IMUNOEXPRESSÃO DO LIGANTE DO RECEPTOR … - Aminopropyltriethoxysilene CEPSH - Comitê de Ética em...
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Georgia Ribeiro Martini IMUNOEXPRESSÃO DO LIGANTE DO RECEPTOR DO ATIVADOR DO FATOR NUCLEAR KAPPA B E DA OSTEOPROTEGERINA EM LESÕES CENTRAIS E PERIFÉRICAS DE CÉLULAS GIGANTES Dissertação submetida ao Programa de Pós Graduação em Odontologia, área de concentração Diagnóstico Bucal da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de mestre em 2017. Orientador: Prof. Dr. Rogério de Oliveira Gondak Coorientadora: Profª. Drª. Elena Riet Correa Rivero Florianópolis 2017
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Georgia Ribeiro Martini
IMUNOEXPRESSÃO DO LIGANTE DO RECEPTOR DO
ATIVADOR DO FATOR NUCLEAR KAPPA B E DA
OSTEOPROTEGERINA EM LESÕES CENTRAIS E
PERIFÉRICAS DE CÉLULAS GIGANTES
Dissertação submetida ao Programa de
Pós Graduação em Odontologia, área
de concentração Diagnóstico Bucal da
Universidade Federal de Santa
Catarina para a obtenção do Grau de
mestre em 2017.
Orientador: Prof. Dr. Rogério de
Oliveira Gondak
Coorientadora: Profª. Drª. Elena
Riet Correa Rivero
Florianópolis
2017
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca
Universitária da UFSC.
Georgia Ribeiro Martini
IMUNOEXPRESSÃO DO LIGANTE DO RECEPTOR DO
ATIVADOR DO FATOR NUCLEAR KAPPA B E DA
OSTEOPROTEGERINA EM LESÕES CENTRAIS E
PERIFÉRICAS DE CÉLULAS GIGANTES
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de
“Mestre” e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós–
graduação em Odontologia.
Florianópolis, 15 de fevereiro de 2017
________________________
Profª Izabel Cristina Santos Almeida, Drª.
Coordenadora do Curso
Banca Examinadora:
________________________
Prof. Rogério de Oliveira Gondak, Dr.
Orientador
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________
Prof. Filipe Modolo Siqueira, Dr.
Membro
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________
Prof. Filipe Ivan Daniel, Dr.
Membro
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________
Profª. Grasieli de Oliveira Ramos, Drª.
Membro
Universidade do Oeste Catarinense
Este trabalho é dedicado à minha amada família pelo carinho e apoio.
AGRADECIMENTOS
À Deus por sempre guiar e iluminar meu caminho e me colocar no
lugar certo, com as pessoas certas.
Aos meus pais, Darley e Marisa por sempre acreditarem nos meus
sonhos; eu jamais chegaria ao dia de hoje sem o apoio deles.
Ao meu irmão, Rafael, por ser meu exemplo, minha referência, meu
muito obrigada por ser um grande incentivador na minha vida
acadêmica.
À minha cunhada Carolina Mozzini, por toda ajuda e conselhos durante
este período.
Ao meu noivo, Giovani, pelo amor, carinho e paciência e também pelas
palavras de incentivo durante esse período do mestrado, foi
fundamental.
À família Knolseisen pelo carinho e por compreenderem a minha
ausência em muitos momentos importantes.
Meus sinceros agradecimentos ao meu orientador Rogério Oliveira
Gondak pela dedicação e todos os ensinamentos passados, pela
paciência, compreensão, infinita disponibilidade, pela confiança em
mim depositada na condução do meu trabalho e pelo incentivo contínuo
neste período.
À profª Elena, minha coorientadora, por toda atenção e ensinamentos
dispensados, pela clareza e objetividade, por estar sempre pronta a me
ouvir e esclarecer minhas dúvidas e pela colaboração inestimável neste
trabalho.
Á profª Liliane, por ser minha referência, obrigada pela oportunidade de
trabalhar ao seu lado e por ser a maior incentivadora na superação dos
meus limites.
Ao prof Filipe Modolo por todo o aprendizado e confiança depositada
durante a rotina do laboratório, com toda certeza fez diferença durante
este período.
Á prof Maria Inês Meurer, por ser meu exemplo de docente, por todos
os ensinamentos e a palavras amigas.
Aos professores Filipe Ivan Daniel, Felipe Perozzo Daltoé, Inez Beatriz
Ratt, Etiene Munhoz, Alessandra Camargo, Rodrigo Alves de Lima, e
Marcio Corrêa por compartilharem seus conhecimentos.
Aos meus colegas: Emanuely, Jussara, Caroline Zimmerman, Angélica,
Fernanda, Rúbia, Mariah, Mariana e Diogo pela amizade e troca de
conhecimento. Vocês fizeram esse período mais leve e divertido.
As minhas irmãs de coração Luana, Dessana e Maria Hilda por todas as
palavras de incentivo e conforto nesse período.
Aos meus amigos que me acompanharam nessa etapa, que
compreenderam a minha ausência e torceram pelo meu sucesso.
Aos funcionários da Universidade Federal de Santa Catarina por serem
sempre solícitos.
Á CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Pessoal, pela
concessão da bolsa de estudos.
Á Universidade Federal de Santa Catarina, que pela segunda vez me
recebeu, pela oportunidade de ampliar meus conhecimentos através do
PPGO.
À todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para este
trabalho, meus sinceros agradecimentos.
“Um sonho que se sonha só,
É só um sonho que se sonha só,
Mas sonho que se sonha junto, é realidade”
(Raul Seixas)
RESUMO
As lesões centrais e periféricas de células gigantes são processos
proliferativos não-neoplásicos caracterizados pela presença de
numerosas células gigantes multinucleadas, que apresentam
características histológicas similares, mas com comportamento clínico
distinto. O ligante do receptor ativador kappa-B (RANKL) e a
osteoprotegerina (OPG) são importantes proteínas correlacionadas a
osteoclastogênese e sua expressão pode estar envolvida na patogênese
dessas lesões. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de
RANKL e OPG em lesões periféricas de células gigantes (LPCG) e
lesões centrais de células gigantes (LCCG), e quantificar o número de
células gigantes multinucleadas (CGM) bem como seus núcleos em cada
grupo de lesões. Vinte casos de cada lesão foram selecionados do
Laboratório de Patologia Bucal da Universidade Federal de Santa
Catarina. A imunoexpressão de RANKL e OPG assim como a contagem
de CGM e núcleos foi avaliada com o software Image J 1.45s. Não
houve diferença estatística na quantificação de CGM por mm², no
entanto, o número de núcleos por CGM foi maior em LCCG (P= 0,010).
A expressão de RANKL foi notadamente maior nas LCCG que nas
LPCG (P= 0,042). Entretanto, não houve diferença estatística entre as
duas lesões na expressão de OPG. Nossos achados demonstraram maior
expressão de RANKL e número de núcleos nas LCCG o que pode
explicar a diferença de comportamento clínico entre as duas lesões e
também a patogênese.
Palavras chaves: Imuno-histoquímica. NF-Kappa B. Osteoprotegerina.
Células gigantes.
.
ABSTRACT
The central and peripheral giant cell granulomas are non-neoplastic
proliferative processes characterized by the presence of numerous
multinucleated giant cells having similar histologic features but distinct
clinical behavior. The receptor activator of nuclear factor Kappa-B
ligand (RANKL), and osteoprotegerin (OPG) are the important proteins
correlated to osteoclastogenesis, whose expression may be involved
with the pathogenesis of these lesions. The aim of this study was
evaluate immunohistochemically the expression of RANKL and OPG in
peripheral giant cell granulomas (PGCG) and central giant cell
granulomas (CGCG) and quantify the number of multinucleated giant
cell (MGC) and their nuclei. Twenty cases of each lesion were selected
from the Oral Pathology Laboratory of the Federal University of Santa
Catarina. The immunoexpression of RANKL and OPG as well as
quantification of MGC and nuclei was performed with the software
Image J 1.45s. No statistic difference were found in the quantification
of the MGC for mm², however the number of nuclei of the MGC was
higher in CGCG (P = 0.010). RANKL expression in CGCG was higher
than PGCG (P = 0.042). In contrast, there was no statistic difference
between two lesions for OPG expression. Our findings showed a higher
expression of RANKL and number of nuclei in CGCG which may
explain the difference in the clinical behavior between these lesions and
their pathogenesis.
Key words: Immunohistochemistry. NF-Kappa B. Osteoprotegerin.
Giant cells.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Sistema RANKL/OPG ............................................................... 32
Figura 2- Microfotografia de LCCG e LPCG e imuno-histoquímica de
RANKL e OPG .........................................................................................
55
Figura 3- Proporção dos casos de lesão periférica de células gigantes e
lesão central de células gigantes relacionados ao gênero...........................
57
Figura 4- Localização anatômica dos casos lesão periférica de células
gigantes e lesão central de células gigantes................................................
59
Figura 5- Quantificação de núcleos das CGM de LPCG e LCCG............. 61
Figura 6- Análise comparativa da imunoexpressão de RANKL em
lesões periféricas e centrais de células gigantes ........................................
63
Figura 7- Correlação positiva entre os imunomarcadores RANKL e
OPG em LCCG e PLCG............................................................................
65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Características clínicas, microscópicas e imuno-histoquímicas
das lesões central e periférica de células
gigantes................................................................................................ 53
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATPS - Aminopropyltriethoxysilene
CEPSH - Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos
c-fos- Fator de transcrição ativador do complexo de proteína 1
CGM – Células gigantes multinucleadas
DAB - Diaminobenzidina
DP- Desvio Padrão
FA – Fibroma ameloblástico
H&E – Hematoxilina e eosina
Ig2 – Imunoglobulina 2
IL1 – Interleucina 1
LCCG – Lesão central de células gigantes
LPB – Laboratório de patologia bucal
LPCG - Lesão periférica de células gigantes
M-CSF – Fator estimulante de colônia de macrófagos
MO – Mixoma odontogênico
NFATc1 – Fator nuclear de células T ativadas
NF-KB- Fator nuclear kappa B
OCIF – Fator inibitório da osteoclastogênese
OMS – Organização mundial de saúde
OPG – Osteoprotegerina
PBS – Tampão fosfato salina
PTH – Paratormônio
RANK – Receptor fator nuclear kappaB
RANKL - Ligante do receptor do fator nuclear kappaB
TOA – Tumor odontogênico adenomatóide
TOCC- Tumor odontogênico cístico calcificante
TOCE – Tumor odontogênico calcificante epitelial
TCG- Tumor de células gigantes
TNF - Fator de necrose tumoral
TNFα – Fator de necrose tumoral alfa
TRAF6 – Fator associado ao receptor fator de necrose tumoral
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina
LISTA DE SÍMBOLOS
α – Alfa
µm – Micrômetro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................... 25
1.1 LESÃO PERIFÉRICA DE CÉLULAS GIGANTES ........ 25
1.2 LESÃO CENTRAL DE CÉLULAS GIGANTES ............ 26
1.3 SISTEMA RANK/RANKL/OPG ..................................... 30
1.3.1 RANK ....................................................................... 32
1.3.2 RANKL .............................................................................. 33
1.3.3 OPG .................................................................................. .. 33
1.4 EXPRESSÃO DE RANKL/OPG EM DOENÇAS
ÓSSEAS.......................................................................................
34
2. JUSTIFICATIVA ................................................................. 37
3. OBJETIVOS .......................................................................... 39
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................... 39
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................ 39
4. ARTIGO ................................................................................ 41
5. CONCLUSÕES ..................................................................... 67
REFERÊNCIAS .................................................................... 69
ANEXO A–TERMO CONSUBISTANCIADO DO CEPSH.. 79
APÊNDICE A- METOLOGIA EXPANDIDA ...................... 83
ANEXO B- GUIA DE INFORMAÇÕES DO AUTOR.......... 87
25
1.INTRODUÇÃO
1.1 LESÃO PERIFÉRICA CÉLULAS GIGANTES (LPCG)
A lesão periférica de células gigantes (LPCG) é uma lesão reativa
benigna com etiologia e patogenia incerta (Florez-Moreno et al., 2008,
Chaparro-Avendano et al., 2005). Em um estudo realizado por Naderi et
al. (2012) de 2068 casos de lesões reativas, a LPCG foi a mais
prevalente com 30,12%.
A lesão pode ocorrer em qualquer idade, sendo mais comum
entre a 5º e 6ª décadas de vida (Naderi et al., 2012, Lester et al., 2014).
A mandíbula é mais acometida que a maxila (Dayan et al., 1990,
Shadman et al., 2009, Motamedi et al., 2007, Lester et al., 2014).
Clinicamente a LPCG apresenta-se como um aumento de volume
nodular, de inserção séssil ou pediculada, de coloração que varia de
rósea, semelhante à mucosa, a vermelho-púrpura e ocorre
exclusivamente em gengiva ou rebordo alveolar. A LPCG raramente
afeta o osso adjacente, mas em alguns casos pode causar uma erosão
superficial ao osso subjacente (Motamedi et al., 2007, Chaparro-
Avendano et al., 2005, Salum et al., 2008). A dor não é uma
característica comum, a menos que a lesão esteja ulcerada por trauma
e/ou se torne infectada (Gandara-Rey et al., 2002, Lester et al., 2014).
Para o diagnóstico diferencial da LPCG devem ser incluídos o fibroma
ossificante periférico, granuloma piogênico e o fibroma de irritação
(Zhang et al., 2007).
A LPCG não é considerada uma neoplasia verdadeira e sim uma
lesão reativa que tem sua origem do ligamento periodontal e
mucoperiósteo do rebordo alveolar, decorrente de uma irritação ou
trauma local como extração dentária, impacção alimentar, restaurações
dentárias não satisfatórias, próteses desadaptadas, trauma crônico,
doença periodontal, presença de cálculo, e aparelhos ortodônticos
(Dayan et al., 1990, Motamedi et al., 2007, Chaparro-Avendano et al.,
2005, Houston, 2005).
Histologicamente, a LPCG é caracterizada pela presença de células
gigantes multinucleadas (CGM) entremeadas por células mononucleares
(fibroblastos, monócitos-macrófagos) dispersas em um estroma de fibras
colágenas de densidade variável. É revestida por epitélio pavimentoso
paraceratinizado, e caracteriza-se por ser bem vascularizada com
numerosos capilares, áreas hemorrágicas e hemossiderina. Também
26
apresenta infiltrado inflamatório crônico, evidenciado pela presença de
linfócitos, plasmócitos e histiócitos ou agudo composto por células
polimorfonucleares. Também pode apresentar tecido mineralizado do
tipo lamelar, cementóide ou calcificação distrófica (Dayan et al., 1990,
Florez-Moreno et al., 2008, Flaitz, 2000, Lester et al., 2014).
O tratamento consiste em remoção cirúrgica com extensa
curetagem da base da lesão para evitar recidivas. A recorrência descrita
na literatura está entre 1,4% e 12 % (Motamedi et al., 2007, Bhaskar et
al., 1971).
1.2 LESÃO CENTRAL DE CÉLULAS GIGANTES (LCCG)
Definida pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (Barnes,
2005) como uma lesão intraóssea caracterizada pela presença de tecido
conjuntivo fibroso com múltiplas CGM, focos de hemorragia e
ocasionalmente trabeculado ósseo. A lesão central de células gigantes
(LCCG) é uma lesão intraóssea benigna de etiologia controversa e
corresponde a 7% de todas as lesões benignas dos maxilares (de Lange
et al., 2004).
A LCCG pode ocorrer em qualquer idade, mas tem predileção
por pacientes jovens, abaixo dos 30 anos de idade e acomete duas vezes
mais as mulheres que homens. A mandíbula é mais afetada que a
maxila (de Lange et al., 2004, Sun et al., 2009, Gungormus & Akgul,
2003, de Lange et al., 2007, Motamedi et al., 2007), sendo comum na
região anterior (de Lange et al., 2007, Reddy et al., 2012). O
comportamento clínico varia de crescimento lento e aumento de volume
assintomático a destruição óssea local, reabsorção e/ou descolamento
dos dentes adjacentes (de Lange et al., 2004, Stavropoulos & Katz,
2002).
Chuong et al (1986) descreveu duas variantes de comportamento
das LCCG denominadas agressivas e não agressivas de acordo com os
sinais e sintomas. As lesões agressivas são caracterizadas por
apresentarem dor, parestesia, tamanho maior de 5 cm, crescimento
rápido, recidiva após curetagem cirúrgica, afilamento ou perfuração da
cortical óssea, deslocamento ou reabsorção de dentes adjacentes.
Atualmente não se encontram na literatura marcadores moleculares e
imuno-histoquímicos que diferencie os dois subtipos (Itonaga et al.,
2003). Reddy et al. (2012) em um estudo histomorfométrico avaliaram a
27
quantidade de CGM em lesões agressivas e não agressivas, e em lesões
agressivas observaram uma maior quantidade de CGM como também
uma maior quantidade de núcleos nessas células nas lesões agressivas.
Radiograficamente, a LCCG apresenta descrições variadas,
podendo ser unilocular ou multilocular, de aspecto radiolúcido ou com
focos radiopacos, ser bem delimitado ou de limites imprecisos, podendo
assim apresentar descontinuidade da cortical, deslocamento ou
reabsorção dos dentes adjacentes à lesão (Sun et al., 2009, Aghbali et
al., 2013). Os achados radiográficos não são específicos para a LCCG,
pois podem mimetizar uma variedade de outras lesões dos maxilares tais
como cistos, tumores odontogênicos, lesões fibro-ósseas, malformações
vasculares e lesões malignas, como lesões ósseas metastáticas (De
Lange & Van den Akker, 2005, Kruse-Losler et al., 2006).
Microscopicamente a LCCG é caracterizada por múltiplas CGM e
células mononucleares em um estroma rico em fibras colágenas (Florez-
Moreno et al., 2008, Aghbali et al., 2013), sendo histologicamente
idêntica a LPCG. Em um estudo realizado por Agbhali et al.(2013), os
autores observaram a quantidade de núcleos por célula gigante foi maior
em LCCG que nas LPCG, sendo uma hipótese para diferenciar o
comportamento clínico destas lesões.
A LCCG tem sua histologia idêntica a outras lesões que
acometem os ossos gnáticos, como o tumor marrom, decorrente do
hiperparatireoidismo (Di Daniele et al., 2009, Shetty et al., 2015), o
querubismo (Jain & Sharma, 2006); Barnes L,2005) cisto ósseo
aneurismático (Urs et al., 2014) e o tumor de células gigantes (Werner,
2006).
O tumor marrom do hiperparatireoidismo é o resultado de uma
desordem metabólica que afeta ossos longos, costelas e pelve
(Chowdhury et al., 2013). A produção excessiva do paratormômio
(PTH) causa um desequilíbrio na atividade osteoclástica resultando na
destruição óssea (Rubin et al., 2001). A doença é mais comum em
adultos, com média de idade de 50 anos e afeta três vezes mais mulheres
que homens (Chowdhury et al., 2013). O envolvimento dos ossos
gnáticos é raro, mas, quando ocorre, a mandíbula é mais acometida
(Jebasingh et al., 2008). A literatura refere uma frequência do tumor
marrom de 1,5% a 1,75% no hiperparatireoidismo primário e 3 a 4% no
hiperparatireoidismo secundário. Radiograficamente e histologicamente
o tumor marrom é idêntico a LCCG, sendo assim necessários exames
laboratoriais como dosagem sérica de cálcio, fosfatase alcalina, níveis
PTH para definir o diagnóstico (Shetty et al., 2015).
28
O querubismo é uma doença fibro-óssea, genética e autolimitada
que afeta os ossos gnáticos. Caracteriza-se pela substituição de osso
normal por uma proliferação de tecido fibrovascular contendo CGM,
causando um aumento de volume bilateral da mandíbula e maxila.
Desenvolve- se em pacientes com idade entre 1 a 7 anos (Jain &
Sharma, 2006). Microscopicamente o querubismo é indistinguível da
LCCG. A correlação com os dados clínicos-radiográficos pode ser uma
ferramenta útil para distinguir o querubismo da LCCG (Barnes,2005).
O cisto ósseo aneurismático é descrito pela OMS como uma lesão
osteolítica, expansiva, caracterizado por ser uma cavidade cheia de
sangue e pela presença de tecido conjuntivo contendo material osteóide
e CGM. É uma lesão rara, sendo a maioria dos casos envolvendo ossos
longos, como fêmur e tíbia, apenas 2 % dos casos ocorrem nos ossos
gnáticos (Urs et al., 2014).
O tumor de células gigantes (TCG) é uma lesão agressiva, com
tendência à recidiva, e que acomete os ossos longos raramente
ocorrendo nos maxilares. Histologicamente é caracterizado por
apresentar numerosas CGM e numerosos núcleos por células gigantes
distribuídas em um estroma altamente celularizado e com a presença de
necrose. Radiograficamente apresenta-se como uma lesão osteolítica,
agressiva e de limites imprecisos (Murphey et al., 2001).
A cirurgia é a modalidade de tratamento mais aplicada em LCCG.
Lesões não agressivas tendem a responder com sucesso a enucleação e
curetagem dessas lesões, especialmente em pacientes jovens
(Triantafillidou et al., 2011). No entanto em lesões agressivas a taxa de
recidiva com tratamento cirúrgico tem sido entre 37,5 a 70% (de Lange
et al., 2007). A ressecção em bloco tem sido uma alternativa para
diminuir a chance de recidiva, porém os danos funcionais e cosméticos
são expressivos (Bataineh et al., 2002); (Infante Cossio et al., 2007)
(Tosco et al., 2009). Terapias medicamentosas têm sido sugeridas para
diminuir a morbidade causada pela cirurgia, reduzindo o tamanho da
lesão e consequentemente a necessidade de uma ampla ressecção.
Medicamentos como calcitonina, injeção intralesional com
corticosteroides e interferon α-2a são descritos como alternativas para
lesões agressivas, contudo mais estudos randomizados são necessários
para comprovar a eficácia desses tratamentos (Suarez-Roa Mde et al.,
2009).
A calcitonina foi sugerida por Harris em 1993, depois de
confirmar através de imuno-histoquímica, que as células gigantes
encontradas nessas lesões reagem com anticorpo monoclonal específico
para osteoclastos inibindo a ação destes nos ossos. Desde então tem se
29
apresentado como uma terapia não cirúrgica para o tratamento de lesões
agressivas (Allon et al., 2009, Harris, 1993), sendo a forma de spray
nasal mais indicada (de Lange et al., 2006). Tem sido sugerido na
literatura que a calcitonina seja utilizada em associação com a injeção
intralesional de corticosteroide, diminuindo assim o chamado
“fenômeno de escape” da calcitonina, que tem seu efeito diminuído se
utilizada por um longo período (Vered et al., 2006; Rachmiel et al.,
2012).
A injeção intralesional de corticosteroide foi descrito pela
primeira vez por Jacoway em 1988 (Jacoway JR,1988). Os esteroides
são utilizados por possuírem capacidade de inibir a reabsorção óssea
mediada pelas proteases lisossomais das células gigantes e também por
induzirem a apoptose dos osteoclastos (Carlos & Sedano, 2002, Abdo et
al., 2005). As recomendações para esse tipo de medicamento é que
sejam realizadas injeções intra-lesionais uma vez por semana, por 6
semanas, em múltiplos sítios da lesão (Vered et al., 2008, Kurtz et al.,
2001). Não é descrito na literatura efeitos colaterais do uso desse
medicamento usado localmente, como quando utilizado de forma
sistêmica (El Hadidi et al., 2015).
A ação da calcitonina e dos corticosteroides deve-se, em partes,
aos receptores de calcitonina e glicocorticoides presentes nas CGM
(Tobon-Arroyave et al., 2005). Vered et al (2006) sugeriram que fosse
realizada uma análise imuno-histoquímica das CGM para avaliar a
presença desses receptores e decidir qual a melhor estratégia terapêutica.
Outra associação descrita na literatura é a utilização dos
corticosteroides concomitantemente com bifosfonatos, medicamentos
amplamente utilizados em condições como osteoporose, doença de
Paget e tumores metastáticos por apresentar propriedades que inibem a
osteólise (da Silva et al., 2012). Os mesmos autores relaram um caso
onde utilizaram alendronato sódico, um tipo de bifosfonato,
concomitante com o uso de injeções intralesionais de triancinolona em
um caso de LCCG agressivas e obtiveram a remissão total da lesão, sem
a necessidade de complementação cirúrgica, com acompanhamento de 4
anos, sem sinal de recidiva da lesão. No entanto, mais estudos clínicos
são necessários para comprovar a eficácia dessa associação.
O interferon α-2a também é um medicamento indicado como
terapia adjuvante no tratamento cirúrgico de LCCG agressivas, e foi
utilizado pela primeira vez em 1999 por Kaban et al (1999). Tem sido
proposto por apresentar propriedades anti-angiogênicas e também por
estimular a diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos,
otimizando a neoformação óssea (Abukawa et al., 2006). No estudo de
30
De Lange et al (de Lange et al., 2006) o interferon α-2a quando
utilizado no tratamento primário estabilizou o rápido crescimento
lesional e reduziu o seu tamanho. No entanto, os efeitos colaterais desse
medicamento são pouco tolerados pelos pacientes, tais como fadiga,
dores de cabeça e febre (Goldman et al., 2005).
O imatinib, inibidor de tirosina quinase, é um medicamento
utilizado para o tratamento de subtipos de leucemia mielóide crônica e
tumores gastrointestinais, e por inibir a ação dos osteoclastos,
desregulam o Fator ativador de receptor nuclear KB (RANK), um
regulador da atividade óssea. Tem sido sugerido seu uso para tratamento
de LCCG agressivas em associação com o interferon α-2a (de Lange et
al., 2009).
O Denosumab é um anticorpo monoclonal (Ig2) capaz de inibir a
lise óssea bloqueando o ligante do fator receptor ativador nuclear KB
(RANKL), uma proteína fundamental para diferenciação e maturação
dos osteoclastos, e como consequência inibindo a reabsorção óssea
(Branstetter et al., 2012, Gupta et al., 2015).
1.3 SISTEMA RANK/RANKL/OPG
O tecido ósseo está em constante remodelação pela atividade dos
osteoclastos, que atuam na reabsorção da matriz óssea, e dos
osteoblastos, que sintetizam o tecido ósseo (Boyle et al., 2003). Os
osteoclastos são derivados de precursores monoclonais das células
hematopoiéticas que também dão origem aos macrófagos (Karsenty &
Wagner, 2002). O entendimento deste processo que regula a atividade
dos osteoclastos teve um avanço significativo nas últimas décadas com a
descoberta do sistema RANK/RANKL/OPG (Boyce & Xing, 2007). O
sistema RANK/RANKL/OPG é um dos mecanismos que regulam essa
atividade no organismo e mantém o funcionamento dos osteoclastos e
osteoblastos em equilíbrio, garantindo a integridade do tecido ósseo. Em
situações patológicas a expressão desses marcadores pode estar alterada
(Wada et al., 2006).
A elucidação desse sistema iniciou pela descoberta da
osteoprotegerina (OPG) por dois grupos independentes, e de forma
inesperada. Simonet et al (Boyle et al., 2003) estavam investigando
moléculas relacionadas aos receptores do fator de necrose tumoral
(TNF) que pudessem exercer atividade terapêutica utilizando ratos
transgênicos que superexpressavam vários receptores dos TNF
31
relacionados ao cDNA. Durante o experimento observaram que ratos
que superexpressavam um cDNA específico desenvolveram
osteopetrose por apresentarem deficiência de osteoclastos no tecido
ósseo, posteriormente, a proteína relacionada a esse fenômeno foi
denominada de osteoprotegerina, pois demonstrava proteger o tecido
ósseo de reabsorções excessivas, indicando que a OPG exercia um papel
importante na regulação da osteoclastogênese (Simonet et al., 1997).
Independentemente a isso, pesquisadores do Snow Brand Milk Group identificaram uma molécula idêntica ao testarem a hipótese de
Rodan-Martin (definiam o osteoblasto como fator central de controle da
osteoclastogênese e na reabsorção óssea), os autores estavam
investigando fatores que inibissem e ativassem os osteoclastos e
reportaram o fator inibitório da osteoclastogênese (OCIF), que
posteriormente foi reconhecido ser idêntico a proteína descoberta pelo
primeiro grupo (Yasuda et al., 1998b).
Assim que a OPG foi identificada, ambos os grupos identificaram
seu ligante, denominado inicialmente como ligante de OPG e fator de
diferenciação dos osteoclastos, e observaram ser idêntico a um membro
da família de ligantes do TNF, o Ligante do Receptor Ativador Nuclear
Kappa B (RANKL), fator conhecido por estimular células dendríticas
(Yasuda et al., 1998b, Lacey et al., 1998). Após o reconhecimento do
ligante da OPG, foi observado que o seu receptor era idêntico a um fator
já revelado anteriormente, o receptor fator nuclear-kB (RANK)
(Anderson et al., 1997).
O processo de ativação e maturação dos osteoclastos requer uma
cascata de eventos complexos que ainda não estão totalmente
compreendidos, envolvendo o sistema RANK/RANKL e o fator
estimulante de colônias de macrófago (M-CSF), que está presente em
osteoblastos e células do estroma são necessários para diferenciação e
ativação dos osteoclastos, no entanto o M-CSF sozinho não é capaz de
complementar esse processo (Boyce & Xing, 2008, Boyce & Xing,
2007).
A ligação de RANKL, expresso em osteoblastos e células do
estroma, ao RANK, expresso em precursores de osteoclastos e
osteoclastos maduros recruta uma proteína adaptadora (TRAF6)
ativando fator nuclear kB, esse último é responsável por aumentar a
expressão da proteína c-fos que interage com NFATc1 (Fator nuclear de
células T ativadas) para ativar a transcripção dos genes da
osteoclastogênese. A OPG inibe esse processo se ligando a RANKL e,
assim, inibe a cascata de eventos responsável pela ativação e maturação
32
dos osteoclastos, impedindo a reabsorção óssea (Boyce & Xing, 2008,
Khosla, 2001). (Figura1)
Figura 1. Mecanismo de diferenciação e ativação dos osteoclastos.
Adaptado de Boyce & Xing, 2007.
Em condições patológicas, citocinas com propriedades
proreabsortivas como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e a
Interleucina 1 (IL1) interferem nesse sistema primeiramente por
estimularem a produção de M-CSF e também por aumentarem a
expressão de RANKL (Boyce e Xing, 2008).
1.3.1 RANK
O Receptor Ativador Nuclear Kappa B (RANK – do inglês
Receptor Activator of Nuclear factor Kappa- B) é um receptor
transmembrana, de superfície celular, do tipo 1 da família do TNF que
está presente em células precursoras de osteoclastos, osteoclastos
maduros, células dendríticas, fibroblastos e células T (Anderson et al.,
1997). É caracterizado por ser um peptídeo de 616 aminoácidos e sua
ativação se faz pela ligação com RANKL (Receptor Ativador Nuclear
Kappa b ligante) induzindo a maturação dos pré-osteoclastos e ativação
33
dos osteoclastos maduros (Wada et al., 2006). A expressão de RANK
também tem sido encontrada em glândulas mamárias (Fata et al., 2000)
e em algumas células tumorais como no câncer de mama e de próstata,
ou seja, tipos de tumores com alto potencial de desenvolver metástase
óssea (Wittrant et al., 2004).
1.3.2 RANKL
O Receptor Ativador Nuclear Kappa B ligante (RANKL – do
inglês Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B ligand) é uma
proteína transmembrana tipo II, expressa na superfície de membrana
celular e também como proteína secretada por diversos tipos celulares,
como linfócitos T e osteoblastos. É um peptídeo de 317 aminoácidos
pertencendo à família do TNF (Boyce & Xing, 2008, Hofbauer, 2006,
Tyrovola et al., 2008). No tecido ósseo a expressão de RANKL é
encontrada em osteoblastos e células do estroma, e também é observado
na medula óssea e nos tecidos linfáticos (linfonodos, timus, baço). Sua
expressão também é observada em células epiteliais mamárias durante a
gestação (Wada et al., 2006, Fata et al., 2000).
O RANKL também tem sido associado à resposta imune, ativando
células T e inibindo a apoptose de células dendríticas (Wong et al.,
1997). Assim como o RANK, o RANKL também é expresso em
algumas células tumorais malignas, e tem como função estimular a
proliferação das células tumorais pela sinalização autócrina ou
parácrina, se produzidas por células vizinhas como células T ativadas
(Kim et al., 2006). Experimentos in vivo demonstraram que roedores
com deficiência de RANKL apresentaram osteopetrose e defeitos na
erupção dentária, e ainda apresentaram deficiência na diferenciação de
células T e B, e deficiência nos linfonodos, concluindo que RANKL é
crucial para o metabolismo ósseo e formação do sistema imune (Kong et
al., 1999).
1.3.3 OPG
A osteoprotegerina foi assim definida por ser considerada uma
protetora do tecido ósseo, impedindo a sua reabsorção. Atua como
antagonista de RANKL, pois a ligação de OPG com RANKL impede a
ativação e diferenciação dos osteoclastos, inibindo a lise óssea. É um
peptídeo de 380 aminoácidos que pertence à família de receptores do
TNF sendo secretada como proteína solúvel (Simonet et al., 1997,
Yasuda et al., 1998a).
34
A OPG é expressa em diferentes tipos celulares, como os
osteoblastos, as células do tecido linfático, vascular e medula óssea
(Simonet et al., 1997, Yasuda et al., 1998a). Tem sido sugerido que a
presença de OPG protege vasos sanguíneos calibrosos de calcificações,
prevenindo complicações oriundas da aterosclerose (Bucay et al.,
1998).
A expressão de OPG é regulada por muitos fatores que induzem a
expressão de RANKL por osteoblastos, no entanto, em condições
patológicas observa-se um aumento da expressão de RANKL e uma
baixa expressão de OPG, favorecendo a osteoclastogênese (Boyce &
Xing, 2007).
Em um estudo in vivo em roedores foi observado que uma
depleção de OPG resultou em severa osteoporose, um aumento na
formação de osteclastos e consequentemente um aumento da reabsorção
óssea. E ainda nesse mesmo estudo foi observada uma intensa
calcificação das artérias mais calibrosas (Bucay et al., 1998, Mizuno et
al., 1998).
1.4 EXPRESSÃO DE RANKL/OPG EM DOENÇAS ÓSSEAS
É conhecido que o desequilíbrio desse sistema altera o
metabolismo ósseo e alguns distúrbios ósseos estão sendo relacionadas a
essa alteração, como a falha na erupção dentária, doença periodontal e
doenças mais graves como a osteopetrose, doença de Paget, osteoporose,
artrite reumatóide (Boyce & Xing, 2007). Com isso a expressão desses
marcadores tem sido muito investigada para melhor compreensão das
doenças e com a finalidade de descobrir um futuro alvo nas terapias
antitumorais.
Dentre os tumores que acometem os maxilares Da Silva et al. (da
Silva et al., 2008) avaliaram a expressão de RANK, RANKL e OPG em
tumores odontogênicos ceratocísticos, ameloblastomas e cistos
dentígeros e observaram uma maior expressão de RANK e RANKL em
ameloblastomas sólidos quando comparados ao cisto dentígero.
Também observaram que os ameloblastomas tanto tipo sólido como
unicístico apresentaram maior expressão de RANKL do que OPG,
diferentemente dos casos avaliados de tumores odontogênicos
ceratocísticos e dos cistos dentígeros que apresentaram maior expressão
de OPG quando comparados a RANKL.
Em outro estudo também avaliando a expressão de RANK,
RANKL e OPG em ameloblastomas sólidos/multicísticos recorrentes foi
35
notada uma alta expressão de RANK no epitélio tumoral enquanto a
marcação de RANKL foi predominantemente no estroma. A expressão
de OPG foi mais observada em epitélio tumoral que tecido conjuntivo
(Siar et al., 2015).
Andrade FR et al. (2008) avaliaram a presença desses marcadores
em tumor odontogênico cístico calcificante (TOCC), tumor
odontogênico adenomatóide (TOA), tumor odontogênico calcificante
epitelial (TOCE), mixoma odontogênico (MO), fibroma ameloblástico
(FA). A expressão de RANK, RANKL e OPG foi encontrada em todos
os casos. No estroma e células mesenquimais do TOEC, MO, FA houve
uma maior expressão de RANKL enquanto no TOA e TOCC houve uma
maior expressão de OPG.
A expressão de RANK/RANKL/OPG também tem sido
investigada outras doenças ósseas como em mieloma múltiplo,
caracterizada por desenvolver lesões osteolíticas no tecido ósseo
acompanhado de dor, hipercalcemia e fraturas patológicas. Giuliani e
colaboradores observaram uma maior expressão de RANKL e uma
redução de OPG nesses pacientes (Giuliani et al., 2001).
Em tumores de células gigantes (TCG), uma doença rara que
acomete ossos longos, caracterizada por destruição maciça dos ossos,
células derivadas do estroma de TCG apresentaram superexepressão de
RANKL, o que explicaria a característica osteolítica da lesão (Wittrant
et al., 2004).
Em tumores de mama, doença com alto potencial de desenvolver
metástase óssea a expressão de RANKL aumentada têm sido
relacionada a um pior prognóstico, enquanto que a maior expressão de
OPG têm sido associada a um melhor prognóstico e aumento da
sobrevida (Cross et al., 2006).
Com relação à presença desses marcadores em LCCG e LPCG
poucos são os estudos descritos na literatura. Elias et al.
(2010)analisaram a expressão de RANKL e OPG em LCCG
comparando com o cisto ósseo simples (COS) e a displasia fibrosa (DF)
e observaram uma maior expressão de RANKL nas LCCG. Em outro
estudo realizado por Fanourakis et al. (2010) foi avaliada a expressão de
RANKL e OPG em LPCG e através de uma análise semi-quantitativa
foi observado uma alta expressão desses marcadores nas amostras
analisadas. Liu et al. (2003) avaliaram através da hibridização in situ a
presença de mRNA de RANKL e OPG em LCCG e LPCG, e
observaram que o mRNA de RANKL foi expresso principalmente em
células mononucleares enquanto que o mRNA de OPG foi encontrada
tanto em células mononucleares quanto em CGM.
36
37
2. JUSTIFICATIVA
A LCCG e a LPCG são processos proliferativos não-neoplásicos
com aspectos histológicos similares, mas com características clínicas
distintas. Assim, o estudo da atividade osteoclástica mediada pelo
sistema RANKL-OPG pode gerar melhor entendimento da histogênese e
comportamento clínico destas lesões, além de favorecer o
desenvolvimento de futuras ferramentas para prognóstico e tratamento.
38
39
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar da expressão do RANKL e OPG, e quantificar as CGM e
seus núcleos em LPCG e LCCG, diagnosticados no LPB-UFSC no
período de 2006 a 2016.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar os dados sócio-demográficos dos pacientes
diagnosticados com LCCG e LPCG pelo LPB-UFSC;
Quantificar a população de CGM, bem como seus núcleos em
LCCG e LPCG;
Avaliar a diferença entre a expressão imuno-histoquímica das
proteínas RANKL, OPG no estroma de LPCG e LCCG;
Avaliar a relação RANKL/ OPG em LPCG e LCCG;
Estabelecer possíveis correlações entre a expressão das
proteínas do estudo e os dados clínicos e histológicos de cada
lesão.
40
41
4. ARTIGO
Artigo formatado conforme as normas da revista Oral Diseases (Anexo A), com exceção do idioma.
TÍTULO
Imunoexpressão do ligante NF-kappa B e osteoprotegerina na
diferenciação das lesões centrais e periféricas de células gigantes.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de RANKL e OPG em
LPCG e LCCG, e quantificar as células gigantes multinucleadas (CGM)
e seus núcleos nestas lesões. Vinte casos de cada lesão foram
selecionados do Laboratório de Patologia Bucal da UFSC, no período de
2006 a 2016. A avaliação da imunoexpressão de RANKL e OPG assim
como a quantificação de CGM e núcleos foi realizada com o auxílio do
software Image J 1.45s. Não houve diferença estatística na quantificação
de CGM por mm², no entanto o número de núcleos por CGM foi maior
em LCCG (P = 0,010). A expressão de RANKL foi maior nas LCCG
que nas LPCG (P= 0,042). Entretanto, não houve diferença estatística
entre as duas lesões na expressão de OPG. Nossos achados
demonstraram maior expressão de RANKL e número de núcleos nas
LCCG o que pode explicar a diferença de comportamento clínico entre
as duas lesões e também a patogênese.
Palavras chaves: Imuno-histoquímica. RANKL. OPG. Lesão central de
células gigantes. Lesão periférica de células gigantes.
42
INTRODUÇÃO
As lesões central e periférica de células gigantes são lesões benignas
que afetam os ossos gnáticos e sua etiologia e patogenia são incertas
(Florez-Moreno et al., 2008). A lesão periférica de células gigantes
(LPCG) é descrita como uma lesão reativa, afetando somente a gengiva
e rebordo alveolar, manifestando-se como nódulo vermelho ou roxo.
Pode ocorrer em qualquer idade, sendo mais comum na quinta e sexta
décadas de vida. Não há predileção por gênero e ocorre tanto em maxila
quanto em mandíbula (Motamedi et al., 2007, Lester et al., 2014).
Permanece incerto se a LPCG é uma entidade distinta, ou uma variante
periférica da lesão central de células gigantes (LCCG).
A LCCG é descrita pela OMS como uma lesão intraóssea benigna
que afeta principalmente mulheres abaixo dos 30 anos de idade (Barnes,
2005). A LCCG tende a envolver mais a mandíbula que a maxila, e é
mais comum na região anterior (de Lange et al., 2007, Reddy et al.,
2012). O comportamento clínico varia entre um crescimento lento e
ausência de sintomatologia, denominada do tipo não agressiva, à um
crescimento rápido associado a dor, reabsorção das raízes de dentes
adjacentes, deslocamento dental, denominada tipo agressiva (Chuong et
al., 1986).
Histologicamente a LPCG e LCCG são caracterizadas pela
presença de numerosas células gigantes multinucleadas e células
mononucleares em um estroma fibroso e bem vascularizado, podendo
apresentar material osteóide (Lester et al., 2014, Aghbali et al., 2013).
Apesar das duas lesões apresentarem as mesmas características
histológicas, elas apresentam comportamento clínico distinto. Muitos
pesquisadores tem tentado explicar a diferença no comportamento
clínico através da avaliação citomorfométrica dos núcleos das células
gigantes (Aghbali et al., 2013); a expressão de marcadores como da
angiogênese (CD34) e de macrófagos (CD68) (Kumar et al., 2016); p53
(gene supressor tumoral), PCNA (antígeno nuclear de proliferação
celular), Ki-67 (proteína não histona de proliferação celular) e AgNOR
(regiões organizadoras nucleolares argirofílicas) (Souza et al., 2000); ou
ainda a expressão de RANK (receptor ativador do fator nuclear kappa-
B), GRa (receptor glicocorticoide) e CTR (receptores de calcitonina)
(Tobon-Arroyave et al., 2005).
Estudos relacionados ao sistema RANK/RANKL/OPG na
osteoclastogênese acarretaram em um grande avanço no conhecimento
43
sobre o turn over ósseo. O receptor ativador do fator nuclear Kappa-B
(RANK), expresso em precursores de osteoclastos se liga ao ligante do
receptor ativador do fator nuclear Kappa-B (RANKL), expresso na
membrana de superfície de osteoblastos e células do estroma
promovendo a diferenciação e ativação dos osteoclastos. A
osteoprotegerina (OPG) inibe esse processo ligando-se ao RANKL. O
aumento da expressão de RANK/RANKL tem sido observado em
diversas doenças ósseas como osteoporose, metástase óssea e tumores
odontogênicos. (Andrade et al., 2008, Siar et al., 2015, da Silva et al.,
2008) e em situações com aumento da atividade osteolítica (Wada et al.,
2006).
O objetivo deste estudo foi avaliar através de imuno-histoquímica
a expressão de RANKL e OPG em LCCG e LPCG, uma vez que não
foram encontrados estudos prévios na literatura que avaliassem a
expressão desses marcadores nessas lesões; e também quantificar as
CGM, bem como seus núcleos nestas lesões, a fim de contribuir para um
melhor entendimento da patogênese dessas duas lesões.
MATERIAIS E MÉTODOS
Seleção da amostra
Os casos avaliados neste estudo foram selecionados dos arquivos
do Laboratório de Patologia Bucal, da Universidade Federal de Santa
Catarina, no período de 2006 a 2016. Foram selecionados 20 casos de
LPCG e 20 de LCCG. Dados demográficos como idade, gênero e
localização anatômica foram coletados das fichas de biópsias.
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa em seres
humanos da Universidade Federal de Santa Catarina sob o parecer nº
1.468.638 de 29/03/16 (Apêndice A).
Quantificação das células gigantes e seus núcleos
Para avaliação histológica foram obtidos cortes de 5 µm e corados
com hematoxilina e eosina (H&E). A análise foi realizada por dois
avaliadores calibrados e cegados utilizando microscópio óptico
binocular (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), acoplado
a um sistema de aquisição de imagem digital (A620, Cannon, Lake
Success, NY, EUA. Foram capturados 5 campos de cada caso, com
aumento de 400x, selecionados da área central da lesão com a maior
44
prevalência de células gigantes multinucleadas (CGM). A quantificação
das CGM e seus respectivos núcleos foi realizada através do software
Image J 1.45s (Maryland, EUA). Os parâmetros incluídos foram: CGM
e número de núcleos/mm² de tecido conjuntivo.
Imuno-histoquímica
Das amostras fixadas em formol e emblocadas em parafina foram
obtidos cortes de 3 µm, estendidas em lâminas de vidro silanizadas
(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As amostras foram
desparafinadas com xilol seguidas de reidratação em concentrações
decrescentes de álcool. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado
com peróxido de hidrogênio a 6% diluído em álcool metílico em dois
banhos de 20 e 10 minutos cada, em temperatura ambiente. A
recuperação antigênica foi realizada com imersão das amostras em
solução de tampão citrato, pH 6,0 a 96°C por 40 minutos. Os cortes
foram incubados com anticorpo monoclonal primário de rato anti-
RANKL (N-19, diluição 1:200, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) e
anti-OPG (N-20, diluição 1:200, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA)
em câmara úmida a 4 - 8°C, por 18 horas. Após esse período, as
amostras foram imersas em tampão fosfato salina (PBS) e em seguida
realizado a incubação do anticorpo conjugado de biotina anti-cabra de
frango de diluição 1:500 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,
EUA). As reações foram visualizadas com o kit Vectastain ABC (Vector
Laboratories, Burlingame, CA, EUA) e reveladas com DAB (Dako
Cytomation, Glostrup, Dinamarca). Os controles negativos foram
obtidos através da omissão do anticorpo primários. Em relação aos
controles positivos, e de acordo com os fabricantes dos anticorpos
primários, foram utilizadas amostras teciduais ricas em CGM.
Análise Imuno-histoquímica
A imunoexpressão de RANKL e OPG foi analisada utilizando o
software Image J 1.45s (Maryland, EUA). A análise foi feita em 5
campos com aumento de 400x para cada caso, capturados com câmera
(Cannon A620, Ōita, Japão) utilizando microscópio óptico binocular
(Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Para a avaliação
foram selecionadas áreas hot spots, sem artefatos ou alta concentração
de hemossiderina. A imunoreatividade para RANKL e OPG foi
caracterizada pela marcação citoplasmática acastanhada e os valores
45
foram expressos por porcentagem de área marcada em cada amostra.
Também foi mensurada a relação RANKL/OPG para cada grupo.
Análise Estatística
Para a análise estatística dos achados clínicos, reações imuno-
histoquímicas, quantificação das células gigantes e núcleos foi aplicado
o teste exato de Fischer e Mann-Whitney, utilizando o software SPSS
18.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL, EUA). As correlações foram analisadas
utilizando o teste de Spearman. Os resultados foram expressos pela
média ± DP (desvio padrão) considerando o nível de significância de
5% (P <0.05).
RESULTADOS
Análise Clínica
Dos 20 casos estudados de LPCG 12 (60%) ocorreram nos
pacientes do gênero masculino, enquanto que nas LCCG 14 (70%)
ocorreram no sexo feminino (Figura 3). A média de idade dos pacientes
afetados pela LPCG foi de 37, 05 ± 23,89 anos enquanto a LCCG foi de
24,1± 17,67 anos. Nos dois grupos estudados o sitio anatômico mais
acometido foi a mandíbula (Figura 4, Tabela 1).
Análise Histológica
Não foi encontrada diferença estatística na quantificação de CGM
por mm² entre as LPCG e LCCG (P =0,245). No entanto o número de
núcleos das células gigante foi evidentemente maior nos casos de LCCG
(P = 0.010), sendo o número médio de núcleos de CGM/mm2 de 230,3
para LPCG e 336,7 para LCCG (Figura 2 A-B, Figura 5, Tabela 1).
Análise Imuno-histoquímica
A imunomarcação das proteínas RANKL e OPG foi evidenciada
em citoplasma e membrana plasmática das células gigantes
multinucleadas, e células mononucleadas do estroma como linfócitos e
células endoteliais. A marcação de células mononucleares foi observada
em todos os componentes da amostra, no entanto, em alguns casos, não
46
foi constatada a marcação de CGM, tanto para RANKL quanto OPG
(Figura 2C-F).
A expressão de RANKL foi maior em LCCG que em LPCG (P= 0,042) (Figura 6). No entanto não foi encontrada diferença significativa
entre as duas lesões na expressão de OPG (P= 0,091), mesmo que a
média de marcação tenha sido maior em LCCG (9,16) quando
comparada a LPCG (4,65). A razão de RANKL/OPG não apresentou
diferença estatística entre os dois grupos, mas foi observada uma
correlação positiva entre RANKL e OPG em LCCG e LPCG (r =
+0,638, P = 0,002 e r = + 0,792, P = 0,001 respectivamente) (Figura 7).
DISCUSSÃO
No presente estudo foram avaliadas lesões centrais e periféricas
de células gigantes. Ambas são descritas como lesões benignas que
afetam os tecidos gnáticos e, apesar de apresentarem as mesmas
características histológicas, observa-se um comportamento clínico
distinto. A LPCG é mais comum que a LCCG (Florez-Moreno et al.,
2008), ambas podem ocorrer em qualquer idade. Em nosso estudo foi
observado uma prevalência de pacientes jovens, de acordo com outros
estudos descritos na literatura ( Motamedi et al., 2007, Sun et al., 2009,
Aghbali et al., 2013).
A respeito da distribuição de gênero, nossos resultados
apresentaram uma predileção pelo sexo masculino em LPCG,
diferentemente da LCCG onde foi encontrada maior prevalência do sexo
feminino, concordando com outros dados encontrados na literatura
(Motamedi et al., 2007, Zarei et al., 2007, Salum et al., 2008, Sun et al.,
2009, Reddy et al., 2012, Aghbali et al., 2013). Sobre o sítio anatômico
mais afetado, nosso estudo encontrou predileção pela mandíbula em
ambas as lesões, assim como descrito por outros autores (Motamedi et
al., 2007, Shadman et al., 2009, Sun et al., 2009, Florez-Moreno et al.,
2008).
Sobre os aspectos microscópicos, foi encontrado no presente
estudo um número maior de núcleos por CGM nas LCCG quando
comparada a LPCG, consistente com outros estudos (Aghbali et al.,
2013, Florez-Moreno et al., 2008). Apesar de essas lesões apresentarem
características histológicas similares, elas apresentam comportamento
clínico distinto. Muitas pesquisas têm sido realizadas para tentar
explicar essa diferença como a avaliação citomorfométrica no número
de CGM e de núcleos por célula gigante. Aghbali et al (2013)
analisaram os aspectos microscópicos dessas lesões e observaram que a
47
média de número de núcleos por CGM foi de 9,54 nas LCCG e 8,58 nas
LPCG; Florez-Moreno e coautores (2008) encontraram um número
maior de núcleos por CGM nas LCCG que nas LPCG.
A quantificação de células gigantes presente nessas lesões
também tem sido realizada como uma ferramenta com o objetivo de
prever o comportamento clínico dessas lesões, assim como no feito por
Ficarra et al (1987) que avaliaram 32 casos de LCCG divididos em dois
grupos, não agressiva e agressiva e observaram um maior número de
núcleos em CGM no grupo das lesões agressivas. Em outro relato, o
maior número de núcleos por CGM foi observado no tumor de células
gigantes (TCG) quando comparado a LCCG (Auclair et al., 1988).
Considerando a expressão de RANKL e OPG em LPCG e LCCG,
são poucos os relatos descritos na literatura. Em nosso estudo foi
observado maior expressão de RANKL em LCCG comparado a LPCG,
este resultado é esperado uma vez que a LCCG é uma lesão intraóssea e
apresenta alta atividade osteolítica. A expressão de RANKL em LCCG
também foi maior quando comparado a displasia fibrosa (DF) e cisto
ósseo simples (COS); a DF e COS apresentaram maior expressão de
OPG nas amostras analisadas (Elias et al., 2010). Em outra pesquisa, foi
analisada a expressão de RANKL e c-fos, um fator de transcrição
ativador do complexo de proteína 1, essencial para osteoclastogênese em
LCCG (Ahmed & Dunlap, 2016), e os autores constataram uma forte
imunoreatividade para ambos os marcadores, essa marcação foi
classificada como difusa, como observada em nosso estudo. Fanourakis
et al (2010) avaliaram a expressão de RANKL e OPG em 22 casos de
LPCG, e observaram uma alta expressão desses marcadores nas
amostras analisadas.
O padrão de marcação citoplasmática e de membrana de
superfície encontrada em nossas amostras está de acordo com outros
estudos descritos na literatura (da Silva et al., 2008, Andrade et al.,
2008, de Matos et al., 2013, Ahmed & Dunlap, 2016, Chuang et al.,
2009), assim como reação positiva em células mononucleares como as
células endoteliais, linfócitos e fibroblastos (da Silva et al., 2008,
Andrade et al., 2008, de Matos et al., 2013, Ahmed & Dunlap, 2016,
Chuang et al., 2009). Alguns relatos sobre o tumor de células gigantes
descrevem que a superexpressão de RANKL em células mononucleares
podem representar o verdadeiro componente neoplásico nessas lesões
(Atkins et al., 2000, Huang et al., 2000, Branstetter et al., 2012). Devido
a LCCG ser uma lesão osteolítica era esperado que se observasse maior
expressão de RANKL do que OPG. No entanto, não foi encontrada
diferença significativa na expressão destes marcadores na LCCG, assim
48
como não houve diferença estatística entre a razão RANKL/OPG
quando comparada a LPCG com a LCCG. Estudos relacionados à
osteoclastogênese sugerem que as diferenças entre os marcadores
RANKL e OPG podem determinar a atividade osteolítica das lesões
(Elias et al., 2010, de Matos et al., 2013, Andrade et al., 2008). Os
resultados encontrados na corrente pesquisa podem ser justificados
provavelmente por outras vias que também interferem diretamente na
osteoclastogênese e não somente o sistema RANKL/OPG.
Não foram encontrados na literatura estudos prévios que
comparassem a expressão de RANKL e OPG em LCCG e LPCG,
acarretando na falta de um estudo de referência e para comparação dos
nossos resultados. Ainda, diferentes fontes de anticorpos utilizados e
métodos de quantificação dificultam a comparação com outros estudos.
Além disso, a LCCG e a LPCG são caracterizadas pela presença de
grande quantidade de hemossiderina dificultando a análise da reação
positiva dessas áreas, devido a isso, essas áreas foram excluídas da
nossa avaliação. Ademais, dados incompletos dos pacientes
impossibilitam uma melhor correlação entre as características clinicas e
os aspectos histológicos.
O conhecimento referente a expressão de RANKL e OPG em
patologias ósseas tem acarretado em informações novas e válidas para o
melhor entendimento dos mecanismos que regulam a osteoclastogênese
em situações fisiológicas e patológicas. Nossos achados mostraram uma
maior expressão de RANKL em LCCG que pode explicar a diferença de
comportamento clínico entre a LCCG e a LPCG e a distinta patogênese
dessas lesões. No entanto, mais estudos são necessários para esclarecer e
confirmar esses achados.
49
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52
53
Tabela 1- Características clínicas, microscópicas e imuno-histoquímica
dos pacientes com lesão central e periférica de células gigantes.
LPCG, lesão periférica de células gigantes; LCCG, lesão central de
células gigantes; CGM, células gigantes multinucleadas; RANKL,
Ligante do receptor ativador do fator nuclear KB; OPG,
osteoprotegerina; DP, desvio padrão; * Teste exato de Fischer; ** Teste
Mann-Whitney.
LPCG (n=20) LCCG (n=20) P-valor
Idade (média ± DP) 37,05 ± 23,89 24,05 ± 17,67 0,168
Gênero
Feminino
Masculino
8
14
0,057
12 6
Sítio Anatômico
Mandíbula
Maxila
14
15
0,004*
6 5
CGM/ mm² 39,3 ± 19,1 46,7 ± 20,2 0,245
Núcleos CGM/mm² 230,3 ± 106,1 336,7 ± 144,3 0,010**
RANKL (%/área) 4,9 ± 3,1 10,2 ± 8,3 0,042**
OPG (%/área) 4,6 ± 2,7 9,1 ± 7,9 0,091
RANKL/OPG 1,16 1,76 0,330
54
55
Figura 2 A,B Microfotografia apresentando alta proliferação de
células gigantes multinucleadas (CGM) em lesão periférica de
células gigantes (LPCG) e lesão central de células gigantes
(LCCG) respectivamente (hematoxilina & eosina, aumento
400x). Expressão imunohistoquímica do ligante do receptor
NF- kappaB e osteoprotegerina em CGM e células
mononucleares de LPCG (C,E) e LCCG (D,F),
respectivamente (aumento original 400x)
A B
C D
E F
56
57
Figura 3. Proporção dos casos de lesão periférica de células
gigantes e lesão central de células gigantes relacionados ao
gênero. LPCG- Lesão periférica de células gigantes. LCCG-
Lesão central de células gigantes
58
59
Figura 4. Localização anatômica dos pacientes com lesão
periférica de células gigantes e lesão central de células
gigantes. LPCG- Lesão periférica de células gigantes. LCCG-
Lesão central de células gigantes
60
61
Figura 5. Quantificação de núcleos das células gigantes
multinucleadas em lesões periféricas e centrais de células
gigantes. LPCG- Lesão periférica de células gigantes. LCCG-
Lesão central de células gigantes
62
63
Figura 6. Análise comparativa da imunoexpressão de RANKL
em lesões periféricas e centrais de células gigantes. LPCG-
Lesão periférica de células gigantes. LCCG- Lesão central de
células gigantes.
64
65
Figura 7. Correlação positiva entre os imunomarcadores
RANKL e OPG em lesões periféricas e centrais de células
gigantes. RANKL- Ligante do receptor fator nuclear Kappa B.
OPG- Osteoprotegerina.
66
67
5. CONCLUSÃO
De acordo com o presente estudo, é possível concluir:
Houve uma prevalência do sexo feminino nas LCCG e do
sexo masculino nas LPCG;
A maioria dos pacientes afetados teve idade inferior a 30
anos e a mandíbula foi o sítio anatômico mais acometido
em ambas as lesões;
A quantidade de núcleos por CGM foi significativamente
maior nas LCCG;
A expressão de RANKL foi maior nas LCCG quando
comparadas a LPCG;
Não foi encontrada diferença estatística na expressão de OPG
entre a LCCG e a LPCG;
Os resultados observados podem complementar o
conhecimento sobre a distinta patogênese dessas lesões,
bem como a diferença no comportamento clínico entre a
LCCG e LPCG.
68
69
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79
ANEXO A – Parecer Consubstanciado do CEPSH
80
81
82
83
APÊNDICE A - Metodologia Expandida
DELINEAMENTO DO ESTUDO
O estudo proposto é de natureza básica, observacional descritivo
retrospectivo.
ASPECTOS ÉTICOS E LEGAIS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com
Seres Humanos (CEPSH) da UFSC sob o número 1.468.638.
SELEÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras deste estudo retrospectivo foram selecionadas nos
arquivos do Laboratório de Patologia Bucal (LPB) da UFSC, de 2006 a
2016. A seleção dos casos foi feita com base nas fichas de biópsia,
laudos anatomopatológicos e na análise das lâminas coradas no H&E.
Foram selecionados 20 casos de Lesões Centrais de Células Gigantes e
20 casos de Lesões Periféricas de Células Gigantes. Como critério de
inclusão, os casos de LCCG deveriam conter informação referente ao
aspecto radiográfico e as amostras teciduais emblocadas em parafina
tinham que conter material suficiente para a aplicação de reações imuno-
histoquímicas.
QUANTIFICAÇÃO DAS CÉLULAS GIGANTES
MULTINUCLEADAS, BEM COMO SEUS NÚCLEOS.
Todos os casos foram histopatologicamente revisados por meio
das lâminas histológicas coradas em hematoxilina & eosina (H&E) e foi
realizada a quantificação das CGM, bem como seus núcleos. As lâminas
tiveram sua identificação mascarada de forma que a captura das imagens
e a análise microscópica fosse feita por um examinador cegado quanto
ao grupo a que cada lâmina pertencia. Foram capturados cinco campos
de cada lâmina, em aumento de 400x por meio de microscópio óptico
binocular (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), acoplado
84
a um sistema de aquisição de imagem digital (A620, Cannon, Lake
Success, NY, USA) e a um microcomputador (HP Compaq 6005, São
Paulo, Brasil), onde foram armazenadas as imagens.
Em cada lâmina histológica e com o auxílio do software Image J
1.45s (Maryland, USA), foi avaliada a quantificação das CGM (CGM) e
de seus respectivos núcleos. Os parâmetros de análise incluiram: número
de CGM e dos núcleos identificados por mm2 de tecido conjuntivo.
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
As amostras foram submetidas à técnica de imunoistoquímica
pelo método da estreptavidina-biotina-peroxidase. Todos os
procedimentos foram realizados no LPB. Para cada um dos anticorpos
foi seguido às orientações do fabricante e padronização, assim como foi
incluído controle negativo com omissão do anticorpo primário para cada
reação. O controle negativo de todas as reações foi realizado pela
omissão do anticorpo primário. Das amostras fixadas em formol e
emblocadas em parafina foram obtidos cortes de 3µm de espessura,
estendidos em lâminas de vidro preparadas com solução de ATPS,3-
aminopropyltriethoxysilene, (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Os cortes
foram inicialmente fixados na lâmina mantendo-as em estufa a 65ºC,
durante 8 horas. Foi realizada a desparafinização com dois banhos de
xilol, o primeiro overnight e o segundo durante 20 minutos, e em
seguida foi realizada a reidratação dos cortes com 3 banhos de álcool
etílico absoluto, 1 banho de álcool a 95%, 1 banho de álcool etílico a
85%, e 2 banhos de água destilada, todos de 5 minutos. Para o bloqueio
da peroxidase endógena foi realizado duas imersões de 20 e 10 minutos,
respectivamente, em solução de peróxido de hidrogênio a 6% em álcool
metílico (80 ml de álcool metílico com 20ml de água oxigenada). A
reativação antigênica foi realizada mantendo as lâminas em solução de
tampão citrato 0,01M, pH 6,0, em banho-maria a temperatura constante
de 96ºC, durante 40 minutos. Após esse período as lâminas foram
retiradas do banho maria e aguardou-se até que atingissem a temperatura
ambiente. Em seguida foram realizados 2 banhos de 5 minutos de PBS.
Para o bloqueio de ligações inespecíficas, foi realizado 40 minutos de
incubação em solução de leite desnatado a 5% em PBS (5g de leite
desnatado 5% com 100ml de PBS), seguido de dois banhos de PBS de 5
minutos cada. A incubação com os anticorpos primários foi realizada
em câmara úmida mantida sob refrigeração (4 a 8°C), durante 18 horas.
Os anticorpos primários utilizados foram RANKL (Santa Cruz
85
Biotechnology, CA, EUA), na diluição 1:200; e OPG (Santa Cruz
Biotechnology, CA,EUA) também na diluição 1:200.
Para amplificação da reação foi utilizado anticorpo secundário
(chicken anti-goat IgG-HRP, CA, EUA), na diluição 1:500, pelo período
de 45 minutos. Na sequência foi realizado um banho em PBS de 5
minutos, seguido por incubação do anticorpo terciário Vectastain ABC
(Vector Laboratories, Burlingame,EUA) sendo uma gota de cada
reagente diluído em 5ml de PBS por 45 minutos. Após 2 banhos de PBS
de 5 minutos foi realizada a revelação da reação através de solução
cromógena, contendo diaminobenzidina (DAB) em tampão Tris-HCl
0,05M, pH 7,4, com exposição de cada corte por 3 minutos e banho de
água destilada de 5 minutos. Após a revelação, foi realizada a contra-
coloração das lâminas com hematoxilina de Harris, por 5minutos. A
remoção do pigmento formólico deu-se por rápida imersão das lâminas
em solução de hidróxido de amônia 1 % e subsequente lavagem em água
corrente durante 2 minutos. Os cortes foram novamente submetidos à
desidratação com uma sequência de 1 banho de álcool etílico 85%, 1
banho de álcool etílico 95%, 3 banhos de álcool absoluto, todos por 5
minutos. E para finalizar, foi realizado dois banhos de 20 minutos no
xilol. A montagem das lâminas foi realizada com Entellan (Merck,
Darmstadt Alemanha). Após essa etapa, as lâminas foram mantidas em
estufa (40ºC) por no mínimo 24 horas antes de serem examinadas ao
microscópio de luz.
ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA
Para avaliação das reações foi utilizado o software ImageJ 1.45q
(National Institutes of Health) a partir de imagens capturadas com
câmera fotográfica (Cannon, A620, San Jose, CA, EUA) acoplada a
microscópio de luz (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).
Foram capturados 5 campos equidistantes de cada caso com
magnificação de 400X, totalizando um total de área tecidual analisada
de 1 mm2. As áreas hotspots de avaliação corresponderam a maior
integridade tecidual, com ausência de artefatos e evidente
imunomarcação.
Como os anticorpos RANKL e OPG apresentaram padrão de
marcação citoplasmática, os valores foram expressos em média de
porcentagem (%) de área imunomarcada. Nas lesões periféricas de
células gigantes o epitélio de revestimento foi excluído da avaliação.
86
Também foi calculada a relação RANKL/OPG em cada um dos
grupos analisados, comparando-os.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística dos achados clínicos, quantificação de
células gigantes e núcleos, e a reação imunohistoquímica foi aplicado
teste exato de Fischer e o teste Mann-Whitney, utilizando o software
SPSS, versão 18.0 (SPSS Inc., Chigaco, IL, EUA). As correlações
foram avaliadas utilizando o teste de Spearman. Os resultados foram
expressos pela média ± DP (desvio padrão) com nível de
significância estatística considerado de 5% (P <0.05).
87
ANEXO B – Guia de informações ao autor
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![[Empresa] - oseculo.ptoseculo.pt/fos/wp-content/uploads/2018/02/RACONTAS-FOS-2016.pdf · de 2016 respostas sociais que deram apoio a um total de 735 clientes desde os 4 ... • Foram](https://static.fdocumentos.com/doc/165x107/5c003f4609d3f20e6b8c97be/empresa-de-2016-respostas-sociais-que-deram-apoio-a-um-total-de-735-clientes.jpg)
