Imunologia Clínica e Laboratorial

DOCÊNCIA EM

SAÚDE

IMUNOLOGIA CLÍNICA E LABORATORIAL

1

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Portal Educação

P842i Imunologia clínica e laboral/ Portal Educação. - Campo Grande: Portal

Educação, 2012.

94p. : il.

Inclui bibliografia

ISBN 978-85-8241-156-8

1. Imunologia clínica. 2. Imunologia laboral. I. Portal Educação. II. Título.

CDD 616.079

2

SUMÁRIO

1 HISTÓRICO (DESCOBERTA DE ANTICORPOS E RELAÇÃO COM ANTÍGENOS) ............... 3

2 ANTICORPOS: ESTRUTURA, DIFERENTES SUBCLASSES E FUNÇÃO .............................. 9

3 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO E AGLUTINAÇÃO .................................................................. 18

4 QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ANTIGÊNICA OU DE ANTICORPOS................... 25

5 MÉTODOS QUALITATIVOS ..................................................................................................... 37

6 IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS EM CÉLULAS E ANTÍGENOS ......................................... 42

7 METODOLOGIAS COM USO DE BIOLOGIA MOLECULAR ................................................... 49

8 PRINCIPAIS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS PROPOSTOS PELO MINISTÉRIO DA

SAÚDE BRASILEIRO PARA AS SEGUINTES DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS ....... 58

REFERÊNCIAS ................................................................................................................................... 87

3

1 HISTÓRICO ( DESCOBERTA DE ANTICORPOS E RELAÇÃO COM ANTÍGENOS)

O sistema imune é capaz de garantir a proteção mais eficaz de indivíduos, numa

população natural, contra os mais diversos tipos de agentes infecciosos, como:

1. Bactérias (Figura 1);

2. Vírus (Figura 2);

3. Fungos (Figura 3);

4. E parasitas (Figura 4).

Este sistema é geralmente dividido em resposta imune inata e adaptativa.

Na resposta imune inata temos os seguintes mecanismos de defesa:

I. Barreiras contrainfecções como a pele;

II. Células fagocitárias e sistema complemento;

III. Proteínas de fase aguda como a proteína C-reativa;

IV. Citosinas inflamatórias;

V. Células natural killer (NK);

VI. Eosinófilos.

Já na resposta imune adaptativa temos:

I. Estrutura e função de anticorpos;

II. Anticorpos e também alguns componentes do sistema complemento;

III. Base celular de formação de anticorpos;

IV. Memória imunológica;

V. Vacinas;

VI. Respostas, primária e secundária.

4

A resposta imune adaptativa é iniciada quando há um reconhecimento específico dos

antígenos seja por anticorpos e alguns componentes do sistema complemento, sejam por meio

do receptor de antígenos de linfócitos T (TCR).

Antes de mais de nada, deve-se sempre lembrar o princípio formulado por Theodosius

Dobzhansky de que “Nada em biologia faz sentido, a não ser à luz da evolução”. Deste modo, as

relações evolutivas das respostas imunes, inata e adaptativa adquirem contornos claros para a

ciência imunogenética, em especial quando se estudam aspectos que evoluem as relações entre

micro-organismos e a imunidade. Portanto, a resposta imune é resultante da coevolução e os

processos de ativação, supressão e regulação que se desenvolvem no decorrer do

desenvolvimento da resposta imune e que envolvem o discernimento deste sistema do que é

“próprio” e “não próprio”.

Figura 1: Foto mostrando diferentes cepas bacterianas. Disponível em:

<http://www.bioamn.blogspot.com/>. Acesso em: 07 fev. 2009.

5

Figura 2: Foto exemplificando vírus. Disponível em: <http://www.bioamn.blogspot.com/>. Acesso

em: 07 fev. 2009.

Figura 3: Foto exemplificando fungos sobre tronco na natureza. Disponível em:


6

Figura 4: Foto exemplificando parasitas, sendo que neste caso, são nematelmintos. Disponível

em: <www.infoescola.com/.../nematelmintos-nematoda/>.

Acesso em: 07 fev. 2009.

Histórico:

Há mais de um século o conceito de discriminação entre o “próprio” e o “não próprio”

pelo sistema imune foi introduzido por bacteriologista Paul Ehrlich, aproximadamente em 1890

(Figura 5).

O termo “balas mágicas” foi criado por tal cientista, dando origem ao conceito de

"receptores específicos" em Biologia. Paul Ehrlich realizou experimentos nos quais ele constatou

que alguns tecidos se coravam com apenas certos corantes. Com tal observação, ele concluiu

que tais tecidos exibiam "receptores" específicos para os corantes utilizados nos experimentos

que realizou. Nessa época (em meados de 1890), nascia a Imunologia como um ramo da

Bacteriologia Médica, ela própria um ramo nascente da Medicina experimental criado por

Pasteur e Koch.

7

Um pouco mais tarde, em 1908, Paul Ehrlich, juntamente com Ilja I. Mechnikov que

também realizou trabalhos com imunidade, ambos receberam o prêmio Nobel de Medicina.

Figura 5: Foto do médico alemão Paul Ehrlich que introduziu o conceito do que é “próprio” e o

“não próprio” pelo sistema imune em aproximadamente 1890.

Relação de anticorpos com antígenos:

A reação do anticorpo contra antígeno é conhecida como antígeno-anticorpo. Os

anticorpos são glicoproteínas presentes no sangue do hospedeiro. Já os antígenos são

quaisquer substâncias dos agentes infecciosos que ao serem introduzidos no hospedeiro são

capazes de desencadearem a resposta imune com o reconhecimento e produção de anticorpos

e ativação de células do sistema imune.

O reconhecimento dos anticorpos dos diversos antígenos presentes em diferentes

patógenos [bactérias (Figura 1), vírus (Figura 2) fungos (Figura 3) e parasitas (Figura 4)]

envolve ligações reversíveis e não covalentes como pontes de hidrogênio, interações

hidrofóbicas e de Van der Waals e ligações iônicas (Figura 6).

A força de ligação entre anticorpo e antígeno é denominada afinidade. Esta força é

comumente representada pela dissociação constante, ou seja, o Kd, é capaz de descrever a

8

concentração dos antígenos necessária para ocupar os locais de ligação de ½ das moléculas de

anticorpos presentes em uma solução com anticorpo.

Um Kd menor indica uma interação de afinidade mais forte e maior, uma vez que uma

concentração menor de antígenos se faz necessária para ocupar os espaços de ligação.

Figura 6: Esquema de ligação de anticorpos do tipo IgE ou IgG a antígenos representados na

figura por quadrados em laranja presentes na superfície de um determinado patógeno. PAULA,

Patrícia Ferreira de. Defesa de Mestrado em: Imunologia pelo Instituto de Ciências Biomédicas

da USP-SP (2003).

Para anticorpos específicos para antígenos naturais, o Kd usualmente varia de 10-7 a

10-11M. O soro de um indivíduo imunizado conterá uma mistura de anticorpos com diferentes

afinidades ao antígeno de determinado patógeno.

Já a avidez consiste da força total de ligação entre anticorpo e antígeno, ou seja, leva

em consideração que a dobradiça da região dos anticorpos fornece a eles flexibilidade,

permitindo-o que um único anticorpo seja capaz de se ligar a antígenos multivalentes por mais

de um local de ligação. Deste modo, embora a afinidade de qualquer um dos locais de ligação

ao antígeno será a mesma para cada epítopo (porção específica do antígeno no qual se liga ao

anticorpo), a força de ligação do anticorpo ao antígeno deverá levar em consideração a ligação a

todos os locais de todos os epítopos do antígeno disponível.

9

2 ANTICORPOS - ESTRUTURA, DIFERENTES SUBCLASSES E FUNÇÕES:

Os anticorpos se encontram presentes tanto em fluídos corpóreos como na superfície

de um número limitado de tipos celulares (Figura 7).

Os linfócitos B são as únicas células capazes de produzir anticorpos e quando se inicia

esta produção, passam a ser chamados de plasmócitos. Em um indivíduo adulto saudável com

70 kg é capaz de produzir cerca de três gramas de anticorpos por dia (Figura 7).

Figura 7: Esquema mostrando principalmente, linfócitos B produzindo anticorpos. Disponível em:


Estrutura molecular dos anticorpos:

Os diferentes anticorpos, também denominados imunoglobulinas ou isótipos

compartilham as mesmas características estruturais básicas, mas são consideravelmente

variáveis nos locais que se ligam aos antígenos (Figura 8). Tal variabilidade é importante, pois

10

permite que diferentes anticorpos sejam capazes de se ligarem a um número grande de

antígenos, variando de 107 a 109.

Cada molécula de anticorpo tem um núcleo simétrico composto de duas cadeias leves

(VL - Figura 8, cada com aproximadamente 24 kD) e duas cadeias pesadas (VH - Figura 8 cada

com aproximadamente 55 ou 77 kD) (Figura 8).

Diferentes subclasses de anticorpos (isótipos):

As moléculas de anticorpos podem ser divididas em classes e subclasses diferentes

em relação às suas cadeias pesadas. As diferentes classes de anticorpos também denominadas

isótipos e nos seres humanos são subdivididas em subclasses como mostra a Tabela 1.

Figura 8: Diagrama esquemático da estrutura básica referente a uma molécula de anticorpo do

isótipo IgG (imunoglobulina G). Adaptado de Abbas et al., 2000.VH: Cadeia pesada; VL: Cadeia

leve.

Local de ligação

ao antígeno

Receptor Fc e regiões de

ligação de proteínas do

sistema complemento

VL VL

VH

VH

CL CL

CH1 CH

1

CH

2

CH

2

CH

3

CH

3

Dobradiça

11

Tabela 1: Classes e subclasses de anticorpos humanos e suas principais

características. Adaptado de Abbas et al. (2000).

Anticorpo

ou

imunoglobu

lina

Subcla

sses

Concentração no

soro humano

(mg/mL)

Forma

Secretória

Funções

IgA IgA1 3,0 Monômero,

dímero, trímero

Imunidade da mucosa e neonatal

IgA2 0,5 Monômer,

dímero, trímero

IgD Não

tem ___ Não tem

Receptora de antígenos em linfócitos

B não ativados

IgE Não

tem 0,05 Monômero Hipersensibilidade imediata

IgG IgG1 9 Monômero Opsonização,

Ativação do sistema complemento,

citotoxidade

dependente de anticorpo, imunidade

neonatal, imunidade passiva, feedback

negativo

dos linfócitos B

IgG2 3 Monômero

IgG3 1 Monômero

IgG4 0,5 Monômero

IgM Não

tem 1,5 Pentâmero

Receptora de antígenos de linfócitos B

não ativados, ativação do sistema

complemento

___ Concentração indetectável.

12

Principais funções dos anticorpos e suas classes e subclasses:

As diferentes funções das moléculas de anticorpos são desencadeadas por intermédio

de suas capacidades de se ligarem especificamente aos diferentes antígenos e também, por

serem capazes de interagir com outras moléculas efetoras do sistema imune como o sistema

complemento, e diferentes células do sistema imune. Desta maneira, as funções efetoras dos

diferentes anticorpos são dependentes de suas interações com os diversos antígenos derivados

dos mais diversos tipos de patógenos que estão presentes no hospedeiro. No entanto, os

anticorpos podem interagir com os antígenos do próprio hospedeiro, e assim, muitas doenças

podem ser desencadeadas como as doenças autoimunes.

A especificidade é um aspecto muito importante do reconhecimento ao antígeno

aonde as moléculas de anticorpos podem se ligarem especificamente aos antígenos,

apresentando diferenças pequenas entre suas estruturas bioquímicas.

Essa especificidade é aplicada ao reconhecimento dos diferentes antígenos por todas

as classes de anticorpos (Tabela 1). Além disso, devido às constituições bioquímicas de todos

os organismos vivos serem fundamentalmente similares, o elevado grau de especificidade será

tal que os anticorpos produzidos em respostas aos antígenos geralmente não se ligarão com

moléculas próprias estruturalmente similares. Algumas vezes, no entanto, alguns anticorpos que

são produzidos em resposta aos micróbios, apresentam reação cruzada aos antígenos do

próprio hospedeiro que pode ser a base para certas doenças imunológicas como as doenças

autoimunes. Tal fato refere-se à reação cruzada encontrada em diversas técnicas de

imunodiagnósticos que será mais bem discutido no Módulo II.

As respostas das moléculas de anticorpo variam dependendo do tipo do antígeno,

envolvendo vários tipos celulares da resposta imune como macrófagos e linfócitos T, a história

prévia de exposição ao antígeno e o local anatômico de entrada deste antígeno.

13

Funções das diferentes classes de anticorpos propriamente ditas:

As principais funções efetoras das moléculas de anticorpos são o reconhecimento de

antígenos, a neutralização, eliminação de patógenos e de suas toxinas. Como já dito acima, a

eliminação dos antígenos que é mediada por anticorpos requer a participação de outros sistemas

efetores da resposta imune como os macrófagos (Figura 9) e as proteínas do sistema

complemento (Figuras 10 e 11; Tabela 1).

Figura 9: O anticorpo interage com o organismo infeccioso permitindo que este seja mais bem

reconhecido pelo macrófago (célula em laranja claro) e agindo assim, como importante opsonina.

Os macrófagos, assim como as células dendríticas são células apresentadoras de

antígenos, também chamados de APC, ou seja, células capazes de interagirem com os

antígenos por meio do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), uma grande região

genômica capaz de apresentar antígenos próprios e não próprios. No entanto, no exemplo da

Figura 9, o macrófago interage com o antígeno por meio dos anticorpos que neste caso

M

14

funcionam como moléculas facilitadoras da fagocitose, processo esse que faz parte da resposta

imune inata.

O sistema complemento é formado por mais de 30 proteínas presentes no soro ou na

parede celular de diferentes tipos celulares de hospedeiros e patógenos e pode ser ativado por

três vias diferentes: a via clássica, alternativa e da lectinas. A via clássica é ativada quando

isótipos do tipo IgG ou IgM ligados especificamente a antígenos presentes em diversos

patógenos, associam-se à C1q do complexo C1, que é formado pela associação de duas

moléculas de C1r e duas moléculas de C1s e C1q (Figura 10). Com a ligação do componente

C1q a imunocomplexos, há uma mudança conformacional dessa molécula permitindo que as

moléculas C1r se autoativem e subsequentemente, ativem C1s. Com a ligação do componente

C1q a imunocomplexos, há uma mudança conformacional dessa molécula permitindo que as

moléculas C1r se autoativem e subsequentemente, ativem C1s. Com a ativação da serino-

protease C1s, há a clivagem de C4 em C4a e C4b e de C2 em C2a e C2b (Figura 10).

Os fragmentos C2a permanecem ligados aos fragmentos C4b formando o complexo

chamado de C3 convertase da via clássica, por apresentar atividade enzimática sobre as

moléculas de C3, clivando-as em C3a e C3b (Figura 10). A anexação de vários fragmentos de

C3b ao complexo enzimático C4bC2a gera atividade enzimática sobre C5 (C5 convertase)

clivando-o em C5a e C5b (Figura 10). A partir deste ponto, inicia-se a formação do complexo

molecular denominado complexo de ataque à membrana (MAC) (Figuras 10 e 11). Esse

complexo é formado a partir da associação de C6, C7, C8 e várias moléculas de C9 e é capaz

de provocar alterações na membrana ou parede celular do patógeno, podendo acarretar em

ruptura e lise celular (Figuras 10 e 11; Tabela 1).

Um resumo das diferentes funções dos anticorpos já foi apresentado na Tabela 1.

15

Figura 10: Esquema mostrando a eliminação de determinado antígeno (em verde) através da

formação do complexo de ataque à membrana (MAC) formado a partir da ativação do sistema

complemento via clássica. PAULA, Patrícia Ferreira de. Defesa de Mestrado em Imunologia pelo

Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2003).

C1r2C1s2

C1q

C1

VViiaa cclláássssiiccaa::

C4a

C4 C4b

CC11ss

C2b

C2 C2a

CC11ss

C4b C2a

C3b

C4b2a3b C4b2a

C3 C3a C5 C5a

C5b

MAC

C5b

C6 C

7 C8

C9

16

Figura 11: Micrografia eletrônica demonstrando poros na parede celular promovidos pela

ativação do sistema complemento através da formação do complexo de ataque a membrana

(MAC) na bactéria gram-negativa Shigella dysenteriae. Disponível em:

<users.rcn.com/.../BiologyPages/C/Complement.html>. Acesso em: 14 fev. 2009.

As funções dos anticorpos estão condicionadas à forma como são produzidos. Os

anticorpos são primeiramente gerados a partir de seus primeiros contatos com o antígeno

(resposta primária) e quando interagem através de um segundo contato (resposta

secundária), são derivados da ativação de linfócitos B denominados linfócitos B de memória

(Figura 12). Desta forma, a resposta secundária se desenvolve mais rapidamente, de forma

mais intensa e duradoura, apresentando quantidades maiores de anticorpos do que a resposta

primária (Figura 12).

17

Figura 12: Esquema mostrando a cinética das repostas imunes dependentes de anticorpos

primárias e secundárias. Disponível em:


A) 1ª exposição: 1º contato com o antígeno desencadeia resposta imune primária,

durante a qual são ativados linfócitos B e T que se diferenciam em células efetoras e de

memória.

B) e C) 1ª e 2ª exposições: Eliminando os antígenos, as células efetoras

desaparecem, permanecendo as células de memória que promoverão uma resposta secundária

mais rápida, intensa e prolongada frente a um segundo contato com o antígeno que

desencadeou a resposta primária.

A) 1ª exposição

C) 2ª exposição

B) 1ª exposição

18

3 REAÇÃO DE PRECIPITAÇÃO E AGLUTINAÇÃO

Precipitação

Interações polivalentes entre anticorpos e antígenos apresentam significância

biológica. Uma concentração correta de imunocomplexos (anticorpos-antígenos interagindo

polivalentemente) é denominada “zona de equivalência”. (Figura 13). Neste contexto, os

imunocomplexos formam uma extensiva rede de moléculas ligadas não covalentemente de tal

forma que a maioria das moléculas de anticorpos e antígenos estará sobre a forma de

complexadas em grandes massas (Figura 13).

A reação de precipitação é um conceito importante, uma vez que imunocomplexos são

formados naturalmente durante o desenvolvimento da resposta imune e, caso eles não sejam de

alguma forma retirados de circulação, eles poderão se acumular em diferentes tecidos do

hospedeiro, levando a injúria do tecido (Figura 13).

O acúmulo de imunocomplexos nos diferentes tecidos poderá levar a doenças

autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico (LES). Esta doença autoimune é crônica e apesar

de ser de etiologia desconhecida, por intermédio de pesquisas científicas já se sabe que é

multifatorial. A LES acomete principalmente mulheres de 20 a 30 anos de idade, sendo cerca de

90% dos casos.

Indivíduos primariamente deficientes de proteínas do sistema complemento como

pacientes deficientes de C1q, C1r, C1s, C2, C3 e C4 foram descritos com LES. Como os

fragmentos C3b e C4b gerados a partir da ativação deste sistema são importantes para

solubilização e remoção de imunocomplexos da circulação sanguínea, pacientes deficientes das

proteínas do sistema complemento, tendem ter depósitos de grandes redes de imunocomplexos

em diversos tecidos podendo levar ao LES, bem como outras doenças autoimunes como a

glomerulonefrite. Além disso, a reação de precipitação é utilizada em diferentes métodos de

imunodiagnósticos, como será visto a partir do Módulo II.

19

Figura 13: Curva mostrando como ocorre a reação de precipitação quando há excesso de

anticorpos em solução (Zona excesso de Anticorpos); quando há a concentração adequada de

imunocomplexos (Zona de Equivalência) e por fim, quando há excesso de antígenos em

solução (Zona de Excesso de Antígenos).

Aglutinação

O fundamento básico das técnicas de aglutinação é similar ao princípio das técnicas

que se utilizam do conceito de precipitação. No entanto, a reação de aglutinação baseia-se na

capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno presente em uma superfície de uma grande

partícula de tal forma que leva a uma alteração do estado físico do antígeno que é denominada

interação secundária (Figuras 14, 15 e 16).

A interação secundária pode ser identificada de diferentes maneiras como, por

exemplo, quando o antígeno está presente em uma superfície de uma partícula grande como

uma bactéria, fungos, látex ou um eritrócito; os anticorpos, uma vez ligados, levam estas

partículas se agruparem de modo visível num fenômeno conhecido como aglutinação (Figuras

14 e 15). Deste modo, as reações utilizadas para identificar os diferentes grupos sanguíneos

(ABO e Rh) utilizam-se deste princípio sendo, neste caso, denominada de hemoaglutinação (do

grego, haima, sangue).

ZZoonnaa ddee EExxcceessssoo

ddee AAnnttííggeennooss

ZZoonnaa ddee

EEqquuiivvaallêênncciiaa

ZZoonnaa ddee EExxcceessssoo

ddee AAnnttiiccoorrppooss

20

Tal procedimento é utilizado para identificar qual grupo sanguíneo ABO (Figuras 14,

15 e 16) um indivíduo possui e também pode ser utilizado para o grupo Rh, mas se deve levar

em consideração que somente 75% dos indivíduos Rh positivos (D positivos) podem ser tipados

desta forma, uma vez que existem os D “fracos” que necessitam ser testados pela forma de

aglutinação indireta por meio da técnica Coombs indireto.

Para esta tipagem utiliza-se anticorpos (aglutininas) anti-A ou anti-B e anti-D que se

ligarão nos determinantes antigênicos A, B e D respectivamente presentes nas hemácias

(aglutinogênios) (Figuras 14, 15 e 16). Estes aglutinogênios estão presentes em um grande

número de cópias na superfície das hemácias, levando as células a se ligarem cruzadamente

entre si quando da ligação do anticorpo específico (Figuras 14, 15 e 16). Estas ligações

cruzadas ocorrem por meio da ligação simultânea de uma mesma molécula de anticorpo em

células diferentes, uma vez que cada molécula de imunoglobulina possui pelo menos dois sítios

de ligação ao antígeno (Figuras 8 e 16).

A) Amostra de sangue na placa teste:

B) Reagente anticorpo (Anti-A, Anti-B):

21

C) Mistura-se:

D) Controle negativo:

E) Leitura do resultado: Um resultado positivo é indicado por uma

aglutinação visível, como ilustrado abaixo.

22

Figura 14: Exemplificando tipagem sanguínea para sistema ABO em lâminas. Disponível em:

<www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 14/02/2009.

Figura 15: Foto mostrando o resultado final da reação de aglutinação em hemácias para sistema

ABO em lâminas. Disponível em: <www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 14/02/2009.

negativo positivo

23

Figura 16: Esquema mostrando a reação de aglutinação em hemácias. Disponível em:

<www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 14/02/2009.

A relação antígeno-anticorpo (Figura 17) tem sido aplicada nas mais diversas

metodologias para imunodiagnóstico das mais diferentes doenças existentes, sendo que, hoje,

cada vez mais, amplia-se o número destas metodologias para melhoria da relação custo-

benefício para os diversos laboratórios clínicos espalhados por todo o país.

Desta forma, com o intuito de que os tratamentos das diferentes doenças sejam mais

efetivos, rápidos e acurados por intermédio de um diagnóstico o mais precoce possível, mas com

um custo relativamente baixo; muitas metodologias já consagradas têm sido aprimoradas

(Ferreira de Paula & Waldman, 2009).

Neste módulo, serão apresentadas diferentes metodologias que estão separadas de

acordo com o seu objetivo.

AAnnttiiccoorrppoo

AAnnttííggeennoo

24

Figura 17: Esquema apresentando a interação antígeno-anticorpo, fenômeno utilizado

em todas as técnicas laboratoriais de imunodiagnóstico das mais diversas doenças existentes.

PAULA, Patrícia Ferreira de. Aula de defesa de Mestrado em Imunologia pelo Instituto de

Ciências Biomédicas da USP-SP (2003).

Antígeno

Anticorpo

25

4 QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO ANTIGÊNICA OU DE ANTICORPOS

a) Imunodifusão Radial Simples (Mancini, & Fahey, 1965)

A aplicação desta técnica tem sido utilizada para a quantificação de proteínas séricas,

como componentes do sistema complemento, anticorpos como imunoglobulinas (IgM), e

proteínas de fase aguda como a proteína C-reativa, que é uma proteína que quando está em

níveis elevados indicadora de infecção.

Nesta técnica, uma quantidade padronizada do anticorpo específico é incorporada ao

gel e a mistura é colocada sobre uma placa ou lâmina (Figuras 18 e 19). Após a geilificação, são

realizados orifícios no gel para a colocação do antígeno em volumes precisos em diferentes

diluições, além da amostra-padrão com suas concentrações conhecidas do antígeno a ser

quantificado (Figuras 18 e 19).

O antígeno se difunde de acordo com seu tamanho molecular e encontra o anticorpo

imobilizado no gel; à medida que mais antígeno chega o precipitado se dissolve (zona de

excesso de antígeno demonstrada na Figura 13 do Módulo I) e o antígeno migra mais,

encontrando novas moléculas de anticorpo. Após algumas horas de difusão, encontra-se a zona

de equivalência (Figura 13 do Módulo I e Figura 18), permitindo assim, que os complexos

antígenos-anticorpos se precipitem em um halo ao redor do orifício (Figuras 18 e 19).

O tempo para difusão depende do coeficiente do anticorpo, sendo que moléculas

maiores como alfa-2-macroglobulina e IgM, necessitam de até 96 horas para completar a

migração, enquanto moléculas pequenas podem completar a difusão em 24 horas.

A metodologia requer rigorosa padronização das condições e reagentes, como pureza

e concentração do gel de agarose, concentração do anticorpo incorporado ao gel, espessura do

gel na placa, uniformidade do tamanho do orifício, além do pH e concentração iônica do meio.

26

Figura 18: Esquema mostrando uma placa de imunodifusão radial simples ou Mancini onde, no

exemplo, pretende-se investigar o antígeno encontrado na amostra de soro humano. PAULA,

Patrícia Ferreira de. Aula de defesa de Mestrado em Imunologia pelo Instituto de Ciências

Biomédicas da USP-SP (2003).

Figura 19: Figura mostrando uma placa de imunodifusão radial simples ou Mancini. Disponível

em: <www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 21 fev. 2009.

Poços onde são

colocados padrões

e amostras a serem

dosados

Agarose

contendo

anticorpos

anti-IgG humana

Halo de precipitação

IgG – anti-IgG

Utilização: dosagem

de IgG, IgA e IgM e

proteínas séricas.

Ag Ag Ag Ag

Ag Ag Ag Ag

FFiilleeiirraa ggeerraallmmeennttee

uussaaddaa ppaarraa ooss ppaaddrrõõeess

110000%% 7755%% 5500%% 2255%%

110000%% 5500%% 110000%% 5500%%

27

Após a realização do experimento, os halos serão medidos utilizando régua apropriada

como mostra a Figura 20 e posteriormente, deverá ser realizado um gráfico da curva padrão

confrontando as concentrações conhecidas com os tamanhos de halos medidos em mm2, onde a

área desses halos é diretamente proporcional à concentração dos antígenos (Figura 20).

A) Mais detalhe:

B) Mais amplo:

Figura 20: Figura mostrando como se mede, utilizando uma régua específica, os halos da

técnica de Mancini. Disponível em:

<www2.ucg.br/cbb/professores/49/Medicina/3_Semana/Precipitacao.ppt>.


28

Figura 21: Figura mostrando a curva-padrão que deverá ser realizada a partir da medida dos

halos (mm2) comparando com as concentrações conhecidas dos padrões, para enfim, se

conseguir as concentrações desconhecidas das amostras. PAULA, Patrícia Ferreira de. Defesa

de Mestrado em Imunologia pelo Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2003).

As vantagens da imunodifusão radial simples são: facilidade de execução, tempo

curto de realização, não necessita de aparato especial.

Já as principais desvantagens são: baixa sensibilidade e especificidade e difícil

preservação do gel. A sensibilidade é uma característica inerente ao método, estreitamente

relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou de anticorpo que poderá ser detectada. A

especificidade indica que o método em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo

desejado.

b) ELISA e Radioimunensaio (RIA)

[Ag]

mm2 R

2 0,90

29

O ELISA (“Enzime-linked ImmunoSorbent Assay”) e o radioimunensaio (RIA) são

técnicas mais sensíveis que a de Manicini para determinar a concentração sérica de

determinado antígeno ou anticorpo.

O ELISA foi desenvolvido nos anos 1970 e muito difundido comercialmente a partir dos

anos de 1985 como método para identificar e quantificar anticorpos anti-HIV. Neste método, que

é o mais comumente utilizado nos laboratórios, há a imobilização de um dos componentes,

antígeno ou anticorpo, em fase sólida que em geral é realizada utilizando uma placa de

poliestireno (Figura 22). Além disso, a identificação e quantificação do antígeno ou anticorpo

ocorrem através de que um dos dois é conjugado com uma enzima marcada como fosfatase

alcalina, peroxidase ou beta-galactosidase e que preserva a sua atividade enzimática e

imunológica.

O substrato da enzima utilizada para esta técnica forma um produto colorido cuja

alteração da cor poderá ser monitorada visualmente ou por meio de espectrofotômetro, que

determina a relação entre a intensidade da cor e a quantidade que está sendo analisado na

amostra (Figuras 22, 23 e 24).

O método ELISA pode ser utilizado para pesquisa de antígenos por meio do:

I) ELISA competitivo com antígeno marcado;

II) ELISA competitivo com anticorpo marcado;

III) ELISA de captura de antígeno ou sanduíche (Figura 22).

Já para a pesquisa de anticorpos;

I) ELISA indireto (Figura 23);

II) ELISA de captura de Imunoglobulina classe específica;

III) ELISA sanduíche.

O ELISA apresenta então, as seguintes vantagens:

30

I) De ser um método de alta sensibilidade;

II) Permite quantificar anticorpo ou antígeno;

III) Ser seguro e IV) de baixo custo.

Já a principal desvantagem do ELISA consiste na possibilidade de resultados

alterados por pequenas variações na pipetagem e tempo de incubação em razão à elevada

sensibilidade deste método.

Exemplificando a diferenciação do método de ELISA do Radioimunensaio (RIA), será

apresentada mais detalhadamente na Figura 22, o ELISA sanduíche e o RIA sanduíche para

pesquisa de antígenos, que é a variação mais usada nos laboratórios.

No caso do RIA, um radioisótopo marcado fica conjugado a um dos dois, antígeno ou

anticorpo. Isto significa que, apenas no final da reação é que o ELISA e o RIA se diferenciam, no

resto eles são bastante semelhantes (Figura 22).

Apesar do RIA ser um método altamente sensível, capaz de detectar e quantificar

substâncias presentes em amostras com limite de detecção da ordem de picogramas, capaz,

portanto, de determinar a presença de hormônios, possui a desvantagem de ter que se

manipular isótopo radioativo, apresentando risco operacional, a necessidade de se aplicar

medidas especiais, bem como elevado custo de biossegurança.

31

33ºº PPaassssoo::

44ºº PPaassssoo::

Ag

11ºº PPaassssoo::

B) ELISA e Radioimunensaio (Sanduíche):

22ºº PPaassssoo::

1º Ac

32

55ºº PPaassssoo::

Figura 22: Esquema mostrando semelhanças e diferenças entre os métodos ELISA sanduíche e

Radioimunensaio sanduíche para a pesquisa de antígenos. Adaptado de Abbas et al., 2000. O 1º

e o 3º passos do esquema são para lavar com tampão específico e retirar os excessos,

respectivamente, de anticorpo e de antígeno.

Radioisótop

o

Radioimunensaio

2º Ac

Substrato

Enzima

ELISA

33

Figura 23: Esquema um ELISA indireto para pesquisa de anticorpos. Disponível em:

<http://www.fes.br/disciplinas/far/imunologia%20clinica/>. Acesso em: 21 fev. 2009.

(2) Anticorpo

conjugado com

enzima

34

Figura 24: Figura apresentando uma placa de poliestireno do ELISA cuja reação do substrato

com a enzima utilizada resultou em uma coloração esverdeada. Disponível em:

<www.slideshare.net/labimuno>. Acesso em: 21 fev. 2009.

c) Western Blotting.

Em geral, este método é utilizado para identificar o antígeno e determinar a quantidade

relativa e o peso molecular das proteínas em uma mistura proteica ou de outras moléculas.

Em primeiro lugar a mistura é separada por meio do uso de um SDS-PAGE, de tal

forma que as posições finais das diferentes proteínas no gel estarão de acordo com seus pesos

moleculares como mostra na Figura 25. O aparelho utilizado para tal separação está

representado em diferentes tamanhos na Figura 26. A partir desta separação, as proteínas são

transferidas para uma membrana através da ação de capilaridade (blotting) ou por eletroforese

de tal forma que a membrana adquire uma réplica das proteínas separadas como mostra a

Figura 24.

A posição do antígeno que se pretende obter com este teste, pode ser detectada

utilizando o seu anticorpo específico marcado. No caso da Figura 25, o anticorpo específico foi

marcado com um isótopo radioativo e o resultado foi revelado com o uso de autorradiografia,

mas o anticorpo poderia ter sido marcado com enzima capaz de interagir com um substrato que

liberasse cor assim, como ocorre no ELISA.

35

As vantagens do método de Western Blotting são:

I) Alta sensibilidade e especificidade;

II) Reconhecimento de antígenos individuais em um estrato;

III) Realização de perfil de reconhecimento de antígenos;

IV) Determinação de proteínas imunodominantes.

As suas principais desvantagens são:

I) Custo médio a elevado;

II) Procedimento longo e propenso a erro em vários passos;

III) Dependendo da forma de revelação do resultado pode haver problemas de

biossegurança.

Figura 25: Esquema do método Western blotting. Adaptado de Abbas et al., 2000.

+ EElleettrrooffoorreessee

Papel de filtro

Membrana

Papel filtro espesso

Tampão

AAuuttoorrrraaddiiooggrraaffiiaa

Blotting

36

Figura 26: Figura apresentando aparelho, em diferentes tamanhos (A e B) utilizado para separar

as proteínas antigênicas de interesse em uma mistura proteica. Disponível em:

<www.slideshare.net/labimuno>. Acesso em: 21 fev. 2009.

37

5 MÉTODOS QUALITATIVOS

a) Imunoeletroforese

Este método combina eletroforese e imunodifusão dupla em meio gelificado, em

tempos distintos, com alto poder resolutivo. A imunoeletroforese é capaz de comparar misturas

complexas de antígenos que são separados em geral, em gel de agarose, pela aplicação de uma

corrente elétrica. No entanto, para a realização da eletroforese, também são utilizados como

suportes papel de filtro, acetato de celulose, gel de Agar e poliacrilamida.

As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com seus

pesos moleculares e cargas elétricas (Figura 27). Posteriormente, uma canaleta é recortada

entre os poços onde foram colocadas as amostras com os antígenos e então, é preenchida com

o anticorpo que se difunde até formar arcos de precipitação com os antígenos separados por

eletroforese (Figura 27).

Figura 27: Esquema mostrando como é realizada a imunoeletroforese. Adaptado de Abbas et al., 2000. PAULA, Patrícia Ferreira de. Aula de

Imunodiagnóstico para alunos de graduação em Ciências Biológicas pelo Instituto de Biociências da USP-SP na disciplina de Imunologia do

Departamento de imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2001).

Ag

Ac

+ -

Ag

38

A imunoeletroforese é um método qualitativo que pode ser utilizado para detectar

antígenos utilizando anticorpos específicos a eles, desde que os imunocomplexos formados

tenham tamanho suficiente para formar as linhas de precipitação. Esta técnica também permite

a caracterização de proteínas com confiabilidade, detectando anormalidades estruturais (padrão

de mobilidade eletroforética) e alterações nas concentrações (espessura do arco

precipitado). A sua principal desvantagem é que não apresenta relativamente sensibilidade

muito alta.

b) Imunodifusão dupla radial (Ouchterlony, 1947):

Neste método qualitativo, os dois componentes, antígeno e anticorpo, difundem-se

radialmente em todas as direções, a partir de orifícios no meio gelificado e se encontram

formando linhas ou arcos de precipitação correspondentes aos imunocomplexos possíveis desta

interação, ou seja, cada arco corresponde a um par de imunocomplexo antígeno-anticorpo

(Figura 28). As linhas de precipitação poderão ser visualizadas com corante após lavagem das

proteínas solúveis do meio gelificado com tampão apropriado.

A técnica permite a comparação simultânea, por exemplo, de vários sistemas

antigênicos contra o mesmo sistema de anticorpo de reatividade e especificidade conhecidas

(Figura 29), desde que a interação antígeno-anticorpo tenha atingido a zona de equivalência e

que esteja em quantidade suficiente para formar turvação ou precipitado visível (Figura 28).

Esta técnica é muito utilizada na pesquisa e diagnóstico de determinadas doenças

como a cisticercose. As principais desvantagens da imunodifusão radial simples são:

I) Método semiquantitativo;

II) Ser de baixa sensibilidade;

III) Requer o uso de extratos antigênicos em concentração elevada, da ordem de

mg/mL.

39

Figura 28: Esquema mostrando como é realizada a imunodifusão radial dupla. PAULA, Patrícia

Ferreira de. Aula de Imunodiagnóstico para alunos de graduação em Ciências Biológicas pelo

Instituto de Biociências da USP-SP na disciplina de Imunologia do Departamento de imunologia

do Instituto de Ciências Biomédicas da USP-SP (2001).

Figura 29: Esquema mostrando as diferentes possibilidades de resultados da interação

antígeno- anticorpo em uma imunodifusão radial dupla. Disponível em:

<www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 28 fev. 2009.

Identidade total ou fusão Identidade total ou fusão

não Identidade

Identidade parcial com

formação de esporão

Identidade parcial com

formação de duplo esporão

Identidade total e

independência

Ag

Ac

40

c) “Veneral Disease Research Laboratory” (VDRL)

O VDRL é um teste sanguíneo rotineiramente utilizado no diagnóstico da sífilis, mas

que também tem sido aplicado no seguimento terapêutico desta doença.

A base do VDRL consiste no uso de um anticorpo que é produzido pelo paciente com

sífilis e que reagem contra cardiolipina, presentes em numerosos tecidos e que atingem

elevados níveis na infecção por Treponema pallidum.

O VDRL pode permanecer reagente por longos períodos, mesmo após a cura da

infecção, porém, apresenta quedas progressivas em suas titulações, até que se torna não

reagente. Desta forma, esse teste é indispensável para o seguimento da sífilis pós-tratamento.

Recomenda-se que o exame seja realizado de seis em seis meses até o final do segundo ano.

No caso dos recém-nascidos não infectados, eles podem apresentar os anticorpos

maternos e por isso, o teste será reagente até o 3º mês de vida. Isto significa, que se o

diagnóstico for realizado dentro do período de nascimento do bebê até o seu terceiro mês de

vida, o resultado será falso-positivo.

Muitas outras condições podem gerar resultados falso-positivos como viroses

(mononucleoses, hepatites), drogas, gravidez, febre reumática, artrite reumatoide, lúpus

eritematoso sistêmico, malária e lepra. Desta forma, apesar de apresentar alta sensibilidade, o

VDRL apresenta baixa especificidade.

Em geral, para os indivíduos adultos, quando o teste VDRL for negativo, será

compatível a um indivíduo sem sífilis. Entretanto, indivíduos podem ser negativos para VDRL e

ainda terem sífilis, uma vez que nos estágios iniciais da doença, o VDRL em geral é negativo e

esta condição é denominada, falso-negativo para VDRL.

A titulação do VDRL ocorre por meio da aglutinação do sangue que é proporcional à

quantidade de anticorpos presentes no sangue, podendo diluí-lo uma, duas, três ou quatro vezes

mais até que a reação não aconteça mais. No entanto, os títulos de VDLR são considerados

positivos quando 1/16 ou superiores.

41

Neste teste, aproximadamente 1% dos pacientes com sífilis na fase secundária (as

diferentes fases da sífilis será visto no Módulo IV), apresenta o efeito pró-zona. Este efeito

consiste no excesso de anticorpos no indivíduo a ser testado, proporcionando um resultado

falso-negativo. Isto porque, como já apresentado por intermédio da Figura 13 do Módulo I,

quando há excesso de anticorpos, não há a zona de equivalência necessária para a visualização

do resultado de um teste. Mas, tal fenômeno ocorre quando o soro não for diluído, por isso existe

a necessidade de diluí-los de 1/16 ou mais.

42

6 IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS EM CÉLULAS E ANTÍGENOS:

a. Imunofluorescência

A imunofluorescência é utilizada com o objetivo de se identificar a distribuição de um

antígeno anatomicamente, ou seja, sua localização em tecidos ou células, intracelular ou de

membrana. Esta metodologia caracteriza-se pela utilização de anticorpos que permanecem

ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.

Os fluorocromos são moléculas que absorvem luz em comprimento de onda baixa e

elevada energia e são capazes de emitir luz em comprimento de onda maior, de menor energia.

Este fenômeno é conhecido como fluorescência.

O fluorocromo geralmente usado na técnica de imunofluorescência é o isotiocianato

de fluoresceína, mas também pode ser utilizado a lisamina-rodamina B, vermelho Texas e

ficoeritrina. Cada um desses florocromos apresenta uma emissão de cor de comprimentos de

onda diferentes, garantindo que se realizem testes simultâneos para identificação de diferentes

marcadores celulares.

Esta técnica constitui basicamente em incubar o tecido ou célula com um anticorpo

marcado com o fluorocromo e a posição onde ocorreu esta marcação poderá ser visualizada, por

intermédio da leitura final deste ensaio, utilizando um microscópio de fluorescência. A Figura 30

exemplifica como seria a visualização do resultado por meio da técnica de imunofluorescência.

43

Figura 30: Foto mostrando o depósito de IgG em biópsia renal por meio da técnica de

imunofluorescência. Disponível em: <www.fleury.com.br>. Acesso em: 07 mar. 2009.

A vantagem deste método é que ele é altamente específico e sensível e sua principal

desvantagem é o elevado custo do microscópio utilizado para a visualização do resultado da

imunofluorescência.

Como poderá ser visto, a seguir, na Figura 31, existem duas variações desta

metodologia:

I) Imunofluorescência direta;

II) Imunofluorescência indireta.

I) Imunofluorescência direta (Figura 31):

A imunofluorescência direta é caracterizada pela detecção do antígeno diretamente

em células ou tecidos utilizando o anticorpo específico ao antígeno que se deseja localizar

marcado com o fluorocromo.

44

Este tipo de imunofluorescência é utilizado para a detecção direta de micro-organismos

em secreções como na urina, nas fezes, em cortes de tecidos entre outros, além de ser usado

na caracterização de células tumorais.

A principal limitação deste tipo de teste de imunofluorescência tem haver com a

relação custo-benefício, pois se faz necessário a utilização de um conjugado para cada antígeno,

elevando o seu custo.

II) Imunofluorescência indireta (Figura 31):

A imunofluorescência indireta utiliza um anticorpo anti-imunoglobulina marcado com

fluorocromo para a detecção de anticorpos que se ligarão a antígenos presentes em células ou

tecidos.

Os conjugados de fluorocromo e anti-imunoglobulina permitem identificar os diferentes

isótipos de anticorpos presentes na amostra a ser testada, como anti-IgG ou anti-IgA.

Esta variação do teste de imunofluorescência tem a vantagem de apresentar maior

sensibilidade e possibilidade de se utilizar o mesmo conjugado de fluorocromo e anti-

imunoglobulina para vários sistemas, reduzindo o custo do teste.

A imunofluorescência indireta é usada no diagnóstico de diversas doenças

infecciosas como doença de Chagas, AIDS e hepatites; além de imunocomplexos de doenças

autoimunes.

45

Figura 31: Esquemas dos tipos de imunofluorescência. Adaptado de Abbas et al. (2000).

b) Citometria de Fluxo (FACS)

A citometria de fluxo é um método multiparamétrico capaz de analisar individual e

simultaneamente os componentes estruturais celulares. Além de possibilitar a investigação dos

diferentes estágios de maturação ou ativação celulares por meio da análise da expressão de

diferentes moléculas intracelulares ou da superfície celular.

Nesta técnica, as células são geralmente marcadas com fluorocromos e assim, a

fluorescência emitida pela célula é medida por meio do desvio de luz incidente. Em relação ao

método de imunofluorescência, a citometria de fluxo apresenta a vantagem de permitir a

detecção do tamanho relativo da célula e sua granulosidade.

Como mostra a Figura 32, na citometria de fluxo, populações celulares misturadas

com diferentes anticorpos marcados com fluorocromos (em vermelho e em azul claro) passam

por um feixe de laser (em amarelo) que incidirá sobre a célula, permitindo que essa crie

Imunofluorescência:

FFlluuoorrooccrroommoo Direta

Indireta

46

diferentes sinais fluorescentes de acordo com o fluorocromo que ela estiver ligada (vermelho ou

azul claro). Os tipos celulares serão separados de acordo com esses diferentes sinais gerados,

conforme mostra a Figura 32.

A Figura 33 mostra um exemplo de resultado (gráfico) obtido a partir da citometria de

fluxo.

Esta metodologia é bastante utilizada nos laboratórios de análise clínica para a

contagem e fenotipagem das células do sangue periférico, uma vez que essas células

apresentam em suas membranas antígenos específicos geralmente classificados com um

número correspondente ao seu e denominados “cluster of diferentiation” (CD), como

exemplificado na Figura 33.

Na clínica, é comum ainda à aplicação desta metodologia na monitorização da infecção

pelo vírus de imunodeficiência humana (HIV) através da quantificação das populações

linfocitárias T CD4+ e T CD8+. Isto porque, os o linfócitos T CD4+ decrescem progressivamente a

partir da infecção, uma vez que o HIV infecta essas células tão importante para a resposta imune

contra agentes infecciosos; enquanto que os linfócitos T CD8+ elevam quantitativamente a partir

da infecção.

Outra importante contribuição desta metodologia é no diagnóstico de leucemias e

linfomas, uma vez que com ela se é capaz de se reconhecer antígenos específicos presentes na

superfície ou no interior de células normais e de células neoplásicas em vários estágios de

maturação.

47

Figura 32: Esquema da citometria de fluxo (FACS). Adaptado de Abbas et al. (2000).

FFlluuoorreessccêênncciiaa

Analisa e

Separa

Citometria de Fluxo (FACS)

48

Figura 33: Gráfico resultante de uma citometria de fluxo (FACS) mostrando um histograma de

células normais de sangue periférico obtido em função da positividade para a molécula CD45.

Disponível em: <www.labmed.pt/>. Acesso em: 07 mar. 2009.

49

7 METODOLOGIAS COM USO DE BIOLOGIA MOLECULAR:

a) Reação em cadeia da polimerase (PCR e RT-PCR): Conceito, Descrição da

técnica, exemplos de utilização

A) PCR

A metodologia da reação em cadeia pela polimerase (PCR- “polymerase chain

reaction”) permite obter a quantidade suficiente para se detectar e analisar qualquer sequência

específica de DNA em estudo.

Com essa metodologia qualquer sequência específica de DNA poderá ser amplificada

a partir de diversos materiais biológicos como sangue, urina, cabelo e biópsias de tecidos. No

entanto, a molécula de DNA deverá ser extraída do material coletado utilizando proteínas

desproteinizantes como o fenol, clorofórmio, capazes de desnaturar e retirar as proteínas que

ficam associadas à molécula de DNA no interior do núcleo. Posteriormente, o etanol é

adicionado permitindo que o material genético se precipite no tubo e por fim, possa ser

solubilizado utilizando solução de tampão apropriada.

Conceito

A PCR, desenvolvida pelo geneticista Kary Mullis em 1993, utiliza a enzima Taq-

polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus, que atua em elevadas temperaturas e

baseia-se no processo de replicação do DNA que ocorre in vivo. Desta forma, para se entender

melhor esta metodologia, primeiramente se faz necessário, relembrar alguns conceitos básicos

de biologia.

50

O DNA é uma molécula de fita dupla formada por quatro nucleotídeos básicos: guanina

(G), citosina (C), timina (T) e adenina (A); sendo que a guanina interage com a citosina e a timina

com a adenina. In vivo, para que haja a replicação do DNA, essa molécula deverá se separar de

forma a permitir que nucleotídeos novos emparelhem com cada uma das fitas de DNA

separadas.

A ligação destes novos nucleotídeos e a formação de duas novas fitas de DNA

ocorrerá a partir da presença de um conjunto de enzimas existentes no núcleo dos diferentes

tipos celulares e que são importantes em cada etapa da replicação do DNA.

Assim como ocorre in vivo, a PCR também permite a formação de novas fitas de DNA.

Neste caso, sequências específicas de DNA se amplificam em aproximadamente 1 Kb de

comprimento por meio da repetição dos chamados ciclos de DNA, como será visto a seguir.

Descrição da técnica

A PCR envolve ciclos múltiplos de um processo que pode ser dividido nas seguintes

etapas:

1) Denaturação, que significa separação da fita dupla de DNA em duas fitas únicas;

2) Anelamento de oligonucleotídeos do tipo primers à sequência molde de DNA;

3) Extensão do primer ao longo da sequência-alvo de DNA;

4) Formação de novas fitas duplas de DNA.

1) Denaturação (Figura 34):

51

A separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples ocorre quando se eleva a

temperatura da amostra de DNA para 95º a 100ºC.

2) Anelamento dos primers (Figura 34):

O primer constitui em uma pequena sequência de ácido nucleico que se liga à fita de

DNA alvo. Ele serve como ponto de partida para adição (extensão) de nucleotídeos (A, G, C, T)

complementares ao longo do resto da fita molde de DNA.

Na PCR, é necessário que se tenha um conhecimento prévio da sequência do DNA

que se deseja amplificar que é denominada sequência-alvo. A partir disso, desenham-se dois

primers, ou seja, duas sequências iniciadoras que serão capazes de começar o processo de

síntese da sequência alvo, ou seja, uma que servirá para promover a síntese da sequência-alvo

em um sentido da fita de DNA (3’-5’) e outro para o sentido inverso (5’-3’).

O anelamento dos primers, ou seja, a ligação dos primers à sequência-alvo

ocorrerá quando a temperatura for diminuída para aproximadamente 40º a 60ºC.

3) Extensão do primer ao longo da sequência-alvo de DNA (Figura 34):

A extensão do primer ao longo da sequência-alvo de DNA ocorrerá por intermédio da

adição de nucleotídeos com o uso da polimerase estável ao calor (Taq- polimerase). Neste caso,

a temperatura deverá ser elevada para 70º a 75ºC.

4) Formação de novas fitas duplas de DNA, como mostra a Figura 34.

52

O procedimento inteiro incluindo as quatro etapas do ciclo de DNA pode ser realizado

com um tubo de plástico de microcentrifuga contendo uma reação com uma mistura de tampões,

nucleotídeos, primers, Taq- polimerase e uma amostra de DNA molde.

Figura 34: Esquema da metodologia da reação em cadeia pela polimerase (PCR) com suas

etapas. Disponível em: <www.dialogica.com.ar/>. Acesso em: 28 mar. 2009.

O aparelho utilizado para esta técnica é um termociclador (Figura 35) que é capaz de

controlar as diferentes temperaturas necessárias para a realização da PCR de forma

automatizada e contínua.

53

Através da PCR, uma única molécula de DNA poderá se multiplicar em mais de um

bilhão de cópias após 30 ciclos em menos de três horas, dependendo do tempo aplicado para

cada passo no ciclo e do tipo de termociclador usado.

Figura 35: Foto de um termociclador. Disponível em: <www.saberweb.com.br/>. Acesso em: 14

mar. 2009.

O produto amplificado poderá ser visualizado por intermédio de um gel de

eletroforese corado com brometo de etídeo e o seu tamanho poderá ser estimado comparando

com padrões lineares de DNA, apresentados fora da foto na Figura 36.

54

Figura 36: Foto de eletroforese em um gel de agarose de produtos amplificados por PCR.

Acesso em: <www.geocities.com/>. Acesso em: 14 mar. 2009.

As principais vantagens da PCR são ser simples e rápida e a necessidade de

quantidades pequenas de DNA alvo. Desta forma, a PCR constitui uma das mais poderosas

ferramentas da biologia molecular atualmente sendo cada vez mais utilizada pelos

pesquisadores e em laboratórios clínicos, além de poder ser utilizada para vários fins como

poderá ser visto a seguir. No entanto, suas principais limitações constituem na reprodutividade

relativamente baixa no padrão das bandas eletroforéticas e no problema da contaminação do

DNA por outro material genético que não aquele que se pretende investigar.

55

Exemplos da utilização da PCR

A PCR pode ser usada não só para amplificar sequências de moléculas de DNA, mas

também permite detectar mutações em uma sequência-alvo, ou mesmo detectar moléculas de

DNA de organismos que não são fáceis de serem cultivados. Além disso, por meio desta técnica

é possível realizar comparações genotípicas entre linhagens de diferentes organismos.

Por outro lado, a PCR constitui uma das técnicas mais usadas em laboratórios de

pesquisas médicas e biológicas para diagnóstico de doenças hereditárias e infecciosas, testes

de paternidade e na medicina forense e criação de organismos transgênicos.

B) RT-PCR

A descrição técnica da RT-PCR é a mesma que a de PCR mostrado acima, uma vez

que a RT-PCR constitui uma variação da PCR. Desta forma, para a sua realização, se faz

necessária a utilização de uma enzima denominada transcriptase reversa, previamente ao uso

da polimerase.

A transcriptase reversa é uma enzima capaz de realizar uma transcrição ao contrário,

ou seja, capaz de polimerizar moléculas de DNA a partir de moléculas de RNAm (RNA

mensageiro) e é encontrada naturalmente em vírus como o HIV.

O isolamento da transcriptase reversa permitiu que houvesse adaptação da PCR e

assim, moléculas de RNA são convertidas para moléculas de DNA, denominadas de cDNA. Elas

recebem este nome por ser uma fita de DNA complementar ao RNA, sendo que, a partir da

síntese do cDNA, protocolos padrões da metodologia da PCR já apresentada acima são

utilizados como pode ser visto na Figura 37.

56

Figura 37: Esquema mostrando uma reação de RT-PCR.

A) Início da utilização da enzima transcriptase reversa.

B) Síntese do DNA complementar (cDNA).

C) Início da reação do PCR, mostrado na Figura 36.

Disponível em: <http://www.rsbcancer.com.br>. Acesso em: 14 mar. 2009.

Exemplos da utilização da RT-PCR

A técnica de RT- PCR permite estudar a expressão de um gene específico, pois só

haverá cDNA para ser amplificado, se tiver existido um RNAm que corresponde, portanto, à

expressão do gene responsável pela transcrição deste RNAm.

A expressão para a produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da

célula dentro do organismo do hospedeiro, como por exemplo, células musculares expressam

proteínas diferentes das células cardíacas. Além disso, existem vários artigos na literatura

57

especializada mostrando adaptações desta técnica para os mais diversos objetivos e a partir de

diferentes amostras como plantas e outros animais como porcos.

58

8 PRINCIPAIS DIAGNÓSTICOS LABORATORIAIS PROPOSTOS PELO MINISTÉRIO DA

SAÚDE BRASILEIRO PARA AS SEGUINTES DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS

A doença infecciosa pode ser entendida como uma doença, humana ou animal, que

se manifesta de forma clínica e que se resulta de uma infecção. Por sua vez, infecção é a

penetração de micro-organismos no organismo de um hospedeiro, produzindo-lhe danos, com

ou sem o aparecimento de sintomas clinicamente reconhecíveis.

a) Doença de Chagas

A doença de Chagas é endêmica nas Américas, ou seja, exclusiva do continente

americano, mas com agravamento entre os países em desenvolvimento pela precariedade das

condições de saúde e higiene, bem como elevado grau de pobreza e miséria.

I. História natural

A doença de Chagas é uma doença parasitária causada pelo protozoário flagelado

Trypanossoma cruzi (Figura 38) que é transmitido principalmente por intermédio dos barbeiros

da espécie Triatoma infestans. (Figura 39). A transmissão ocorre no momento da picada, que é

quando os barbeiros eliminam suas fezes infectadas pelo protozoário para o homem, mamíferos

domesticáveis como cão, gato e rato doméstico e animais silvestres como gambá e morcego.

59

Figura 38: Foto mostrando o Trypanossoma cruzi visto ao microscópio. Disponível em:

<cbme.usp.br/.../microbiologia__1/trypanossoma>. Acesso em: 21 mar. 2009.

Por outro lado, existem relatos da transmissão ter ocorrido via transfusão sanguínea,

quando o sistema de controle de transfusão não foi eficiente e até mesmo, transmissão

congênita (da mãe para o rebento), mas neste último caso com morte prematura.

Figura 39: Foto mostrando do Triatoma infestans., vetor da doença de Chagas. Disponível em:

<http://www.sucen.sp.gov.br>. Acesso em: 21 mar. 2009.

60

A doença de Chagas apresenta a fase aguda e a fase crônica, sendo que seus

sintomas podem variar ao longo da infecção. A fase aguda é assintomática ou apresenta

sintomas geralmente mais leves como febre, mal-estar geral, cefaleia e edemas causados na

pálpebra denominados sinal de Romaña ou no local de inoculação do Trypanossoma cruzi.

Com a progressão da doença, durante até 20 anos, os sintomas tornam-se crônicos e

graves tais como doença cardíaca e do aparelho digestivo. Se não tratada, a doença de chagas

crônica é muitas vezes fatal.

II. Diagnóstico laboratorial da Doença de Chagas

A confirmação da infecção pelo protozoário Trypanossoma cruzi (Figura 38) é

realizada por intermédio de critérios clínico-epidemiológicos e laboratoriais.

As metodologias utilizadas podem ser parasitológicas diretas, ou seja, com o intuito de

se identificar o Trypanossoma cruzi (Figura 38) no sangue periférico como pesquisa direta do

parasita em gotas de sangue por microscopia ou sorológicos, como a aplicação do ELISA e de

imunofluorescência.

Na fase aguda, a parasitemia (parasita presente no sangue) é mais intensa e,

portanto, a sensibilidade de todos os métodos parasitológicos é considerada elevada nesta

fase. Enquanto que na fase crônica, quando há menor parasitemia, ou são utilizados métodos

que aumentam o número de tripanossomas como o cultivo deles, mas há a preferência para o

uso de métodos sorológicos capazes de medir os anticorpos IgG antiantígenos do

Trypanossoma cruzi (Figura 38).

b) Dengue

O dengue é uma doença infecciosa febril causada por um arbovírus da família

Flaviviridae de evolução benigna na maioria dos casos.

61

A sua forma de transmissão ocorre pela picada da fêmea do mosquito Aedes aegypti

(Figura 40) infectado com o arbovírus da família Flaviviridae ao homem, sendo que não ocorre

transmissão de pessoa para pessoa.

Figura 40: Foto da fêmea do mosquito Aedes aegypti responsável pela transmissão do vírus

causador do dengue ao homem. Disponível em: <http://www.fiocruz.br>. Acesso em: 21 mar.

2009.

O dengue é classificado em quatro tipos diferentes de vírus, ou seja, os sorotipos 1, 2,

3 e 4, sendo que, no Brasil, predominam os sorotipos 1 e 2.

O dengue pode se apresentar clinicamente das seguintes formas: infecção

inaparente, dengue clássica (DC), febre hemorrágica de dengue (FHD) e síndrome do

choque do dengue (SCD), que pode evoluir para óbito.

Geralmente, o DC se inicia com uma febre alta abrupta, seguida de cefaleia,

prostração, mialgia, anorexia, náuseas, vômitos, manchas avermelhadas, dores nas articulações,

entre outras características não só atribuíveis ao dengue.

No início, embora a FHD e a SCD apresentarem sintomas semelhantes ao da DC

podem evoluir para hemorragias e ocasionalmente, falência múltipla dos órgãos e ao óbito.

Desta forma, nestes casos, o quadro clínico se agrava rapidamente.

I. Diagnóstico laboratorial do dengue

62

O diagnóstico do dengue compreende de exames clínicos, laboratoriais e investigação

epidemiológica. Deste modo, o diagnóstico definitivo da dengue é realizado por intermédio de

métodos de isolamento do vírus, de algum dos antígenos virais ou da detecção de seu RNA no

soro ou tecido dos pacientes.

O isolamento viral é realizado a partir das amostras do sangue, derivados ou tecidos

coletados nos primeiros cinco dias após o início da febre, sendo importante para a identificação

do sorotipo viral circulante. Já a detecção de seus antígenos virais é realizada por

Imunofluorescência e RNA, por RT-PCR.

A detecção de anticorpos também é empregada para fins de diagnóstico, sendo o

método de ELISA para captura de IgM é o mais usado. Neste teste, o objetivo é detectar

anticorpos IgM específicos aos quatro sorotipos do vírus da dengue, pois esses isótipos se

desenvolvem rapidamente, podendo ser detectados após o 5º dia de desenvolvimento da

doença e portanto precocemente. Além disso, na maioria dos casos, apresenta a vantagem de

necessitar somente de uma amostra do soro para a realização do ELISA.

c) Febre Amarela

A febre amarela é uma doença febril aguda de curta duração (12 dias), causada por

um vírus da família Flaviviridae. É epidemiologicamente dividida em febre amarela urbana e

silvestre, ou seja, a forma silvestre é transmitida principalmente pelo mosquito do gênero

Haemagogus janthinomys para macacos e o homem, poderá se infectar acidentalmente quando

entra neste ecossistema. Enquanto que a forma urbana é transmitida principalmente pelo Aedes

aegypti (Figura 40) para o homem.

A febre amarela é uma doença de gravidade variável, sendo que o quadro típico

apresenta evolução bifásica, ou seja, período de infecção e período de intoxicação.

O início dos sintomas da febre amarela é abrupto, com febre alta, calafrios, cefaleia,

dorsalgia, mialgia, prostração, náuseas e vômitos, durando cerca de três dias. Posteriormente, o

caso poderá evoluir para a cura ou para a forma mais grave (período de intoxicação) que se

caracteriza pelo aumento da febre, diarreia, reaparecimento de vômitos, instalação de

63

insuficiência hepática e renal. A icterícia que é discreta no início da doença se intensifica,

ocorrem manifestações hemorrágicas, prostração intensa, podendo levar ao estado de coma.

i. Diagnóstico laboratorial da febre amarela

O diagnóstico da febre amarela é clínico, epidemiológico e laboratorial. A comprovação

da infecção pode ser realizada pelo isolamento do vírus a partir de amostras de sangue,

derivados ou tecidos coletados nos primeiros cinco dias após o início da febre. Além disso, o

genoma viral poderá ser demonstrado utilizando PCR, enquanto que antígenos do vírus da febre

amarela no sangue ou no tecido do paciente poderão ser demonstrados utilizando a metodologia

de imunofluorescência.

O diagnóstico sorológico, assim como a dengue, é realizado principalmente através do

ELISA para captura de IgM contra antígenos do vírus da febre amarela, sendo que, na maioria

dos casos, apresenta a vantagem de necessitar apenas de uma amostra de soro para a sua

realização.

d) HIV/AIDS


A Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença caracterizada por

uma disfunção grave do sistema imunológico do indivíduo infectado pelo vírus de

imunodeficiência humana (HIV) (Figura 41) com dois tipos conhecidos HIV-1 e HIV-2. O

indivíduo portador do vírus HIV se torna incapaz de controlar infecções oportunistas

principalmente pela significativa destruição dos linfócitos T CD4+.

64

Figura 41: O Vírus HIV infectando uma célula. Disponível em: <http://www.fiocruz.br>. Acesso

em: 21 mar. 2009.

O HIV pode ser transmitido por: relação sexual; transfusão de sangue ou de produtos

sanguíneos contaminados; uso de agulhas ou seringas contaminadas; da mãe para o filho

durante a gravidez, parto ou por meio do leite materno infectado ou até mesmo, acidentalmente,

por intermédio do contato de sangue com mucosas ou ferimentos na pele ou perfurações com

instrumentos perfurocortantes infectados com HIV.

No entanto, o vírus HIV não é transmitido pelo convívio social ou familiar, por abraço

ou beijo, alimentos, água, picada de mosquitos ou outros insetos.

A evolução da HIV/AIDS pode ser dividida em três fases:

A) Fase aguda

65

Essa fase ocorre de poucos dias até duas semanas a partir da infecção por HIV e o

indivíduo pode apresentar febre, dor de garganta, mialgia, fadiga, diarreia, lesão na mucosa oral,

entre outras, dificultando o diagnóstico da doença por apresentar sintomas semelhantes a outras

doenças virais.

B) Infecção assintomática ou Latência clínica

Esta fase que apresenta duração variável de alguns anos, o indivíduo permanece livre

de qualquer sintoma e aparentemente, nada tem de diferente de um indivíduo sadio, a não ser

pelo fato de que se for realizado um teste sorológico, este indivíduo apresentará anticorpos

contra HIV.

C) Doença sintomática (AIDS)

A AIDS propriamente dita é definida por diversos sinais, sintomas e doenças,

principalmente as oportunistas, que com a progressiva destruição de células imunológicas, o

indivíduo não consegue mais combater infecções causadas por micróbios que em condições

normais não seriam patogênicos como candidíase e herpes simples; ou mesmo infecções com

outros micróbios que podem se reativar na presença do vírus HIV, como é o caso da tuberculose

pulmonar, a doença oportunista mais comum entre os pacientes com AIDS.

II. Diagnóstico laboratorial de HIV/AIDS

O diagnóstico laboratorial do HIV em pacientes portadores desse vírus é realizado por

intermédio da utilização de metodologias que permitam investigar anticorpos anti-HIV, antígenos,

material genético ou que isolem o vírus em cultura.

66

Para os indivíduos menores de 18 meses de idade, é indicado investigar o DNA ou

RNA viral, uma vez que poderia haver reação cruzada com os anticorpos maternos nas

crianças. Desta forma, poderão ser utilizados PCR para DNA viral e RT-PCR para RNA viral.

Já para aqueles com mais de 18 meses de idade, os testes que pesquisam os

anticorpos são os mais utilizados como o método de ELISA, Western Blotting e

Imunofluorescência Indireta.

No entanto, deve ser levado em consideração que os anticorpos anti-HIV somente

serão detectáveis em torno de 30 dias após a infecção em indivíduos imunologicamente

competentes. Esse intervalo entre a infecção e a detecção dos anticorpos por metodologias

laboratoriais é denominado janela imunológica. Nesse período, as provas sorológicas podem

ser falso-negativas e por isso, há a necessidade de realizar mais de um teste em tempos

diferentes.

Em geral, o método de ELISA é usado amplamente como teste inicial para a detecção

de anticorpos anti-HIV no sangue dos pacientes, sendo que se o resultado for positivo, o

indivíduo deverá realizar outros testes adicionais, denominados confirmatórios como a

Imunofluorescência Indireta e Western Blotting.

e) Hepatites Virais A, B, C, D e E

Embora, cada hepatite seja causada pelo seu respectivo vírus, ou seja, vírus para

hepatite A (VHA), para B (VHB), para C (VHC), para D (VHD) e para hepatite E (VHE); o

termo hepatite viral engloba processos inflamatórios do fígado causados por vírus.

I. Hepatite A

67

O principal modo de transmissão do VHA é fecal-oral por meio da ingestão de água e

alimentos contaminados. Deste modo, é mais comum onde há condições precárias de

saneamento básico.

A hepatite A viral é aguda com o início dos sintomas (com a duração média de sete

dias) caracterizado principalmente por mal-estar, cefaleia, febre baixa, dores abdominais, fadiga

intensa, perda de apetite, náuseas e vômitos.

O estágio posterior é caracterizado pela presença de icterícia (amarelamento da pele

e dos olhos causado pelo acúmulo de bile no sangue) que se apresenta com intensidade variável

e colúria (urina escura castanho-avermelhada) e sua duração é de, geralmente, quatro a seis

semanas. Por outro lado, a hepatite A é considerada benigna, com a recuperação completa de

praticamente 99% dos casos.

a. Diagnóstico laboratorial da hepatite A

O diagnóstico pode ser clínico-laboratorial e clínico-epidemiológico. Primeiramente, são

realizados exames capazes de identificar alterações hepáticas como as dosagens de

aminotransferases que indicam a lesão do parênquima hepático, podendo estar em níveis três

vezes maiores que o normal.

Como apenas os sintomas clínicos não são capazes de identificar o agente etiológico,

ou seja, não é capaz de identificar o VHA responsável pelo desenvolvimento da doença, a

aplicação de exames sorológicos torna-se fundamental.

De três a quatro semanas após a infecção por VHA, os isótipos IgM poderão ser

detectados por ELISA e eles persistem por cerca de quatro meses. Enquanto que, os isótipos de

IgG quando detectados, constituem marcadores de infecção passada e de vacinação para essa

doença, permanecendo no sangue durante toda a vida do indivíduo.

II. Hepatite B

68

As principais formas de transmissão do VHB são: via sexual, transfusão de sangue e

procedimentos médicos, odontológicos e hemodiálises sem as adequadas normas de

biossegurança.

A hepatite B viral pode ser assintomática ou sintomática. Quando sintomática, ocorre

principalmente febre baixa, mal-estar e dor nas articulações, podendo ou não haver icterícia.

Essa fase aguda tende a desaparecer em um período inferior a seis meses. No entanto, alguns

indivíduos podem desenvolver a forma crônica com processo inflamatório hepático por mais de

seis meses, podendo culminar em cirrose hepática ou até mesmo câncer de fígado.

a. Diagnóstico laboratorial da Hepatite B

Além dos testes aplicados para se verificar alterações hepáticas como se faz para

investigar a hepatite A, métodos sorológicos e de biologia molecular são realizados nas fases

aguda e crônica, considerando diferentes moléculas denominadas marcadoras da hepatite B, ou

seja, são indicadores da presença e diferentes estágios da doença como são mostradas nas

Tabelas 2 e 3, a seguir. Desta forma, a confirmação diagnóstica é realizada por exame destes

marcadores no sangue.

Tabela 2: Marcadores sorológicos e seus respectivos significados para a hepatite B

aguda. Retirado de: Ministério da Saúde. Guia de Bolso. Volume I, 2004.

Marcador Significado

HBsAg É o primeiro marcador detectado no curso da infecção por HBV e

declina rapidamente a níveis indetectáveis.

Anti-HBc-IgM Marcador recente da infecção, permanecendo no soro até seis meses

após a infecção.

Anti-HBc-IgG Marcador de longa duração que representa contato prévio com o vírus.

69

Pode estar presente nas infecções agudas e crônicas.

HBeAg Indicador de replicação viral. Sua presença indica alta infectividade.

HBV-DNA Níveis deste marcador durante a fase de replicação intensa do vírus

estão acima de 100.000 cópias/mL.

Anti-HBe Surge após o desaparecimento do HBeAg, indicando o fim da fase

replicativa do VHB

Anti-HBs

É o único anticorpo que confere imunidade ao HBV. Está presente no

soro após o desaparecimento do HBsAg, indicando cura e imunidade. Está

presente também isoladamente em indivíduos vacinados.

Tabela 3: Marcadores sorológicos e seus respectivos significados para a hepatite B

crônica. Retirado de: Ministério da Saúde. Guia de Bolso. Volume I, 2004.

Marcador Significado

HBsAg Sua presença por mais de seis meses indica hepatite crônica.

HBeAg Está presente enquanto ocorrer replicação viral na infecção crônica.

Anti-HBe Sua presença sugere redução ou ausência da replicação viral,

indicando melhora bioquímica e histológica.

HBV-DNA É encontrado em qualquer fase da doença, sendo, portanto necessário

ser quantificado para monitorar tratamento.

O DNA deste do VHB-DNA pode ser detectado por PCR e os anticorpos e seus

antígenos por ELISA.

70

III. Hepatite C

A hepatite C constitui um dos problemas mundiais mais graves de Saúde Pública por

causa do grande número de casos que evoluem para a forma crônica, podendo levar para

cirrose e câncer do fígado.

A sua transmissão ocorre principalmente após o contato com o sangue contaminado

via transfusão de sangue, usuários de drogas injetáveis e trabalhadores de saúde que se

acidentam com agulhas contaminadas, mas também pode ocorrer via sexual, principalmente

entre indivíduos com muitos parceiros sexuais.

a. Diagnóstico laboratorial da hepatite C

O principal método sorológico utilizado para diagnosticar a hepatite C é o método de

ELISA para a detecção de anticorpos anti-VHC. A presença do vírus deve ser confirmada pela

investigação qualitativa do vírus VHC por PCR.

IV. Hepatite D

A hepatite D ou delta é uma doença viral aguda que pode evoluir para forma crônica,

sendo que pode ser transmitido junto com o VHB a indivíduos sem contato prévio com o vírus da

hepatite B, caracterizando uma coinfecção, ou ainda, pode ser transmitido a indivíduos já

portadores do antígeno HBsAg, caracterizando uma superinfecção. Na verdade, o VHD

necessita do VHB para produzir a infecção por hepatite D.

O VHD é transmitido de forma semelhante ao VHB, ou seja, via sexual, transfusão de

sangue e procedimentos médicos, odontológicos e hemodiálises sem as adequadas normas de

biossegurança.

71

A hepatite D apresenta-se assintomática, sintomática ou com formas gravíssimas,

podendo levar a óbito.

a. Diagnóstico laboratorial da hepatite D

Os exames laboratoriais realizados são os mesmos aplicados para identificação dos

marcadores para hepatite B, bem como anticorpos IgM e IgG anti-HDV detectados pelo método

de ELISA.

V. Hepatite E

A hepatite E é uma doença viral aguda de curso benigno, que não cronifica, podendo

apresentar-se de forma assintomática ou com sintomas semelhantes ao da hepatite A, sendo

que a icterícia é observada na maioria dos casos.

O VHE é transmitido via oral-fecal, semelhante à hepatite A, mas se apresenta

principalmente no Sudeste da Ásia, África, México e por enquanto, apenas existem registros

sorológicos de sua circulação no território brasileiro e não há descrição de casos.

a. Diagnóstico laboratorial da hepatite E

O diagnóstico é clínico-laboratorial, sendo que o ELISA é a técnica mais usada para a

detecção de seu marcador sorológico que é a IgM anti-VHE. Tal marcador tem sido detectado

em 95% dos casos com infecções recentes, ou seja, cerca de quatro dias após o início dos

sintomas e desaparece após quatro ou cinco meses. O RNA deste vírus pode ser detectado por

meio do uso de RT-PCR.

72

f) Leptospirose

A leptospirose é uma doença infecciosa causada pela bactéria Leptospira interrogans

(Figura 42) que acomete homens e animais. O seu modo de transmissão para o homem é pelo

contato com água ou solo contaminado, pela urina dos animais portadores, sendo o rato o

principal foco de disseminação da doença no meio urbano. Deste modo, após enchentes e

calamidades onde se sabe que houve contaminação do ambiente com esgotos (moradia dos

ratos), espera-se um número maior de leptospirose humana.

O contato da bactéria com a pele ou mucosas lesadas permite a sua entrada no

organismo e o início da infecção, que é abrupto e apresenta um espectro clínico que varia desde

um estado semelhante ao gripal até formas mais graves, podendo ocorrer meningite,

insuficiência renal e icterícia. Uma característica bem comum entre os pacientes com

leptospirose é a presença de mialgia (dor) nas panturrilhas, coxa, abdome e musculatura

paravertebral.

Figura 42: Foto da bactéria Leptospira interrogans causadora da leptospirose. Disponível em:

<http://www.leptospirosis.org>. Acesso em: 21 mar. 2009.

73

I. Diagnóstico laboratorial da leptospirose

O diagnóstico é clínico-epidemiológico e laboratorial. Na prática laboratorial é indicativo

isolar as leptospiras de sangue, urina ou líquido cefalorraquiano por cultivo e também avaliar o

DNA bacteriano por meio de PCR do sangue, urina, liquor e amostras de tecidos.

Entre os métodos sorológicos, existe um teste de referência denominado MAT

(“Microscopic Agglutination Test”) que incuba várias cepas vivas de leptospiras com o soro dos

pacientes em diferentes diluições para que por meio de uma reação de aglutinação microscópica

seja possível indicar a presença de anticorpos antileptospiras nos soros dos pacientes. No

entanto, como esta técnica é trabalhosa e necessita de cepas vivas, apresentando elevado risco

operacional e, portanto, o método de ELISA para a detecção de anticorpos IgM tem sido uma

alternativa cada vez mais difundida.

g) Malária

A malária é uma doença infecciosa causada pelos protozoários parasitas Plasmodium

vivax, Plasmodium falciparum (Figura 43) e Plamodium malariae que são transmitidos ao

homem, principalmente, por intermédio da picada das fêmeas dos mosquitos infectados do

gênero Anopheles. (Figura 44). O número de casos novos dessa doença por ano, ou seja, sua

incidência anual é de 300 a 500 milhões de indivíduos por todo o globo. Segundo a Organização

Mundial de Saúde (OMS), 1,5 a 2,7 milhões de pessoas morrem por malária no mundo.

A malária é caracterizada pela presença de febre alta acompanhada de calafrios,

suores e cefaleia, que ocorrem de forma cíclica, cujos períodos de repetição dos sintomas

diferem de acordo com o parasito infectante. Outras manifestações importantes são: anemia,

fadiga, dor abdominal acompanhada de palidez e icterícia.

O Plasmodium falciparum (Figura 43) é responsável pela forma clínica mais grave da

malária, podendo evoluir para distúrbios da coagulação sanguínea, choque, insuficiência renal

ou hepática, encefalopatia aguda, edema pulmonar e assim, podendo culminar em coma e óbito.

74

Figura 43: Foto mostrando o Plasmodium falciparum responsável pela forma mais grave da

malária. Figura modificada. Disponível em: <http://www.msgpp.org>. Acesso em: 28 mar. 2009.

Figura 44: Foto mostrando a fêmea do gênero Anopheles, responsável pela transmissão dos

protozoários causadores da malária. Figura modificada. Disponível em: <http://www.msgpp.org>.

Acesso em: 28 mar. 2009.

I. Diagnóstico laboratorial da malária

O diagnóstico da malária é realizado por meio da identificação do parasita no sangue,

por meio principalmente do método de gota espessa ou esfregaço com coloração de Giemsa.

75

Entre as metodologias para a detecção de anticorpos, consideradas factíveis

operacionalmente e, portanto, empregadas na rotina dos laboratórios, estão o método de ELISA

e de Imunofluorescência Indireta.

h) Raiva

A raiva é uma doença infecciosa aguda causada por um vírus que se propaga pelo

sistema nervoso central, levando ao óbito após um tempo curto de duração, ou seja, em média,

entre cinco a sete dias após a apresentação dos sintomas. Deste modo, a letalidade da raiva é

de 100%, ou seja, o número de óbitos entre os indivíduos doentes é para todos os casos de

raiva, sendo, portanto a prevenção uma indispensável ferramenta para o controle desta doença.


A transmissão da raiva para o homem ocorre através da inoculação do vírus contido na

saliva do animal infectado que pode ser cão, gato, morcego, macaco, entre outros;

principalmente por meio da mordedura e mais raramente, pela arranhadura e lambedura de

mucosas.

O paciente apresenta inicialmente um mal-estar geral, anorexia, cefaleia, náuseas, dor

de garganta, entorpecimento, irritabilidade, inquietude e sensação de angústia. Com a

progressão da infecção, ocorrem espasmos musculares generalizados e/ou convulsões,

períodos de alucinações até a instalação de coma e evolução ao óbito.

II. Diagnóstico laboratorial da raiva

A partir dos dados clínicos e epidemiológicos a suspeita da doença se instala e assim,

faz-se necessário a confirmação laboratorial.

76

As principais técnicas utilizadas para a identificação de antígenos ou anticorpos

específicos da doença são as Imunofluorescências Direta e Indireta de amostras de saliva,

sangue e impressão da córnea (extremamente doloroso para o paciente). No caso da raiva, por

ser uma doença de período de incubação curto, ou seja, apresenta um intervalo de tempo curto

entre a infecção e o aparecimento da doença, também sendo realizado o diagnóstico, pós-morte

por análise de fragmentos do cérebro pela técnica de Imunofluorescência Direta.

i) Sífilis

A sífilis adquirida é uma doença infectocontagiosa considerada sexualmente

transmissível (DST), pela forma de transmissão do seu agente etiológico, a bactéria Treponema

pallidum (Figura 45) ser sexual, na área genital, em quase todos os casos.

No início dos anos 90, houve uma significativa diminuição de praticamente todas as

DSTs provavelmente pelas medidas de prevenção provocadas por mudanças nas práticas

sexuais, estimuladas pelas elevadas taxas de óbito entre os pacientes portadores da AIDS. No

entanto, atualmente, o número de casos de sífilis tem crescido em virtude de vários fatores que

incluem a falsa sensação de segurança associada à melhora clínica dos portadores do HIV em

uso do coquetel de drogas antirretrovirais. Alguns estudos mostram que a sífilis é a DST mais

associada à AIDS.

I.História natural da sífilis

A sua evolução pode ser dividida em recente e tardia. Mas também tem a sífilis

congênita, cuja transmissão ocorre da gestante infectada a partir de seu 4º mês de gestação

para seu filho via disseminação hematogênica.

77

a. Sífilis adquirida recente

Essa forma compreende o primeiro ano de evolução da doença, período de

desenvolvimento da resposta imune quando a doença não for tratada e inclui: a sífilis primária,

secundária e latente.

A sífilis primária da sífilis é caracterizada pelo aparecimento de uma lesão firme e

dura denominada cancro duro após 10 a 90 dias da infecção, cuja evolução é uma cicatrização

espontânea. Após duas e quatro semanas do aparecimento do cancro duro, é que as

metodologias sorológicas poderão ser aplicadas, pois é neste período que se é capaz de

encontrar positividade, caso o indivíduo se apresente infectado.

A sífilis secundária da sífilis é caracterizada pela disseminação dos treponemas para

o organismo e pelo aparecimento de lesões cutâneas e indolores. Neste caso, as reações

sorológicas são sempre positivas.

Já a fase latente da sífilis é caracterizada pela inexistência de manifestações visíveis,

mas há treponemas localizados em determinados tecidos, permitindo que o diagnóstico nesta

fase só ocorra por meio de testes sorológicos.

b. Sífilis adquirida tardia

Essa forma considera o período após um ano de evolução e ocorre em pacientes que

não receberam tratamento adequado ou que não foram tratados. É também chamada de fase

destrutiva, pois nela ocorre um processo crônico imunoinflamatório.

As suas manifestações clínicas compreendem em formas cutânea, óssea,

cardiovascular e até nervosa, em que pode levar até a demência do paciente.

78

c. Sífilis congênita

A sífilis congênita ocorre com a infecção do feto pelo Treponema pallidum por via

placentária. As suas manifestações clínicas incluem lesões mucocutâneas, lesões oculares,

comprometimento renal e do SNC.

II. Diagnóstico laboratorial

O diagnóstico da sífilis é clínico, epidemiológico e laboratorial e depende da fase de

infecção da sífilis. Para identificação do Treponema pallidum, na fase primária da sífilis, é

recomendado o uso de microscopia de campo escuro (Figura 45). Tal teste permite de forma

mais rápida e eficaz a observação dessa bactéria de forma direta, uma vez que ela se apresenta

móvel no material coletado do paciente (lesões do paciente).

Um teste rotineiramente aplicado é o VDRL, mas como já visto com maior

detalhamento no Módulo II, apresenta fatores limitantes como o efeito pró-zona e baixa

especificidade. Desta forma, um método, rotineiramente usado para confirmar a especificidade

dos anticorpos é o teste de imunofluorescência indireta que neste caso é denominado FTA-abs,

que do inglês significa absorção do anticorpo trepomenal fluorescente, no qual utiliza a bactéria

íntegra como antígeno.

Os isótipos IgM podem ser detectados por ELISA nas fases primárias, secundária e

para confirmar a sífilis congênita.

79

Figura 45: Foto mostrando o Treponema pallidum como é visto em microscopia de campo

escuro. Disponível em: <http://pt.wikipedia.org>. Acesso em: 28 mar. 2009.

j) Toxoplasmose

A toxoplasmose é uma doença causada pelo protozoário Toxoplasma gondii (Figura

46) e sua transmissão ao homem podem ocorrer por meio da ingestão de água contaminada

com fezes de gatos infectados; ingestão de carne infectada, crua e mal cozida, especialmente

carne de porco e carneiro; infecção transplacentária e transfusão de sangue ou transplante de

órgãos de um doador infectado.

Figura 46: Foto mostrando o protozoário Toxoplasma gondii, responsável pela toxoplasmose.

Disponível em: <http://www.msgpp.org>. Acesso em: 28 mar. 2009.

80

A toxoplasmose apresenta quadro clínico variado, desde infecção assintomática até

manifestações mais graves, incluindo comprometimento ocular, manifestações pulmonares,

meningoencefálias, hepáticas e cardíacas.

I. Diagnóstico laboratorial da Toxoplasmose

O diagnóstico é clínico com a confirmação de estudos sorológicos cujos isótipos

medidos variam de acordo com a fase de desenvolvimento da doença.

No início da infecção, que é considerada a fase aguda da doença os isótipos IgM e

IgA são medidos, pois são marcadores da fase aguda por meio da aplicação do método de

ELISA.

A próxima fase consiste em uma fase de transição, em que poderá se detectar níveis

crescentes de IgG, redução gradativa de IgM e ausência ou praticamente indetectáveis

níveis de IgA.

Na fase crônica da doença, apenas existem níveis de isótipos de IgG a serem

detectados. Desta forma, por meio dos diferentes níveis de anticorpos que aparecem ao longo

de seu desenvolvimento da doença é possível acompanhar o seu curso.

k) Tuberculose

A tuberculose é uma doença infecciosa crônica causada principalmente pela bactéria

Mycobacterium tuberculosis (Figura 47), sendo a pulmonar, a forma clínica mais comum, com

cerca de 80% dos casos.

A transmissão do Mycobacterium tuberculosis ocorre por meio da fala, tosse ou espirro

de um indivíduo doente para o sadio, atingindo principalmente o pulmão.

81

Figura 47: Foto de microcolônias do Mycobacterium tuberculosis em placa. Disponível em:

<http://ilovebacteria.com>. Acesso em: 28 mar. 2009.

I. História Natural da Tuberculose Pulmonar

Em cerca de 90% dos casos de infecção, o sistema imunológico consegue impedir o

desenvolvimento da doença, permanecendo esses indivíduos restritos à infecção (Figura 48).

No entanto, os 10% restantes de indivíduos infectados desenvolverão a doença, sendo que

metade apresentará a chamada tuberculose primária nos dois a três primeiros anos após a

infecção, enquanto que os outros 5% infectados desenvolverão, muitos anos mais tarde, a

chamada tuberculose pós-primária (Figura 48).

A TB primária é resultante da progressão do complexo pulmonar primário, sendo a

forma miliar a mais grave (Figura 48).

Já a TB pós-primária origina-se, na maioria dos casos, da reativação endógena, ou

seja, ocorre através da reativação de um foco quiescente do Mycobacterium tuberculosis. Apesar

de constituir tema controverso, se aceita que a TB pós-primária pode originar-se também de uma

reinfecção exógena, ou seja, resultante de uma nova infecção (Figura 48)

82

A reativação endógena e a reinfecção exógena são indistinguíveis clinicamente, no

entanto, podem ser diferenciadas entre si por intermédio da aplicação de técnicas de biologia

molecular.

Os sinais e sintomas mais frequentes da tuberculose são: comprometimento do

estado geral, febre baixa vespertina com sudorese, inapetência e emagrecimento. Na forma

pulmonar, apresenta-se também dor torácica, tosse inicialmente seca e posteriormente

produtiva acompanhada ou não de escarros com sangue.

Figura 48: Esquema com um resumo da história natural da tuberculose. PAULA,

Patrícia Ferreira de. Figura retirada de tese de Doutorado, tema “Fatores associados à recidiva,

ao abandono e ao óbito no retratamento da tuberculose pulmonar” (2008).

IndivIndivííduo infectado duo infectado

e doentee doenteIndivIndivííduo primoduo primo--infectadoinfectado

Transmissão do bacilo

(Permanece restrito (Permanece restrito àà

primo infecprimo infecçção)ão)

~ 90%~ 90% ~ 5%~ 5%

TB pTB póóss--primprimááriaria

(Reativa(Reativaçção endão endóógena ou gena ou

reinfecreinfecççãoão exexóógena)gena)

TB primTB primááriaria

~ 5%~ 5%

(Em 2(Em 2--3 anos ap3 anos apóós s

primoprimo--infecinfecçção)ão)

IndivIndivííduo infectado duo infectado

e doentee doenteIndivIndivííduo infectado duo infectado

e doentee doenteIndivIndivííduo primoduo primo--infectadoinfectado

Transmissão do bacilo

(Permanece restrito (Permanece restrito àà

primo infecprimo infecçção)ão)

~ 90%~ 90%~ 90%~ 90% ~ 5%~ 5%

TB pTB póóss--primprimááriariaTB pTB póóss--primprimááriaria

(Reativa(Reativaçção endão endóógena ou gena ou

reinfecreinfecççãoão exexóógena)gena)

TB primTB primááriaria

~ 5%~ 5%

(Em 2(Em 2--3 anos ap3 anos apóós s

primoprimo--infecinfecçção)ão)

83

II. Diagnóstico laboratorial para a Tuberculose

Entre indivíduos sintomáticos respiratórios, ou seja, indivíduos com tosse e

expectoração de escarro por três semanas a mais, recomenda-se a baciloscopia de escarro que

permite a identificação do Mycobacterium tuberculosis no escarro do paciente. Para a aplicação

desta metodologia, recomenda-se a coleta de duas amostras de escarro: a primeira deve ser

coletada quando o sintomático respiratório procura a Unidade de Saúde, não havendo

necessidade de estar em jejum e a segunda amostra, deve ser coletada na manhã do dia

seguinte, assim que o paciente despertar.

A baciloscopia de escarro também é realizada para monitorar o curso da doença,

realizando-se pelo menos ao final do segundo, quarto e sexto mês de tratamento.

Para a tuberculose, o método de cultura do Mycobacterium tuberculosis é

recomendado principalmente quando a baciloscopia foi repetitivamente negativa, ou seja, não for

possível detectar as bactérias no escarro por não haver quantidade suficiente para ser detectável

por este teste.

Para exames de rotina, no caso da tuberculose, métodos sorológicos e de biologia

molecular como o PCR embora sejam úteis, não são ainda recomendados pelo Ministério da

Saúde brasileiro, devido seu alto custo e complexidade para o diagnóstico desta doença.

l) Doenças associadas ao ASLO (Anticorpo antiestreptolisina O)

As bactérias estreptococos beta hemolítico do grupo A são responsáveis pelo

aparecimento de diversas doenças como amigdalite, escarlatina (infecção de garganta associada

a uma erupção de pele), septicemia (infecções do sangue), erisipela (infecção do tecido abaixo

da pele, geralmente nas pernas), febre reumática e glomerunefrite (inflamação renal) aguda;

podendo inclusive levar ao óbito em aproximadamente um mês.

A bactéria mais importante deste grupo é o Streptococcus pyogenes (Figura 49), pois

ele é responsável pela forma mais comum de faringite.

84

Figura 49: Foto do Streptococcus pyogenes, causador de diversas doenças, incluindo a forma

mais comum de faringite. Disponível em: <http://pt.wikipedia.org>. Acesso em: 28 mar. 2009.

Este grupo de bactérias se caracteriza também pela presença de estreptolisina O que

são hemolisinas capazes de causar hemólise total, ou seja, substâncias capazes de promover

ruptura total dos eritrócitos do hospedeiro. Tal fenômeno ocorre por meio da interação destas

hemolisinas com seus anticorpos, ou seja, anticorpos antiestreptolisina O (ASLO) presentes no

organismo do hospedeiro, no caso, no homem.

A elevação do ASLO sérico, ou seja, acima de 166 UI/mL a 200 Ul/mL, é indicativa que

houve um contato prévio com a bactéria estreptococo beta hemolítico do grupo A, atingindo os

seus valores máximos entre quatro a seis semanas. Embora na tuberculose o ASLO também

possa se elevar, neste caso, não está associado à bactéria estreptococo beta hemolítico do

grupo A.

O ASLO deve ser dosado após o jejum de oito horas e a detecção se faz indiretamente

por meio de provas que determinam a elevação de anticorpos contra a enzima estreptolisina O.

A amostra sérica do ASLO é diluída em uma preparação comercial de estreptolisina O

e incubada. Após a adição de hemácias de coelho ou humanas, o tubo é reincubado e

examinado visualmente. Se não ocorrer hemólise como mostra a Figura 50, significa que a

infecção é recente.

85

Figura 50: Tubos da esquerda e central sem hemólise e da direita com hemólise. Disponível em:

<http://pt.wikipedia.org>. Acesso em: 28 mar. 2009.

A dosagem deste anticorpo pode ser realizada por nefelometria cujo princípio permite

que reações de precipitação entre antígeno e anticorpo em soluções diluídas produzam

(aumento da reflexão da luz, que pode ser diretamente medida pela dispersão da luz incidente

Figura 51).

A quantidade e a natureza da dispersão dependem da forma e do tamanho das

partículas, da concentração e do comprimento de onda da luz e do índice de refração do meio

(Figura 51).

As substâncias são medidas pela adição de quantidades constantes de anticorpos

puros e opticamente claros a concentrações crescentes da substância em análise (Figura 51). O

feixe de luz incide sobre os complexos formados na solução do tubo ou cubeta e a intensidade

de luz dispersada é medida por uma célula fotométrica como densidade óptica (Figura 51).

As vantagens da nefelometria são: totalmente automatizada, de fácil realização, rápida

e precisa, tem a capacidade de necessitar pequenos volumes de amostra e tem uma

sensibilidade adequada para a medida de proteínas de significado clínico como é o caso do

ASLO. No entanto, como esta técnica tem sido realizada atualmente, mais manualmente, a

86

dosagem do ASLO tem sido realizada também por ELISA, turbodimetria, neutralização da toxina,

entre outros.

Figura 51: Esquema do método de nefelometria. Disponível em:

<http://www.lvapli.ufsc.br/Aulas>. Acesso em: 28 mar. 2009.

Não só para as doenças descritas acima, bem como para todas aquelas que ainda

apresentam impacto para Saúde Pública brasileira, se faz necessário um remanejamento

constante de verbas públicas nas diferentes esferas Municipais, Estaduais e Federais. Desta

forma, o SUS (Sistema Único de Saúde) e seus sistemas para a prevenção, o controle e a

vigilância de diversas doenças poderão realizar seus papéis mais efetivamente. Além disso,

surge a necessidade da introdução de novas técnicas como as de biologia molecular para a

tuberculose, por exemplo, que embora o custo em termos financeiros seja mais elevado que

muitas técnicas já consolidadas; muitos benefícios para os profissionais de saúde e

principalmente para a população ocorreriam como a diminuição do tempo de espera dos

resultados e o aumento considerável da sensibilidade e da especificidade dos testes aplicados.

Fonte de luz

Tungstênio

Mercúrio

Xenônio

Cubeta

30º

0º

90º

http://www.lvapli.ufsc.br/Aulas

87

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93

GLOSSÁRIO

Denaturação: separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples.

Doença infecciosa: uma doença, humana ou animal, que se manifesta de forma clínica e que

se resulta de uma infecção.

Especificidade do teste: indica que o método em questão identificará somente o antígeno ou o

anticorpo desejado.

Fenótipo: características observáveis expressas por uma célula ou organismo, como por

exemplo, resistência às drogas ou morfologia.

Genótipo: características genéticas de uma célula ou um organismo de acordo com o seu

genoma inteiro ou a um local específico do loci gênico (alelo).

Infecção: é a penetração de micro-organismos no organismo de um hospedeiro, produzindo-lhe

danos, com ou sem o aparecimento de sintomas clinicamente reconhecíveis.

Janela Imunológica: intervalo entre a infecção e a detecção dos anticorpos por metodologias

laboratoriais.

Letalidade: o número de óbitos entre os indivíduos doentes.

Período de incubação: intervalo de tempo entre a infecção e o aparecimento da doença.

Polimerase: enzima que facilita a síntese de uma nova fita de DNA.

Primer: constitui em uma pequena sequência de ácido nucleico que se liga à fita de DNA alvo.

Sensibilidade do teste: uma característica inerente ao método, estreitamente relacionada com

a quantidade mínima de antígeno ou de anticorpo que poderá ser detectada.

Imunologia Clínica e Laboratorial

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