JESSICA BELTRAMI RIBEIRO

IMPORTÂNCIA DAS ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS DE LEITE E DE CARNE BOVINA “IN

NATURA” NA SAÚDE PÚBLICA

Trabalho de Conclusão de Curso de Graduação apresentado para a obtenção do título de Bacharel

em Medicina Veterinária, junto ao curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal de

Goiás, Campus Jataí.

Orientadora:

Profa. Dra. Cleusely Matias de Souza

Supervisor:

Professor Dr. Germano Francisco Biondi

JATAÍ

2010

2

JESSICA BELTRAMI RIBEIRO

Trabalho de conclusão de Curso de Graduação defendido e aprovado em 29/11/2010 pela Banca Examinadora constituída pelos professores:

Profa. Dra. Cleusely Matias de Souza

(Presidente da Banca)

Prof. Dr. Ariel Eurides Stella (Membro da Banca)

Prof. Msc. Francys Pimenta da Faria (Membro da Banca)

3

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

BSCAJ/BC/UFG

R482i

Ribeiro, Jessica Beltrami

Importância das análises físico-químicas e microbiológicas de leite e de carne bovina “ in natura” na saúde pública / Jessica Beltrami Ribeiro. - 2010.

57 f. : il., figs., tabs.

Orientadora: Profª.Drª. Cleusely Matias de Souza.

Monografia (Graduação) – Universidade Federal de Goiás, Campus Jataí, 2010.

Bibliografia.

Inclui lista de tabelas e figuras.

1. Análises Físico-Químicas. 2. Análise microbiológica-Carne Bovina. 3. Leite. Saúde Pública .I. Título.

CDU: 619:614.23

4

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar e acima de tudo, agradeço a Deus pela minha vida e

pela minha família, e, ao meu Anjo da Guarda pela companhia e proteção.

Aos meus pais, Dagmar e Fernando, que me dedicaram sua vida e seu

amor, todo meu respeito, amor e gratidão, para sempre. Cada gota de suor e cada

lágrima derramada, cada sorriso, cada vitória, dedico a vocês.

À minha eterna irmãzinha, Rebeca, pelo amor e apoio irrestritos.

Ao meu amor, Fábio Henrique, agradeço de todo o coração pelo apoio,

coragem e amor a mim dedicados.

À toda minha família, materna e paterna, pelo apoio e carinho. E à minha

vovó Marly, agradeço pelo exemplo de fé e força.

À minha casa, Universidade Federal de Goiás – Campus Jataí, onde

aprendi a grandiosidade e a honra da profissão, meus sinceros agradecimentos.

Aos meus professores, minha sincera gratidão pelos conhecimentos

passados e dedicação com que exercem o dom de ensinar. Em especial, à Professora

Doutora Vera Lúcia da Silva Dias Fontana e à professora Doutora Cleusely Matias de

Sousa, pelo excepcional apoio, compreensão e por acreditarem no meu potencial.

Aos meus amigos, a quem sempre dedicarei amizade e carinho, e o meu

desejo de que o sucesso permeie suas vidas e ilumine seus caminhos. Aos meus

queridos amigos Verônica, Rômulo, Miguel, Ísis, Willian Martins e todos que

compartilharam esses cinco anos ao meu lado, que nossa amizade resista e se

fortaleça com o tempo. À Juliane de Campos Inácio, minha amiga de infância, que me

acolheu, mesmo depois de tantos anos, meus sentimentos sinceros de carinho e

gratidão.

Muito obrigada à UNESP – Campus Botucatu, Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia e ao Departamento de Higiene e Saúde Pública Veterinária,

pela oportunidade do estágio.

Aos funcionários do SOAP, UNESP-Botucatu, agradeço imensamente pela

paciência e atenção com que me trataram e por todo o conhecimento que adquiri lá.

Em especial, ao Prof Doutor Germano Biondi, aos futuros Doutores e aos queridos

5

residentes do Laboratório Cibeli Viana, Daniel Cazaes, Juliano Pereira e Mateus Mioni,

o meu desejo de sucesso e felicidade a todos.

A todos aqueles a quem conheci por onde passei, a todos aqueles a quem

amei e que me amaram, muito obrigada pela participação na construção da minha

história.

6

“Pouco conhecimento faz com que

as pessoas se sintam orgulhosas. Muito

conhecimento, que se sintam humildes.”

(Leonardo da Vinci)

7

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 1

2 O LOCAL DO ESTÁGIO.................................................................................... 3

3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O ESTÁGIO............................... 5

3.1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS..................................................................... 5

3.1.1. Análises da Carne Bovina.......................................................................... 5

3.1.2. Análises de Leite........................................................................................ 11

3.2. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS.................................................................. 24

3.2.1. Metodologia................................................................................................ 25

3.2.2. Microrganismos Pesquisados..................................................................... 29

4. QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DOS ALIMENTOS E A SAÚDE

PÚBLICA...............................................................................................................

40

4.1. Toxi-infecções causadas por alimentos cárneos e lácteos........................... 41

4.1.1. Principais doenças causadas por ingestão de carne e leite....................... 43

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................. 47

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 48

ANEXOS............................................................................................................... 57

8

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Laboratório de Análises Físico-Químicas do SOAP, Botucatu,

2010.............................................................................................

3

FIGURA 2 Laboratório de Análises Microbiológicas voltado à extensão do

SOAP, Botucatu, 2010................................................................

4

FIGURA 3 Efeito do pH na coloração da carne............................................ 7

FIGURA 4 Mensuração de pH com aparelho pHmêtro................................ 9

FIGURA 5 Realização da Prova de H2S em carne de aves, SOAP, 2010... 10

FIGURA 6 Resultado Positivo da Prova de H2S em carne bovina “in natura”,

SOAP, 2010...................................................................

11

FIGURA 7 Mensuração da Densidade do Leite a 15º C, com lactodensímetro de

Quevene......................................................

13

FIGURA 8 Mensuração da Acidez do Leite em Graus Dornic...................... 14

FIGURA 9 Resultados da Prova de Alizarol em leite pasteurizado, SOAP,

2010.............................................................................................

15

FIGURA10 Leitura do Teor de Gordura em Butirômetro de Gerber.............. 17

FIGURA11 Resultado Positivo do Teste de Fosfatase Alcalina em leite

pasteurizado, SOAP, 2010..........................................................

19

FIGURA 12 Resultado Positivo da Prova de Peroxidase em leite

pasteurizado................................................................................

20

FIGURA 13 Série de Tubos para a técnica de NMP, com Caldo Lauril Sulfato

Triptose...........................................................................

9

27

FIGURA 14 Petrifilme para Contagem de Microrganismos Aeróbios Mesófilos (A)

e de Bolores e Leveduras (B)................................

29

FIGURA 15 Resultados Positivos para a Presença de Coliformes Totais em

Caldo Lauril Sulfato Triptose.......................................................

31

FIGURA 16 Produção de Gás por Coliformes Termo-tolerantes em Caldo

Escherichia coli............................................................................

32

FIGURA 17 Cultura de Salmonella sp em Agar Xilose-Lisina Dexocolato

(XLD)...........................................................................................

34

FIGURA 18 Câmara de Anaerobiose para Cultivo de Clostrídios Sulfito-

redutores.....................................................................................

35

FIGURA 19 Resultado Positivo para Presença de Listeria sp em Caldo

Fraser..........................................................................................

37

10

1. INTRODUÇÃO

Como expresso na Declaração Universal dos Direitos Humanos,

todo homem tem o direito à saúde (ONU, 1948) e ela está diretamente ligada

aos alimentos. GERMANO & GERMANO (2008) afirmam que é imprescindível,

portanto, que eles sejam produzidos em quantidade e com qualidade

suficientes para manter o equilíbrio orgânico, ou seja, a saúde dos seres

humanos.

Um alimento para ser considerado de qualidade deve possuir

características sensoriais, nutricionais, sanitárias e de mercado, que façam

dele um produto consumido e apreciado pelo consumidor, que contribua para

sua boa saúde e que não lhe cause doenças (RODRIGUES & SANTOS, 2010).

No entanto, por conta das características físicas e químicas dos

alimentos, eles podem se tornar perigosos ao homem servindo como veículos

de transmissão e/ou como nutrientes para a multiplicação de diversos

microrganismos, muitas vezes patogênicos e capazes de produzir toxinas

causadoras de doenças (GONÇALVES, 1998).

Portanto, o controle higiênico-sanitário dos alimentos é fundamental,

tendo em vista que tem por objetivo prevenir os danos à saúde do homem

advindos do seu consumo; assegurando sua qualidade e a redução de seu

desperdício (GERMANO & GERMANO, 2008).

Qualquer doença causada por ingestão de alimentos é considerada

um problema de saúde pública. A Inspeção de Produtos de Origem Animal

(IPOA) e a Vigilância Sanitária são instrumentos de garantia da saúde pública,

uma vez que visam, em termos gerais, garantir a qualidade e a inocuidade dos

alimentos produzidos dentro do país. Sua atuação abrange todas as etapas de

produção, armazenamento, embalagem, transporte e comercialização, a fim de

monitorar toda a cadeia produtiva. A função do laboratório de análises de

alimentos é, portanto, de dar suporte à IPOA e a Vigilância Sanitária,

analisando as características inerentes ao alimento pesquisado e comprovando

ou não, os benefícios e a segurança que ele trará ao consumidor.

Entre os alimentos de maior importância no estudo das doenças

transmitidas por alimentos estão o leite e a carne bovina “in natura”, pois são

alimentos largamente utilizados na alimentação humana e, cujo, consumo é

11

alto em relação a outros alimentos de origem animal e que figuram como fontes

importantes de surtos de doenças causadas por alimentos.

O leite é um alimento essencial ao ser humano, pois atua como fonte

importante de proteína, gordura, energia e outras substâncias fundamentais ao

seu desenvolvimento (TRONCO, 2008). Entretanto, sabe-se que na cadeia

produtiva do leite existem várias fontes de contaminação deste alimento, dentre

elas, o próprio animal, os equipamentos, o ambiente e as pessoas envolvidas

no seu processamento (ROBERTS et al., 1995).

Assim como o leite, a carne bovina também é um alimento de

excelente qualidade nutricional, pois na sua composição estão presentes

proteínas de ótimo valor biológico formadas por todos os aminoácidos

essenciais, além de vitaminas e minerais. Em contrapartida, devido à sua

composição rica e sua elevada atividade de água, a carne se torna um

excelente meio de cultura para microrganismos estando freqüentemente

envolvida na disseminação de patógenos causadores de enfermidades ao

homem e a outros animais (PENSEL, 1998; SAUCIER, 1999).

Em vista disso, este trabalho tem como objetivo ressaltar a

importância das Análises Laboratoriais de Alimentos, sendo elas, Físico-

Químicas e Microbiológicas, na Saúde Pública, fundamentais na prevenção de

doenças de origem alimentar potencialmente transmissíveis pelo consumo de

carne bovina e leite.

12

2. O LOCAL DO ESTÁGIO

O presente estágio foi realizado nos laboratórios do Serviço de

Orientação à Alimentação Pública (SOAP), sob a supervisão do Professor

Doutor Germano Francisco Biondi, no período de 02 de agosto a 09 de

novembro de 2010. O SOAP pertence ao Departamento de Higiene Veterinária

e Saúde Pública da Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP,

na cidade de Botucatu, Estado de São Paulo.

O SOAP conta com um laboratório para Análises Físico-Químicas e

dois para Microbiológicas, sendo um voltado para extensão e outro para

pesquisa, onde são realizadas análises em alimentos de acordo com as

exigências da Legislação vigente. Os serviços de extensão do SOAP atendem

atualmente indústrias, cozinhas hospitalares, lanchonetes e hipermercados.

Nas Figuras 1 e 2 observam-se imagens das dependências do

SOAP.

FIGURA 1 - Laboratório de Análises Físico-Químicas do

SOAP, Botucatu, 2010.

13

FIGURA 2 - Laboratório de Microbiologia, voltado à extensão,

SOAP, Botucatu, 2010.

14

3. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O ESTÁGIO

3.1. ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS

A legislação que disciplina e padroniza as características físico-

químicas do leite e da carne bovina é composta pela Instrução Normativa (IN)

Nº 20, de 21 de julho de 1999 do Ministério da Agricultura, Pecuária e

Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 1999) e pela IN SDA Nº 68, de 12 de

dezembro de 2006 do MAPA (BRASIL, 2006), estas, oficializam os Métodos

Analíticos Oficiais Físico-Químicos para o controle de Produtos Cárneos e seus

ingredientes- sal e salmoura e de Leite e Produtos Lácteos, respectivamente.

Além destas, a Portaria Nº 01, de 13 de outubro de 1981, do

Laboratório Nacional de Referência Animal, aprova e oficializa Métodos

Analíticos para Controle de Produtos de Origem Animal e seus Ingredientes,

constituindo-se em Métodos Microbiológicos e Métodos Físicos e Químicos e

os padrões aceitáveis para os alimentos (BRASIL, 1981).

3.1.1. Análises da carne bovina

As carnes e seus derivados estão sujeitos a alterações por reações

químicas, físicas e microbiológicas. As alterações físicas e químicas decorrem

principalmente da modificação e/ou degradação de proteínas e lipídios, que é

provocada tanto pela ação de agentes naturais, como por exemplo, o oxigênio,

quanto por enzimas hidrolíticas endógenas naturalmente presentes na carne e,

ainda por outras substâncias como enzimas, peptídios, aminas, entre outras

produzidas por microrganismos (IAL, 2008).

Avaliação Sensorial:

A avaliação sensorial da carne bovina foi padronizada pela IN N20

de 1999, do MAPA (BRASIL, 1999) e corresponde à verificação da coloração,

15

do odor, do aspecto e da consistência da carne “in natura”. Os resultados

obtidos eram registrados em livro específico para esse fim.

a) Coloração

De acordo com BRASIL (1999), a coloração da carne deve ser

uniforme, sem manchas claras ou escuras, variando do vermelho rosado ao

vermelho pardo.

A cor normal da carne é conferida, sobretudo, pela mioglobina e em

menor grau, pela hemoglobina. Em um tecido muscular bem sangrado, a

mioglobina contribui com 80 a 90% do pigmento total (PARDI et al., 2006).

Quando a carne fica em contato com o ar, os pigmentos reagem

com o oxigênio molecular e formam um pigmento relativamente estável

denominado oximioglobina. Este pigmento é responsável pela cor vermelha

brilhante, que proporciona um aspecto atraente para o consumidor (ROÇA,

2000).

Vários fatores podem interferir na cor normal da carne fresca, como

a idade,o sexo e espécie animal, o corte de carne, a capacidade de retenção

de água, a desnaturação da mioglobina pelo calor,o ressecamento e o grau de

deterioração da superfície da carne, além do comprimento de onda da luz que

atinge sua superfície (CAMPOS & FONSECA, 2003).

Dentre as alterações na coloração da carne pode-se citar a

coloração pálida apresentada pelas carnes PSE (sigla inglesa de Pale, Soft,

Exsudative) e a coloração escura apresentada pelas carnes DFD (sigla inglesa

de Dark, Firm, Dry). A palidez da carne PSE advém da queda brusca do pH,

condicionada pela glicólise rápida, quando o músculo ainda apresenta

temperatura perto da fisiológica, o que leva à desnaturação das proteínas

(WOELFEL et al., 2002). No caso das carnes escuras, a alteração na cor se

inicia quando o pH excede 5,7, o que ocorre devido a quantidade insuficiente

do glicogênio que será quebrado em ácido lático após a morte de animal

(BOLES & PEGG, 2005, LENGERKEN et al., 2002).

Além das alterações descritas podemos mencionar ainda, a

alteração da cor por conseqüência do desenvolvimento microbiano. Essa

16

alteração é decorrente da utilização da mioglobina pelos microrganismos,

fazendo com que o grupo heme se separe da proteína, desenvolvendo uma

coloração esverdeada (GUILHERME et al., 2008).

A exposição da carne ao ar frio por muito tempo causa dessecação

da superfície, levando ao escurecimento denominado de “queimadura pelo frio”

(PARDI et al., 2006).

FIGURA 3 - Efeito do pH na coloração da carne

Fonte: BOLES e PEGG (2005)

Para a realização desta análise, eram efetuadas avaliações visuais

das peças, a fim de averiguar a coloração da peça como um todo.

b) Odor

De acordo com BRASIL (1999), o odor da carne deve ser suave,

agradável e característico de carnes sãs, podendo tornar-se amoniacal e fétido

quando da ação dos microrganismos e da putrefação, respectivamente.

Já PARDI et al (2006), definiram que o odor da carne fresca lembra

um ligeiro odor ácido lático comercial e que a carne de animais idosos possui

um odor mais intenso que a dos jovens da mesma espécie.

Nesta análise, utilizou-se olfação como instrumento de avaliação.

c) Aspecto

17

Quanto ao aspecto, a IN 20/1999 (BRASIL, 1999), prevê que a carne

seja uniforme, sem acúmulo sanguíneo ou corpos estranhos.

No momento da realização dessa análise foi verificado visualmente o

aspecto geral da peça, quanto à presença de estruturas ou características

atípicas à carne bovina.

d) Consistência

A carne “in natura” deve apresentar consistência firme, compacta e

elástica. Quando se inicia a putrefação, a superfície torna-se viscosa e friável

(BRASIL, 1999).

O método utilizado para a avaliação da consistência das amostras

de carne bovina foi a palpação.

Determinação do pH

O pH tem por finalidade determinar se uma substância é ácida,

neutra ou básica (ZIMERMAN, 2010). Faz-se o cálculo do pH a partir da

concentração hidrogeniônica (H+) ou hidroxiliônica (OH-) presentes na solução.

Fisiologicamente, o trifosfato de adenosina (ATP) tem como função

a manutenção das atividades de contração e relaxamento musculares. No

entanto, por conta da morte do animal, o aporte sanguíneo de oxigênio e de

nutrientes cessa, de forma que os músculos são obrigados a empregar o

metabolismo anaeróbico na tentativa de manter a temperatura e a integridade

celular, utilizando suas reservas de glicogênio como fonte de ATP. Para sua

formação, o glicogênio é degradado em ácido lático, que fica acumulado no

tecido e é o responsável pela queda do pH muscular que ocorre no período

post mortem do animal (WARRIS, 2003).

A carne dos animais recentemente abatidos, de acordo com

THORNTON (1969), pode apresentar uma variação do pH de 6,5 a 7,2, caindo

posteriormente até alcançar uma valor final de 5,6 a 5,8 após 24 horas do

18

abate, elevando-se depois lentamente devido à autólise e ao desenvolvimento

bacteriano.

A metodologia utilizada para verificar o pH em carnes bovinas “in

natura” está de acordo com o preconizado por BRASIL (1999). A Figura 4

representa a realização do teste.

FIGURA 4 - Mensuração de pH com aparelho pHmêtro, Botucatu, 2010.

O padrão de pH aceito pela Legislação Brasileira para as carnes

bovinas “in natura” varia de 5.8 a 6.2, consideradas carnes boas para consumo;

de 6.2 a 6.4 carnes indicadas ao consumo imediato e, acima de 6.4, carnes

impróprias para consumo, em início de putrefação (BRASIL, 1999).

No Laboratório do SOAP, adotou-se a prova de determinação do pH

como controle. Nos casos em que a amostra era reprovada nesta análise,

realizavam-se as Provas de Éber e de H2S.

Prova de Éber

O método utilizado estava de acordo com TERRA & BRUM (1988)

(Anexo 1).

Este método baseia-se no fato de que em todo alimento protéico

ocorre liberação de amônia quando da sua degradação. A amônia liberada

19

reage com o ácido clorídrico, formando Cloreto de amônio (NH4Cl), sob a forma

de vapores brancos (IAL, 2008).

Prova de H2S

Esta prova foi realizada de acordo com IAL (2008) (Anexo 2).

A metodologia consiste na constatação da presença do gás

sulfídrico, proveniente da decomposição de aminoácidos sulfurados,

normalmente liberados nos estágios de decomposição da proteína animal. O

H2S se combina com o acetado de chumbo, produzindo sulfeto de chumbo

(PbS), que confere ao papel a mancha preta espelhada característica do

resultado positivo (IAL, 2008).

As Figuras 5 e 6 mostram a realização da Análise e o resultado

positivo, respectivamente.

FIGURA 5 - Realização da Prova de H2S em carne de aves,

SOAP, 2010.

20

FIGURA 6 - Resultado Positivo da Prova de H2S em carne

bovina “in natura”, SOAP,2010.

3.1.2. Análises de Leite

Para comprovar a qualidade do leite pode-se lançar mão de várias

análises físico-químicas, de provas de higiene, reações colorimétricas e provas

sensoriais. Além destas, há ainda o exame qualitativo, por meio do qual é

possível identificar a presença de substâncias adulterantes e/ou conservantes

ou mesmo calcular o rendimento industrial do produto (TRONCO, 2008).

As características do leite normal, de acordo com o Regulamento de

Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal (RIISPOA)

(BRASIL, 1952), no seu artigo n 289, estão dispostas no Quadro 1.

21

CARACTERÍSTICAS PADRÃO ACEITÁVEL

Teor de Gordura Mín 3%

Acidez 15 e 20º D

Densidade a 15º C 1028 a 1033

Lactose Mín 4,7%

Extrato Seco Total (EST) Mín 11,5%

Extrato Seco Desengordurado

(ESD) Mín 8,5%

Índice Crioscópico (IC) - 0,540º H

Índice de Refração (IR) >37º Zeiss QUADRO 1 – Características Físico-Químicas do leite normal e seus

respectivos padrões. Fonte: BRASIL, 1952.

Diante disso, as provas físico-químicas de rotina para análise de

leite pasteurizado e UHT (Ultra High Temperature) executadas no laboratório

de Análises Físico - Químicas em Alimentos do SOAP foram: Densidade

relativa a 15C, Acidez em Graus Dornic, Determinação do Teor de Gordura –

Método de Ackerman, Determinação de Sólidos Totais e de Sólidos não-

gordurosos, Pesquisa de Fosfatase Alcalina, de H2O2, de Cloro, de Formol, de

Peroxidase e Índice Crioscópico. Todas as análises seguiram metodologia

preconizada em BRASIL (2006) e IAL (2008).

Densidade Relativa a 15C

A densidade, ou massa específica, de uma substância é

determinada por pesagem e pode ser definida como a massa de sua unidade

de volume (g/ml), sendo que depende da temperatura e da pressão a que a

substância está submetida (MATISSEK et al., 1998).

A mensuração da densidade do leite, por ser uma emulsão de

gordura em água, oferece informações sobre a quantidade de gordura nele

contida, e, de maneira geral, um acréscimo de gordura provoca um decréscimo

da densidade (IAL, 2008).

22

Segundo TRONCO (2008), a densidade relativa a 15C pode ser

aferida utilizando-se o termolactodensímetro de Quevene (Figura 7), que

apresenta graduações de 15 a 45C e densidade de 1.015 a 1.045 (g/cm3). A

temperatura da amostra deve estar preferencialmente, entre 10 e 20C.

A metodologia utilizada para a realização da mensuração de

densidade a 15º C é preconizada por IAL (2008) (Anexo 3).

Devido à calibração do termolactodensímetro em 15C, quando a

amostra estiver em temperatura diferente desta, deve-se fazer a correção

acrescentando-se à densidade obtida o valor de 0,0002 para cada grau acima

dos 15C preconizados ou, quando a temperatura estiver abaixo dos 15ºC,

deve-se subtrair 0,0002 da densidade obtida, para cada grau abaixo dos 15C

(BRASIL, 2006).

De acordo com TRONCO (2008) e IAL (2008), pode-se também

fazer a correção da densidade em função da temperatura através de tabelas

que correlacionam os graus lactodensimétricos com a temperatura da amostra

(Anexo 4).

FIGURA 7 - Mensuração da densidade do Leite a 15°C, com termolactodensímetro de Quevene, Botucatu, 2010.

23

Acidez em Graus Dornic

Resumidamente, a titulação ácida é a medida da capacidade

tamponante do leite entre o pH da amostra e o ponto de viragem da

fenolftaleína, que varia de 8,3 a 8,6 (TRONCO, 2008).

Para mensuração do pH do leite, utiliza a Solução de Dornic para

titulá-lo, sendo que cada 0,1 mL de solução utilizada corresponde a 1D ou 0,1

g de ácido lático/litro de leite (TRONCO, 2008) (Anexo 5).

Segundo o RIISPOA (BRASIL, 1952), no seu artigo n 293, o leite

normal deve apresentar, dentre outras características, acidez titulável entre

15D e 20D.

Segundo IAL, (2008) a acidez indica o estado de conservação do

leite. Logo, uma acidez alta é o resultado da acidificação da lactose, provocada

por microrganismos em multiplicação no leite.

A Figura 8 ilustra a realização da titulação na Mensuração da Acidez

em Graus Dornic.

FIGURA 8 - Mensuração de Acidez do leite em Graus Dornic, Botucatu, 2010

24

Prova do Alizarol

A prova do alizarol é um método colorimétrico para a mensuração do

pH do leite, utilizando-se a base da prova do álcool com a adição do indicador

alizarina (dioxiantraquinona). O indicador atua fazendo com que a observação

da floculação e a mudança de cor sejam simultâneas à variação de pH do leite

(TRONCO, 2008). A metodologia adotada está de acordo com IAL (2008)

(Anexo 6).

Os resultados obtidos podem variar entre as colorações vermelho

tijolo, marrom e violeta. Quando o leite está com acidez normal, entre 14 e

18D, a amostra apresenta coloração vermelho tijolo e as paredes do tubo não

contem grumos, apenas ligeira precipitação. Entretanto, se a amostra

apresentar coloração variando entre marrom e amarelo, significa que o leite se

encontra ácido, com acidez acima de 21D, sendo que, o aparecimento de

coloração amarela intensa indica acidez elevada ou leite colostral. E se, após a

agitação, a reação apresentar coloração lilás ou violeta, indica que o leite

amostrado se apresenta alcalino, o que condiz com casos de mamites ou

adição de neutralizantes (BRASIL, 2006; TRONCO, 2008). As colorações

resultantes da Prova do Alizarol podem ser observadas na Figura 9.

FIGURA 9 - Resultados da Prova de Alizarol em leite

pasteurizado, SOAP,2010.

25

Determinação do Teor de gordura – Método de Gerber

A gordura do leite varia entre espécies, raças, quantidade e duração

das ordenhas, estágios da lactação e da dieta fornecida aos animais.

Segundo GONZÁLEZ (2001), as variações no teor de gordura do

leite podem ser observadas, por exemplo, entre as raças Jersey e Guernsey,

que apresentam maior teor de gordura do que as vacas da raça Holandesa.

Ainda de acordo com ele, o teor de gordura é menor no leite retirado no início

da ordenha e que aumenta gradualmente em porcentagem com o decorrer da

ordenha, ou seja, o último leite da glândula é o mais alto em conteúdo de

gordura.

A ampla variação apresentada pelo teor de gordura no leite pode ser

explicada pelo fato de que aproximadamente 25% dos ácidos graxos do leite

são derivados da dieta, 50% derivam do plasma sanguíneo e o restante é

elaborado pela glândula mamária a partir de precursores, principalmente o

acetato (GONZÁLEZ, 2001).

Com base na IN N 68 do MAPA (BRASIL, 2006), o método mais

utilizado para a determinação do teor de gordura de amostras de leite é o

método de Gerber, porquanto foi o método utilizado no laboratório de Físico-

Química do SOAP (Anexo 7).

O método de Gerber para determinação do teor de gordura no leite

utiliza-se do princípio da destruição dos glóbulos de gordura e da dissolução da

caseína contida na amostra, acarretando a precipitação da gordura a ponto de

ser mensurada. Para aumentar a eficácia do teste, utiliza-se o álcool isoamílico,

cuja função é diminuir a tensão superficial na interfase entre a gordura e a

mistura ácida do leite, facilitando a sua separação e contribuindo para a

ascensão dos glóbulos menores durante a centrifugação (PEARSON, 1998).

A Figura 10 mostra a coluna de gordura formada no butirômetro de

Gerber.

26

FIGURA 10 - Leitura do Teor de Gordura em Butirômetro de Gerber, Botucatu, 2010.

Determinação do Extrato Seco Total – Método de Ackermann

O Extrato Seco Total (EST) é constituído pela gordura, pelos

carboidratos, pelas proteínas e sais minerais contidos no leite (VIEIRA et al.,

2005).

Para o cálculo indireto do EST do leite, foi utilizado um instrumento

chamado Disco de Ackermann, que relaciona o teor de gordura e a densidade

da amostra e, a partir destes dados, indica o teor de sólidos totais presentes na

amostra.

Este disco é constituído de dois círculos concêntricos graduados,

sendo o círculo interno representativo da densidade e o círculo médio, do teor

de gordura, cujas mensurações já foram previamente determinadas. O teor de

sólidos totais está representado na graduação externa à do teor de gordura

(TRONCO, 2008).

O método consiste em ajustar os discos para que os dados de

densidade e teor de gordura coincidam e a marcação indique, na graduação

externa, a porcentagem (m/v) dos sólidos totais presentes na amostra

(BRASIL, 2006; IAL, 2008; TRONCO, 2008).

27

Além deste método, a Instrução Normativa n68 do MAPA (BRASIL,

2006), autoriza o uso de outras fórmulas para a determinação do EST, partindo

do mesmo princípio do método de Ackermann, como a Equação de Fleishmann

e uma Fórmula Prática para o cálculo do EST (ANEXO 8).

Determinação de Extrato Seco Desengordurado

O Extrato Seco Desengordurado corresponde a todos os

componentes do leite, excetuando-se a gordura e a água. Seu cálculo é feito a

partir da subtração do teor de gordura do valor obtido na prova de mensuração

do EST ( TRONCO, 2008; PEARSON, 1998; IAL, 2008).

Pesquisa de Fosfatase Alcalina

A fosfatase alcalina é uma enzima hidrolítica naturalmente presente

no leite cru, sensível à temperatura de pasteurização (IAL, 2008).

A presença desta enzima fornece, portanto, indicativo de que o leite

não sofreu o tratamento térmico adequado, podendo ter ocorrido mistura ou

recontaminação com leite cru (TRONCO, 2008).

De acordo com a IN 68/2006 (BRASIL, 2006), a retirada de alíquota

superior da amostra para a realização do teste pode levar a falsos positivos, já

que a fosfatase alcalina encontra-se adsorvida nos glóbulos de gordura em

suspensão. Além disso, prevê que, apesar de pouco comum, a fosfatase pode

sofrer reativação após algum tempo após a pasteurização, sendo importante

então, a observação pelo analista do tempo de prateleira do produto.

Existem no mercado vários kits utilizados para a prova de fosfatase

alcalina. O utilizado no laboratório do SOAP era da marca Labtest. Este kit

utiliza-se do princípio de que a fosfatase alcalina tem capacidade de hidrolisar

a timolftaleína monofosfato liberando timolftaleína, que tem coloração azul em

meio alcalino. O aparecimento da cor indica a positividade do teste (LABTEST,

2009).

28

A Figura 11 mostra resultado positivo da Prova de Pesquisa de

Fosfatase Alcalina em leite pasteurizado.

FIGURA 11 - Resultado Positivo do Teste de Fosfatase Alcalina em leite pasteurizado, SOAP, 2010.

Segundo BRASIL (2002), o padrão esperado para essa análise é o

resultado negativo, indicando que o processo térmico a que o produto foi

submetido foi eficaz.

Pesquisa de Peroxidase

A peroxidase é, assim como a fosfatase alcalina, uma enzima

presente no leite cru, no entanto, ela é destruída quando submetida a

temperaturas maiores do que a de pasteurização rápida, que é feita a 75C, por

20 segundos (IAL, 2008).

Portanto, a presença da peroxidase indica tratamento térmico

excessivo da amostra.

A pesquisa desta enzima se baseia na sua habilidade de desdobrar

a água oxigenada e liberar oxigênio ativo, o qual pode fixar-se em uma

substância oxidável, produzindo oxidação e a mudança de cor da solução

(TRONCO, 2008).

O método utilizado para a pesquisa desta enzima foi a Prova

qualitativa de H2O2 e guaiacol, segundo BRASIL (2006) (Anexo 9).

29

O oxigênio resultante do desdobramento da água oxigenada pela

peroxidase é transferido para a molécula de guaiacol e é oxidado,

transformando sua leucobase em uma forma corada (TRONCO, 2008; BRASIL,

2006).

O resultado padrão esperado é o positivo (BRASIL, 2002), que é

evidenciado quando do aparecimento de um halo de coloração salmão cinco

minutos após o preparo da solução (BRASIL, 2006) (Figura 12).

FIGURA 12 - Resultado Positivo da Prova de Peroxidase no Leite pasteurizado.

Pesquisa de H2O2

De acordo com o RIISPOA (BRASIL,1952), não é permitido o uso de

nenhuma substância conservadora no leite.

A Portaria 005/83 (BRASIL, 1983), do MAPA, que regulamenta os

critérios de inspeção do leite e produtos lácteos, prevê que o leite em que

forem encontradas substâncias conservadoras, inibidoras, neutralizantes ou

reconstituintes da densidade deve ser condenado ao consumo humano,

podendo ser empregado apenas para fabricação de sabão e caseína industrial.

O peróxido de hidrogênio, bem como o cloro e o formol, são

substâncias empregadas ilicitamente para a conservação do leite, tendo em

30

vista suas propriedades de controle dos microrganismos, seu desenvolvimento

e/ou sua multiplicação (TRONCO, 2008), haja visto que sua ingestão causa

irritação gastrintestinal, cuja severidade depende da concentração da solução

ingerida (BRASIL, 2007).

A execução da técnica da pesquisa de peróxido de hidrogênio está

largamente delineada no Anexo 10.

Pesquisa de cloro e formol

MARTINS & MARTINS (1985) consideram que, ainda que os

resíduos de cloro e formol possam ser contaminantes incidentais, estas

substâncias são sensibilizantes ou tóxicas para o consumidor e capazes de

alterar o produto do pronto de vista nutricional e sensorial, prejudicando

inclusive seu aproveitamento industrial.

A pesquisa de cloro é fundamentada na liberação de iodo que ocorre

a partir do iodeto de potássio, quando há presença de cloro ou hipocloritos. Os

hipocloritos formam cloreto de potássio e liberam iodo, que vai imprimir ao

líquido uma coloração amarelada (TRONCO, 2008).

A pesquisa de cloro e a pesquisa de formol foram efetuadas de

acordo com IAL (2008) e estão descritas nos Anexos 11 e 12, respectivamente.

A presença de cloro é confirmada se a amostra apresentar coloração

amarelada após a agitação. Para confirmação, deve-se adicionar 1 mL de

solução de amido a 1% e verificar a coloração azul-violeta em caso de

presença de cloro livre (BRASIL, 2006).

No caso da pesquisa de formol, a positividade é comprovada quando

do aparecimento de coloração salmão na amostra (BRASIL, 1981; TRONCO,

2008; IAL, 2008).

Índice Crioscópico

O índice Crioscópico (IC) ou Ponto de Congelamento (PC) do leite é

medido considerando a temperatura em que o leite passa do estado líquido

31

para o estado sólido. Internacionalmente, esta medida é dada em graus Hortvet

(H). Sendo que 1º C é igual a 0,9656 º H (TRONCO, 2008).

As equações abaixo relacionam numericamente as unidades Graus

Hortvet (H) e Graus Celsius (C)

H= 1,03562 x C ou C= 0,9656 x H (TRONCO, 2008).

A prova de determinação do IC é considerada de precisão, tendo em

vista que a temperatura de congelamento do leite é uma de suas

características mais constantes (TRONCO, 2008) e está intimamente ligada ao

teor de lactose presente em sua constituição. Segundo WENDORFF et al

(1993), a lactose sozinha é responsável por 50% da variação do Índice

Crioscópico do leite. De acordo com pesquisas, foram encontrados IC’s de -

0,537º C em amostras de leite com 4,7% de lactose e, de -0,544ºC em

amostras com 4,8% deste carboidrato, que demonstram a importância deste

constituinte na variação do IC.

Tal influência da lactose no IC ocorre, pois ela é o principal fator

regulador do equilíbrio osmótico de leite, cuja função é atrair moléculas de

água para as células epiteliais da glândula mamária. Portanto, em função

dessa estreita relação, o teor de lactose é o que menos sofre variação e a

quantidade de água presente no leite depende diretamente do teor de lactose

presente em sua constituição (GONZÁLEZ et al 2001), e ao se adicionar água

no leite, o PC se aproxima de zero (PEARSON, 1998).

O Índice Crioscópico do leite é, então, uma análise qualitativa, que

visa à detecção de fraudes por adição de água no leite. Entretanto, TRONCO

(2008), cita que o IC pode sofrer pequenas variações de acordo com o período

de lactação, estação do ano, clima, latitude, alimentação, raças, doenças dos

animais e processos de pasteurização, seja lenta ou rápida, e/ou esterilização

– UHT, além do estado de conservação da matéria-prima, entre outros.

Adicionalmente, SANTOS (2008) explica que maiores IC’s são

encontrados no verão, o que pode estar relacionado com um maior consumo

de água pelos animais, devido às altas temperaturas. Além disso, cita também

que o desequilíbrio de energia e proteína na dieta dos animais, bem como a

utilização deficiente da proteína dietética, pode contribuir para a redução da

32

síntese de lactose e, em consequência disso, ocorre o aumento da crioscopia

do leite.

O método usado para a mensuração do Índice Crioscópico do leite

está de acordo com o preconizado por IAL (2008) e consiste no congelamento

da amostra até -3C, através de aparelhos de crioscopia, seguido de

cristalização imediata por vibração mecânica. Esse processo produz uma

elevação rápida da temperatura da amostra, com liberação de calor de fusão,

até que alcança um platô correspondente ao PC ou ponto de equilíbrio entre os

estados sólido e líquido (TRONCO, 2008). Devem ser feitas três medições para

cada amostra, sendo que a tolerância aceitável de diferença dos resultados é

de, no máximo, 0,002H, e os resultado final é obtido a partir da média

aritmética das medições (IAL, 2008).

O equipamento deve ser calibrado regularmente, pois a calibração

fornece uma referência confiável ao circuito eletrônico do crioscópio, para que

os resultados sejam válidos. Deve-se fazer a calibração de acordo com as

especificações do fabricante, utilizando-se duas soluções padrão (IAL, 2008).

Para o cálculo da porcentagem de água adicionada ao leite, utliza-se

a seguinte fórmula:

% água = (P – P’) / P x 100

Onde

P= índice Crioscópico padrão

P’= Leitura do IC da amostra

É importante considerar ainda que o estado de conservação da

amostra interfere no Índice Crioscópico do leite, haja vista que a degradação da

lactose por microrganismos acarreta a produção de quatro moléculas de ácido

lático para cada molécula da lactose degradada, o que eleva a acidez da

amostra. Sendo assim, a fração de substâncias solúveis da amostra estará

aumentada e o ponto de congelamento se distanciará do zero (TRONCO,

2008).

33

3.2. ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS

Os alimentos de origem animal não são isentos de riscos à saúde,

pois sua riqueza em proteínas e água facilita a rápida deterioração do produto,

bem como a sobrevivência e multiplicação de inúmeros microrganismos

patogênicos (GERMANO & GERMANO, 2008).

A contaminação microbiana pode ocorrer em qualquer das fases da

cadeia de produção, podendo ter sido adquirida desde a fase de criação dos

animais até a destinação dos produtos ao consumidor (GERMANO &

GERMANO, 2008).

Portanto, as análises microbiológicas são fundamentais para se

conhecer as condições de higiene em que o alimento foi preparado, os riscos

que o alimento pode oferecer à saúde do consumidor e se o alimento terá, ou

não, a vida útil pretendida. Essa análise é indispensável também, para verificar

se os padrões e especificações microbiológicas para alimentos, nacionais ou

internacionais, estão sendo atendidas adequadamente (FRANCO &

LANDGRAF, 2005).

O procedimento a ser empregado nas análises é determinado pelo

tipo de alimento que será analisado e pelo propósito específico da pesquisa. A

escolha pode, também, depender dos tipos de microrganismos a serem

pesquisados em um alimento suspeito de ter causado uma doença (PELCZAR

et al., 1997).

A Legislação Brasileira que disciplina e padroniza as análises

microbiológicas nos alimentos de origem animal é constituída pela IN Nº 62, de

26 de agosto de 2003 (BRASIL, 2003), do MAPA; pela IN N51, de 18 de

setembro de 2002 (BRASIL, 2002), do MAPA; pela IN N40, de 12 de

dezembro de 2005 (BRASIL, 2005), do MAPA e pela RDC Nº 12, de 2 de

janeiro de 2001, da ANVISA (BRASIL, 2001); sendo estas as metodologias

adotadas no laboratório de microbiologia do SOAP.

34

3.2.1. Metodologia

Diluições

Segundo disciplina a IN Nº62/2003 (BRASIL, 2003), do MAPA,

diluição é o procedimento de adição de uma substância a outra, para reduzir a

concentração de uma dessas substâncias.

Em microbiologia de alimentos, utilizam-se, rotineiramente, diluições

decimais das amostras, com os critérios de massa por unidade de volume (m/v)

ou volume por unidade de volume (v/v) (BRASIL, 2003) (Anexo 13).

O número de diluições depende do nível de contaminação esperado

(SILVA et al., 2001). Para alimentos com expectativa de crescimento

bacteriano baixo, as inoculações devem ser efetuadas a partir de diluição inicial

10-0 para líquido e 10-1 para sólidos ou pastosos, com, no mínimo, duas

diluições subsequentes. Entretanto, para alimentos com expectativa de grande

crescimento microbiano, ou se desconhece o número provável de

microrganismos existentes, utilizam-se diluições de 10-1 a 10-6, para garantir as

condições de contagem (BRASIL, 2003).

Deve-se considerar que as pipetas utilizadas no processo não

devem ser de capacidade maior do que 10 vezes do volume a ser coletado e

que precisam ser trocadas a cada diluição e manejadas de forma que

contaminações acidentais sejam evitadas. Adicionalmente, não é indicado

inserir as pipetas mais do que 2,5 cm abaixo da superfície do líquido dentro dos

tubos e a liberação do líquido deve ser feita de forma lenta e pelas paredes do

tubo, para evitar a adesão do líquido às paredes da pipeta, que ocorre quando

a amostra é liberada rapidamente. Quando houver contaminação da pipeta,

deve-se dispensá-la e a substituir por outra devidamente asséptica (BRASIL,

2003; SILVA et al., 2001).

35

Procedimentos de Cultura de Microrganismos

Há muitos métodos que podem ser utilizados para a contagem de

microrganismos nos alimentos. A escolha depende de fatores como o tipo da

amostra, características dos microrganismos investigados, características dos

meios de cultura, limite de contagem mínima, objetivo da análise e tempo

disponível (ROBERTS et al., 1995).

a) Técnica de Contagem em Placas

O método de contagem de microrganismos em placas é um método

geral que pode ser utilizado tanto para a contagem de aeróbios mesófilos,

aeróbios psicrotrófilos, bolores e leveduras e clostridios sulfito redutores, como

também para a contagem de gêneros e espécies em particular, a exemplo do

Staphylococcus aureus, do Bacillus cereus e do Clostridium perfringens (SILVA

et al., 2001).

Esta técnica permite a visualização da formação de colônias a partir

de um número “fixo” de células viáveis, sendo utilizada, portanto, para a

obtenção da contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) presentes

na amostra sob análise (BRASIL, 2003).

Segundo JAY (2005), porções de amostras de alimentos são

homogeneizadas, diluídas serialmente em diluente apropriado, plaqueadas

sobre ou dentro de um meio ágar adequado, o qual é incubado sob

temperatura adequada por determinado tempo sendo, então, todas as colônias

visíveis contadas.

As técnicas básicas de contagem de microrganismos em placas

incluem as técnicas de semeadura. A semeadura pode ser em profundidade,

em superfície e por sobrecamada. As técnicas de semeadura executadas no

laboratório do SOAP estavam de acordo com o preconizado por SILVA et al

(2001) e por BRASIL (2003), descritas em Anexo 14.

36

b) Número Mais Provável (NMP)

Este método é baseado na probabilidade de se encontrar

crescimento bacteriano depois do cultivo em meio líquido de diluições

sucessivas da amostra (ROBERTS et al., 1995).

Segundo BRASIL (2003), a análise por NMP é recomendada quando

é esperado um baixo número de microrganismos alvo (< 100/g ou mL), ou

quando, em função de limitações do método e das diluições necessárias para o

alimento específico, o padrão de aceitação/rejeição não pode ser atendido por

meio de provas de contagem; ou ainda, quando as células presentes estejam

comprometidas fisiologicamente e não tenham condições de formar colônias

em meios sólidos seletivos (BRASIL, 2003).

Para a determinação do NMP, a amostra deverá ser diluída tantas

vezes quantas necessárias para que a última diluição de 3, 5 ou 10 tubos

apresente todos os resultados negativos. Quanto maior o número esperado do

microrganismo pesquisado, maiores deverão ser as diluições usadas (BRASIL,

2003). A metodologia adotada para a execução da técnica de NMP foi descrita

por BRASIL (2003) (Anexo 15).

A Figura 13 ilustra uma série de tubos com caldo lauril sulfato

triptose, utilizados para a técnica de NMP.

FIGURA 13 - Série de Tubos para Técnica de NMP, com caldo Lauril Sulfato Triptose, Botucatu, 2010.

37

Depois da incubação, a maior diluição (menor concentração) a

apresentar crescimento ou produção de ácido e gás, permite uma estimativa do

número de bactérias na amostra original (HARRIGAN, 1998).

O arranjo de número de tubos positivos das três diluições, ou as

mais significativas, é transposto para quadros estatísticos (Anexo 16), que

informam o NMP para as diferentes combinações de tubos positivos e que

também incluem os limites de confiança dos números mais prováveis dos

microrganismos pesquisados em função do quadro em questão (BRASIL,

2003).

HARRIGAN (1998) acredita que o método de NMP deve ser utilizado

em conjunto com métodos seletivos e diagnósticos para determinar os números

de grupos particulares de organismos, como por exemplo, o número de

coliformes em amostras de alimentos.

c) Filme Seco

O método da reidratação de filmes secos consiste de dois filmes

plásticos unidos pela extremidade, sendo um dos filmes coberto com meio de

cultura, ao qual adiciona-se 1 mL da amostra diluída, que é distribuído por

pressão. Este método, chamado Petrifilme, foi desenvolvido pela empresa 3M e

é aprovado pela AOAC (Association os Official Analytical Chemists) como

alternativa aceitável para a Contagem Padrão em Placas. Os meios de cultura

podem conter ingredientes não-seletivos para contagem aeróbia ou certos

ingredientes seletivos para detectar grupos específicos de microrganismos

(JAY, 2005).

Quando da utilização de Petrifilmes com ingredientes não-seletivos,

após incubação, as microcolônias se apresentam coradas de vermelho, devido

à presença do corante tetrazólio (JAY, 2005).

A Figura 14 mostra Petrifilmes para contagem de microrganismos

aeróbios mesófilos e bolores e leveduras.

38

FIGURA 14 - Petrifilme para contagem de Microrganismos Aeróbios Mesófilos

(A) e de Bolores e Leveduras (B), Botucatu, 2010.

3.2.2. MICRORGANISMOS PESQUISADOS

As análises microbiológicas de rotina realizadas no laboratório do

SOAP – Botucatu, para leite pasteurizado e carne bovina “in natura” foram

contagem total de Microrganismos Aeróbios Mesófilos, contagem de Coliformes

Totais e de Coliformes Termo-tolerantes, pesquisa de Salmonella sp, pesquisa

de Clostrídios Sulfito Redutores, pesquisa de Listeria monocytogenes e

pesquisa Staphylococcus aureus.

Contagem Total de Microrganismos Aeróbios Mesófilos

A análise deste grupo de microrganismos é comumente utilizada

para verificar a qualidade sanitária dos alimentos, considerando-se que, ainda

que não haja microrganismos patogênicos ou deterioração visível do produto,

uma alta contagem de aeróbios mesófilos indica insalubridade do alimento

analisado, excetuando-se os alimentos fermentados, em que microrganismos

são adicionados à formulação e podem mascarar os resultados. Além disso, é

imprescindível considerar que todas as bactérias patogênicas de origem

alimentar crescem a essa escala de temperatura. Portanto, uma vez que as

A B

39

condições de crescimento desses microrganismos foram dadas, há chance de

o alimento estar contaminado com algum patógeno (FRANCO & LANDGRAF,

2005).

A contagem desses microrganismos pode ser feita através de

Contagem Padrão em Placas, com plaqueamento em profundidade ou em

superfície utilizando-se ágar padrão para contagem. Adicionalmente, a

contagem também pode ser feita com a utilização de Petrifilme. A incubação é

feita a 35C por 48h (SILVA et al., 2001).

Segundo DELAZARI (1979), embora a Legislação Brasileira não

estabeleça padrões aceitáveis para contagem de microrganismos aeróbios

mesófilos em carne crua, trabalhos constataram que carnes apresentando 107

UFC/g já estão com sua qualidade comprometida em relação ao aroma e à

viscosidade superficial. De acordo com SILVA et al. (2001), isto é justificado

pela degradação de aminoácidos pelas bactérias, processo que se inicia

quando a glicose é totalmente consumida. Esta degradação de aminoácidos

provoca aparecimento de odores sulfídricos e de ésteres ácidos.

Contagem de Coliformes Totais

O grupo de coliformes totais inclui as bactérias em forma de

bastonetes Gram negativos, não esporuladas, aeróbias e anaeróbias

facultativas, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48

horas, a temperatura de 35C (SILVA et al., 2001; TRONCO, 2008).

A enumeração de coliformes totais é utilizada para avaliar as

condições higiênicas do produto, pois, quando em alto número, indica

contaminação decorrente de falha durante o processamento, limpeza

inadequada ou tratamento térmico insuficiente (PARDI et al., 1993).

As provas para determinar coliformes, no caso de leite cru, permitem

avaliar o grau de contaminação do próprio leite. No entanto, considerando que

estas bactérias não sobrevivem à temperatura de pasteurização, a realização

desta prova em leite pasteurizado visa detectar tratamento térmico ineficiente

ou recontaminação posterior (TRONCO, 2008).

40

O procedimento preconizado pela Food and Drug Administration

consiste do uso do método do NMP pela inoculação em tubos com caldo Lauril

Sulfato Triptose (LST) (SILVA et al., 2001), porquanto foi o método utilizado

para a realização destas análises, cuja metodologia foi descrita por SILVA et al.

(2001) (Anexo 15).

De acordo com SILVA et al. (2001) este meio de cultura permite um

enriquecimento seletivo dos coliformes, recuperando células injuriadas. O

crescimento e produção de gás no tubo de Durhan evidenciam um teste

positivo (Figura 15).

FIGURA 15 - Resultados Positivos para a Presença de Coliformes Totais em Caldo Lauril Sulfato Triptose, Botucatu, 2010.

Embora a Contagem de Coliformes Totais seja amplamente utilizada

como indicador de qualidade higiênico-sanitária dos alimentos, a RDC

N12/2001 (BRASIL, 2001), não estabelece padrões regulatórios para esses

microrganismos em uma gama de alimentos, e entre eles, carnes e leite. No

entanto, segundo a IN 51 (BRASIL, 2002), o MAPA considera como aceitáveis

duas amostras, em um lote de cinco, com contagens de coliformes a 35C

entre 2 e 4 NMP/mL de leite tipo C; duas amostras, em lote de cinco, com

contagens entre 2 e 5 NMP/mL de leite tipo B; e contagens menores que 1

NMP/ mL em leite tipo A.

41

3.2.2.1. Contagem de Coliformes Termo-tolerantes

A separação dos coliformes de origem fecal, ou termo-tolerantes,

daqueles de origem não fecal, é feita através de incubação a temperatura

elevada (BRASIL, 1993). JAY (2005) considera que um teste para coliformes

fecais é essencialmente um teste para E.coli tipo I, embora algumas linhagens

de Citrobacter e Klebsiella possam se adequar a esta definição.

Contudo, de acordo com a Portaria 101/1993 (BRASIL, 1993), do

MAPA, o termo coliforme de origem fecal não tem validade taxômica, pois

apenas indica a presença de E.coli, não separando esta bactéria das demais,

geralmente consideradas de pouco ou nenhum significado em saúde pública.

Por outro lado, a presença de microrganismo do grupo de origem fecal no

alimento pode ter ocorrido por contaminação indireta, através do ambiente e

sua contagem, à multiplicação ocorrida no próprio alimento.

A metodologia adotada para realização da pesquisa de Coliformes

Termo-tolerantes está de acordo com SILVA et al. (2001) (Anexos 17 e 18).

Os coliformes fecais produzem ácidos e gás em caldo EC em

temperatura entre 44 e 46C (JAY, 2005) (Figura 16).

FIGURA 16 – Produção de Gás por

Coliformes Termo-tolerantes em Caldo Escherichia coli

Segundo a IN 51 (BRASIL, 2002), o padrão de contagem de

coliformes a 45C aceitáveis para leite tipo C é de uma amostra, em lote de

cinco, com contagem entre 1 e 2 NMP/ mL; para leite tipo B, o padrão aceitável

42

é de duas amostras, em lote de cinco, com contagem entre 1 e 2 NMP/ mL; e,

para leite tipo A, é obrigatória a ausência desses microrganismos.

Além do significado higiênico da presença dos coliformes termo-

tolerantes, deve-se considerar ainda, o significado em saúde pública, uma vez

que diversas linhagens de E. coli são patogênicas ao ser humano. Essas

linhagens são agrupadas de acordo com seus fatores de virulência,

manifestações clínicas e epidemiologia em classes (FRANCO & LANDGRAF,

2005):

E. coli enteropatogenica clássica

E. coli enteroinvasiva

E.coli enterotoxigênica

E. coli enterohemorrágica

E. coli shigatoxigênica

E.coli enteroagregativa

De forma geral, os sintomas são diarréia, vômitos, náuseas,

podendo ou não cursar com febre variando conforme a classe envolvida na

intoxicação (TRABULSI, 2008).

3.2.2.2. Pesquisa de Salmonella sp

O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae, estando

intimamente ligado aos gêneros Escherichia e Shigella (PELCZAR et al., 1997).

Este gênero é representado por bacilos gram-negativos, não

produtores de esporos, anaeróbios facultativos. Normalmente são móveis por

meio de flagelos peritríquios, produtores de gás e ácido a partir da glicose,

reduzem nitrato a nitrito, são produtores de sulfeto-hidrogênio (H2S) e utilizam

citrato como única fonte de carbono (RIEMANN et al., 2005).

Apesar da generalidade, existem alguns sorovares que apresentam

variação, como a S. gallinarum e S. pullorum que são imóveis, ou algumas

amostras de S. choleraesuis e S.paratyphi A que não produzem gás sulfídrico.

O citrato é normalmente utilizado por estas bactérias, com exceção da S.typhi e

da S.paratyphi (FRANCO & LANDGRAF, 2005).

43

A Figura 17 ilustra uma cultura de Salmonella sp em ágar Xilose-

Lisina Dexocolato.

FIGURA 17 - Cultura de Salmonella sp em ágar Xilose-Lisina

Dexocolato (XLD), 2010.

A Salmonella sp é, conhecidamente, um dos agentes mais

envolvidos em surtos de toxi-infecções alimentares no mundo, sendo a S.

typhimurium o sorotipo mais isolado em alimentos. Essas bactérias estão

amplamente distribuídas no ambiente e tem como portadores as aves, os

animais de produção, os animais domésticos e os silvestres, tendo as aves

uma importância maior devido à excreção contínua das salmonelas em suas

fezes (FRANCO & LANDGRAF, 2005).

Estes microrganismos tem capacidade de se multiplicar em uma

ampla faixa de temperatura, entre 7 e 49.5C, sendo 37C a temperatura ótima

para crescimento. A atividade de água afeta diretamente seu desenvolvimento

e, embora o limite mínimo seja 0.94, essas bactérias podem sobreviver por

longos períodos em alimentos com baixa atividade de água. O pH mínimo para

multiplicação é de 3.8, abaixo ou acima disso há diminuição da sua atividade.

Então, é possível que um alimento inicialmente com baixas contagens de

Salmonella sp, submetido à condições ótimas de crescimento, se torne

infectante dentro de quatro horas (GERMANO & GERMANO, 2008).

A metodologia adotada pelo laboratório do SOAP para a realização

desta prova está em consonância com a preconizada por BRASIL (2005)

(Anexos 19 e 20).

44

O padrão exigido pela RDC n° 12 (BRASIL, 2001) é de ausência

deste microrganismo em 25g de carne bovina “in natura” e em 25 mL de leite

bovino pasteurizado.

3.2.2.3. Pesquisa de Clostrídios sulfito-redutores

Os Clostrídios sulfito-redutores pertencem a um grupo de

microrganismos com fatores de virulência distintos, inseridos no gênero

Clostridium. A principal característica deste grupo é sua capacidade de reduzir

sulfito a sulfeto de hidrogênio (H2S) a uma temperatura de 46C. Todavia, a

pesquisa desse grupo de microrganismos tem como objetivo principal indicar,

de forma simples e rápida, a potencial presença do Clostridium perfringens e

do Clostridium botulinum, duas espécies capazes de causar graves doenças ao

ser humano e aos animais (PRATES et al., 2008).

O Clostridium botulinum é um bacilo Gram-positivo formador de

endósporos, anaeróbio estrito, comum no solo e nas águas ambientais

(GERMANO & GERMANO, 2008).

A Figura 18 mostra uma câmara de anaerobiose utilizada para o

cultivo de clostrídios sulfito-redutores.

FIGURA 18 - Câmara de Anaerobiose para Cultivo de Clostrídios Sulfito Redutores, Botucatu, 2010.

45

Este patógeno é o agente causador do botulismo, uma intoxicação

alimentar grave e aguda, cujos sinais envolvem distúrbios digestivos e

neurológicos. A contaminação ocorre através da ingestão de diversos tipos de

alimentos, sejam eles enlatados, embutidos, de origem vegetal ou animal, cuja

esterilização foi ineficaz e/ou sua conservação foi feita em substratos com pH

acima de 4.6, criando assim condições favoráveis à produção da neurotoxina

pelo micorganismo (GERMANO & GERMANO, 2008).

O Clostridium perfringens é um bacilo Gram-positivo, anaeróbio,

eventualmente aerotolerante e formador de esporos, sendo agrupado em cinco

tipos (A, B, C, D, E), de acordo com as exotoxinas produzidas (GERMANO &

GERMANO, 2008).

GERMANO & GERMANO (2008), consideram que carnes e produtos

cárneos, aves e molhos de carne são alimentos em que o C. perfringens se

desenvolve facilmente especialmente, se forem submetidos a resfriamento por

tempo prolongado ou armazenamento não refrigerado e reaquecido no

preparo. Além disso, citam que a maior frequência de surtos da doença está

relacionada com produtos preparados com antecedência e em grande

quantidade. Portanto, um grande número de pessoas está susceptível,

sobretudo aquelas que se utilizam de serviços de alimentação coletiva, sendo

os jovens e idosos os indivíduos mais acometidos.

Estas análises foram realizadas de acordo com o descrito por

TERRA & BRUM (1988) (Anexo 21).

Pesquisa de Listeria sp

As bactérias do gênero Listeria são bastonetes Gram-positivos, não-

esporulados, que não coram pela coloração do ácido rápido e são catalase-

positivas (JAY, 2005).

No gênero Listeria estão incluídas as espécies L. innocua e L. grayi

não patogênicas, L. welshimeri, L.seeligeri e L. ivanovii, que dificilmente

acometem o homem e a L. monocytogenes, de maior importância em saúde

pública por ser a mais patogênica para o homem (GERMANO & GERMANO,

2008).

46

A Figura 19 mostra coloração enegrecida apresentada pelo caldo

Fraser, quando da presença de Listeria sp.

FIGURA 19 - Resultado positivo para presença de Listeria sp em caldo Fraser, Botucatu, 2010.

GERMANO & GERMANO (2008), citando um trabalho da

Organização Mundial da Saúde, afirmam que a L. monocytogenes é um

contaminante ambiental amplamente distribuído, cujo modo de transmissão

primário para o homem é a contaminação de alimentos em qualquer ponto da

cadeia alimentar, desde a origem até o consumidor final. A eliminação total

desse microrganismo de todos os alimentos é impraticável e pode ser

impossível.

JAY (2005) considera que qualquer alimento fresco de origem

animal ou vegetal pode apresentar números variados de L. monocytogenes.

Em geral, esse microrganismo tem sido encontrado em leite cru, queijo mole,

carnes frescas ou congeladas, frango, frutos do mar, frutas e produtos

vegetais. Já entre as demais espécies de Listeria spp, a L. innocua é mais

comum em carnes, leite, frutos do mar congelados, queijos semiduros,

amostras de ovo inteiro e vegetais.

As análises para isolamento de Listeria spp. e Listeria

monocytogenes são imprescindíveis, tendo em vista que as mudanças nas

características e nos hábitos alimentares, na forma em que os alimentos são

produzidos, a habilidade deste microrganismo de sobreviver em condições

adversas e sua capacidade de crescer em temperatura de refrigeração, aliadas

47

à sua resistência ao congelamento, ao calor e aos diversos antibióticos,

tornaram esse microrganismo emergente e de grande importância entre os

patógenos transmitidos por alimentos e atualmente representa um grande

problema para as indústrias de alimentos e órgãos oficiais de regulamentação

(DOWNEY & ITO, 2001; FABER & PETERKIN,1991).

A metodologia adotada para pesquisa de Listeria sp utilizada no

SOAP está em consonância com BRASIL (2003) (Anexos 22 e 23).

3.2.2.4. Pesquisa de Staphylococcus aureus

Os estafilococos são bactérias Gram-positivas, imóveis, de forma

esférica, medindo de 0,5 a 1,0 mm, podendo se apresentar isoladas, em pares

ou agrupadas em massas irregulares em forma de “cacho”. Apresentam

metabolismo respiratório e fermentativo, atuando sobre carboidratos com

produção de ácidos, sendo aeróbias facultativas. Podem crescer em

temperaturas de 7 a 48°C, com um crescimento ótimo entre 30 e 37°C (HOLT,

1994).

De acordo com GERMANO & GERMANO (2008), o S. aureus é

considerado um dos mais frequentes causadores de surtos de toxi-infecção

alimentar. Segundo XAVIER et al (2007), em muitos países, o Staphylococcus

aureus é considerado o segundo ou terceiro mais comum patógeno causador

de intoxicação alimentar, perdendo em número apenas para Salmonella sp. e

competindo com o Clostridium perfringens.

A contaminação dos alimentos se dá principalmente, através da

transmissão pelos manipuladores, portadores assintomáticos ou com algum

tipo de infecção. Além disso, MACHOSHVILI et al (1991) citam que o S. aureus

pode ser transmitido também por animais, principalmente, gado leiteiro com

mastites, cujo leite apresenta altas contagens deste microrganismo.

Os alimentos mais envolvidos são aqueles com elevado teor de

umidade e alta porcentagem de proteína, tais como as carnes e os produtos

derivados de bovinos, suínos e aves, além de ovos. Outro grupo importante de

alimentos é o de leite e seus derivados, como queijos cremosos e produtos de

confeitaria. De modo geral, todos os alimentos que requerem considerável

48

manipulação durante seu preparo e cuja temperatura de conservação é

inadequada são passíveis de causar intoxicação (GERMANO & GERMANO,

2008).

A intoxicação por S. aureus é causada pela ingestão da enterotoxina

produzida pela bactéria, quando as condições necessárias à sua multiplicação

são fornecidas (TRABULSI, 2008). Segundo SILVA et al (2001), apesar de o S.

aureus ser sensível a temperatura, a enterotoxina produzida por ele é

termorresistente.

Apesar da reconhecida importância do S.aureus em saúde pública,

SILVA et al (2001) consideram que a contagem deste microrganismo em

alimentos pode ser feita também, com objetivo de verificar o controle da

qualidade higiênico-sanitária dos processos de produção de alimentos, uma

vez que ele serve como indicação de contaminação pós-processo ou das

condições de sanitização das superfícies destinadas ao contato com alimentos.

Há vários métodos disponíveis para a contagem de S. aureus, com

sensibilidade variável tanto em função das características seletivas/ diferenciais

utilizadas na formulação dos meios de cultura, como em função da técnica de

contagem propriamente dita (direta em placas e pelo Número Mais Provável).

O ágar Baird-Parker (BP) pode ser utilizado para plaqueamento direto em

alimentos processados ou “in natura”.

A metodologia adotada pelo SOAP está de acordo com o

preconizado em BRASIL (1981) e por SILVA et al (2001) (Anexo 24).

49

4. QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DOS ALIMENTOS E A SAÚDE PÚBLICA

Considerando que a qualidade dos alimentos está intimamente

ligada à manutenção da saúde do homem, o laboratório constitui importante

órgão de apoio à inspeção e à vigilância sanitária de produtos alimentícios.

Sendo que sua principal função é verificar a segurança do alimento, detectando

riscos de ordem físico-química, microbiológica ou toxicológica, infrações de

ordem higiênico-sanitária e fraudes (GERMANO & GERMANO, 2008).

Dentre os perigos que os alimentos podem oferecer ao homem, as

Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs) são os mais frequentemente

diagnosticados.

As DTAs são síndromes, de natureza tóxica ou infecciosa,

ocasionadas a partir da ingestão de alimentos e/ou de água contaminados com

agentes de origem biológica, física ou química em quantidades que causem

enfermidades (CÂMARA, 2002).

Muito embora vários fatores possam ser responsáveis por causar

DTA’s, as autoridades da área de proteção dos alimentos consideram a

contaminação microbiana dos alimentos como fonte principal destas doenças

(GERMANO & GERMANO, 2008).

A ocorrência das DTA’s vem aumentando de modo significativo em

nível mundial, por conta da mudança de hábitos cotidianos e alimentares.

Dentre os fatores que configuram esse cenário atual estão o

crescente aumento das populações e de seus grupos vulneráveis, o processo

de urbanização desordenado e a necessidade de produção de alimentos em

grande escala, somados ao deficiente controle dos órgãos públicos e privados

no tocante à qualidade dos alimentos disponíveis ao consumidor (BRASIL,

2005).

Além disso, a globalização e o aumento da velocidade dos

acontecimentos e da vida cotidiana obrigaram a população a recorrer a

alimentos do tipo “fast-foods” e à alimentação em vias públicas. Em

contrapartida, diante do aumento da população, novas modalidades de

produção e o incremento do uso de aditivos foram necessários para suprir a

demanda mundial de alimentos e, somando-se aos demais fatores

50

mencionados, contribuem sobremaneira para o aumento dos casos de DTA’s

registrados (BRASIL, 2005).

Em geral, as DTAs possuem curto período de incubação e quadro

clínico gastrointestinal, manifestado por diarréia, náuseas, vômitos e dores

abdominais, podendo ocorrer ou não, febre. Normalmente, o quadro progride

para a cura em um pequeno espaço de tempo, havendo recuperação total dos

pacientes. Todavia, em indivíduos muito jovens ou idosos e debilitados, estas

doenças podem originar complicações graves, podendo levá-los ao óbito

(GERMANO & GERMANO, 2008).

Segundo dados do Ministério da Saúde (BRASIL, 2005), as

ocorrências de surtos de DTAs estão associadas à presença de alguns fatores

de risco, como falhas na cadeia de refrigeração, acondicionamento e preparo

inadequados, falhas nas práticas de higiene dos manipuladores e de

equipamentos, utilização de matérias-primas e água contaminadas, além de

condições ambientais desfavoráveis.

4.1. Toxi-infecções Causadas por Alimentos Cárneos e Lácteos

De acordo com o Ministério da Saúde, os dados obtidos entre 1999

e 2008, mesmo que apresentando discrepâncias, mostram que 6.062 surtos de

DTAs foram notificados, nos quais 177.330 pessoas foram acometidas,

culminando com 64 óbitos. Em 51% das notificações, informações sobre o

agente etiológico envolvido foram ignoradas; 34% não apresentavam

informações concretas sobre o alimento envolvido e, 24.1% não indicavam o

local onde o alimento foi consumido com exatidão (BRASIL, 2008).

Dentre os agentes etiológicos mais frequentemente isolados, consta,

em primeiro lugar, a bactéria Samonella spp, responsável por 42% dos casos

com agente identificado. Em segundo lugar, a bactéria Staphylococcus spp,

com 20.2% dos casos identificados. Em seguida, Bacillus cereus, 6.9%;

Clostridium perfringens, 4.9%; Samonella enteriditis, 4.0%; Shigella spp, 2.7%

(BRASIL, 2008).

Considerando os alimentos mais envolvidos em surtos notificados,

ovos crus e mal cozidos representam a maior porcentagem entre os alimentos

51

envolvidos, somando 22.8% dos casos; alimentos mistos, com vários

ingredientes estiveram presentes em 16.8% dos casos; as carnes vermelhas

foram associadas a 11.7% dos casos; sobremesas, a 10%; água, 8.8%; leite e

derivados, 7.1% e outros, 21.8% (BRASIL, 2010).

De acordo com estudo realizado por CÂMARA (2002) no estado de

Mato Grosso do Sul, entre os anos de 1998 e 2001, os microrganismos mais

isolados nos casos de surtos de toxinfecção alimentar notificados foram

Estafilococus coagulase (+), E. coli, Salmonella sp, Clostridium perfringens e

Bacillus cereus. A distribuição dos casos, de acordo com os alimentos e os

agentes etiológicos envolvidos, está representada na Tabela 1.

TABELA 1 – Distribuição dos casos de surtos de Toxinfecções Alimentares no estado do MS, de acordo

com os grupos alimentares e os agentes etiológicos envolvidos. Fonte: CÂMARA, 2002.

Nos Estados Unidos da América, dados do Centers of Disease

Control and Prevention (CDC) indicam que em 2007 houve 21.244 casos de

DTA’s, com 18 mortes. Entre os agentes isolados em laboratórios, o norovirus

foi o mais encontrado seguido por Samonella spp. Das 18 mortes, 11 foram

atribuídas a agentes bacterianos, sendo cinco por Samonella ssp, três por

Listeria monocytogenes, duas por Escherichia coli O157:H7 e uma por

Clostridium botulinum. As outras duas mortes foram associadas ao agente viral

norovirus e à intoxicação química por toxina de cogumelo (Anexo 25).

52

De acordo com dados do CDC, os alimentos considerados veículos

de patógenos que culminaram em surtos de DTA no ano de 2007, nos EUA,

foram peixe, com 41 surtos, frango, com 40 e carne bovina, em 33 surtos. Além

disso, a carne foi associada à 667 casos de DTA notificados neste período

(CDC, 2010). Estes dados comprovam a importância da carne bovina no que

tange à veiculação de patógenos e ocorrência de doenças.

4.1.1. Principais Doenças Transmitidas por Ingestão de Carne e Leite

A carne e o leite são dois produtos básicos da alimentação do

brasileiro e muito envolvidos em surtos de toxi-infecções alimentares.

As bactérias estão envolvidas em mais de 90% dos casos de surto

de toxi-infecção alimentar relacionados ao consumo de leite. As espécies

Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Escherichia coli O157:H7,

Campylobacter sp., Staphylococcus aureus, Brucella sp., Mycobacterium sp. e

Clostridium botulinum estão frequentemente envolvidas (CHYE et al., 2004).

A carne é o mais perecível de todos os alimentos importantes, sendo

abundante em nutrientes necessários para o crescimento de bactérias,

leveduras e bolores, e quantidades adequadas desses nutrientes estão

presentes e disponíveis na carne fresca (JAY, 2005). Dentre as bactérias mais

associadas à contaminação da carne bovina “in natura” estão o C. perfringens,

S. aureus e Salmonella spp (GERMANO & GERMANO, 2008).

A Listeria monocytogenes é responsável por provocar sintomatologia

inicialmente semelhante a um resfriado, com febre baixa e mal-estar geral,

podendo progredir para meningite, meningoencefalite, septicemia, aborto ou

parto prematuro. A taxa de mortalidade gira em torno de 20 a 30% dos casos

diagnosticados, sendo que as mulheres grávidas e seus fetos, os idosos, os

indivíduos com patologias imunossupressoras e as crianças são indivíduos

considerados como grupo de risco (SILVA et al., 2001).

Segundo TRABULSI (2008), a Salmonella typhimurium, espécie

mais patogênica ao homem, causando gastrenterite. O período de incubação

desta doença é de 48 horas, aproximadamente, cursando com diarréia, dores

de cabeça, febre, cólicas intestinais e calafrios. Apesar de ser autolimitante, a

53

doença pode progredir para desidratação grave e bacteremia, culminando com

óbito, especialmente de indivíduos que apresentam depressão do sistema

imune, idosos e neonatos.

A transmissão da Salmonella sp ao ser humano ocorre,

principalmente, através do consumo de carne e ovos crus ou malcozidos e

leite, cujo processamento térmico não ocorreu ou foi ineficaz ou, ainda, por

contaminação cruzada durante o preparo, armazenamento ou consumo de

outros alimentos (REIMANN et al., 2005). De acordo com TODAR (2008), a

contaminação da carne pode ser originaria da contaminação do animal, mas

geralmente se dá devido contaminação da carne com conteúdo intestinal na

linha de abate.

Quanto à toxi-infecção causada por Escherichia coli, sabe-se que

existem quatro classes reconhecidamente patogênicas ao homem, que causam

gastrenterite. Dentre elas, a E. coli O157:H7 produz uma potente enterotoxina,

responsável pelos danos causados na mucosa intestinal quando da infecção

por este patógeno (FDA, 2009). De acordo com QUINN et al. (2003), nos

últimos anos, esta classe tem sido considerada um dos principais patógenos

veiculados por alimentos, responsável pela Síndrome da Hemolítica Urêmica e

pela Colite Hemorrágica. Segundo SANTOS & FONSECA (2009), os sintomas

iniciais são fortes dores abdominais e diarréia aquosa e/ou sanguinolenta,

entretanto, a Síndrome Hemolitica Urêmica causa insuficiência renal e pode

levar à morte, especialmente em indivíduos jovens.

Em se tratando de intoxicação por Staphylococcus aureus, o

paciente apresenta quadro com náuseas, vômito, diarréia e dores abdominais,

sendo que os sinais iniciam-se, em média, 4 horas após a ingestão e perduram

por 12 horas (TRABULSI, 2008). Entretanto, a doença pode progredir e exigir

hospitalização (DOWNES & ITO, 2001).

O botulismo, causado pelo microrganismo Clostridium botulinum,

pode ocorrer de formas distintas. Em bebês, acontece colonização do intestino

pelos esporos e a produção da toxina. Em adultos, o botulismo clássico advém

da ingestão da toxina pré-formada no alimento. E, além destas, há ainda o

botulismo de lesão, ocorrência rara relatada especialmente em usuários de

drogas. Apesar das diferentes formas de contração da toxina, a doença

54

culmina com afecção irreversível do sistema nervoso levando à paralisia flácida

muscular (TRABULSI, 2008).

O Campylobacter jejunii é responsável por causar a

campilobacteriose gastrentérica, quando alimentos contaminados são

consumidos. A doença tem como sinais clínicos a diarréia aquosa, podendo ser

sanguinolenta, febre, dores abdominais e musculares e, ocorre

aproximadamente, entre dois e cinco dias após a ingestão do alimento

contaminado e pode perdurar por dez dias, sendo, entretanto, autolimitante

(FDA, 2009). De acordo com SANTOS & FONSECA (2009), devido ao

crescimento deste microrganismo ser pequeno nos alimentos, sua dose

infectante é, em geral, muito baixa, em torno de 500 UFC/mL, o que corrobora

a preocupação quanto à pasteurização eficiente do leite, uma vez que o leite

cru é uma das fontes mais importantes de infecção.

A brucelose, doença causada por bactérias do gênero Brucella, pode

ser contraída pelo homem através da ingestão de leite “in natura” ou de

produtos à base de leite não tratado. E dentre os sinais clínicos estão pirexia

flutuante, mal-estar geral, fadiga, dores musculares e articulares, sendo que

osteomielite é a complicação mais comum (QUINN et al., 2003). Segundo

MAFRA (2009), a doença é um grave problema de saúde pública, tendo em

vista que é facilmente transmissível ao homem, apresenta alta persistência e o

tratamento e o controle dos animais portadores é difícil.

As bactérias do Gênero Mycobacterium spp que formam o

“Complexo Mycobacterium tuberculosis” são as responsáveis pela tuberculose

em humanos, sendo constituído pelas espécies M. tuberculosis e M. bovis

(SANTOS & FONSECA, 2009). Nos casos de tuberculose ativa, o individuo

acometido apresenta tosse, podendo conter sangue, dores no peito, fadiga,

calafrios, perda de peso, febre e sudorese noturna (CDC, 2010).

De acordo com HARRIGAN (1998), a intoxicação alimentar causada

por C. perfringens é uma infecção ao invés de intoxicação, uma vez que

consideramos intoxicação a ocorrência dos sintomas causados por uma toxina

produzida pelo microrganismo. Os sintomas desta afecção, no entanto, são

resultantes da formação da toxina no intestino durante a esporulação de um

grande número de células vegetativas ingeridas, sendo que o C. perfringens

raramente esporula nos alimentos. A doença apresenta período de incubação

55

variando entre 6 e 24 horas e decorre com diarréia aquosa e espasmos

intestinais, sendo autolimitante em indivíduos sadios. Todavia, em indivíduos

imunodeprimidos podem ocorrer complicações (TRABULSI, 2008).

Segundo ROBERTS et al (1995), os alimentos contaminados com

grandes quantidades de formas vegetativas de C. perfringens podem ocasionar

uma enfermidade caracterizada por diarréia e dor abdominal. As formas

vegetativas são muito sensíveis à refrigeração e congelamento e, nos

alimentos que sofreram este processo, apenas os esporos sobrevivem.

56

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Tendo em vista todos os dados discutidos neste trabalho, ficou

evidente que as análises laboratoriais dos alimentos, em especial carne “in

natura” e leite, constituem ferramentas importantes para a Saúde Pública.

As doenças transmitidas por alimentos figuram como importantes

problemas de saúde pública, uma vez que envolvem um grande número de

pessoas acometidas, uma gama de alimentos de consumo relevante e

vultosas perdas econômicas.

Sendo assim, é imprescindível conhecer e garantir as características

físico-químicas e microbiológicas destes alimentos, uma vez que nenhum

alimento está totalmente livre de substâncias ou microrganismos

patogênicos ao ser humano. Portanto, o reconhecimento e a quantificação

da microbiota que contamina os alimentos, sejam eles carne ou leite, bem

como a avaliação de suas características ao consumo e a notificação dos

casos, se fazem indispensáveis no que tange à prevenção e ao controle das

Doenças Transmitidas por Alimentos.

57

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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tipo C, do Leite Pasteurizado e do Leite Cru Refrigerado e o Regulamento Técnico da Coleta de Leite Cru Refrigerado e seu Transporte a Granel. Diário Oficial da União. Brasília, 2002, p.13.

8. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa N° 62, de 26 de Agosto de 2003. Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água. Diário Oficial da União. Brasília: 2003, p.14.

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66

ANEXOS

67

ANEXO 1

Metodologia para execução da Prova de Éber

O procedimento desta prova consistiu em transferir 1 mL de ácido clorídrico, 3 mL de etanol e 1 mL de éter sulfúrico para um tubo de ensaio. Fixa-se um pedaço da amostra na extremidade de um arame de 25 cm de comprimento, introduzindo-o no tubo de ensaio, de modo que não toque nas paredes do tubo e nem na superfície do reagente. O aparecimento de fumaça branca e espessa indica que a amostra está entrando em estado de decomposição (TERRA & BRUM, 1988).

68

ANEXO 2

Metodologia para execução da Prova de H2S

Transfere-se 10g da amostra homogeneizada para um Erlenmeyer de 125 mL e adiciona-se água destilada até cobrir a amostra. Lacra-se o Erlenmeyer com papel filtro embebido em solução de acetato de chumbo e ácido acético glacial. Então, o erlenmeyer deve ser colocado em banho-maria, de modo que o fundo do frasco fique a 3 cm do nível da água, por 10 minutos. O aparecimento de mancha negra-grafite no papel filtro indica presença de gás sulfídrico (TERRA & BRUM, 1988, IAL, 2008).

69

ANEXO 3

Metodologia para execução da Prova de Densidade Relativa A 15º C

Na execução desta prova, vertem-se 500 mL da amostra de leite homogeneizado em béquer ou proveta, evitando incorporação de ar e formação de espuma. Em seguida, Introduz-se o termolactodensímetro, limpo e seco na amostra, com cuidado, para que não se encoste à parede da proveta e aguarda-se a flutuação. A densidade marcada na cúspide do menisco indica o resultado da análise. Quando a amostra se encontra em temperatura diferente de 15C, deve-se efetuar correção, acrescentando-se 0,0002 no resultado obtido, para cada grau acima dos 15C desejados ou subtraindo-se 0,0002 do resultado obtido, para cada grau abaixo dos 15C (BRASIL, 2006).

70

ANEXO 4

Correção da densidade do leite na prova de Densidade a 15º C, segundo a temperatura da amostra.

Fonte: IAL, 200

71

ANEXO 5

Metodologia para execução da Prova de Acidez em Graus Dornic

O método utilizado para a realização deste teste consiste em transferir 10 mL da amostra homogeneizada para um béquer e adicionar de quatro a cinco gotas da solução de fenolftaleína a 1% e proceder titulação com solução de Dornic (soda N/9) até que a amostra adquira coloração ligeiramente rósea (BRASIL, 2006).

72

ANEXO 6

Metodologia para execução da Prova de Alizarol

O procedimento consiste em adicionar, em partes iguais a solução de alizarol (0,1% em álcool a 68%) e o leite fluido em tubo de ensaio, promover sua agitação e observar coloração gerada (BRASIL, 2006).

73

ANEXO 7

Metodologia para execução da prova de determinação do teor de gordura – Método de Gerber

Este método consiste em colocar 10 mL de ácido sulfúrico denso 1,820 em butirômetro e, em seguida, adicionar lentamente, com pipeta volumétrica, 11 mL da amostra de leite, cuidadosamente, para que não ocorra queima da amostra. Em seguida, 1 mL de álcool amílico deve ser adicionado. Enxuga-se a boca do recipiente com papel absorvente e procede-se seu fechamento com rolha adequada, limpa e seca. A mistura é submetida à agitação manual, segurando-a com proteção devido ao aquecimento que a amostra sofre durante esse processo. PEARSON (1998) acrescenta que a agitação deve ser feita até que não hajam partículas brancas visíveis. Posteriormente, utilizando centrífuga de Gerber, efetua-se centrifugação por aproximadamente cinco minutos, em velocidade de 1000-1200 rpm. Na seqüência a amostra é colocada em banho-maria a temperatura de 65C durante 3 a 5 minutos, dispondo o butirômetro com a rolha para baixo. A leitura direta deve ser feita observando-se a parte inferior do menisco da coluna de gordura formada, cuja graduação fornece a porcentagem de gordura presente na amostra analisada (PEARSON, 1998; BRASIL, 2005; TRONCO, 2008).

74

ANEXO 8

Metodologia alternativa para execução da Determinação do Extrato Seco Total

Equação de Fleishmann

% Extrato Seco = 1,2G + 2, 665 [(100D – 100)/D]

Fórmula Prática

% Extrato Seco = G/5 + D/4 + G + 0,26

Onde,

D = Densidade

G = Teor de gordura

75

ANEXO 9

Metodologia para execução da Prova de Pesquisa de Peroxidase

A metodologia adotada consiste em transferir 10 mL da amostra para um tubo de ensaio, aquecendo-o em banho-maria a 45C por cinco minutos, para a ativação da enzima. Em seguida, acrescenta-se 2 mL da solução hidroalcoolica de guaiacol a 1%, pelas paredes e, na sequência, 3 gotas da solução de peróxido de hidrogênio a 3%. O resultado é positivo quando do aparecimento de um halo de coloração salmão, sendo observado após cinco minutos do preparo da solução (Brasil, 2006).

76

ANEXO 10

Metodologia para execução da prova de pesquisa de peróxido de hidrogênio

A técnica adotada consiste em transferir 10 mL da amostra em tubo de ensaio de 20 mL e adicionar 2 mL de solução de guaiacol a 1% e 2 mL de leite cru. O aparecimento de uma coloração salmão indica a presença do peróxido de hidrogênio (BRASIL, 2006; IAL, 2008).

77

ANEXO 11

Metodologia para execução da prova de pesquisa de cloro

Transfere-se 5 mL da amostra para tubo de ensaio e adiciona-se 0,5 mL de solução de iodeto de potássio a 7,5%, submetendo a mistura à agitação (IAL, 2008). A presença de cloro é confirmada se a amostra apresentar coloração amarelada após a agitação. Para confirmação, adiciona-se 1 mL de solução de amido a 1% e verifica-se a coloração azul-violeta em caso de presença de cloro livre (BRASIL, 2006).

78

ANEXO 12

Metodologia para execução da Prova de pesquisa de formol

A prova para pesquisa de formol consiste em verter 10 mL da amostra em tubo de ensaio e adicionar 1 mL de solução de floroglucina a 1% e 2 mL de solução de hidróxido de sódio a 10% e agitar (BRASIL, 1981; TRONCO, 2008; IAL, 2008). A positividade é comprovada quando do aparecimento de coloração salmão na amostra (BRASIL, 1981; TRONCO, 2008; IAL, 2008).

79

ANEXO 13

Metodologia adotada para execução de diluições seriadas

Para a obtenção de uma diluição de base 10, homogeneízam-se porções da amostra com o volume do diluente necessário para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume, ou peso, da amostra. Assim, a diluição 1:10 de uma amostra consiste em adicionar 1 mL da amostra em 9 mL de diluente, ou, 10 mL da amostra em 90 mL de diluente, e assim sucessivamente (BRASIL, 2003). Para a preparação da segunda diluição (10-2), deve-se transferir assepticamente 1 mL da primeira diluição para 9 mL de diluente. As demais diluições devem ser feitas de forma sucessiva similar à segunda (SILVA et al., 2001). No procedimento de análises de alimentos sólidos, a unidade analítica coletada deve ser homogeneizada, precedida de uma diluição inicial 1:10, para permitir diluição e inoculação nos meios de cultura (SILVA et al., 2001). De acordo com BRASIL (2003), a homogeneização das diluições é fundamental, sendo que a primeira diluição, em casos de amostras sólidas e pastosas, deve ser feita em aparelho “stomacher” por 30 segundos a 2 minutos; e as diluições subsequentes devem ser homogeneizadas com o auxílio de agitador de tubos, por um tempo não superior a 1 minuto. Além disso, sempre que for necessário inocular amostras líquidas sem as diluir, considerar que a amostra está diluída em 100. Para alimentos sólidos, normalmente, utilizam-se 10 ou 25 gramas, sendo tomadas amostras de vários pontos, de forma que a amostra seja representativa.

80

ANEXO 14

Técnicas de semeadura adotadas

A semeadura em profundidade consiste em inocular 1 mL de cada diluição nas placas de Petri estéreis, abrindo-as apenas o suficiente para a inserção da pipeta, próximo ao bico de Bunsen. Em seguida, verte-se 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem (APC), previamente fundido e resfriado a 45C. A homogeneização do inóculo com o meio de cultura deve ser feita com movimentação suave das placas, em círculos ou em formato de oito, de oito a dez vezes, nos sentido horário e anti-horário. Posteriormente à solidificação do ágar, invertem-se as placas e as incuba a temperatura específica para o microrganismo a ser pesquisado. Para a contagem das colônias, deve-se selecionar as placas com 25 a 250 colônias e contá-las com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. O cálculo do número de UFC’s por grama ou mL da amostra é calculado multiplicando-se o número de colônias contadas pelo inverso da diluição inoculada (SILVA et al., 2001). A semeadura em superfície consiste em selecionar três diluições da amostra e inocular 0,1 mL de cada diluição na superfície da placa de Petri previamente preparada com ágar específico. Usando uma alça de Drigalski, espalha-se o inóculo por todo o meio, até que o excesso do líquido seja absorvido. Após 15 minutos da inoculação, inverte-se a placa e submete-a a incubação de acordo com os microrganismos a serem pesquisados. A contagem é semelhante à efetuada quando da semeadura em profundidade, no entanto, multiplica-se o resultado por dez, tendo em vista que o inoculado neste caso é 10 vezes menor do que no caso anterior (SILVA et al., 2001). Já a semeadura por sobrecamada é feita inicialmente como na semeadura em profundidade adicionando-se, entretanto, uma nova camada de 10 ou 12 mL do ágar previamente utilizado, fundido e mantido a 46-48C, e incubá-lo após solidificação. Além deste método, é possível adicionar uma camada de ágar sobre semeadura em superfície (BRASIL, 2003).

81

ANEXO 15

Metodologia adotada para execução da Técnica de Número Mais Provável

O procedimento consiste em adicionar 1 mL da primeira diluição selecionada da amostra a cada um dos três tubos contendo o meio de cultura. Em seguida, repete-se esse processo com cada diluição selecionada, em função do grau de crescimento esperado e incubam-se os tubos em condições específicas de acordo com os microrganismos pesquisados (ROBERTS et al., 1995; SILVA et al., 2001; BRASIL, 2003).

82

ANEXO 16

Número Mais Provável por grama ou mL, para séries de três tubos com inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL e respectivos intervalos de confiança 95%.

Os intervalos de confiança 95% constantes das tabelas de NMP oferecem a informação de que, em pelo menos 95% das vezes, há a chance da concentração real do microrganismo alvo estar incluído no intervalo de confiança calculado para cada arranjo de tubos positivos.

Fonte: BRASIL, 2003.

83

ANEXO 17

Metodologia utilizada para contagem de coliformes termo-tolerantes

Fonte: SILVA et al., (2001).

TESTE CONFIRMATIVO DE E.COLI

TESTE CONFIRMATIVO DE COLIFORMES TERMO-

TOLERANTES

84

ANEXO 18

Metodologia utilizada para detecção de E. coli

Para a metodologia de NMP específica de E.coli, faz-se semeadura em tubos de lauril triptose – MUG (4-metil-umbeliferil-beta-D-glicuronídeo), a partir dos tubos EC positivos, usados no teste de NMP de coliformes a 45C. Em seguida, incubar as amostras a 35C por 20 horas e efetuar leitura em câmara de ultravioleta (UV), com emissão de luz em 366nm. Espera-se que a Beta-glucoronidase da E.coli, quando presente hidrolise o MUG (incolor) liberando o composto 4 – metilumbeliferona, que é fortemente fluorescente. Após a leitura da fluorescência, adiciona-se o reativo de Kovacs para verificar a produção de Indol, onde, o aparecimento de coloração vermelho na camada do álcool isoamílico representa uma reação positiva. Considera-se presença de E.coli nos tubos positivos para fluorescência e Indol. Calcula-se o NMP a partir da tabela (BRASIL, 1993).

85

ANEXO 19

Metodologia utilizada para isolamento de Salmonella sp.

Fonte: Silva et al., 2001.

86

ANEXO 20

Metodologia utilizada para identificação de Salmonella sp

Fonte: Silva et al., 2001.

87

ANEXO 21

Metodologia adotada para pesquisa de clostrídios sulfito-redutores

Fonte: Silva et al., 2001.

88

ANEXO 22

Metodologia adotada para isolamento de Listeria sp (BRASIL, 2003)

Homogeneizar 25 g de cada amostra assepticamente em 225 mL de caldo para enriquecimento de Listeria e incubar a 30º C ± 1º C. Após 24h, transferir alíquotas de 0,1 mL para tubos com 9 mL de caldo Fraser e incubar a 30º C ± 1º C/24-48h. Tubos que apresentarem resultado positivo devem ser semeados em ágar Oxford e em ágar Triptose com acido nalidíxico (ATN), e incubados a 30ºC ± 1º C/24-48h. As colônias que se apresentarem cinza azuladas no Agar ATN, quando observadas sob incidência de luz oblíqua e enegrecidas no Oxford, devem ser re-isoladas em Agar triptose e incubadas 30º C ± 1º C/24h. Colônias características são repicadas em ágar estoque, que é um Agar nutriente fosfatado, utilizado para manutenção de cepas, e incubar a 30º C ± 1º C/24h.

89

ANEXO 23

Metodologia adotada para confirmação da presença de Listeria sp (BRASIL,2003)

Repicar o mesmo inóculo para tubos com ágar estoque inclinado e para placas contendo ATN. Incubar a 30 ± 1ºC por 24 horas. Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do ágar estoque para a realização das provas de confirmação e identificação.

a) Prova da catalase: Em uma placa de petri, depositar uma gota de

peróxido de hidrogênio 3%. Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro,

palito de madeira ou pipeta de Pasteur, retirar uma alíquota do cultivo e

misturar com a gota do reagente. A presença de catalase se traduz por

desprendimento de borbulhas de oxigênio (catalase positiva). Das culturas

catalase positivas, fazer um esfregaço para coloração de Gram.

b) Coloração de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete

curto ou na forma de cocobacilo, Gram positivo.

c) Prova da motilidade típica: Inocular uma alíquota da cultura em ágar motilidade, com agulha, por picada. Incubar em estufa de demanda biológica de oxigênio. (B.O.D) a 22-25°C por dois a cinco dias. Após incubação, verificar o tipo de crescimento. A Listeria sp apresenta crescimento móvel característico em forma de guarda-chuva.

c) Prova de redução de nitrato: Após a leitura da motilidade,

adicionar a cada tubo duas a três gotas de alfa-naftilamina 0,5% e duas a três

gotas de ácido sulfanílico a 0,8%. O aparecimento de coloração rosa indica

positividade. Quando não houver desenvolvimento de coloração, adicionar

ao meio alguns miligramas de pó de zinco. Nesse caso, o aparecimento de

coloração rosa indica reação negativa e a não alteração de cor indica

positividade. As culturas de Listeria sp não reduzem o nitrato.

90

ANEXO 24

Metodologia adotada para pesquisa Staphylococcus aureus

Fonte: Silva et al., 2001.

91

ANEXO 25

Número e Porcentagem de surtos de toxi-infecção alimentar notificados nos Estados Unidos da América, de acordo com a etiologia.

Fonte: CDC, 2010.