Importância do Complexo Mediador na Actividade Transcricional do ...

Ana Rita Ladeira Courelas da Silva

Licenciada

Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade

Transcricional do Yap8

Dissertaccedilatildeo para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em

Geneacutetica Molecular e Biomedicina

Orientadora Regina Menezes Doutora ITQBUNL

Co-orientadora Claudina Rodrigues-Pousada Professora Doutora ITQBUNL

Setembro de 2011

Juacuteri

Presidente Prof Doutor Joseacute Paulo Sampaio Arguente Prof Doutor Adriano Henriques Vogal Doutora Regina Menezes Vogais


Licenciada







Setembro de 2011

Juacuteri


Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade Transcricional do Yap8

Copyright Ana Rita Ladeira Courelas da Silva FCTUNL UNL

A Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tecircm o direito perpeacutetuo e sem

limites geograacuteficos de arquivar e publicar esta dissertaccedilatildeo atraveacutes de exemplares impressos

reproduzidos em papel ou de forma digital ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser

inventado e de a divulgar atraveacutes de repositoacuterios cientiacuteficos e de admitir a sua coacutepia e distribuiccedilatildeo

com objectivos educacionais ou de investigaccedilatildeo natildeo comerciais desde que seja dado creacutedito ao autor

e editor

O trabalho aqui descrito foi desenvolvido no

Laboratoacuterio Genomics and Stress Instituto de

Tecnologia Quiacutemica e Bioloacutegica Universidade

Nova de Lisboa

i

Agradecimentos

Eacute com enorme satisfaccedilatildeo que exponho aqui o meu sincero agradecimento a todos aqueles que tornaram

possiacutevel a realizaccedilatildeo deste trabalho

Em primeiro lugar venho expressar os meus agradecimentos agrave Professora Doutora Claudina Rodrigues-

Pousada co-orientadora deste trabalho por ter-me recebido no seu laboratoacuterio e por ter acreditado nas

minhas capacidades

Em segundo lugar um profundo agradecimento agrave Doutora Regina Menezes pela excelecircncia na orientaccedilatildeo

cientiacutefica leccionaccedilatildeo apoio e disponibilidade em todos os momentos

Aos meus Pais pelo apoio incondicional

Ao Andreacute por toda a compreensatildeo e amor

Agrave Soraia por todas as dicas uacuteteis e amizade

Aos meus colegas do laboratoacuterio Genomics and Stress pelo excelente conviacutevio o que me proporcionou uma

enorme satisfaccedilatildeo em desenvolver este trabalho neste laboratoacuterio

Aos meus amigos Daniel e Carina pelos cafeacutes e conversas que tanto me ajudaram a aliviar o cansaccedilo

ii

iii

Sumaacuterio

Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da

expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que

facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O

complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como

em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos

transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute

responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em

Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao

stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo

transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da

membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz

a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo

Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do

complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na

ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute

drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a

subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem

disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de

trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2

Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo

iv

v

Abstract

The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression

This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and

mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator

complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this

complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal

transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a

positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal

role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates

transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma

membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8

induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in

this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator

tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective

subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was

shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the

activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of

Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2

Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription

vi

vii

Iacutendice Geral

1 Introduccedilatildeo 1

11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1

12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2

13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2

14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5

15 O complexo Mediador 7

16 Objectivos 12

2 Materiais e Meacutetodos 13

21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13

22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14

23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17

24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17

25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18

26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18

27 Ensaio de Two-hybrid 18

28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20

210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21

3 Resultados e Discussatildeo 23

31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos

compostos de arseacutenio 23

32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo

interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25

33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do

Yap8 27

34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29

viii

35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula

ao stress pelos compostos de arseacutenio 33

36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo

do Yap8 35

37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave

destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36

4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39

5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41

ix

Iacutendice de Figuras

Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4

Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5

Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo

do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7

Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o

complexo Mediador 9

Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da

transcriccedilatildeo 10

Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11

Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por

arseacutenio 24

Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a

expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26

Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28

Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do

Yap8 29

Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30

Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31

Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32

Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33

Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido

pelos compostos de arseacutenio 34

Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-

activaccedilatildeo do Yap8 36

Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37

Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40

x

xi

Iacutendice de Tabelas

Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13

Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15

Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16

xii

xiii

Listagem de Abreviaturas e Siglas

As(V) ndash arsenato

As(III) ndash arsenito

HSF ndash Heat shock factors

HSP ndash Heat shock proteins

STRE ndash Stress responsive element

PKA ndash proteiacutena cinase A

YRE ndash Yeast responsive elements

YAP ndash yeast AP-1 like proteins

ACR ndash Arsenic compounds resistance

NES ndash Nuclear export signal

Cys ndash Cisteiacutena

YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1

GSH ndash glutationo reduzido

ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio

TBP ndash TATA-Binding protein

RNA Pol II ndash RNA polimerase II

Med ndash Mediador

CTD ndash Domiacutenio C-terminal

YPD ndash Yeast peptone dextrose

MSC ndash Meio sinteacutetico completo

SD ndash drop-out

CAA ndash casaminoaacutecidos

YNB ndash Yeast nitrogen base

LB ndash Luria Bertani

dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos

Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina

Trp ndash Triptofano

UV ndash ultra-violeta

TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico

EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico

PVDF - polyvinylidene fluoride

L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas

ordmC ndash graus Celsius

DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros

microL ndash microlitro

min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma

microg ndash micrograma

nm ndash nanoacutemetros

mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts

WT ndash Wild type (estirpe selvagem)

Yap ndash Proteiacutena

YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1

1 Introduccedilatildeo

11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede

O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na

natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de

compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses

tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica

Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais

criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)

O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)

(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito

satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem

devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do

cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado

como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas

Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o

arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de

electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito

utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros

conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio

orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado

(Bhattacharjee e Rosen 2007)

A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o

cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)

Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do

Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona

outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e

respiratoacuterias (Vahter 2009)

Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo

fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia

promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas

canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade

microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006

Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-

-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas

2

causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray

2004 Barrett et al 2003)

Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma

caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que

modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao

niacutevel molecular

12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico

A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo

modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em

ceacutelulas de eucarioacutetas superiores

Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos

geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento

relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente

com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande

quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O

facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo

cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas

superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes

(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como

modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi

demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como

rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com

doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto

que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo

relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos

como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos

toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)

13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap

A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute

um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares

responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente

3

plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este

tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)

Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae

desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da

expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que

codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas

moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de

transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas

envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas

(Rodrigues-Pousada et al 2010)

Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat

Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a

expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de

proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de

azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem

a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados

negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-

Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)

No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a

reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress

depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes

regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores

da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta

famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA

apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de

S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-

ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela

interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura

12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo

activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)

Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre

os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de

ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem

sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6

reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia

4

TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al

resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)

Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4

(adaptado de httphigheredbcswileycom)

Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao

stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao

stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e

nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de

toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na

destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7

ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem

funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a

activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o

Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz

de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo

(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica

em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais

DNA

Diacutemero de Gcn4

5

Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap


14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio

Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios

mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por

proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O

gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente

localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de

arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132

Cys137

e

Cys274

e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da

importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo

entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do

Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que

6

codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente

(Menezes et al 2004)

Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de

arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal

regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para

uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo

(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na

manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes

antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -

glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)

Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de

importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes

dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen

2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado

trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este

motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto

na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela

aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)

Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato

sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no

vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura

13) (Menezes et al 2008)

Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado

trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees

natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O

arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a

inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos

de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou

et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que

satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas

A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente

com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no

citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das

proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+

+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe

2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam

lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano

7

et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro

acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do

ferro

Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e

destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)

15 O complexo Mediador

A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos

factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA

mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado

pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os

factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios

para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem

destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da

cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo

O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo

preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos

cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras

da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem

pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este

eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o

iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)

A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-

se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de

As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8

ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a

maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais

(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento

da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA

polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o

seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)

O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila

domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas

(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14

Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O

moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31

transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de

transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e

transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e

para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e

Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas

subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por

CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do

Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro

moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)

A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes

sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al

2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995

Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador

encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila

interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de

transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo

aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA

polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal

(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a

sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi

demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA

polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-

iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto

o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH

permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que

9

vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)

(Chadick e Asturias 2005)


complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)

As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-

Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma

actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta

ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo

pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al

2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio

intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase

II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode

exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a

activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al

2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8

em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo

Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila

Domiacutenio Cdk8

10

consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira

que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de

inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica


transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)

A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de

humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos

em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como

na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador

(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem

DNA-factor de transcriccedilatildeo

Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF

Complexo de preacute-

iniciaccedilatildeo fechado


iniciaccedilatildeo aberto

Elongaccedilatildeo da

transcriccedilatildeo

Re-iniciaccedilatildeo

da


Complexo de

preacute-iniciaccedilatildeo

11

sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai

et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos

reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os

mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em

S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o

moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A

cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as

interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo

da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que

quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de

transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene

CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene

Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por

computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida

por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)

Humano Humano Levedura Levedura

Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos

Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do

Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento

da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em

resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a

caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2

Assim pretendeu-se

1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular

ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio

2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2

3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8

4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do

Mediador

5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da

levedura ao stress pelo arseacutenio

6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8

13

2 Materiais e Meacutetodos

21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento

As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os

inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)

[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2

(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)

casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)

uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)

(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-

outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina

002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina

015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo

com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1

endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi

usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas

celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)

extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados

neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa

concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente

Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo

Estirpe Genoacutetipo Referecircncia

W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006

DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100

lys2 med14-100 Leroy et al 2006

BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF

BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30

YDL005ckanMX4 EUROSCARF


YGL025ckanMX4 EUROSCARF


YGL151wkanMX4 EUROSCARF


YOL051wkanMX4 EUROSCARF


YNL236wkanMX4 EUROSCARF

14

Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)

Estirpe Genoacutetipo Fonte

Y190

MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101

trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ

LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3

URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz

Clontech

SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-

901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010

PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-

901 lys2-80 Mel- med12kanMX4

Shahi et al 2010



Shahi et al 2010

PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-

901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4

Shahi et al 2010

PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-

901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1

Shahi et al 2010

22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho

Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados

e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5

MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe

BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8

utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de

cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion

(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no

termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante

1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC

(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o

tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC

15

Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho

Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo

ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para

Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo

YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para

Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo

U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para

Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo

MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo

GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo

MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo

GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo

MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo

GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo

MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo

GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo

MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo

GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo

YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo

GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo

YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo

GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo

YAP8

5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-

c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo

MED2

5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)

Construccedilatildeo

MED2-HA

5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)

5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag

attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo

(MED2HA_FW)

5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg

tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo

(MED2HA_RV)

16

Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho

Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte

pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com

HA 2micro (GAD-HA) Clontech

pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado

com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech

pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo





pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo

pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo

pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993

pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo

publicado

YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo

pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo

lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado

com YAP8 Menezes et al 2004

pRS416 CEN Stratagene

YEplac195 2micro Stratagene

Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator

(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2

utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas

separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e

A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um

novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos

plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC

e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng

do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England

Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC

e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por

choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram

adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl

25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram

incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g

17

Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em

meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram

incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram

inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos

plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a

anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados

23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura

Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a

30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x

107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute

alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107

ceacutelulasmL As

suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas

vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo

TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi

ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo

Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo

PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas

foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a

3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram

plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h

24 Anaacutelises fenotiacutepicas

Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram

efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram

diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados

novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x

107

ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas

foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com

Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2

(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram

incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi

monitorizado apoacutes 48h

18

25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido

Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio

de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002

triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a

DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo

de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume

foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas

foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-

3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido

(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio

(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram

incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul

26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido

As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees

celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600

entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela

adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min

e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos

tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas

foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo

de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido

(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela

A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada

a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio

Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a

determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula

ndash

onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo

27 Ensaio de Two-hybrid

A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o

domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do

Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-

19

Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e

agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC

As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-

Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e

centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a

monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito

na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o

volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas

foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente

descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul

28 Northern-Blot

As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram

diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O

stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As

culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de

fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)

Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de

vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a

4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10

min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de

etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras

foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol

70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de

aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho

Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a

65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc

5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de

bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel

de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-

75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida

MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o

padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a

integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua

bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de

20

transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM

(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)

Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e

novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave

membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10

mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no

rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-

se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22

As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com

o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees

do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE

Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de

soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a

noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram

utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa

cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas

utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma

nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das

membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os

sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em

httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot

As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC

com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo

meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura

e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo

durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas

com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e

novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro

igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a

15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a

15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl

625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol

001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet

21

foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e

as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais

foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl

375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia

005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-

Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)

As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot

sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se

papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04

Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de

PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel

3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10

mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada

com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A

membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a

4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o

anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz

Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas

condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum

Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi

utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax

MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram

manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das

proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com

peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e

revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para

normalizar os niacuteveis de proteiacutena

210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo

As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos

plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC

com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As

culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram

recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram

incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas

22

com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram

adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA

2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas

foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a

15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada

como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram

incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc

conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com

tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC

durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo

de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de

agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o

sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10

[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005

tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos

durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell

durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para

membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se

agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal

intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das

proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no

ponto 29

23

3 Resultados e Discussatildeo


compostos de arseacutenio

O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os

reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob

stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo

transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No

entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de

transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo

A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar

a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores

mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S

cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al

2010)

Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na

adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios

fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes

para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na

figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda

do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de

arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo

dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e

Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al

2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que

codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao

arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress

induzido por este metaloacuteide

24


arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial

foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em

meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4

20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a

30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico

med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas 37ordmC 08M

NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25

O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode

concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de

arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura

do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador

(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias

2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador

participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos


Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador

para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos

na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio

cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da

cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade

Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser

dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da

actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress

osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e

cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15

Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao

arseacutenio

32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do

Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena

O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio

uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de

destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o

Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress

induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as

subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus

genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por

Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel

de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a

estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos

niacuteveis de ACR2

26


expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento

exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito

na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA

do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a

construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de

Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como

controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas

0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI

BY4742 med2 med3 med5

med15 med16 BY4742

W303 med14

As(V) Fisio As(V) Fisio

Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27

Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades

da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus

genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave

reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo

foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas

estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-

blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente

influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de

mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado

pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis

de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para

permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as

mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8

33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-

activaccedilatildeo do Yap8

Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis

de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma

consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de


Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e

nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da

sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da

proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o

operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste

caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a

construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo

repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade

da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26

28

Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish

et al 2000)

Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute

induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al

2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do

gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem

reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16

que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando

comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior

sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o

mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes

resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada

pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene

ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio

lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que

natildeo transcrevem

o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de

ligaccedilatildeo LexA

Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12

Actividade Relativa da β-Galactosidase

Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo

do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio

SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado

com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como

descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da

actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h

com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas

34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8

Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos

factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e

Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e

o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer

contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador

Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A

estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica

entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios

de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo

de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou

com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor

transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias

UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi

BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30

co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD

pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio

de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi

monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-

Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25

Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)

Domiacutenio de Ligaccedilatildeo

ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4

YAP8 MED


iniciaccedilatildeo

Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas

1 Transformaccedilatildeo em leveduras

2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-

LEU- com e sem arsenato

4 Adiccedilatildeo de x-Gal

LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem

Interacccedilatildeo

(2)

Com


31

Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas

ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que

reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2

do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o

Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a

coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer

interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2

estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento

estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8

Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-

expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED

foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado

com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e

meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas

Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid

foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para

monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees

proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo

desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y

estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)

Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32

Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As

proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave

imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e

meacutetodos (figura 37)

Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo

Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o

anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado

no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena

Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os

resultados obtidos no ensaio de two-hybrid

Proteiacutenas

totais

Incubaccedilatildeo com esferas de agarose

com proteiacutena A conjugada com

anticorpo anti-c-Myc

Imunoprecipitaccedilatildeo

lavagem e eluiccedilatildeo das

proteiacutenas de interesse

Anaacutelise por Western-

blotting utilizando o

anticorpo anti-HA

33

Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-

MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando

esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo

35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da

levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio

O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress

por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o

proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este

moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e

a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular

o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que

depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em

leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo

Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do

gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)

De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do

complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios

fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do

Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8

desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de

arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece

regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio

Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34

Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress

induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico

completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e

plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)

20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas

a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico

Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das

subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A

eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo

choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere

uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve

regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade

As(III)

As(V) Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35

Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress

estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses

gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes

36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-


Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress

por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo

seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do

Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma

alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e

cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter

lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e

meacutetodos

Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute

semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100

nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta

subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor

de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule

negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na

activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress

induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia

das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica

podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta

celular comum

36

0 5 10 15 20


Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de

trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram

incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em

meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi

efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise

quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial

induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash

condiccedilotildees fisioloacutegicas


destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2

As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades

da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de

transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o

comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress

imposto pelos compostos de arseacutenio

De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a

estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-

Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas

proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311

mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas

embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o

Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees

fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade

A B

SEY6210lt lexAYAP8gt

med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37

Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8

desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-

Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4

(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc

e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-

Consiccedilotildees fisioloacutegicas

Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve

haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8

parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis

de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da

CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o

seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar

presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento

da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao

niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o

Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios

de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo

O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena

eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico

mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos

de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo

Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39

4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais

O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por

factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de

transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo

transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de

nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do

complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a

regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito

regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e

degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)

Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a

transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado

que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos

compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram

eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2

em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste

metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo

provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees

fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de

transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de

transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades

do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura

39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades

Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8

como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador

atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os

diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos

interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador

Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade

do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em

condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando

estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio

ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o

aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo

Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a

40

concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre

o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)

Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo

De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e

estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores

remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios

de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14

cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-

traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade

41

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Licenciada







Setembro de 2011

Juacuteri









e editor




Nova de Lisboa

i

Agradecimentos





minhas capacidades









ii

iii

Sumaacuterio





















iv

v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

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med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

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med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















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26









0

20

40

60

80

100

AC

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3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

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αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


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(2)

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Coloacutenias que

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29

0 2 4 6 8 10 12























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med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

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(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

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-

- YAP8

MED2

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MED14

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YAP8

32











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33























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-Myc

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Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

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Fisioloacutegicas

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700microM

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35













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36

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38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






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Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399





















e editor




Nova de Lisboa

i

Agradecimentos





minhas capacidades









ii

iii

Sumaacuterio





















iv

v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

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GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



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Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



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(MED2HA_FW)



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























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19











28 Northern-Blot
























20





















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21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







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W303

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Condiccedilotildees

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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399

















Nova de Lisboa

i

Agradecimentos





minhas capacidades









ii

iii

Sumaacuterio





















iv

v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

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Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

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med15

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BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

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YA

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αSbaI


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Fisio As(V)

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27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

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LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


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Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


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lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

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Sem


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Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

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YAP8

32











Proteiacutenas

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33























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-Myc

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-

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-

Med2-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

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mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














i

Agradecimentos





minhas capacidades









ii

iii

Sumaacuterio





















iv

v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





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xiii


















Med ndash Mediador




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Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






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mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

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1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





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+ H2O2 HO + HO

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+ O2- O2

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As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

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GSH

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Acr3

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ADP+Pi

Hxt

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Pho87

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8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

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Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

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TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

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Frente

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12

16 Objectivos






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14



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Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



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15























YAP8



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16
















publicado






















17












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107







18



























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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







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W303

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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Fisioloacutegicas

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

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27





























28


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Plasmiacutedeo

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LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

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Nuacutecleo

Meio de Cultura com

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Coloacutenias que


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Coloacutenias que

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0 2 4 6 8 10 12























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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

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MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

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-Myc

Med16-HA

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-

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-

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

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cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














ii

iii

Sumaacuterio





















iv

v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

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min ndash minuto

mg ndash miligrama

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mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

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7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




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14



Y190





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Shahi et al 2010



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15























YAP8



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

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100

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20

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YA

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Fisio As(V)

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27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

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(1) (2)

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Sem


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Com


31





















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-

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YAP8

32











Proteiacutenas

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33























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-

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-

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34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

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SEY6210

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SEY6210

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

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1mM

CoSO4

A

B

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mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














iii

Sumaacuterio





















iv

v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














iv

v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

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As(III)-3GS

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Hxt

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Pho87

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Pho84

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Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

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2

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med2

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mM

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


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CdCl2

700microM

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1mM

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W303

B

A

25




















arseacutenio













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26









0

20

40

60

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20

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YA

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αSbaI

27





























28


et al 2000)













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Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


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lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























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med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

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med15lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

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(1) (2)

(1) (1)

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31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

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YAP8

32











Proteiacutenas

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33























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ap8-c

-Myc

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Med14-HA

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-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

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mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














v

Abstract



















vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

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GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

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Pho84

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Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

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mM

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BY4742

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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700microM

H2O2

1mM

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

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20

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YA

P8

U3

B

A

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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

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W303lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

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(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

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cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














vi

vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




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mg ndash miligrama

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mM ndash milimolar

M ndash molar

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YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










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e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

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3+

Fe3+

+ O2- O2

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7



ferro





















As(III)

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GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

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1

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BY4742

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1mM

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

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100

AC

R2U

3

0

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YA

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U3

B

A

C

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αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














vii

Iacutendice Geral







16 Objectivos 12









28 Northern-blot 19

29 Western-blot 20








Yap8 27


viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

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med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

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YA

P8

U3

B

A

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αSbaI


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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

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27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

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med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














viii




do Yap8 35





ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

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ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

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Pho84

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Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

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15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

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med15

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BY4742

mM

med2

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BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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1mM

CoSO4

BY4742

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

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0

20

40

60

80

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YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

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W303lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














ix







complexo Mediador 9





arseacutenio 24





Yap8 29











x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




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mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

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7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

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med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

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Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

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cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














x

xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






L- litro

mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

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med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

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MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

37ordmC 20microM

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700microM

H2O2 08M

NaCl

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CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











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36

0 5 10 15 20

























A B


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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

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Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














xi





xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

Leu ndash Leucina






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mL ndash mililitro

xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

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+ O2- O2

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7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



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16
















publicado






















17












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107







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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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05

1

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15

2

2

As(V)

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Fisioloacutegicas

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B

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25




















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26









0

20

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AC

R2U

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YA

P8

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B

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αSbaI

27





























28


et al 2000)













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Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

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o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

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Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























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W303lt lexAYAP8gt

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med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









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iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

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Sem


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31





















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-

- YAP8

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YAP8

32











Proteiacutenas

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33























Med2-HA Y

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-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

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34













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Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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med12

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SEY6210

med12

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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B

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mM

35













meacutetodos











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36

0 5 10 15 20

























A B


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37






















Med2-HA

αSbaI

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αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














xii

xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

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xiv

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V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





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+ H2O2 HO + HO

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+ O2- O2

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7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





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Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













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YAP8



MED2



MED2-HA




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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

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15

2

2

As(V)

As(III)

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NaCl 20microM

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W303

B

A

25




















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niacuteveis de ACR2

26









0

20

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AC

R2U

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YA

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B

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αSbaI

27





























28


et al 2000)













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Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

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Nuacutecleo

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Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


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lacZ

29

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A B Fisio As(V)

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30









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LacZ

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(1) (2)

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Sem


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31





















Fisio As(V)

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-

- YAP8

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YAP8

32











Proteiacutenas

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33























Med2-HA Y

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Med16-HA

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-

IP IN

-

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Yap

8-c

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34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

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SEY6210

med12

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SEY6210

med12

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

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1mM

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A

B

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mM

35













meacutetodos











celular comum

36

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A B


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37






















Med2-HA

αSbaI

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Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














xiii


















Med ndash Mediador




SD ndash drop-out





Ura ndash Uracilo

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xiv

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YAP ndash Gene

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1



































2
































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4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

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+ H2O2 HO + HO

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7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

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As(III)

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Vacuacuteolo

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GSH

As(III)-3GS

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ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

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Pho84

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Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






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13




































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Y190





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Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



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YAP8



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







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W303

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

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NaCl 20microM

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1mM

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

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AC

R2U

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YA

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B

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27





























28


et al 2000)













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Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

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x-Gal

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(1)

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lacZ

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0 2 4 6 8 10 12























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A B Fisio As(V)

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30









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(1) (2)

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-

- YAP8

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YAP8

32











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33























Med2-HA Y

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-Myc

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Med14-HA

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-

IP IN

-

Med2-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

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med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














xiv

h ndash horas




min ndash minuto

mg ndash miligrama

ng ndash nanograma



mM ndash milimolar

M ndash molar

V ndash volts



YAP ndash Gene

yap ndash Mutante

1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














1



































2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

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GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

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BY4742

mM

med2

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BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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1mM

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BY4742

med2

med3

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

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αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


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Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

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YAP8

32











Proteiacutenas

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33























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-Myc

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-

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-

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














2
































3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

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7



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As(III)

As(V)

As(III)

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As(III)

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Vacuacuteolo

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GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













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YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

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mM

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BY4742

mM

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


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CoSO4

BY4742

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med3

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

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100

AC

R2U

3

0

20

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100

YA

P8

U3

B

A

C

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αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

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αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

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-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

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Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

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1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














3




































4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

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GSH

As(III)-3GS

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Acr3

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ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



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15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

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2

2

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BY4742

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Condiccedilotildees


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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

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AC

R2U

3

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YA

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B

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αSbaI


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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

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x-Gal

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o lacZ

Coloacutenias que

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lacZ

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Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

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0 2 4 6 8 10 12























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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














4


















DNA

Diacutemero de Gcn4

5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

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MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

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34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














5










Cys137

e

Cys274





6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



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As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

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Vacuacuteolo

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GSH

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Hxt

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Pho87

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8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

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BY4742

mM

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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1mM

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W303

B

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25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

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R2U

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20

40

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YA

P8

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B

A

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αSbaI


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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













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Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

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Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

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Meio de Cultura com

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o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

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Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

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med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

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Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

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SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














6



































+ H2O2 HO + HO

- + Fe

3+

Fe3+

+ O2- O2

+ Fe



7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

As(V)

As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

As(III)-3GS

Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































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Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

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mM

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BY4742

mM

med2

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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CoSO4

BY4742

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

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med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

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1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














7



ferro





















As(III)

As(V)

As(III)

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As(III)

As(III)

Vacuacuteolo

As(III)

GSH

As(III)-3GS

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Acr3

ATP

ADP+Pi

Hxt

Fps1

Pho87

Ycf1

Acr2

Pho84

Pho89

Pho86

Pho90

8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



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(MED2HA_FW)



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























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19











28 Northern-Blot
























20





















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21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

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1

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2

As(V)

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


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B

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25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

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AC

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0

20

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YA

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B

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αSbaI


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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

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et al 2000)













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Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

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(1)

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BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














8





































9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

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BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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37ordmC 20microM

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A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














9


















Domiacutenio Cdk8

10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

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mM

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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B

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25




















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26









0

20

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R2U

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YA

P8

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B

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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

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Meio de Cultura com

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o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

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Hiacutebrido

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Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









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iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

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Med16-HA

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-

IP IN

-

Med2-HA

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Yap

8-c

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34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

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SEY6210

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SEY6210

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37ordmC 20microM

CdCl2

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H2O2 08M

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CoSO4

A

B

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35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














10










(i) (ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

Montagem


Complexo fechado

Mediador-DNA

Montagem RNA

Pol II-promotor

Recrutamento

RNA Pol II-

TFIIF








da


Complexo de


11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































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Y190





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Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



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YAP8



MED2



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16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

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W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

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1

1

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2

2

As(V)

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Condiccedilotildees

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NaCl 20microM

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BY4742

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

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YA

P8

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B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

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transcrevem o

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Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

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W303lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

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Sem


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Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









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33























Med2-HA Y

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Med16-HA

Med14-HA

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-

IP IN

-

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Med14-HA

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Yap

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-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

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SEY6210

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cycC

cdk8

SEY6210

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

CdCl2

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A

B

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35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

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αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














11

















Anterior Direita

Esquerda

Frente

Posterior

12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



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Shahi et al 2010



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16
















publicado






















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107







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19











28 Northern-Blot
























20





















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21



































22






















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24







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W303

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B

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25




















arseacutenio













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26









0

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R2U

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0

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YA

P8

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B

A

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αSbaI


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Fisio As(V)

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αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

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(1)

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29

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BY4748lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

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-

IP IN

-

Med2-HA

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Yap

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34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

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35













meacutetodos











celular comum

36

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A B


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med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














12

16 Objectivos






Assim pretendeu-se






Mediador




13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




(MED2HA_FW)



(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

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αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














13




































14



Y190





Clontech





Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010













15























YAP8



MED2



MED2-HA




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(MED2HA_RV)

16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















107







18



























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19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







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W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

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25




















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26









0

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R2U

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αSbaI

27





























28


et al 2000)













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Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

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Meio de Cultura com

x-Gal

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o lacZ

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Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

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29

0 2 4 6 8 10 12























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30









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31





















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-

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33























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Yap

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34













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38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














14



Y190





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Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



Shahi et al 2010



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15























YAP8



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16
















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17












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24







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25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

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AC

R2U

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0

20

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YA

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B

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27





























28


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31





















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-

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33























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37ordmC 20microM

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700microM

H2O2 08M

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A

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meacutetodos











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36

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A B


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37






















Med2-HA

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SEY6210 cycC cdk8

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αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














15























YAP8



MED2



MED2-HA




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16
















publicado






















17












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107







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19











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20





















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21



































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ponto 29

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2010)














24







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W303

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

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1

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B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

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100

AC

R2U

3

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20

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100

YA

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B

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27





























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31





















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-

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Fisioloacutegicas

05 1 15

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SEY6210

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700microM

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NaCl

1mM

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A

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35













meacutetodos











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36

0 5 10 15 20

























A B


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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

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αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














16
















publicado






















17












ceacutelulasmL As















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19











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20





















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23














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B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

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AC

R2U

3

0

20

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YA

P8

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B

A

C

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αSbaI


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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

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Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


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Hiacutebrido

(1)

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29

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A B Fisio As(V)

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30









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LacZ

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(1) (2)

(1) (1)

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Sem


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Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

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-

- YAP8

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YAP8

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Proteiacutenas

totais









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33























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-

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Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














17












ceacutelulasmL As















107







18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

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29

0 2 4 6 8 10 12























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med2lt lexAYAP8gt

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med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














18



























ndash






19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

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med15

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BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

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med15

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med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

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Coloacutenias que

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Local de


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29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

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med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














19











28 Northern-Blot
























20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

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mM

med2

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med5

med15

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BY4742

mM

med2

med3

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med15

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BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

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BY4742

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med3

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

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αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

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lacZ

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o lacZ

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Hiacutebrido

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Local de


Gene Reporter

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29

0 2 4 6 8 10 12























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med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

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MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

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SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














20





















httprsbwebnihgovij

29 Western-Blot













21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

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mM

med2

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BY4742

mM

med2

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BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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BY4742

med2

med3

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

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lacZ

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Hiacutebrido

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lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

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med15lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














21



































22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

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med15

med16

BY4742

mM

med2

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BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


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CoSO4

BY4742

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med3

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med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

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(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

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MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









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33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

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Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

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A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














22






















ponto 29

23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

As(III)

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

med16

BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


NaCl 20microM

CdCl2

700microM

H2O2

1mM

CoSO4

BY4742

med2

med3

med5

med15

med16

med14

W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

60

80

100

YA

P8

U3

B

A

C

Yap8-c-Myc

αSbaI


med15 med16 BY4742

W303 med14


Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























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med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

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CdCl2

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A

B

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mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














23














2010)














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

As(V)

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med15

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BY4742

mM

med2

med3

med5

med15

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BY4742

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees


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CoSO4

BY4742

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med3

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W303

B

A

25




















arseacutenio













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26









0

20

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60

80

100

AC

R2U

3

0

20

40

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80

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YA

P8

U3

B

A

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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

27





























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et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

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Hiacutebrido

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Local de


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29

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med2lt lexAYAP8gt

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med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

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-

- YAP8

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33























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-

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-

Med2-HA

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Yap

8-c

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34













As(III)


Fisioloacutegicas

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Fisioloacutegicas

05 1 15

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med12

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SEY6210

med12

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SEY6210

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A

B

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mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














24







med14

W303

med14

W303

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05

05

1

1

15

15

2

2

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mM

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Fisioloacutegicas

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W303

B

A

25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

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100

AC

R2U

3

0

20

40

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100

YA

P8

U3

B

A

C

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αSbaI


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Fisio As(V)

Yap8-c-Myc

αSbaI

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et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

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lacZ

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med2lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

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(1) (2)

(1) (1)

(2)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

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-

- YAP8

MED2

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YAP8

32











Proteiacutenas

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33























Med2-HA Y

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-Myc

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-

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-

Med2-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

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cycC

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Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

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A

B

mM

mM

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meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

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cycClt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














25




















arseacutenio













niacuteveis de ACR2

26









0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

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YA

P8

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B

A

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αSbaI


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Fisio As(V)

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αSbaI

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et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

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lacZ

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Meio de Cultura com

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Local de


Gene Reporter

lacZ

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0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

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med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

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-

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-

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Yap

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As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

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SEY6210

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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37ordmC 20microM

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700microM

H2O2 08M

NaCl

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A

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meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

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40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














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0

20

40

60

80

100

AC

R2U

3

0

20

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YA

P8

U3

B

A

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αSbaI


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W303 med14


Fisio As(V)

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αSbaI

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lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

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LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

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Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

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Local de


Gene Reporter

lacZ

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

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-

IP IN

-

Med2-HA

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Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














27





























28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

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Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

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Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

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0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

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W303lt lexAYAP8gt

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A B Fisio As(V)

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30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

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Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

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-

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-

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Yap

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As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

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cdk8

SEY6210

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

H2O2 08M

NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














28


et al 2000)













lexA-YAP8

Plasmiacutedeo

Reporter

(2)

LexAYap8

Complexo Mediador

Transcrito de

lacZ

Nuacutecleo

Meio de Cultura com

x-Gal

Coloacutenias que


o lacZ

Coloacutenias que

transcrevem o

lacZ

Plasmiacutedeo

Hiacutebrido

(1)

Local de


Gene Reporter

lacZ

29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

med3lt lexAYAP8gt

med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

cycC

cdk8

37ordmC 20microM

CdCl2

700microM

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NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















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133 689-693





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Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














29

0 2 4 6 8 10 12























BY4748lt lexAYAP8gt

med2lt lexAYAP8gt

W303lt lexAYAP8gt

med5lt lexAYAP8gt

med15lt lexAYAP8gt

med16lt lexAYAP8gt

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med14lt lexAYAP8gt

A B Fisio As(V)

Fisio As(V)

30









YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

cdk8

SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

med12

med13

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37ordmC 20microM

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700microM

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NaCl

1mM

CoSO4

A

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mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















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133 689-693





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Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


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YAP8 MED


iniciaccedilatildeo






LacZ

LacZ LacZ mRNA

(1) (2)

(1) (1)

(2)

(2)

Sem


(2)

Com


31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

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YAP8

32











Proteiacutenas

totais









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33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

Med14-HA

Med16-HA

Yap

8-c

-Myc

34













As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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CdCl2

700microM

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CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

39




































40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







42

















Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





47



Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


399














31





















Fisio As(V)

GAL4BD

GAL4AD

-

- YAP8

MED2

MED3

MED5

MED14

MED16

YAP8

32











Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

ap8-c

-Myc

Med16-HA

Med14-HA

Med5-HA

-

IP IN

-

Med2-HA

Med5-HA

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Yap

8-c

-Myc

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As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

05 1 15

02 04 05

SEY6210

med12

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cycC

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SEY6210

med12

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cycC

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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cycC

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37ordmC 20microM

CdCl2

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NaCl

1mM

CoSO4

A

B

mM

mM

35













meacutetodos











celular comum

36

0 5 10 15 20

























A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

cycClt lexAYAP8gt

cdk8lt lexAYAP8gt

Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

38

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40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


43















Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





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14 1989-1997





















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133 689-693





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Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


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Proteiacutenas

totais









anticorpo anti-HA

33























Med2-HA Y

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Med16-HA

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-

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-

Med2-HA

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Yap

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As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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SEY6210

med12

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cycC

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SEY6210

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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meacutetodos











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36

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A B


med12lt lexAYAP8gt

med13lt lexAYAP8gt

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Fisio As(V)

37






















Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

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αSbaI

Fisio As(V)

38

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40










41



Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


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Nature 369 371-378












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Journal 434 243-251












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Chemistry 282(19) 14113-14120










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Med16-HA

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-

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-

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Yap

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As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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SEY6210

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Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

SEY6210

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meacutetodos











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A B


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Fisio As(V)

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Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

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αSbaI

Fisio As(V)

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Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


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Nature 369 371-378












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Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


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As(III)


Fisioloacutegicas

Condiccedilotildees

Fisioloacutegicas

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A B


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Med2-HA

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Methods 2(6) 475-476













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Berlin







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Letters 579 904-908



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A


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Nature 369 371-378












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A B


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Med2-HA

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Methods 2(6) 475-476













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Berlin







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Letters 579 904-908



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A


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Nature 369 371-378












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A B


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Methods 2(6) 475-476













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Letters 579 904-908



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A


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Nature 369 371-378












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Med2-HA

αSbaI

SEY6210 cycC cdk8

Yap8-c-Myc

αSbaI

Fisio As(V)

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Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


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Nature 369 371-378












6982-6993






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Journal 434 243-251












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Chemistry 282(19) 14113-14120










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Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


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Nature 369 371-378












6982-6993






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Journal 434 243-251












197



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Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


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Nature 369 371-378












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Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


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Nature 369 371-378












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Journal 434 243-251












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Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


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Methods 2(6) 475-476













Biology 30(10) 2437-2448






Berlin







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Letters 579 904-908



251-254









A


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Nature 369 371-378












6982-6993






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Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





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14 1989-1997





















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133 689-693





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Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


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Nature 369 371-378












6982-6993






44











Journal 434 243-251












197



95(5) 717-728





45








14 1989-1997





















46

























133 689-693





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Chemistry 282(19) 14113-14120










Berlin


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Nature 369 371-378












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Importância do Complexo Mediador na Actividade Transcricional do ...

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