Gen©tica Molecular das Epiderm³lises Bolhosas* Molecular Genetics of Epidermolysis Bullosa
Introdução ao PCR Reação da Polimerase em Cadeia Outubro de 1985 (idéia em 1983) American...
Transcript of Introdução ao PCR Reação da Polimerase em Cadeia Outubro de 1985 (idéia em 1983) American...
Introdução ao PCR
• Reação da Polimerase em Cadeia
• Outubro de 1985 (idéia em 1983)• American Society of Human Genetics• criado por Kary B. Mullis
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/
Características do PCR
• Amplificação de Seqüências
• Processo Cíclico– 15 a 40 ciclos– realizado por mudança de
temperatura
Produção de DNA por PCR
• Produção de 2 a 4 g DNA em 1-3 hs• específico = amplifica sequência-alvo
na presença de DNA genômico• sensível = detecta até apenas 1
sequência de molde• flexível = muitas variações da técnica
básica de PCR
Requerimentos Básicos do PCR
1. Molde - DNA ou RNA2. DNA polimerase3. dNTPs4. Iniciadores de
Oligonucleotídeos (Primers)
Função dos Iniciadores Primers
• fornecer grupo 3’ OH para iniciação de síntese de DNA
• definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser amplificado
• estabelecer especificidade
Função dos Primers
Oligos IniciadoresPrimers
• sintetizados quimicamente• tipicamente entre 15 a 25 bases • define limites de alvo a amplificar
– prévio conhecimento da sequência alvo
– tradução reversa de uma sequência de PTN
– primer de seqüências aleatórias
Ciclos de Temperatura no PCR
Anelamentodo Primer Tm
Desnaturação Extensão
94oC do Primer
72oC
Desnaturação do DNA94 a 100oC
• desnaturar DNA alvo• desnaturar produtos de ciclos
prévios• 4 a 10 min de desnaturação inicial• duração de 30 s a 1 min
Anelamento do Primer40 a 70oC
• temperatura de “hibridização”• otimização da temperatura para
cada par de primer– composição = %G+C
Tm = 81.5 + 16.6(log10([M Na+])) + 0.41*(%GC) - 600/length
– determina especificidade do produto amplificado
• tipicamente 30 s a 2 min
Anelamento do Primer%G+C• Tm = 81,5o + 16,6 * (log10([M Na+])) + 0,41*(%GC) -
600/comprimento– [Na] em concentração Molar {PCR usa-se KCl}– %GC em percentual– comprimento em bases
• Primer3 - 600/length• GCG - 674/length
– formamida: subtrair 65*(% formamida)
• Primers > 10 bases em 0,05 M sal (PCR)Tm = 59,9 + 0.41*(%GC) - 675/comprimento
http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html
Extensão do Primer72oC
• Taq polimerase– faixa de atividade: 20oC a 85oC– atividade varia 100x nessa faixa
• Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do produto desejado
Exponencialidade do PCR
Caso ideal:
N = No 2n
• N = número de moléculas amplificadas
• No = número inicial de moléculas
• n = número de ciclos de amplificação
Amplificação Geométrica
Ciclo Número Fita Duplas produzidas 1 0 5 8 10 256 15 8.192 20 262.144
25 8.388.608 30 268.435.456
35 8.589.934.58940 274.877.906.800
PCR
Cinética do PCR
• Fase inicial (screening)– Primers procuram o DNA molde com
sequências complementares (como sondas)– Primers em considerável excesso.
• Fase exponencial– acúmulo exponencial do fragmento de DNA– várias cópias das sequências alvos
• Fase tardia ou plateau– amplificação já é sub-ótima
Efeito “Plateau”• Desvio do ideal teórico
– reassociação do produto compete com anelamento do primer
– polimerase torna-se limitante – perda de atividade
– acúmulo de inibidores da polimerase (pirofosfato)
– Limitação de outros componentes– Competição entre produtos– Pareamento produto x molde -
amplificação não específica
DNA molde
• número de cópiastipicamente 105 a 106 moléculas-alvo
Quantidade de DNA = equivalente a 3 x 105 cópiasFONTE Genoma Haplóide (pb) QuantidadeHumano 3 x 109 1 gLevedura 2 x 107 10 ngE.coli 4 x 106 1 ngplasmídeo 3 x 103 1 pg
DNA molde• Número de cópias• DNA genômico: 50 a 250 ng
– 1 g de DNA genômico humano = 3 X 105 moléculas de um gene único
• O mesmo número de moléculas está presente em:– 10 ng de DNA genômico de levedura– 1 ng de DNA genômico de E. coli– 1-2 pg de plasmídeo– 2 pg de bacteriofago
Taq DNA Polimerase
• Proteína de 94 kDa• Temperatura ótima: 75 a 80oC• Termoestabilidade limitada• Ausência de função de edição
sem exonuclease 3’ para 5’
Concentração de enzima = 1 a 2,5 U / 100 L
Efeito da Temperatura na Taxa de Síntese de DNA
Temperatura Taxa de Síntese(nucleotídeos /seg)
22oC 0,2537oC 1,555oC 2470oC > 6075oC > 150
Estabilidade da Taq sob Altas Temperaturas
Temperatura T 1/2 (minuto)
92,5oC 130 95,0oC 40 97,5oC 5
Frequência de Erro de DNA Polimerases Termoestáveis
Enzima Taxa de Mutaçãopor 10-6 inserções de
base
Taq 300Vent (NEB) 57
Fatores Promotoresda Fidelidade da Taq e
Especificidade dos Primers
• baixar a concentração de dNTPs (menos 200 M)
• concentração de Mg++ - inversa/
[Magnésio]
• Concentração de Mg2+ afeta:– anelamento dos primers– temperatura de desnaturação do DNA
molde e dos produtos amplificados• Especifidade da reação • Formação de dímeros de primers• Atividade e fidelidade da enzima
• Usualmente – inicia com 1,5 mM
Considerações na Seleção de Primers
• Especificidade: primer deve formar duplex estável no sítio alvo específico
• Primer não forma duplex estável com si próprio ou com o outro primer
• Primer não possui sítios falsos no DNA alvo
Estabilidade dos Primers
• Comprimento - número de bases• Relação GC/AT
• Temperatura de desnaturação Tm
– análises do vizinho mais próximo– energia livre de formação de duplex
Tm x GC%
Critérios para desenho de primers
• Composição de bases: – GC% = 40 a 60%– distribuição homogênea ao longo
do primer• Comprimento:
– 18 a 25 bases do primer complementar ao molde
– Ambos primers = mesmo comprimento (até 3 bases)
Critérios para desenho de primers
•Seqüências repetidas ou auto-complementares: – Sem repetições invertidas no primer
ou seqüências auto-complementares com + 3 bases seguida
•Complementaridade entre par de primers:– 3’ de primer não pode ligar a qualquer
ponto do outro primer – Primers presentes em alta concentração e
formação de híbridos com amplificação de dímeros de primers
- Temperatura de fusão:O Tm calculado dos dois membros do par de “primers” não deve diferir em mais que 5oC O Tm do produto amplificado não deve diferir dos valores de Tm dos “primers”em mais que 10oC.-
Temperatura de Separação de Duplexes de
DNA
Tm = 81,5 + 16,6 log [Na+] + 0,41 (%G + %C) - 0,65 (% formamida) - 675/comprimento - % erro de pareamento
http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html
Especificidade dos Primers
• Teoricamente 15 bases estabelecem especificidade
1/4 15 = 1,1 x 10 -9
• Famílias de genes relacionados• Duplicações• assume toda sequência do primer
envolvida seleção de sítio-alvo
Problemas comuns no Desenho de Primers
• Auto-complementariedade• Complementariedade entre
primers• Establidade térmica excessiva
Auto Complementariedade
• Formação de alça
GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT
HOTGACTTC Tm = 71oC
ACTGAA
Auto Complementariedade
• Formação de alça sem problema
GAACTACCTACGAAGATACTTCAGTOH
Tm = 24oC CTTC GAAG
Complementariedade entre Primers
• Formação de “primer dimer”
5’ GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH
5 ‘ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH
OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC
GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH
Excesso de Estabilidade Térmica em 3’OH
TTTACTTAGTCGGACGCGGC OH
CGCGGC OH
-------------GCGCCG--------------------Extremidade 3’ crucial = preferir 3’ como G ou C. Não recomendável que seja ...NNGG ou ...NNCC
-> gerar dímeros de primers
A extremidade 5’ não precisa ser complementar à seqüência alvo = permite adicionar seqüências com
propósitos específicos na extremidade 5’
- sítio para enzima de restrição, mais 3 a 4 bases adicionais- promotores para transcrição in vitro- promotores de seqüências consenso para inicío de tradução para transcrição e tradução in vitro
Para o cálculo do Tm considera-se apenas a região complementar à seqüência alvo.
Primers com sítios para enzimas de restrição:
Estabilidade Interna
• Melhores primers possuem terminal5’ estável e terminal 3’ instável– reduz pareamento falso
• Baixa estabilidade 3’ previne a formação de DNA duplexes que podem iniciar a síntese de DNA– terminal 5’ deve parear para formar
duplex estável
Mal-pareamento pré-PCR
• Causas:– DNA fita simples complexo na
amostra molde– mistura de reação completa incubada
a temperatura com atividade da Taq
• Solução - “Hot Start”
Prevenção de Mis-priming
PCR ConvencionalMix de reação completo
20 a 25 oCTransferir para termociclador
Ciclos
Produto amplificado
PCR “Hot Start”Mix de reação completo
20 a 25 oCTransferir para termociclador
desnaturação 100 oCmanter a 80 oC
Adicionar Taq polimerase
Ciclos
Produto amplificado
Enzimas para “Hot-Start”
• AmpliTaq Gold– enzima recombinante– forma inativada - ativação 10 min
94oC
• Platinum Taq Polymerase– ligação com inibidor termolábil
contendo anticorpo monoclonal
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
http://genomics.biotech.ufl.edu/~wgf/primer/index.htm
Parâmetros dos ciclos:
1. Temperatura e Tempo de desnaturação
• Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na PCR
• Tipicamente 94oC por 30 s
• Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima
Parâmetros dos ciclos:
2. Temperatura e Tempo de anelamento
• Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primers
• Tempo de anelamento = 15 a 30 s
• Tempo de extensão função tamanho do AMPLICON– 1 minuto é suficiente 1,2 kb– Longo reduz a meia vida da enzima
A Tm do produto amplificado não deve exceder ~85oC.
Temperatura de desnaturação em PCR é definida como a temperatura na qual há separação irreversível das fitas de uma população homogênea de moléculas.
A temperatura de separação irreversível das fitas é vários graus acima do Tm
(tipicamente, 92oC para DNA com 50% de G+C).
DNA Polimerases
Sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um primer pela
incorporação de NTPs na direção 5’ -> 3’ tendo como orientação a
informação contida na fita molde (template).
DNA Polimerases• As DNA polimerases normalmente
têm também atividade exonuclease
• 3’ -> 5’ = atividade proof reading
• 5’ -> 3’ = atividade corretiva – necessidade de remoção de um
segmento de DNA que está a frente da enzima
DNA Polimerases Termoestáveis
• Thermos aquaticus (Taq polymerase)– 1ª descoberta e + usada– Síntese 5’-> 3’ / Exonuclease 5’-> 3’
• Thermus thermophilus (rthpol) = similar à subunidade da DNA pol-III de E. coli. – rTth pol atividade de transcriptase reversa na
presença de Mn2+
• DNA polimerases adicionam base a mais na 3’ – > adição > [Mg2+] e de [enzima].– A base a mais adicionada é quase sempre A
DNA Polimerases Termoestáveis
Thermos aquaticus (Taq polymerase)
• Taxa de incorporação de bases erradas pode variar entre 10-3 a 10-6, dependendo das concentrações de Mg2+ e dNTPs
• A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da enzima com o DNA, favorecendo a interrupção da polimerização.
• Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dNTPs favorecem a extensão de primers com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch.
DNA Polimerases Termoestáveis
• Pyrococcus furiosus (Pfu) - com 2 subunidades codificadas por 2 genes de único operon– Forte atividade exonuclease 3’->5’
(atividade proof reading)
• Enzimas com atividade proof reading não adicionam A na extremidade 3’OH, independentemente do molde
DNA Polimerases Termoestáveis
Polimerases com função corretiva• Pyrococcus furiosus (Pfu)• Thermoccocus litoralis (Tli) Promega• Vent DNA polymerase = Tli
recombinante New England Biolabs– Atividade exonucleásica 3’-> 5’– Mais termoestáveis que a Taq – Meia vida de 6,7 h a 95oC)– Sintetizam fragmentos de até 13 kpb.
Variações de Taq polymerase
• AmpliTaq: Taq polimerase produzida em E. coli. Reprodutibilidade maior que enzima nativa [Applied Biosystems]
• AmpliTaq Gold: forma modificada da AmpliTaq fornecida em forma inativa. Requer aquecimento a 94-95 oC por 10 min para ser ativada
• Stoffel fragment: forma amputada da Taq sem 289 amino ácidos terminal N, sem atividade exonuclease 5’ --> 3’. Cerca de 2 vezes mais termoestável que a Taq [Applied Biosystems]
Variações de Taq polymerase
• Taq 2000 : Taq recombinate altamente purificada [Stratagene]
• AdvanTaq: sem amino ácidos N-terminais com maior termorresistência, melhor atividade em faixa ampla de [Mg] e maior afinidade pelo molde – uso concentração de DNA alvo muita baixa [Clontech]
• AGSGold DNA polymerase: maior capacidade de síntese de DNA (3 vezes mais produto que a Taq) [Hybaid]
PCR de longa distância• Mistura de enzimas = melhor que uma
única enzima para amplificar fragmentos longos– KlenTaq / Pfu (ex.: 160:1 a 640:1)– Taq / Pfu
Existem várias misturas disponíveis comercialmente• Elongase (Invitrogen)• Expand DNA Polymerase (Boehringer)• Advantage (Clontech)
Modelo de
funcionamento da
mistura de enzimas
Elongase (Invitrogen)
Taq/Pfu