Indicadores microbiológicos para qualidade do...

Universidade Federal Rural de PernambucoPrograma de Pós-Graduação em Ciência do Solo

Disciplina: Seminário IIProfessor: Mario de Andrade Lira Junior

Indicadores microbiológicos para qualidade do solo

Mestranda: Rayssa Pereira VicentinOrientador: Mario de Andrade Lira JuniorCo-orientador: José Carlos Batista Dubeux Junior Co-orientador: Márcia do Vale Barreto Figueiredo

Recife, 04 de dezembro de 2009.

para qualidade do solo

Introdução

Qualidade do solo é a capacidade do solo

funcionar nos limites do ecossistema,

sustentando a produtividade biológica, mantendo

Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.

a qualidade ambiental e promovendo a saúde

vegetal e animal.

Biológicas

•Composição vegetal.•Fauna: Macro.

Meso.Micro.

•Microbiota.


Parâmetros da Qualidade do Solo

Químicas Físicas

•Condutividade Hidráulica.•Resistência a Penetração.•Agregação.

•Teores totais do elementos.•Conteúdo e composição da Matéria Orgânica.•Xenobióticos.


Desenvolvimento

Quando têm sido utilizados os indicadores microbiológicos?

Parâmetro sensível.

Quando a microbiologia é foco do trabalho.

No estudo do Fluxo e Ciclagem dos Elementos.

Indicadores Microbiológicos

Densidade.


Diversidade.

Atividade.

Densidade


• Contagem de nódulos.

Métodos:

http://www.cnpab.embrapa.br/images/fbnl.jpg


• Infecção micorrízica.

Densidade - Métodos

Clareamento com KOH e

Coloração com azul de tripano.

Observação com microscópio

H2O2.azul de tripano. microscópio

estereoscópico.

• Número de esporos de fungos.



Amostras tratadas com corantes.

Observação em microscópios

• NMP (Número mais Provável.



Diluições seriadas de amostras

Inoculação em meio líquido ou semi-

sólido.

Tabela estatística

NMP

http://bervieira.sites.uol.com.br/dilui.htm

• NMP (Número

mais Provável.

Tabela Estatística de Cochran

Moreira & Siqueira, 2006.

P1 > P2 > P3

• Carbono da biomassa microbiana.



Amostras frescas

Fumigada.Extração com K2SO4, seguida de filtragem.Não-Fumigada.

Digestão com Dicromato, ácido sulfúrico e ácido

ortofosfórico.

Titulação com sulfato ferroso amoniacal,

utilizando fenolftaleína como indicador.

Silva et al., 2007.

Carbono total – Carbono solo = Carbono da biomassa.KC


Diversidade

Variedade de indivíduos.

Bactérias: Apenas 1% é passível de cultivo.

Métodos Moleculares

Moreira & Siqueira, 2006.


RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) –Polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição.

Indicadores microbiológicos para qualidade do solo.Diversidade

Proximidade genética de isolados.

Extração de DNA do isolado.

Digestão com enzima de restrição.

Separação de fragmentos em

Métodos:

DNA do isolado.

http://static.hsw.com.br/gif/how-to-prepare-soil-for-planting-4.jpghttp://www.mundovestibular.com.br/articles/219/1/O-DNA/Paacutegina1.htmlhttp://1.bp.blogspot.com/_YnaVC3EBaBU/Ssn1Ob2gUBI/AAAAAAAAANw/W9y2BjSioxA/s320/replicação+semiconservativa.JPG

enzima de restrição. fragmentos em eletroforese horizontal.

RFLP


http://www.scielo.cl/fbpe/img/amv/v40n2/art11-figura01.jpg

• AFLP (Amplified fragment length polymorphism) –

polimorfismos de comprimento de fragmentos

amplificados.


Diversidade – Métodos

Extração do DNA genômico

Digestão com enzimas de restrição Amplificação.DNA genômico

do isolado.enzimas de restrição com corte adesivo.

Amplificação.

Eletroforese em gel de agarose.Dendrograma de

similaridade.

PCR

Reagentes:

• Tampão.

• dNTP.

• Primer


94°C

50-60°C

• Amostra de DNA.

• Taq Polimerase.

• MgCl.

50-60°C

72°C

http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/Taq.htm

• ARDRA.


Diversidade



Extração do DNA

genômico do isolado.

Amplificação de genes

universais.

Digestão com enzimas de restrição.

do isolado.

Eletroforese em gel de agarose.

Dendrograma de similaridade.

http://pgrc3.agr.gc.ca/facilities-installations_e.html

•DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) –Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação.



Extração do DNA Total de

Microrganismos do Solo.

Amplificação (genes

universais ou de grupos).

Eletroforese em gel de

agarose.Solo. grupos).

agarose.

Eletroforese em gel com gradiente de

desnaturação

DendrogramaSequênciamento.

DGGE



Menos [ ]

A=TC=G

Desnaturante – Formamida.

http://www.eeescience.utoledo.edu/Faculty/Sigler/RESEARCH/Protocols/DGGE/DGGE.pdf

Mais [ ]http://biomicrolab.web.ua.pt/images/DGGEgela.jpg

• Biblioteca Metagenômica/Sequenciamento.


Diversidade



DNA de amostra

ambiental

Amplificação

http://www.libertaria.pro.br/d_ressurgentes_arquivo/cadeia.jpg

ambiental

Sequenciamento


Sequenciamento

Desnaturação do DNA

Anelamento de 1 primer

Polimerização com nucletídeos marcados.

• Microarranjos.


Diversidade



Poços com DNA fita

simples.

Hibridização com DNA da

http://www.fiocruz.br/ccs/media/grafico_microarranjo.JPG

Hibridização com DNA da

amostra.

Identificação através da

fluorescência.

• Box-PCR.


Diversidade

Os Primers utilizados são sequências grandes

de nucleotídeos que se repetem no DNA.

Gerando uma variedade diferente tamanho de

http://www.bspp.org.uk/publications/new-disease-reports/012/2005-84-1.gif

Gerando uma variedade diferente tamanho de

fragmento.


Atividade microbiana

Respiração Basal

Amostras Frescas

Incubar amostra + frascos contendo

NaOH em ambiente hermético.

Frascos NaOH são acrescidos

BaCl2 para precipitar o CO2.

Titulação com ácido Titulação com ácido clorídrico na presença

de fenolftaleína.

RBS (mg de C-CO2 kg-1 solo hora-1)

Coeficiente Metabólico qCO (mgC-CO2 .g-1 BMS C.h-1 )

Silva et al., 2007.



Atividade Enzimática

Princípio: Incubação com substrato, por determinado tempo e temperatura, e leitura do produto da reação.

Enzimas: • Arilsulfatase (mineralização de Enxofre).• Arilsulfatase (mineralização de Enxofre).

• Fosfatase (mineralização do Fóforo).

• Celulase (degradação da Celulase).Celulose Celobiose

• β-glucosidase (degradação da Celobiose).Celobiose Glicose



Determinação de ATP

Extração:• Ácido Tricloroacético.• Solução de Fosfato.• Ácido Sulfúrico.• Ácido Fosfórico.• Ácido Fosfórico.

Leitura: HPLC (High performance liquid chromatography) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Considerações finais

•É de suma importância a determinação de mais

de um parâmetro de qualidade do solo.

• Os Indicadores Microbiológicos são

parâmetros sensíveis pra determinar as

alterações da qualidade do solo.

•Devido a dificuldade de cultivar as bactérias,

métodos moleculares viabilizam o estudo da sua

diversidade.

Obrigada!


Obrigada!

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