UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

INFECÇÕES POR Ranavirus E COCOS GRAM-POSITIVOS EM GIRINOS E RÃS DE CRIAÇÃO (Rana catesbeiana Shaw, 1802) DO

ESTADO DE GOIÁS.

. Rolando Alfredo Mazzoni Romero

Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita

GOIÂNIA 2006

ii

ROLANDO ALFREDO MAZZONI ROMERO

INFECÇÕES POR Ranavirus E COCOS GRAM-POSITIVOS EM GIRINOS E RÃS DE CRIAÇÃO (Rana catesbeiana Shaw, 1802) DO

ESTADO DE GOIÁS.

Tese apresentada para obtenção do grau de Doutor em

Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás

Área de Concentração: Sanidade Animal

Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita – CPA, UFG Comitê de Orientação: Prof. Dra. Iolanda Aparecida Nunes – CPA, UFG Prof. Dra. Wilia M. E. D. de Brito – IPTSP, UFG

GOIÂNIA 2006

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AGRADECIMENTOS

Para quem veio de outro país e ficou quatro anos desenvolvendo este

trabalho é praticamente impossível fazer uma lista de todas as pessoas e

instituições que contribuíram para realização do mesmo. A Energia Universal

manifestou-se brindando apoio em todas as formas possíveis, desde o trabalho

da Taq DNA polimerase até na forma de inúmeras pessoas e Instituições.

Assim sendo, quero expressar meu reconhecimento especial para:

À CAPES, que na celebração do Convênio com a Universidade de la

República do Uruguai fez possível a realização deste doutorado.

À Universidade Federal de Goiás, que abriu as portas para a realização

deste trabalho.

À Universidade de la República do Uruguai, e especialmente à Facultad de

Veterinária, e Instituto de Investigaciones Pesqueras.

À Escola de Veterinária da UFG, e especialmente ao Programa de Pós-

graduação em Ciência Animal.

Ao Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária que foi

minha casa durante este período.

Aos Professores e funcionários, especialmente meu orientador Prof. Dr.

Albenones José de Mesquita pelo apoio constante e principalmente pela amizade

e sua qualidade humana.

Aos colegas da pós-graduação pelo bom companheirismo, apoio e estimulo

recebido.

À minha família pela difícil tarefa de convivência com um pós-graduando.

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SUMÁRIO

CAPITULO 1 - 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS .......................................... 12 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 43 OBJETIVOS .................................................................................................. 9REFERÊNCIAS................................................................................................. 10CAPITULO 2 - CARACTERIZAÇÃO DE RANAVIRUS ISOLADOS DE

GIRINOS DE RÃ TOURO (Rana catesbeiana Shaw, 1802) EM RANÁRIOS COMERCIAIS ....................................... 20

RESUMO ......................................................................................................... 20ABSTRACT ...................................................................................................... 211 INTRODUÇÃO............................................................................................... 222 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 262.1 Amostras de Vírus ..................................................................................... 262.2 Isolamento de vírus ................................................................................... 262.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 272.4 Seqüenciamento ........................................................................................ 293 RESULTADOS .............................................................................................. 313.1 Isolamento em cultura de células ............................................................. 313.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 313.3 Seqüenciamento ........................................................................................ 334 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES .................................................................. 45REFERÊNCIAS ................................................................................................ 48CAPITULO 3 -

RANAVÍRUS ASSOCIADOS A MORTANDADE DE GIRINOS (Rana catesbeiana Shaw, 1802) DE CRIAÇÃO INTENSIVA NO BRASIL. ................................................................... 53

RESUMO ......................................................................................................... 53ABSTRACT ...................................................................................................... 541 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 552 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 572.1 Amostragem de girinos .............................................................................. 572.2 Análise Microbiológica ............................................................................... 572.3 Histopatologia ............................................................................................ 582.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 592.5 Microscopia eletrônica de transmissão ...................................................... 602.6 Parasitologia .............................................................................................. 613 RESULTADOS .............................................................................................. 623.1 Epizootiologia ............................................................................................ 623.2 Evidências clínicas .................................................................................... 623.3 Necrópsia ................................................................................................... 633.4 Histopatologia ............................................................................................ 643.5 Microbiologia ............................................................................................. 673.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 673.7 Parasitologia .............................................................................................. 683.8 Microscopia eletrônica de transmissão....................................................... 684 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES .................................................................. 694.1 Infecção em girinos jovens 694.2 Infecção em girinos na pré-metamorfose 70REFERÊNCIAS .... 73CAPITULO 4 - QUADROS INFECCIOSOS EM RÃS DE CRIAÇÃO (Rana

catesbeiana Shaw, 1802) NA FASE PÓS-METAMÓRFICA EM RANÁRIOS COMERCIAIS. .................................................

79

RESUMO ......................................................................................................... 79ABSTRACT ...................................................................................................... 80

v

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 812 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 852.1 Amostragem das rãs .................................................................................. 852.2 Microbiologia .............................................................................................. 862.3 Histopatologia ............................................................................................ 872.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 872.5 Microscopia eletrônica de transmissão ..................................................... 892.6 Proteínas séricas totais ............................................................................. 892.7 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis ................................. 892.8 Reprodução da Doença ............................................................................ 903 RESULTADOS ............................................................................................ 913.1 Epizootiología ........................................................................................... 913.2 Sinais Clínicos .......................................................................................... 913.3 Achados de necropsia ............................................................................. 943.4 Histopatologia ......................................................................................... 953.5 Microbiologia .............................................................................................. 993.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 993.7 Microscopia eletrônica de transmissão ...................................................... 993.8 SDS page das proteínas sericas totais ...................................................... 993.9 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis .................................. 1003.10 Reprodução da doença ............................................................................ 1004 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES ................................................................... 101REFERÊNCIAS .............................................................................................. 110CAPITULO 5 - PROCESSO INFECCIOSO SUPER AGUDO SEMELHANTE

AO CHOQUE ENDOTÓXICO EM RÃS DE CRIAÇÃO (Rana catesbeiana Shaw, 1802) 121

RESUMO ......................................................................................................... 121ABSTRACT ...................................................................................................... 1221 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1232 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 1252.1 Amostragem das rãs .................................................................................. 1252.2 Análise Histopatologica .............................................................................. 1252.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 1262.4 Análise Microbiológica ............................................................................... 1272.5 Microscopia eletrônica de transmissão ...................................................... 1282.6 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis .................................. 1283 RESULTADOS .............................................................................................. 1303.1 Necrópsia ................................................................................................... 1313.2 Histopatologia ............................................................................................ 1313.3 Microbiologia .............................................................................................. 1343.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................. 1343.5 Microscopia eletrônica de transmissão ...................................................... 1343.6 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis ................................. 1344 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES ................................................................... 135REFERÊNCIAS ............................................................................................... 139CAPITULO 6 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................. 144

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RESUMO

A presença de enfermidades tem inviabilizado a produção nos ranários constituindo um dos principais fatores limitantes para o crescimento da atividade. Objetivou-se com o presente estudo determinar o papel dos vírus da Família Iridoviridae gênero Ranavirus nas doenças de importância econômica nos ranários comerciais, visando relacionar sua eventual presença com os quadros clínicos observados. Para tanto, foram realizados estudos envolvendo as fases de girino e de rã, pesquisando os agentes etiológicos, a epizootiología das doenças, a sintomatologia clínica, a anatomia patológica macroscópica, a histopatologia, a bacteriologia convencional, e a virologia, sendo esta por meio do emprego de técnicas moleculares, cultura de células e a microscopia eletrônica de transmissão. Foi diagnosticada pela primeira vez em rãs de criação do Brasil, uma doença específica que acomete girinos de até 30 dias de idade, determinada por um vírus da Família Iridoviridae, gênero Ranavirus. O quadro, de tipo super agudo, caracterizou-se por surtos de morbidade e mortalidade acima de 90% da população do ranário. Clinicamente foram observados girinos com edemas e ascite, assim como girinos finos ou emaciados. As lesões localizaram-se principalmente no fígado e nos rins, com destruição quase completa do parênquima. Nenhum agente bacteriano pôde ser incriminado na etiologia da enfermidade. Observou-se uma homologia de quase 100% nas regiões seqüenciadas do genoma entre o vírus isolado no Brasil com aquelas do Frog Virus 3, indicando que o agente pode ter sido introduzido no país pelas rãs importadas de América do Norte. Formas clínicas diferentes foram observadas nos girinos no período pré-metamorfose e nas rãs, as que podem ser considerada como “Septicemia estreptocócica secundária” devido à abundante presença de cocos Gram-positivos associados às lesões. A morte foi conseqüência da septicemia associada ao comprometimento funcional de órgãos vitais como fígado e rins. Foi identificado um quadro super agudo nas rãs, sugerindo, a presença de uma síndrome semelhante ao choque séptico. A síndrome denominada de “perna vermelha” não foi observada em nenhuma das rãs estudadas.

Palavras-chave: Aqüicultura, estreptococos, ranicultura, septicemias, ranavírus.

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ABSTRACT Diseases are an important limiting factor for frog farming development. This study was developed to determine the role of virus of the Iridoviridae Family, genus Ranavirus in economically important diseases affecting farmed frogs, aiming to find relationships among these viruses and the clinical syndromes observed. Studies had been carried out with frogs and tadpoles searching for etiological agents, the epizootiology of the diseases, clinical symptoms, macroscopic anatomo-pathology, histopathology, conventional bacteriology and virology by molecular techniques, cell culture and transmission electron microscopy. A specific illness affecting tadpoles up to 30 days old was characterized for the first time in farmed frogs of Brazil. The etiological agent is a virus of the Iridoviridae Family, genus Ranavirus. The syndrome is characterized by sudden outbreaks of morbidity and mortality above of 90% of the farm population. Clinically, swollen tadpoles with edemas and ascites were observed, as well as thin or emaciated ones. Lesions were located mainly in liver and kidneys, with almost complete tissue destruction. No bacterial agents could be incriminated in the etiology of the disease. An homology of almost 100% was detected into the genomic areas studied of the Brazilian virus, when compared with those of Frog Virus 3, indicating that the agent may have been carried by the frogs from North America. Another disease was found affecting tadpoles reaching the pre-metamorphic period and frogs. The disease should be considered as a "secondary streptococci septicemia" due to the abundance of Gram-positive cocci associated with the observed lesions. Death was consequence of the septicemia, associated with the functional damage of the liver and kidneys. A super acute syndrome was identified in frogs suggesting the presence of septic shock like syndrome. The so-called "red leg syndrome" was not observed in any of the frogs. Keywords: Aquaculture, frog farming, septicemia, streptococci, ranavirus.

1

CAPITULO 1 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS A aqüicultura na América do Sul tem experimentado um

desenvolvimento muito acelerado, principalmente no Brasil, sendo uma das novas

atividades produtivas com fins de obtenção de alimentos. Sua importância fez

com que o atual governo criasse a Secretaria Especial de Aqüicultura e Pesca

subordinada diretamente à Presidência da República.

A ranicultura, apesar de constituir uma das atividades mais recentes

dentro da aqüicultura mundial, é uma das criações de organismos aquáticos que

tem se estabelecido firmemente. Em decorrência do clima favorável, da excelente

adaptação da rã touro (Rana catesbeiana Shaw, 1802) e da tecnologia

desenvolvida pelos produtores e pesquisadores brasileiros, a ranicultura tornou-se

uma importante atividade no Brasil, particularmente no Estado de Goiás. Dados

referentes à produção obtida nos anos 2000-2004 colocam Goiás como o primeiro

produtor do país com 150 toneladas anuais, o que representa 90% da exportação

brasileira (SILVA, 2005). Esta produção encontra-se distribuída entre pequenos e

médios produtores agropecuários, sendo um setor inovador e produtor de

alimentos de alta qualidade para consumo humano. Seus principais mercados

consumidores encontram-se em países desenvolvidos como Estados Unidos e

França, constituindo importante fonte de divisas para os paises exportadores.

Com a geração de conhecimentos sobre manejo e alimentação, a

ranicultura transformou-se numa atividade super intensiva, com altas densidades

de população e dependendo estritamente dos alimentos artificiais balanceados.

Entretanto, a esses fatores se associa maior suscetibilidade às doenças de

diversas etiologias o que ameaça à viabilidade técnica e econômica dos criatórios

de organismos aquáticos, fato que também ocorre em outras atividades

produtivas (AUSTIN, 1984).

A experiência compartilhada e o alto grau de desenvolvimento

alcançado pela ranicultura no Brasil indicam que a presença de enfermidades têm

inviabilizado a produção nos ranários constituindo-se em um dos principais fatores

limitantes para o crescimento da atividade (MAZZONI, 2000; HIPÓLITO, 2002;

SILVA, 2005). O fechamento no ano 2000 do maior ranário existente no Uruguai

2

no ano 2000, e o fim das atividades no ano 2005 do maior ranário do Brasil

situado no Município de Hidrolândia, são exemplos relevantes.

Sendo a ranicultura uma atividade relativamente nova, a experiência no

estudo científico das doenças em rãs de criação ainda pode ser considerada

muito escassa, pois os produtores não tem conhecimento dos agentes etiológicos

envolvidos e conseqüentemente das medidas profiláticas e terapêuticas

apropriadas.

As descrições relativas a mortalidades generalizadas em ranários,

citam quadros de ascite e edemas em girinos e rãs. Estes quadros podem estar

ou não acompanhados de sintomatologia nervosa e, às vezes, as mortes ocorrem

de forma súbita. É fato comum que num mesmo surto ocorram os diversos

quadros clínicos que compõem a síndrome.

Apesar da importância econômica, diversos fatores têm dificultado o

estudo científico destas doenças, principalmente a inespecificidade dos sinais

clínicos em anfíbios, bem como as condições particulares de manejo e

alimentação artificial que, muito provavelmente, constituem causas

predisponentes para transformação de um eventual agente comensal num

patógeno. Assim, numerosas pesquisas têm sido desenvolvidas mas sem

conclusões claras quanto aos agentes etiológicos e, conseqüentemente, sem

recomendações de medidas de controle e/ou prevenção (HIPÓLITO, 2002).

Por outro lado, existem informações abundantes sobre doenças que

afetam anfíbios em populações selvagens, assim como aqueles utilizados para

estudos em laboratórios. Estas informações podem ser utilizadas para melhor

compreensão das doenças nas rãs de criação. Neste sentido, têm sido

identificadas doenças emergentes produzidas por fungos e vírus, sendo que, em

rãs de criação, esses agentes têm recebido pouca atenção. O fungo da espécie

Batrachochytrium dendrobatidis foi detectado em rãs touro de criação no Uruguai

(MAZZONI et al., 2003) e os vírus do gênero Ranavirus foram detectados em

girinos de criação do citado país e também do Brasil (MAZZONI, 2003; GALLI et

al., 2006). Estes diagnósticos, bem como a importância adquirida pelos vírus do

gênero Ranavirus como causadores de doenças em anfíbios, peixes e répteis,

são justificativas mais que suficientes para o aprofundamento do conhecimento

sobre o papel desses microrganismos nas rãs de criação.

3

Diante do exposto e da relevância do tema, objetivou-se com o

presente estudo determinar o papel dos vírus da Família Iridoviridae gênero

Ranavirus nas doenças de importância econômica nos ranários comerciais, assim

como estabelecer um diagnóstico diferencial visando relacionar sua eventual

presença com os quadros clínicos observados. Para tanto, foram realizados

estudos envolvendo os agentes etiológicos, a epizootiología da doença, a

sintomatologia clínica, a anatomia patológica macroscópica, a histopatologia, a

bacteriologia convencional, e a virologia através de técnicas moleculares, cultura

de células e microscopia eletrônica de transmissão.

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2 REVISÃO DA LITERATURA Surtos de doenças com alta mortalidade, caracterizados clinicamente

por edemas e ascite, com ou sem sintomatologia nervosa, têm sido observados

reiteradamente em girinos e rãs de criação.

No que pese essas doenças terem sido objeto de diversos estudos nas

últimas décadas, estes foram direcionados principalmente à identificação dos

agentes envolvidos em surtos ou episódios de mortalidade maior que a esperada,

seja na fase de girino ou na adulta (AMBROSKY et al., 1983; HIPÓLITO et al.,

1987, 1988a, b; BARROS et al., 1988; CARNEVIA & MAZZONI, 1988;

GUIMARAES et al., 1988; MOREIRA et al., 1988; SOUZA, 1988; PINHEIRO,

1989; MAGALHAES, 1991a, b, c, 1992; MAGALHAES et al., 1992; SILVA et al.,

1993, 1997; HIPÓLITO, 1995; MARTINS et al., 1995; FIORIO et al., 1997;

HIPÓLITO, 1997; LIMA & VALLES, 1997; LIMA et al., 1997; MORAES et al.,

1997; FERREIRA et al., 1998; HIPÓLITO, 1999; HIPÓLITO et al., 2000a; MAUEL

et al., 2002; PASTERIS et al. 2006). Somente em uma oportunidade foi realizada

pesquisa de vírus pela microscopia eletrônica (HIPOLITO et al., 2000). Em todos

os outros trabalhos, os diagnósticos concentraram-se exclusivamente no achado

de agentes parasitários ou bacterianos, não sendo realizado um estudo dos

surtos no intuito de estabelecer o papel etiológico dos agentes detectados e

outros aspectos das doenças que permitam a elaboração de medidas de

prevenção e/ou controle. Em revisão, HIPÓLITO (2002) constatou que a maioria

dos trabalhos tratava de comunicados efêmeros, não tendo continuidade no

estudo do caso.

As septicemias têm sido reportadas como a causa mais importante de

mortalidade em anfíbios, sendo freqüente o achado de animais mortos sem

sintomas premonitórios (CRAWSHAW, 1994). Porém existe ainda grande

incerteza em relação às características destas patologias. Nos estudos e

publicações realizados desde o final do século XIX até o ano 1995, a maioria dos

trabalhos de diagnóstico identificou bactérias como responsáveis pelos surtos.

Estes estudos incluíram a denominação de uma patologia chamada de perna

vermelha ou “red leg”. A patologia é considerada como um complexo

microbiológico ou síndrome, e foi apontada como a doença de maior importância

5

em anfíbios, sendo o agente predominante a Aeromonas hydrophila (RUSSEL,

1898; EMERSON & NORRIS, 1905; KULP & BORDEN, 1942; MILES, 1950;

REICHENBACH-KLINKE & ELKAN, 1965; GIBBS et al., 1966; GLORIOSO et al.,

1974; VAN DER WAAIJ et al., 1974; COSGROVE, 1980; HIRD et al., 1981;

NYMAN S., 1986. VIZOTTO, 1988). Pesquisas enfocando a importância da

síndrome da perna vermelha ainda continuam na literatura mais recente

(SOMSIRI, 1994; MAUEL et al., 2002; HADFIELD et al., 2005; PASTERIS et al.,

2006). Porém, esta enfermidade têm sido questionada como doença específica,

sendo considerada apenas como manifestação clínica de septicemia e morte

devida a agentes da microbiota normal que invadem o organismo debilitado por

outras causas (CUNNINGHAM et al., 1996; MAZZONI, 2000a; GREEN et al.,

2002).

Diversos estudos realizados em rãs de criação têm relatado a presença

de estreptococos. GLORIOSO et al. (1974) descreveram os achados em R.

catesbeiana septicêmicas dos Estados Unidos, assinalando a presença de

estreptococos que, naquele momento, não foram considerados patogênicos.

AMBROSKY et al. (1983) identificaram uma doença altamente letal, produzida por

Streptococcus spp. não hemolítico afetando rãs de cativeiro em Belém-PA, Brasil.

Os sinais clínicos e a epizootiología da doença descrita são totalmente

coincidentes com os das estreptococoses que ainda hoje continuam sendo

diagnosticadas. Este trabalho comprova que a doença encontra-se presente nas

rãs de criação há mais de 20 anos.

GUIMÃRAES et al. (1988) descreveram infecções produzidas em R.

catesbeiana dos Estados de Goiás e Pará, incluindo a identificação de diversos

estreptococos. HIPÓLITO et al. (1988b, 1997) indicaram a presença de

Streptococcus spp no sistema nervoso central da mesma espécie e descreveram

lesões neurológicas. HIPÓLITO (1995, 1997, 1999) também incluiu os

estreptococos entre os agentes produtores de mortalidade em rãs de cativeiro. As

referências confirmam a importância dessas bactérias no processo mórbido, mas

até o momento não foi proposto nenhum mecanismo de controle apropriado.

CUNNINGHAM et al. (1996) incriminaram Streptococcus sp. e

estreptococos do grupo D em incidentes de mortalidade em Rana temporaria na

Europa. FIORIO et al. (1997) descreveram bactérias do gênero Streptococcus em

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episódios de mortalidade de rã touro associada a soluções de continuidade na

pele. MAUEL et al (2002) realizaram a primeira citação de Streptococcus iniae em

R. catesbeiana de criação nos Estados Unidos. O microrganismo foi isolado em

surtos de doenças septicêmicas conjuntamente com outras espécies bacterianas,

a partir de diversos órgãos estudados. Os sinais e as lesões descritos são

semelhantes aos encontrados nos ranários da América do Sul. MAZZONI (2000a,

2000b) indicou a presença de Streptococcus spp em R. catesbeiana em ranários

comercias de Uruguai exibindo sinais nervosos e edemas.

A estreptococose tem sido identificada também em peixes, como uma

síndrome produzida por cocos Gram-positivos de diversas espécies. Estas

bactérias têm sido implicadas como produtoras de doenças em organismos

aquáticos em várias partes do mundo. BERCOVIER et al. (1997) e ELDAR et al.

(1997) descreveram a infecção estreptocócica como uma entidade produzida por

bactérias dos gêneros Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus e Vagococcus.

Estabeleceram que a “estreptococose” nos peixes deve ser considerada como um

complexo de doenças semelhantes produzidas por diferentes gêneros e espécies

de cocos Gram-positivos, originando uma síndrome particular.

Streptococcus iniae tem sido incriminado reiteradamente como

produtor primário de doenças em diversas espécies de peixes. A bactéria tem

sido reportada como produtora de infecções em humanos, sendo considerada

uma doença emergente (CDC, 1996; WEINSTEIN et al.. 1997; GREENLEES et al.

1998; DURBOROW, 1999; LEHANE et al., 2000; FULLER et al., 2001; LAU et al.,

2003)

Apesar da freqüente presença de bactérias, seja Gram-negativas como

as Aeromonas ou Gram-positivas como os estreptococos, existem dúvidas em

relação ao papel primário das mesmas no processo mórbido, pois em geral, trata-

se de habitantes normais do ambiente. Foi assim que a partir de pesquisas

realizadas na Inglaterra (CUNNINGHAM et al., 1996) e na Austrália (BERGER et

al., 1998) que a responsabilidade das bactérias em surtos de mortalidade em

anfíbios acabou adquirindo um papel secundário.

Vírus pertencentes à família Iridoviridae, gênero Ranavirus e um fungo

chytridiomyceto (Batrachochytrium dendrobatidis) têm sido identificados como os

verdadeiros agentes etiológicos nas enfermidades das rãs, mas até o final do

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século passado não eram realizadas pesquisas nos ranários com o intuito de

identificar esses agentes.

Os iridovírus que infectam animais aquáticos possuem distribuição

mundial sendo associados a doenças severas em anfíbios (CUNNINGHAM et al.,

1996; AHNE et al.,1997; ZUPANOVIC et al., 1998; DASZAK et al., 1999;

CHINCHAR & MAO, 2000; DASZAK et al., , 2000; HYATT et al., 2000; SPEARE,

2001; ZHANG et al., 2001; CHINCHAR, 2002; CULLEN & OWENS, 2002; HE et

al., 2002; KIM et al., 2002; MARSH et al., 2002; WENG et al., 2002; DASZAK et

al., 2003; GANTRESS et al., 2003; JANCOVICH et al., 2003; GREER et al. 2005.

ROBERT et al., 2005; ZHANG et al., 2006). Os girinos apresentam a maior

suscetibilidade e podem sofrer mortalidade de até 100% da população. Estes

vírus podem infectar outras espécies diferentes dentro da mesma classe

taxonômica, bem como animais de classes diferentes (MAO et al., 1999).

As primeiras suspeitas do envolvimento de vírus pertencentes à

Família Iridoviridae, gênero Ranavirus foram levantadas a partir de observações

em ranários do Uruguai (MAZZONI, 2000a, b; MAZZONI & CARNEVIA, 2000) e

confirmadas em trabalhos que empregaram a técnica de detecção por reação em

cadeia da polimerase (MAZZONI, 2003; GALLI et al., 2006). HIPÓLITO et al.

(2000) empregaram a microscopia eletrônica de transmissão em amostras de rãs

adultas criadas comercialmente no Brasil e detectaram partículas virais

semelhantes aos grupos Herpesvírus, Togavírus e Paramixovírus, sem que

fossem vinculadas à doença algumas. Nesse estudo não foram detectados

agentes da Família Iridoviridae.

No entanto, existem dúvidas em relação ao poder patogênico destes

agentes. Na rã touro, os mesmos foram detectados tanto em anfíbios sadios

como doentes (WOLF et al., 1968). Em outras espécies, também os vírus foram

encontrados em anfíbios sadios (ZUPANOVIC et al., 1998; ZHANG et al., 2001;

GANTRESS et al., 2003, GREER et al. 2006).

Fato semelhante está ocorrendo com uma doença emergente

produzida pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis que tem sido implicada com

muita freqüência como responsável por surtos de mortalidade e diminuição de

populações ao redor do mundo (BERGER et al., 1998,1999; DASZAK et al., 1999;

LONGCORE et al., 1999; SPEARE & BERGER, 2000; MAZZONI, 2000a, 2000b;

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BERGER et al., 2002; GUAYASAMIN et al., 2002; MAZZONI et al., 2003;

SPEARE, 2003; HANSELMANN et al., 2004; BLAUSTEIN & DOBSON, 2006). O

fungo tem sido identificado em paises da América do Sul como Equador

(BERGER et al., 1999; RON & MERINO, 2000), Venezuela (GUAYASAMIN et al.,

2002; BONACCORSO et al., 2003; HANSELMAN et al., 2004), Uruguai

(MAZZONI, 2000a, b; MAZZONI et al., 2003), Argentina (HERRERA et al., 2005)

e Brasil (CARNAVAL et al., 2006). Apenas no Uruguai, o diagnóstico foi realizado

em rãs de criação da mesma espécie cultivada no Brasil. Esse fato reveste-se de

grande interesse pois existe a possibilidade do aparecimento da doença nas rãs

brasileiras.

Outros fungos pertencentes ao clado Mesomycetozoa têm sido

também implicados como causadores de doenças de anfíbios na natureza

(GREEN et al., 2002).

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3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral

Objetivou-se com o presente trabalho determinar o papel dos vírus da

Família Iridoviridae, gênero Ranavirus, nas doenças de importância econômica

em ranários comerciais do Estado de Goiás, bem como caracterizar as formas

clínicas das mesmas.

3.2. Objetivos específicos 3.2.1 Identificar e caracterizar o ranavírus detectado em girinos.

3.2.2 Estabelecer diagnóstico diferencial entre o ranavirus e outros agentes

relacionados às doenças de importância econômica em ranários comerciais.

3.2.3 Estabelecer a epizootiologia, sintomatologia e alterações anatomo

histopatológicas das doenças infecciosas que acometem girinos e rãs de criação

(Rana catesbeiana Shaw 1802).

3.2.4 Caracterizar as formas clínicas das doenças infecciosas que acometem

girinos e rãs de criação (Rana catesbeiana Shaw 1802).

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19

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20

CAPITULO 2 CARACTERIZAÇÃO DE RANAVIRUS ISOLADOS DE GIRINOS DE RÃ TOURO (Rana catesbeiana Shaw, 1802) EM RANÁRIOS COMERCIAIS.

RESUMO Vírus pertencentes à família Iridoviridae, gênero Ranavirus, têm sido diagnosticados como agentes etiológicos de doenças de anfíbios, peixes e répteis em diversas partes do mundo. Trabalhos recentes têm reportado a presença de agentes do gênero Ranavirus em girinos de rã touro do Brasil e Uruguai, por meio do emprego da técnica de PCR, revelando alta homologia nas regiões seqüenciadas do genoma com a espécie protótipo da família Iridoviridae, Frog Virus 3-FV3, além de outros vírus geneticamente muito próximos. Objetivou-se com o presente estudo caracterizar o vírus presente nas rãs de criação visando ampliar o conhecimento do agente, bem como estabelecer seu grau de homologia com outros vírus do gênero. Aplicaram-se técnicas de cultivo e isolamento em células A6, microscopia eletrônica de transmissão, e reação em cadeia da polimerase (PCR) visando amplificar e seqüenciar o gene completo que codifica a proteína principal da cápside (MCP) dos iridovírus, bem como outras regiões do genoma. Foram obtidos resultados positivos para iniciadores direcionados a MCP e para a RNA polimerase DNA dependente (Pol II), sendo o produto de PCR correspondente a MCP de aproximadamente 1480 pares de bases, e o correspondente à Pol II de aproximadamente 377 pares de bases. O seqüenciamento revelou homologia com FV3, superior a 99% para MCP e 100% para Pol II, indicando que, provavelmente, o vírus presente no Brasil pode ter sido introduzido por as rãs touro de criação importadas da América do Norte. A seqüência obtida para a MCP foi registrada no GenBank com o número DQ897669. Palavras chave: FV3, Iridoviridae, MCP, ranicultura, vírus.

21

ABSTRACT Viruses from the family Iridoviridae, genus Ranavirus, have been identified as etiological agents in amphibian, fish and reptile diseases all around the world. Ranavirus with high sequence homology with Frog Virus 3, type species of the Iridoviridae family, have been recently detected in farmed tadpoles from Brazil and Uruguay by polymerase chain reaction-PCR technique. The goal of this study was to amplify and sequence the complete major capsid protein gene (MCP) along with other genomic regions to increase the knowledge about homology degree of Brazilian virus related to other ranaviruses. Viral cell culture and isolation, as well as transmission electron microscopy studies were also performed. Positive results were obtained with primers directed to amplify MCP and RNA polymerase DNA dependent-Pol II genes. Amplified PCR products for complete MCP were about 1480 bp and 377 bp for Pol II. Multiple alignments for obtained sequences revealed homologies over 99% for MCP products and 100% for Pol II products with FV3, suggesting the imported American bullfrogs probably introduced the virus. Obtained sequence was deposited in GenBank with number DQ897669. Key words: Frog farming, FV3, Iridoviridae, MCP, virus.

22

1 INTRODUÇÃO Os ranavírus pertencem ao gênero Ranavirus da Família Iridoviridae,

que inclui ainda os gêneros Lymphocystisvirus, Chloriridovirus, Iridovirus, e o

recentemente identificado Megalocytivirus. São vírus grandes, que medem de 120

a 300 nm de diâmetro e apresentam simetria icosahédrica. O genoma é composto

por uma única molécula linear de DNA de fita dupla com tamanho variável de 102

a 212 kbp, dependendo da espécie. O virión é constituído por três estruturas

concêntricas: uma cápside protéica externa, uma membrana polipeptido-lipídica

intermediária e um núcleo central contendo um complexo DNA-proteínas. Como

característica única entre os vírus que infectam animais, apresentam DNA

ciclicamente permutado e com terminações redundantes, resultante da formação

de concatâmeros no genoma durante a replicação. Todos os representantes da

família expressam a proteína principal da cápside (MCP) de aproximadamente 50

kDa, cujas propriedades moleculares são utilizadas para caracterização e

identificação de espécies (WEBBY et al., 1998; CHINCHAR et al, 2005;

WILLIAMS et al., 2005). A espécie protótipo da Família, frog virus-3 (FV3) foi

recentemente analisado e seu genoma completo seqüenciado (TAN et al., 2004).

Os ranavírus são agentes infecciosos capazes de acometer três

classes diferentes de animais pecilotérmicos vertebrados: peixes teleósteos,

anfíbios e répteis (MAO et al., 1997; CAREY et al., 1999). Nos últimos 20 anos, as

doenças produzidas por vírus desse gênero foram identificadas de forma

crescente em peixes, anfíbios e répteis ocasionando enfermidades de importância

econômica em criações comercias, e levando à redução das populações de

anfíbios na natureza. Nos últimos anos, os ranavirus têm sido considerados como

patógenos emergentes (HEDRICK et al., 1992; HENGSTBERGER et al., 1993;

CUNNINGHAM et al., 1996; MAO et al., 1996; AHNE et al., 1998; ZUPANOVIC et

al., 1998; DASZAK et al., 1999; CHINCHAR & MAO, 2000; HYATT et al., 2000;

ZHANG et al., 2001; CULLEN & OWENS, 2002; HE et al., 2002; KIM et al., 2002;

MARSH et al., 2002; WENG et al., 2002; GANTRESS et al., 2003; JANCOVICH et

al., 2003; QIN et al., 2003; SPEARE, 2003; DO et al, 2005; WILLIAMS, 2005;

ZHANG et al., 2006) e recentemente as doenças produzidas por esse vírus foram

23

colocadas pela Organização Internacional de Epizootias na lista das enfermidades

dos animais selvagens (OIE, 2002).

Em relação à presença destes agentes em rãs de criação, MAZZONI

(2000a, 2000b), levantou a suspeita da doença ocorrer em girinos com base nas

características epizootiológicas e clínicas dos animais afetados. Posteriormente,

MAZZONI (2003) e GALLI et al. (2006) detectaram ranavírus em girinos do Brasil

e Uruguai através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Os autores

observaram uma elevada homologia nas duas regiões seqüenciadas do genoma

com o FV3 e com outros vírus geneticamente muito próximos. Em decorrência

desse achado surgiu a indagação: o agente detectado pertencia a uma nova

espécie ou foi introduzido com as rãs importadas da América do Norte? Esta

última hipótese encontra respaldo nas afirmações de WOLF et al. (1968) segundo

as quais o FV3 é endêmico na rã-touro americana (Rana catesbeiana Shaw,

1802) importadas da América do Norte em 1970 (MATHIAS & SCOTT 2004).

A caracterização de uma espécie de ranavírus depende de um

conjunto de resultados obtidos por meio de seqüenciamento, restriction fragment

length polymorphism (RFLP), perfil de proteínas, tipo de hospedeiro e

características estruturais (HYATT et al., 2000; WILLIAMS et al., 2005). Utilizando

os citados recursos, foram determinadas seis espécies dentro do gênero

Ranavirus FV3, enzootic hematopoyetic necrotic virus (EHNV), Bohle iridovirus

(BIV), Amblystoma tigrinum virus (ATV), European catfish virus (ECV) e Santee-

Cooper ranavirus (SCRV) (MAO et al., 1997; HYATT et al., 2000)..

Quando a determinação das espécies é realizada através de técnicas

que incluem a construção de dendrogramas filogenéticos, os métodos

recomendados são aqueles realizados a partir do seqüenciamento total do

genoma viral (HERNIOU et al., 2001) ou pelo menos os que incluem um grupo

concatenado de genes (ROKAS et al., 2003).

MAO et al. (1997) demonstraram que os iridovírus isolados da mesma

região geográfica são idênticos ou similares, mas o mesmo não acontece com

aqueles provenientes de áreas diferentes. Os autores obtiveram esses dados

após seqüenciamento da MCP, mas recomendando incluir outras regiões do

genoma para melhor identificação das relações entre os vírus desta família.

24

Em estudo comparativo de 30 iridovírus isolados de peixes e anfíbios

originários da Austrália, América do Norte, Ásia, Europa e Venezuela, HYATT et

al. (2000) concluíram que existem diferenças filogenéticas entre vírus de

diferentes regiões geográficas. Os autores estabeleceram que devido ao alto grau

de conservação do gene que codifica a MCP no decorrer do tempo e dentro da

mesma espécie, que pequenas diferenças na seqüência são significativas.

Porém, os autores também recomendaram a associação de diferentes técnicas

para a identificação apropriada dos ranavírus.

MARSH et al. (2002) diferenciaram iridovírus da Austrália, Europa e

América do Norte pelo seqüênciamento da MCP e relataram que o gene

encontrava-se conservado nos vírus da família, mas possuía variações que

permitiam diferenciar entre espécies próximas. Recomendaram ainda o

seqüênciamento total da proteína para a obtenção de resultados confiáveis na

diferenciação das espécies isoladas e na determinação do grau de conservação

ao longo do tempo, em diferentes regiões geográficas e nas diversas espécies de

hospedeiro.

GOLDBERG et al. (2003) exploraram as variações intraespecíficas

entre cepas de iridovírus (large mouth bass virus-LMBV) isoladas de peixes na

América do Norte. Os autores observaram diferenças nos resultados do amplified

fragment length polymorphism-AFLP, mas não nas seqüências do DNA

analisadas e ressaltaram que no caso dos iridovírus, técnicas de “genome

screening” como AFLP podem ser de maior utilidade que os seqüênciamento

parciais para resolver diferenciação entre cepas muito próximas geneticamente.

JANCOVICH et al. (2004) realizaram estudo filogeográfico dos

ranavírus que acometem salamandras nos Estados Unidos, comparando 514

nucleotídeos da extremidade 5´ do gene da proteína MCP e identificaram-nos

como pertencentes a um único grupo monofilogenético, diferente do FV3 e de

outros ranavírus.

DO et al. (2005) analisaram através do seqüênciamento total da MCP,

13 diferentes iridovírus isolados de peixes na Coréia do Sul tendo demonstrando

que pertenciam a uma mesma espécie e que as semelhanças encontradas

deveram-se à introdução de um único agente.

25

Considerando o exposto e as homologias com FV3 detectadas no vírus

presente no Brasil (GALLI et al., 2006), objetivou-se com o presente trabalho

realizar o isolamento e cultivo do vírus, e seqüênciamento completo do gene que

codifica a MCP, além de complementá-lo com análises de outras regiões do

genoma que permitem ampliar o conhecimento sobre o grau de homologia com

outros vírus do gênero. Estes dados possibilitarão verificar o grau de conservação

do vírus no decorrer de 35 anos desde a sua introdução no país.

26

2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Amostras de Vírus O vírus foi obtido de girinos doentes de até 30 dias de idade com sinais

de edema e ascite, provenientes de três ranários localizados no Estado de Goiás,

dois localizados no Município de Gameleira, 150 km ao sudoeste de Brasília e um

no Município de Hidrolândia, 250 km ao sudoeste de Brasília. Os girinos foram

preservados em etanol a 95% no local de colheita ou congelados a -20°C no

laboratório. Como controle positivo foi utilizada uma cepa cedida pelo Dr. V. G.

Chinchar da Universidade do Mississippi, Estados Unidos.

2.2 Isolamento de vírus O isolamento do vírus foi realizado no Departamento de Microbiologia e

Imunologia da Universidade de Rochester, Nova Iorque, no laboratório de Biologia

Molecular do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária e no

setor de Virología Animal do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da

Universidade Federal de Goiás. Para isolamento e cultivo do vírus, girinos

congelados foram macerados com grau e pistilo esterilizados adicionando-se

água destilada esterilizada para facilitar a suspensão do material. Com auxílio de

seringa esterilizada de 5 mL, o material foi colhido e distribuído em tubos tipo

eppendorf esterilizados de 2 mL. Procedeu-se o congelamento e

descongelamento do macerado por três vezes à -80°C, seguido de centrifugação

a 10.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante contendo o vírus foi filtrado em

filtro “Millipore” de 0,45µ, aliquotado e armazenado a -80°C até o momento do

uso.

A suspensão de girinos macerada e filtrada foi inoculada em células A6

obtidas a partir de fibroblastos de rã (RAFFERTY, 1969) cedidas pelo Prof. Dr.

Jacques Robert da Universidade de Rochester. Inicialmente procedeu-se a cultura

de células em garrafas de 25 cm2 com o meio de cultura “Dulbecco´s Modified

Eagle Medium” (dMEM-GIBCO) com adição de antibióticos e antifúngicos e

incubadas à temperatura ambiente em câmara escura. Assim que as células

alcançaram 80% de confluência, desprezou-se o meio de cultura e inoculou-se

1.0 mL da suspensão viral, imediatamente após o descongelamento, ou 1.0 mL

27

de PBS na garrafa controle. Na fase experimental realizada nos Estados Unidos,

utilizou-se uma cepa de comprovado efeito citopático (ECP) como controle

positivo. Após um período de 45 minutos para permitir a aderência dos vírus às

células, foram adicionados 5 mL do meio de cultura. Os cultivos foram observados

duas vezes por dia, durante sete dias, para verificação de ECP. Com o intuito de

aumentar a concentração viral e permitir a máxima expressão da virulência foram

realizadas três passagens cegas do vírus. Cada passagem consistiu em congelar

a – 80°C e descongelar, por três vezes, as garrafas nas quais foram observados

ECP. A seguir, procedeu a centrifugação a 5000 RPM durante 10 minutos, sendo

o sobrenadante obtido novamente aliquotado em tubos tipo eppendorf de 2 mL e

reutilizado imediatamente ou congelado a – 80°C até sua reutilização.

2.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Para identificação do vírus, diretamente de suspensão de girinos e dos

cultivos celulares inoculados, utilizou-se à técnica de PCR.

A extração do DNA viral foi realizada a partir de porções de 50 mg de

girinos inteiros após maceração utilizando o método do fenol/clorofórmio

(SAMBROOK et al., 1989). Foram utilizados iniciadores direcionados a regiões

conservadas no genoma dos iridovírus (Quadro 1), principalmente para o gene

que codifica a proteína imediata precoce (IE) ICP-18, a proteína MCP, a RNA

polimerase DNA dependente (Pol II) e a subunidade α do fator de iniciação

eucariótico (eIF2-α).

Os iniciadores direcionados para amplificação do gene que codifica a

proteína IE (GALLI et al., 2006) foram utilizados como “screening” primário das

amostras, por ter sido comprovadamente eficaz nas condições de nosso

laboratório. Sendo que na amostra positiva, realizava-se o PCR com os demais

iniciadores.

Com o intuito de obter o gene completo responsável pela codificação da

MCP, foram utilizados iniciadores localizados nas extremidades 5´e 3´ do gene

correspondente na seqüência de FV3 (TAN et al., 2004) sendo que o iniciador

“forward” é original do presente trabalho e o “reverse” já utilizado por HYATT et al.

(2000) segundo é apresentado no Quadro 1. Para a determinação da temperatura

28

ótima de anelamento de este par de iniciadores realizou-se uma PCR de

gradiente térmico, sendo avaliadas as temperaturas desde 50°C até 65°C.

QUADRO 1 – Iniciadores utilizados para amplificação parcial do genoma de ranavirus, “bp” indica o comprimento do amplicon. Nome Forward Reverse Produto

(bp)

MCP

ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA

AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)

1483

Pol II

TCACCGCCGCAGACATCTTTAG

GTAACCGTTCTTTTCGCAGTGG

377

IE

ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)

AAATGTCCTAATCTATACACC (2)

479

eIF2α

CAACAACAGGGACATCAGAAAGAG

TCTCGTTCCAGACATCAGGGAG

289

(1) HYATT et al. (2000); (2) GALLI et al. (2006). Os restantes iniciadores são originais do presente trabalho.

O mix utilizado para a amplificação com os diferentes iniciadores

constituía-se de 2,5 µL 10x tampão de PCR [Tris-HCl 20 mM (pH 8.4), KCl 50

mM], dNTP 200 µM, 2,5 mM MgCl2, 2.5 µM de cada iniciador, 1 U de Taq DNA

Polymerase, 5 µL de DNA template e água MilliQ até completar 50 µL para cada

reação. Os ciclos de amplificação para cada par de iniciadores utilizados são

apresentados no Quadro 2.

Os produtos de amplificação foram submetidos a corrida em gel de

agarose a 1%, corados com brometo de etídeo 0.5 µg/mL e visualizados em

transiluminador de luz UV.

29

QUADRO 2 – Protocolos de PCR utilizados para cada par de iniciadores.

1er. ciclo

Desnaturação Anelamento Extensão Final

N° de ciclos

°C t (min)

°C t (min) °C t (seg)

°C t (min)

°C t (min)

MCP 40 90 1 94 1 60 60 72 1,5 72 5

Pol II

40 90 1 94 1 60 60 72 1 72 5

IE

30 90 1 94 1 45 40 72 1 72 5

eIF2α

40 90 1 94 1 60 60 72 1 72 5

2.4 Seqüenciamento Os produtos amplificados e confirmados na leitura como correspondendo

ao peso molecular esperado, foram sequenciados no Laboratório de Genoma de

Plantas, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás. Todos

os produtos foram seqüenciados pelo menos seis vezes em ambas as cadeias. A

reação de seqüenciamento dos fragmentos ocorreu com cada oligonucleotídeo

iniciador separado. O protocolo utilizado foi o seguinte: 1µL do produto de PCR,

2,5 pmol de oligonucleotídeo iniciador, 2 µL de tampão SaveMoney (2 mL de Tris-

HCl 1M pH 9.0, 1 mL de MgCl2 50 mM, água MiliQ-q.s.p. 10 mL), 1 µL do kit

DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing (Pharmacia Biotech, EUA). A

reação foi realizada no termociclador GeneAmp PCR Systems 9700 (Applied

Biosystems), cujos ciclos foram de 95ºC durante 20 segundos e 60ºC por 1

minuto e 15 segundos.

A etapa de precipitação do DNA ocorreu da segunte manerira: 40 µL

de isopropanol 65% foram adicionados aos 10 µL de reação. A mistura foi

homogeneizada no vortex (TECNAL –TE162) por 30 segundos. Deixou-se que a

precipitação ocorresse à temperatura ambiente por 20 minutos. As amostras

foram, entanto, centrifugadas a 2000 rcf (força de centrifugação relativa) por 45

minutos e o sobrenadante descartado. Ao precipitado, foram adicionados 250 µL

de etanol 60% para lavagem do material, e centrifugado a 2000 rcf por 10

minutos. O processo de lavagem com álcool foi repetido utilizando 100 µL do

mesmo e, o sobrenadante descartado. A placa contendo as amostras foi

30

centrifugada de maneira invertida a 500 rpm por um minuto para garantir que todo

o álcool fosse retirado da mesma. Uma secagem complementar foi realizada

deixando-se a placa por aproximadamente 10 minutos na capela de fluxo laminar.

Este material foi ressuspenso em 10 µL de formamida, vortexado por 1 minuto,

deixado á temperatura ambiente por 5 minutos e levado em triplicatas ao

analisador automático de seqüências 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems

ABI Prism).

Alinhamentos múltiplos foram realizados utilizando Clustal W (THOMPSON

et al., 1994) e ferramentas disponibilizadas no GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi). O programa PHYLIP

(http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html) foi aplicado para a construção das

matrizes de distãncias e elaboração de árvores filogenéticas baseados no método

do “neighbour joining” e os valores de “bootstrap” foram obtidos pela realização de

100 repetições mediante as ferramentas disponibilizadas pelo Instituto A.N.

Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology-Universidade Estadual de

Moscou. (http://www.genebee.msu.su/services/phtree_reduced.html).

31

3 RESULTADOS 3.1 Isolamento em cultura de células Após 48 horas da inoculação, as células começaram a evidenciar

sinais de lesão viral. A uniformidade do tapete começou a desaparecer, as células

perderam seu contorno regular e desprenderam-se do tapete, além de apresentar

lise celular. Muitas células mostraram-se alongadas ou com forma de estrela

(Figura 1).

FIGURA 1 – Cultura de células A6 mostrando o efeito citopático após 48 horas

de inoculação da suspensão de girinos suspeitos de infecção por ranavirus.

3.2 PCR

Foram obtidos resultados positivos com os iniciadores utilizados na

amplificação do DNA genômico das amostras de girinos de até 30 dias de idade,

salvo com aqueles iniciadores direcionados ao gen eIF2-α.

A temperatura de anelamento ótima para amplificação completa da

MCP foi de aproximadamente 60°C (Figura 2). O produto de amplificação

apresenta aproximadamente 1480 pares de bases.

32

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151500 bp

FIGURA 2 – Gel de PCR de gradiente térmico realizado para determinação da temperatura ótima de anelamento dos iniciadores direcionados à amplificação do gene completo que codifica a proteína MCP. Canaletas 1 e 15 marcador de peso molecular. Canaletas 2 a 14 com os produtos de PCR desde 50 até 62°C. Canaleta número 12 representa a amostra de 60°C.

A Figura 3 mostra os resultados da amplificação do DNA genômico

obtidos a partir de girinos de até 30 dias de idade utilizando os iniciadores para

Pol II. Observa-se a obtenção de um produto de aproximadamente 377 pares de

bases.

FIGURA 3 – Gel de PCR mostrando o produto de amplificação obtido com iniciadores direcionados à amplificação do gen que codifica a proteína Pol II. Canaletas 1 e 6 marcador de peso molecular 100 bp ladder. Canaletas 2 e 3 amostras positivas com peso molecular de aproximadamente 377 bp. Canaleta 4 controle positivo, e 5 controle negativo.

1 2 3 4 5 6

400 bp

33

3.3 Seqüenciamento

A análise das seqüências obtidas pela amplificação completa do gene

que codifica a MCP permitiu identificar uma série de 1465 pares de bases, sendo

registrada no GenBank com o número de acesso DQ897669. Verificou-se

homologia de 99,7% com as seqüências AY548484 e U36913 correspondentes à

FV3, com 1461 bp idênticas, entre o total de 1465. Os altos percentuais revelam a

grande homologia com outros vírus pertencentes ao gênero Ranavirus, sendo

apresentados no alinhamento múltiplo da Figura 4. A partir destes dados foi

realizado o alinhamento múltiplo das seqüências nucleotídicas completas,

elaborada uma matriz de distâncias genéticas entre os vírus (Tabela 1) e o

dendrograma correspondente (Figura 5).

Os percentuais na homologia do gene que codifica a proteína MCP

continuaram elevados quando comparadas às seqüências de aminoácidos

deduzidas. Foi encontrada uma identidade de 99% com FV3 -U36913 e

AY548484; 98% com Bohle iridovirus - AY187046 e Rana tigrina ranavirus

- AY033630, AY033630 e AF389451; 96% com Epizootic haematopoietic necrosis

virus - AY187045; e 95% com Ambystoma tigrinum virus - AY150217.

A comparação com traduções da MCP não constantes no GenBank

correspondentes a Rana grylio virus, mas publicadas por ZHANG et al. (2006)

revelou 99% de homologia com RGV 9506 e RGV 9507 e 97% com RGV 9508. A

Figura 6 apresenta o alinhamento múltiplo da tradução dos aminoácidos

correspondente à seqüência completa da MCP para o vírus isolado no Brasil e a

comparação com outros vírus do gênero.

Quando analisadas as seqüências do gene que codifica a proteína Pol

II, foram identificadas 356 pares de bases, com 100% de homologia com a

seqüência do FV3 AY548484, 98% com Tiger frog virus - AF389451, 96% com

Regina ranavirus - AF368230 e Ambystoma tigrinum stebbensi virus - AY150217.

O vírus detectado no Brasil localizou-se geneticamente junto com FV3

nos dendrogramas elaborados para ambas seqüências. Esta proximidade está

corroborada com os altos valores de “bootstrap” obtidos (Figuras 5 e 7).

34

DQ897669 1 ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGTTTAATCGACTTGGCCACTTATGAC 60 AY548484 97345 ......................................C..................... 97404 U36913 92 ......................................C..................... 151 AF389451 95938 ......................................C..................... 95997 AY033630 1 ......................................C..................... 60 AY187046 1 ...................T..................C..T.................. 60 AY187045 17 ..............C.......................C..................... 76 AY150217 17651 ..............C.......................C..................... 17592 DQ897669 61 AATCTTGAGAGAGCAATGTACGGGGGTTCGGACGCCACCACGTACTTTGTCAAGGAGCAC 120 AY548484 97405 ............................................................ 97464 U36913F 152 ............................................................ 211 AF389451 95998 ............................................................ 96057 AY033630 61 ............................................................ 120 AY187046 61 .............................A.............................. 120 AY187045 77 .....C....................C................................. 136 AY150217 17591 .....C...........A........C...........T....................T 17532 DQ897669 121 TACCCCGTGGGGTGGTTCACCAAGCTGCCGTCTCTGGCTGCCAAGATGTCGGGTAACCCG 180 AY548484 97465 ............................................................ 97524 U36913 212 ............................................................ 271 AF389451 96058 ..................................................T......... 96117 AY033630 121 ..................................................T......... 180 AY187046 121 ............................................................ 180 AY187045 137 ......................................C..............C...... 196 AY150217 17531 ........A........T....................C..............C...... 17472 DQ897669 181 GCTTTCGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGTTCCCAGGTCGGGGGATTACATCCTCAACGCC 240 AY548484 97525 ............................................................ 97584 U36913 272 ............................................................ 331 AF389451 96118 ............................................................ 96177 AY033630 181 ............................................................ 240 AY187046 181 ............................................................ 240 AY187045 197 ............................................................ 256 AY150217 17471 ...................................................A........ 17412 DQ897669 241 TGGTTGGTGCTCAAGACCCCCGAGGTCGAGCTCCTGGCTGCAAACCAGCTGAGAGAAAAT 300 AY548484 97585 ...................................................G....C... 97644 U36913 332 ...................................................G....C... 391 AF389451 96178 ........A...........T.................C............G........ 96237 AY033630 241 ........A...........T.................C............G........ 300 AY187046 241 ...................................................G....C... 300 AY187045 257 ...........................A..........C............G....C..C 316 AY150217 17411 ...........................A..........C............G.......C 17352 DQ897669 301 GGCACCATCAGGTGGACAAAGAACCCCATGCACAACATTGTGGAGAGCGTCACCCTCTCA 360 AY548484 97645 ............................................................ 97704 U36913 392 ............................................................ 451 AF389451 96238 ............................................................ 96297 AY033630 301 ............................................................ 360 AY187046 301 .....A...................................................... 360 AY187045 317 .....A........................................A.....A....... 376 AY150217 17351 ....................A.........................A.....A....... 17292 DQ897669 361 TTCAACGACATCAGCGCCCAGTCCTTTAACACGGCATACCTGGACGCCTGGAGCGAGTAC 420 AY548484 97705 ............................................................ 97764 U36913 452 ............................................................ 511 AF389451 96298 .....................................................T...... 96357 AY033630 361 .....................................................T...... 420 AY187046 361 ............................................................ 420 AY187045 377 ............................................................ 436 AY150217 17291 ............................................................ 17232 DQ897669 421 ACCATGCCAGAGGCCAAGCGCACAGGCTACTATAACATGATAGGCAACACCAGCGATCTC 480 AY548484 97765 ............................................................ 97824 U36913 512 ............................................................ 571 AF389451 96358 ......................T..................................... 96417 AY033630 421 ......................T..................................... 480 AY187046 421 ...........A..........T..................................... 480 AY187045 437 ......................T..................................... 496 AY150217 17231 ...........A..........T..................................... 17172

35

DQ897669 481 ATCAACCCCGCCCCGGCCACAGGCCAGGACGGAGCCAGGGTCCTCCCGGCCAAGAACCTG 540 AY548484 97825 ............................................................ 97884 U36913 572 ............................................................ 631 AF389451 96418 ............................................................ 96477 AY033630 481 ............................................................ 540 AY187046 481 ............................................................ 540 AY187045 497 ...........................A................................ 556 AY150217 17171 ...........................A...A.........T.................. 17112 DQ897669 541 GTTCTTCCCCTCCCATTCTTCTTCTCCAGAGACAGCGGCCTGGCCCTGCCAGTCGTCTCC 600 AY548484 97885 ............................................................ 97944 U36913 632 ............................................................ 691 AF389451 96478 ......................................A..................... 96537 AY033630 541 ......................................A..................... 600 AY187046 541 ............................................................ 600 AY187045 557 ............................................................ 616 AY150217 17111 ............................................ .........T...... 17052 DQ897669 601 CTCCCCTACAACGAGATCAGGATAACAGTCAAGCTGAGGGCCATCCAGGACCTCCTGATC 660 AY548484 97945 ...............................................C............ 98004 U36913 692 ...............................................C............ 751 AF389451 96538 ............................................................ 96597 AY033630 601 ............................................................ 660 AY187046 601 ...........T..A............................................T 660 AY187045 617 ............................................................ 676 AY150217 17051 ............................................................ 16992 DQ897669 661 CTCCAGCACAACACCACAGGGGCAATCAGCCCCATCGTGGCCTCCGACCTTGCGGGAGGT 720 AY548484 98005 ............................................................ 98064 U36913 752 ............................................................ 811 AF389451 96598 ..................................................C......... 96657 AY033630 661 ..................................................C......... 720 AY187046 661 ..................................................C......... 720 AY187045 677 ..........................................G.......C.A....... 736 AY150217 16991 ......................T...................G.......C.A....... 16932 DQ897669 721 CTCCCCGACACCGTCGAGGCCAACGTCTACATGACCGTCGCCCTCATCACCGGGGACGAG 780 AY548484 98065 ............................................................ 98124 U36913 812 ............................................................ 871 AF389451 96658 ............................................................ 96717 AY033630 721 ............................................................ 780 AY187046 721 ............................................................ 780 AY187045 737 ............................................................ 796 AY150217 16931 ...........T..............T...........T..................... 16872 DQ897669 781 AGACAGGCCATGAGCAGCACAGTCAGGGACATGGTTGTGGAGCAGGTGCAGGCCGCCCCA 840 AY548484 98125 ............................................................ 98184 U36913 872 ............................................................ 931 AF389451 96718 ..G.................................................T....... 96777 AY033630 781 ..G.................................................T....... 840 AY187046 781 ............................................................ 840 AY187045 797 ..G................................C........................ 856 AY150217 16871 ..G................................C........................ 16812 DQ897669 841 GTCCACATGGTCAACCCCAGGAACGCGACCACCTTCCACACCGACATGCGGTTCTCACAC 900 AY548484 98185 ............................................................ 98244 U36913 932 ............................................................ 991 AF389451 96778 ...........................G................................ 96837 AY033630 841 ...........................G................................ 900 AY187046 841 ...........................G....................A........... 900 AY187045 857 ...........................G................................ 916 AY150217 16811 ...........................G................................ 16752 AF157681 1 . 1 AF157669 1 . 1 AF157647 1 . 1 AF157645 1 . 1 AF157677 1 . 1 AF157675 1 . 1 AF157663 1 . 1 AF157661 1 . 1 AF157657 1 . 1 AF157655 1 . 1 AF157653 1 . 1 AF157649 1 . 1 AF157673 1 . 1

36

AF157671 1 . 1 AF157651 1 . 1 AF157679 1 . 1 AF157659 1 . 1 AF157667 1 . 1 AF157665 1 . 1 DQ897669 901 GCAGTCAAGGCCTTGATGTTTATGGTGCAGAACGTCACACACCCTTCCGTCGGCTCCAAT 960 AY548484 98245 ............................................................ 98304 U36913 992 ............................................................ 1051 AF389451 96838 ............................................................ 96897 AY033630 901 ............................................................ 960 AY187046 901 ............................................................ 960 AY187045 917 ............C............................................... 976 AY150217 16751 ............C.....................................T......... 16692 AF157681 2 ............................................................ 61 AF157669 2 ............................................................ 61 AF157647 2 ............................................................ 61 AF157645 2 ............................................................ 61 AF157677 2 ............................................................ 61 AF157675 2 ............................................................ 61 AF157663 2 ............................................................ 61 AF157661 2 ............................................................ 61 AF157657 2 ............................................................ 61 AF157655 2 ............................................................ 61 AF157653 2 ............................................................ 61 AF157649 2 ............................................................ 61 AF157673 2 ............................................................ 61 AF157671 2 ............................................................ 61 AF157651 2 ............................................................ 61 AF157679 2 ............................................................ 61 AF157659 2 ............................................................ 61 AF157667 2 ............................................................ 61 AF157665 2 ............................................................ 61 DQ897669 961 TACACCTGCGTCACTCCCGTCGTGGGAGTCGGCAACACGGTCCTGGAGCCAGCCCTTGCG 1020 AY548484 98305 ............................................................ 98364 U36913 1052 ............................................................ 1111 AF389451 96898 ............................C...........................G... 96957 AY033630 961 ............................C...........................G... 1020 AY187046 961 ........................................................G... 1020 AY187045 977 ..........C....................A........................G... 1036 AY150217 16691 ..........C............T................................G... 16632 AF157681 62 ............................................................ 121 AF157669 62 ............................................................ 121 AF157647 62 ............................................................ 121 AF157645 62 ............................................................ 121 AF157677 62 ............................................................ 121 AF157675 62 ............................................................ 121 AF157663 62 ............................................................ 121 AF157661 62 ............................................................ 121 AF157657 62 ............................................................ 121 AF157655 62 ............................................................ 121 AF157653 62 ............................................................ 121 AF157649 62 ............................................................ 121 AF157673 62 ............................................................ 121 AF157671 62 ........................................................G... 121 AF157651 62 ........................................................G... 121 AF157679 62 ..........C.............................................G... 121 AF157659 62 ..........C.............................................G... 121 AF157667 62 ..........C....................A........................G... 121 AF157665 62 ..........C.............................................G... 121 DQ897669 1021 GTAGATCCCGTCAAGAGCGCCAGCCTGGTGTACGAAAACACCACAAGGCTCCCCGACATG 1080 AY548484 98365 ............................................................ 98424 U36913 1112 ............................................................ 1171 AF389451 96958 ..G......................................................... 97017 AY033630 1021 ..G......................................................... 1080 AY187046 1021 ..G......................................................... 1080 AY187045 1037 ..G......................................................C.. 1096 AY150217 16631 ..G......A...............................................C.. 16572 AF157681 122 ......................CG.................................... 181 AF157669 122 ......................CG.................................... 181 AF157647 122 ......................CG.........A.......................... 181 AF157645 122 ......................CG.........A.......................... 181

37

AF157677 122 ......................CG.................................... 181 AF157675 122 ......................CG.................................... 181 AF157663 122 ......................CG.................................... 181 AF157661 122 ......................CG.................................... 181 AF157657 122 ......................CG.................................... 181 AF157655 122 ......................CG.................................... 181 AF157653 122 ......................CG.................................... 181 AF157649 122 ......................CG.................................... 181 AF157673 122 ......................CG.................................... 181 AF157671 122 .................T.......................................... 181 AF157651 122 ..G...................CG.................................... 181 AF157679 122 ..G..............T.......................................C.. 181 AF157659 122 ..G..............T.......................................C.. 181 AF157667 122 ..G...................CG.................................C.. 181 AF157665 122 A.G..............T.......................................C.. 181 DQ906049 431 .................................... 396 DQ906048 431 .................................... 396 DQ897669 1081 GGAGTCGAGTACTACTCGCTGGTGGAGCCCTGGTACTATGCCACCTCCATCCCAGTCAGC 1140 AY548484 98425 ............................................................ 98484 U36913 1172 ............................................................ 1231 AF389451 97018 ............................................................ 97077 AY033630 1081 ............................................................ 1140 AY187046 1081 ............................................................ 1140 AY187045 1097 ........................C................................... 1156 AY150217 16571 ........................C................................... 16512 AF157681 182 ............................................................ 241 AF157669 182 ............................................................ 241 AF157647 182 ............................................................ 241 AF157645 182 ............................................................ 241 AF157677 182 ............................................................ 241 AF157675 182 ............................................................ 241 AF157663 182 ............................................................ 241 AF157661 182 ............................................................ 241 AF157657 182 ............................................................ 241 AF157655 182 ............................................................ 241 AF157653 182 ............................................................ 241 AF157649 182 ............................................................ 241 AF157673 182 ............................................................ 241 AF157671 182 ........................C................................... 241 AF157651 182 ............................................................ 241 AF157679 182 ........................C................................... 241 AF157659 182 ........................C................................... 241 AF157667 182 ........................C................................... 241 AF157665 182 ........................C................................... 241 DQ906049 395 ............................................................ 336 DQ906048 395 ............................................................ 336 DQ897669 1141 ACCGGGCACCACCTCTACTCTTATGCCCTCAGCCTGCAGGACCCCCACCCATCCGGATCC 1200 AY548484 98485 ............................................................ 98544 U36913 1232 ............................................................ 1291 AF389451 97078 .................................A.........................A 97137 AY033630 1141 .................................A.........................A 1200 AY187046 1141 ............................................................ 1200 AY187045 1157 ............................................................ 1216 AY150217 16511 .............................T.............................. 16452 AF157681 242 ............................................................ 301 AF157669 242 ............................................................ 301 AF157647 242 ............................................................ 301 AF157645 242 ............................................................ 301 AF157677 242 ............................................................ 301 AF157675 242 ............................................................ 301 AF157663 242 ............................................................ 301 AF157661 242 ............................................................ 301 AF157657 242 ......................................................A..... 301 AF157655 242 ......................................................A..... 301 AF157653 242 ......................................................A..... 301 AF157649 242 ............................................................ 301 AF157673 242 ............................................................ 301 AF157671 242 ............................................................ 301 AF157651 242 ............................................................ 301 AF157679 242 ............................................................ 301 AF157659 242 ............................................................ 301 AF157667 242 ............................................................ 301 AF157665 242 ............................................................ 301

38

DQ906049 335 ............................................................ 276 DQ906048 335 ............................................................ 276 M19872 1 ........................... 27 AF367980 8141 ........................... 8115 DQ897669 1201 ACCAATTACGGTAGACTGACCAACGCCAGCCTTAACGTCACCCTGTCCGCTGAGGCCACC 1260 AY548484 98545 ............................................................ 98604 U36913 1292 ............................................................ 1351 AF389451 97138 ...........C................................................ 97197 AY033630 1201 ...........C................................................ 1260 AY187046 1201 ...........C................................................ 1260 AY187045 1217 ...........C................................................ 1276 AY150217 16451 ...........C........T....................................... 16392 AF157681 302 ............................................................ 361 AF157669 302 ............................................................ 361 AF157647 302 ............................................................ 361 AF157645 302 ............................................................ 361 AF157677 302 ............................................................ 361 AF157675 302 ............................................................ 361 AF157663 302 ............................................................ 361 AF157661 302 ............................................................ 361 AF157657 302 .................A.......................................... 361 AF157655 302 .................A.......................................... 361 AF157653 302 .................A.......................................... 361 AF157649 302 ............................................................ 361 AF157673 302 ...........................................................A 361 AF157671 302 ..............................A..........................G.. 361 AF157651 302 ...........C................................................ 361 AF157679 302 ...........C..................A.C........................G.. 361 AF157659 302 ...........C..................A.C........................G.. 361 AF157667 302 ...........C................................................ 361 AF157665 302 ...........C..................A.C........................G.. 361 DQ906049 275 ............................................................ 216 DQ906048 275 ............................................................ 216 M19872 28 ............................................................ 87 AF367980 8114 ...........C........T....................................... 8055 AY833650 1 ........C................................................ 57 DQ897669 1261 ACGGCCGCCGCAGGAGGTGGAGGTAACAACTCTGGGTACACCACCGCCCAAAAGTACGCC 1320 AY548484 98605 ............................................................ 98664 U36913 1352 ............................................................ 1411 AF389451 97198 .................C......G................................... 97257 AY033630 1261 .................C......G................................... 1320 AY187046 1261 .................C......G................................... 1320 AY187045 1277 ......T..........C.....CG................................... 1336 AY150217 16391 G....G...........C.....CG................................... 16332 AF157681 362 ............................................................ 421 AF157669 362 ............................................................ 421 AF157647 362 ............................................................ 421 AF157645 362 ............................................................ 421 AF157677 362 .................C......G................................... 421 AF157675 362 .................C......G................................... 421 AF157663 362 .................C......G................................... 421 AF157661 362 .................C......G................................... 421 AF157657 362 ............................................................ 421 AF157655 362 ............................................................ 421 AF157653 362 ............................................................ 421 AF157649 362 .................C......G................................... 421 AF157673 362 .......T.........C......G................................... 421 AF157671 362 .................C.......................................... 421 AF157651 362 .................C......G................................... 421 AF157679 362 ............................................................ 421 AF157659 362 ............................................................ 421 AF157667 362 .....T...........C.....CG................................... 421 AF157665 362 .................C.....C.................................... 421 DQ906049 215 ............................................................ 156 DQ906048 215 ............................................................ 156 M19872 88 ............................................................ 147 AF367980 8054 .................C.....CG................................... 7995 AY833650 58 .................C......G................................... 117 DQ897669 1321 CTCATCGTTCTGGCCATCAACCACAACATTATCCGCATCATGAACGGCTCGATGGGATTC 1380 AY548484 98665 ............................................................ 98724 U36913 1412 ............................................................ 1471 AF389451 97258 ............................................................ 97317

39

AY033630 1321 ............................................................ 1380 AY187046 1321 ...........................................................T 1380 AY187045 1337 ............................................................ 1396 AY150217 16331 ............................................................ 16272 AF157681 422 ............................................................ 481 AF157669 422 ............................................................ 481 AF157647 422 ............................................................ 481 AF157645 422 ............................................................ 481 AF157677 422 ............................................................ 481 AF157675 422 ............................................................ 481 AF157663 422 ............................................................ 481 AF157661 422 ............................................................ 481 AF157657 422 ............................................................ 481 AF157655 422 ............................................................ 481 AF157653 422 ............................................................ 481 AF157649 422 ............................................................ 481 AF157673 422 ............................................................ 481 AF157671 422 ............................................................ 481 AF157651 422 ...........................................................T 481 AF157679 422 ............................................................ 481 AF157659 422 ............................................................ 481 AF157667 422 ............................................................ 481 AF157665 422 ............................................................ 481 DQ906049 155 ............................................................ 96 DQ906048 155 ............................................................ 96 M19872 148 ............................................................ 207 AF367980 7994 ............................................................ 7935 AY833650 118 ...........................................................T 177 DQ897669 1381 CCAATCTTGTAAAGAGTA-TTTTTCAGCGCAAAGTCTTTTCCGTCATGGGTCCTCCATGA 1439 AY548484 98725 ..................-......................................... 98783 U36913 1472 ..................-......................................... 1530 AF389451 97318 ..................-......................................... 97376 AY033630 1381 ..................-......................................... 1439 AY187046 1381 ..................-........T................................ 1439 AY187045 1397 ..................-......................................... 1455 AY150217 16271 ..................-......................................... 16213 AF157681 482 ..................-......................................... 540 AF157669 482 ..................-......................................... 540 AF157647 482 ..................-......................................... 540 AF157645 482 ..................-......................................... 540 AF157677 482 ..................-......................................... 540 AF157675 482 ..................-......................................... 540 AF157663 482 ..................-......................................... 540 AF157661 482 ..................-......................................... 540 AF157657 482 ..................-......................................... 540 AF157655 482 ..................-......................................... 540 AF157653 482 ..................-......................................... 540 AF157649 482 ..................-......................................... 540 AF157673 482 ..................-......................................... 540 AF157671 482 ......C...........T......................................... 541 AF157651 482 ..................-........T................................ 540 AF157679 482 ..................T......................................... 541 AF157659 482 ..................T......................................... 541 AF157667 482 ..................-......................................... 540 AF157665 482 ......C...........T......................................... 541 DQ906049 95 ..................-......................................... 37 DQ906048 95 ..................-......................................... 37 M19872 208 ..................-......................................... 266 AF367980 7934 ..................-......................................... 7876 AY833650 178 ..................-........T................................ 236 DQ897669 1440 TGGAAATAAAACATGAAGTGTCCGTT 1465 AY548484 98784 .......................... 98809 U36913 1531 .......................... 1556 AF389451 97377 .......................... 97402 AY033630 1440 ....................... 1462 AY187046 1440 ................. 1456 AY187045 1456 ................. 1472 AY150217 16212 ..A....................... 16187 AF157681 541 .......................... 566 AF157669 541 .......................... 566 AF157647 541 .......................... 566 AF157645 541 .......................... 566 AF157677 541 .......................... 566

40

AF157675 541 .......................... 566 AF157663 541 .......................... 566 AF157661 541 .......................... 566 AF157657 541 .......................... 566 AF157655 541 .......................... 566 AF157653 541 .......................... 566 AF157649 541 .......................... 566 AF157673 541 .......................... 566 AF157671 542 .......................... 567 AF157651 541 .......................... 566 AF157679 542 .......................... 567 AF157659 542 .......................... 567 AF157667 541 .......................... 566 AF157665 542 .......................... 567 DQ906049 36 .......................... 11 DQ906048 36 .......................... 11 M19872 267 .......................... 292 AF367980 7875 ..A....................... 7850 AY833650 237 .......................... 262

FIGURA 4 – Alinhamento múltiplo para a seqüência de MCP obtida no Brasil (DQ897669) com aquelas disponíveis no GenBank. DQ897669 Brazilian vírus MCP; AY548484 Frog Virus 3 genoma completo; U36913 Frog virus 3 MCP gene; AF389451 Tiger frog virus, genoma completo; AY033630 Rana tigrina ranavírus MCP gene; AY187046 Bohle iridovirus MCP gene; AY187045 Epizootic haematopoietic necrosis virus MCP gene; AY150217 Ambystoma tigrinum stebbensi vírus, genoma completo; AF157681 Tadpole edema virus MCP gene; AF157669 Frog virus 3 MCP gene; AF157647 Rana temporaria United Kingdom iridovirus 2 MCP gene; AF157645 Rana temporaria United Kingdom iridovirus 1 capsid MCP; AF157675 Bufo marinus Venezuelan iridovirus 3 MCP gene; AF157663 Bufo marinus Venezuelan iridovirus 4 MCP gene; AF157661 Bufo marinus Venezuelan iridovirus 6 MCP gene; AF157657 Bufo bufo United Kingdom iridovirus 3 MCP gene; AF157655 Bufo bufo United Kingdom iridovirus 2 MCP gene; AF157653 Bufo bufo United Kingdom iridovirus 1 MCP gene; AF157649 Bufo marinus Venezuelan iridovirus 1 MCP gene; AF157673 Leptodactylus Venezuelan iridovirus 1 MCP gene; AF157671 Guppyfish iridovirus MCP gene; AF157651 Bohle iridovirus MCP gene; AF157679 Sheetfish iridovirus MCP gene; AF157659 Catfish iridovirus MCP gene; AF157667 EHNV MCP gene; AF157665 Doctor fish virus MCP gene; DQ906049 FV 3 MCP gene; DQ906048 FV3 MCP gene; M19872 FV3 ICR489 gene; AF367980 Regina ranavirus clone PstI 8.141 P8.141A, P8.141B, P8.141C e P8.141D genes, e MCP gene; AY833650 Bohle iridovirus ICP 46 (ICP 46) gene. Os pontos indicam igual base na posição indicada. Os números ao lado das seqüências indicam a posição das bases.

41

TABELA 1 – Análise comparativa das seqüências completas de nucleotídeos da proteína maior da cápside (MCP) de ranavirus. Os valores representam o grau de diferença na seqüência de 1463 bp.

Matriz de Distâncias Ranavirus* 1 2 3 4 5 6 7 1 DQ897669 0.000 2 FV3 0.005 0.000 3 TFV 0.020 0.019 0.000 4 RTV 0.023 0.022 0.003 0.000 5 BIV 0.031 0.028 0.031 0.027 0.000 6 EHNV 0.042 0.039 0.038 0.035 0.029 0.000 7 ATV 0.049 0.048 0.046 0.049 0.058 0.034 0.000 *. 1 – Ranavírus isolado no Brasil (DQ987669) 2 – FV3 genoma completo (AY548484) 3 - Tiger Frog Virus genoma completo (AF389451) 4 – Rana tigrina ranavírus MCP (AY033630) 5 – Bohle iridovirus MCP (AY187046) 6 - Epizootic haematopoietic necrosis virus MCP (AY187045) 7 - Ambystoma tigrinum stebbensi virus, genoma completo (AY150217)

42

FIGURA 5 – Dendrograma com valores de “bootstrap” construído com o

alinhamento das seqüências completas da proteína MCP de ranavírus isolado no Brasil e outros vírus do gênero Ranavirus.

BRASIL 1 MSSVTGSGITSGLIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP FV3 MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP RGV 9506 MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP RGV 9507 MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP RGV 9508 MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP BIV MSSVTGLGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP TFV MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP EHNV MSSVTGSGITSGFIDLATYDNLERAMYGGSDATTYFVKEHYPVGWFTKLPSLAAKMSGNP BRASIL 61 AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLRENGTIRWTKNPMHNIVESVTLS FV3 AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVESVTLS RGV 9506 AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNDTIRWTKNPMHNIVESVTLS RGV 9507 AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVESVTLS RGV 9508 AFGQPFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVKLLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVENVNLS BIV AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVESVTLS TFV AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVELLAANQLGENGTIRWTKNPMHNIVESVTLS EHNV AFGQQFSVGVPRSGDYILNAWLVLKTPEVKLLAANQLGDNGTIRWTKNPMHNIVENVNLS BRASIL 121 FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL FV3 FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL

43

RGV 9506 FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRIGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL RGV 9507 FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRIGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL RGV 9508 FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRIGYYNMIGNTSDLINPAPATGQNGARVLPAKNL BIV FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL TFV FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQDGARVLPAKNL EHNV FNDISAQSFNTAYLDAWSEYTMPEAKRTGYYNMIGNTSDLINPAPATGQNGARVLPAKNL BRASIL 181 VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG FV3 VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG RGV 9506 VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG RGV 9507 VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG RGV 9508 VLPLPFFFSRDSGLALPAVSLPYNEIRITVKLRAIQDLLILQHNTTGAISPIVAADLEGG BIV VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG TIV VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVASDLAGG EHNV VLPLPFFFSRDSGLALPVVSLPYNEIRITVKLRAIHDLLILQHNTTGAISPIVAADLEGG BRASIL 241 LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH FV3 LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH RGV 9506 LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNAATFHTDMRFSH RGV 9507 LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNAATFHTDMRFSH RGV 9508 LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH BIV LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH TFV LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQVAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH EHNV LPDTVEANVYMTVALITGDERQAMSSTVRDMVVEQVQAAPVHMVNPRNATTFHTDMRFSH BRASIL 301 AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM FV3 AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM RGV 9506 AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM RGV 9507 AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM RGV 9508 AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM BIV AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGVGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM TFV AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCVTPVVGAGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDM EHNV AVKALMFMVQNVTHPSVGSNYTCATPVVGVDNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDI BRASIL 361 GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT FV3 GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT RGV 9506 GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT RGV 9507 GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTSASLNVTLSAEAT RGV 9508 GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT BIV GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT TFV GVEYYSLVEPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSMQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT EHNV GVEYYSLVQPWYYATSIPVSTGHHLYSYALSLQDPHPSGSTNYGRLTNASLNVTLSAEAT BRASIL 421 TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL 463 FV3 TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL RGV 9506 TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL RGV 9507 TAAAGGGGNNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL RGV 9508 TAAAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL BIV TAAAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL TFV TAAAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL EHNV TASAGGGGDNSGYTTAQKYALIVLAINHNIIRIMNGSMGFPIL FIGURA 6– Alinhamento múltiplo realizado com Clustal W dos aminoácidos da

proteína MCP para a seqüência do vírus isolado no Brasil; FV3 - AY548484; três cepas de Rana grylio virus (RGV) seqüenciadas por ZHANG et al. (2006); Bohle iridovirus (BIV) AY187046; Tiger frog virus (TFV) AY033630; e Epizootic hematopoietic necrotic virus (EHNV) AY187045. Os aminoácidos que diferem de FV3 encontram-se sombreados.

44

TABELA 2 – Análise comparativa das seqüências de nucleotídeos da proteína RNA polimerase DNA dependente (Pol II) de ranavirus. Os valores representam o grau de diferença na seqüência de 356 bp.

Matriz de Distâncias

Ranavirus* 1 2 3 4 5 1 BR 0.000 2 FV3 0.000 0.000 3 TFV 0.036 0.036 0.000 4 ATV 0.065 0.065 0.030 0.000 5 RRV 0.262 0.266 0.254 0.261 0.000 *. 1 – Ranavírus isolado no Brasil (DQ987669) 2 – FV3 (AY548484) 3 - “Tiger Frog Virus” (AF389451) 4 - “Ambystoma tigrinum stebbensi virus” (AY150217) 5 - "Regina ranavirus” (AF368230)

FIGURA 7 – Dendrograma com valores de “bootstrap” construído com o alinhamento das seqüências de nucleotideos da proteína Pol II de ranavírus isolado no Brasil e outros vírus do gênero Ranavirus.

45

4 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam a presença de

um vírus pertencente ao gênero Ranavirus em rãs touro criadas no Brasil.

Ressalta-se que a elevada homologia verificada entre as regiões seqüenciadas do

vírus em estudo e aquelas do FV3, corroboram as observações de GALLI et al.

(2006) e indicam que o vírus detectado no Brasil foi, provavelmente, introduzido

no paÍs junto com as rãs importadas da América do Norte.

Segundo ESSANI & GRANOFF (1989), o “vírus do edema do girino-

TEV” pode ser considerado uma cepa do FV3. Esse agente, isolado de rãs touro

na América do Norte, foi considerado endêmico nesta espécie (WOLF et al.,

1968). Estas observações concordam com as do presente estudo, no sentido de

que o vírus isolado nas rãs touro do Brasil, pode ser o mesmo FV3 dos Estados

Unidos e não uma outra espécie autóctone da América do Sul.

HYATT et al. (2000) realizando comparações entre 30 iridovirus

isolados de peixes e anfíbios verificaram que as seqüências obtidas da proteína

MCP indicavam que os vírus de diferentes regiões agrupavam-se em clados

separados. Assim, os vírus da Venezuela formaram um clado individual, diferente

daqueles da América do Norte. Os dados obtidos no presente trabalho situam o

vírus estudado no mesmo clado do FV3, portanto, geneticamente mais próximo a

este do que dos vírus geograficamente vizinhos, reforçando a hipótese de que a

introdução do vírus no Brasil ocorreu através da importação de rãs da América do

Norte.

ZHANG et al. (2001) ao caracterizarem os ranavírus isolados de rãs de

criação (R. grylio) na China, por meio de estudos da extremidade 5´ da MCP

concluíram que os três vírus isolados eram semelhantes entre si e com o FV3,

diferenciando-se deste último apenas por um nucleotídeo. Seus resultados

levaram os autores a considerarem que a entrada do vírus no país deu-se a

través das rãs de criação importadas dos Estados Unidos. Provavelmente, o

mesmo aconteceu na América do Sul com a introdução da rã touro.

ZHANG et al. (2006) amplificaram e seqüênciaram o gene que codifica

a MCP, tendo verificado maiores diferenças na extremidade 3´, e homologia com

FV3 superior a 99% para RGV9506 e 9507, e de 97,4% para RGV9508. Estes

resultados são semelhantes aos obtidos no presente trabalho e indicam elevada

46

conservação genética do FV3 ao longo do tempo em diferentes áreas

geográficas.

Quando comparados os aminoácidos da proteína MCP dos três vírus da

China com as obtidas no presente trabalho, observaram-se homologias de 99%

com RGV 9506 e RGV 9507, e 97% com RGV 9508. Estes resultados eram

esperados, considerando a alta homologia verificada entre os vírus da China e os

do presente estudo com o FV3.

Mas, segundo GOLDBERG et al. (2003) outras técnicas de

caracterização molecular como “amplified fragment length polymorphism” (AFLP)

devem ser utilizadas para determinar com maior precisão a similaridade com o

FV3.

Estudos recentes de GALLI et al. (2006) revelam semelhanças entre os

vírus isolados de rãs touro de criação do Brasil e do Uruguai, bem como sua

similaridade com FV3. Os resultados do presente trabalho despertam interesse na

realização de estudos do genoma com o vírus detectado no Uruguai, uma vez que

a introdução de rãs nesse país foi realizada a partir de rãs de criação do Brasil,

em 1998.

No que pese a alta homologia verificada com FV3 nos fragmentos do

genoma do vírus isolado no Brasil, nota-se algumas diferenças no gene que

codifica a proteína eIF2α. Este gene, relacionado com fatores de virulência

(ESSAUBER et al., 2001), não foi detectado com os iniciadores aqui utilizados,

sendo que o controle positivo, constituído por uma cepa de FV3, sempre

amplificou. No entanto, o seqüênciamento total do genoma do mutante de FV3

aza-Cr não identificou um gene completo correspondente à proteína eIF2α (TAN

et al., 2004). Nesse sentido, torna-se interessante a avaliação de fatores de

virulência, uma vez que o vírus presente no Brasil, apesar de associado a surtos

de mortalidade generalizada em girinos, parece não representar grande perigo

para as rãs (dados não apresentados). Esses vírus podem se tornar patogênicos

devido a causas estressantes ou debilidade dos animais, como reiteradamente

enfatizado por CHINCHAR, (2000); ZHANG et al. (2001); GOLDBERG et al.

(2003); WILLIAMS et al. (2005).

Aparentemente o FV3 e espécies semelhantes não representam um

patógeno que possa ameaçar as populações de rã touro, ficando reservado a este

47

anfíbio o papel de um potencial disseminador do vírus devido a sua grande

utilização em ranicultura e, conseqüentemente, uma ameaça potencial para as

populações de anfíbios na natureza. Considerando os ranavirus, encontra-se bem

estabelecido que uma cepa pouco patogênica para uma espécie animal pode ser

muito agressiva para outra. Adicionalmente verifica-se o perigo de disseminação a

outras classes de organismos aquáticos (HENGSTBERGER et al., 1993;

ZUPANOVIC et al., 1998; MAO et al., 1999; CHINCHAR, 2002; WILLIAMS et al.,

2005).

Embora no presente trabalho tenha sido observada elevada homologia

entre o vírus isolado no Brasil e o FV3, são necessários estudos mais

aprofundados que incluam o perfil de proteínas, o padrão AFLP e,

preferencialmente, o seqüênciamento completo do seu genoma visando a

classificação exata da espécie detectada.

48

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52

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53

CAPITULO 3 RANAVÍRUS ASSOCIADOS A MORTANDADE DE GIRINOS (Rana catesbeiana Shaw, 1802) DE CRIAÇÃO INTENSIVA NO BRASIL.

RESUMO Doenças que cursam com alta mortalidade, caracterizadas clinicamente por edemas e ascite, têm sido observadas reiteradamente em girinos de criação. O conhecimento destas doenças é escasso, tornando necessário determinar os agentes etiológicos envolvidos, visando sugerir as correspondentes medidas profiláticas e terapêuticas. Agentes virais pertencentes à Família Iridoviridae, gênero Ranavirus, têm sido confirmados recentemente em girinos de criação por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase. Assim, objetivou-se com o presente trabalho a caracterização das doenças nos girinos, visando principalmente determinar a participação etiológica dos vírus. Foram realizados estudos em três ranários comerciais do Estado de Goiás, incluindo necropsias, análises histopatológicas, microbiológicas, parasitológicas, moleculares e de microscopia eletrônica de transmissão. Foram identificados dois quadros clínicos diferentes, sendo um deles em girinos jovens de até quatro semanas de vida, com mortalidade acima de 90% da população, cuja etiologia foi atribuída a um vírus do gênero Ranavirus, Família Iridoviridae. O outro em girinos na pré-metamorfose, cuja presença de cocos Gram-positivos constitui a causa principal das lesões encontradas e dos sinais clínicos evidenciados. Pela primeira vez foi identificada uma doença produzida por iridovirus no Brasil, tornando um achado de importância para a ranicultura, e também para a aqüicultura em geral, tendo em vista que estes agentes podem acometer outros grupos de organismos aquáticos. Palavras chave: Aqüicultura, estreptococos, ranicultura, septicemia, vírus.

54

ABSTRACT Diseases with high mortality, clinically characterized by oedema and ascites, have been frequently observed in farmed tadpoles. Since there is scarce information about these diseases, it is necessary to determine etiological agents involved, for recommending appropriate prophylactic and therapeutic measures. Viruses belonging to the Family Iridoviridae, genus Ranavirus, have been recently detected in farmed tadpoles by polymerase chain reaction. So, the objective of this study was the characterization of the diseases affecting farmed tadpoles, aiming to determine the etiological role of viruses. There were performed studies in three commercial farms located at Goiás State, including necropsy, histopathological analysis, microbiology, parasitology, and molecular studies. There were determined two different clinical patterns, one of them in young tadpoles till four weeks old, with mortality above 90% of population, etiologically related to a virus (Ranavirus, Family Iridoviridae). The second one in tadpoles reaching the pre-metamorphic period, where the presence of Gram-positive cocci was the main cause for observed lesions and clinical signs. For the first time a disease produced by iridoviruses was identified in Brazil, being an important fact for frog farming, as well as for aquaculture, considering that these infectious agents can infect other aquatic organisms from different groups. Key words: Aquaculture, frog farming, streptococci, septicemia, virus.

55

1 INTRODUÇÃO A ranicultura é uma atividade em expansão na América do Sul sendo a

espécie cultivada a rã-touro Americana (Rana catesbeiana Shaw, 1802)

introduzida no Brasil em 1935, mas as populações atualmente criadas foram

originadas de 300 casais importados da América do Norte em 1970 ao Brasil

(MATHIAS & SCOTT, 2004). Em decorrência do clima favorável, da excelente

adaptação da rã touro, e da tecnologia desenvolvida pelos produtores e

pesquisadores brasileiros, a ranicultura constitui uma atividade importante no

Brasil, particularmente no Estado de Goiás. Com o melhoramento nos

conhecimentos sobre manejo e alimentação, a ranicultura transformou-se numa

atividade super intensiva, com altas densidades de população e com estrita

dependência dos alimentos balanceados. Entretanto, os métodos intensivos de

cultivo favoreceram o aparecimento de doenças que constituem uma ameaça

para a viabilidade técnica e econômica dos criatórios de organismos aquáticos

(AUSTIN, 1984).

As doenças infecciosas septicêmicas em anfíbios têm características

etiológicas pouco claras, devido principalmente aos sinais inespecíficos e aos

achados de diversos agentes que atuam em forma conjunta, sendo na maioria

das vezes, oportunistas. As bactérias incriminadas nas doenças em larvas de

várias espécies de anfíbios são todas elas habitantes do ambiente e convivem de

forma permanente com os animais afetados. Este fato sugere que os girinos

adoecem quando causas estressantes ou debilitantes colaboram para produzir

uma queda na imunidade e conseqüentemente a invasão pelos microrganismos

presentes (GLORIOSO et al., 1974; AMBROSKY et al., 1983; GREEN et al.,

2002; MAUEL et al., 2002; PASTERIS et al., 2006).

Os iridovirus que infectam animais aquáticos possuem uma distribuição

mundial e estão associados a doenças severas (CUNNINGHAM et al., 1996;

AHNE et al.,1998; DASZAK et al., 1999; HYATT et al., 2000; SPEARE, 2001;

ZHANG et al., 2001; CHINCHAR, 2002; HE et al., 2002; MARSH et al., 2002;

WENG et al., 2002; GREER et al. 2005; ROBERT et al., 2005; ZHANG et al.,

2006). Os girinos têm maior suscetibilidade podendo sofrer mortalidade de até

100% da população. Por outro lado, os iridovírus podem infectar outras espécies

56

diferentes dentro da mesma classe taxonômica, bem como de classes diferentes

(MAO et al., 1999).

Em ranários da China, ZHANG et al. (2001) isolaram agentes do gênero

Ranavirus de girinos, rãs jovens e rãs adultas da espécie Rana grylio, as quais

apresentavam sinais de doença e mortalidade de até 90%.

WENG et al. (2002) relataram a “doença da distensão abdominal” em

girinos de criação da espécie Rana tigrina rugulosa, também na China.

Observaram quadros clínicos com mortalidade de 95% dos girinos, os quais

apresentavam abdome aumentado de tamanho, ataxia e redução da atividade. À

necropsia identificaram rins, fígado e baço aumentados de tamanho e com

petéquias na superfície.

GREEN et al. (2002), estudando 44 surtos de doenças em anfíbios dos

Estados Unidos, incriminaram os iridovírus em 25 casos, sendo 20 deles em

girinos, e cinco na espécie rã touro.

Doenças com alta mortalidade, caracterizadas clinicamente por

edemas e ascite, têm sido observadas reiteradamente em girinos. MAZZONI

(2000a, 2000b); MAZZONI & CARNEVIA (2000) suspeitaram da participação de

um agente viral pertencente à Família Iridoviridae, gênero Ranavirus, baseados

em quadro clínico semelhante ao descrito por WOLF et al. (1968) para o vírus do

edema do girino (TEV). A presença do agente foi confirmada recentemente em

girinos de criação pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) (GALLI

et al., 2006). Estes resultados, corroboram a hipótese da etiologia viral para a

doença estudada.

Objetivou-se com o presente trabalho caracterizar as doenças

infecciosas em girinos de criação e verificar a participação de ranavirus como

agente etiológico. Para tanto, foram realizadas pesquisas dos agentes etiológicos,

a epizootiología das doenças, a sintomatologia clínica, a anatomia patológica

macroscópica, a histopatologia, a bacteriologia convencional, e a virologia, sendo

esta por meio do emprego de técnicas moleculares, cultura de células e a

microscopia eletrônica de transmissão.

57

2 MATERIAL E MÉTODOS Foram estudados girinos criados em três ranários localizados no Estado

de Goiás, dois localizados no Município de Gameleira, 150 km ao sudoeste de

Brasília e um no Município de Hidrolândia, 250 km ao sudoeste de Brasília. , no

período de 2003 a 2005. Um dos ranários realizava exclusivamente a fase de

reprodução, eclosão e cria de girinos até 30 dias de vida quando eles ainda estão

no estágio 25 segundo GOSNER (1960). O outro ranário recebia girinos do

anterior, dedicando-se à metamorfose e engorda de rãs. O terceiro criatório

realizava todas as fases do ciclo na mesma estrutura. Todos os ranários

utilizavam fontes de água superficial.

Os girinos foram alimentados com rações fareladas contendo 45% de

proteína bruta, principalmente de origem animal.

A água dos tanques foi constantemente renovada e a densidade

mantida na faixa de um girino por litro de água. Toda vez que um tanque de

criação era esvaziado, drenava-se a água e realizava-se limpeza e desinfecção

final com cloro.

2.1 Amostragem de girinos Utilizaram-se 500 girinos de rã touro (R. catesbeiana) com sinais

aparentes da doença e 100 girinos aparentemente sadios. Para fins de estudo, os

girinos foram separados em dois grupos, o primeiro até os 30 dias de idade e o

segundo até a metamorfose. Todos os espécimes foram transportados em sacos

plásticos contendo água, e analisados imediatamente no laboratório do Centro de

Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade Federal de

Goiás.

Selecionaram-se preferencialmente girinos nos estágios iniciais da

síndrome, não tendo sido utilizados animais mortos para evitar erros induzidos

pelas alterações “pós-mortem” (NACE, 1974).

2.2 Análise Microbiológica Uma vez sacrificados por concussão craniana e corte da medula

cervical (AVMA, 1993), os exemplares foram submersos em solução de ácido

58

peracético a 0,2%. Após a abertura da pele e cavidade celômica, fígado, rins,

baço e líquido ascítico foram retirados utilizando-se utensílios esterilizados para

cada corte. As amostras foram processadas imediatamente pelos métodos de

rotina (BRASIL, 2003) sendo inoculadas em caldos BHI (Brain Heart Infussion

Broth), Casoy, (Tripticase Soy Broth), Glicose Azida e Selenito-Cistina. Todas as

amostras foram incubadas a 30°C por 24-72 h. O período de incubação de 72 h

deveu-se ao crescimento lento de alguns estreptococos, procurando-se, desta

forma, dar tempo suficiente para seu desenvolvimento, tentando-se evitar a

ocorrência de falsos negativos. Assim que foi observado crescimento bacteriano

foram semeadas alíquotas em placas de ágar sangue contendo 5% de sangue

desfibrinado de carneiro, e incubadas a 30°C por um período máximo de 72 hs,

determinando-se as características hemolíticas e morfologia das unidades

formadoras de colônias (UFC). As UFC isoladas e com diferente morfologia foram

selecionadas para coloração de Gram e observação em microscópio de contraste

de fase.

Os cocos Gram-positivos foram estudados mediante provas

bioquímicas complementares. As UFC identificadas primariamente pela

bioquímica como estreptococos, foram enviadas para determinação da espécie ao

Aquatic Animal Health Research Laboratory em Auburn - Alabama, nos Estados

Unidos. As culturas foram processadas pelo método de Identificação de ácidos

graxos da membrana, FAME (Fatty Acid Methyl Ester).

Os bastonetes Gram-negativos foram incubados em placas de ágar

McConkey e as UFC selecionadas inoculadas em tubos de TSI (Triple Sugar Iron

Agar) e submetidas à bateria de testes bioquímicos para identificação da espécie.

Amostras de água e da ração foram analisadas periodicamente por

técnicas microbiológicas convencionais para determinação de contaminação fecal

e presença de cocos Gram-positivos (BRASIL, 2003).

2.3 Histopatologia Girinos inteiros de até 30 dias de idade, ou fígado, rins e baço de

girinos com mais de 30 dias, foram extraídos e preservados em formol tamponado

a 10% (vol-vol) e processados segundo a rotina no laboratório de Histopatologia

do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás pelos métodos de

59

LUNA (1968). Os blocos parafinados foram secionados em cortes de 4-5 µ e

corados com hematoxilina-eosina (H&E) para as avaliações primárias das lesões.

Adicionalmente, os cortes selecionados foram também corados pelo método de

Gram para visualização de bactérias em geral, pelo método de Fite para detecção

de mycobactérias e coloração de PAS para visualização de fungos.

2.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Foram processados 60 girinos inteiros com até 30 dias de idade, além

do fígado, rim, baço e músculo de 50 girinos na pré-metamorfose. As amostras

foram preservadas em etanol a 95% ou congelados a -20°C até processamento

no Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Pesquisa em Alimentos da

Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás. A extração do DNA foi

realizada a partir de porções de 50 mg utilizando o método do fenol/clorofórmio

(SAMBROOK et al., 1989).

Foram utilizados iniciadores direcionados a regiões conservadas no

genoma dos iridovírus (Quadro 1). Para o gene que codifica a proteína imediata

precoce (IE) ICP-18 utilizaram-se iniciadores propostos por GALLI et al. (2006), e

para o gene que codifica a proteína MCP foram utilizados iniciadores localizados

nas extremidades 5´e 3´ da seqüência de FV3 (TAN et al., 2004) sendo que o

iniciador “forward” é original do presente trabalho e o “reverse” já utilizado por

HYATT et al. (2000) segundo é apresentado no Quadro 1.

QUADRO 1 – Iniciadores utilizados para amplificação parcial do genoma de ranavirus, “bp” indica o comprimento do amplicon. Nome Forward Reverse Produto

(bp)

MCP

ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA

AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)

1483

IE

ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)

AAATGTCCTAATCTATACACC (2)

479

(1) HYATT et al. (2000); (2) GALLI et al. (2006).

60

O mix utilizado para a amplificação com os diferentes iniciadores

constituía-se de 2,5 µL 10x tampão de PCR [Tris-HCl 20 mM (pH 8.4), KCl 50

mM], dNTP 200 µM, 2,5 mM MgCl2, 2.5 µM de cada iniciador, 1 U de Taq DNA

Polymerase, 5 µL de DNA template e água MilliQ até completar 50 µL para cada

reação. Os produtos de amplificação foram submetidos a corrida em gel de

agarose a 1%, corados com brometo de etídeo 0.5 µg/mL e visualizados em

transiluminador de luz UV.

Foram também utilizados iniciadores direcionados à identificação da

bactéria Streptococcus iniae aplicando a metodologia de PCR proposta por

BERRIDGE et al. (1998). Os cocos Gram-positivos, independentemente do

gênero foram purificados, sendo o DNA extraído pela metodologia do

fenol/clorofórmio (SAMBROOK et al., 1989).

2.5 Microscopia eletrônica de transmissão As amostras foram processadas no laboratório de Microscopia

Eletrônica do Instituto Biológico de São Paulo. O material analisado foi

selecionado a partir de lesões identificadas nas lâminas da histopatologia. Uma

vez delimitada a região suspeita, a mesma foi localizada no bloco parafinado e

realizado corte de aproximadamente 1 mm de diâmetro. O fragmento extraído foi

desparafinado, re- hidratado e finalmente processado pela técnica de inclusão em

resina, seguida de contrastação positiva de cortes ultrafinos de acordo com os

procedimentos usuais de inclusão em resina, baseando-se nos métodos de LUFT,

(1961) e GONZALES-SANTANDER, (1969). Os fragmentos de órgãos foram

fixados em glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1M e pH 7,0, pós-fixados

em tetróxido de ósmio a 2% em tampão fosfato 0,2M, pH 7,0, corados por acetato

de uranila a 0,5%, desidratados em série cetônica crescente (50 a 100%) e

incluídos em resina Spurr. Após ultra seccionamento dos blocos, os cortes

ultrafinos obtidos foram corados positivamente pelo tratamento seqüencial de

acetato de uranila (WATSON, 1958) e citrato de chumbo (REINOLDS, 1963),

antes de serem observados ao microscópio eletrônico de transmissão Philips EM

208.

61

2.6 Parasitologia Estudos da pele e das guelras foram realizados a fresco em

microscópio ótico mediante raspagens com lâmina de bisturi esterilizada.

(REICHENBACH-KLINKE & ELKAN, 1965).

62

3 RESULTADOS

3.1 Epizootiologia

Em girinos jovens de até 30 dias de idade, a doença foi detectada no

Estado de Goiás em todas as épocas do ano, sendo a maior freqüência

observada no período das chuvas, ou seja, de Novembro a Abril. A mortalidade

pode atingir percentuais elevados de 90 até 100% da população total.

Verificou-se que girinos aparentemente saudáveis morriam

subitamente. Em alguns casos a totalidade dos girinos de um tanque morria em

24 a 48 h. Girinos de tanques contíguos, às vezes originados na mesma desova,

não apresentavam sintomas de forma simultânea. Porém, no período de uma ou

duas semanas morriam quase todos os exemplares ficando no ranário só 1-2% da

população inicial.

Os girinos sobreviventes continuaram seu desenvolvimento sem sinais

aparentes da doença. Todavia no período prévio à metamorfose, observou-se

uma síndrome caracterizada por morbidade baixa, com alta letalidade, afetando 2

a 3% da população por dia.

3.2 Evidências clínicas O conjunto de sinais evidenciou a existência de duas formas clínicas,

uma que afeta girinos jovens e outra que acomete girinos próximos à

metamorfose.

3.2.1 Quadro clínico em girinos jovens

Caracterizado por surtos super agudos ou agudos com morbidade e

mortalidade acima de 90% da população do ranário.

A doença acometeu principalmente girinos entre a segunda e quarta

semana de vida e caracterizou-se por uma forma aguda de infecção, com

aparecimento de sinais clínicos de letargia, aumento do volume abdominal de

duas a três vezes o tamanho normal, ou diminuição do volume abdominal

sugerindo caquexia. A morte ocorreu dentro das 24 h após observação dos sinais

clínicos. Outros girinos desenvolveram forma super aguda da infecção com morte

sem evidência clínica (Figura 1).

63

FIGURA 1 – Girinos com sintomas de infecção. a) no centro girino normal, e a

esquerda e direita girinos ascíticos; b) no centro girino jovem normal, à esquerda girinos caquecticos, e à direita girinos asciticos; c) girino na pré-metamorfose com ascite e úlcera na pele (seta), d) girino na pré-metamorfose com edema na pata.

3.2.2 Quadro clínico em girinos na pré-metamorfose

Os poucos animais que sobreviveram, continuaram seu

desenvolvimento sem alterações até atingir o período da metamorfose, quando foi

observada uma segunda variante da doença caracterizada por edemas nas patas,

ascite e, às vezes, úlceras na pele (Figura 1), com baixa morbidade e alta

mortalidade dos animais afetados.

3.3 Necropsia 3.3.1 Achados macroscópicos em girinos jovens

Observou-se um grau variável de ascite com líquido sero-hemorrágico à

abertura da cavidade celômica e tonalidade pálida do fígado.

64

3.3.2 Achados macroscópicos em girinos na pré-metamorfose

Os girinos doentes mostraram diversos graus de lesões nos órgãos

internos, mas sem padrão definido. As de maior freqüência foram aumento do

volume e coloração anormal do fígado, geralmente cinzenta ou amarelada; baço

aumentado de volume e com coloração pardo-escura e rins hemorrágicos.

3.4 Histopatologia 3.4.1 Achados microscópicos em girinos jovens

À microscopia os órgãos mais afetados foram os rins, seguidos pelo

fígado. Nos rins, observou-se morte celular generalizada, afetando glomérulos e

túbulos, com abundante picnose e cariorexia, com perda total da estrutura normal

do parênquima (Figura 2A). Notou-se, também, uma marcada infiltração de

eosinófilos.

No fígado os hepatócitos mostraram-se vacuolizados, com esteatose e

áreas de morte celular com marcada picnose e cariorexia (Figura 2B). Notou-se

um infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear e, em algumas

regiões, infiltração de eosinófilos.

Em girinos de até três semanas de idade, os cortes histológicos

corados pelo método de Gram, não revelaram a presença de bactérias no

parênquima dos órgãos afetados, ou na mucosa dos órgãos digestivos.

Entretanto, em girinos com quatro semanas de idade foram identificados cocos

Gram-positivos nas mucosas do estômago e intestino e colonização inicial de

diversos tecidos. Os cortes revelaram também a presença de cocos gram-

positivos no conteúdo gastro intestinal.

3.4.2 Achados microscópicos em girinos na pré-metamorfose

3.4.2.1 Achados em animais aparentemente sadios

Girinos sem sinais aparentes de doença revelaram diversos graus de

lesão quando estudados histopatologicamente. Os principais órgãos afetados

foram os rins e fígado. Os rins apresentaram infiltração mononuclear abundante.

O fígado mostrou diversos graus de esteatose e quantidade variável de

65

granulomas em fases iniciais, com necrose central (Figura 2C). A coloração de

Gram aplicada aos cortes histológicos dos dois órgãos revelou a presença de

cocos Gram positivos.

A

DC

B

FIGURA 2–

(A) Lesão renal em girino jovem produzida por ranavírus, com perda total da arquitetura do órgão. Necrose celular com picnose e cariorexia (estrela), infiltrado mononuclear (seta larga) e aumento dos eosinófilos (seta fina preta). Coloração H&E, 200X. (B) – Lesão hepática em girino jovem produzida por ranavírus. Necrose, notando-se picnose e cariorexia, com perda da estrutura trabecular. Coloração H&E, 200X. (C) Rim de girino na pré-metamorfose mostrando acentuado infiltrado mononuclear e túbulos com abundante material hialino. Coloração H&E, 400X. (D) Fígado de girino na pré-metamorfose. Observa-se perda da estrutura trabecular do tecido hepático e a fase inicial da formação dos granulomas, com área de necrose central e infiltrado mononuclear abundante. Coloração de H&E, 200X.

66

3.4.2.2 Forma aguda

A maioria dos girinos apresentaram lesões por sepse, caracterizadas

por resposta inflamatória múltipla e granulomas bacterianos distribuídos no

parênquima dos diversos órgãos, além de áreas de necrose associadas à

presença de macrófagos e grande infiltração linfocitária.

O número de focos de melanomacrófagos distribuídos no fígado foi

muito reduzido e às vezes ausente. Macrófagos com cocos fagocitados foram

também um achado comum no parênquima do órgão, sendo observada forte

relação entre esta resposta e o aparecimento dos granulomas que mostraram

regiões necróticas circundadas por macrófagos e fibroblastos. Outro achado

comum foi a esteatose hepatocítária, com perda da estrutura normal do tecido,

associada, por vezes, a necrose. As lesões no fígado foram mais intensas na

região centrolobular que do que na região periportal.

Os rins sempre foram muito afetados, apresentando infiltração

mononuclear às vezes focal e outras difusa, necrose glomerular e tubular,

congestão, e granulomas. Foram observados glomérulos com espessamento da

membrana basal, aumento da celularidade, desaparecimento das alças, retração,

atrofia e esclerose. Foi possível observar o depósito de material hialino nos

glomérulos e abundantes cilindros hialinos nos túbulos (Figura 2D). Esse tipo de

lesão pode ser classificada como glomerulonefrite membranoproliferativa,

evoluindo à esclerose, o que determina síndrome nefrótica seguida por

insuficiência renal.

O estudo das secções pela coloração de Gram revelaram a presença

de cocos Gram-positivos em grau variável associados às lesões observadas na

coloração H&E. Observaram-se cocos Gram-positivos nos glomérulos e no

interstício, demonstrando que os microrganismos são carregados pelo sangue,

produzindo lesões e granulomas. As colorações de PAS e Fite foram negativas

para a presença de fungos e micobacterias respectivamente.

Não foram identificados nos tecidos estudados corpúsculos de inclusão

viral.

67

3.5 Microbiologia

3.5.1 Girinos jovens

As culturas a partir de amostras de tecidos ou líquido ascítico não

revelaram a presença de bactérias na fase inicial dos sintomas.

Nos girinos com mais de quatro semanas, as análises bacteriológicas

apresentaram resultados inespecíficos, com presença de cocos Gram-positivos

dos gêneros Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus e Leuconostoc,

associados a bastonetes Gram negativos dos gêneros Aeromonas,

Pseudomonas, Citrobacter e Proteus. Deve-se ressaltar que não foi detectada a

presença de uma única espécie bacteriana que pudesse ser incriminada como

agente causal, mas os achados sempre corresponderam a cultivos mistos.

3.5.2 Girinos na pré-metamorfose

Todos os girinos estudados foram positivos para cocos Gram-positivos

de diversos gêneros, sendo que 60% deles foram positivos para Aeromonas

hydrophyla e Citrobacter spp. e 35% para Pseudomonas spp. e Proteus spp.

Dentre os cocos Gram-positivos, foram identificados principalmente Streptococcus

uberis, S. agalactie, S. faecalis, S. dysgalactiae, e Enterococcus spp. Em todos os

casos, os órgãos afetados com maior freqüência foram o fígado, seguido pelo rim.

Unidades formadoras de colônias não tipificadas no laboratório foram

identificadas pelo FAME como Enterococcus gallinarium, E. columbae, E.

casseliflavus, Leuconostoc spp. e Aerococcus viridians.

3.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Quando foram estudados girinos com menos de 30 dias de idade

apresentando sinais típicos da doença, a PCR direcionada aos genes que

codificam as proteínas MCP e IE detectou em 90% dos casos os genes alvo.

Quando analisados girinos na pré-metamorfose evidenciando edemas e ascite,

10% foram positivos para o virus.

68

3.7 Parasitologia Os estudos parasitológicos revelaram a presença de parasitas da pele

cujas lesões recebem o nome genérico de “opacidade contagiosa da pele”, onde

o protozoário mais freqüentemente encontrado foi o Oodinum spp.

3.8 Microscopia eletrônica de transmissão Quando analisadas amostras de girinos até quatro semanas de idade,

foram observadas partículas hexagonais completas e incompletas com a forma

icosaédrica típica dos vírus da família (Figura 3). Nestes cortes observou-se a

ocorrência de alterações típicas de infecção viral, com as células lisadas, as

organelas todas alteradas e vazias, mitocôndrias sem cristas e núcleos disformes

contendo cromatina marginalizada ou grumos de cromatina com ausência de

membrana nuclear além de inclusões claras, alterações compatíveis com infecção

viral.

Nos estudos das amostras de girinos na pré-metamorfose, não foram

observadas inclusões nem partículas virais.

360 nm

FIGURA 3 - Microscopia eletrônica de transmissão. Microfotografia de corte

ultrafino de rim de girino jovem com sintomas de edema e ascite. Observam-se, no citoplasma, partículas hexagonais completas (seta) e incompletas com a forma icosaédrica típica dos vírus da família.

69

4 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Os dados do presente estudo permitiram considerar a existência de

duas síndromes diferenciadas, uma delas em girinos jovens, de até um mês de

vida e outra em girinos sobreviventes, na pré-metamorfose.

4.1 Infecção em girinos jovens A infecção em girinos jovens com menos de 30 dias de idade

caracteriza-se pela ocorrência de edema e ascite de forma aguda, com índices de

morbidade e mortalidade de mais de 90% da população do ranário sendo o

principal agente etiológico envolvido um vírus da Família Iridoviridae, que

segundo os produtos de PCR obtidos pertence ao gênero Ranavirus (GALLI et al.,

2006; MAZZONI et al., dados não publicados).

O quadro clínico caracterizado por ascite e edema, com mortalidade

elevada coincide com as observações de WOLF et al. (1968) em R. catesbeiana

infectada pelo vírus do edema do girino (TEV) e de ZHANG et al. (2001) e WENG

et al. (2002) para girinos de rã na China com a “doença da barriga inchada”

produzidas, também, por ranavírus. Os sinais observados de edema e ascite

também são indicativos da presença da lesão em nível histopatológico. No que se refere a histopatologia, a lesão principal foi observada nos

rins, com destruição quase completa do parênquima, embora o fígado também

tenha apresentado importante grau de lesões. Esta preferência do vírus pelo rim

foi também assinalada em estudos das lesões produzidas em Xenopus laevis

infectadas com a espécie protótipo da família, o Frog Virus 3, de acordo com

GANTRESS et al. (2003). Não foram observadas petéquias nos órgãos afetados,

o que difere dos achados de WOLF et al. (1968) e WENG et al. (2002).

A ausência de corpúsculos de inclusão viral nos cortes histológicos

estudados estão em concordância com os achados de WILLIAMS et al. (2005).

Esses autores verificaram que os ranavirus não produzem este tipo de

corpúsculos nos tecidos infectados, sendo que os locais de replicação viral

encontram-se dispersos no citoplasma da célula afetada, sem uma membrana

envolvente.

70

Torna-se relevante assinalar que não foi detectada a presença de

bactérias acompanhando as lesões nestes girinos. Ao contrário, estes girinos

apresentaram constantemente reações positivas para ranavírus nos testes de

PCR.

Pela primeira vez foi identificada uma doença produzida por iridovirus

no Brasil, sendo um achado de importância para a ranicultura, e também para a

aqüicultura em geral, tendo em vista que estes agentes têm a capacidade de

acometer outros grupos de organismos aquáticos.

4.2 Infecção em girinos na pré-metamorfose

Girinos que sobrevivem à infecção podem desenvolver um segundo

quadro clínico menos grave, que cursa com edemas nas patas, ascite e, às

vezes, úlceras na pele. Apresentam baixa morbidade e alta mortalidade.

Os estudos histopatológicos revelaram danos menos severo nos rins e

fígado, principais órgãos afetados. O tipo de lesão encontrado é caracterizado por

necrose e degeneração com abundantes granulomas e infiltração mononuclear

linfocitária. Na coloração de Gram observou-se abundante presença de cocos

Gram-positivos associados às lesões descritas. Nota-se a penetração de cocos

Gram-positivos na mucosa do estomago, os quais são transportados pela via

sanguínea iniciando assim uma colonização de outros órgãos internos.

Este tipo de lesão granulomatosa têm sido descrito não só associado às

lesões estreptocócicas bem como a outras bactérias que sobrevivem à fagocitose.

Os macrófagos que fagocitam agentes de elevada resistência, são responsáveis

pelo início de reações inflamatórias localizadas. O desenvolvimento desses

microrganismos, com conseqüente reação imune, dá origem às lesões

granulomatosas características das infecções crônicas (AGIUS & ROBERTS,

2003).

O quadro de lesão estreptocócica coincide com os achados descritos

em criações de trutas, (ELDAR et al., 1995; AKHLAGHY et al., 1996; ELDAR et

al., 1997; CHANG et al., 2002; DILER et al., 2002; BACHRACH et al., 2003),

linguados, (TORANZO et al., 1995; ROMALDE et al., 2000), bagres

71

(SHOEMAKER et al., 2000, 2001) e tilapias (CHANG & PLUMB, 1996; EVANS et

al., 2000a, 2000b; KLESIUS et al., 2000; SHELBY et al., 2002a, 2002b).

Não foi possível, nas condições deste estudo, determinar a causa

primária que antecede a invasão dos tecidos pelos estreptococos. A ação dos

ranavírus nas etapas iniciais dos girinos pode ter sido um fator desencadeante,

atuando isoladamente ou associado a fatores ambientais relacionados ao manejo

e, principalmente, a uma alimentação desbalanceada. A metamorfose constitui

um período de acentuado estresse, portanto, parece lógico pensar que girinos

debilitados podem morrer ao longo do processo. Do equilíbrio entre a resposta

imune, a presença dos microrganismos, e o grau de lesão pré-existente nos

diversos tecidos, surge a severidade da doença neste período específico. Estas

afirmações estão em concordância com aquelas já assinaladas, mencionando que

os girinos adoecem quando causas estressantes ou debilitantes colaboram para

produzir queda na imunidade e conseqüente invasão pelos microrganismos

presentes (GLORIOSO et al., 1974; AMBROSKY et al., 1983; GREEN et al.,

2002; MAUEL et al., 2002; PASTERIS et al., 2006).

A presença de diversas espécies sem a determinação de um patógeno

permanente ou constante, indica o caráter secundário da infecção. Porém, o

papel dos cocos não pode ser descartado na evolução da doença e, portanto,

devem ser levados em conta nos planos de controle sanitário dos ranários

comerciais.

Não foram associados agentes virais às mortes de girinos nesta fase.

As lesões identificadas na histopatologia, diferem daquelas descritas para os

ranavírus, e nos estudos de PCR só 10% dos girinos estudados foram positivos

para esses vírus. Estes resultados indicam que o papel dos vírus nos quadros de

mortalidade em girinos na pré-metamorfose não é fundamental. Os achados da

histopatologia sugerem que a patogênese do quadro seja de lesão estreptocócica

secundária. Após ação primária do vírus, os estreptococos penetram através das

paredes dos órgãos digestivos e colonizam diversos tecidos, iniciando assim, o

processo de infecção, formação de granulomas e septicemia. O papel do vírus na

depleção imunitária que habilita a penetração das bactérias, não foi determinado,

mas poderia ser uma das causas envolvidas.

72

Nas descrições realizadas para epizootiologia e patogenia dos

Ranaviurs, tem sido feita referência à maior susceptibilidade dos girinos mais

jovens às infecções por estes agentes (WOLF et. al., 1968; GRANOFF et al.,

1969; JANCOVICH et al., 1997; HYATT et al., 2000; CULLEN & OWENS, 2002) e

estudos avaliando as respostas imunes em anfíbios corroboram estes resultados

(GANTRESS et al., 2003).

A presença de parasitas do gênero Oodinum na pele dos girinos

estudados pode ser considerada uma conseqüência do estado geral dos anfíbios,

sendo secundária às infecções descritas acima.

73

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79

CAPITULO 4 QUADROS INFECCIOSOS EM RÃS DE CRIAÇÃO (Rana catesbeiana Shaw, 1802) NA FASE PÓS-METAMÓRFICA EM RANÁRIOS COMERCIAIS.

RESUMO

Doenças com alta mortalidade têm sido comuns em todos os ranários. Apesar dos numerosos trabalhos realizados, existe ainda desconhecimento dos agentes etiológicos envolvidos, e principalmente do papel dos vírus. Objetivou-se com o presente trabalho realizar a caracterização dos processos infecciosos em rãs de criação, dando ênfase à participação etiológica dos ranavírus. Um ranário comercial do Estado de Goiás foi utilizado para estudos clínicos e obtenção de amostras para análises complementares que envolveram necropsia, análises histopatológicas, microbiológicas, moleculares e de microscopia eletrônica de transmissão. Foram identificados quatro quadros diferentes, subclínico, super agudo, agudo e crônico. No quadro subclínico os animais não apresentaram sinais clínicos evidentes. Nos casos agudos predominaram sintomas inespecíficos como apatia, edemas e, às vezes, manifestações nervosas. As lesões atingiram diversos órgãos internos, com predominância no fígado, rins e baço. Necrose, degeneração e granulomas, associados à presença de cocos Gram-positivos constituíram os achados de maior significância na histopatologia. No quadro crônico as rãs apresentaram-se debilitadas e com sintomas nervosos evidentes. As lesões neste quadro se assemelharam àquelas do quadro agudo, sendo mais graves e incluindo, em todos os casos, alterações no sistema nervoso central. Os quadros observados foram identificados como septicemias estreptocócicas secundárias. Foi descartado o papel dos vírus na produção dos sinais clínicas e lesões macro e microscópicas encontradas nesta fase da criação. Palavras chave: Aqüicultura, estreptococos, ranicultura, septicemias.

80

ABSTRACT

Disease outbreaks with high mortality have been frequent events in all frog farms. In spite of several papers been published on this issue, there is still a lack of knowledge about etiological agents involved, and mainly the role of virus in adult frog diseases. The goal of this study was a primary characterization of farmed frog diseases, stressing on the determination of an eventual viral etiology. Clinical observations, as well as frog sampling for necropsy, histopathology, microbiology, molecular studies and transmission electron microscopy were performed at a frog farm from Goiás State. Four different syndromes were identified: sub clinical, super-acute, acute and chronic. The sub clinical syndrome showed no evident disease signs. Both acute syndromes showed mainly non-specific symptoms like apathy, edemas and nervous signs. Several internal organs were affected, mostly liver, kidney and spleen. Most common histopathological findings were necrosis, degeneration and granulomas, in association with Gram-positive. On the chronic syndrome frogs were weak, with evident nervous symptoms. Lesions resemble those found at the acute syndrome but with more severe pattern, including, in all cases, central nervous system disorders. The disease was characterized as secondary streptococcal septicemia. No viral role was detected in the disease. Key words: Aquacultre, frog farming, septicemia, streptococci.

81

1 INTRODUÇÃO A pesar de constituir uma das atividades mais novas dentro da

aqüicultura mundial a criação de rãs é uma atividade em expansão em toda a

América do Sul, especialmente no Brasil. A rã touro (Rana catesbeiana Shaw,

1802) foi introduzida ao Brasil em 1935, mas as populações atualmente criadas

foram originadas de 300 casais importados da América do Norte em 1970

(MATHIAS & SCOTT 2004). Em decorrência do clima favorável, e da excelente

adaptação da espécie, assim como da tecnologia desenvolvida pelos produtores e

pesquisadores brasileiros, a ranicultura constitui uma atividade importante no

Brasil, particularmente no Estado de Goiás. Dados referentes à produção obtida

entre os anos 2000 e 2004 indicam que Goiás ocupa o primeiro lugar no “ranking”

nacional com 150 toneladas anuais, das quais 90% destina-se à exportação

(SILVA, 2005).

Com os avanços no conhecimento sobre manejo e alimentação, a

ranicultura transformou-se numa atividade intensiva, com altas densidades de

população e estrita dependência dos alimentos balanceados artificiais fatores que

produzem estresse e conseqüentemente maior suscetibilidade a doenças de

diversas etiologias (ROTTMAN et al., 1992).

Sendo a ranicultura uma atividade nova, a experiência do estudo

científico com as doenças em rãs de criação ainda é incipiente. Diversos

trabalhos nas últimas décadas foram direcionados principalmente para a

identificação dos agentes envolvidos em surtos ou em episódios de mortalidade

maior que a esperada, seja na fase de girino ou adulta (AMBROSKY et al., 1983;

HIPÓLITO et al., 1987; GUIMARAES et al., 1988; HIPÓLITO et al., 1988a, b, c;

HIPÓLITO, 1995; FIORIO et al., 1997; HIPÓLITO, 1997; HIPÓLITO et al., 1997;

HIPÓLITO, 1999; HIPÓLITO, 2002; MAUEL et al., 2002; HIPÓLITO et al., 2003;

PASTERIS et al. 2006). Os diagnósticos concentraram-se exclusivamente na

identificação de agentes parasitários e bacterianos, não sendo realizado

acompanhamento dos surtos, no intuito de estabelecer o papel etiológico dos

agentes detectados e de outros aspectos das doenças que permitam a

elaboração de medidas de prevenção ou controle. Segundo HIPÓLITO (2002), a

82

maioria dos trabalhos consistiram em comunicados efêmeros, não tendo

continuidade no estudo do caso.

As septicemias têm sido reportadas como a causa mais importante de

mortalidade em anfíbios, sendo freqüente o achado de animais mortos sem sinais

prévios (CRAWSHAW, 1994). Porém, existe ainda um certo grau de incerteza em

relação às características desta infecção. Nos estudos e publicações realizados

no período compreendido entre o final do século XIX e o ano 1995, a maioria dos

trabalhos de diagnóstico identificou bactérias como responsáveis pelos surtos.

Estes estudos incluíram uma patologia denominada de “perna vermelha” ou “red

leg”, considerada como um complexo microbiológico ou síndrome sendo apontada

como a doença de maior importância em anfíbios (RUSSEL, 1898; EMERSON &

NORRIS, 1905; KULP & BORDEN, 1942; MILES, 1950; REICHENBACH-KLINKE

& ELKAN, 1965; GIBBS et al., 1966; GLORIOSO et al., 1974; VAN DER WAAIJ et

al., 1974; COSGROVE, 1980; HIRD et al., 1981; NYMAN, 1986; VIZOTTO, 1988).

As pesquisas assinalando a importância da síndrome da perna

vermelha ainda continuam na bibliografia mais recente (SOMSIRI, 1994; MAUEL

et al., 2002; HADFIELD et al., 2005; PASTERIS et al., 2006). Porém,

CUNNINGHAM et al. (1996), têm atribuído às bactérias papel secundário, e

responsabilizado os vírus da família Iridoviridae, gênero Ranavirus como os

verdadeiros agentes etiológicos.

As primeiras suspeitas do envolvimento de vírus pertencentes à

Família Iridoviridae, gênero Ranavirus foram levantadas a partir de observações

em ranários do Uruguai (MAZZONI, 2000a, b; MAZZONI & CARNEVIA, 2000) e

confirmadas pelo trabalho de detecção por reação em cadeia da polimerase

(GALLI et al., 2006). HIPÓLITO et al. (2003) realizaram estudo empregando a

técnica de microscopia eletrônica de transmissão e detectaram partículas virais

semelhantes aos grupos Herpesvírus, Togavírus e Paramixovírus em rãs criadas

comercialmente no Brasil, mas não foram vinculadas a nenhuma doença.

Também não foram detectados no citado estudo, agentes da Família Iridoviridae.

Os vírus das rãs, particularmente aqueles do gênero Ranavirus, têm

sido identificados tanto em doenças de anfíbios na natureza, bem como em

cativeiro (ZUPANOVIC et al., 1998; DASZAK et al., 1999, 2000, 2003; CHINCHAR

& MAO, 2000; DASZAK et al., 2000; HYATT et al., 2000; ZHANG et al., 2001;

83

CHINCHAR, 2002; CULLEN & OWENS, 2002; GREEN et al., 2002; HE et al.,

2002; KIM et al., 2002; MARSH et al., 2002; WENG et al., 2002; DASZAK et al.,

2003; GANTRESS et al., 2003; JANCOVICH et al., 2003; GREER et al. 2005.

ROBERT et al., 2005; ZHANG et al., 2006). Porém existem dúvidas em relação a

patogenicidade destes agentes em rãs adultas da espécie Rana catesbeiana, pois

foram detectados tanto em anfíbios sadios como em doentes (WOLF et al., 1968)

além de ter sido detectados em outras espécies de anfíbios (ZUPANOVIC et al.,

1998; ZHANG et al., 2001; GANTRESS et al., 2003, GREER et al. 2006).

Fato semelhante está ocorrendo com uma doença emergente

produzida pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis que tem sido implicada com

muita freqüência em surtos de mortalidade e redução de populações ao redor do

mundo (BERGER et al., 1998, 1999; DASZAK et al., 1999; LONGCORE et al.,

1999; SPEARE & BERGER, 2000; MAZZONI, 2000a, b; BERGER et al., 2002;

GUAYASAMIN et al., 2002; MAZZONI et al., 2003; SPEARE, 2003;

HANSELMANN et al., 2004; BLAUSTEIN & DOBSON, 2006). O fungo tem sido

identificado na América do Sul, Equador (BERGER et al., 1999; RON & MERINO,

2000), Venezuela, (GUAYASAMIN et al., 2002; BONACCORSO et al., 2003;

HANSELMAN et al., 2004), Uruguai (MAZZONI, 2000a, b; MAZZONI et al., 2003),

Argentina (HERRERA et al., 2005) e Brasil (CARNAVAL et al., 2006). Apenas no

Uruguai, o diagnóstico foi realizado em rãs de criação da mesma espécie

cultivada no Brasil. Esse fato reveste-se de grande interesse pois existe a

possibilidade do aparecimento da doença nas rãs brasileiras.

Outros fungos pertencentes ao clado Mesomycetozoa tem sido também

implicados em doenças de anfíbios na natureza (GREEN et al., 2002).

As dificuldades e a escassez de diagnósticos etiológicos, o achado de

várias espécies bacterianas em forma conjunta, geralmente todas elas

pertencentes à flora normal, o desconhecimento do papel dos vírus, os quadros

clínicos inespecíficos e como conseqüência, a falta de conhecimento acerca de

medidas profiláticas e terapêuticas apropriadas, levaram à realização do presente

trabalho.

Considerando a importância adquirida pelos vírus do gênero Ranavirus

como agentes etiológicos de doenças em anfíbios, peixes e répteis, propôs-se o

presente trabalho com o objetivo de realizar a caracterização dos processos

84

infecciosos em rãs de criação, dando ênfase à participação etiológica dos

ranavírus. Para tanto, foram realizadas pesquisas dos agentes etiológicos, a

epizootiologia das doenças, a sintomatologia clínica, a anatomia patológica

macroscópica, a histopatologia, a bacteriologia convencional, e a virologia, sendo

esta por meio do emprego de técnicas moleculares, cultura de células e a

microscopia eletrônica de transmissão.

85

2 MATERIAL E MÉTODOS O presente estudo se refere a surtos de uma doença ocorridos durante

quatro anos consecutivos, de 2002 até 2005. Apesar da doença ter sido reportada

em quase todos os ranários do Brasil, a descrição aqui apresentada baseou-se

fundamentalmente nas observações realizadas em um ranário localizado no

Município de Hidrolândia, Estado de Goiás. Aloja constantemente um milhão de

girinos e 400.000 rãs. As rãs, logo após a metamorfose, foram confinadas em

baias de concreto de seis m2 localizadas em galpões fechados. Quando

alcançaram aproximadamente 50 g foram transferidas para novas baias de 12 m2.

Todas as baias possuíam uma piscina de cinco cm de profundidade que ocupava

20% da superfície total. A água foi obtida a partir de uma represa de 20 hectares

alimentada por várias nascentes. A represa possuía uma variada população de

peixes, bem como répteis, outras espécies de anfíbios e aves.

As rãs foram alimentadas duas vezes por dia com ração artificial

extrusada contendo 45% de proteína bruta. Somente as rãs após a metamorfose

receberam como complemento 5% de larvas de mosca doméstica, produzida no

próprio ranário, por um período de 21 dias para estimular o consumo da ração.

Outras práticas de manejo incluíram a eliminação diária do alimento

úmido não consumido e dos animais mortos. A água das piscinas era

constantemente renovada, e drenada completamente uma vez ao dia, juntamente

com os sedimentos das fezes. A baia inteira era lavada pelo menos duas vezes

na semana. Periodicamente as rãs eram submetidas a um processo de triagem

para manter os tamanhos uniformes e reduzir o canibalismo. A densidade foi

mantida na faixa de 150 rãs por m2 durante a fase inicial, até diminuir para 40 por

m2 na etapa de terminação. Toda vez que uma baia era esvaziada, a água era

drenada e realizava-se uma limpeza e desinfecção final com cloro.

2.1 Amostragem das rãs Os animais doentes utilizados no presente estudo originaram de um

ranário localizado no Município de Hidrolândia. O grupo controle foi constituído

por rãs sem sintomas aparentes oriundas de ranários localizados nos Estados do

86

Pará, Goiás, Maranhão e Mato Grosso. Um total de 1155 rãs doentes e 75 sadias

foram utilizadas no presente estudo.

Os exemplares machos e fêmeas foram distribuídos em três categorias

de 410 anfíbios cada: 1) Rãs pós-metamorfose; 2) Rãs jovens, de 20 até 80 g; e

3) Rãs adultas. Foram selecionadas preferencialmente rãs nos estágios iniciais do

processo infeccioso, à exceção das rãs que apresentaram quadro crônico.

Animais mortos não foram utilizados para evitar erros induzidos pelas alterações

pós-mortem, principalmente em relação aos resultados das análises

microbiológicas, segundo recomendações do NACE (1974).

As rãs foram sacrificadas mediante o emprego de clorofórmio

(SPEARE, 1989) ou insensibilizadas por concussão craniana e sacrificadas por

meio de corte da medula cervical (AVMA, 1993).

2.2 Microbiologia Uma vez sacrificados os exemplares foram submersos em solução de

ácido peracético a 0,2%. Após abertura da pele e da cavidade celômica, fígado,

rins, baço, pulmões, coração e cérebro foram extraídos assepticamente. As

amostras foram processadas imediatamente no laboratório de bacteriologia do

Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade

Federal de Goiás, sendo inoculadas em caldos BHI (Brain Heart Infussion Broth),

Casoy (Tripticase Soy Broth), Glicose Azide e Selenito-Cistina, segundo os

métodos rotineiros (BRASIL, 2003). Todas as amostras foram incubadas a 30°C

por 24-72 h. O período de 72 horas deveu-se ao crescimento lento de alguns

estreptococos, e procurou-se de esta forma propiciar um tempo suficiente para o

desenvolvimento, evitando a ocorrência de falsos negativos. Assim que foi

observado crescimento bacteriano foram semeadas alíquotas em placas de ágar

sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, e incubadas a 30°C,

determinando-se as características hemolíticas e morfologia das colônias-UFC.

As UFC isoladas, com diferente morfologia, foram selecionadas para coloração de

Gram, observação em microscópio de contraste de fase, e identificação mediante

provas bioquímicas complementares. Os cocos Gram-positivos foram estudados

mediante provas bioquímicas complementares. As UFC identificadas

primariamente pela bioquímica como estreptococos, foram enviadas para

87

determinação da espécie ao Aquatic Animal Health Research Laboratory em

Auburn - Alabama, nos Estados Unidos. As culturas foram processadas pelo

método de Identificação de ácidos graxos da membrana, FAME (Fatty Acid Methyl

Ester).

Os bastonetes Gram-negativos foram incubados em placas de ágar

McConkey e as UFC selecionadas inoculadas em tubos de TSI (Triple Sugar Iron

Agar) para finalmente serem submetidas à bateria de testes bioquímicos para

identificação da espécie (BRASIL, 2003).

Amostras de água e da ração foram analisadas periodicamente por

técnicas microbiológicas convencionais para determinação de contaminação fecal

(BRASIL, 2003) e presença de cocos Gram-positivos como descrito

anteriormente.

2.3 Histopatologia Fragmentos de fígado, rins, baço, estomago, pulmões, coração e

cérebro foram extraídos e preservados em formol tamponado a 10% (vol-vol) e

processados segundo a rotina de estudos de histopatologia no laboratório de

Histopatologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás,

utilizando as técnicas propostas por LUNA (1968). Os blocos parafinados foram

secionados em cortes de 4-5 µ e corados com hematoxilina-eosina (H&E) para as

avaliações primárias das lesões. Adicionalmente, os cortes selecionados foram

também corados pelo método de Gram para visualização de bactérias em geral,

pelo método de Fite para detecção de micobacterias e coloração de PAS para

visualização de fungos.

2.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Fragmentos de fígado, rim, baço e músculo foram preservados em

etanol a 95% ou congelados a -20°C até processamento no laboratório de

Biologia Molecular do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária

da Universidade Federal de Goiás. A extração do DNA foi realizada a partir de

porções de 50 mg utilizando o método do fenol/clorofórmio (SAMBROOK et al.,

1989). Foram utilizados iniciadores direcionados a regiões conservadas no

genoma dos iridovírus (Quadro 1). Para o gene que codifica a proteína imediata

88

precoce (IE) ICP-18 utilizaram-se iniciadores propostos por GALLI et al. (2006), e

para o gene que codifica a proteína MCP foram utilizados iniciadores localizados

nas extremidades 5´e 3´ da seqüência de FV3 (TAN et al., 2004) sendo que o

iniciador “forward” é original do presente trabalho e o “reverse” já utilizado por

HYATT et al. (2000) segundo é apresentado no Quadro 1.

QUADRO 1 – Iniciadores utilizados para amplificação parcial do genoma de ranavirus, “bp” indica o comprimento do amplicon. Nome Forward Reverse Produto

(bp)

MCP

ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA

AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)

1483

IE

ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)

AAATGTCCTAATCTATACACC (2)

479

(2) HYATT et al. (2000); (2) GALLI et al. (2006).

O mix utilizado para a amplificação com os diferentes iniciadores

constituía-se de 2,5 µL 10x tampão de PCR [Tris-HCl 20 mM (pH 8.4), KCl 50

mM], dNTP 200 µM, 2,5 mM MgCl2, 2.5 µM de cada iniciador, 1 U de Taq DNA

Polymerase, 5 µL de DNA template e água MilliQ até completar 50 µL para cada

reação. Os produtos de amplificação foram submetidos a corrida em gel de

agarose a 1%, corados com brometo de etídeo 0.5 µg/mL e visualizados em

transiluminador de luz UV.

Foram também utilizados iniciadores direcionados à identificação da

bactéria Streptococcus iniae aplicando a metodologia de PCR proposta por

BERRIDGE et al. (1998). Os cocos Gram-positivos, independentemente do

gênero foram purificados, sendo o DNA extraído pela metodologia do

fenol/clorofórmio (SAMBROOK et al., 1989).

89

2.5 Microscopia eletrônica de transmissão As amostras foram processadas no laboratório de Microscopia

Eletrônica do Instituto Biológico de São Paulo. O material analisado foi

selecionado a partir de lesões identificadas nas lâminas da histopatologia. Uma

vez delimitada a região suspeita, a mesma foi localizada no bloco parafinado e

realizado corte de aproximadamente 1 mm de diâmetro. O fragmento extraído foi

desparafinado, reidratado e finalmente processado pela técnica de inclusão em

resina, seguida de contrastação positiva de cortes ultrafinos de acordo com os

procedimentos usuais de inclusão em resina, baseando-se nos métodos de LUFT,

(1961) e GONZALES-SANTANDER, (1969). Quando utilizamos esta técnica, os

fragmentos de órgãos são fixados em glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato

0,1M e pH 7,0, pós-fixados em tetróxido de ósmio a 2% em tampão fosfato 0,2M,

pH 7,0, corados por acetato de uranila a 0,5%, desidratados em série cetônica

crescente (50 a 100%) e incluídos em resina Spurr. Após ultra seccionamento dos

blocos, os cortes ultrafinos obtidos foram corados positivamente pelo tratamento

seqüencial de acetato de uranila (WATSON, 1958) e citrato de chumbo

(REINOLDS, 1963), antes de serem observados ao microscópio eletrônico de

transmissão Philips EM 208.

2.6 Proteínas séricas totais

Visando avaliação primária das funções hepática e renal foi realizado

um estudo eletroforético das proteínas totais no soro das rãs, comparando 30

exemplares para cada um dos quadros clínicos observados: rãs sadias, rãs na

fase aguda dos sintomas e rãs na fase crônica. O sangue foi coletado diretamente

do coração, deixando-o coagular a temperatura ambiente dentro da seringa. As

seringas foram acondicionadas em caixa de material isotérmico contendo gelo e

transportadas ao laboratório. Extraiu-se o soro e centrifugou-se a 5000 rpm por 15

minutos. O sobrenadante foi retirado e congelado a – 20°C até o uso. Fez-se a

eletroforese em SDS-PAGE, pelo método de LAEMILLI (1970).

2.7 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis A pele das rãs foi amostrada realizando-se raspagens nas regiões

ventrais do abdômen e dos membros posteriores com bisturi esterilizado. O

90

material obtido foi colocado sobre uma lâmina de vidro, corado com uma mistura

de KOH 10% e azul de algodão em proporções de 50:50 (vol-vol) e coberto por

lamínula para observação em microscópio óptico, segundo descrição de

MAZZONI et al. (2003).

2.8 Reprodução da Doença No intuito de comprovar a patogenicidade primária dos agentes

isolados, culturas puras obtidas dos animais doentes foram inoculadas em rãs

aparentemente sadias. UFC com, no máximo dois repiques no laboratório foram

diluídas segundo a escala de Mac Farland em concentrações crescentes de 103

até 1010 UFC por mL e inoculadas nas rãs por via intra peritoneal. Nove grupos de

30 rãs sadias, de igual peso e idade, foram colocados em baias separadas para

cada teste realizado. Oito grupos receberam cada um deles um inoculo de 1.0 mL

da concentração correspondente de bactérias, e o nono grupo 1.0 mL de solução

salina tamponada (PBS). O mesmo procedimento foi realizado utilizando uma

mistura de todas as bactérias isoladas, testando-se desta forma a possibilidade

de uma ação conjunta dos agentes envolvidos.

Macerados de órgãos obtidos de rãs com sintomatologia aguda foram

também aplicados pela via intraperitoneal nos exemplares do experimento

visando observar os resultados da aplicação conjunta dos diversos agentes

envolvidos. Os testes foram realizados a partir de fígado, rins e cérebro. Os

tecidos foram macerados, diluídos em PBS e 1 mL do sobrenadante foi inoculado

em cada rã. Nesse caso, grupos de 10 animais sadios foram utilizados, bem como

um grupo controle inoculado com PBS.

91

3 RESULTADOS Observou-se a existência de quatro diferentes formas de

apresentação do processo infeccioso. A primeira, inaparente ou subclínica, onde

os sinais clínicos não são evidentes, mas em nível microscópico foram detectadas

lesões moderadas acompanhadas da presença de cocos Gram-positivos. A

segunda, super aguda, que lembra a síndrome de choque tóxico ou choque

séptico. A terceira, aguda, com sintomatologia inespecífica, decorrente de lesões

de tipo necrótico-degenerativas, associadas a presença de cocos Gram-positivos

e septicemia. A quarta, crônica, onde os animais apresentaram-se caquécticos e

predominaram os sinais nervosos.

Não foram observadas diferenças entre as três categorias de rãs

que justificasse a descrição em separado do processo infeccioso. Nesse contexto,

são apresentados os resultados relevantes obtidos para cada uma das quatro

formas de apresentação da infecção.

3.1 Epizootiología A enfermidade pode aparecer repentinamente na forma aguda

espalhando-se pelo criatório inteiro ou permanecer na forma latente, com baixa

morbidade e mortalidade, podendo aumentar a severidade ao longo do ano.

Merece destaque o fato de que durante o período mais frio a morbidade e a

mortalidade foram menores, mas quando a temperatura voltou a subir, a doença

recrudesceu. A doença acometeu rãs em todas as fases, desde a pós-

metamorfose até animais no ponto de abate. Observou-se que as rãs afetadas

geralmente apresentavam boas condições de desenvolvimento.

3.2 Sinais Clínicos Os sinais clínicos de doença septicêmica em rãs de criação podem ser

considerados pouco específicos e evidenciam-se pouco tempo antes da morte.

Porém, existe reduzido número de rãs que consegue sobreviver, mas permanece

com sintomas crônicos de tipo neurológico. Foram caracterizadas três formas

clínicas diferentes.

92

3.2.1 Forma sub-clínica ou inaparente

Os animais permaneceram sem sinais aparentes da doença e com

comportamento normal (Figura 1A) até os momentos que antecederam a morte.

Um percentual variável de rãs não evidenciou sinais da doença alcançando a fase

de abate ou tornando-se reprodutor.

3.2.2 Forma aguda

Nas baias afetadas observou-se um padrão definido de rãs com

sintomas da doença e animais mortos. Não foram evidenciados sinais prévios que

pudessem indicar que uma determinada rã estivesse doente.

Os sinais clínicos incluíram: modificações da postura normal,

depressão, diminuição da reação aos estímulos externos (Figura 1B), edemas,

ascite, bem como pulmões insuflados que assemelham ao aspecto de balão,

responsáveis pelo aumento da pressão interna que pode provocar prolapso retal

(Figura 1C), sintomas nervosos de incordenação, natação errática e diversos

graus de curvatura da coluna vertebral o que leva ao desvio da cabeça para um

dos lados (Figura 1D).

Em alguns casos, a alta mortalidade dizimou, em curto período de

tempo, 90% das rãs. Nas rãs que morreram observou-se perda de movimentos,

postura de cabeça baixa, seguida por estado tipo comatoso, ou convulsivo e

quadro tetânico caracterizado pelos membros estendidos. Eventualmente

observou-se vômito sanguinolento no momento da morte acompanhado de um

som forte e agudo. Não foram observadas hemorragias na pele nem ulcerações.

Quando as rãs foram colhidas imediatamente após a morte, não se observou

nenhuma coloração vermelha na pele. Evidenciou-se a característica aguda ou

super aguda do aparecimento dos sinais e, conseqüentemente, o óbito dos

animais que podia acontecer em um curto período de tempo. Notou-se à

necropsia que as rãs se alimentavam até o aparecimento dos sinais clínicos. O

quadro fatal assemelhou-se às descrições realizadas para o choque séptico em

outras espécies animais incluindo o homem.

93

3.2.3 Forma crônica

Entre 0,1 a 0,5% da população desenvolveu um quadro crônico

caracterizado clinicamente pelas seqüelas nervosas. Foram achados comuns

nestes animais a falta de coordenação, posturas anormais como lordose e

diversos graus de escoliose levando ao desvio da cabeça para um dos lados

indistintamente. Alguns deles tinham dificuldades para manterem-se na posição

normal, nadar ou pular. Algumas rãs, apesar dos sintomas assinalados

conseguiam se alimentar e continuavam crescendo lentamente. Poucas

recuperavam a condição normal sem algum tipo de tratamento.

A B

C D

FIGURA - 1 (A) Rã sadia em posição normal. (B) Rã com sintomas iniciais da doença. Posição anormal do corpo com a cabeça voltada para baixo, apatia e falta de reação aos estímulos externos. (C) Rã com sintomatologia aguda, pulmões insuflados, com aumento da pressão interna e prolapso retal. (D) Rã com sintomas nervosos de incordenação e postura anormal com nado errático.

94

3.3 Achados de necropsia

3.3.1 Rãs sadias

Diversos graus de alteração hepática foram observados,

principalmente aumento de tamanho associado a colorações anormais, sendo as

mais comuns as amareladas ou em noz-moscada.

3.3.2 Rãs sem sintomas, forma sub-clínica ou inaparente

Os animais sem sintomas aparentes exibiam diversos graus de lesão

tissular, independentemente da idade, incluindo rãs recentemente

metamorfoseadas. Macroscopicamente, os órgãos mais afetados na observação

foram fígado, rins e baço. O fígado mostrou diversos graus de pigmentação

anormal, desde colorações pardo escuras a quase preto, bem como tons

acinzentados ou amarelados. O baço mostrou-se aumentado de tamanho e às

vezes de cor pardo-escura. Os rins apresentaram-se congestos ou hemorrágicos.

3.3.3 Forma aguda

Nas rãs doentes observou-se diversos graus de lesão nos órgãos internos,

mas sem um padrão definido. As alterações mais freqüentes foram o aumento do

tamanho do fígado além de coloração anormal, geralmente acinzentada ou

amarelada, baço com aumento de tamanho e coloração pardo-escura, e rins

hemorrágicos. Às vezes, pequenos nódulos esbranquiçados foram observados na

superfície do fígado e baço e coração. Algumas rãs tinham os pulmões insuflados,

cheios de ar, o que proporcionava ao corpo o aspecto de balão, levando ao

aumento da pressão interna e ao prolapso retal. À necropsia, observaram-se

algumas rãs com pulmões fortemente hemorrágicos e grau variável de ascite com

exsudato sero-hemorrágico. A maioria dos animais apresentou o tubo digestivo

contendo alimento, incluindo o estomago e o duodeno. O corpo adiposo

apresentava características normais.

95

3.3.4 Forma crônica

Esta foi a única fase da doença na qual as rãs apresentaram perda de

peso de moderada a intensa. O fígado mostrou-se às vezes pálido ou muito

escuro, o baço exibia aumento de volume e os rins apresentavam-se

hemorrágicos. Os corpos adiposos exibiam menor tamanho que aqueles das rãs

sadias e das rãs com síndrome aguda.

3.4 Histopatologia

3.4.1 Forma subclínica ou inaparente

Rãs sem sinais aparentes da doença revelaram diversos graus de

lesão nos estudos histológicos, independentemente da idade. Os principais

órgãos afetados foram o rim e o fígado. Enquanto o fígado mostrou diversos

graus de esteatose e uma quantidade variável de granulomas em suas fases

iniciais (Figura 2), os rins apresentaram infiltração mononuclear abundante e

alguns túbulos esclerosados. A coloração de Gram aplicada aos cortes revelou a

presença de cocos Gram-positivos (Figura 2).

3.4.2 Forma aguda

Um quadro de lesões septicêmicas foi constatado na maioria das rãs

estudadas. Fígado, rins, baço, coração, pulmões e cérebro foram afetados em

grau variável de severidade. Uma resposta inflamatória focal múltipla e

granulomas bacterianos foram observados distribuídos no parênquima dos

diversos órgãos e nas serosas das vísceras. Áreas de necrose associadas à

presença de macrófagos e uma grande infiltração linfocitária foram identificadas

na maioria dos tecidos (Figura 3). O número de focos de melanomacrófagos

distribuídos no fígado foi muito reduzido e, às vezes, ausente por completo.

Macrófagos, contendo em seu interior cocos fagocitados, constituiu um achado

comum no parênquima do fígado, e notou-se forte relação entre esta resposta e o

aparecimento dos granulomas. Estes mostraram regiões necróticas rodeadas por

macrófagos e fibroblastos (Figura 3). A esteatose hepatocitária com perda da

estrutura normal do tecido associada a necrose foi outro achado comum. As

96

lesões hepáticas foram de maior gravidade na região centrolobular do que na

região periportal.

Os rins sempre foram muito afetados, apresentaram infiltração

mononuclear, necrose glomerular e tubular, congestão e granulomas. Foram

observados glomérulos com espessamento da membrana basal,

desaparecimento das alças, retração, atrofia e esclerose. Foi possível observar o

depósito de material hialino nos glomérulos e abundantes cilindros hialinos nos

túbulos (Figura 3). O tipo de lesão pôde ser qualificada como glomerulonefrite

membranoproliferativa evoluindo para esclerose e insuficiência renal com

síndrome nefrótica. Todas as rãs estudadas apresentaram mineralização tubular

multifocal. Estomago e intestino não apresentaram lesões.

A maioria das rãs estudadas mostrou grau variável de congestão no

epicárdio com hemorragias e infiltração de macrófagos mononucleares e linfócitos

(Figura 3). Em alguns corações estudados observaram-se granulomas com o

mesmo padrão histológico já assinalado. O baço apresentou grau variável de

congestão, hiperplasia linfocítica inespecífica, granulomas e necrose (Figura 3).

Os pulmões revelaram diversos graus de infiltração mononuclear, congestão e

hemorragias.

O estudo dos cortes histológicos corados pelo Gram revelou a

presença de cocos Gram-positivos, em grau variável, associados às lesões

observadas na coloração H&E (Figura 3). As colorações de PAS e Fite foram

negativas para a presença de fungos e micobacterias, respectivamente. Também

não foram identificados nos tecidos estudados corpúsculos de inclusão viral.

97

A B

C

DC

FIGURA 2 – (A) Fígado de rã sem sintomas, com alteração da estrutura trabecular e infiltração focal (setas) formada por leucócitos mononucleares. Estes aglomerados constituem a fase inicial dos granulomas. H&E 200x. (B) Corte de rim de rã sadia. Coloração de Gram. São observados cocos gram-positivos colonizando a região dos túbulos proximais, 1000x. (C) Fígado com degeneração gordurosa, predominantemente na região centro lobular. H&E, 100x. (D) Rim de rã sem sintomas apresentando forte infiltrado mononuclear e zonas de necrose. H&E, 200x.

98

A B

C D

DC

B

B

C D

E F

FIGURA 3 – (A) Fígado de rã na fase aguda da doença mostrando abundante necrose e degeneração dos hepatócitos. Nota-se forte infiltração inflamatória predominantemente por mononucleares e formação de um granuloma (seta). H&E 400x. (B) Rim de rã na fase aguda com necrose e degeneração glomerular (setas), e infiltrado mononuclear. Observa-se material hialino nos túbulos proximais. H&E 100x.) (C) Glomérulode rã com sinais agudas, notam-se abundantes cocos Gram-positivos (setas). Coloração de Gram, 1000x. (D) Coração de rã na fase aguda mostrando epicardio com forte infiltrado mononuclear e formação de granuloma (seta). H&E 400x. (E) Baço de rã na fase aguda com áreas de necrose e formação de granulomas (seta), H&E, 200x. (F) Infiltrado inflamatório mononuclear e hemorragia nas meninges de rãs na fase crônica com sintomas nervosos. H&E, 200x.

99

3.4.3 Forma crônica

Os achados histopatológicos nestas rãs lembraram aqueles descritos

para o quadro agudo, mas com maior gravidade. Em particular o estudo do

sistema nervoso central mostrou diversos graus de infiltração mononuclear nas

meninges com formação de granulomas (Figura 3). O encéfalo foi também

afetado em algumas rãs, apresentando o mesmo infiltrado inflamatório e formação

de granulomas. Na coloração de Gram realizada nas secções de tecidos,

evidenciou-se a presença de cocos Gram-positivos. As colorações de PAS e Fite

foram negativas.

3.5 Microbiologia

Verificou-se que 90% das rãs estudadas foram positivas para cocos

Gram-positivos; 50% para Edwarsiella tarda e Escherichia coli.; 40% para

Citrobacter spp.; 25% para Pseudomonas spp. e Proteus spp; e menos de 10%

para Aeromonas hydrophyla, sempre associada a outros microorganismos. Dentre

os cocos, foram isolados principalmente Streptococcus uberis, S. agalactie, S.

faecalis, S. dysgalactiae e Enterococcus spp.

A análise das amostras de ração e da água de abastecimento do

ranário não revelaram contaminação por Streptococcus. As condições

microbiológicas da água eram compatíveis com os valores aceitados para o uso

em aqüicultura.

3.6 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Nas rãs estudadas, a pesquisa de ranavirus e S. iniae foi sempre

negativa.

3.7 Microscopia eletrônica de transmissão Não foram encontradas inclusões típicas de vírus e nem a presença de

partículas virais, nas amostras estudadas.

3.8 SDS page das proteínas séricas totais Estudos de eletroforese de proteínas sanguíneas revelaram grande

depleção nos animais doentes quando comparados com aqueles sadios. O valor

100

médio encontrado para rãs sadias foi de 2,56 g/dL, para rãs na fase aguda da

doença foi de 0,725 g/dL, e 1,24 g/dL para animais na fase crônica.

3.9 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis

Os resultados da pesquisa para fungos produtores da chytridiomicose

foram negativos em todos os casos estudados.

3.10 Reprodução da doença Não foi possível realizar a reprodução da doença em animais sadios

com nenhuma das doses utilizadas, seja de bactérias puras ou em cultura mista.

Também não foi possível reproduzir a doença injetando macerados de órgãos de

rãs doentes com sintomatologia aguda.

101

4 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES Os resultados obtidos confirmaram que nos ranários comerciais de

Goiás existe uma doença severa, com alta morbidade e mortalidade que

acarretam significativos danos econômicos. Epizootiologicamente há maior

prevalência nas épocas de temperaturas mais elevadas, sendo acometidas rãs

em todas as fases do ciclo produtivo, principalmente animais em bom estado

geral.

A sintomatologia foi inespecífica, cursando de forma subclínica,

super aguda, aguda ou crônica. No quadro subclínico, os animais não

apresentaram sintomas evidentes. Nos casos agudos, as rãs morriam

rapidamente sem evidenciar sinais prévios ou se apresentaram letárgicas,

ascíticas ou edematosas. Às vezes também eram evidentes sintomas nervosos.

Um quadro específico super agudo e fatal assemelhou-se às descrições

realizadas para o choque séptico em outras espécies animais incluindo o homem.

(SALLES et al., 1999; MULLER-ALOUF et al., 2001).Algumas rãs evoluiram para

quadro nervoso de caráter crônico caracterizado por lesões severas

disseminadas, acometendo inclusive o sistema nervoso central, as quais eram

responsáveis pela sintomatologia apresentada, ficando os animais debilitados e

caquéticos. À necropsia e histopatologia, notava-se que as lesões predominaram

no fígado e nos rins. O quadro inicial é de tipo necrótico-degenerativo, evoluindo

para infiltrações por linfócitos mononucleares e formação de granulomas. Estas

lesões apresentam-se associadas à presença de bactérias, principalmente cocos

Gram-positivos. Surtos de doenças com alta mortalidade têm sido comuns em todos

os ranários. A presença de cocos Gram-positivos atuando isoladamente ou

combinados com outras bactérias, tem sido observada em doenças septicêmicas

nas rãs de criação e anfíbios na natureza.

GLORIOSO et al. (1974) obtiveram resultados semelhantes aos do

presente trabalho ao analisarem bacteriologicamente amostras de rãs touro nos

Estados Unidos. Os autores assinalaram que nessas rãs foram isoladas de cada

indivíduo entre duas e oito espécies diferentes de bactérias, não existindo padrão

definido nessas combinações. Também não foi isolado microrganismo em cultura

102

pura. Fungos e vírus não foram isolados. Verifica-se, portanto, que existe

concordância entre estes achados e os resultados do presente trabalho.

AMBROSKY et al. (1983) descreveram um surto de mortalidade em rãs

de criação, por Streptococcus spp beta hemolíticos em R. catesbeiana do Estado

de Pará, com epizootiologia e sintomas clínicos coincidentes com as observações

deste trabalho. As principais lesões reportadas pelos autores foram a presença

de septicemia, hepatite e esplenite necrotizante com hemorragias em ambos

órgãos. Os autores também isolaram a bactéria do baço de rãs sadias,

confirmando a hipótese de que os germes podem coabitar órgãos do animal sem

produzir sinais evidentes de doença. A pesquisa de agentes virais também

revelou resultados negativos. Os autores relacionaram o surto a fatores de

estresse e densidade elevada que, associados às bactérias, determinaram a

morte das rãs.

GUIMARAES et al. (1988) relataram quadros de infecções produzidas

em R. catesbeiana dos Estados de Goiás e Pará, nos quais a mortalidade atingiu

80% da população em epizootias semelhantes aquelas do presente estudo.

Foram isoladas diversas bactérias, incluindo Edwarsiella tarda, Proteus vulgaris,

Staphylococcus epidermidis e Streptococcus spp, a partir de amostras de fígado,

baço, rins, líquido peritoneal e ovários, com os estreptococos apresentando maior

freqüência. Os autores atribuíram o quadro ao estresse produzido por diversos

fatores combinados, mas não determinaram a natureza ou origem da citada

epizootia.

HIPÓLITO et al. (1988, 1997) isolaram Streptococcus spp do sistema

nervoso central em R. catesbeiana e descreveram lesões neurológicas.

HIPÓLITO (1995, 1997, 1999) cita os estreptococos entre os agentes causais de

mortalidade em rãs de cativeiro. FIORIO et al. (1997) relacionaram bactérias do

gênero Streptococcus com mortalidade de rã touro associada a soluções de

continuidade na pele. MAZZONI (2000a, b) incriminou os Streptococcus spp

isolados de R. catesbeiana de ranários comerciais do Uruguai como responsáveis

pelos sinais nervosos e edemas.

MAUEL et al (2002) estudaram um surto com semelhantes

características em R. catesbeiana de ranário do Estado da Geórgia nos Estados

Unidos e identificaram os seguintes microrganismos: A. hydrophila,

103

Chryseobacterium meningosepticum, Chryseobacterium indolgenes, Edwarsiella

tarda, Citrobacter freundii, Pseudomonas spp., e Streptococcus iniae. PASTERIS

et al. (2006), estudando doenças em rãs de criação (R. catesbeiana) da

Argentina, relataram a presença de Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis, E.

faecium, Staphylococcus aureus, e leveduras. Sendo que nestes estudos, os

autores não realizaram a pesquisa de ranavírus ou chytrídeos, porém, a

identificação simultânea de diversos microrganismos são concordantes com as

observações da nossa pesquisa.

Todos os autores (AMBROSKY et al., 1983; GUIMARAES et al., 1988;

HIPÓLITO et al., 1988; HIPÓLITO, 1995; FIORIO et al., 1997; HIPÓLITO, 1997;

HIPÓLITO et al., 1997, 1999; MAZZONI, 2000a, b; MAUEL et al., 2002;

PASTERIS et al., 2006), foram unânimes em indicar os estreptococos como

agentes envolvidos em processos infecciosos, corroborando com os resultados

obtidos neste estudo. A análise desses achados sugere maior suscetibilidade das

rãs para estes microrganismos, que por sua vez, são habitantes naturais do

ambiente.

Os estreptococos têm sido incriminados freqüentemente como

produtores de doenças em organismos aquáticos. O quadro de lesão

estreptocócica descrita no presente trabalho coincide com aquele observado em

criações de diversas espécies (ELDAR et al., 1994, 1995; TORANZO et al., 1995;

CHANG & PLUMB, 1996; ELDAR & GHITTINO, 1999; EVANS et al., 2000;

KLESIUS et al., 2000; ROMALDE et al., 2000; SHOEMAKER et al., 2000, 2001;

CHANG et al., 2002; COLORN et al., 2002; SHELBY et al., 2002a, b;

DUREMDEZ, 2004; KVITT & COLORN, 2004).

BERCOVIER et al. (1997) e ELDAR et al., (1997) descreveram a

infecção estreptocócica como uma entidade mórbida produzida por bactérias dos

gêneros Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus e Vagococcus. Sugeriram

que a estreptococose nos peixes deve ser considerada como um complexo de

doenças semelhantes produzidas por diferentes gêneros e espécies de cocos

Gram-positivos, que originam uma síndrome particular. Segundo aqueles autores,

nas estreptococoses dos peixes, as medidas terapêuticas tradicionais são

geralmente ineficazes, pois a ação dos antibióticos é de curta duração, sendo

necessária à repetição dos tratamentos. BERCOVIER et al. (1997); ELDAR et al.

104

(1997); KLESIUS et al. (2000); SHELBY et al. (2002a) estabeleceram que as

vacinas autógenas constituem a única medida aplicada com sucesso. Estas

observações coincidem com os resultados obtidos na aplicação de medidas

terapêuticas pelos ranicultores durante o curso da doença. Assim, a

administração de antibiótico do grupo das penicilinas foi acompanhada da

diminuição imediata nos índices de morbidade e mortalidade, mas uma semana

após a suspensão da medicação, a enfermidade retomou os níveis iniciais.

Apesar das semelhanças entre a estreptococose dos peixes e a

doença em rãs, torna-se importante assinalar que nos anfíbios não foi possível

reproduzir os sintomas da enfermidade por meio da inoculação das bactérias

isoladas, bem como o uso de vacinas não mostrou eficiência na prevenção ou

controle da doença (dados não apresentados).

Não foi possível, nas condições deste estudo, determinar a causa

primária que antecede a invasão dos tecidos pelos estreptococos. A ação dos

ranavírus nas etapas iniciais dos girinos (MAZZONI et al., dados não publicados)

pode ter sido fator desencadeante, atuando isoladamente ou associado a fatores

ambientais relacionados ao manejo e, principalmente, a uma alimentação não

balanceada. Tem sido discutido entre os ranicultores e técnicos envolvidos na

pesquisa do setor, a qualidade das rações oferecidas às rãs. O elevado conteúdo

em carboidratos e proteínas nestes alimentos pode, sem dúvidas, constituir-se na

origem de alterações que levam à degeneração gordurosa do fígado,

impedimento ou diminuição de suas funções metabólicas, e sobrecarga dos rins

que acabam sendo lesados (CARNEVIA & MAZZONI, 1988; HIPÓLITO, 2001). As

causas da degeneração gordurosa hepática citadas na bibliografia referem tanto a

excessos de gordura no alimento como a carências dos aminoácidos colina e

metionina na alimentação (KING & ALROY, 2000). A sintomatologia predominante

de edemas e ascites associada à presença de lesões importantes nos rins e

fígado estão em concordância com esta doença. A síndrome hepato-renal é

descrita, detalhadamente, na bibliografia científica em outras espécies,

fundamentalmente no homem (ROBBINS et al., 1996; GUINÉS, 2001). De igual

forma, os sintomas nervosos observados freqüentemente na fase aguda da

doença, podem ter origem no quadro de encefalopatia hepática (COTRAN, 1994),

105

no qual as toxinas não eliminadas pelo fígado chegam ao sistema nervoso

central, lesando-o e originando sinais semelhantes aos descritos neste trabalho.

Os resultados da análise das proteínas totais do soro indicam, em

geral, baixa concentração plasmática, quando comparados com os obtidos por

COPPO (2003) em rãs de criação (R. catesbeiana) na Argentina. Este autor

encontrou valores médios de 4,34 g/dL, quase o dobro do verificado no presente

estudo para rãs sadias. Isto pode ser atribuído à lesão do fígado e rins dessas

rãs, constatada na histopatologia. Este tipo de lesão provoca diminuição da

função hepática bem como perda de proteínas pelo rim, constituindo a causa dos

baixos valores encontrados. A grande diferença entre os valores obtidos para rãs

que não apresentam sintomas da doença e rãs que apresentam o quadro agudo

revela o severo comprometimento metabólico destas últimas, e corrobora com os

achados na histopatologia e as observações clínicas de edemas e ascites.

Não foi possível fazer associação dos ranavirus com a doença

estudada. Os resultados no PCR foram sempre negativos e as lesões na

histopatologia foram diferentes daquelas descritas para estes agentes. Apesar

dos órgãos mais afetados serem os mesmos acometidos pelos vírus, a lesão

predominante foi a necrose e degeneração, com infiltração mononuclear e

formação de granulomas. Não foram observadas lesões de picnose e cariorexia,

nem as hemorragias na maioria dos órgãos, mencionadas nas infecções por

iridovírus (WOLF et al., 1968; CUNNINGHAM et al., 1996; ZHANG et al., 2001)

nem a lesão predominante nos túbulos proximais (ROBERT et al., 2005).

WOLF et al. (1968) trabalhando com R. catesbeiana nos Estados

Unidos, isolaram um vírus poliédrico citoplasmático que chamaram de “vírus do

edema do girino” ou “tadpole edema vírus” (TEV). O agente foi isolado de todos

os girinos e rãs adultas independentemente do seu estado sanitário. Os

resultados do presente estudo diferem fundamentalmente destes achados pois o

vírus não foi detectado pelas técnicas de PCR e microscopia eletrônica de

transmissão nas rãs pós-metamorfose. Observaram-se sinais clínicos

semelhantes aos descritos pelos autores, mas vale ressaltar que são

inespecíficos e decorrentes do quadro de lesão renal e hepática, que

predominaram em ambos dos estudos.

106

CUNNINGHAM et al. (1996) apresentaram dois tipos de síndrome em

Rana temporaria coletadas em locais de mortalidades elevadas no Reino Unido.

Uma síndrome hemorrágica que afeta a musculatura esquelética e no trato

alimentar e sistema urinário e outra ulcerativa que acomete a pele e provoca

necrose nos membros posteriores. Em alguns casos foram encontradas rãs com

sinais comuns às duas síndromes. Os autores concluíram que o agente

responsável da doença foi um iridovírus, entretanto neste estudo não foi

detectada a presença do agente, nem o tipo de lesão descrita pelos autores.

ZHANG et al. (2001) reportaram casos de mortalidades acima de 90%

em rãs de criação (Rana grylio) na China e atribuíram a causa a um ranavirus

(Rana grylio vírus, RGV). A descrição dos sintomas inclui hemorragias petequiais

na pele que evoluem para ulcerações. As hemorragias tornam-se evidentes à

medida que a doença avança no parênquima dos órgãos internos,

fundamentalmente fígado e rins. À microscopia óptica, diversos graus de lesão,

incluindo necrose, foram observados, resultando em destruição do tecido e

formação de cavidades de diversos tamanhos no fígado e baço. No coração,

foram observadas atrofia, fibrose e necrose. No intestino, verificou-se a presença

de células epiteliais aumentadas de volume e numerosas células necróticas, além

de sangue na cavidade. Nas septicemias estudadas no Brasil, não se observou

presença de hemorragias petequiais, nem as ulcerações referidas por esses

autores. Ao microscópio, as lesões diferiram com as encontradas neste estudo

principalmente em relação aos granulomas sem formação de cavidades

decorrentes da necrose, além da ausência de lesões nas paredes do tubo

digestivo.

GREEN et al. (2002), ao estudar 30 surtos em rãs silvestres nas fases

pós-metamorfose e adultas, atribuíram aos iridovírus a etiologia de quatro deles e

atribuindo os demais surtos a fungos, os quais não foram identificados em nosso

estudo. Isto era o esperado tendo em vista que as condições de cativeiro

favorecem o desenvolvimento e a ação bacteriana e, na natureza, as condições

de alimentação e densidade populacionais são apropriadas.

WENG et al. (2002) reportaram na China surtos de “doença da barriga

inchada” causados por iridovírus em rãs de criação da espécie Rana tigrina

rugulosa. A presença do iridovírus foi confirmada por microscopia eletrônica e por

107

técnicas moleculares. À necropsia,foram observados hepatomegalia e

esplenomegalia e, na histopatologia foi detectada necrose hepática e renal, sem

presença de degeneração e de granulomas, a diferença dos resultados do

presente estudo.

ROBERT et al. (2005) descreveram lesões produzidas pelo vírus FV3

em Xenopus laevis experimentalmente inoculadas. Os autores comprovaram o

tropismo do agente pelo rim, observando que sinais de edemas e hemorragias

foram os mais evidentes e tem íntima relação com lesão do órgão. Nos cortes

corados pela H&E, os autores observaram lesões de necrose principalmente nos

túbulos proximais e glomérulos. Nos túbulos distais foi observada apenas a

presença de cilindros hialinos. No fígado, foi verificada necrose celular, mas em

menor grau. Ao contrário do presente estudo, os autores não detectaram lesões

degenerativas e granulomatosas.

GREER et al. (2005) estudaram cinco surtos de mortalidade em girinos

de Rana sylvatica e rãs pós-metamorfose da espécie Rana pipiens, no Canadá.

Baseados em observações a campo, na avaliação histopatológica e em técnicas

moleculares, atribuíram aos ranavirus a causa dos surtos. Porém, relataram que

resultados positivos foram obtidos na PCR para rãs sadias criadas em laboratório

e ovos coletados em locais onde infecções por iridovírus haviam sido reportadas.

A partir desses resultados, notou-se a importância da realização de diagnóstico

diferencial consistente, devido à semelhança dos sinais clínicos e da preferência

ou eleição de órgãos como o fígado e o rim. Os fungos envolvidos nas doenças

de anfíbios já citadas, também não foram detectados.

A síndrome denominada de “perna vermelha” não foi observada em

nenhuma das rãs quando a análise foi realizada com o animal ainda vivo.

Quando as rãs foram encontradas mortas, ou moribundas, os sinais clássicos de

eritema na região ventral do corpo e patas começaram a ser evidentes. Estes

resultados são coincidentes com aqueles citados por GREEN et al. (2002) que

estudando surtos em anfíbios dos Estados Unidos, não diagnosticaram red leg.

São concordantes também quanto à constatação de que a maioria das

mortalidades atribuídas à síndrome de perna vermelha refere-se a diagnósticos

incompletos, nos quais a premissa básica de não realizar estudos microbiológicos

em rãs em fases terminais ou mortas não foi cumprida, bem como, não foi

108

pesquisada a presença de vírus, nem realizadas as análises histopatológicas

correspondentes. Assim, há que se concordar com a afirmação dos autores: “a

perna vermelha é um diagnostico erroneamente e excessivamente utilizado na

medicina de anfíbios e na epizootiología herpetológica”. Em função dos resultados

obtidos e das afirmações de GIBBS et al.(1966) CUNNINGHAM et al. (1996) e

GREEN et al. (2002) os autores do presente estudo apresentam a proposta de

eliminar da nômina científica o termo “perna vermelha” ou red leg, por considerá-

lo uma fonte de confusão no que se refere à etiologia do surto, bem como por

fazer referência a um evento que se apresenta em várias situações, associadas

ou não com agentes infecciosos.

A lesão granulomatosa característica da doença descrita no presente

estudo, tem sido associada à infecções estreptocócicas bem como de outras

bactérias resistentes à fagocitose AGIUS & ROBERTS (2003). Os macrófagos

uma vez que fagocitam agentes de elevada resistência são responsáveis pelo

inicio de reações inflamatórias localizadas. O desenvolvimento daqueles

microrganismos, com conseqüente reação imune, dá origem a lesões

granulomatosas características das infecções crônicas.

Em determinadas situações, as bactérias coabitam os tecidos das rãs

produzindo lesões sem sintomatologia evidente demonstrando que os anfíbios

conseguem atingir condições de produção aceitáveis convivendo com uma certa

contaminação bacteriana. Segundo MITCHELL (2003) e IICAB (2005) os

estreptococos potencialmente patogênicos podem colonizar de forma

assintomática, animais normais e humanos, requerendo ação de fatores

desencadeantes para produzir sintomas evidentes. Sabe-se que o número de

bactérias é limitado usualmente pelas defesas não-específicas. Algumas espécies

chegam a produzir doenças quando estes mecanismos falham ou quando uma

cepa nova aparece, seja pelo ganho de determinados genes de virulência ou pela

presença de cápsulas polisacarídeas de proteção.

A morte das rãs é causada por septicemia associada ao

comprometimento funcional do fígado e rins principalmente, mas outros órgãos

como baço, e coração são afetados à medida que a doença avança. O quadro

pode ser qualificado como “septicemia estreptocócica secundária”.

109

Observações a campo indicam que a utilização, pelos produtores, de

penicilina na ração ou penicilina e estreptomicina injetável mostraram resultados

imediatos na redução do aparecimento de novos casos, assim como da

mortalidade, mas a ação destes antibióticos durou entre sete e 10 dias. Após esse

período, a doença retomou aos níveis originais. Foi também observado que a

aplicação de medidas de biossegurança básicas, comprovadamente

imprescindíveis em outras criações com maior desenvolvimento

(SOBESTIANSKY, 2002) revelaram-se efetivas. Um vazio sanitário de três

meses, seguido de medidas de desinfecção adequadas controlaram a doença no

ranário em estudo e também em outros ranários (VIANA, 2005). Esta observação

sugere que, provavelmente, em função das modificações das condições

ambientais, ocorrem mudanças que diminuem a quantidade de microrganismos

presentes e controlam a doença.

Ficou demonstrado que o papel dos cocos Gram-positivos não pode

ser descartado na evolução da doença e, portanto, devem ser levados em conta

nos planos de controle sanitário dos ranários comerciais. Porém, a presença de

diversas espécies sem a determinação de um patógeno permanente ou

constante, indica o caráter secundário da infecção.

O curso insidioso, a ausência de um patógeno específico, a

associação de diversas espécies bacterianas, a resposta imune de tipo crônico e

a lesão degenerativo-necrótica encontrada nos principais órgãos de metabolismo,

sugerem provável causa múltipla para a doença, decorrente da ação conjunta de

fatores infecciosos, ambientais e alimentares. É provável que uma ação inicial dos

ranavírus, identificada nos girinos, possa constituir a porta de entrada das

bactérias.

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121

CAPITULO 5 PROCESSO INFECCIOSO SUPER AGUDO SEMELHANTE AO CHOQUE ENDOTÓXICO EM RÃS DE CRIAÇÃO (Rana catesbeiana Shaw, 1802).

RESUMO

Na realização de estudos de doenças septicêmicas em rãs de criação foi observado uma forma super aguda que acontece em 15 a 20% dos animais doentes. O objetivo do presente trabalho foi estudar as características particulares desta forma da infecção, mediante estudos clínicos e para-clínicos que envolveram amostragem de exemplares para necropsia, análises histopatológicas, microbiológicas, moleculares e de microscopia eletrônica de transmissão. Os sinais clínicos observados incluem modificações da postura normal, depressão, e diminuição da reação aos estímulos externos. As rãs morrem em curto período de tempo apresentando incoordenação, opistótomo e convulsões, permanecendo em quadro tetânico com os membros estendidos. À necropsia, foram observados aumento do tamanho do fígado e coloração anormal, geralmente cinzenta ou amarelada, baço pardo-escuro e aumentado de tamanho, rins e pulmões hemorrágicos e ascite leve com exsudato soro-hemorrágico. À histopatologia, observou-se um quadro característico de lesões produzidas por sepse generalizada. Fígado, rins, baço, coração, pulmão e cérebro foram afetados. Verificou-se nesses órgãos uma resposta inflamatória múltipla, necrose associada à presença de macrófagos e infiltração linfocitária. Granulomas bacterianos foram observados distribuídos no parênquima dos diversos órgãos. A alteração histopatológica mais freqüente neste quadro foi o aparecimento de aglomerados basofílicos arredondados distribuídos na maioria dos órgãos afetados, correspondendo a cocos Gram-positivos. O quadro clínico super agudo, associado aos achados de necrópsia e histopatologia sugerem a ocorrência de um choque que, devido a quantidade e distribuição generalizada dos microrganismos, indicam origem séptica. Por tanto, a análise dos resultados do presente estudo permitem-nos concluir sobre a presença de uma síndrome semelhante à síndrome de choque endotóxico ou choque séptico em rãs de criação. Palavras chave: Aqüicultura, choque, estreptococos, ranicultura.

122

ABSTRACT

During the study of septicemic diseases in farmed frogs, it was detected a particular syndrome characterized by super acute mortality affecting 15 to 20% of the sick population. Clinical signs included abnormal posture, depression, and low reaction to external stimuli. Frogs died in a very short time showing incoodination, opistotonous and convulsions with tetany, remaining with the four legs extended. Necropsy findings included hepatomegaly with abnormal color, generally grayish or yellowish, dark red and swollen spleen, hemorrhagic kidneys, strongly hemorrhagic lungs and slight ascites with serum-hemorrhagic exudate. Histopathologically, a septicemic pattern was observed. Liver, kidney, spleen, heart, lungs and brain showed a multiple inflammatory response with necroses in association with macrophage and lymphocitic infiltration. Bacterial granuloma were observed spread in all organs. The most frequent histopathological lesion were basophilic aggregates spotted through all affected organs. The super acute condition, associated with necropsy and histopathological findings suggested shock syndrome that, due to bacterial quantity and distribution indicated a septic origin. These results resembled the existence of a toxic shock syndrome or septic shock in farmed frogs, and indicate that this kind of disease could be an usual finding in other aquaculture species. Key words: Frogs, septicemia, streptococci, shock

123

1 INTRODUÇÃO Com os avanços nos conhecimentos sobre manejo e alimentação, a

ranicultura transformou-se numa atividade intensiva, com altas densidades de

população e estrita dependência de alimentos balanceados artificiais. Os métodos

intensivos de cultivo favorecem o aparecimento de doenças que constituem

ameaça à viabilidade técnica e econômica dos ranários e são considerados

fatores que limitam o crescimento da atividade (NACE, 1974; AMBROSKY et al.,

1983; GUIMARAES et al., 1988; CRAWSHAW, 1994; MAZZONI, 2000a;

MAZZONI & CARNEVIA, 2000; ZHANG et al., 2001; MAZZONI, 2003).

No Brasil, conforme revisão realizada por HIPÓLITO (2002), a maioria

dos trabalhos relativos ao assunto, foram comunicados efêmeros, não tendo

continuidade no estudo do caso. Os diagnósticos concentraram-se

exclusivamente na identificação de agentes parasitários e bacterianos, não sendo

realizado acompanhamento dos surtos, no intuito de estabelecer o papel

etiológico dos agentes detectados e de outros aspectos das doenças que

permitam a elaboração de medidas de prevenção ou controle.

Trabalhos realizados com rãs de criação na China (Rana grylio e Rana

tigrina rugulosa) identificaram a presença de vírus da família Iridoviridae gênero

Ranavirus como produtores de doenças com elevada mortalidade e impacto

econômico (ZHANG et al., 2001, 2006; WENG et al., 2002; ZHANG et al., 2006).

Nas rãs de ambientes naturais tem sido identificada uma doença

emergente com alta mortalidade, produzida pelo fungo Batrachochytrium

dendrobatidis (BERGER et al., 1998; BERGER et al., 1999; DASZAK et al., 1999;

LONGCORE et al., 1999; SPEARE & BERGER, 2000; MAZZONI, 2000a, b;

BERGER et al., 2002, GUAYASAMIN et al., 2002; MAZZONI et al., 2003;

SPEARE, 2003; HANSELMANN et al., 2004; BLAUSTEIN & DOBSON, 2006).

O presente trabalho constitui parte de estudos realizados no Brasil com

o intuito de aprofundar o conhecimento sobre as doenças das rãs de criação

(Rana catesbeiana Shaw, 1802), principalmente aquelas com alta mortalidade, e

conseqüentemente de maior impacto econômico.

124

As observações clínicas dos surtos acompanhados neste estudo, bem

como daqueles citados na bibliografia sobre doenças de rãs, revelaram

sintomatologia inespecífica e, portanto, insuficiente para conferir o diagnóstico.

Dentre as diversas formas clínicas observadas, constatou-se a

presença de mortes súbitas de forma super aguda, já informadas pelos

ranicultores (informação pessoal) e outros autores (NACE, 1974; GUIMARAES et

al., 1988), mas, nunca estudado em forma isolada. Em função da importância

apresentada por esta forma clínica propôs-se este estudo com o objetivo de

conhecer as características etiológicas e fisiopatológicas envolvidas neste

processo infeccioso super agudo. Para tanto, foram realizadas pesquisas dos

agentes etiológicos, a epizootiologia das doenças, a sintomatologia clínica, a

anatomia patológica macroscópica, a histopatologia, a bacteriologia convencional,

e a virologia, sendo esta por meio do emprego de técnicas moleculares, cultura de

células e a microscopia eletrônica de transmissão.

125

2 MATERIAL E MÉTODOS O presente estudo foi realizado em um ranário de ciclo completo

localizado no Estado de Goiás, no Município de Hidrolândia. As rãs, logo após a

metamorfose, foram confinadas em baias de concreto localizadas em galpões

fechados. Todas as baias possuíam piscina de cinco cm de profundidade

ocupando 20% da superfície total. A água foi obtida a partir de uma represa de

20 hectares alimentada por várias nascentes.

As rãs foram alimentadas duas vezes por dia com ração extrusada

apresentando 45% de proteína bruta. De forma periódica, as rãs foram

submetidas a triagem para manter tamanhos uniformes e reduzir o canibalismo. A

densidade foi mantida na faixa de 150 animais por m2 durante a fase inicial, até

alcançar 40 por m2 na etapa de terminação.

2.1 Amostragem das rãs Foram utilizadas 60 rãs com sinais típicos do quadro super agudo da

doença. Os exemplares estudados foram coletados no momento prévio à morte

ou durante o processo de convulsões e vômito decorrentes da apresentação

super aguda da enfermidade. As rãs foram insensibilizadas por concussão

craniana e sacrificadas por corte da medula nervosa cervical (AVMA, 1993).

2.2 Análise Histopatologica Fragmentos de fígado, rins, baço, estomago, pulmões, coração e

cérebro foram extraídos e preservados em formol tamponado a 10% (vol-vol) e

processados segundo a rotina de estudos de histopatologia no laboratório de

Histopatologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás,

utilizando as técnicas propostas por LUNA (1968). Os blocos parafinados foram

secionados em cortes de 4-5 µ e corados com hematoxilina-eosina (H&E) para as

avaliações primárias das lesões. Adicionalmente, os cortes selecionados foram

também corados pelo método de Gram para visualização de bactérias em geral,

pelo método de Fite para detecção de micobacterias e coloração de PAS para

visualização de fungos.

126

2.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Fragmentos de fígado, rim, baço e músculo foram preservados em

etanol a 95% ou congelados a -20°C até processamento no laboratório de

Biologia Molecular do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária

da Universidade Federal de Goiás. A extração do DNA foi realizada a partir de

porções de 50 mg utilizando o método do fenol/clorofórmio (SAMBROOK et al.,

1989). Foram utilizados iniciadores direcionados a regiões conservadas no

genoma dos iridovírus (Quadro 1). Para o gene que codifica a proteína imediata

precoce (IE) ICP-18 utilizaram-se iniciadores propostos por GALLI et al. (2006), e

para o gene que codifica a proteína MCP foram utilizados iniciadores localizados

nas extremidades 5´e 3´ da seqüência de FV3 (TAN et al., 2004) sendo que o

iniciador “forward” é original do presente trabalho e o “reverse” já utilizado por

HYATT et al. (2000) segundo é apresentado no Quadro 1.

QUADRO 1 – Iniciadores utilizados para amplificação parcial do genoma de ranavirus, “bp” indica o comprimento do amplicon. Nome Forward Reverse Produto

(bp)

MCP

ATGTCTTCTGTAACTGGTTCA

AAAGACCCGTTTTGCAGCAAAC (1)

1483

IE

ATGATCCAAGCCTACCTGTGC (2)

AAATGTCCTAATCTATACACC (2)

479

(3) HYATT et al. (2000); (2) GALLI et al. (2006).

O mix utilizado para a amplificação com os diferentes iniciadores

constituía-se de 2,5 µL 10x tampão de PCR [Tris-HCl 20 mM (pH 8.4), KCl 50

mM], dNTP 200 µM, 2,5 mM MgCl2, 2.5 µM de cada iniciador, 1 U de Taq DNA

Polymerase, 5 µL de DNA template e água MilliQ até completar 50 µL para cada

reação. Os produtos de amplificação foram submetidos a corrida em gel de

127

agarose a 1%, corados com brometo de etídeo 0.5 µg/mL e visualizados em

transiluminador de luz UV.

Foram também utilizados iniciadores direcionados à identificação da

bactéria Streptococcus iniae aplicando a metodologia de PCR proposta por

BERRIDGE et al. (1998). Os cocos Gram-positivos, independentemente do

gênero foram purificados, sendo o DNA extraído pela metodologia do

fenol/clorofórmio (SAMBROOK et al., 1989). 2.4 Análise Microbiológica O sangue foi colhido assepticamente diretamente do coração das rãs

vivas e foram preparados esfregaços que foram posteriormente corados com

Giemsa. Uma vez sacrificados os exemplares foram submersos em solução de

ácido peracético a 0,2%. Após abertura da pele e da cavidade celômica, fígado,

rins, baço, pulmões, coração e cérebro foram extraídos assepticamente. As

amostras foram processadas imediatamente no laboratório de bacteriologia do

Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade

Federal de Goiás, sendo inoculadas em caldos BHI (Brain Heart Infussion Broth),

Casoy (Tripticase Soy Broth), Glicose Azide e Selenito-Cistina, segundo os

métodos rotineiros (BRASIL, 2003). Todas as amostras foram incubadas a 30°C

por 24-72 h. O período de 72 horas deveu-se ao crescimento lento de alguns

estreptococos, e procurou-se de esta forma propiciar um tempo suficiente para o

desenvolvimento, evitando a ocorrência de falsos negativos. Assim que foi

observado crescimento bacteriano foram semeadas alíquotas em placas de ágar

sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, e incubadas a 30°C,

determinando-se as características hemolíticas e morfologia das colônias-UFC.

As UFC isoladas, com diferente morfologia, foram selecionadas para coloração de

Gram, observação em microscópio de contraste de fase, e identificação mediante

provas bioquímicas complementares. Os cocos Gram-positivos foram estudados

mediante provas bioquímicas complementares. As UFC identificadas

primariamente pela bioquímica como estreptococos, foram enviadas para

determinação da espécie ao Aquatic Animal Health Research Laboratory em

Auburn - Alabama, nos Estados Unidos. As culturas foram processadas pelo

128

método de Identificação de ácidos graxos da membrana, FAME (Fatty Acid Methyl

Ester).

Os bastonetes Gram-negativos foram incubados em placas de ágar

McConkey e as UFC selecionadas inoculadas em tubos de TSI (Triple Sugar Iron

Agar) para finalmente serem submetidas à bateria de testes bioquímicos para

identificação da espécie (BRASIL, 2003).

Amostras de água e da ração foram analisadas periodicamente por

técnicas microbiológicas convencionais para determinação de contaminação fecal

(BRASIL, 2003) e presença de cocos Gram-positivos como descrito

anteriormente.

2.5 Microscopia eletrônica de transmissão As amostras foram processadas no laboratório de Microscopia

Eletrônica do Instituto Biológico de São Paulo. O material analisado foi

selecionado a partir de lesões identificadas nas lâminas da histopatologia. Uma

vez delimitada a região suspeita, a mesma foi localizada no bloco parafinado e

realizou-se corte de aproximadamente 1 mm de diâmetro. O fragmento extraído

foi desparafinado, reidratado e finalmente processado pela técnica de inclusão em

resina, seguida de contrastação positiva de cortes ultrafinos de acordo com os

procedimentos usuais de inclusão em resina, baseando-se nos métodos de LUFT

(1961) e GONZALES-SANTANDER (1969). Quando utilizou-se esta técnica, os

fragmentos de órgãos foram fixados em glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato

0,1M e pH 7,0, pós-fixados em tetróxido de ósmio a 2% em tampão fosfato 0,2M,

pH 7,0, corados por acetato de uranila a 0,5%, desidratados em série cetônica

crescente (50 a 100%) e incluídos em resina Spurr. Após ultra seccionamento dos

blocos, os cortes ultrafinos obtidos são corados positivamente pelo tratamento

seqüencial de acetato de uranila (WATSON, 1958) e citrato de chumbo

(REINOLDS, 1963), antes de serem observados ao microscópio eletrônico de

transmissão Philips EM 208.

2.6 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis

A pele das rãs foi amostrada realizando raspagens nas regiões

ventrais do abdome e dos membros posteriores com bisturi esterilizado. O

129

material obtido foi colocado sobre uma lâmina de vidro, corado com uma mistura

de KOH 10% e Azul de Algodão em proporções de 50:50 (vol-vol) e coberto por

uma lamínula para observação em microscópio óptico, segundo a descrição de

MAZZONI et al. (2003).

130

3 RESULTADOS Os resultados da epizootiología, microbiologia, PCR e microscopia

eletrônica de transmissão não diferem daqueles descritos para rãs septicêmicas

em trabalhos anteriores (MAZZONI et al. dados não publicados) pelos autores.

Rãs doentes e mortas foram detectadas em todas as etapas do ciclo

de vida não sendo encontrado relação com o manejo, tipo de alimentação ou

localização dentro do ranário. Observou-se que entre 15 e 20% dos animais

afetados evoluíram para um quadro super agudo. Esse quadro coexiste no

mesmo ranário, inclusive nas mesmas baias, com outros quadros da doença

(MAZZONI et al., dados não publicados). Não foram observados sinais

premonitórios que pudessem indicar que uma determinada rã seria afetada.

Os sinais clínicos incluíram: modificações da postura normal,

depressão, e diminuição da reação aos estímulos externos. As rãs apresentaram

ainda incordenação, opistótomo e convulsões, permanecendo em quadro tetânico

com os membros estendidos (Figura 1).

FIGURA 1 - Rãs em posição estendida, típica do quadro

super agudo

Às vezes, foi observado vômito sanguinolento no momento da morte e

emissão de um som forte e agudo. Não foram observadas hemorragias na pele e

nem ulcerações. Quando as rãs foram colhidas imediatamente após a morte, não

se observou nenhuma coloração vermelha na pele. Torna-se imperativo relatar

que o aparecimento super agudo dos sintomas e o conseqüente óbito dos animais

pode acontecer em período muito curto, de cerca de 30 minutos. Verificou-se que

as rãs se alimentavam até o aparecimento dos sinais clínicos, fato comprovado à

131

necropsia. O quadro que levou os animais à morte lembrou as descrições

realizadas em outras espécies animais e no homem para o choque séptico.

3.1 Necrópsia As rãs doentes mostraram diversos graus de lesões nos órgãos

internos, mas sem um padrão definido. As lesões de maior freqüência foram:

aumento do volume e coloração anormal do fígado, geralmente cinzenta ou

amarelada, baço aumentado de volume e com coloração pardo-escura além de

rins hemorrágicos. Às vezes, observaram-se pulmões fortemente hemorrágicos e

ascite leve contendo exsudato sero-hemorrágico.

A maioria dos animais apresentou alimento no tubo digestivo, incluindo

o estômago e o duodeno, enquanto o corpo adiposo apresentava-se com

características normais.

3.2 Histopatologia Foi observado um quadro de lesões inflamatórias e vasculares

produzidas pela sepse na maioria das rãs afetando o fígado, rins, baço, coração,

pulmão e cérebro.

Foram observados resposta inflamatória múltipla, localizada nas

serosas das vísceras bem como granulomas bacterianos distribuídos no

parênquima dos diversos órgãos. Também ocorreram áreas de necrose

associadas à presença de macrófagos e grande infiltração linfocitária na maioria

dos tecidos.

A alteração mais freqüente neste quadro foi o aparecimento de focos

basofílicos arredondados distribuídos na maioria dos órgãos afetados,

correspondendo a aglomerados de bactérias, provavelmente cocos (Figura 2).

Um achado comum foi a esteatose hepática com perda da estrutura

normal do tecido e necrose. Os rins apresentaram-se muito afetados, com

infiltração mononuclear, necrose glomerular e tubular, congestão, granulomas e

abundantes cilindros hialinos nos túbulos, bem como mineralização tubular

multifocal. Os pulmões revelaram diversos graus de infiltração mononuclear,

congestão e hemorragias.

132

A B

C D

FIGURA 2 – Rã adulta. Focos basofílicos correspondendo a

aglomerados de cocos. (A) Fígado 200X; (B) Baço 200X; (C) Coração 400X; (D) Rim 200X.. Coloração H&E.

As rãs estudadas mostraram grau variável de congestão no epicárdio

com hemorragias e infiltração de monócitos macrófagos e linfócitos. No coração

observaram-se granulomas com o mesmo padrão histológico já assinalado nos

outros tecidos, assim como abundantes bactérias infiltrando o miocárdio e o

epicardio. No baço notou-se grau variável de congestão, hiperplasia linfocítica

inespecífica, granulomas e necrose, sempre associados à presença bacteriana.

133

A B

Figura 3 - Aglomerado de cocos gram-positivos no miocárdio (A), e em

rim de rãs (B). Coloração de Gram, 1000X.

A coloração de Gram revelou a presença de grandes aglomerados de

cocos Gram-positivos associados às lesões observadas na H&E (Figura 3). Esses

aglomerados de bactérias foram identificados na intimidade de todos os tecidos

dos órgãos e vísceras examinados. Não foi observada reação inflamatória

circundando esses aglomerados bacterianos. A pesquisa de corpúsculos de

inclusão viral foi negativa.

FIGURA 4 - Esfregaço de sangue cardíaco corado pelo Giemsa. Observam-se abundantes cocos isolados ou em cadeias na superfície das hemáceas (seta), assim como em um leucócito (ponta de seta), 1000x.

134

3.3 Microbiologia Todas as rãs estudadas com esta síndrome albergaram cocos Gram-

positivos de diversas espécies e gêneros. Assim, foram identificados

principalmente, Streptococcus uberis, S. agalactie, S. faecalis, S. dysgalactiae, e

Enterococcus spp. Staphylococcus spp foi identificado em 40% dos casos. Apesar

de não serem observados outros microrganismos nos cortes histológicos

submetidos à coloração de Gram, Edwarsiella tarda, Escherichia coli, Citrobacter

spp., Pseudomonas spp., Proteus spp, e Aeromonas hydrophyla, foram também

detectados eventualmente, mas sem um padrão constante, nem quanto à sua

presença nem quanto a combinações entre eles.

Amostras de sangue colhido diretamente do coração das rãs, coradas

pelo método de Giemsa revelaram a presença de abundantes cocos, muitas

vezes em cadeias aderidos às paredes das hemáceas, bem como no interior de

células de defesa (Figura 4).

3.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Nas rãs estudadas, a pesquisa de ranavirus e S. iniae foi negativa.

3.5 Microscopia eletrônica de transmissão Não foram encontradas inclusões típicas de vírus, nem presença de

partículas virais.

3.6 Pesquisa do fungo Batrachochytrium dendrobatidis As pesquisas do fungo foram negativas em todos os animais

estudados.

135

4 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES A análise do conjunto de resultados permite evidenciar a presença de

um quadro particular, do tipo septicêmico e super agudo, mediado principalmente

pelos estreptococos, que após um período variável de infecção sub-clínica,

conseguem proliferar em quantidades muito elevadas que rapidamente levam a

morte.

As septicemias têm sido reportadas como a causa mais importante de

mortalidade em anfíbios, sendo freqüente o achado de animais mortos sem

sintomas premonitórios (CRAWSHAW, 1994). Este mesmo autor assinala que os

microrganismos normais do meio ambiente podem tornar-se patogênicos quando

os anfíbios são submetidos a condições de estresse, sendo que a sintomatologia

observada não depende do tipo de microrganismo envolvido. Os resultados das

pesquisas realizadas confirmaram estas observações.

Apesar da importância das septicemias nos anfíbios, o risco de isolar

bactérias oportunistas que entram no organismo submetido a condições de

choque e colapso generalizado é elevado (NACE, 1974). O autor recomenda

utilizar amostras para processamento microbiológico oriundas de rãs que

sobreviveram pelo menos oito horas após a colheita. As observações do citado

trabalho indicaram que os resultados da bacteriologia para este quadro clínico

não são de completa validade.

Apesar dessas considerações, os estudos microbiológicos revelaram a

constante presença de cocos Gram-positivos. À histopatologia, as quantidades

elevadas destas bactérias, formando verdadeiros aglomerados no parênquima

dos órgãos, indicam o papel fundamental das mesmas no quadro. É importante

ressaltar que estes microrganismos foram observados nos estágios prévios da

doença, em amostras obtidas de rãs sem sinais evidentes, assim como em rãs

com sintomatologia aguda (MAZZONI et al., dados não publicados). Isto sugere

que estas bactérias não pertencem aos invasores oportunistas. Esses cocos

foram detectados nos cortes de tecidos e nos esfregaços sanguíneos, podendo o

quadro ser nomeado de septicemia estreptocócica.

136

Quando os tecidos foram submetidos a análises bacteriológicas de

rotina, outras bactérias principalmente bastonetes Gram-negativos também foram

identificadas, mas provavelmente pertençam ao grupo de invasores secundários.

Septicemias por estreptococos ocorrem de forma esporádica ou

epizoótica em populações selvagens ou de criação em grande numero de

espécies aquáticas (ROMALDE et al., 2000; TORANZO et al., 2005).

Nas rãs, diversos autores (GLORIOSO et al., 1974; AMBROSKY et al.,

1983, GUIMARAES et al., 1988) obtiveram na bacteriologia, resultados

semelhantes aos do presente trabalho.

Mortalidades de anfíbios foram estudadas em relação a surtos na

natureza (CUNNINGHAM et al., 1996; BERGER et al., 1998; GREEN et al., 2002)

sendo identificados além de diversos grupos de bactérias, agentes virais e fungos.

No presente estudo, não foi possível incriminar esses patógenos como

responsáveis diretos pela mortalidade.

Os estreptococos potencialmente patogênicos podem ser albergados

de forma assintomática por animais normais e humanos. O número de bactérias é

limitado usualmente pelas defesas não específicas, requerendo a ação de fatores

desencadeantes para agir e produzir sintomas evidentes. Algumas espécies

chegam a produzir doenças quando estes mecanismos falham ou quando uma

cepa nova ou virulenta aparece (MITCHELL, 2003; IICAB, 2005).

As características do quadro clínico super agudo, de duração muito

curta desde o aparecimento dos sintomas até a morte, associadas aos achados

de necropsia e à histopatologia sugerem a ocorrência de um choque séptico,

devido à quantidade e distribuição generalizada dos microrganismos.

Quadros de choque foram observados em estágios terminais das

doenças septicêmicas nos anfíbios com iguais características clínicas às

assinaladas no presente estudo. (NACE, 1974).

Choque séptico ou síndrome de choque tóxico (TSS) é um quadro

amplamente conhecido no homem, caracterizado pelo rápido início da doença

com febre, hipotensão, vômitos, diarréia e eventualmente falha em múltiplos

órgãos (SALLES et al., 1999; WHITE, 2000; MULLER-ALOUF et al., 2001). É uma

condição muito grave e quase sempre fatal se não tratada de imediato, e ocorre

quando uma infecção generalizada determina diminuição do fluxo sanguíneo e

137

perda conseqüente da funcionalidade dos órgãos vitais. A síndrome acontece em

indivíduos imunologicamente comprometidos ou com doenças crônicas, e tem

como causa diversos microrganismos que liberam toxinas que danificam

diretamente os tecidos ou estimulam respostas inflamatórias exageradas.

Antecedentes de infecções urinárias, biliares ou do trato gastrintestinal são

também mencionadas como possíveis causas predisponentes (ENCICLOPEDIA

MEDICA EN ESPAÑOL, 2004; IICAB, 2005; THE MERCK VETERINARY

MANUAL, 2005). A presença de severas lesões hepáticas e renais nas rãs

estudadas corrobora com estas afirmações.

Apesar de a patogênese da síndrome não ser ainda bem conhecida, a

TSS é produzida por superantígenos pertencentes à família das toxinas

pirogênicas bacterianas, principalmente de Staphylococcus aureus e

Streptococcus pyogenes e outros estreptococos do grupo A (GAS) de Lancefield

(SCHLIEVERT, 1993). S. pyogenes e GAS foram considerados os produtores de

uma síndrome específica e diferente, chamada síndrome semelhante ao choque

tóxico [toxic shock like syndrome] (TSLS) com os mesmos sintomas, mas com a

adição de uma necrose severa dos tecidos (BOHACH et al., 1990; STEVENS,

1995). As causas do quadro são exotoxinas pirogênicas de três sorotipos (A, B e

C) e um superantígeno estreptocócico (SSA). Existe super estimulação dos

linfócitos T e das células apresentadoras de antígenos mediados pelas toxinas,

que determinam liberação de grandes quantidades de citocinas, desencadeando

uma cascata de respostas inflamatórias que leva ao aparecimento da síndrome

(SALLES et al., 1999; MULLER-ALOUF et al., 2001). O envolvimento de

bacteriófagos na difusão dos genes codificadores das toxinas produtoras de TSLS

têm sido também demonstrado (KAPUR et al., 1992).

As frações lipídicas dos lipopolisacarídeos da parede celular das

enterobactérias foram também incriminadas na origem da síndrome (THE MERCK

VETERINARY MANUAL, 2005). Porém, não foram detectadas quantidades

destes microrganismos que pudessem evidenciar o envolvimento deles como

causa principal do choque. Entretanto, o papel destas bactérias não pode ser

descartado totalmente.

Trabalhos desenvolvidos nas últimas décadas têm revelado que outros

germes estão também envolvidos na produção da síndrome. KORMAN et al.

138

(2004) observaram estes quadros de choque associados ao Streptococcus equi

subespécie. zooepidemicus pertencente ao grupo C de Lancefield. O

microorganismo não possui nenhum dos genes conhecidos como produtor de

super antígenos GAS, mas mostrou evidencias de sua produção. S. canis e S.

equi subespécie zooepidemicus têm sido isolados de cães com TSLS. Os

sintomas observados foram, entre outros, vômitos, estado de choque, debilidade

e depressão extremas, convulsões, dores intensas e hemorragias espontâneas

levando a epistaxe e a esputos sanguinolentos. Os suínos albergaram com

freqüência o S. suis, sem sintomas, mas cepas virulentas podem causar doenças

severas com sintomas de labirintite, otite média e interna que levam a disfunções

vestibulares, meningite com tremores, incordenação, convulsões e opistótomo.

O conjunto dos resultados obtidos permite-nos evidenciar a presença

de um quadro particular do tipo septicêmico e super agudo em rãs doentes.

O vírus do gênero Ranavirus foi descartado como produtor do quadro,

devido à ausência de resultados positivos na PCR, assim como na microscopia

eletrônica de transmissão. Foi também descartado o papel do fungo B.

dendrobatidis, pois não foi possível identificá-lo nos estudos realizados.

Os achados do presente trabalho indicam a presença de uma síndrome

semelhante ao TSS ou TSLS em rãs de criação, levantando a suspeita de que

este tipo de síndrome pode ser comum também em outras espécies empregadas

à aqüicultura. A observação de quadros de choque séptico em animais

pecilotérmicos reportada neste trabalho, requer novos estudos na procura de

maiores conhecimentos relacionados à patogênese e aos diversos mecanismos

envolvidos no aparecimento do quadro.

139

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144

CAPITULO 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS Foi caracterizada pela primeira vez em rãs de criação do Brasil, uma

doença específica que acomete girinos de até 30 dias de idade, cujo agente

etiológico é um vírus da Família Iridoviridae, gênero Ranavirus. Clinicamente foram

observados girinos com abdome aumentado de tamanho, com edemas e ascite,

assim como girinos finos ou emaciados. Revelaram lesão localizada principalmente

no fígado e nos rins, com destruição quase completa do parênquima. Nenhum

agente bacteriano pôde ser incriminado na etiologia da enfermidade. A presença

constante nos resultados da PCR de um vírus do gênero Ranavirus, associada aos

achados na histopatologia e na microscopia eletrônica de transmissão, confirmaram

o papel fundamental deste microrganismo nesta enfermidade.

Estudos de epidemiologia molecular realizados permitem incluir o vírus

detectado dentro do gênero Ranavirus. Observou-se homologia de quase 100%

nos setores do genoma estudado com aqueles do Frog Vírus 3, o que indica sua

possível introdução com as rãs importadas da América do Norte.

Foi identificado quadro específico em girinos na pré-metamorfose, no

qual o papel dos vírus não pôde ser determinado. Nesta fase, bactérias

oportunistas, principalmente cocos Gram-positivos foram encontradas em

associação às lesões. Estas predominam no fígado e rins, mas também alcançam

outros órgãos internos. A lesão é de tipo necrótico-degenerativo, com resposta

inflamatória predominantemente de linfócitos mononucleares e formação de

granulomas. O quadro é insidioso, apresentando-se com edemas, ascites e às

vezes úlceras na pele. A lesão estreptocócica coincide com os achados descritos

em criações de trutas, linguados, bagres, e tilapias.

Nas rãs, foi caracterizado quadro septicêmico com sintomatologia

inespecífica, cursando de forma super aguda, aguda ou crônica. Nas fases

agudas predominam sintomas como letargia, apatia, edemas e ascite sendo que,

às vezes, as rãs apresentam sintomas nervosos. À histopatologia e microbiologia

o quadro comporta-se de forma semelhante àquela observada nos girinos na pré-

metamorfose. A morte é conseqüência da septicemia associada ao

145

comprometimento funcional do fígado e rins, principalmente. Na fase crônica as

rãs apresentam-se emaciadas e com posturas anormais sugestivas de lesões

nervosas.

Não foi possível reproduzir a doença injetando as bactérias isoladas a

partir de animais com sintomas agudos, assim como não foi isolado de forma

constante e permanente um único microrganismo. Vírus e fungos não foram

associados aos surtos estudados.

A doença observada em girinos na pré-metamorfose e nas rãs, pode

ser considerada como uma “septicemia estreptocócica secundária”. As bactérias

cohabitam inicialmente os tecidos do animal, produzindo lesões sem

sintomatologia evidente. Fatores individuais influenciados seguramente pelas

condições ambientais e de manejo determinam a evolução a desenvolver-se em

cada animal. A presença de diversas espécies sem determinação de um

patógeno permanente ou constante indica o caráter secundário da infecção.

Porém, o papel dos cocos não pode ser descartado na evolução da doença e,

portanto, devem ser levados em conta nos planos de controle sanitário dos

ranários comerciais. Não foi possível, nas condições deste estudo, determinar a

causa primária que antecede a invasão dos tecidos pelos estreptococos. O papel

primário dos vírus detectados nas primeiras semanas de vida pode ter sido fator

desencadeante, favorecendo a invasão bacteriana observada em quadros de

animais mais velhos.

A síndrome denominada de “perna vermelha” não foi observada em

nenhuma das rãs estudadas. Os autores do presente estudo propõem a

eliminação da terminologia científica do termo “perna vermelha” ou “red leg”, por

considerá-lo fonte de confusão quanto à etiologia do surto, bem como por fazer

referência a evento que se apresenta em numerosas condições, associadas ou

não com agentes infecciosos.

Os achados do presente trabalho sugerem a presença de uma

síndrome semelhante ao choque séptico em rãs de criação, levantando a suspeita

de que esta entidade possa ser também comum em outras espécies empregadas

na aqüicultura.

Observações a campo indicam que a aplicação de medidas de

biossegurança básicas, comprovadamente imprescindíveis em outras criações

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com maior desenvolvimento revelaram-se efetivas. Um vazio sanitário de três

meses, seguido de medidas de desinfecção adequadas controlaram a doença no

ranário em estudo e também em outros ranários.

O fungo Batrachochytrium dendrobatidis, agente produtor da

chytridiomicose, não foi identificado nas rãs estudadas, não sendo, portanto

incriminado como responsável nos surtos estudados. Também não foram

observados outros fungos incriminados como causadores de doenças de anfíbios.