4 µg/mL para miconazol e de

0,0031 a > 16 µg/mL para terbinafina (Tabela 4).

87

Tabela 4. Valores da concentração inibitória mínima (CIM) dos antifúngicos micafungina, anfotericina B, 5-

fluorcitosina, fluconazol, itraconazol, voriconazol, miconazol e terbinafina frente aos isolados selecionados para o

estudo

24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h

299 C.bertholletiae 8->16* ≥ 16 ≥ 16 ≥ 16 2 2 ≥ 64 > 64 > 64 64 1 1 - 2 >8 >8 1 - 2 2 0,031 0,063

300 C.bertholletiae ≥ 16 ≥ 16 ≥ 16 ≥ 16 2 - 4 4 - 8 > 64 > 64 32 - > 64 >64 >8 2 - 8 >8 >8 1 - 2 1 - 2 0,031 0,031

301 C.bertholletiae ≥ 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 1 - 4 2 - 8 > 64 > 64 32 - 64 ≥ 64 1 8 >8 >8 2 1 - 2 0,016 0,063

1046 Rhizopus oryzae ≥ 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 0,5 - 2 1 - 4 > 64 > 64 ≥ 64 16 - > 64 1 - 2 4 - 8 >8 >8 1 2 >16 >16

1143 Rhizopus oryzae > 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 0,25 - 0,5 1 > 64 > 64 > 64 > 64 >8 >8 >8 >8 2 2 - 4 >16 >16

1237 Rhizopus oryzae > 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 0,5 - 1 1 - 2 > 64 > 64 32 - 64 > 64 8 >8 >8 >8 1 - 2 1 >16 >16

1455 Rhizopus oryzae > 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 0,25 - 0,5 0,5 - 1 > 64 > 64 > 64 > 64 4 - >8 2 - >8 >8 >8 1 2 - 4 >16 >16

1820 Rhizopus stolonifer > 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 0,25 0,5 > 64 > 64 > 64 > 64 2 4 >8 >8 1 1 >16 >16

1832 Rhizopus oryzae > 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 0,25 1 > 64 > 64 > 64 > 64 1 >8 >8 >8 0,25 - 2 2 >16 >16

1834 Syncephalastrum racemosum ≥ 16 > 16 ≥ 16 ≥ 16 0,5 0,5 - 1 > 64 > 64 > 64 > 64 1 1 >8 >8 0,25 - 2 2 0,5 1

IC 100 IC 50 IC 50

LIF

noIdentificação

Antifungico (ug/mL)

Anfotericina B 5-Fluorocitosina Fluconazol Itraconazol Voriconazol MiconazolMicafungina

MEC

Terbinafina

IC 50 IC 100 IC 50 IC 50 IC 100

LIF = Laboratório de Investigação em Fungos; MEC = Concentração Efetiva Mínima; IC 50=leitura de 50% de inibição do crescimento; IC

100=leitura de 100% de inibição de crescimento. *Todos os testes foram realizados em duplicata e resultados diferentes foram observados

em algumas leituras conforme demonstrado na tabela.

88


combinação

Os resultados das combinações de antifúngicos realizadas através da

metodologia do "tabuleiro de xadrez" demonstraram 100% de sinergismo nas

interações entre anfotericina B x itraconazol e anfotericina B x voriconazol quando

se faz a leitura considerando valores de 100 % de inibição de crescimento visível

tanto para itraconazol quanto para voriconazol. Sinergismo de 80% e 20% de

indiferença foram observados quando considerados valores correspondentes a

50% de inibição do crescimento visível para os dois antifúngicos (Tabela 5 e 6).

As interações resultantes entre terbinafina x itraconazol quando se faz a

leitura considerando valores de 100 % de inibição de crescimento visível para

itraconazol foi de 90% de sinergismo e 10% de indiferença. Sinergismo de 70% e

30% de indiferença foram observados quando considerados valores

correspondentes a 50% de inibição do crescimento visível para itraconazol (Tabela

7).

As interações resultantes da combinação de terbinafina x voriconazol

considerando valores de 100 % de inibição de crescimento visível para voriconazol

foi de 80% de sinergismo e 20% de indiferença. Sinergismo de 50% e 50% de


50% de inibição do crescimento visível para voriconazol. (Tabela 8).

89

Tabela 5. Suscetibilidade dos isolados de Mucorales frente à combinação de anfotericina B X itraconazol

Anfotericina

B

Itraconazol

( 50 %)

Anfotericina

B

Itraconazol

( 50 %)CIF T

Anfotericina

B

Itraconazol

( 100 %)

Anfotericina

B

Itraconazol

( 100 %)CIF T

299 C.bertholletiae 2 1 0,03125 0,125 0,1 S 2 2 0,03125 0,125 0,08 S



1046 Rhizopus oryzae 0,125 0,5 0,03125 0,125 0,5 S 0,125 4 0,03125 0,125 0,3 S


1237 Rhizopus oryzae 0,25 0,125 0,03125 0,125 1 I 0,25 2 0,03125 0,125 0,2 S

1455 Rhizopus oryzae 0,125 1 0,03125 0,125 0,4 S 0,125 4 0,03125 0,125 0,3 S

1820 Rhizopus stolonifer 0,125 0,5 0,03125 0,125 0,5 S 0,125 4 0,03125 0,125 0,3 S


1834 Syncephalastrum racemosum 0,125 0,25 0,03125 0,125 0,8 I 0,125 4 0,03125 0,125 0,3 S

Identificação LIF

no

InteraçãoCIM antifúngico sozinho

(µg/mL)

CIM antifúngico em

combinação (µg/mL)Interação

CIM antifúngico sozinho

(µg/mL)

CIM antifúngico em

combinação (µg/mL)

LIF: Laboratório de Investigação em Fungos; CIM: Concentração Inibitória Mínima; CIF: Concentração Inibitória Fracional; T: Tipo de

Interação; S: Sinergismo; I: Indiferença. As leituras para itraconazol foram realizadas com 50% de inibição do crescimento e 100% de

inibição de crescimento na leitura de CIM quando testado isoladamente.

90

Tabela 6. Suscetibilidade dos isolados de Mucorales frente à combinação de anfotericina B X voriconazol

Anfotericina

B

Voriconazol

( 50 %)

Anfotericina

B

Voriconazol

( 50 %)CIF T

Anfotericina

B

Voriconazol

( 100 %)

Anfotericina

B

Voriconazol

( 100 %)CIF T






1237 Rhizopus oryzae 0,25 1 0,03125 0,5 0,6 I 0,25 8 0,03125 0,5 0,2 S


1820 Rhizopus stolonifer 0,125 1 0,03125 0,5 0,8 I 0,125 2 0,03125 0,5 0,5 S


1834 Syncephalastrum racemosum 0,125 4 0,03125 0,5 0,4 S 0,125 32 0,03125 0,5 0,3 S

Interação

IdentificaçãoLIF

no


(µg/mL)

CIM antifúngico em



(µg/mL)

CIM antifúngico em



Interação; S: Sinergismo; I: Indiferença. As leituras para voriconazol foram realizadas com 50% de inibição do crescimento e 100% de


91

Tabela 7. Suscetibilidade dos isolados de Mucorales frente à combinação de terbinafina x itraconazol

TerbinafinaItraconazol

( 50 %)Terbinafina

Itraconazol

( 50 %)CIF T Terbinafina

Itraconazol

( 100 %)Terbinafina

Itraconazol

( 100 %) CIF T

299 C.bertholletiae 0,03125 1 0,00048 0,125 0,1 S 0,03125 2 0,00048 0,125 0,08 S



1046 Rhizopus oryzae >16 4 0,125 8 2 I >16 >16 0,125 8 0,5 S

1143 Rhizopus oryzae >16 4 0,125 2 0,5 S >16 8 0,125 2 0,3 S

1237 Rhizopus oryzae >16 4 0,125 4 1 I >16 8 0,125 4 0,5 S

1455 Rhizopus oryzae >16 0,5 0,125 2 4 I >16 2 0,125 2 1,0 I

1820 Rhizopus stolonifer > 16 1 0,125 0,5 0,5 S >16 2 0,125 0,5 0,3 S

1832 Rhizopus oryzae > 128 2 1 1 0,5 S > 128 4 1 1 0,3 S

1834 Syncephalastrum racemosum 0,5 2 0,125 0,125 0,3 S 0,5 4 0,125 0,125 0,3 S

Identificação LIF

no


(µg/mL)

CIM antifúngico em



(µg/mL)

CIM antifúngico em



Interação; S: Sinergismo; I: Indiferença. As leituras para itraconazol foram realizadas com 50% de inibição do crescimento e 100% de


92

Tabela 8. Suscetibilidade dos isolados de Mucorales frente à combinação de terbinafina x voriconazol

TerbinafinaVoriconazol

( 50 %)Terbinafina

Voriconazol

( 50 %) CIF TTerbinafina

Voriconazol

( 100 %)Terbinafina

Voriconazol

( 100 %)CIF T

299 C.bertholletiae 0,03125 4 0,0078 0,125 0,3 S 0,03125 >16 0,0078 0,125 0,3 S

300 C.bertholletiae 0,03125 4 0,01563 0,125 0,5 S 0,03125 >16 0,01563 0,125 0,5 S

301 C.bertholletiae 0,01563 4 0,01563 0,125 1 I 0,01563 >16 0,01563 0,125 1 I

1046 Rhizopus oryzae >16 4 0,125 16 4 I >16 >16 0,125 16 1 I

1143 Rhizopus oryzae >16 8 0,125 4 0,5 S >16 >16 0,125 4 0,3 S


1455 Rhizopus oryzae >16 2 0,125 4 2 I >16 >16 0,125 4 0,3 S

1820 Rhizopus stolonifer >16 1 0,125 0,125 0,1 S >16 2 0,125 0,125 0,08 S


1834 Syncephalastrum racemosum 0,5 8 0,25 0,125 0,5 S 0,5 >16 0,25 0,125 0,5 S


(µg/mL)

CIM antifúngico em

combinação (µg/mL)Identificação

LIF

no


(µg/mL)

CIM antifúngico em


CIM: Concentração Inibitória Mínima; CIF: Concentração Inibitória Fracional; T: Tipo de Interação; S: Sinergismo; I: Indiferença. As leituras

para voriconazol foram realizadas com 50% de inibição do crescimento e 100% de inibição de crescimento na leitura de CIM quando

testado isoladamente.

93

A combinação de terbinafina x anfotericina B demonstrou 100% de

sinergismo (Tabela 9).

Tabela 9. Suscetibilidade dos isolados de Mucorales frente à combinação de

terbinafina x anfotericina B

TerbinafinaAnfotericina

BTerbinafina

Anfotericina

BCIF T

299 C.bertholletiae 0,03125 4 0,00048 0,03125 0,02 S



1046 Rhizopus oryzae >16 0,5 0,125 0,25 0,5 S

1143 Rhizopus oryzae >16 1 0,125 0,25 0,3 S



1820 Rhizopus stolonifer >16 0,5 0,125 0,25 0,5 S


1834 Syncephalastrum racemosum 0,5 0,25 0,125 0,03125 0,4 S


(µg/mL)

CIM antifúngico em


Identificação LIF

no

LIF: Laboratório de Investigação em Fungos; MIC: Concentração Inibitória Mínima; CIF:

Concentração Inibitória Fracional; T: Tipo de Interação; S: Sinergismo.



automatizado Biocell - Tracer®

Para a padronização do inóculo foram avaliados vários parâmetros, tais

como: meio para indução de esporulação; tempo de crescimento prévio da cultura

fúngica, concentração ideal de Poli-L-Lisina, concentração e quantidade do

inóculo; tempo e temperatura de incubação prévia com o meio de cultura RPMI;

temperatura de execução do teste; intervalos de leitura e duração do teste (Tabela

10).

94

Tabela 10. Padronização do teste no sistema automatizado Biocell-Tracer para

Rhizopus oryzae (LIF 1832)

mediana

3 min

16 à 24 h a 35oC

1μl

Temperatura de execução do teste

Duração do teste*

35oC

76 min

Tempo e temperatura de incubação prévia com RPMI

Quantidade de inóculo

Medida para avaliação estatística dos resultados

Intervalos de leitura

Parâmetros avaliados Parâmetros obtidos (LIF 1832)

Agar batata

3 dias a TA

0,02%

105conidios

Meio para indução de esporulação

Tempo de crescimento prévio da cultura fúngica

Concentração ideal de Poli-L-Lisina

Concentração do inóculo em mL

*Pré - exposição:15 minutos ; Exposição: 60 minutos; Pós - exposição: 30 minutos. *TA (temperatura ambiente)

O tempo ideal de crescimento das culturas para a obtenção de conídios foi

de 3 a 4 dias a 28º C em ágar batata, sendo o melhor meio de cultura para a

produção de conídios.

As hifas foram melhor fixadas à placa de cultura com poli-L-Lisina (PLL) na

concentração de 0,02% (w/v).

Os isolados de Mucorales apresentaram crescimento inicial ideal após 16h

de incubação de 1 μL do inóculo contendo 105conidios/ μL sendo 24 horas o

tempo de incubação máximo para realização dos experimentos. A temperatura de

incubação prévia para inóculos dos isolados de Mucorales foi de 35o C, de acordo

com o CLSI (M38-A2, 2008) e esta foi também a temperatura para a execução do

teste; intervalo de 3 min para a medida da taxa de crescimento das hifas; 1h e 45

min como o tempo total de experimento.

Inicialmente o tempo de experimento para o isolado Rhizopus oryzae no

BCT foi padronizado em 76 minutos: sendo os 15 minutos iniciais considerados

como controle de crescimento (período de pré-exposição) e 60 minutos com a

presença do antifúngico (período de exposição). Com esta padronização foram

realizados os testes de avaliação dinâmica de crescimento na ausência ou

95

presença dos antifúngicos anfotericina B, terbinafina e itraconazol em suas

diferentes concentrações. A CIM obtida pelo teste de suscetibilidade dos

antifúngicos isolados in vitro foi utilizada como ponto de partida para avaliação do

crescimento das hifas e a partir desta foram avaliadas dosagens mais baixas

(figuras 15 e 16).

Figura 15. Acompanhamento de crescimento de hifas de Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente ao

antifúngico anfotericina B nas concentrações de 0,5; 0,25; 0,125 e 0,06 µg/mL.

Figura 16. Acompanhamento de crescimento de hifas de Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente ao

antifúngico terbinafina nas concentrações de 128; 64 e 32 µg/mL.

96

Os resultados da taxa de inibição do crescimento das hifas para os valores

anfotericina B nas concentrações acima testadas foram de: 98,5% para 0,5 µg/mL

de anfotericina B; 88.25% para 0,25 µg/mL; 81,61% para 0,125 µg/mL de

anfotericina B e 0% para 0,06 µg/mL de anfotericina B ( figura 17).

Figura 17. Porcentagem de inibição de crescimento de hifas de Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente

ao antifúngico anfotericina B nas concentrações de 0,5; 0,25; 0,125 e 0,06 µg/mL.


terbinafina nas concentrações acima testadas foram de: 98,7% para 128 µg/mL de

terbinafina; 97,44% para 64 µg/mL de terbinafina e 0% 32 µg/mL de terbinafina

(figura 18).


ao antifúngico terbinafina nas concentrações de 128; 64 e 32 µg/mL.

97

O acompanhamento da avaliação de suscetibilidade das hifas de Rhizopus

oryzae (LIF 1832) com a utilização das CIMs dos antifúngicos anfotericina B,

itraconazol e terbinafina obtidas pelo método de microdiluição em caldo está

representado na figura 19.

Figura 19. Acompanhamento de crescimento de hifas de Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente aos

antifúngicos anfotericina B, itraconazol e terbinafina nas concentrações de 0,25; 1,0 e 128 µg/mL,

respectivamente.


de CIMs obtidos pelo método de microdiluição em caldo foram: 88.25% de inibição

de crescimento quando se utilizou CIM de 0,25 µg/mL de anfotericina B (IC100)

obtida pelo método de microdiluição em caldo; 0% de inibição de crescimento

quando se utilizou CIM de 1,0 µg/mL de itraconazol (IC100) obtida pelo método de

microdiluição em caldo e no caso de CIM >128 µg/Ml (IC80) obtida pelo método de

microdiluição em caldo (foi avaliada a concentração de 128 µg/mL) para

terbinafina, a taxa de inibição foi de 98.70% (Figura 20).

98


as CIMs de anfotericina B, itraconazol e terbinafina

Estes resultados não pareciam estar de acordo nem com a interação

sinérgica obtida entre itraconazol e terbinafina com a metodologia do “tabuleiro de

xadrez” nem tampouco com a boa resposta clínica observada no paciente. Deste

modo, foi avaliada a combinação de itraconazol e terbinafina (antifúngicos

utilizados no tratamento do paciente) conforme caso resumido no anexo 2 nas

concentrações séricas médias, possíveis de serem atingidas, embora não

dosadas, de acordo com as doses administradas: 0.25 µg/mL de itraconazol e 1,0

µg/mL de terbinafina (58,59).

Uma vez que estavam sendo avaliadas concentrações reduzidas de

antifúngicos, o tempo de experimento BCT foi alterado para 2h e 30 minutos.

Assim os 15 minutos iniciais foram considerados como controle de crescimento

(período de pré-exposição) e 135 minutos com a presença do antifúngico (período

de exposição) (figura 21). Com a realização do teste, a taxa de inibição do

crescimento das hifas do isolado em estudo frente a combinação de terbinafina e

itraconazol foi de 49,3 %.

99

Figura 21. Acompanhamento de crescimento do isolado Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente a

combinação de itraconazol na concentração de 0,25 µg/mL e terbinafina na concentração de 1

µg/mL.

101

5. DISCUSSÃO

5.1. Identificação dos isolados de Mucorales

O diagnóstico precoce da mucormicose continua sendo um desafio e é uma

necessidade ainda não satisfatoriamente atendida, sendo de grande impacto no

sucesso do tratamento. O diagnóstico a partir de biópsia de tecidos continua a ser

o padrão-ouro, embora para alguns pacientes isto não seja viável, devido a

trombocitopenia ou instabilidade hemodinâmica. Além do mais, erros de

amostragem e dificuldades ocasionais na diferenciação de Mucorales em

amostras de tecido podem resultar em resultados falso-negativos ou falso-

positivos. Alguns artigos mostram também que novas ferramentas moleculares

para identificação de Mucorales em tecidos estão cada vez mais disponíveis (62-

66).

Nos experimentos iniciais para identificação molecular dos isolados em

estudo, foram utilizados os primers ITS1 e ITS4 e através da amplificação do DNA

fúngico diretamente das culturas, a identificação molecular foi realizada com

sucesso para os isolados: Rhizopus oryzae (LIF 1046, 1143, 1455, 1820, 1237) e

1832), não sendo possível a identificação molecular dos isolados de

Cunninghamella bertholletiae (LIF 299, 300 e 301) e Syncephalastrum sp. (LIF

1834), devido a impossibilidade de amplificação do DNA fúngico. Sendo assim, foi

necessário alterar os pares de primers sendo utilizado os pares de primers ITS4 e

ITS5, com os quais foi possível identificar os isolados de Rhizopus oryzae (LIF

1046, 1143, 1237, 1455, 1832) e Syncephalastrum racemosum LIF (1834), não

sendo possível novamente a identificação dos isolados de Cunninghamella

bertholletiae (LIF 299, 300 e 301) e com estes primers não foi possível identificar

também o isolado de Rhizopus sp. (LIF 1820). A escolha deste primers

inicialmente foi devido ao fato da maioria dos artigos na literatura disponíveis

utilizarem regiões ITS para identificação de Mucorales (30, 35,61).

Para os isolados que não foi possível a identificação tanto com a utilização

dos primers ITS1/ITS4 quanto os primers ITS4/ITS5, a opção foi a utilização dos

102

iniciadores NL1/NL4 que permitem o seqüenciamento da região D1/D2 constituinte

do DNA ribossomal 28S, o que também possibilitou a identificação de todos os

isolados em estudo conforme tabela 3 que mostra a similaridade dos resultados

entre os bancos de dados disponíveis. (Muraosa et al., Medical Mycology

Research Center Universidade de Chiba, Comunicação Pessoal). Neste trabalho

foram utilizados os seguintes bancos de dados: Biolomics (www.cbs.knaw.nl) e

ISHAM (www.mycology.lab.org) para aumentar as possibilidades de comparação

dos resultados.

Além da realização da PCR a partir do DNA extraído de culturas, foi

verificada também a possibilidade de amplificação do material genético

diretamente das culturas fúngicas utilizando para isto DNA Polimerase MigthyAmp

e os iniciadores NL1/NL4, o que permitiu uma maior agilidade na obtenção dos

resultados, além de redução nos custos, sendo a identificação obtida com sucesso

para todos os isolados. A enzima MigthyAmp DNA Polymerase (Takara Bio,

Japão), possibilita uma maior rapidez e eficiência nas reações de ligação para

amplificação do material genético (55,56).

Não houve concordância entre a identificação morfológica e molecular para

os isolados LIF 1237 e 1832, classificados morfologicamente como Absidia

(Lichtheimia) sp. e Rhizomucor sp. e ambos como Rhizopus oryzae por

sequenciamento. Da mesma forma, o isolado LIF 1820 foi classificado por

sequenciamento como Rhizopus stolonifer.

Isto pode ser decorrente das limitações da identificação morfológica desta

classe de fungos filamentosos, já que é uma técnica demorada, há necessidade

de profissionais experientes, é dependente de condições de crescimento do micro-

organismo já que a observação macroscópica e microscópica das estruturas

muitas vezes não corresponde às descrições disponíveis em manuais de

identificação e a presença de variações das características dentro de uma mesma

espécie devido tanto ao ambiente, como também a subjetividade do observador.

Poucos artigos relatam a identificação de Mucorales através da utilização dos

iniciadores NL1/NL4 e mostram que os bancos de dados disponíveis geralmente

http://www.cbs.knaw.nl/

http://www.mycology.lab.org/

103

não são suficientes para identificação de algumas espécies relacionadas a alguns

gêneros, como Mucor, Rhizopus e Cunninghamella (35).

Técnicas moleculares mostram um enorme potencial para identificar com

rapidez e precisão, porém, ensaios de detecção moleculares para os Mucorales

não são ainda amplamente disponíveis. Um conjunto de dados com base em

sequências 18S e 28S do rRNA de 42 isolados de Mucorales sequenciados, foi

construído mostrando que o seqüenciamento da região ITS é um método confiável

para a identificação precisa da maioria dos Mucorales até espécie e que as

seqüências 18S foram altamente conservadas, mas as seqüências 28S foram

mais variáveis entre as espécies (35). Em nosso trabalho, os resultados da

identificação molecular utilizando a região ITS não foram concordantes para os

isolados de Cunninghamella bertholletiae cuja amplificação só foi possível com a

utilização da região 28S.

Para a identificação de Mucorales, a região ITS tem sido proposta como um

alvo valioso para identificação do gênero e, geralmente, ao nível de espécie, no

entanto, a região D1/D2 do 28S é capaz de fornecer uma resolução melhor

quando se objetiva a identificação de espécies (62).

Como em nosso trabalho, alguns artigos na literatura relatam também

casos de divergências entre a identificação morfológica e molecular em que os

isolados geralmente em discordância são também finalmente classificados como

Rhizopus oryzae, sendo considerada identificação morfológica de gênero também

frequentemente imprecisa (62-65).

Estudo com 20 isolados de Mucorales usando o sistema automatizado rep

– PCR e sequências ITS como ferramentas moleculares de identificação

encontrou 100 % de concordância entre estas duas metodologias. No entanto,

apresentou somente 74% de concordância com a identificação baseada na

morfologia, sendo que os isolados com resultados discordantes foram

identificadas como Rhizopus sp. pelos métodos moleculares (62).

Por meio do sequenciamento das regiões ITS1 e ITS 2 KONTOYIANNIS et

al., (65) determinaram o gênero de 19 isolados de Mucorales e compararam os

104

resultados obtidos com a identificação morfológica. A taxa de concordância foi de

79% entre os resultados baseados em métodos morfológicos e moleculares. Dos

quatro isolados identificados incorretamente pela morfologia, três eram do gênero

Rhizopus.

Estudo realizado com 190 isolados clínicos de Mucorales utilizando os

primers ITS4 e ITS5, com análise filogenética realizada com o programa MEGA

4.0 e a identificação final com o banco de dados Basic Local Alignment Tool

(BLAST), evidenciou que os agentes mais prevalentes de mucormicose foram

Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus e que a correlação entre morfologia e

métodos moleculares na identificação de espécies foi de 92,6% e de gênero de

100% (30), sendo que em nosso trabalho a correlação entre morfologia e

identificação molecular tanto a nível de espécie e de gênero foi de 80%, sendo os

isolados com resultados discordantes classificados como Rhizopus oryzae.

Muitos laboratórios não identificam além de gênero, sendo a espécie

frequentemente omitida também na literatura médica, especialmente quando as

observações não correspondem às descrições ou ilustrações disponíveis. A

identificação de Mucorales continua a ser uma tarefa difícil e demorada. No

entanto, características morfológicas observadas por profissionais experientes

podem fornecer um alto nível de precisão. Este conhecimento, associado às

técnicas moleculares podem ser ferramentas úteis na identificação de espécies de

Mucorales de importância clínica, assim como para a delimitação de espécies

ainda não descritas. Embora a identificação molecular de Mucorales utilizando

regiões ITS venha sendo usada, frequentemente com sucesso, nos últimos anos,

os bancos de sequências, como BLAST, ainda representa uma limitação pelo

número reduzido e imprecisão de algumas sequências depositadas (29,30).

Apesar das técnicas moleculares serem mais rápidas e mais confiáveis do

que a identificação micológica padrão, mais estudos são necessários na busca de

uma melhor padronização das técnicas e melhoria da sensibilidade (62-66).

105

5.2. Testes de suscetibilidade

5.2.1. Avaliação da suscetibilidade aos antifúngicos isolados in

vitro pelo método de microdiluição em caldo (CLSI, M38-

A2)

A concentração do inóculo recomendada pelo CLSI para fungos

filamentosos é 0,4 X 104 a 5 X 104 UFC/ml. Neste trabalho verificamos que para os

isolados de Mucorales em estudo, a concentração de inóculo ideal foi de 4 X 104

UFC/ml, já que concentrações mais baixas ou mais altas conduziam a dificuldades

de interpretação dos resultados.

As placas de microdiluição foram incubadas a 37ºC e as leituras das CIMs

foi realizada após 24 horas de incubação. A placa do teste de suscetibilidade do

isolado LIF 1820 (R. stolonifer) foi incubada à temperatura ambiente, pois não

houve crescimento em temperaturas mais elevadas, conforme já informado.

Os resultados dos testes de CIM dos antifúngicos frente aos isolados deste

estudo mostraram que os antifúngicos mais ativos contra a maioria dos isolados

foram anfotericina B e itraconazol. Os isolados C.bertholletiae e Syncephalastrum

racemosum foram mais sensíveis a concentrações mais baixas de terbinafina do

que Rhizopus oryzae e Rhizopus stolonifer. Todos os isolados foram altamente

resistentes a micafungina, 5-fluorocitosina, fluconazol e voriconazol. Observou-se

também uma melhor nitidez na leitura realizada com 48 horas de incubação tanto

para itraconazol quanto para voriconazol. Verificou também que os isolados

pertencentes ao gênero Rhizopus sp. foram menos sensíveis ao itraconazol em

relação as outros isolados avaliados. Através dos resultados observa-se que além

da anfotericina B, outros antifúngicos possuem atividade in vitro contra Mucorales

e dependendo da espécie e gênero tem perfis diferentes de suscetibilidade.

Embora os baixos valores de CIM obtidos frente a miconazol apresentados

na tabela parecerem promissores, este não tem sido muito utilizado para o

tratamento de mucormicose e infecções sistêmicas por fungos filamentosos devido

106

à sua toxicidade e farmacocinética, sendo indicado somente para uso tópico nos

casos de dermatofitoses, malassezioses e candidíases mucocutâneas (67-71).

Apesar de níveis sanguíneos relativamente baixos e de curta duração de

miconazol em exsudato do espaço retroperitoneal pélvico, estudo realizado por

Mikamo et al.,(69) demonstrou sua eficácia clínica na candidíase sistémica, com a

utilização de uma ou mais infusões intravenosas diárias de miconazol,

desempenhando um papel importante no tratamento.

Trabalho publicado por Taguchi et al.,(72) utilizando o sistema

automatizado BCT avaliou a atividade in vitro de miconazol contido no soro

humano do mesmo paciente em que foi injetado miconazol na concentração de

600 mg /dia durante 2 dias sobre hifas de Aspergillus fumigatus. As concentrações

de miconazol obtidas no soro foram de 8,8; 3,5 e 1,6 µg/mL. O soro contendo 8,8

µg/mL de miconazol inibiu o crescimento de hifas após 90 minutos de avaliação

dinâmica de crescimento e o soro contendo 3,5 µg/mL após 100 minutos de

avaliação dinâmica de crescimento enquanto que no soro contendo 1,6 µg/mL não

houve inibição de crescimento.

De acordo com Ribes (73) a mucormicose permanece como uma infecção

de difícil tratamento sendo associada com uma alta taxa de mortalidade.

Anfotericina B não é efetiva em todos os casos de mucormicose principalmente se

o paciente apresentar no decorrer da doença uma infecção disseminada. Sua

atividade terapêutica é limitada devido aos severos efeitos colaterais, sendo que a

função renal comprometida frequentemente conduz à interrupção da terapia.

Estudo realizado por JONHSON et al., (74), com alguns isolados de

Mucorales mostrou que estes também foram resistentes a 5-fluorocitosina e

fluconazol o que está de acordo com os resultados encontrados em nosso

trabalho. Além do mais, foi observado um aumento entre as CIMs dos antifúngicos

após 24 horas de incubação, com exceção de anfotericina B que não apresentou

muita diferença. Altas CIMs de voriconazol foram encontradas para todos os

isolados.

107

Apesar de não haver indicação do uso de azólicos no tratamento de

mucormicose e os estudos do uso de antifúngicos azólicos no tratamento de

mucormicose serem escassos, tem se verificado que os compostos azólicos

sozinhos ou em combinação tem efeitos benéficos em modelos de animais

infectados por Rhizopus sp. e podem apresentar uma alternativa ao tratamento

(75-78).

Estudos realizados por Dannaoui et al., (17,79) relatam diferenças nos

perfis de suscetibilidade in vitro entre gêneros e espécies de Mucorales frente a

diferentes antifúngicos, evidenciando que o tratamento médico adequado muitas

vezes requer uma identificação específica do agente patogênico. A identificação

precisa de espécies de Mucorales poderia também ter grande importância para

pesquisas sobre a eficácia do antifúngico. Além disso, os resultados mostraram,

por exemplo, que Rhizopus sp. foram menos susceptíveis a itraconazol,

posoconazol, terbinafina e anfotericina B do que Absidia sp que foi menos

susceptível do que Mucor sp a anfotericina B (80).

Algumas mudanças no manejo da mucormicose em pacientes com câncer

hematológico com alto risco para esta infecção pode aumentar ou diminuir a

incidência de mucormicose nesta população. Recentemente os pesquisadores

descobriram que a sobrecarga de ferro preexistente é um preditor de pior

prognóstico com aumento de infecções bacterianas e fúngicas principalmente

mucormicose em pacientes com doenças hematológicas malignas ou

transplantados. Alguns trabalhos relatam a administração de deferasirox, um

quelante de ferro, no início de um câncer hematológico, já que este indiretamente

atua contra o desenvolvimento de Mucorales. O deferasirox utilizado para o

tratamento de sobrecarga de ferro em pacientes com doenças hematológicas

malignas poderia, teoricamente, diminuir a ocorrência de mucormicose (10, 65,81-

83).

A realização dos testes de suscetibilidade aos antifúngicos in vitro é

importante para padronização de algumas etapas da metodologia, como o tempo

de crescimento fúngico, temperatura de incubação, preparo do inóculo, diluição

108

dos antifúngicos e preparo do meio de cultura visto que dependendo do micro-

organismo avaliado é necessário alterar as condições do teste.

Embora estudos de correlação clínico laboratorial frente aos testes de

suscetibilidade realizados para leveduras (CLSI M27 S4) (82) estejam caminhando

para a determinação de pontos de corte para estes testes, ainda não há nada

definido para fungos filamentosos. Documentos do CLSI e EUCAST relatam

apenas alguns pontos de corte epidemiológicos para algumas espécies de

Aspergillus (83). Estudos com quantidade significativa de isolados e

acompanhamento clínico de pacientes com infecções por fungos filamentosos,

especialmente as sistêmicas, esbarram em grande número de dificuldades e ainda

são muito limitados.

5.2.2. Avaliação da Concentração Inibitória Fracional (CIF) dos isolados

de Mucorales através da metodologia do "tabuleiro de xadrez"

frente a anfotericina B x itraconazol; anfotericina B x voriconazol;

terbinafina x itraconazol; terbinafina x voriconazol e terbinafina x

anfotericina B

Através dos resultados obtidos observou-se 100% de sinergismo nas

interações entre anfotericina B x itraconazol e anfotericina B x voriconazol quando

se faz a leitura considerando valores de 100 % de inibição de crescimento visível

tanto para itraconazol quanto para voriconazol. Sinergismo de 80% e 20% de


50% de inibição do crescimento visível para os dois antifúngicos. O documento do

CLSI (M38 A2) preconiza leituras de 100% de inibição de crescimento, mas

considera os testes realizados com antifúngicos isolados. De acordo com os

resultados, verifica-se uma diminuição da concentração inibitória mínima obtida

tanto para anfotericina, itraconazol e voriconazol quando os antifúngicos são

associados.

109

No caso da combinação entre terbinafina x itraconazol, observou-se que

quando se faz a leitura considerando valores de 100 % de inibição de crescimento

visível para itraconazol as interações resultantes foram 90% de sinergismo e 10%

de indiferença. Sinergismo de 70% e 30% de indiferença foram observados

quando considerados valores correspondentes a 50% de inibição do crescimento

visível para itraconazol. Importante destacar que no caso da terbinafina o ideal é

fazer a combinação de antifúngicos, principalmente no caso dos isolados de

Rhizopus oryzae e Rhizopus stolonifer, uma vez que na microdiluição in vitro para

este antifúngico avaliado individualmente estes isolados são altamente resistentes.

Esta combinação foi utilizada no tratamento de um paciente com mucormicose

rino-orbito-cerebral em nossa instituição que obteve desfecho clínico favorável

conforme demonstrado no anexo 2, evidenciando que se fossem considerados

apenas os testes de microdiluição utilizando a CIM frente a terbinafina

individualmente, o paciente poderia não iniciar o tratamento com terbinafina

associada a itraconazol o que poderia conduzir a mau prognóstico.

Os resultados evidenciam o fato da combinação de terbinafina e itraconazol

poder ser utilizada no tratamento de mucormicose devido ao tipo de interação

resultante e desfecho clínico favorável, sendo importante destacar que tanto

anfotericina B, terbinafina e itraconazol podem ter contribuído para o tratamento

(anexo 2).

As interações resultantes da combinação de terbinafina x voriconazol

considerando valores de 100 % de inibição de crescimento visível para voriconazol

foram de 80% de sinergismo e 20% de indiferença. Sinergismo de 50% e 50% de

indiferença foram observados quando considerados valores correspondentes a 50%

de inibição do crescimento visível para voriconazol. Estes resultados mostram que

terbinafina combinada também com voriconazol poderia ser uma alternativa ao

tratamento de mucormicose, apesar dos Mucorales serem mais resistentes a

voriconazol individualmente em comparação com o itraconazol.

Para a combinação de terbinafina x anfotericina B houve 100% de

sinergismo, demonstrando que esta associação poderia também ser útil em

110

pacientes, diminuindo os efeitos colaterais principalmente de anfotericina B que

poderia ser utilizada em dosagens muito mais baixas do que quando avaliada

individualmente.

Estudo realizado por Dannaoui et al., (17) mostrou também que as

combinações de antifúngicos como, por exemplo, anfotericina B x terbinafina e

anfotericina B x voriconazol apresentaram sinergismo in vitro contra Mucorales.

Apesar de ser indicada primeiramente no tratamento de micoses superficiais, a

combinação de terbinafina com anfotericina B tem sido aplicada com sucesso no

tratamento de mucormicose. Suas aplicações estão sendo estendidas, uma vez

que alguns trabalhos relatam valores baixos de CIMs contra isolados de

Mucorales (18,19).

Embora as equinocandinas não demonstrem atividade in vitro contra

Mucorales em testes de sensibilidade padrão, durante a mucormicose

disseminada em ratos com cetoacidose diabética, a combinação de complexo

lipídico de anfotericina e caspofungina sinergicamente melhora a sobrevida em

comparação com a monoterapia. Estudo realizado mostrou que a terapia

combinada com anfotericina B lipossomal com micafungina ou anidulofungina

também aumentou significativamente a sobrevivência de camundongos

neutropênicos com mucormicose disseminada (10, 20,21).

De acordo com Spellberg et al., (22), a alta taxa de mortalidade de

mucormicose com monoterapia atualmente disponível, particularmente em

pacientes hematológicos, tem estimulado o interesse no estudo de novas

combinações de agentes antifúngicos no intuito de obter resultados melhores em

relação à monoterapia. Recentemente, a terapia por combinação de polienicos

lipídicos e equinocandinas é a mais promissora. Outras opções incluem a

combinação de poliênicos lipídicos com deferasirox ou posaconazol. É importante

a realização dos ensaios clínicos para determinar se os resultados destas

infecções devastadoras podem ser melhorados com novas combinações. É

fundamental a realização de ensaios controlados para comparar a eficácia da

terapia combinada com a de monoterapia. A ausência e as falhas destes estudos

111

levam a questionamentos sobre quais estratégias são mais eficazes e menos

tóxicas para esta infecção mortal. Estas abordagens como, por exemplo,

anfotericina B lipossomal combinada com fator estimulante de colônias de

granulócitos e macrófagos mostrou ser eficaz em modelos animas de

mucormicose invasiva. No entanto, estas abordagens ainda não estão

desenvolvidas como novas combinações de agentes antifúngicos, sendo

necessários mais estudos antes de serem priorizadas para investigação clínica em

larga escala.

Combinações de terbinafina ou caspofungina com anfotericina B,

posaconazol ou itraconazol foram estudadas in vitro como potenciais tratamentos

contra 18 isolados de Mucorales (Mucor irregularis). Sinergismo foi observado

para as combinações de terbinafina com anfotericina B, posaconazol, e itraconazol

contra os isolados em estudo e para as combinações de caspofungina com

anfotericina B, posaconazol, e itraconazol não sendo observado antagonismo (23).

Neste estudo não foi avaliada a combinação de anfotericina B com

equinocandinas devido à indisponibilidade desta classe de antifúngicos na forma

de sal na instituição até a finalização destes resultados.

A combinação de antifúngicos é frequentemente usada para infecções

fúngicas de difícil tratamento e poderia ser uma estratégia útil para o tratamento

de mucormicose, já que resulta em redução de toxicidade de dosagens individuais

e pode contribuir com a eficácia do tratamento, dependendo do tipo de interação

resultante entre os antifúngicos avaliados.

A realização da metodologia do "tabuleiro de xadrez" permite a combinação de

dois antifúngicos em concentrações diferentes de maneira que tanto a maior quanto a

menor concentração de um agente antifúngico combina com as respectivas

concentrações de outro antifúngico a ser testado, sendo importante para guiar o

tratamento da mucormicose, associada com os testes de suscetibilidade aos

antifúngicos isolados in vitro.

112

5.2.3. Avaliação da suscetibilidade a antifúngicos pela técnica de


automatizado Biocell - Tracer®

Existem poucos relatos sobre a avaliação dinâmica do crescimento fúngico

e sua taxa de inibição de crescimento em contato com agentes antifúngicos (41-

53) e não há relatos sobre estes testes para agentes causais de Mucoralomycosis.

Alguns estudos com outros fungos filamentosos mostraram que hifas podem

responder bem, com altas taxas de inibição de crescimento, a menores

concentrações de antifúngicos do que os conídios, sendo possível talvez

estabelecer uma melhor correlação com a evolução clínica, uma vez que as hifas

são as estruturas fúngicas presentes no tecido infectado.

Conforme a tabela 9, para a padronização do inóculo para avaliação

dinâmica de crescimento foram avaliados vários parâmetros, tais como: meio para

indução de esporulação; tempo de crescimento prévio da cultura fúngica,

concentração ideal de Poli-L-Lisina, concentração e quantidade do inóculo; tempo

e temperatura de incubação prévia com o meio de cultura RPMI; temperatura de

execução do teste; intervalos de leitura e duração do teste.

A observação de crescimento em tempo real de Rhizopus oryzae (LIF 1832)

neste trabalho, revelou um comportamento de crescimento completamente

diferente do relatado até o momento para Aspergillus sp., Fusarium sp. (49,50),

dermatófitos (51) e fungos demáceos (53). R. oryzae apresenta, em média,

crescimento de 9 μm/3min enquanto o crescimento de dermatófitos variou entre

0,35 e 2,02 μm/10min; Aspergillus entre 1,63 e 8,71 μm/10min; Fusarium sp. entre

1,0 e 6,5 μm/5min e fungos demáceos entre 0,5 e 3,5 μm/10min.

De acordo com estudos anteriores, o tempo de experimento no BCT para

Aspergillus sp., Fusarium sp., dermatófitos e fungos demáceos foi de 210 minutos,

assim distribuídos: os primeiros 30 minutos (período de pré – exposição ou

controle interno do teste) e 120 minutos na presença de antifúngico (período de

exposição) e 30 minutos finais após a retirada do agente antifúngico em teste

(período de pós-exposição)(49-51).

113

Para Rhizopus oryzae (LIF 1832) foi necessário reduzir o período de pré-

exposição para 15 minutos seguidos de 60 minutos período de exposição (tabela

9). Este padrão pode ser utilizado para a avaliação da inibição do crescimento

dinâmico frente às CIMs de AMB e TERB obtidas para conídios conforme figuras

15 e 16. Assim, apesar da CIM de TERB obtida pelo método de microdiluição em

caldo ter sido > 128 μg/mL (IC80), a taxa de inibição de crescimento avaliada com

128 µg/mL foi de 98,70%, indicando que as hifas podem responder a

concentrações mais baixas do que os esporos. Para anfotericina B a taxa de

inibição para CIM 0,25 µg/mL obtida pelo método de microdiluição em caldo

(IC100) foi de 88.25% e não houve inibição do crescimento de hifas frente à CIM

1,0 µg/ml de ITC sozinho.

De maneira controversa, resultados do teste microdiluição em caldo para

determinação de CIMs utilizando esporos mostraram alta sensibilidade do isolado

de Rhizopus oryzae (LIF 1832) frente a AMB e ITC em comparação com TERB.

Assim como o teste de combinação entre TERB e ITC mostrou sinergismo

(CIF=0.3), foi avaliado crescimento dinâmico de hifas de Rhizopus oryzae (LIF

1832) frente a combinação de terbinafina x itraconazol.

Alguns artigos relatam que compostos azólicos isoladamente ou em

combinação podem ter efeitos benéficos em modelos animais infectados por

Rhizopus sp.. e podem fornecer alternativas de tratamento para mucoralomycosis

[74-76].

De acordo com os registros do paciente, ele recebeu itraconazol 300 mg/dia

e terbinafina 250 mg/dia, que deveriam resultar em concentrações séricas médias

de 0.35 e 1,0ug/mL respectivamente e que juntamente com anfotericina B

permitiram o desfecho clínico favorável (anexo 2).

Para tentar mimetizar in vitro o sucesso terapêutico obtido in vivo as

concentrações séricas médias de itraconazol e terbinafina foram combinadas em

um mesmo experimento no BCT com tempo diferente de experimento em relação

a avaliação dinâmica de crescimento para CIMs de anfotericina B e terbinafina.

Por se tratar de concentrações extremamente baixas, foi necessário estender o

114

período de exposição (previamente padronizado em 75 minutos) (figura 21). Foi

possível observar atividade de inibição do crescimento fúngico apenas a partir de

90 minutos de experimento. A taxa de inibição obtida ao final de 150 minutos de

exposição foi de 49,3% que, embora sendo menor do que o esperado (trabalhos

anteriores descartam taxas de inibição abaixo de 50%) (47-53,86-89), ainda deve

representar um bom resultado devido ao desfecho clínico favorável do paciente

em tratamento.

Neste caso, a avaliação da inibição do crescimento, em tempo real, das

combinações das concentrações séricas de ITC e TERB diretamente sobre as

hifas do agente causal demonstraram correlação adequada com o resultado

clínico, indicando que talvez somente a avaliação destas concentrações seja

necessária para determinar a suscetibilidade do micro-organismo em questão. Se

apenas os resultados dos testes de sensibilidade realizados com esporos para

determinação de CIMs de antifúngicos isolados pela metodologia de microdiluição

em caldo tivessem sido considerados na indicação da terapêutica, provavelmente

este paciente não teria recebido TERB, já que a CIM para este antifúngico foi >

128 μg/mL (IC80).

Não foi possível atribuir a um antifúngico em particular todo o mérito do

sucesso terapêutico. No entanto, é possível inferir que mesmo a taxa de inibição

de crescimento de hifas abaixo de 50% para a combinação das concentrações

séricas de ITC e TERB pode ter contribuído para o favorável desfecho clínico.

A determinação da porcentagem de taxa de inibição no BCT atualmente

não é padronizada no sentido de predizer se o micro-organismo em teste será

sensível ou não, o fato é que trabalhos na literatura sugerem que as hifas

respondem a concentrações mais baixas do que os esporos utilizados na

metodologia de microdiluição em caldo (47-53,86-89).

A avaliação da inibição do crescimento de hifas é uma metodologia capaz

de mimetizar uma situação semelhante a que acontece nos tecidos de pacientes

infectados sendo de grande importância para predizer o potencial terapêutico de

um determinado agente antifúngico.

115

Estudos de acompanhamento do paciente com a realização dos testes de

suscetibilidade por diferentes metodologias seriam o modo ideal de estabelecer a

real correlação entre estes e o desfecho clínico. No entanto, são raras as vezes

em que isto é possível.

Cada vez mais, estudos de testes de suscetibilidade correlacionando

desfecho clínico estão sendo encorajados. Os avanços em relação aos patógenos

leveduriformes já podem ser vistos nos manuais do CLSI. Para os fungos

filamentosos, estruturas complexas e multifacetadas, ainda há muito que estudar.

Os dados deste trabalho sugerem que a forma de hifa é mais suscetível que

a forma de esporos frente aos antifúngicos avaliados, sendo a avaliação de

crescimento dinâmico uma metodologia com grande potencial preditivo para

orientação terapêutica em casos de mucormicose.

117

6. CONCLUSÕES

Os isolados foram identificados por técnicas morfológicas e moleculares,

obtendo divergência em apenas dois isolados: LIF 1237 e 1832, classificados

morfologicamente como Absidia (Lichtheimia) sp. e Rhizomucor sp. e ambos

como Rhizopus oryzae por sequenciamento.

Foi feita a padronização dos testes de suscetibilidade tanto para antifúngicos

isolados quanto em combinação, com a necessidade de novas

padronizações para outras espécies. Para os isolados de Mucorales que não

Rhizopus spp., as condições ideais para a realização dos testes de

suscetibilidade pela técnica de microdiluição em caldo foram: incubação

prévia de 2 a 3 dias a 35ºC, inóculo de 4 X 104 UFC/mL e leitura após 24

horas de incubação a 35ºC. Para o isolado LIF 1820 (R. stolonifer) o teste

deve ser realizado à temperatura ambiente; AMB e ITC foram os

antifúngicos mais ativos, enquanto MCF, 5FC e FCZ os menos ativos;

houve diferença de suscetibilidade aos antifúngicos entre as espécies;

Os testes de suscetibilidade aos antifúngicos combinados mostraram

diminuição da CIM obtida para AMB, ITC, VOR e TERB quando os

antifúngicos são associados. CIMs altas de TERB foram observadas para

os isolados de Rhizopus oryzae e Rhizopus stolonifer, em contradição aos

resultados obtidos no teste desse antifúngico isolado, ressaltando a

importância da combinação de antifúngicos no manejo de mucormicose;

118

Foi padronizada as condições da avaliação de dinâmica de crescimento

para Mucorales do gênero Rhizopus sp., sendo diferente de trabalhos

disponíveis na literatura. Para CIMs de AMB e TERB as seguintes

condições padronizadas foram: poli-L-Lisina (PLL) na concentração de

0,02% (w/v); 1 μL do inóculo de 105 esporos/mL; tempo de crescimento

prévio de 3 a 4 dias a 28º C em ágar batata dextrose; a 35oC de 16 a 24h;

35oC para execução do teste; tempo total de experimento de 76 minutos;

com intervalos de leitura a cada 3 min. Para a avaliação dinâmica de

crescimento para a combinação dos antifúngicos TER e ITC o tempo total

de experimento foi de 150 minutos.

Não foi possível atribuir a um antifúngico em particular todo o mérito do

sucesso terapêutico obtido pelo paciente em tratamento de mucormicose

decorrente do isolado R. oryzae (LIF 1832).

119

7. REFERÊNCIAS

1. Kwon-Chung KJ. Taxonomy of Fungi causing Mucormycosis and

Entomophthoramycosis (Zygomycosis) and nomenclature of the disease:

Molecular Mycologic Perspectives. Clinical Infectious Diseases 2012;

54(S1):S8-15.

2. Ainsworth GC. Introduction and keys to higher taxa. In: Ainsworth GC, Sparrow

FK, Sussman AS, eds. The fungi. IVA. A taxonomic review with keys. New

York: Academic Press, 1973:1-7.

3. Whittaker RH. New concepts of kingdoms of organisms. Evolutionary relations

are better represented by new classifications than by the traditional two

kingdoms. Science 1969; 163:150-60.

4. Schussler A, Schwarzott D, Walker C.A new fungal phylum, the

Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycol Res 2001; 105:1413-21.

5. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF. A higher-level phylogenetic classification of

the Fungi. Mycol Res 2007; 111:509-47.

6. Kian JL, Njo-Injo TE, Pohan A, Muelen VH, Emmons CW. Basidiobolus

ranarum as a cause of subcutaneous phycomycosis in Indonesia. AMA Arch

Dermatol 1956; 74:378-83.

7. Clark BM. The epidemiology of phycomycosis. In: Wolstenholme GEW, Porter

R, eds. Systemic mycoses. London: J & A Churchill, 1968:179-205.

8. Ajello L, Dean DF, Irwin RS. The zygomycete Saksenaea vasiforme as a

pathogen of humans with a critical review of the etiology of zygomycosis.

Mycologia 1976; 68: 52-62.

9. Hoffmann K, Discher S, Voigt K. Revision of the genus Absidia (Mucorales,

Zygomycetes) based on physiological, phylogenetic, and morphological

characters: thermotolerant Absidia spp. form a coherent group, Mycocladiaceae

fam. nov. Mycol Res 2007; 111:1169-83.

120

10. Ibrahim A, Spelberg B, Edwards J. Iron Acquisition: A Novel Prospective on

Mucormycosis Pathogenesis and Treatment.Nacional Institute of

Health.2008; 21(6): 620-625.

11. Sens YAS, Martini D, Watanabe L, Gadelha CP, Souza JF, Jabur P. Relato

de caso: mucormicose em rim transplantado. Jornal Brasileiro de Nefrologia

2002; 24 (3): 153-6.

12. Chamilos G, Lewis RE, Lianchun JH, Xiao L, Zal T, Gilliet M, Halder G,

Kontoyiannis P. Drosophila melanogaster as a model host to dissect the

immunopathogenesis of zygomycosis.PNAS.2008;105 (27) : 9367- 9372.

13. Coraçari AR, Alves AT, Brasil RG, Fernandes AM, Maníglia JV.

Mucormicose Rino-órbito-cerebral: Relato de Caso e Revisão de Literatura.

Arquivos Internacionais de Otorrinolarinologia. 2003; 7(2):160-165.

14. Rogers TR, Treatment of zygomycosis: current and new options. Journal of

Antimicrobial Chemotherapy. 2008; 61: 35-39.

15. Perkhofer S, Lechner V, Lass-Flo¨rl C. In Vitro Activity of Isavuconazole

against Aspergillus Species and Zygomycetes According to the

Methodology of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility

Testing. Testing. Antimicrobial Agentes and Chemotherapy. 2009;53 (4):

1645-1647.

16. Lass- Flörl C, Mayr A, Perkhofer S, Hinterberger G, haudorfer J, Speth C,

Fille M. Activities of Antifungal Agents against Yeasts and Filamentous

Fungi: Assessment according to the Methodology of the European

Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Antimicrobial Agentes

and Chemotherapy.2008; 52 (10): 3637-3641.

17. Dannaoui E, Afeltra J, Meis JFGM, Verweij PE. In Vitro susceptibilities of

Zygomycetes to Combinations of Antimicrobial Agents. Antimicrobial

agentes and chemotherapy. 2002;46 (8):2708-2711.

18. Foss NT, Rocha MR, Lima VT, Velludo MA, Roselino AM.

Entomophthoramycosis: therapeutic success by using amphotericin B and

terbinafine. Dermatology. 1996; 193:258-260.

121

19. Jessup CJ, Ryder NS, Ghannoum MA. An evaluation of the in vitro activity

of terbinafine. Med. Mycol. 2000. 38:155-159

20. Ibrahim AS, Bowman JC, Avanessian V, et al. Caspofungin inhibits

Rhizopus oryzae 1,3-beta-D-glucan synthase, lowers burden in brain

measured by quantitative PCR, and improves survival at a low but not a

high dose during murine disseminated zygomycosis. Antimicrob Agents

Chemotherapy 2005; 49:721-7.

21. Spellberg B, Fu Y, Edwards JEJr, Ibrahim AS. Combination therapy with

amphotericin B lipid complex and caspofungin acetate of disseminated

zygomycosis in diabetic ketoacidotic mice. Antimicrob Agents

Chemotherapy 2005; 49:830-2.

22. Spellberg B, Ibrahim A, Roilides E. et al. Combination Therapy for

Mucormycosis: Why, What, and How? Clinical Infectious Diseases

2012:54(S1):S73-78.

23. Zhang S, Li R, Yu J. Drug Combinations against Mucor irregularis In Vitro.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy.2013:57(7):3395-97.

24. Ogawa T, Takezawa k, Tojima I. et al. Successful treatment of rhino-orbital

mucormycosis by a new combination therapy with liposomal amphotericin B

and micafungin.Clinical Infectious Diseases 2012:54(S1):S79-85.

25. Sidrim JJC, Moreira JLB. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais da

Micologia Médica. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999, 287 p.

26. Lacaz CS, Porto E, Martins JEC, Heins-Vacari EM, Melo NT. Tratado de

Micologia Médica Lacaz. 9ª ed., São Paulo: Sarvier, 2002.1104p.

27. Larone DH. Medically important fungi: a guide for identification.4. ed.

Washington: ASM Press, 2002.

28. Wengenack NL, Binnicker MJ. Fungal Molecular Diagnostics. Clin Chest

Med 2009; 30: 391- 408.

29. Scholer HJ, Muller E, Schipper MAA. Mucorales, InD. H. Howard (ed.),

Fungi pathogenic for humans and animals, part A.Biology. Marcel Dekker,

New York. 1983, p.9-59.

122

30. Bankowski MJ, Anderson SM. Real-time nucleic acid amplification in clinical

microbiology. Clin Microbiol Newsl 2004; 26 (2):9-15.

31. Alvarez E, Sutton DA, Cano J et al. Spectrum of zygomycete species

identified in clinically significant specimens in the United States. Journal of

Clinical Microbiology. 2009; 47 (6):1650-1656.

32. Almyroudis N, Sutton D, Fothergill A, Rinaldi M, Kusne S. 2007. In vitro

susceptibilities of 217 clinical isolates of Zygomycetes to conventional and

new antifungal agents. Antimicrob. Agents Chemother. 51: 2587-2590.

33. Schorödl W, Heydel T, Schwartze VU. et al. Direct analysis and

identification of pathogenic Lichtheimia species by Matrix-Assisted laser

desorption ionization- time of flight analyzer-mediated mass spectrometry.

Journal of Clinical Microbiology. 2012; 50 (2): 419-427.

34. O’Donnell K, Kistler HC, Cigelnik E, et al. Multiple evolutionary origins of the

fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from

nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proc Natl Acad Sci USA 1998;

95(5):2044-9.

35. Voigt, K., E. Cigelnik, & K. O’Donnell. Phylogeny and PCR identification of

clinically important zygomycetes based on nuclear ribosomal DNA

sequence data. J. Clin. Microbiol. 1999. 37:395-3964.

36. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference method for broth

dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi- Second Edition.

Approved standard, CLSI document M38-A2. 2008; 28 (16).

37. Ruíz-Cendoya M, Rodriguez MM, Mariné M, et al. In vitro interactions of

itraconazole and micafungin against clinically important filamentous fungi.

International Journal of Antimicrobial Agents. 2008; 32; 418-420,

38. Gómez-López A, Cuenca-Estrella M, Mellado E, et al. In vitro evaluation of

combination of terbinafine with itraconazole or amphotericin B against

Zygomycota. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2003; 45;

199-202.

123

39. Berenbaum M.C., A method for testing for synergy with any number of

agents. The journal of infections diseases. Vol.137, n.2,1978.

40. Guarro J, Llop C, Aguilar C, Pujol I. Comparison of in vitro antifungal

susceptibilities of conidia and hyphae of filamentous fungi. Antimicrob.

Agents Chemoter. 1997;41(12): 2760-2762.

41. Bezjak V. Standardization of a hyphal inoculum of Aspergillus for

amphotericin B susceptibility testing J.Clin.Microbiol 1985; Apr.509-512

42. Matsuoka H, Yoshikazu II, Takekawa Y, Teraoka T. Evaluation of antifungal

volatile compounds on the basis of the elongation rate of a single hyphae.

Applied and envirnomental microbiology 1990; Dec. 3779-3784.

43. Yamada S, Cao J, Sumita A, Kirasawa K, Kurata H., Oh, K., Matsuoka H.

Automatic antifungal activity analyzing system on the basis of dynamic

growth procee of a single hyphae. Mycopathology 1992;118: 65-69.

44. Oh K, Yang HC, Matsuoka A, Kurata H. Combined effect of amphotericin B

and fluocytosine on gromth of Candida albicans estimated at a single hypha

level. J. Med. Vet Mycology 1995; 33(3); 01-04.

45. Taguchi H, Miyaji M, Nishimura K. Studied on the synergistic effect of

amphoterecin B and 5-fluorocytosine on the growth of single hyphae of

aspergillus fumigatus by a biocell-tracer system. Mycoscience 1995; 36:

341-344.

46. Iida Y, Oh K, Saito M, Matsuoka H, Kurata H, Natsume M, Abe H. Detection

of antifungal activity in Aemarrhena asphodeloides by sensitive BCT method

and isolation of its active compound. J.Agric. Food Chem 1999; 47: 584-

587.

47. Ansheng L, Taguchi H, Miyagi M, Nishimura K, Shaoxi W. Study on the

hyphal responses of Aspergillus fumigatus to the antifungal agent by Biocell-

tracer. Mycopathology 1999; 148: 17-23.

48. Moreira LS. Estudo da atividade de drogas antifúngicas através de curvas de

crescimento de Candida albicans utilizando sistema automatizado Biocell-

124

Tracer. Campinas, 2003. (Tese de Mestrado - Faculdade de Ciências Médicas,

Universidade Estadual de Campinas).

49. Teixeira ABA, Moretti ML, Schreiber AZ. Evaluation of F. solani hyphae and

conidia susceptibility to amphotericin B and itraconazole: study of a clinical

case. Mycophatologia. 2005; 116(4):291-296.

50. Teixeira ABA. Avaliação de suscetibilidade a antifúngicos pelo Sistema Biocell-

Tracer® de monitorização de crescimento de hifas de espécies de Aspergillus e

Fusarium, 2006. (Tese de Doutorado - Faculdade de Ciências Médicas,

Universidade Estadual de Campinas).

51. Biancalana FS, Lyra L, Moretti ML, Kamei K, Schreiber AZ. Standardization

of Hyphal Growth Inhibition Rate as a Means of Evaluating Microsporum

spp. in vitro Susceptibility to Terbinafine, Griseofulvin and

Ciclopiroxolamine. Mycophatologia, 2011.172(4):279-85.

52. Biancalana FS. Avaliação da suscetibilidade de hifas e conídios de fungos

demáceos frente aos antifúngicos anfotericina B, itraconazol e voriconazol e

terbinafina, e a última em combinação com os demais antifúngicos, 2011.

(Tese de Doutorado - Faculdade de Ciências Médicas, Universidade

Estadual de Campinas).

53. Biancalana FS, Lyra L, Moretti ML, Schreiber AZ. Susceptibility testing of

terbinafine alone and in combination with amphotericin B, itraconazole, or

voriconazole against conidia and hyphae of dematiaceous molds. Diagn

Microbiol Infect Dis. 2011 Dec; 71(4):378-85.

54. Rodrigues EG, Lirio VS, Lacaz CS. Preservação de fungos e actinomicetos

de interesse médico em água destilada. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo

[online]. 1992; 34(2) p. 159-165.

55. Miura M., Tanigawa C., Fujii Y. Kaneko S. Comparison of six commercially

available DNA polymerases for direct PCR. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo.

[online]. 2013; 55 (6).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21945391



125

56. Lu Q., Hu H., Mo J., Shu L. Enhanced amplification of bacterial and

fungal DNA using a new type of DNA polymerase. Australasian Plant

Pathology.2012; 41(6); p.661-663.

57. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA,

McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD,

Gibson TJ, Higgins DG. (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0.

Bioinformatics, 23: 2947-2948.

58. Eliopoulos GM, Mollering RC Jr. Antimicrobial combinations. In: V.Lorian

(ed.), Antibiotics in laboratory medicine. 3 ed. Baltimore MD: Williams &

Wilkins, p. 432-492.

59. Argenta JS, Santurio JM, Alves SH, et al. In vitro activities of voriconazole,

itraconazole and terbinafine alone or in combination against Pythium

insidiosum isolates from Brazil. Antimicrob. Agents Chemother. 2008; 52:

(2); 767-769,

60. Traconal [Bula de medicamento].Guarulhos. Aché Laboratórios

Farmacêuticos.

61. Lamisil [Bula de medicamento].São Paulo. Novartis.

62. Healy M, Walton D, Reece K, Lising M, Bittner T, Frye S, Kontoyiannis D. P.

Species Identification of Clinical Zygomycetes Isolates by Automated rep-

PCR and DNA Sequencing. Interscience Conference on Antimicrobial

Agents and Chemotherapy 44th General Meeting, Washington DC, USA

October 30 – November 2, 2004

63. Dannaoui E. Molecular tools for identification of Zygomycetes and the

diagnosis of zygomycosis. Clinical Microbiology and Infection.2009;15(5).

64. White T J, Bruns T, Lee S, Taylor JW. Amplification and direct sequencing

of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH,

Sninsky JJ, White TJ, eds. PCR protocols: a guide to methods and

applications. San Diego, CA: Academic Press, 1990:315–22.

65. Chakrabarti A, Ghosh A, Prasad GS.et al. Apophysomyces elegans: an

emerging zygomycete in India. J Clin Microbiol 2003; 41:783-8.

http://link.springer.com/journal/13313

http://link.springer.com/journal/13313

126

66. Kontoyiannis, D. P., M. S. Lionakis, R. E. Lewis, G. Chamilos, M. Healy,

C.Perego, A. Safdar, H. Kantarjian, R. Champlin, T. J. Walsh, and I. I. Raad.

Zygomycosis in a tertiary-care cancer center in the era of Aspergillus active

antifungal therapy: a case control observational study of 27 recent cases.

The Journal of Infectious Diseases. 2005; 191:1350-60.

67. Sawyer PR, Brogden RN, Pinder, R.M. et al. Miconazole: a review of its

antifungal activity and therapeutic efficacy. Drugs, 1975; 9(6); p.406-423.

68. Hell RC. Brogden RN, Speight TM. et al. Econazole: a review of its

antifungal activity and therapeutic efficacy. Drugs, 1978; 16 (3), p.177-201.

69. Richardson MD, Warnock DW. Fungal infection-Diagnosis and

management. London: Blackwell, 1993. Cap.3: Antifungal drugs: 17-43.

70. Hell RC. Brogden RN, Pakes GE, Speight TM, Avery GS. Miconazole: a

preliminar review of its therapeutic efficacy in systemic fungal infections.

Drugs 1980; 19:7-30.

71. Mikamo H, kawazoe K, Sato Y, Ito K, Tamaya T. Pharmacokinetics of

miconazole in sérum and exudate of pelvic retroperitoneal space after

radical hysterectomy and pelvic lymphadenectomy. International Journal of

Antimicrobial Agents 1998; 207-211.

72. Taguchi H, Myahji M, Yoshida T. Evaluation of miconazole activity contained

in human sérum to hypha of Aspergillus fumigatus. Journal of Medical

Mycology. 2000; 41(1):41-4.

73. Ribes JA, Vanover-Sams CL, Baker DJ. Zygomycetes in human disease.

Clin. Microbiol. Rev. 2000; 13:236-301.

74. Johnson EM, Szekely A, Warnock D W. In vitro activity of voriconazole,

itraconazole and amphotericin B against filamentous fungi. Journal of

Antimicrobial Chemotherapy. 1998: 42, 741-745.

75. Goldani LZ, Sugar AM. Treatment of murine pulmonar mucormycosis with

SCH 42427, a broad-spectrum triazole antifungal drug. J.Antimicrob.

Chemother. 1994, 33:369–372.



127

76. Sheehan DJ, Hitchcock CA, Sibley CM. Current and emerging azole

antifungal agents. Clin. Microbiol. Rev. 1999. 12: 40-79.

77. Mosquera J, Warn PA, Rodriguez - Tudela JL, Denning D W. Treatment of

Absidia corymbifera infection in mice with amphotericin B and itraconazole.

J. Antimicrob. Chemother. 2001. 48:583-586.

78. Sugar A M, Liu XP. Combination antifungal therapy in treatment of murine

pulmonary mucormycosis: roles of quinolones and azoles Antimicrob.

Agents Chemother. 2000. 44:2004-2006.

79. Dannaoui E, Meletiadis J, Mouton JW, Meis JFGM, Verweij PE. In vitro

susceptibilities of zygomycetes to conventional and new antifungals. J.

Antimicrob. Chemother. 2003; 51: 45-52.

80. Machouart M, Larche J, Burton K, Collomb J, Maurer P, Cintrat A, Biava

MF, Greciano S, Kuijpers AFA, Contet-Audonneau N, Hoog GS, Gerard A,

Fortier B. Genetic Identification of the Main Opportunistic Mucorales by

PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism. J. Clin. Microbiol. 2006;

44(3); p. 805-810.

81. Brittenham GM. Iron-chelating therapy for transfusional iron overload. N

Engl J Med 2011; 364: 146-56.

82. Ibrahim AS, Gebermariam T, Fu Y. et al. The iron chelator deferasirox

protects mice from mucormycosis through iron starvation. J Clin Invest

2007; 117:2649-57.

83. Kontoyiannis DP, Lewis RE, Lotholary O. et al. Future directions in

Mucormycosis Research. Clinical Infectious Diseases 2012:54(S1):S79-85.

84. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for broth

dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; approved standard, third

edition. CLSI document M27-A3. Wayne, PA, 2008.

85. In vitro susceptibility of filamentous fungi to systemically active antifungal

agents determined by CLSI M38-A2 Broth microdilution methods. Disponível

em:< www.uptodate.com>. Acesso em: 08 maio 2014.

128

86. Teixeira AB, Moretti ML, Trabasso P, Von Nowakonski A, Aoki FH, Vigorito

AC, Miyaji M, Nishimura K, Taguchi H, Schreiber AZ. Evaluation of

Fusarium solani hyphae and conidia susceptibility to amphotericin B and

itraconazole: study of a clinical case. Mycopathologia. 2005 Nov;160(4):291-

6.

87. Oh KB, Shirogane H, Matsuoka H, Niitsu A, Yamada S, Kurata H, Mochizuki

M, Kume H. Evaluation of antifungal activity of an antifungal drug by in vitro

simulation of in vivo pharmacokinetics of the drug against fungal hyphal

growth. Nihon Ishinkin Gakkai Zasshi. 1998; 39 (3):173-8

88. Teixeira AB, Moretti ML, Machado HC, Nishimura K, Taguchi H, Schreiber

AZ. Evaluation of the inhibitory effect of amphotericin B on the apical growth

of F. solani using the BioCell-Tracer system.Mycoses. 2007 May; 50(3):183-

8.

89. Teixeira AB, Moretti ML, Trabasso P, Von Nowakonski A, Aoki FH, Vigorito

AC, Miyaji M, Nishimura K, Taguchi H, Schreiber AZ. Evaluation of

Fusarium solani hyphae and conidia susceptibility to amphotericin B and

itraconazole: study of a clinical case. Mycopathologia. 2005 Nov; 160

(4):291-6.












129

8. ANEXOS

130

ANEXO 1: Eletroferogramas ilustrando sequenciamento das regiões D1/D2 para os isolados de

Mucorales. (A) LIF 299, (B) LIF 300, (C) LIF 301, (D) LIF 1046, (E) LIF 1143, (F) LIF 1237, (G) LIF 1455,

(H) LIF 1832. (I) LIF 1820 e (J) LIF 1834. Imagens obtidas pelo software ATSQ.

132

ANEXO 2: Descrição do caso clínico

OCA, 39 anos, etilista crônico com diagnóstico de diabetes mellitus secundária e

pancreatite, é internado em 01/2011 no Hospital das Clínicas da Universidade

Estadual de Campinas, SP/Brasil com forte dor na movimentação ocular esquerda,

diminuição da visão, aparecimento de lesão pálpebra esquerda e edema. É

realizada enucleação de órbita esquerda e o abscesso orbitário é encaminhado

para pesquisa de fungos, sendo o micro-organismo isolado da cultura identificado

morfologicamente como Rhizomucor sp. (LIF 1832).

Tratamento: 21/01/11 a 16/04/11: AMB convencional e AMB lipossomal (14 dias de AMB

convencional, 7 dias de AMB lipossomal 300mg/dia, 7 dias de AMB convencional

50mg/dia EV dia como dose de manutenção, 14 dias de AMB lipossomal

200mg/dia. Em fevereiro/2011 e março/2011 é realizado os seguintes exames:

ressonância magnética de crânio que mostra crescimento do fungo em órbita

esquerda; enucleação de órbita esquerda, esvaziamento de seio etmoidal,

ressecção de duramáter e pequena porção frontal, sendo o material de tumoração

intra-orbitária encaminhado para o exame anátomo-patológico e para pesquisa de

fungos. O resultado do anátomo patológico demonstra processo inflamatório

crônico granulomatoso fúngico com extensa necrose, compatível com

mucormicose e o resultado de cultura é Rhizomucor sp. 17/04/11: Sem sinais de

reativação da doença; ocorre suspensão de AMB e paciente tem alta com os

antifúngicos: ITC 300mg/dia e TERB 250mg /dia. 27/07/11: paciente em uso de

TERB 12mg/dia e ITC 200mg/dia. 08/2011: paciente sem uso de TERB e em uso

de ITC 200mg/dia. 04/2012: Resultado de exame de ressonância magnética de

crânio sem sinais de reativação fúngica, seio frontal sem sinais de atividade

inflamatória associada e ocorre suspensão do ITC. 04/2013: Realização de

polipectomia e sinusectomia frontal; exérese de mucocele não apresentando

coleção fúngica em exame realizado. 10/2013: Ausência de sinal de reativação de

infecção fúngica. 05/2014: paciente avaliado novamente e sem sinal de reativação

da infecção fúngica.

IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE SUSCETIBILIDADE A ...

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