1. INTRODUÇÃO

FBT/FCF/USP 2

1.1 Doença de Chagas

A Doença de Chagas é enfermidade endêmica de natureza parasitária que

afeta aproximadamente 20 milhões de pessoas na América Latina e sul dos Estados

Unidos. Este mal tem como conseqüências o comprometimento de órgãos e de

sistemas fisiológicos como o cardiovascular, o gastrintestinal e, em alguns casos,

neurológico dos pacientes que desenvolvem a doença (Urbina & Docampo, 2003;

Coura & Castro, 2002; Prata, 2001; WHO, 2000).

São estimados cerca de 20.000 a 50.000 casos fatais por ano em decorrência

do agravamento da doença (Otero et al., 2006; Vega-Teijido et al., 2006; Urbina &

Docampo, 2003; Gelb & Hol, 2002; Teixeira et al., 2002; Urbina, 2001, Araújo-Jorge &

Pirmez, 1999). Este panorama pode apresentar maior gravidade devido à ausência de

monitoramento eficaz, vigilância e obtenção de estimativas precisas em relação à

ocorrência da endemia na região amazônica (Rojas et al., 2005). A doença atinge

predominantemente populações pobres e habitantes de zonas rurais, o que torna o

indivíduo infectado marginalizado pela sociedade, com conseqüente exclusão social

(Lana & Tafuri, 2000; WHO, 2000). Este cenário resulta também em sobrecarga dos

sistemas de previdência e aumento nos gastos dos recursos destinados à saúde

pública (WHO, 2000).

A doença de Chagas tem como agente etiológico o Trypanosoma cruzi, que é

transmitido através do repasto sangüíneo do inseto triatomídeo denominado

vulgarmente de “Barbeiro”, e apresenta as fases aguda e crônica de infecção. As

outras formas de contaminação conhecidas são a transmissão congênita na fase fetal,

acidentes laboratoriais, transfusão sanguínea, transplante de órgãos infectados e

ingestão de alimentos contaminados. Atualmente, no Brasil, a via de infecção

transfusional encontra-se controlada devido a medidas de controle exercidas em

bancos de sangue (Funasa, 2005). A transmissão acidental em laboratório apresenta

baixos índices, uma vez que pode ser evitada por meio de treinamento dos

manipuladores do parasita e da adoção de medidas sanitárias preventivas. A infecção

por ingestão oral de alimentos contaminados com parasitas, onde o protozoário

atravessa as mucosas do trato gastrintestinal e vai para o sangue, é via de

contaminação importante e resulta em preocupação para os órgãos de Saúde Pública

(Rojas et al., 2005; Camandaroba et al., 2002, Hoft et al., 1996), haja vista a

ocorrência crescente de casos em todo o Brasil. Dentre estes casos, ressaltam-se

relatos de consumo de caldo de cana contaminado em Santa Catarina, em 2005, e de

açai no Pará, em 2005 (Informativos das Secretarias de Saúde de Santa Catarina e do

Pará, 2005).

FBT/FCF/USP 3

O ciclo de vida do parasita, Figura 1, encontra-se dividido em duas etapas que

ocorrem no hospedeiro invertebrado, o inseto, e em vertebrado, que pode ser o

homem e várias outras espécies de mamíferos. No inseto são encontradas três formas

do parasita, esferoamastigotas, epimastigotas e a tripomastigota metacíclica, sendo

esta a forma infectante presente no inseto. Após a ocorrência de infecção no mamífero

surgem as formas tripomastigota (fase aguda da doença), presente no sangue ou

interstício extracelular, e a amastigota, presente nas células e tecidos atingidos (fase

crônica da doença) (Lana & Tafuri, 2000, Araújo-Jorge & Pirmez, 1999).

Adicionalmente, a forma epimastigota foi também descoberta e documentada em

pequenas concentrações em humanos (Aguirre et al., 2006, Aguirre et al., 2004,

Almeida de Faria et al., 1999; Faucher et al., 1995) e pode apresentar importância no

processo de desenvolvimento da enfermidade.

Figura 1. Ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi. Adaptado de wikipedia:

http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Chagas_ciclo_de_doença, e sob

autorização de Center of Controul of Desease (www.dpd.cdc. gov/dpdx).

FBT/FCF/USP 4

Desde os primóridos da descoberta da Doença de Chagas por Carlos Chagas,

em 1909, os fatores de incidência e gravidade têm promovido a busca incessante de

agentes com atividade antichagásica eficaz e que possam promover a cura da

enfermidade (Castro et al., 2006). O objetivo da terapêutica antichagásica consiste em

suprimir a infecção ou mesmo impedir o desenvolvimento da doença e promover a

eliminação dos parasitas da corrente sangüínea e dos tecidos. Entretanto, os fármacos

disponíveis até o ano de 2006 no Brasil, o benznidazol, e na Argentina, o nifurtimox,

Figura 2, não satisfazem totalmente estes objetivos. Além de sua toxicidade (Castro et

al., 2006, Coura & Castro, 2002; Urbina, 2001; Cançado, 1999; Viodé et al., 1998;

Korolkovas & Burckhalter, 1988)são inespecíficos e não apresentam eficácia na forma

crônica da doença (Katzung, 2001; Lana & Tafuri, 2000).

Figura 2. Estrutura química dos fármacos atualmente empregados no tratamento da

Doença de Chagas.

A pesquisa de novas alternativas medicamentosas tem como base o

conhecimento da estrutura e dos processos metabólicos do Trypanosoma cruzi.

Estudos comparativos entre o metabolismo dos tripanossomas e os seus hospedeiros

mamíferos têm demonstrado a existência de alvos enzimáticos específicos para a

ação de novos compostos com atividade antichagásica, entre estes citam-se a

cruzipaína, a tripanotiona redutase, a fumarato redutase, a gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase, a esqualeno epoxidase e a trans-sialidase parasitária (Krauth-Siegel et

al., 2005; Krauth-Siegel & Inhoff, 2003; Coura & Castro, 2002).

Entre estes alvos, a tripanotiona redutase se apresenta em evidência por ser

responsável pelo mecanismo celular de detoxificação de radicais livres, vital ao

parasita, o que corrobora sua característica como alvo potencial para a ação dos

fármacos (Krauth-Siegel et al., 2005; Krauth-Siegel & Inhoff, 2003; Coura & Castro,

2002; Urbina, 2001; Blumenstiel et al., 1999; Viodé, et al., 1998; Krauth-Siegel et al.,

1995; Jockers-Scherübl et al., 1989; Henderson et al., 1988). Face a estes fatos,

vários autores procuraram obter e estudar compostos que possuíssem a habilidade de

N

S

ON

O

O2NN

N

O

N

O2N

Nifurtimox Benznidazol

O

FBT/FCF/USP 5

inibir a enzima ou induzir a ocorrência de estresse oxidativo, responsável pela

formação de radicais tóxicos ao parasita (Krauth-Siegel & Inhoff, 2003; Blumenstiel et

al., 1999; Viodé, et al., 1998; Henderson et al., 1988). Assim, por esta via, os

compostos 5-nitro-heterocíclicos, devido à característica de formação do radical nitro

ânion, interagem com o sistema tripanotiona redutase e seu substrato, sendo

considerados responsáveis pela atividade biológica. Deste modo, estes compostos se

apresentam como excelente escolha para o estudo e desenvolvimento de futuros

candidatos à fármacos antichagásicos.

1.2 Nitrocompostos

Os nitrocompostos surgiram como agentes terapêuticos na década de 40 e têm

sido empregados, até a atualidade, em diversas classes terapêuticas. Em seu amplo

espectro de atividade destacam-se as aplicações como antiparasitários,

antibacterianos, vasodilatadores, anti-hipertensivos, inseticidas, sedativos,

antipiréticos, analgésicos, antiinflamatórios e antineoplásicos, entre outras (Rang et al.,

2004; Raether & Hänel, 2003; Sweetman, 2002; Katzung, 2001; Tavares et al., 1999;

Tocher, 1997; Kovacic et al., 1989; Korolkovas & Burckhalter, 1988; Herlich &

Scweigel, 1976; Dodd & Stilman, 1944). O grupo nitro presente nestes compostos é

chamado parasitóforo , por ser indispensável à ação antiparasitária, principalmente,

quando ligado aos anéis furânico, tiofênico e imidazólico (Korolkovas & Burckhalter,

1988).

Entre os nitrocompostos identificam-se diversos derivados nitro-heterocíclicos

com atividade antichagásica que podem ser utilizados em estudos visando o

aperfeiçoamento do seu perfil antiparasitário (Aguirre et al. , 2005, Cerecetto et al.,

2000). Entre estes compostos, a nifuroxazida, 5-nitro-furfulideno 4-hidroxi-

benzidrazida, um antimicrobiano de amplo espectro, que também apresenta atividade

antichagásica (Blumenstiel et al., 1999), têm se apresentado como candidato potencial

à modificação estrutural em trabalhos que envolvem estudos de QSAR (Rando et al.,

2002; Tavares et al., 1999; Tavares et al., 1997; Tavares, 1993). Inseridos neste

conjunto, os derivados 5-nitro-furfulideno benzidrazidas e 5-nitro-tiofilideno

benzidrazidas com estrutura análoga à nifuroxazida, Figura 3, se apresentam como

compostos promissores na busca de novos fármacos antichagásicos, visando o

aperfeiçoamento de sua atividade biológica, assim como, a redução de seus efeitos

tóxicos.

FBT/FCF/USP 6

Figura 3. Estrutura química da nifuroxazida e de análogos antichagásicos potenciais.

1.3 Mecanismo de ação dos nitrocompostos

Estudos com derivados 5-nitrofurânicos demonstraram que o grupo nitro na

posição 5 do anel furânico é essencial para o estabelecimento da atividade biológica

(Remers & Bers, 1997). O mecanismo de ação antichagásica da maioria dos

nitrocompostos está ligado ao processo de biorredução do grupo nitro e a

subseqüente interação dos produtos, formados na redução, com biocompostos

essenciais do parasita (Viodé et al., 1998; Tocher, 1997; Edwards, 1993; Edwards,

1990; Declerck & De Ranter, 1986).

De acordo com o mecanismo de ação, Figura 4, há evidências que a formação

do radical nitro ânion, em reação envolvendo um elétron, demonstrado pelo par Ar-

NO2/Ar-NO2-, é intermediário-chave no processo de redução e está envolvido na ação

antichagásica dos 5-nitro-heterocíclicos (Viodé et al., 1998). Neste caso, devido à

ocorrência de redução, a partir dos nitrocompostos, é possível avaliar a

interdependência entre o processo de tranferência eletrônica, de um agente redutor

para o grupo nitro, e a atividade biológica. Ressalta-se que o registro do valor

numérico da transferência eletrônica caracterizada por reação de oxi-redução é

considerado como o potencial de redução do grupo nitro. Desse modo, a determinação

do potencial redox, E0, ou até mesmo, do potencial catódico, Epc, gerado a partir da

redução do grupo nitro, permite avaliar a influência da redução desta classe de

compostos em sua atividade antichagásica. Adicionalmente, pode-se considerar o

potencial de redução do grupo nitro como sendo uma forma de quantificar a eficácia

farmacológica destes compostos.

Observa-se que os produtos ou demais intermediários formados a partir da

reação de redução destes fármacos também podem apresentar danos às enzimas e

ao DNA de bactérias e de parasitas como o Trypanosoma cruzi (Teixeira et al., 2002;

de Castro et al., 1999; Viodé et al., 1998; Hardman et al., 1996). Ainda assim,

considera-se o processo de redução dos nitrocompostos e a formação do par Ar-

NO2/Ar-NO2- como etapa fundamental para a atividade biológica observada.

OO

N N

NO2

H

HOH

Nifuroxazida

XO

N N

NO2

Y

H

H

Y = Grupos substituintesX = (O) furfulidenos, (S) tiofilidenos

7

SOD e TR representam as enzimas superóxido dismutase e tripanotiona redutase

presentes no Trypanossoma cruzi. TS2 é o produto da ação da tripanotiona

redutase sobre seu substrato T(SH)2.

Figura 4. Rotas de biorredução anaeróbia e aeróbia de nitrocompostos

aromáticos, e os intermediários, formados em reações

subseqüentes, ativos frente ao Trypanosoma cruzi e a

bactérias. Adaptado de Viodé et. al., 1998 e Edwards, 1993.

O2●-

Rota aeróbica

Superóxido

dismutase

(S.O.D.)

2 H + + e-

Fé 2+

H2O2

(enzimas

bacterianas)

Fé 3+

OH●+ OH-

espécies reativas tóxicas

Interage com

o substrato da

Tripnotiona

redutase

H2O + ½ O2

(T. R.)

T(SH)2 TS2

Ar-NO2●-

Rota anaeróbica

Ar●+ NO2- (nitrito)2H +

Protonação

Ar-NO2H - danos ao DNA

Ar-NO2

Ar-NO2H

1 e-

Ar-NO(derivado nitroso)

2 H + + 2 e-

2 H + + 2 e-

2 H + + 2 e-

(hidroxilamina) (azoxi composto)

(amino derivado) (azo derivado)

Ar-NHOH Ar-NHNH-Ar

Ar-NH2 Ar-N=N-Ar + H2O Ar-N=N-Ar (O)

- aceptor de grupos tióis

Rota aeróbica

Rota anaeróbica

Flavina

Ciclo

Fútil

Flavina H2

Membrana

Plasmática

O2O2●-

Ar-NO2 Ar-NO2 Ar-NO2●-

NADP+ NADPH

(1 e -)

FBT/FCF/USP 8

A Figura 4 apresenta também o processo de redução de 5-nitro-heterocíclicos

em duas condições distintas, na presença e ausência de oxigênio no meio intracelular.

Em meio aeróbio o radical nitro ânion gerado no processo de redução interage com o

oxigênio presente no meio, em uma etapa metabólica denominada ciclo fútil, formando

o radical O2-. Este radical sofre ação da enzima superóxido dismutase, SOD,

formando espécies como o peróxido de hidrogênio, H2O2 que podem desestruturar

membranas biológicas. O peróxido formado reage com enzimas ferrodoxinas liberando

espécies reativas tóxicas (OH-) às células bacterianas e parasitárias (Chauviére et al.,

2003; Viodé et al., 1998; Tocher, 1997; Edwards, 1993). Verifica-se, assim, que o

processo de redução além de apresentar dependência da estrutura do nitrocomposto,

também sofre influência do oxigênio presente e do meio envolvido na reação de

redução. A Figura 4 ilustra o mecanismo de biorredução de compostos 5-nitro-

heterocíclicos.

Suspeita-se que o processo de redução dos nitrocompostos resulta em inibição

da tripanotiona redutase (Krauth-Siegel et al., 2005; Blumenstiel et al., 1999). Por outro

lado, a redução do grupo nitro resulta em formação de produto eletrofílico que

promove a oxidação da ligação dissulfeto do substrato tripanotiona reduzido, (TS2), e a

subseqüênte formação de substrato oxidado, T(SH)2. Este processo inibe a formação

do substrato biologicamente ativo da tripanotiona redutase, a partir da biomolécula

T(SH2), o que torna o parasita deficiente em suas defesas enzimáticas contra espécies

reativas de oxigênio (Chauviére et al., 2003; Viodé et al., 1998; Hardman et al., 1996

Henderson et al., 1988).

Na via metabólica anaeróbia o radical aniônico formado na primeira etapa do

processo de redução é transformado em derivado nitroso (Ar-NO), que se apresenta

como um eficiente ligante de grupos tióis biomoleculares essenciais às enzimas e às

células. A partir desta etapa, podem ocorrer outras reações de redução, onde o

derivado nitroso gera o intermediário hidroxilamina (Ar-NHOH) e, posteriormente, sob

a ação de agentes redutores, este último é reduzido ao derivado amínico (Ar-NH2). A

reação de formação dos intermediários Ar-NO, Ar-NHOH e Ar-NH2 em ambiente

anaeróbio envolvem a transferência de dois, quatro e seis elétrons, respectivamente

(Julião et al., 2005; Chauviére et al., 2003; Viodé et al., 1998; Squella et al., 1996;

Edwards, 1993; Monteagudo et al., 1992).

A ativação biológica através do processo de biorredução de nitrocompostos

apresenta-se como ponto importante à pesquisa e ao aperfeiçoamento da atividade

biológica desta classe de compostos. Nesta linha de raciocínio, Rozenski et al. em

1995, conseguiram relacionar a ação antibacteriana com o potencial de redução de

FBT/FCF/USP 9

alguns nitrocompostos, comprovando que a atividade biológica é decorrente da

redução do grupo nitro. Paralelamente, diversos estudos sobre o mecanismo de

biorredução do grupo nitro e determinação do potencial de redução por meio de

técnicas eletroquímicas foram realizados, sendo possível, deste modo, conhecer os

intermediários formados e estimar, para cada um destes, a influência sobre a atividade

biológica (Maya et al., 1997; Edwards, 1990; Declerck & De Ranter, 1986).

Estudos polarográficos e voltamétricos (Julião et al., 2005; Bollo et al., 2003;

Karakus & Zuman, 1995; Nüñes-Vergara et al., 1995; Monteagudo et al., 1992;

Morales et al., 1987) foram também utilizados com o objetivo de elucidar o mecanismo

de redução e investigar a sua semelhança com o caminho metabólico envolvido na

biorredução dos compostos nitrofurânicos. Ainda neste contexto, Squella et al. em

1996 demonstrou que o radical nitro ânion gerado eletroquimicamente a partir da

nifuroxazida pareceu ser mais estável em relação aos radicais nitro ânions formados a

partir de outros compostos, entre estes, o nitrofural, o nifurtimox e a furazolidona.

Deste modo, a partir destas informações foi possível considerar que o processo de

biotransformação da nifuroxazida, caracterizada pela redução do grupo nitro e a

formação do correspondente radical nitro ânion, aliado à sua estabilidade, é a etapa

chave para o desempenho da atividade antichagásica (Blumenstiel et al., 1999) e

antimicrobiana (Squella et al., 1996; Edwards, 1993).

Paulino et al., em 2002, ao estudarem compostos bioisósteros nitrofurânicos e

nitrotiofênicos, avaliaram a possibilidade destes compostos atuarem como inibidores

de ligação da enzima tripanotiona redutase do Trypanosoma cruzi com o seu

substrato. Os nitrocompostos foram submetidos a metodologias computacionais, que

simularam a interação do fármaco com o seu receptor, buscando atividade

antiparasitária, entre estas, a antichagásica. Esses autores, em concordância com a

literatura (Blumenstiel et al., 1999; Viodé et al., 1998), descreveram a formação de

radical nitro ânion e também do superóxido a partir dos nitrocompostos como principal

mecanismo de ação antichagásica. Nestes casos sugere-se que algum produto de

redução do grupo nitro in vivo atue como inibidor da tripanotiona redutase, cuja

integridade é fundamental à sobrevivência do parasita.

1.4 Determinação do potencial de redução dos nitrocompostos

Técnicas eletroquímicas têm sido utilizadas para caracterizar o comportamento

redox de moléculas de interesse biológico. Segundo Brajter-Toth et al., 1981, este

processo se deve à constatação experimental de que as reações de transferência de

carga, promovidas em uma interface eletrizada (eletrodo/solução), conduzem a

FBT/FCF/USP 10

intermediários reativos e/ou produtos finais, os quais são os mesmos produzidos por

sistemas biológicos como, por exemplo, os sistemas enzimáticos (Serrano et al., 2006;

Serrano & Gil, 2005; Abreu et al., 2002; Brajter-Toth et al., 1981). Estas técnicas

apresentam rapidez e alta sensibilidade na detecção de espécies eletroativas

orgânicas presentes ou provenientes dos sistemas biológicos (Sapel’nikova et al.,

2001). Inserido neste contexto, as técnicas voltamétricas se apresentam como

ferramenta versátil para simular processos farmacológicos, bioquímicos e/ou

toxicológicos envolvendo mecanismos de transferência eletrônica e estresse oxidativo

(Bollo et al., 2003, Abreu et al., 2002).

O potencial de redução do grupo nitro depende da natureza e posição dos

substituintes presentes na molécula. De acordo com a possível relação entre a

atividade antichagásica dos derivados dos 5-nitro-heterocíclicos e o potencial de

redução, associados à reação Ar-NO2 + 1e- Ar-NO2-, as técnicas voltamétricas

têm sido propostas como método de escolha para medida do potencial de redução e

monitoramento de novos nitrocompostos a serem empregados como potenciais

agentes antichagásicos (Squella et al., 2005; Bollo et al., 2003; Paulino et al., 2002).

Neste aspecto, os dados sobre o potencial de redução fornecidos devem ser

acompanhados das seguintes informações especiais: método eletroquímico utilizado

para sua determinação (voltametria cíclica e/ou de onda quadrada, por exemplo), o

tipo de eletrodo de trabalho empregado e as condições utilizadas durante o processo

experimental, o eletrólito de suporte e o meio de reação (aquoso, misto ou aprótico).

As técnicas eletroquímicas (voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada)

podem ser utilizadas em conjunto visando à complementação dos resultados obtidos,

podendo também, em alguns casos, ser comparadas. Tais técnicas envolvem a

aplicação de perturbação de potencial a um eletrodo, denominado eletrodo de

trabalho, de modo a promover reações de oxidação ou redução na interface

eletrodo/solução. Desse modo, o eletrodo pode ser visto como substituto dos agentes

oxidantes e redutores comumente empregados em solução (Serrano & Gil, 2005;

Harris, 2001; Brett & Brett, 1993; Bard & Falker, 1980). A diferença principal é que em

solução tem-se uma reação homogênea de transferência de elétrons, enquanto na

superfície do eletrodo a reação de transferência de carga é heterogênea (fase sólida e

solução).

O experimento voltamétrico é realizado em uma célula que contém o

nitrocomposto na presença de um eletrólito inerte em solução e envolve, além do

emprego do eletrodo de trabalho, o eletrodo de referência e o eletrodo auxiliar. O

potencial do eletrodo de trabalho é monitorado contra o eletrodo de referência, mas a

FBT/FCF/USP 11

corrente determinada no experimento é produzida pela reação de transferência de

carga flui entre o eletrodo de trabalho e o eletrodo auxiliar (Serrano & Gil, 2005; Brett &

Brett, 1993). O eletrodo de gota de mercúrio ainda é o eletrodo de trabalho mais

utilizado em voltametria (Squella et al., 2005; Bollo et al., 2003; Wang, 2000; La-Scalea

et al., 1998; Squella, et al., 1996; Rozenski, et al., 1995; Morales et al., 1987). Todavia,

devido ao uso limitado em regiões negativas de potencial e conseqüências ambientais

do emprego do mercúrio, este está sendo substituído por outros tipos de eletrodo,

como os eletrodos de carbono vítreo, de pasta de carbono ou diamante dopado com

boro, que além de evitar a contaminação ambiental permitem estudar os processos

eletroquímicos na região positiva de potencial (Serrano et al., 2006; Serrano & Gil,

2005; Wang, 2000).

O carbono apresenta como vantagens a ampla faixa de potencial (cerca de

+1,5 a -1,3 V vs ECS dependendo do meio de reação), além de ser

eletroquimicamente inerte, apresentar resultados reprodutíveis, na ausência de efeitos

de adsorção, e ser de baixo custo (Wang, 2000). Neste contexto, ressalta-se que o

eletrodo de trabalho constituído de carbono se aplica, principalmente, no estudo do

comportamento de reações redox de nitrocompostos, uma vez que permite a detecção

de intermediários formados no processo de redução em uma faixa de potencial ampla,

onde o carbono vítreo atua.

Nos últimos anos inúmeros relatos do processo de redução de nitrocompostos

envolvendo técnicas eletroquímicas têm sido descritos na literatura (Julião et al., 2006;

Julião et al., 2005, Squella et al., 2005; Mandal, 2004; Pedrosa, et al., 2003; Bollo et

al., 2003; La-Scalea et al., 1998; Paulino et al., 2002; Radi, 1999; Buchberger et al.,

1998; Monteagudo, et al., 1992; Morales et al., 1987), ressaltando o emprego de

voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada.

1.4.1 Voltametria cíclica

A voltametria cíclica é técnica versátil de varredura de potencial que tem sido

amplamente utilizada para obter informações sobre reações eletroquímicas a partir do

registro de curvas corrente-potencial. Esta técnica consiste em aplicação de potencial

que varia continuamente com o tempo. Este processo resulta, assim, no registro das

reações eletroquímicas existentes. A voltametria cíclica possibilita a determinação do

potencial redox de espécies eletroativas, a elucidação da cinética das reações de

eletrodo e a avaliação da influência do meio de reação sobre o processo redox

(Serrano & Gil, 2005; Harris, 2001; Wang, 2000; Brett & Brett, 1993).

Na voltametria cíclica, a corrente produzida durante o processo eletroquímico é

obtida a partir da aplicação de uma onda ou rampa triangular de potencial ao eletrodo

FBT/FCF/USP 12

de trabalho, sempre mantido no estado estacionário, Figura 5 A, (Brett & Brett, 1993;

Bard & Falker, 1980). A varredura é iniciada em um dado valor de potencial

denominado de potencial inicial, Ei. A escolha do potencial inicial é realizada em

função da ausência de corrente faradaica (corrente devida a oxidação ou redução do

composto), ou seja, em determinado potencial onde não é detectada ou produzida

variação na estrutura do composto estudado. A partir da escolha de Ei, o potencial é

variado no sentido positivo ou negativo até um determinado valor, denominado de

potencial de inversão de varredura, E, onde, após este ponto, a varredura é invertida

até atingir o potencial de partida. Desse modo, uma corrente de oxidação ou redução é

produzida e registrada como função do potencial aplicado, tanto na varredura direta

quanto na varredura reversa, em uma ilustração denominada voltamograma cíclico,

apresentada na Figura 5 B (Harris, 2001; Wang, 2000; Brett & Brett, 1993).

Em que Ei é o potencial inicial de varredura, Eé o potencial de inversão, Ef é o potencial final,

e +E é o sinal que demostra a ocorrência de varredura no sentido positivo de potencial.

Figura 5. Onda triangular de potencial aplicado ao eletrodo de trabalho (A), expressão

gráfica da corrente vs potencial característica da Voltametria cíclica (B).

A voltametria cíclica é aplicada a sistemas em repouso para garantir que a

espécie de interesse chegue à superfície do eletrodo por meio de processo

exclusivamente difusional (Brett & Brett, 1993; Bard & Falkner, 1980), com exceção de

espécies que são oxidadas ou reduzidas a partir do estado adsorvido. Deste modo, a

partir da difusão das espécies eletroativas, ocorre a geração de uma camada de

difusão na interface eletrodo-solução, o que permite a interação destas espécies com

a superfície do eletrodo de trabalho e a sua detecção, no instante em que se realiza o

experimento. Neste contexto, observa-se que a resposta obtida para determinados

+E Oxidação

Ef

E

EiCorrente

Potencial

Ei

E

Ef

Tempo

(-) 10

Potencial

A B

Redução

FBT/FCF/USP 13

processos redox, caracterizado pela detecção de picos catódicos e/ou anódicos,

depende da concentração da espécie eletroativa em solução (Harris, 2001; Brett &

Brett, 1993).

Esta técnica é normalmente empregada para caracterizar a velocidade da

reação, de transferência de carga para a formação do radical nitro ânion, e seu tempo

de meia vida (parâmetros cinéticos). Adicionalmente, a voltametria cíclica é também

utilizada para estudar a reversibilidade do processo eletródico, ou seja, se o processo

é reversível, quasi-reversível ou irreversível, e avaliar a influência do meio reacional

sobre estes parâmetros, bem como sobre a ocorrência e estabilidade dos radicais e

intermediários formados pela redução de espécies eletroativas como os

nitrocompostos (Harris, 2001; Nunes-Vergara et al., 2001; Squella et al., 1996; Brett &

Brett, 1993; Morales et al., 1987). Entre os diversos trabalhos descritos na literatura

que descrevem o emprego voltametria cíclica no estudo da redução de

nitrocompostos, destaca-se o trabalho de Arguelho et al., em 2001, que estudaram a

redução do benzidazol em meio aprótico (DMSO e eletrólito de suporte Bu4NBF4) e

velocidade de varredura de 500 mV s-1, empregando-se os eletrodo de trabalho de

carbono vítreo, eletrodo de auxiliar de platina e eletrodo de referência de calomelano

saturado. Os autores obtiveram o potencial de redução do nitrofurfurilideno,

característico para o par reversível Ar-NO2/Ar-NO2-, de -1,03 V.

A voltametria cíclica não é a técnica mais recomendável para determinações

analíticas, devido a menor sensibilidade em comparação a outras técnicas

voltamétricas, sendo facilmente superada pela voltametria de pulso diferencial e de

onda quadrada. Apesar disso, o ponto forte da voltametria cíclica é a sua grande

versatilidade para a elucidação de processos de eletrodos e mecanismos de reação

(Brett & Brett, 1993; Olmstead et al., 1969).

1.4.2 Voltametria de onda quadrada

A voltametria de onda quadrada, empregada em análise quantitativa, é mais

rápida e sensível quando comparadas a outras técnicas voltamétricas. Esta técnica

consiste na aplicação de pulsos de potencial ao eletrodo de trabalho de modo a gerar

uma perturbação na forma de onda quadrada simétrica de potencial. A resposta obtida

possui a forma de degraus e é sobreposta a uma rampa linear crescente de potencial

(Souza et al., 2003; Osteryoung & Osteryoung, 1985).

Nesta técnica voltamétrica, independente do sentido da varredura, a corrente é

lida em instantes anteriores à aplicação do pulso e alguns segundos antes do término

do pulso, o que resulta em corrente determinada a partir da diferença entre os valores

FBT/FCF/USP 14

obtidos nos dois pontos, Figura 6. O processo de amostragem de corrente, também

realizado para a voltametria de pulso diferencial, apresenta a vantagem de eliminar a

corrente capacitiva, considerada a corrente de fundo não faradaíca, e a partir desta

característica a técnica se torna mais sensível. A partir da aplicação destes pulsos

pode ocorrer uma resposta catódica e outra anódica correspondente à reação redox,

de caráter reversível ou quasi-reversível, ou mesmo catódica ou anódica, dependendo

do sentido da varredura de potencial, quando a reação apresenta caráter de

irreversibilidade (Zelié, 2005; Souza et al., 2003; Lovric, 2000; Wang, 2000; Komorski-

Lovric & Lovirc, 1995; Brett & Brett, 1993; Osteryoung & Osteryoung, 1985).

Figura 6. Seqüência de pulsos (1-4) característica para a voltametria de onda

quadrada aplicados em determinado período de tempo. Corrente

amostrada é sempre i2 – i1. Adaptado de Brett & Brett, 1993.

Na caracterização eletroquímica de compostos nitro-heterocíclicos, os pulsos

catódicos e anódicos conduzem à formação do radical nitro ânion a partir do nitro

composto (redução) e re-oxidação do nitro anion ao respectivo nitrocomposto quando

o processo apresentar reação reversível, Ar-NO2 + 1e- Ar-NO2-. Assim, as

correntes catódica e anódica são registradas e submetidas, quando expressas em

forma gráfica, versus o potencial aplicado na rampa linear, resultando em

voltamograma consistindo de dois picos, sendo um de redução e outro de oxidação.

Alternativamente, pode-se plotar a diferença entre as correntes anódica e a

catódica como função da rampa linear de potencial. Neste caso, como as correntes

possuem sinais opostos, os picos se sobrepõem gerando um sinal maior de corrente,

Potencial

Tempo

Amplitude

Leitura do pulso direto

Leitura do pulso reverso

Degrau de Potencial

1

2

34

i1

i2

i1

i2

I

I

I

I

I

I

FBT/FCF/USP 15

denominada de resultante, Figura 7, [corrente catódica (-) + anódica (+)]

responsável pela maior sensibilidade da técnica quando aplicada a sistemas

reversíveis (Zelié, 2006; Souza et al., 2003; Harris, 2001). Por outro lado, pode ser

observada, também, a ausência de pico de oxidação, o que caracteriza a ocorrência

de reação irreversível, característica para a reação de redução do nitrocomposto ao

derivado hidroxilamina, Ar-NO2 + 4e- Ar-NO2H, em determinados meios de

reação.

Figura 7. Voltamograma de onda quadrada que demonstra a ocorrência de pulsos

direto (corrente catódica), reverso (corrente anódica) e a corrente

resultante. Adaptado de Brett & Brett, 1993.

Neste sistema voltamétrico, são identificadas, normalmente, algumas

características desejáveis para a detecção e quantificação de espécies eletroativas de

vida curta como o nitro ânion radical. Do mesmo modo como descrito para outros

sistemas voltamétricos, a quantificação de espécies eletroativas, que possibilita o

desenvolvimento de metodologia analítica, decorre do fato da corrente de pico ser

proporcional à concentração de analito. Outras particularidades importantes desta

técnica são: a possibilidade do emprego de amplitude ótima de pulso, a qual é

aplicada em cerca de 50/n mV (onde n é o número de elétrons envolvidos na reação

redox) e a utilização de valores de freqüência (Hz) de 1 a 100 ciclos por segundo, o

que permite o uso de velocidades de varredura da voltametria de onda quadrada

extremamente rápidas. Ressalta-se que esta característica resulta em menor tempo

para a realização dos experimentos, menor consumo de espécies eletroativas,

Potencial

Pulso reverso

Pulso diretoCorrenteResultante

Corrente

POTENCIAL

CORRENTE

FBT/FCF/USP 16

redução de bloqueamento da superfície do eletrodo e ainda proporciona menor

interferência de O2 em análises de amostras degaseificadas (Zelié, 2006; Souza et al.,

2003; Harris, 2001; Wang, 2000; Brett & Brett, 1993; Osteryung & Osteryung, 1985).

1.5 Modelagem Molecular

A busca de fatores que possam influenciar a redução do nitrocomposto ou,

precisamente, apresentar influência sobre o potencial de redução, está relacionada

com a obtenção de subsídios que permitam o entendimento mais aprofundado do

mecanismo de atividade biológica destes compostos. Tal processo permite, também, o

conhecimento de informações estruturais e de propriedades físico-químicas relevantes

que possam ser utilizadas para o planejamento e obtenção de novos nitrocompostos

com atividade antichagásica.

A aplicação de métodos de desenvolvimento de fármacos fundamentados em

informações estruturais e de propriedades físico-químicas se apresenta como

alternativa viável na busca de novos agentes com atividade farmacológica

aproveitável, com vantagens relativas à redução do tempo necessário à obtenção e

identificação de novos possíveis fármacos. Entre estes métodos, a modificação

estrutural de compostos bioativos efetuada por meio de estudos de química

computacional, precisamente, a modelagem molecular, se mostra como ferramenta

extremamente promissora (Carvalho al., 2003; Barreiro et al., 1997).

A modelagem molecular de compostos bioativos, como os nitrocompostos,

consiste em conjunto de ferramentas computacionais que são utilizadas na

compreensão de fatores estruturais de uma ou conjunto de moléculas, do mecanismo

de ação e, também, para a obtenção de dados e informações necessárias para o

estudo das relações entre estrutura química e a atividade biológica (Barreiro et al.,

1997; Höltje et al., 1997; Rozenski et al., 1997; Foye et al., 1995).

Entre os elementos perceptíveis nos estudos de modelagem molecular, alguns

podem ser ressaltados, como a flexibilidade e o arranjo conformacional preferencial,

propriedades estéreo-eletrônicas e valores de energia livre (G) e cargas que

influenciam a interação fármaco-receptor (Barreiro et al., 1997; Höltje et al., 1997).

A maioria das moléculas bioativas apresenta algum grau de liberdade

conformacional, sendo que o arranjo conformacional estável destas moléculas pode

mudar de acordo com fatores relacionados ao ambiente onde estas se encontram

(Patrick, 2001; Höltje et al., 1997). A conformação das moléculas de derivados 5-nitro-

heterocíclicos é resultante da presença de diferentes grupos funcionais em sua

FBT/FCF/USP 17

estrutura química, sendo que estes grupos exercem influência direta e indireta sobre

as características físicas e químicas, de caráter estrutural e eletrônico, da molécula.

Entre estas características estruturais estão a torsão angular, o volume e distâncias

intramoleculares, além da conformação de menor energia mínima. As características

eletrônicas se concentram em ocorrência de efeito indutivo e mesomérico, cargas dos

átomos, valores de energia livre, de HOMO (highest unuccopied molecular orbital) e de

LUMO (lowest occupied molecular orbital), da molécula (Höltje et al., 1997; Foye et al.,

1995).

Segundo Silva, em 2003, a conformação molecular é determinada através de

técnicas de modelagem molecular que analisam a flexibilidade e o arranjo espacial

não idêntico em uma dada molécula e o mesmo é resultante de rotações em torno de

uma ou mais ligações monovalentes.

A análise conformacional envolve métodos computacionais de mecânica

quântica e é dependente de fatores como ângulo das ligações, energia torsional,

distância de duplas ligações e barreiras de energia de rotação interna da molécula

(Silva, 2003; Höltje et al., 1997). Cada conformação calculada e obtida apresenta

valores de energia termodinâmica singulares, onde a estrutura que apresentar menor

valor de energia é considerada aquela de maior estabilidade no ambiente estudado.

Desse modo, algumas características estruturais consideradas importantes para a

atividade biológica como a torsão angular, volume e distância intramoleculares, são

normalmente determinados a partir da conformação de menor energia mínima obtida

pela avaliação conformacional realizada (Monastérios et al., 2005).

Outra aplicação determinante da modelagem molecular envolve o estudo de

características eletrônicas de compostos bioativos potenciais. Neste sentido, ressalta-

se que os valores de energia das propriedades eletrônicas são importantes para a

compreensão dos processos que envolvem e regem a interação fármaco-receptor e a

ação farmacológica. Como já citadas anteriormente, as propriedades eletrônicas

abrangem a densidade eletrônica e efeito mesomérico, cargas dos átomos, valores

termodinâmicos de energia livre, valores de energia dos orbitais de HOMO e LUMO da

molécula.

A análise dos valores de energia dos orbitais de HOMO e de LUMO

possibilitam a avaliação e até a quantificação de propriedades eletrônicas importantes

para o entendimento da reatividade da molécula e, do mesmo modo, desempenho de

sua bioatividade. A diferença entre os valores de HOMO e de LUMO provém

informações sobre a reatividade da molécula, em intervalo de energia chamado banda

de valência ou bandgap (Galeazzi et al., 2003; Freitas et al., 2002; Karelson et al.,

1996). Quanto menor os valores de bandgap maior será a reatividade da molécula

FBT/FCF/USP 18

estudada. Outras duas propriedades obtidas de acordo com os valores de energia de

HOMO e de LUMO são a dureza química () e o potencial químico () da molécula,

que são ferramentas importantes para o entendimento da estabilidade de diferentes

confôrmeros em um sistema molecular.

A dureza química, , calculada segundo a equação = (LUMO – HOMO)/2, é

uma medida da resistência da nuvem eletrônica molecular sofrer deformações

permanentes a partir de sua conformação original, e está diretamente relacionada com

a força de ligação dos átomos. (Pasha et al., 2005; Freitas et al., 2002; Thanikaivelan

et al., 2000; Karelson et al., 1996). Adicionalmente, a dureza química indica se a

molécula tem facilidade ou resistência à adaptação em determinadas reações

químicas ou até mesmo a sítios de interação fármaco-receptor.

O potencial químico, , representa a contribuição por mol de determinado

componente de uma mistura ou solução à energia livre total de determinado sistema

(Florence e Attwood, 2003; Netz e Ortega, 2002). Esta é uma propriedade relevante

em sistemas onde ocorre transferência de massa e energia, tais como reações

químicas radicalares, como as que ocorrem nos nitrocompostos, ou mesmo a

interação entre fármaco e receptor, e é calculada através da equação = - (HOMO +

LUMO)/2 (Pasha et al., 2005; Anadan et al., 2003; Thanicaivelan et al., 2000). Neste

sentido, aplicando o conceito do potencial químico, esta propriedade permite saber a

contribuição dos valores de energia do composto para a energia total do sistema

responsável pelo desencadeamento da atividade biológica.

Outras propriedades eletrônicas obtidas a partir dos valores numéricos da

energia dos orbitais HOMO e LUMO, como a afinidade eletrônica, AE, e o potencial de

ionização, PI, são calculados conforme o Teorema de Koopman (Pasha et al., 2005;

Anadan et al., 2004; Thanikaivelan et al., 2000). Este teorema, uma aproximação

matemática da teoria de orbital molecular, direciona ao emprego da primeira energia

de ionização da molécula à energia de HOMO, determinando o potencial de ionização

como valor negativo de HOMO. Neste mesmo processo, o conceito físico de potencial

de ionização é considerado como a energia requerida para formar um cátion ou ânion

em um processo de ionização (Thanikaivelan et al., 2000).

Do mesmo modo como descrito para o orbital LUMO, a afinidade eletrônica

reflete a capacidade de determinado ligante aceitar um elétron de um composto

doador (Anadan et al., 2003;Thanikaivelan et al., 2000). Segundo o Teorema de

Koopman, a partir dos valores numéricos de LUMO e de HOMO é possível definir os

valores de afinidade eletrônica, calculada por AE = - ELUMO, e dos potenciais de

ionização, calculados através da equação Ip = - EHOMO.

FBT/FCF/USP 19

Diante do exposto, observa-se que o emprego de metodologias de modelagem

molecular permite gerar conhecimento, sobre fatores estruturais e propriedades

eletrônicas, fundamental para o estudo de moléculas bioativas. Desta forma, tais

metodologias se apresentam como ferramenta relevante no processo de planejamento

e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.

1.6 Ensaios de suscetibilidade antichagásica

Os ensaios de suscetibilidade antichagásica são utilizados para avaliar a

bioatividade de fármacos antichagásicos frente a cepas de linhagens diferentes do

agente causador da doença de Chagas. Estes ensaios são também utilizados para

avaliar a atividade antiparasitária de novos compostos com potencial atividade

antichagásica. Segundo Coura, em 2003, centenas de compostos candidatos a

agentes tripanomicidas já foram testadas frente ao Trypanosoma cruzi em infecções

experimentais utilizando animais de laboratório, sendo poucos ensaiados no homem, e

a maioria destes com resultados de baixa eficácia (Coura, 2003; Coura & Castro,

2002).

A avaliação da suscetibilidade antichagásica pode ser realizada por meio de

ensaios in vivo e in vitro e os fatores de eficiência do teste podem ser comprovados a

partir do efeito antiproliferativo (inibição de crescimento parasitário) ou com o emprego

de parâmetros usuais em estudos farmacológicos como IC50, DL50, DE50 e MIC

(Dantas et al., 2006; Rosseli et al., 2005; Millet et al., 2002; Yardley e Croft, 1999;

Liendo et al., 1998). Ainda neste sentido, a atividade antichagásica pode ser

investigada através do emprego dos ensaios de inibição de enzimas específicas do

parasita, como a tripanotiona redutase, a fumarato redutase e a cruzipaína (Aguirre et

al., 2004; Paulino et al., 2002; Ifa et al., 2000; Blumenstiel et al., 1999; Bonnet et al.,

1997). Estes ensaios refletem a seletividade de compostos bioativos frente a alvos

específicos do parasita.

Os testes realizados para o estudo da infecção in vivo, estabelecidos

inicialmente por Carlos Chagas (Araújo-Jorge & de Castro, 1999), são realizados

atualmente através do emprego de diversos modelos experimentais. Entre os mais

utilizados, citam-se a avaliação da influência da administração de substâncias

bioativas sobre a parasitemia em coelhos, hamsters, cães, macacos e ratos (Araújo-

Jorge & de Castro, 1999). Os ensaios realizados em camundongos se encontram em

evidência em relação aos demais e são frequentemente utilizados nas análises de

suscetibilidade antichagásica (Araújo-Jorge & de Castro, 1999).

FBT/FCF/USP 20

Os ensaios da suscetibilidade do parasita in vitro envolvem o cultivo celular do

tripanossoma em meios de cultura apropiados como o LIT, liver infusion tryptose, o

BHI, brain-hearth infusion, ou o NNN, Nicolle McNeal & Novy, juntamente com o

composto sob análise em temperatura de 26 a 28 oC (Rodrigues et al., 2001; Araújo-

Jorge & Pirmez, 1999; Barbosa, 1999; Liendo et al., 1998).

Os protocolos de realização dos ensaios apresentam diferenças em relação à

forma evolutiva do parasita, que pode ser epimastigota, tripomastigota ou amastigota.

Quando são utilizadas as formas tripomastigota e amastigota é possível correlacionar

os resultados obtidos com a atividade antichagásica em anima mobile, uma vez que

estas formas que estão presentes em pacientes portadores do parasita. Entre os

muitos exemplos descritos na literatura que corroboram o emprego destas formas

parsitárias, destaca-se o trabalho de Chung et al., em 2003, que avaliou a atividade de

um derivado hidroximetilado do nitrofural e registrou a atividade antichagásica frente à

forma tripomastigota do parasita.

O ensaio da atividade antichagásica in vitro frente à forma epimastigota do

parasita encontra-se bem estabelecido na literatura (Muelas-Serrano et al., 2002a,b;

Liendo et al., 1998). Embora a forma epimastigota do tripanossoma não seja

usualmente encontrada no organismo humano, existem relatos de que a mesma se

encontra presente em células de mamíferos parasitados (Arán et al., 2005; Tyler e

Engman, 2001; Faucher et. al., 1999; Almeida de Faria et al., 1999). Desse modo, o

emprego do ensaio de suscetibilidade usando a forma epimastigota fornece resultados

passíveis de serem empregados em análise da atividade antichagásica in vivo.

Adicionalmente, estes resultados podem ser extrapolados para avaliações

farmacológicas mais próximas as observadas em infestações humanas,

especificamente frente às formas amastigota e tripamastigota.

Os resultados dos ensaios in vitro, no entanto, são fortemente dependentes

dos métodos de avaliação de crescimento ou inibição de proliferação parasitária,

normalmente realizada através da contagem do número de parasitas em câmara de

Neubauer. Este é o método mais difundido em pesquisa, sendo sua aplicação e

validade comprovadas através dos vários trabalhos descritos na literatura (De

Carvalho et al., 2005; Muelas-Serrano et al., 2002b; Liendo et al., 1998). Entre os

estudos de relevância destaca-se o trabalho de Liendo et al., em 1998, que avaliou o

efeito anti-proliferativo de derivados bis-triazole frente a forma epimastigota cultivada

em meio LIT. Estes ensaios envolveram a inibição de crescimento da cultura de

parasitas através de leituras realizadas tanto por meio de contagem em câmera de

Neubauer, como através de avaliação da densidade celular em contador de partículas

FBT/FCF/USP 21

eletrônicas. Os compostos estudados apresentaram concentração inibitória mínima de

1 a 3 M L-1 após incubação por 120 horas.

Outros métodos de leitura do número de células parasitárias bem

sedimentados por diversos grupos de pesquisa são a espectrofotometria UV/visível

(Pozas et al., 2005, Muelas-Serrano et al., 2000), microscopia de densidade ótica

eletrônica (Santa-Rita et al., 2005; Muelas-Serrano et al., 2002a) e análise de

citometria de fluxo (Villarreal et al., 2004; Vergnes et al., 2002). Neste contexto,

Gómez-Barrio et al. em 2006 avaliaram a atividade de derivados homoalilaminas frente

a forma epimastigota do parasita incubada em meio LIT e mantida em placas de

ELISA. Neste ensaio de microdiluição a leitura do número de células viáveis foi

realizada após 96 horas de incubação com o emprego de espectrofotômetro

UV/visível, 595 nm, e tratamento prévio da amostra com cristais do corante formazan e

de sulfato dodecil sódico (SDS). Os resultados deste ensaio indicaram que a maioria

dos compostos testados, em concentração de 10 g mL-1, não apresentaram atividade

antichagásica.

Alguns pesquisadores como Aguirre et. al., 2006 e Aran et al., 2005

empregaram o meio BHI para o cultivo e crescimento de cepas epimastigotas com

posterior aplicação em ensaios de suscetibilidade antichagásica utilizando leitura em

UV, 600 nm. Este meio de cultura apresenta coloração verde clara o que facilita a

leitura e detecção do crescimento celular por meio de espectrofotometria UV/visível.

Pozas et al. em 2005, estudaram análogos do nifurtimox e avaliaram a

suscetibilidade destes com testes frente a forma epimastigota cultivada em meio LIT,

com leitura feita em UV/visível, 580 nm. Embora os compostos tenham apresentado

atividade menor que o protótipo, este trabalho indicou a possibilidade de leitura por

espectrofotometria do crescimento celular do parasita em meio LIT sem tratamento

prévio da cultura. Neste sentido, em outro estudo, De Carvalho et al., avaliaram a

atividade antichagásica in vitro do ácido usnico extraído da Cladonia substellata e

realizaram leituras diretamente em meio LIT através de UV/visível, 580 nm (De

Carvalho et al., 2005). Este composto apresentou efeito inibitório sobre o crescimento

parasitário quando incubado em concentrações inferiores a 30-50 g mL-1 pelo período

de 24 horas.

Os resultados dos ensaios realizados por Pozas et al. em 2005 e De Carvalho

et al., 2005 descritos acima, realizados em meio LIT com leitura em espectrofotômetro

UV/visível, foram comparados com os valores obtidos através do emprego da câmera

de Neubauer com a finalidade de validação dos mesmos. Estes estudos comprovam a

possibilidade do emprego da metodologia de UV/visível na leitura do número de

FBT/FCF/USP 22

parasitas em meio LIT. Ressalta-se, no entanto, que embora existam vários métodos

de detecção de células parasitárias que podem ser aplicados nos ensaios de

suscetibilidade do tripanossoma aos compostos estudados, o emprego da câmera de

Neubauer ainda é o método de referência para a realização deste estudo, sendo

utilizado, muitas vezes, em paralelo com as outras análises.

1.7 Relações quantitativas entre estrutura-atividade biológica/Relações

quantitativas entre estrutura-propriedade

A resposta biológica provocada por um composto bioativo ocorre por meio de

interações ligante-biomacromolécula alvo e depende da sua estrutura química e de

propriedades físico-químicas intrínsecas. Estas propriedades podem ser de caráter

molecular ou atômico e expressam características de efeito eletrônico, reatividade,

forma, lipofilicidade, estabilidade e polaridade da molécula, entre outras.

Neste aspecto, a realização de modificações na estrutura de um fármaco

resulta em alterações em suas propriedades físico-químicas e, assim, em sua

absorção, biodisponibilidade, interação com o receptor biológico e na sua

correspondente bioatividade (Tavares, 2004; Montanari et al., 2002; Katzung, 2001;

Barreiro & Fraga, 2001; Hardman et al., 1996; Kubinyi, 1995).

As propriedades físico-químicas, principalmente no âmbito do desenvolvimento

de novos agentes terapêuticos, podem ser utilizadas para classificar e quantificar as

contribuições da estrutura química sobre a atividade biológica. Para melhor

entendimento, as propriedades físico-químicas de compostos bioativos, como a

hidrofobicidade, os efeitos eletrônicos e efeito estérico, são geralmente expressas por

meio de parâmetros ou descritores estruturais. Neste contexto, o conhecimento de

valores numéricos de cada descritor estrutural permite estimar a contribuição, de maior

ou menor intensidade, de tais propriedades sobre a atividade biológica (Tavares, 2004;

Cronin & Shultz, 2003; Kubinyi, 1993).

A avaliação da magnitude da influência das propriedades moleculares sobre

determinado efeito bioativo é realizada por meio do estudo das relações quantitativas

estrutura-atividade biológica, QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship). Já a

avaliação da interação entre as propriedades físico-químicas é realizada por meio da

análise das relações quantitativas estrutura-propriedade, QSPR (Quantitative

Structure-Property Relationship).

As análises de QSAR e QSPR ocorrem por meio da obtenção de modelos

matemáticos que envolvem descritores estruturais e/ou variáveis indicadoras

característicos de uma série de compostos com estrutura química análoga. Estas

FBT/FCF/USP 23

análises são aplicadas para a investigação da ocorrência de correlação entre

determinado descritor com outras propriedades físico-químicas ou ainda com a

atividade biológica estudada (He & Jurs, 2005; Verma & Hansch, 2005; Tavares, 2004;

Eriksson et al., 2003; Davis, 1997; Gaudio, 1996; Kubinyi, 1995; Martin, 1981). Desse

modo, a partir do conhecimento das relações entre as características moleculares e a

atividade biológica, propõe-se o emprego destas informações no planejamento, busca

e identificação de fármacos que apresentem melhor perfil farmacológico.

A idéia de que a atividade biológica depende da estrutura química de um

determinado composto surgiu através dos estudos de Crum-Brown & Fraser, em 1868

(Gaudio, 1996). Estes autores registraram que a paralisia desempenhada por uma

série de derivados da estriquinina ocorre em função da estrutura molecular destes

compostos, e pode ser expressa através da relação abaixo (Eq. 1).

Atividade Biológica = (constituição da molécula) (Eq. 1)

Meyer, em 1899, e Overton, em 1901, concluíram, independentemente, que o

efeito narcótico apresentado por diversos compostos não ionizados era dependente do

coeficiente de partição clorofórmio-água e que a atividade narcótica observada

possuia correlação linear com o aumento do coeficiente de partição.

Hammett em 1937, descreveu por meio de equação matemática a ocorrência

de relações lineares de energia livre para diferentes reatividades de compostos

orgânicos aromáticos. Esta equação foi construída avaliando-se a relação linear entre

a constante eletrônica sigma de Hammett () e os valores de energia livre de cada

composto testado. Hammett foi o primeiro autor a utilizar uma constante de

substituinte para descrever uma propriedade estrutural (Gaudio, 1996; Hammett 1937).

Hansch & Fujita em 1964, estudando uma série de derivados de ácido

fenoxiacéticos concluíram que modelos matemáticos lineares obtidos a partir de

estudos de QSAR, que combinavam parâmetros físico-químicos múltiplos relativos aos

efeitos eletrônicos, hidrofobicidade e estereoquímica, eram fundamentais para

descrever a atividade biológica. Neste estudo, os autores apresentaram a formulação

do descritor estrutural da hidrofobicidade () para grupos substituintes e o seu

emprego em equações multiparamétricas que descrevem a resposta biológica em

função de suas propriedades físico-químicas. Este estudo, combinado com a aplicação

de regressão múltipla, permitiu identificar as relações entre a atividade biológica e

FBT/FCF/USP 24

estrutura química de compostos bioativos, expressas por propriedades físico-químicas

de compostos análogos (Tavares, 2004; Ferreira, 2002; Leo & Hansch, 1995; Hansch

& Fujita, 1964).

Nesta mesma linha de trabalho, em estudos posteriores de QSAR, envolvendo

os fenômenos de transporte e distribuição de fármacos em sistemas biológicos,

Hansch & Clayton, em 1973, descreveram que a hidrofobicidade apresenta relação

não linear com a atividade biológica. Estes autores sugeriram que para um conjunto de

compostos análogos, cada componente deste apresenta um dado valor para a

hidrofobicidade e, dependendo de sua estrutura química, esta poderia influenciar a

atividade biológica de maneira positiva (crescente) ou negativa (decrescente).

Especificamente, neste trabalho foram efetuadas correções matemáticas junto ao

modelo linear, resultando na formulação do modelo parabólico, onde moléculas com

hidrofobicidade diminuída ou mesmo muito acentuadas apresentavam atividade

biológica reduzida ou nula (Tavares, 2004; Gáudio, 1996; Kubinyi, 1995; Leo &

Hansch, 1995; Kubinyi, 1993). Esta análise fundamenta-se na idéia de que um

fármaco deve apresentar valor de hidrofobicidade ótimo para conseguir transpor as

membranas biológicas e interagir com o sítio receptor (biomacromolécula alvo)

resultando na resposta farmacológica. Ainda neste aspecto, Kubinyi, em 1977, em

estudos que descreviam a existência de relações não lineares entre a hidrofobicidade

e a atividade biológica, formulou o modelo bilinear, o qual permitiu um ajuste

matemático do modelo parabólico proposto por Hansch (Kubinyi, 1995, Kubinyi, 1993;

Kubinyi, 1977).

Outro marco observado durante o desenvolvimento dos métodos de QSAR foi

o surgimento e o emprego da abordagem de QSAR em três dimensões (QSAR 3D).

Esta abordagem possibilita determinar a conformação ativa e, muitas vezes, as

interações do fármaco com o receptor, as quais não são visualizadas durante a

aplicação dos modelos matemáticos propostos por Hansch. Os estudos de QSAR 3D

foram, inicialmente, utilizados para mapear a superfície tridimencional dos receptores

farmacológicos através de resultados obtidos por meio da aplicação da Análise de

Hansch (Kubinyi, 1997; Kubinyi, 1993).

Cramer et al. em 1988, desenvolveram o método de QSAR 3D denominado

Análise Comparativa de Campos Moleculares (CoMFA), o qual permite descrever as

interações ligante-receptor considerando a conformação bioativa e as propriedades

físico-químicas de interações eletrostáticas e hidrofóbicas destes ligantes (Kubinyi,

1995; Kubinyi, 1993;Cramer et al., 1988). Entre outras abordagens, destaca-se a

metodologia que utiliza o aplicativo denominado VolSurf, que é amplamente utilizado

em pesquisa e desenvolvimento de fármacos. Esta metodologia fundamenta-se na

FBT/FCF/USP 25

obtenção de modelos matemáticos constituídos de valores de descritores físico-

químicos extraídos a partir de mapas de interação molecular (em 3D) e a subseqüente

correlação dos mesmos com a atividade biológica de interesse (Cruciani et al., 2000).

O desenvolvimento dos estudos de QSAR ao longo do século XX e seus

progressos permitiram não só o conhecimento das relações entre a estrutura química

e a atividade biológica de compostos bioativos, como também a definição dos

descritores estruturais que expressam as propriedades físico-químicas que influenciam

a atividade biológica destes compostos. As abordagens utilizadas em estudos de

QSAR, propostas inicialmente por Hammett, em 1937, e em seguida por Hansch &

Fujita, em 1964, juntamente com análise de QSAR 3D, se apresentam como

ferramentas poderosas e complementares, que permitem obter, com maior

abrangência, subsídios fundamentais para a identificação e desenvolvimento de novos

agentes terapêuticos.

1.7.1 Descritores estruturais

Os descritores estruturais são medidas que expressam de maneira quali e

quantitativa as propriedades físico-químicas de uma determinada estrutura química.

Estes são frequentemente utilizados para estabelecer correlações entre as

propriedades físico-químicas e a atividade biológica desempenhada por compostos

bioativos (Tavares, 2004; Cronin & Schultz, 2003; Grover et al., 2000; Kubinyi, 1997).

1.7.1.1 Descritores estruturais que expressam os efeitos eletrônicos

A distribuição eletrônica de determinada molécula é constituída da somatória

dos efeitos eletrônicos de cada grupo ou átomo que forma a estrutura química

molecular. As contribuições diversas de cada porção ou características que compõe o

efeito eletrônico, quando mensuráveis, são expressas por meio de descritores

estruturais característicos.

Existem diversos descritores estruturais propostos para descrever os efeitos

eletrônicos, entre os mais utilizados citam-se a constante de Hammett (), as

constantes de Swain e Lupton para os efeitos de campo e ressonância ( e ),

respectivamente, parâmetros derivados de espectroscopia molecular, como freqüência

de absorção no IV (), e deslocamento químico em espectros de RMN 1H e 13C (), e a

constante de ionização (Ka) (Kubinyi, 1995; Jurs et al., 1995; Kubinyi, 1993; Swain &

Lupton, 1968). Outros descritores têm sido utilizados em escala crescente para

expressar as diferentes contribuições moleculares sobre o efeito eletrônico, entre

estes cita-se a variação no momento dipolar e os parâmetros derivados da química

quântica como as energias dos orbitais moleculares, HOMO e LUMO, energia de

FBT/FCF/USP 26

formação (Hf), potencial químico (), afinidade eletrônica (AE), entre outros. (Cheng

& Yuan, 2006; Gensmantel, 1997; Kubinyi, 1995; Jurs et al., 1995; Kubinyi, 1993).

Constante de Hammett

Hammett em 1937, estudou a reatividade do ácido benzóico em água a

25 oC e verificou a existência de relação linear entre o logaritmo da constante de

ionização do ácido benzóico não substituído e o logaritmo da constante de ionização

do ácido benzóico substituído. O sistema químico estudado por Hammett está

representado na Figura 8.

Figura 8. Reação de ionização de ácidos benzóicos.

O autor deste estudo concluiu que a presença de grupos substituintes ligados

ao ácido benzóico em posição para ou meta exercem influência, por meio do efeito

eletrônico, de maneira a facilitar ou dificultar a ionização destas moléculas. A partir

deste experimento foi formulada uma equação que relaciona a constante de ionização

do ácido benzóico não substituído e dos derivados do ácido benzóico substituído (Eq.

2). A partir desta equação observou-se o isolamento do efeito atribuído

exclusivamente ao grupo substituinte, representado por (sigma de Hammett).

= log KX – log KH (Eq. 2)

Em que:

KX e KH, são valores das constantes de ionização para o composto substituído enão substituído, respectivamente;é a constante que mede a influência do efeito eletrônico do grupo substituintesobre a reação de ionização.

A partir do emprego da equação 2 foi possível determinar o valor da constante

de Hammett para diversos grupos substituintes. Com isso, o autor verificou que a

ionização, medida através da constante de ionização das moléculas empregadas

COOH

X

COO-

X

KX

+ H+

FBT/FCF/USP 27

neste trabalho, poderia ser utilizada para estimar o efeito eletrônico de sistemas

similares ao estudado.

A partir da transformação matemática da equação 2, Hammett sugeriu a

formulação da equação 3, onde o autor atribuiu os valores das constantes do ácido

não substituído como zero (H = 0), e do ácido benzóico substituído R como valor

numérico maior ou menor que zero. Neste sentido, os derivados que apresentam

grupos doadores ou aceptores de elétrons ligados ao ácido benzóico possuem valores

de negativos ou positivos, respectivamente.

log KX = + log KH (Eq. 3)

Em que:

KX e KH, são valores das constantes de ionização para o composto substituído enão substituído, respectivamente;é o coeficiente angular da equação e indica a susceptibilidade da ocorrência areação do grupo substituinte;é a constante que mede a influência do efeito eletrônico do grupo substituintesobre a distribuição eletrônica da molécula.

A equação de Hammett é preditiva no sentido de que o conhecimento da

constante eletrônica possibilita a estimativa da reatividade de um composto. A

constante de Hammett obtida a partir do modelo proposto (Eq. 3) possui caráter

aditivo e é característica de cada grupo substituinte, sendo também conhecida como

constante de grupo. Além disso, é independente da reação envolvida ou mesmo da

molécula (ácido benzóico substituído) em que este grupo está ligado e sofre influência

da posição que o substituinte ocupa na molécula (meta ou para) (Tavares, 2004;

Gaudio em 1996; Hansch & Leo, 1995; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch et al.,

1991; Hammett, 1937).

Taft, em 1956, observou que o emprego da equação de Hammett não se

aplicava adequadamente ao estudo de moléculas alifáticas e aromáticas com

presença de grupo substituinte em posição orto (Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch

et al., 1991; Taft,1956). Neste aspecto, Taft & Lewis, em 1959, realizaram análises

detalhadas da equação de Hammett e propuseram a formulação de derivações desta

(Eq. 4 e 5), em que a constante de Hammett foi dividida individualmente em efeito

indutivo e de ressonância, I e R, respectivamente (Taft & Lewis, 1959).

O emprego destas equações permitiu conhecer e quantificar a influência do

efeito eletrônico de grupos substituintes presentes nas posições para e também em

FBT/FCF/USP 28

meta (m e P), sobre a molécula de compostos aromáticos (Kubinyi, 1995; Kubinyi,

1993; Hansch et al., 1991; Taft & Lewis, 1959; Taft, 1956). Todas estas derivações da

equação de Hammett são apresentadas nas equações 4 e 5.

P = I + R (Eq. 4)

m= I + R (Eq. 5)

Em que:P e m são valores da constante de Hammett para substituintes na posição

para e meta no anel benzênico, respectivamente;I e R são valores da contribuição para os efeitos indutivo e de ressonância,

respectivamente;é o fator de correção para o efeito de ressonância a partir da posição meta.

O trabalho de Taft & Lewis permitiu também a dissociação do efeito polar em

suas componentes de efeito indutivo e de ressonância em uma mesma relação. Esta é

empregada quando a equação de Hammett original não fornece boa correlação ou

quando se pretende conhecer a contribuição de cada um dos efeitos isoladamente

(Tavares, 2004; Hansch & Leo, 1995; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch et al.,

1991; Taft, 1959). A equação que permite a obtenção dos valores isolados das

propriedades físico-químicos ficou conhecida como equação de Hammett extendida,

Eq. 5.

log KX = II + RR + log KH (Eq. 6)

Em que:KX é a constante de ionização do composto substituído;KH é a constante de ionização do composto não substituído;I e R são os coeficientes angulares da equação de Hammett relativos aos

efeitos indutivo e de ressonância, respectivamente;I e R são as contribuições dos efeitos indutivo e de ressonância,respectivamente.

Similarmente ao trabalho de Taft & Lewis, Swain & Lupton, em 1968,

propuseram a separação do efeito eletrônico de grupos substituintes em efeitos de

campo e de ressonância representados por e , respectivamente. Estes descritores

estruturais foram posteriormente redimensionados por Hansch, em 1976, o que

FBT/FCF/USP 29

redefiniu a forma de obtenção e o emprego dos valores correspondentes a estes

descritores (Hansch & Leo, 1995; Kubinyi, 1993; Van de Waterbeend, 1992; Hansch et

al., 1991).

Correlação de Hammett-Zuman

A correlação de Hammett-Zuman é um procedimento criado por Zuman com a

finalidade de avaliar com maior profundidade a influência do efeito eletrônico sobre o

potencial de redução de espécies eletroativas (Macías-Ruvalcaba et al., 2002). Esta

relação foi definida como uma aproximação matemática da equação linear de

Hammett, em que se busca correlacionar o descritor a alguns parâmetros obtidos a

partir de técnicas eletroquímicas (Eq. 7), entre estes o potencial e redução e o

potencial de meia onda (E1/2).

Segundo Bautista-Martinez et al., 2003, o emprego correlação de Hammett-

Zuman permite a investigação detalhada da influência de grupos aceptores ou

doadores de elétrons sobre determinados sistemas moleculares. A partir da diferença

entre os valores de E1/2 do composto não substituído e dos derivados substituídos (Eq.

8) obtém-se os valores que podem ser correlacionados ao sigma de Hammett.

Além disso, tal correlação é empregada quando se supõe que existam reações

químicas acopladas ao processo de transferência de elétrons. Ressalta-se que este

procedimento permite avaliar a ocorrência de correlação linear, ou até não linear, do

descritor sigma de Hammett com o potencial de meia onda, obtido a partir da redução

de derivados eletroativos (Macías-Ruvalcaba et al., 2002; Cosimeli et al., 2001). O

descritor de Hammett tende a apresentar correlação com o potencial de redução ou

potencial de meia onda E1/2, calculado por meio da equação 7 e 8.

E1/2 = Iπx (Eq. 7)

E1/2 = E1/2X - E1/2H (Eq. 8)

Em que:E1/2H e E1/2X correspondem aos valores dos potenciais de meia onda do

composto eletroativo não substituído e substituído, respectivamente;Iπ é o coeficiente angular da correlação de Hammett-Zuman;x é a constante que mede a influência do efeito eletrônico do grupo

substituinte sobre o E1/2.

FBT/FCF/USP 30

1.7.1.2 Descritores estruturais que expressam hidrofobicidade

A hidrofobicidade é a propriedade físico-química que desperta maior interesse

nos estudos de QSAR. Este fato ocorre porque a hidrofobicidade regula tanto a

solubilidade de fármacos, como os processos de absorção, distribuição nos diversos

compartimentos biológicos, tempo de meia-vida e excreção (Katzung, 2001; Hansch et

al., 1990). Em conseqüência, sugere-se que a hidrofobicidade interfere na habilidade

do fármaco de ação específica em atingir e ligar-se ao sítio receptor, interação em que

é responsável pela resposta farmacológica e influencia a intensidade da atividade

biológica (Patrick, 2001; Katzung, 2001).

A compreensão destes processos envolve o conhecimento da estrutura, função

e propriedades das membranas biológicas e engloba, também, as propriedades físico-

químicas como grau de ionização, em função do pH, e lipofilicidade relativa das formas

neutra e ionizada das moléculas estudadas (Tavares, 2004; Barreiro & Fraga, 2001).

Os fármacos são, em sua maioria, ácidos ou bases fracas, e quando presentes

em solução se apresentam em situação de equilíbrio químico entre a forma não

ionizada (dissociada ou neutra) e forma ionizada molecular. A forma neutra é

geralmente mais lipossolúvel e se difunde através das membranas biológicas por

processo passivo, o qual ocorre em função do gradiente de concentração do sistema,

do coeficiente de partição e do volume molecular. A forma ionizada, no entanto,

somente é absorvida através de transporte ativo que é grandemente influenciado pelo

pKa do composto e pH do meio biológico (Tavares, 2004; Barreiro & Fraga, 2001;

Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993).

Entre os descritores estruturais que expressam a hidrofobicidade destacam-se

o coeficiente de partição (log P), a constante de Hansch e a constante de Rekker

(Manhold et al., 1998; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch & Fujita, 1964).

Coeficiente de Partição

O coeficiente de partição (log P) pode ser definido como a razão entre as

concentrações, em condições de equilíbrio, de um composto dissolvido em sistema

bifásico cosntituído por uma fase aquosa e uma fase orgânica (Kubinyi, 1993). Este é

um dos descritores estruturais mais utilizados em estudos de QSAR e sua

determinação fidedigna é fundamental para a compreensão do mecanismo de ação e

planejamento de novos fármacos. Neste sentido, o sistema 1-octanol/ tampão fosfato

pH 7,4 é considerado o sistema de escolha para a determinação do coeficiente de

partição de moléculas para a aplicação em estudos de QSAR (Tavares, 2004; Hansch

& Leo, 1995; Kubinyi, 1993; Leo & Hansch, 1971).

FBT/FCF/USP 31

As vantagens do emprego do 1-octanol como fase orgânica, em relação a

outros sistemas utilizados para a determinação do coeficiente de partição, são:

constiui solvente quimicamente estável; apresenta grupo hidroxila com capacidade de

formar ligações de hidrogênio com grande variedade de grupos polares de diferentes

soluções; tem capacidade de dissolução de muitos compostos orgânicos; as ligações

de hidrogênio da molécula solvatada não necessitam ser quebradas durante a

transferência da fase orgânica para a fase aquosa; e não é volátil em temperatura

ambiente. Embora imiscível em água, o 1-octanol tem capacidade para dissolver até

2,3 mol L-1 de água sob condições de equilíbrio (Tavares, 2004; Kubinyi, 1995;

Kubinyi, 1993). Outra característica importante do solvente 1-octanol é a possibilidade

de medição direta na região do UV, uma vez que este não absorve na faixa do

espectro de UV onde a maioria dos fármacos absorve (Tavares, 2004; Kubinyi, 1993).

A determinação do coeficiente de partição pode ser feita pelos métodos de

Shake-flask, cromatografia de camada delgada (CCD), e cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE). O método de Shake-flask está fundamentado na dissolução de um

composto em sistema bifásico formado por um solvente aquoso e um solvente

orgânico, preferêncialmente o 1-octanol (Tavares, 2004; Kubinyi, 1993; Waller, 1994;

Deardem & Mays, 1985; Hansch & Fujita, 1964). Este método, no entanto, está sendo

substituído por técnicas cromatográficas devido à necessidade de pureza do composto

a ser testado e de tempo prolongado para a realização das medidas experimentais.

Adiciona-se a este fato a dificuldade de reprodutibilidade dos resultados obtidos.

A determinação do coeficiente de partição a partir das técnicas

cromatográficas, que promovem a separação dos compostos, como a CCD e CLAE,

envolvem o emprego de parâmetros característicos para cada técnica, Rf e K’,

respectivamente. Os valores de Rf e K’ se relacionam com o coeficiente de partição

através das equações 9 e 10, utilizadas para a CCD, e 11 e 12, empregadas para a

CLAE, o que possibilita, desse modo, a sua determinação.

Rm = Log [ 1/Rf -1] (eq. 9)

Log P = a Rm + b (eq. 10)

Em que:Rm representa a distância percorrida em relação a um composto padrão;Rf representa a razão entre as distâncias percorridas pelo composto e peloeluente;

P é o coeficiente de partição do composto;a e b são os coeficientes angular e linear da equação, respectivamente.

FBT/FCF/USP 32

K’ = (tr- to)/ to (eq. 11)

Em que:K’ é o fator de capacidade;tr representa o tempo de retenção do composto;to representa o tempo de eluição do solvente.

O tempo de retenção de compostos em sistema 1-octanol/fosfato utilizando

CLAE é expresso quantitativamente pelo fator de capacidade K’. A relação entre o Log

K’ e LogP é obtida através da aplicação da equação descrita a seguir.

logP = log K + log K’ (eq. 12)

Em que:K constante de retenção em meio aquoso,K’ é o fator de capacidade,logP é o logaritmo do coeficiente de partição do composto estudado.

Descritor de Hansch

O descritor estrutural de caráter hidrofóbico foi definido por Hansch & Fujita,

em 1964, como a medida da contribuição hidrofóbica de um determinado grupo

substituinte para o coeficiente de partição da molécula como um todo. Esta medida foi

avaliada a partir da relação logarítmica entre o coeficiente de partição de um composto

substituído e o coeficiente de partição do seu análogo não substituído (Eq. 13).

x = logPx – logPH (eq. 13)

Em que: é a constante de Hansch empregada para expressar a contribuição

hidrofóbica de grupos substituintes, X.LogPx é o coeficiente de partição do composto substituído,LogPH é o coeficiente de partição do composto não substituído.

O descritor de hidrofobicidade sofre influência significativa da posição que o

grupo substituinte ocupa na molécula. O valor de e LogP utilizados para descrever a

hidrofobicidade podem, atualmente, ser calculados empiricamente, sendo que este

procedimento deve ser complementar aos dados obtidos experimentalmente (Tavares,

2004; Kubinyi, 1993; Hansch & Fujita, 1964).

FBT/FCF/USP 33

1.7.1.3 Parâmetros que expressam a atividade biológica

A atividade biológica é resultante da resposta do organismo frente a um

estímulo provocado por compostos bioativos. Neste aspecto, quando se estudam

compostos bioativos potenciais é de fundamental importância a detecção e a

determinação de resposta biológica observada, a qual promove o entendimento dos

mecanismos que regem o efeito farmacológico. Desta forma, as medidas de atividade

biológica devem estar perfeitamente estabelecidas e apresentar elevada precisão e

qualidade em sua determinação para que possam ser usados em modelos

quantitativos, como os obtidos em estudos de QSAR (Tavares, 2004, Cronin &

Schultz, 2003; Grover et al., 2000).

Segundo Cronin & Schultz, 2003, a obtenção dos dados de atividade biológica

e o seu emprego em estudos de QSAR deve seguir algumas diretrizes fundamentais

para que seja possível manter a qualidade dos modelos obtidos. Entre estas, cita-se a

utilização de protocolos simples e a realização dos ensaios em laboratório pré-

determinado e adequado para os analistas efetuarem as análises. Se possível, deve-

se manter sempre o mesmo grupo de analistas nos ensaios biológicos a serem

realizados (Cronin & Schultz, 2003).

A atividade biológica é expressa, geralmente, por meio de potência, e segundo

Tavares, 2004, esta é considerada como sendo o inverso da dose ou concentração

necessária para a obtenção de uma determinada resposta biológica. Desta forma,

quanto menor for a dose necessária para a obtenção de determinada resposta

biológica, maior será a potência do composto analisado (Tavares, 2004; Hansch &

Leo, 1995).

Neste sentido, a escolha do método de quantificação da atividade biológica que

resulte em estimativa de sua potência e em determinação fidedigna de modelos

matemáticos são requisitos fundamentais para o êxito de estudos de QSAR (Tavares,

2004; Cronin & Schultz, 2003; Grover et al., 2000). Entre os parâmetros empregados

para descrever de forma semi-quantitativa ou quantitativa a atividade biológica cita-se

a determinação de dados de inibição de crescimento celular, de concentração inibitória

mínima (CIM), a dose terapêutica eficaz em 50% dos indivíduos (ED50), a dose letal

em 50% dos indivíduos (DL50), e a afinidade de ligantes a determinados receptores

(Ki), entre outras (Tavares, 2004; Cronin & Schultz, 2003; Grover et al., 2000).

1.7.1.4 Escolha dos grupos substituintes

O Diagrama de Craig é uma ferramenta utilizada na seleção de grupos

substituintes de um composto bioativo, que possibilita o planejamento de um conjunto

de análogos adequado para a condução de um estudo de QSAR.

FBT/FCF/USP 34

O emprego deste diagrama permite a obtenção de informações, referentes a

propriedades físico-químicas de efeitos eletrônicos (de Hammett) e hidrofobicidade

(de Hansch), que fornecem suporte aos estudos de QSAR clássico, especificamente

para a análise de Hansch.

Este diagrama consiste em distribuição espacial de grupos substituintes de

acordo com os valores dos descritores físico-químicos (eixo X) e (eixo Y) em um

sistema cartesiano bidimencional, Figura 9. Ressalta-se que cada grupo encontra-se

disposto ao longo dos eixos X e Y dependendo do valor dos descritores físico-

químicos determinado experimentalmente (Kubinyi, 1993; Craig, 1971).

= constante de grupo de Hammett;= constante de hidrofobicidade de Hansch

Figura 9. Diagrama de intercorrelação vs em substituição para-aromática do ácido

benzóico. Adaptado de Craig, 1971.

O emprego do diagrama ocorre por meio da localização de determinado grupo

substituinte no diagrama, onde a partir de suas coordenadas podem-se observar os

valores de e correspondentes (Craig, 1971). A partir de estudos de QSAR que

envolvem a análise da atividade biológica em função dos dois descritores estruturais,

e , a escolha dos substituintes deve atingir a maior dispersão possível no diagrama,

ou seja, os substituintes devem ser selecionados nos quatro quadrantes diferentes,

(-) (+)

(+) (+)

(-) (-)

(+) (-)

FBT/FCF/USP 35

incluindo os grupos -CH3, -NO2, -Cl ou -Br, -H, -NH2 ou-N(CH3)2 (Tavares, 2004;

Volkhard, 1995).

Quando a análise de QSAR envolve o estudo de um único descritor físico-

químico (ou ) deve-se escolher grupos substituintes localizados nas proximidades

de uma linha imaginária paralela ao eixo da propriedade estudada (Tavares, 2004;

Patrick 2001). A escolha adequada dos grupos substituintes faz parte de um conjunto

de cuidados que, se considerados, podem levar à obtenção de correlações

significativas, em estudos de relação estrutura-atividade. Ressalta-se que no processo

de escolha dos grupos substituintes deve-se evitar a colinearidade entre os descritores

(variáveis independentes), o que evita a obtenção de equações não representativas do

fenômeno estudado.

1.7.1.5 Análise de Hansch

O processo dinâmico que resulta na atividade biológica de compostos bioativos

envolve diversos fatores, entre os quais, a absorção, distribuição, interação fármaco-

receptor e excreção destes compostos. Neste sentido, os estudos de QSAR, se

apresentam como ferramenta essencial para o entendimento dos fatores que regem a

resposta biológica e, adicionalmente, permitem estabelecer as relações entre as

propriedades físico-químicas de uma série de compostos análogos com a atividade

biológica por eles desempenhada.

A análise de Hansch é o modelo de QSAR em duas dimensões (QSAR 2D)

mais difundido atualmente e se aplica a série de compostos de estrutura análoga com

variação dos grupos substituintes em posições definidas. Ressalta-se que os

compostos presentes na série estudada devem, se possível, apresentar o mesmo

mecanismo de ação e disponibilidade de descritores físico-químicos confiáveis

(Tavares, 2004; Gaudio, 1996; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993). Está análise está

fundamentada na contribuição aditiva de diferentes propriedades físico-químicas,

expressas por descritores estruturais, sobre a atividade biológica (Tavares, 2004;

Gaudio, 1996; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Martin, 1981; Hansch & Fujita, 1964).

A partir do emprego da Análise de Hansch pode-se caracterizar e isolar as

contribuições individuais de cada propriedade físico-química que influência a

bioatividade de um fármaco. Este processo ocorre por meio da avaliação de modelos

matemáticos obtidos a partir de análise de regressão linear, linear múltipla ou

regressão não linear e visa correlacionar os valores da atividade biológica com as

propriedades físico-químicas estudadas (Gaudio, 1996; Kubinyi, 1993). Nesta análise

de QSAR 2D, os descritores estruturais encontram-se ajustados em equação linear

FBT/FCF/USP 36

multiparamétrica (Eq. 14), a qual permite determinar a dependência da atividade

biológica em relação a estes descritores. Desse modo, a partir da aplicação da análise

de Hansch, podem-se descrever as relações entre as propriedades físico-químicas e

atividade biológica, e, por meio de extrapolação ou interpolação predizer valores da

atividade biológica de um composto ainda não analisado (Tavares, 2004; Gaudio,

1996; Kubinyi, 1995).

No caso de sistemas biológicos, o estudo das relações lineares entre a

hidrofobicidade e a atividade biológica é aplicado apenas a uma faixa limitada de

valores. Este fato está fundamentado na idéia de que moléculas que são muito

hidrofóbicas ou muito hidrofílicas não possuem habilidade de atravessar as

membranas biológicas. Face a este fato, Hansch & Fujita, em 1964, formularam o

modelo matemático parabólico (Eq. 15), que descreve a ocorrência de relação não

linear entre a hidrofobicidade e a atividade biológica. Este modelo expressa a

dependência da atividade biológica com a hidrofobicidade, onde esta propriedade é

linear até alcançar um valor de considerado ótimo, a partir do qual a atividade tende a

decrescer, delineando o perfil parabólico da curva (Tavares, 2004; Tavares 2003).

Kubinyi, em 1977, re-avaliou a influência da hidrofobicidade sobre a resposta

biológica e formulou o modelo matemático bilinear (Eq. 16), o qual é considerado um

ajuste do modelo parabólico aos dados experimentais obtidos e aplicados nos estudos

de QSAR. O autor inseriu no modelo o termo bilinear (), que assume caráter

probabilístico e expressa tanto os processos de transporte e distribuição de um

fármaco através de sistemas biológicos multicompartimentados, como a ocorrência de

relação não linear entre a hidrofobicidade e a atividade biológica (Kubinyi, 1995;

Kubinyi, 1993; Kubinyi, 1977).

log 1/C = a + b+ c (eq. 14)

log 1/C = -a()2 + b + c+ d (eq. 15)

log 1/C = a – b log (+ 1) + c (eq. 16)

Em que:log 1/C representa os valores de atividade biológica;C é a concentração do fármaco requerido para uma dada resposta biológica;a, b, e c são as constantes obtidas através de análise de regressão;é a constante de Hammett empregada para expressar o efeito eletrônico de

grupos substituintes;é a constante de Hansch empregada para expressar a hidrofobicidade de

grupos substituintes.

FBT/FCF/USP 37

1.7.1.6 Quimiometria aplicada ao estudo de QSAR/QSPR

Passados cerca de trinta anos desde a inserção na literatura da análise de

Hansch, outras metodologias matemáticas têm sido descritas e aplicadas com êxito na

construção de modelos, que permitem avaliar as relações quantitativas entre a

estrutura química e a atividade biológica (He & Jurs, 2005; Eriksson et al., 2003;

Ferreira, 2002; Franke & Gruska, 1994). Tais procedimentos, chamados de

quimiométricos, são particularmente empregados quando o número de variáveis

independentes (descritores estruturais) é equivalente ou mesmo excede o número de

compostos estudados (Eriksson et al., 2003). A quimiometria é também utilizada no

reconhecimento de propriedades que permitem a identificação de grupos e, também,

na análise de dados obtidos a partir de fontes de natureza multivariada (Ferreira,

2002).

A quimiometria engloba métodos de regressão, classificação de variáveis

analisadas ou métodos de reconhecimento de padrões. Os primeiros envolvem a

metodologia de regressão linear múltipla (MLR), a regressão por componentes

principais (PCR), e a regressão por mínimos quadrados parciais (partial least squares -

PLS). Já as metodologias de classificação de variáveis são divididas em

supervisionadas ou não supervisionadas. Para as metodologias de reconhecimento de

padrões supervisionadas pode ser citada a análise do K-iésimo vizinho mais próximo

(K th Nearest neighbor - KNN), que apresenta maior destaque desta classe. Entre as

metodologias não supervisionadas destacam-se a análise dos componentes principais

(principal component analysis - PCA) e a análise de agrupamento hierárquico

(Hierarchical cluster analysis - HCA). Entre todas as metodologias matemáticas

empregadas atualmente no estudo de QSAR, a análise de Hansch, a regressão por

PLS, que se encontra inserido em programas computacionais de QSAR 3D, análise

comparativa de campos moleculares (CoMFA) e Volsurf, juntamente com PCA são as

mais empregadas e difundidas na literatura (Teófilo & Ferreira, 2006; Ferreira, 2002;

Cruciani et al., 2000; Wold, 1994, Kubiniy, 1993; Cramer et al., 1989).

Análise por regressão por mínimos quadrados parciais

A ferramenta de correlação denominada análise de regressão por mínimos

quadrados parciais (PLS) é fundamentada na descrição da variável dependente (Y), a

atividade biológica, como uma combinação linear das variáveis independentes (X), os

descritores estruturais. Em outras palavras, este processo é realizado para descrever

de forma otimizada a relação entre os descritores (X) e a atividade biológica (Y),

permitindo a previsão dos dados de atividade biológica (Montanari et al., 2002). Esta

combinação resulta em formação de novos descritores, denominados de variáveis

FBT/FCF/USP 38

latentes, componentes ou fatores ortogonais, que são utilizados para modelar a

atividade (Y) (Ferreira, 2002).

A primeira variável obtida na análise apresenta a maior variância entre todas

obtidas, ou seja, esta abrange o maior volume de informações estatísticas

relacionadas a variável Y, neste caso a atividade biológica. Desse modo, a segunda

variável obtida deve apresentar a segunda maior variância. Os modelos obtidos na

correlação entre os componentes e a atividade biológica são similares aos obtidos

com a análise de Hansch.

Este método apresenta algumas propriedades importantes como a análise

simultânea de inúmeras variáveis dependentes (Y) e independentes (X), não ser

sensível à ocorrência de co-linearidade entre os descritores físico-químicos, e não

necessitar manter a proporção entre o número de compostos e o número de

descritores estruturais estudados (Ferreira, 2002; Montanari et al., 2002; Sjöström &

Eriksson, 1994; Wold, 1994). Face a estas informações, a metodologia de PLS se

apresenta como alternativa complementar ao entendimento e refinamento dos

resultados obtidos a partir da Análise de Hansch (Ferreira, 2002).

Neste sentido, ressalta-se que o emprego de ferramentas quimiometricas no

processo de desenvolvimento de fármacos é bem sedimentado na literatura (Aguirre et

al., 2005; Rosseli et al., 2005; Leitão et al., 2004; Silva et al. em 2004), e tem sido

aplicado, progressivamente, no desenvolvimento de novos fármacos antichagásicos.

FBT/FCF/USP 39

2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

FBT/FCF/USP 40

2.1. JUSTIFICATIVA

A Doença de Chagas é um problema de saúde pública grave que atinge

milhões de pessoas no continente americano (Araújo & Pirmez, 1999). A quimioterapia

atualmente empregada para o tratamento desta enfermidade, além de muito restrita,

apresenta eficácia relativa e resulta, na maioria dos casos, em efeitos colaterais

consideráveis. Estes fatores evidenciam a necessidade premente de busca de novos

agentes antichagásicos visando o controle desta doença.

A introdução de um fármaco completamente novo ao arsenal terapêutico

envolve cerca de 15 anos e custo aproximado de 800 milhões de dólares (Dimasi et

al., 2002). Este cenário, agravado pela falta de investimentos de indústrias

farmacêuticas em pesquisas envolvendo doenças negligenciadas, como a Doença de

Chagas, somado à ausência de tratamento eficaz para estas, resulta em

conseqüências graves ao bem-estar da sociedade. Dentro deste conjunto, citam-se a

sobrecarga dos sistemas de saúde pública, invalidez e morte de indivíduos

chagásicos.

Neste sentido, a aplicação dos métodos de planejamento de fármacos, que

visam à obtenção de agentes terapêuticos com melhor perfil farmacológico e que

promovam o entendimento do mecanismo de ação destes compostos, se apresentam

como alternativas viáveis tanto na busca de novos agentes antichagásicos como para

a redução do tempo necessário à obtenção de novos fármacos. Entre estes métodos,

o estudo das propriedades físico-químicas, emprego de metodologias de modelagem

molecular e a modificação estrutural envolvendo o estudo de QSAR (Quantitative

Structure-Activity Relationship) e QSPR (Quantitative Structure-Property Relationship)

se mostram entre os mais promissores. A metodologia de QSAR permite quantificar a

influência de propriedades físico-químicas sobre a atividade biológica desempenhada,

fornecendo informações importantes para o planejamento de análogos potencialmente

antichagásicos.

À luz do mecanismo de ação antichagásico de compostos 5-nitro-

heterocíclicos, a avaliação do potencial de redução do grupo nitro é fundamental para

o estudo de compostos com melhor perfil farmacológico. Os valores de potenciais de

redução em conjunto com as propriedades físico-químicas e estruturais fornecem

subsídios para o estudo das relações entre estrutura química e o potencial de redução

do grupo nitro, e com a atividade antichagásica. Ademais, ressalta-se que os estudos

de QSPR e SAR provêm informações que se inserem como suporte relevante para o

desenvolvimento de novos agentes antichágasicos.

FBT/FCF/USP 41

2.2 OBJETIVOS

Estudar o processo de redução e determinar o potencial de redução e o

potencial de pico catódico dos nitrocompostos, 5-nitro-2-tiofilideno

benzidrazidas e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas, com atividade

antichagásica por meio de técnicas voltamétricas (Voltametria de Onda

Quadrada e Voltametria Cíclica) em diferentes meios de reação.

Desenvolver estudos de modelagem molecular, utilizando a

metodologia de análise conformacional e cálculo de carga de ponto

único para determinação de fatores estruturais, de propriedades

estéreo-eletrônicas e mapeamento de superfícies moleculares de toda a

série de compostos estudados.

Realizar ensaios de inibição de crescimento parasitário (Trypanosoma

cruzi) dos nitrocompostos candidatos a fármacos e avaliar os fatores

que influenciam a atividade biológica determinada.

Avaliar as relações quantitativas entre a estrutura e as propriedades

físico-químicas, por meio de estudos de QSPR, e as relações

qualitativas entre a estrutura química, e atividade antichagásica.

FBT/FCF/USP 42

3. EXPERIMENTAL

FBT/FCF/USP 43

3.1 Materiais

3.1.1 Reagentes

Ácido cítrico/ citrato PA (Aldrich Chemical Company);

Ácido fosfórico PA (Merck);

Água deionizada (Millipore);

Dimetilformamida PA (Merck);

Dimetilsulfóxido PA (Labsynth Produtos Químicos para Laboratórios);

Dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) 99,9% (Cambridge Isotope

Laboratories, Inc.);

Etanol PA (Labsynth Produtos Químicos para Laboratórios);

Grafite(Merck);

Hidróxido de sódio PA (Merck);

Meio de cultura LIT;

Nitrato de sódio PA (Merck);

Nujol (Johnson & Johnson);

PIPES (ácido Bis-N,N-piperazina-etanosulfônico) (Sigma);

Tetrafluoroborato de tetrabutilamônio (Merck);

Soluções tampão Merck (4,0-7,0-9,0).

3.1.2 Nitrocompostos

Os compostos químicos empregados inicialmente nos experimentos descritos

neste trabalho foram a 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida e 5-nitro-2-furfulideno

benzidrazida. Foram utilizados em seguida 21 análogos, 5-nitro-2-tiofilidenico

4-R-benzidrazida e 5-nitro-2-furfulideno 4-R-benzidrazida, em que R representa os

derivados H, CH3, Cl, F, CF3, OCH3, OCH2CH3, SO2NH2, N(CH3)2, NH2, OH e CN,

Figura 10. Salienta-se que estes compostos foram sintetizados (Masunari & Tavares,

2003; Rezende, 2002; Rando et al., 2001; Furlanetto et al., 2001, Tavares et al. 1999;

Tavares et al. 1997; Tavares, 1993) e encontram-se disponíveis no Laboratório de

Planejamento e Desenvolvimento de fármacos da FBT/FCF/USP, sob coordenação do

Prof. Leoberto Costa Tavares, orientador deste trabalho.

FBT/FCF/USP 44

N N

XO H

H H H

H

HH

R

NO2

H

1

2

6

3

7

5

41716

15 14

13

128 9

10 11

28

23 22

21

201918

25-27

Figura 10. Estrutura química das 5-nitro-2-furfulideno 4-R-benzidrazidas, X=O, e

5-nitro-tiofilideno 4-R-benzidrazidas, X=S, utilizadas neste trabalho.

3.1.3 Equipamentos

- Potenciostato/Galvanostato Autolab PGSTAT 20 com software GPES versão

4.9, Holanda*;

- Célula eletrolítica de 10 ml contendo os eletrodos de referência Ag/AgCl,

(KClsaturado), auxiliar (Platina) e de trabalho (carbono vítreo, pasta de carbono

e pasta de carbono modificada com 5-nitro-heterocíclicos)*;

- pHmetro - Metrohm 654 pHmeter*;

- Espectrofotômetro Hawlett Packard 8452 A Diode Array spectrophotometer*.

- Estufa com controle de temperatura Tecnal**.

- Capela de fluxo laminar**.

- Microscópio óptico Javenela, marca Carl Zeiss com aumento de 25 vezes**;

- Câmara de Neubauer Hausser Scientific – 0,100 mm deep, Lery

Hemoecitometer **.

* Os equipamentos citados encontram-se no laboratório de Eletroanalítica e

Bioeletroanalílitca do IQ/USP-SP.

** Os equipamentos citados encontram-se no laboratório de Planejamento e

desenvolvimento de fármacos da FCF/USP.

3.2 Métodos

3.2.1 Procedimentos experimentais utilizados:

- Espectrofotometria UV/Visível;

- Voltametria cíclica;

- Voltametria de onda quadrada;

- Microscopia ótica e contagem de formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi

em câmara de Neubauer.

FBT/FCF/USP 45

3.2.2 Preparo de amostras

A) Para estudos eletroquímicos

Em meio misto e aprótico: as amostras dos compostos em concentração pré-

determinada (0,5 mol L-1) foram dissolvidas em meio aprótico, dimetilsulfóxido (DMSO)

e, posteriormente, diluídas em solução tampão PIPES com eletrólito de suporte NaNO3

0,1 mol L-1, quando em meio misto, ou DMSO com eletrólito de suporte Bu4NH4BF4,

quando em meio aprótico. As soluções estoque dos compostos foram conservadas em

temperatura ambiente e ausência de luz.

Em meio prótico: os nitrocompostos foram inseridos na constituição da pasta

de carbono conforme o procedimento descrito no item 3.2.3.1.B inserido neste

trabalho.

B) Para a leitura do número de formas epimastigotas viáveis em meio de cultura

As amostras dos compostos em concentração pré-determinada

(1,0 - 10,0 - 20 mg mL-1) foram diluídas em DMSO e, posteriormente, diluídas em meio

de cultura LIT até alcançar a concentração utilizada para leitura em câmara de

Neubauer.

3.2.3 Determinação do potencial de redução

3.2.3.1 Eletrodos:

A) Tratamento do eletrodo de carbono vítreo

O eletrodo de carbono vítreo foi lavado com água, submetido a polimento em

lixa de 1200 m e posteriormente submetido a polimento em flanela e diamante de 3,0

e 1,0 m, respectivamente. As últimas etapas do tratamento do eletrodo de carbono

vítreo envolveram a sonicação em etanol por cinco minutos e limpeza com água

desionizada.

B) Preparo dos eletrodos de trabalho em pasta de carbono

1) Preparo da pasta de carbono

O carbono em pó (grafite) foi submetido a dois banhos de HCl 0,1 mmol L-1 por

duas horas, filtrado sob pressão reduzida sendo, posteriormente, seco em estufa a

temperatura de 350 oC e mantido em dessecador. Este procedimento é necessário

para eliminar picos, resultantes da redução ou oxidação de grupos ativos presentes no

carbono. No preparo da pasta de carbono utilizou-se a proporção de 2:1 de carbono

em pó e óleo mineral (Nujol). O carbono e o óleo mineral (Nujol) foram pesados em

cadinho e, posteriormente, homogeneizados até obter uma pasta consistente.

FBT/FCF/USP 46

2) Preparo de eletrodo de pasta de carbono modificada com nitrocompostos

No preparo deste eletrodo utilizou-se a proporção de 10% de nitrocomposto a

ser imobilizado em pasta de carbono. A pasta de carbono foi preparada como descrito

no ítem anterior, onde, o carbono, o óleo mineral e o nitrocomposto foram

homogeneizados até se obter uma pasta consistente e uniforme, com proporção de

60, 30 e 10%, respectivamente.

3.2.4 Soluções-tampão - Escolha e estudo do seu comportamento frente aos

nitrocompostos

Ao considerar que a composição da solução-tampão tem efeito significativo na

forma e no número de ondas relativas à redução dos compostos analisados,

registradas no voltamograma, foram realizados testes visando determinar a solução

tampão apropriada para a realização deste experimento. A partir disto, os compostos

foram dissolvidos em misturas DMSO/solução-tampão para a determinação da melhor

condição experimental a ser empregada. Assim, as percentagens de DMSO testadas

foram 20% e 50% e as soluções-tampão empregadas foram Britton-Robinson (tampão

universal), soluções de citrato e PIPES com eletrólito de suporte NaNO3 0,3 mol L-1.

Todas as soluções-tampão foram preparadas de acordo com a literatura (Perrin &

Dempsey, 1974) e adequadas à faixa de pH entre 7,0 – 7,5, empregada inicialmente

neste estudo. Os compostos, em concentração de 5,0 mmol L-1, foram inicialmente

dissolvidos em DMSO e diluídos até 1,0 mmol L-1 nas soluções-tampão de pH

desejado.

3.2.5 Espectrofotometria UV/Vis

Os espectros de absorção obtidos a partir da espectrofotometria UV/Vis dos

compostos analisados foram determinados a fim de comparação dos espectros e

confirmação do caráter inerte da solução-tampão. Estas leituras foram realizadas a

partir de solução contendo os compostos dissolvidos em 50% v/v de DMSO/solução

tampão PIPES e em DMSO.

3.2.6 Estudos de modelagem molecular

Neste trabalho utilizou-se o programa Spartan 02 for Linux, versão 1.1.9, e

Spartan 04 for Windows (versão Demo), Wavefunction, Inc. CA, USA (Hehre et al.,

2004). Os modelos dos compostos em três dimensões (3D) foram construídos no

editor estrutural usando os átomos e fragmentos moleculares inseridos no pacote

computacional. O esquema de trabalho adotado no estudo de modelgem molecular

dos nitrocompostos está ilustrado na Figura 11.

FBT/FCF/USP 47

Figura 11. Fluxograma que expressa as etapas e procedimentos semi-empírico (AM1)

e ab initio (HF 3-21G* e 6-31G*) utilizados na modelagem molecular dos

compostos estudados.

A) Otimização de geometria e análise conformacional

Os métodos de mecânica molecular MMFF94 e o método de mecânica

quântica semi-empírico Hamiltoniano AM1 (Austim Model 1) (Dewar et al., 1985) foram

empregados na otimização da geometria estrutural de todos os compostos estudados.

A otimização da geometria estrutural dos compostos 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas

e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas no estado fundamental foi também efetuada por

métodos ab initio em nível Hartree-Fock com o conjunto de bases

3-21 G* e 6-31G*, para melhor avaliação das conformações e configurações obtidas

por AM1.

AM1

Desenho doscompostos

Otimização degeometria molecular

Análiseconformacional

Cálculo de energiade carga de ponto

único

Obtenção dos Cônformerosde menor energia mínima

Determinação daspropriedades

físico-químicas

HF 3-21G*

AM1

HF 6-31G*

HF 6-31G*

Obtenção dos mapas dedensidade de potencialeletrostático, orbitais

moleculares HOMO e LUMO

MMFF94

AM1

FBT/FCF/USP 48

A análise conformacional dos nitrocompostos foi realizada, na estrutura

otimizada pelo método AM1 dos análogos 5-nitro-heterocíclicos, empregando a

metodologia de busca sistemática, aplicando o método AM1. O espaço conformacional

dos nitrocompostos foi explorado por meio da torsão dos ângulos moleculares () com

flexibilidade avaliada em intervalos de incremento de 30o, na faixa de 0-360o. Os

ângulos estudados, ilustrados na Figura 12, foram 1, entre as porções do anel

nitrotiofeno e N=CH, (S-C-C=N); 2, a porção N=CH e NH, (C=N-N-H); 3, os átomos

NH e a carbonila, (H-N-C=O); 4, a carbonila e o anel benzênico, (O=C-C-); 5, anel

benzênico e grupos substituintes, (-Y); 6, ligação existente entre os átomos de

grupos substituintes. As conformações de menor energia mínima de cada molécula

foram obtidas em meio solvatado e em vácuo.

Figura 12. Ângulos diedros () utilizados na análise conformacional dos derivados

5-nitro-heterocíclicos.

B) Energia de carga de ponto único e mapas de potencial eletrostático

Os perfis dos mapas de potencial eletrostático, (maps of electrostatic potential -

MEPs), foram obtidos para todos os confôrmeros de menor energia mínima dos

compostos, selecionados a partir da análise conformacional. Os MEPs foram

calculados a partir das estruturas obtidas no cálculo de energia de carga de ponto

único (método semi-empírico AM1). Os contornos de energia dos MEPs foram gerados

em superfície de van der Waals na faixa de 45 a -75 kcal/mol, e obtidas em tamanhos

pré-determinados de 0,002e/au3. Esta superfície representa o potencial eletrostático

sobreposto à superfície de densidade eletrônica e fornece medidas do tamanho

aproximado de determinado fragmento ou da estrutura química completa do

nitrocomposto.

Todas as cores empregadas na ilustração da superfície do composto

representam regiões que demonstram a intensidade variável dos valores de carga

3

XO

N N

NO2

YH

H

14

2

FBT/FCF/USP 49

eletrostática, sendo que a maior intensidade de cargas negativa e positiva são

delineadas pela cor vermelha e azul, respectivamente.

C) Propriedades físico-químicas

Na etapa de cálculo de energia de carga de ponto único foram obtidos os

valores das propriedades físico-químicas de efeito eletrônico, tais como valores

termodinâmicos de energia livre (em vácuo e solvatado), valores de energia dos

orbitais moleculares de HOMO e de LUMO da molécula, dureza química, afinidade

eletrônica, potencial químico, potencial de ionização e bandgap, além de

características estruturais como a torsão angular, momento de dipolo, volume,

distâncias intramoleculares entre as extremidades de cada molécula e do átomo de

oxigênio do grupo carboníla (C=O) e o hidrogênio do grupo azometínico (HC=N).

Ainda nesta etapa foram determinadas as cargas de potencial eletrostático (Q), do

átomo de carbono substituido (C1), do anel benzênico (QC1), juntamente com o

carbono localizado no anel heterocíclico de cinco membros ligado ao grupo nitro

(QC14). Estes átomos foram escolhidos por se encontrarem em regiões que

representam maior possibilidade de variações de efeito eletrônico por influência de

diferentes grupos ligados a estes, ou mesmo por meio de sua reatividade.

3.2.7 Ensaio de atividade antichagásica

Os ensaios de atividade antichagásica foram executados com a forma

epimastigota do Trypanosoma cruzi no Laboratório de Planejamento e

Desenvolvimento de Fármacos da FCF/USP utilizando a cepa Y, isolada por Silva e

Nussenzweig em 1953. A cepa do parasita utilizada neste trabalho foi gentilmente

disponibilizada pela Professora Maria Júlia Manso Alves, do Laboratório de Bioquímica

Parasitária, Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de

São Paulo.

A) Meio de Cultura

O parasita foi cultivado em meio LIT (liver infusion tryptose), composto por

NaCl 0,4%, KCl 0,04%, Na2HPO4 0,8%, glicose 0,2%, triptose 0,5%, infusão de fígado

0,5%, sendo as porcentagens expressas em massa/volume.

Esta mistura é enriquecida com a adição de 10% de soro bovino, v/v. Agita-se

e em seguida ajusta-se o pH para 7,2 e incuba-se o meio a 68 oC por 1 hora. Após

resfriamento até temperatura ambiente, adiciona-se solução de hemoglobina bovina

FBT/FCF/USP 50

até atingir a concentração de 2%, v/v. A esterilização do meio é realizada por filtração

em membrana Millipore 0,22 mm. Em seguida o meio é distribuído em frascos de vidro

que são estocados a 4 oC (Gonçalves, 1978; Fernandes & Catellani, 1966; Camargo,

1964). Este meio foi preparado no Laboratório de Bioquímica Parasitária,

Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo e

cedido para a realização dos experimentos. O meio LIT foi mantido em frasco

esterilizado sob refrigeração de 4 oC, até o momento do uso.

B) Condições do Cultivo

O cultivo do inóculo, proveniente de culturas de epimastigotas com idade de

72 horas, apresenta normalmente, após período de incubação, cerca de 50x106

parasitas por mL-1.

C) Ensaio de suscetibilidade antichagásica

Os nitrocompostos, ao lado do fármaco de referência, o benznidazol, foram

separadamente dissolvidos em DMSO e diluídos em meio de cultura LIT até obter-se a

faixa de concentração de 1,0 a 20 g mL-1. Adicionalmente, uma alíquota do inóculo,

dependente do número de células viáveis do parasita, foi inserida em tubo Falcon em

conjunto com os compostos a serem testados, solubilizados em 1,0% de DMSO e

meio LIT. A concentração inicial de 20x106 parasitas/mL foi escolhida como padrão

para a realização de todos os ensaios.

O número de parasitas por mL foi obtido por meio de aplicação da equação 17.

A partir do valor numérico (parasitas/mL) emprega-se a equação 18 para a obtenção

do volume de inóculo a ser utilizado na suspensão a ser incubada. De posse do

volume de inóculo necessário para atingir a concentração escolhida de parasitas/mL

são adicionados aos tubos Falcon o volume de suspensão contendo o composto a ser

testado e o meio LIT, necessário para completar o volume da suspensão a ser

incubada (Volume do inoculo x Volume do ensaio = 1,0 mL, Volume total incubado).

Este procedimento é realizado também para o preparo de suspensão controle, sem os

compostos testados, para comparação dos resultados obtidos.

* Fator de diluição do inoculo para contagem (50x);

**Volume da câmara de Neubauer utilizado nas leituras.

Número de parasitas/mL = número contado x diluição* x 10 000** (Eq. 17)

FBT/FCF/USP 51

Volume do inoculo = 20 x 106 (Eq. 18)

Número de parasitas/mL

Os tubos Falcon que contém a suspensão de parasitas e os nitrocompostos em

meio LIT foram incubados em estufa sob temperatura de 28 oC, pelo período de 24 ou

48 horas.

A atividade antichagásica in vitro foi determinada através da contagem em

câmara de Neubauer das formas epimastigotas viáveis em tempo zero e no período de

incubação de 24 horas. De posse do número de parasitas foi realizada a determinação

de inibição da porcentagem de crescimento ou proliferação celular.

Os valores de porcentagem de crescimento parasitário foram obtidos por meio

da equação 19.

CP (%) = (L24 - L0) x 100/ L0 (Eq. 19)

Em que:

CP (%) é a porcentagem de crescimento parasitário em 24 horas;

L0 é a leitura do número de células viáveis em câmara de Neubauer

realizada em tempo inicial (0 horas);

L24 é a leitura do número de células viáveis em câmara de Neubauer

realizada em 24 horas.

Neste método, foi avaliada também a influência da proporção de DMSO

utilizada frente ao desenvolvimento do parasita, mantendo as mesmas condições do

teste descrito acima. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

3.2.8 Relações quantitativas estrutura-propriedade - QSPR

3.2.8.1 Escolha dos substituintes

Considerando a possibilidade de influência eletrônica de grupos substituintes

sobre a redução do grupo nitro dos compostos estudados, escolheu-se, no Diagrama

de Craig (Craig, 1971), Figura 9, os grupos substituintes ao longo do eixo

FBT/FCF/USP 52

correspondente à propriedade eletrônica, expressa pelo de Hammett, Figura 12.

Este procedimento possibilita a análise da influência dos efeitos eletrônicos sobre

qualquer propriedade estrutural que se deseja estudar (Kubinyi, 1993, Craig, 1971).

A seleção de compostos foi efetuada de maneira a formar um sub-grupo para

ser avaliado quanto à redução dos nitrocompostos em meio aprótico, com variação

significativa nos valores de de Hammett (de 0,54, a -0,83) para os substituintes

triflúormetila e dimetilamino, respectivamente.

Figura 13. Grupos substituintes escolhidos para a realização dos

experimentos em meio aprótico de redução.

Em outra etapa do experimento, a análise de QSPR envolveu a avaliação da

influência dos parâmetros de Hammett e de Hansch sobre o potencial de redução

determinado em meio misto de reação, DMSO/ PIPES, 50% v/v. Deste modo, a

escolha dos compostos envolveu a inclusão de grupos substituintes dispersos nos

quatro quadrantes do diagrama de Craig (Craig, 1971), Figura 14.

A hidrofobicidade foi inserida nesta etapa do estudo visando determinar a

possibilidade de interferência desta propriedade no processo de difusão dos

nitrocompostos, do conjunto da solução para a interface do eletrodo de trabalho (Bard

4 - F

H

4 -C l

C F 3

4 - O C H3

4 - C H 3

4 -N (C H )3 2

(+ ), (- )

( -), (+ )

(+ ) , (+ )

( - ), (+ )

FBT/FCF/USP 53

& Falkner, 1980), o que pode influenciar os valores de potencial de redução dos

nitrocompostos.

Figura 14. Grupos substituintes escolhidos para a realização dos

experimentos em meio misto de redução.

3.2.8.2 Estudo de QSPR

Na análise de QSPR realizada neste trabalho empregou-se um conjunto de

vinte e três compostos, sendo doze 5-nitro-tiofilidênico 4-R-benzidrazidas e onze 5-

nitro-furfulidênico 4-R-benzidrazidas. Os valores dos parâmetros físico-químicos de

efeito eletrônico e de hidrofobicidade, expressos por de Hammett e de Hansch

foram correlacionados com o potencial de redução (E1/2) ou com o potencial de pico

catódico (Epc) dos nitrocompostos obtido, nos meios de reação aprótico e misto, e com

o potencial de pico catódico obtido em meio prótico.

A análise dos efeitos eletrônicos envolveu o emprego dos descritores

estruturais p e R, que representam, respectivamente, o efeito polar e de ressonância

dos substituintes em posição para (Hansch & Leo, 1995), e os descritores obtidos a

partir do emprego de técnicas de modelagem molecular, especificamente por meio de

cálculos de mecânica quântica, método semi-empírico AM1, descritos no

4 -F

H

4 -C l

C F 3C N

S O 2 N H 2

4 -O C H34 -O H

4 -N H 2

4 -E t4 -C H3

4 -N (C H )3 2

(+ ), (- )

( -), (+ )

(+ ) , (+ )

( - ), (+ )

FBT/FCF/USP 54

item 3.2.6 C (Hf [Kcal/mol], EHOMO, ELUMO, E, μ, bandgap [eV], momento de dipolo,

QC1 e QC14 [eV]).

Os estudos de QSPR envolveram o emprego de outras propriedades

estruturais, como o volume molecular e distâncias interatômicas, obtidas com o

emprego de cálculo de energia de ponto único (método semi-empírico AM1), em

metodologia descrita no item 3.2.6 C.

A constante de Hansch, bem como o CLogP, foram utilizados para avaliar a

influência da hidrofobificidade da molécula sobre o potencial de redução dos

nitrocompostos em meio misto de reação. Os valores dos descritores estruturais de

caráter eletrônico (p e R) e de hidrofobicidade () foram retirados da literatura

(Hansch & Leo, 1995a,b). As correlações entre o potencial de redução e as

propriedades físico-químicas e estruturais, analisadas sob a forma de QSPR e de

SAR, consideraram os dados apresentados na tabela 1.

Os valores de ClogP, calculados através de ClogP Program 4.0, desenvolvido

e comercializado por Biobyte Corp., Claremont, CA – USA, estão descritos na

literatura e foram disponibilizados pelos autores dos respectivos trabalhos (Rezende,

2002; Tavares et al. 1997; Tavares, 1993).

Tabela 1. Descritores físico-químicos utilizados no estudo de QSPR de 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazidas e 5-nitro-2-furfulideno benzidrazidas.

Descritores de

redução*

Descritores de caráter

eletrônico

Descritores

hidrofóbicos

Descritores de

efeito estérico

Variáveis Y Variáveis X Variáveis X Variáveis X

p, R, Hf (Kcal/mol) ClogP Volume molecular,

Y = Epc ou E1/2

(Volts)

EHOMO (eV), ELUMO (eV),

E (eV), μ (eV),

bandgap, momento de

dipolo, QC1,QC14.

distâncias

interatômicas.

* Descritores obtidos por técnicas voltamétricas no processo de redução dosnitrocompostos;

FBT/FCF/USP 55

Os estudos de QSPR e de SAR/QSAR foram realizados empregando-se o

método de regressão linear múltipla, seguindo o modelo de Hansch (Hansch & Leo,

1995a, Kubinyi, 1993, Hansch & Fujita, 1964). Para isso utilizou-se os programas BiIin

versão 98, desenvolvido por Hugo Kubinyi, BASF-Alemanha, e BuildQSAR

desenvolvido por Anderson C. Gáudio e Daniel B. de Oliveira (Oliveira & Gáudio,

2000), UFES, Brasil.

As regressões foram comparadas com outras análises correlacionais que

empregaram metodologia estatística de análise de regressão múltipla, como a análise

de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS). Este procedimento visou

corroborar os resultados obtidos por meio da regressão linear. Para a realização da

metodologia de PLS utilizou-se o programa computacional Minitab 14.0 (Minitab

Brasil).

A qualidade do ajuste dos modelos obtidos em relação aos valores observados

do potencial de redução e do potencial de meia onda foi avaliada por meio do cálculo

do coeficiente de correlação (r), do desvio-padrão (s) e do teste de Fischer (F).

Segundo Ferreira et al., em 2002 e Kubinyi, em 1997, em termos simplificados, um

modelo bem ajustado deverá apresentar valor de R próximo à unidade, s pequeno e F

elevado (Ferreira et al., 2002; Kubinyi, 1997; Kubinyi, 1993).

FBT/FCF/USP 56

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

FBT/FCF/USP 57

4.1 Escolha da solução-tampão a ser empregada na determinação do potencial

de redução

A escolha da solução-tampão se baseou no critério de solubilidade dos

compostos estudados. Inicialmente os nitrocompostos foram solubilizados em DMSO e

diluídos até atingir as proporções de 20 e 50% v/v em três soluções previamente

selecionadas, PIPES, Britton-Robinson e citrato. Observou-se que os compostos

5-nitro-2-furfulideno benzidrazida e 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida, dissolvidos em

solução mista 50% v/v, não precipitam somente em presença do tampão PIPES. De

acordo com os resultados obtidos e ilustrados na Tabela 2, a solução tampão PIPES

foi escolhida como o melhor meio experimental a ser empregado neste trabalho

quando em presença de DMSO.

Tabela 2. Influência de diferentes soluções-tampão sobre a solubilidade de

1,0 mmol L-1 de nitrocompostos dissolvidos em DMSO.

Soluções tampão 20% (DMSO) 50% (DMSO)

PIPES/DMSO Solução turva não precipitou

Britton-Robinson/DMSO precipitou precipitou

Citrato/DMSO precipitou precipitou

Os espectros de absorção UV/Visível dos nitrocompostos em solução mista de

DMSO/PIPES, 50% v/v, anexo 1, demonstraram que a solução-tampão PIPES não

interage com os compostos dissolvidos em meio DMSO, sendo empregada no

decorrer dos experimentos.

4.2 Determinação do potencial de redução dos nitrocompostos

Na primeira etapa deste trabalho, os experimentos foram dirigidos para a

utilização de métodos eletroquímicos visando determinar o potencial de redução dos

nitrocompostos, especificamente na reação ArNO2 ArNO2. Ressalta-se que

nesta reação o radical nitro ânion gerado eletroquímicamente é considerado o

FBT/FCF/USP 58

responsável pelas reações que desencadeiam atividade antichagásica dos derivados

5-nitro-heterocíclicos.

A determinação do potencial de redução envolveu o emprego de três meios de

reação, aprótico, misto e prótico, o que permitiu avaliar a influência destes meios sobre

a geração do radical nitro ânion. O meio aprótico, freqüentemente citado em estudos

de eletroquímica, é constituído de solvente orgânico como DMSO, DMF ou acetonitrila

e eletrólito de suporte adequado (sal quaternário de amônio). Tal meio permite tanto a

solubilização dos nitrocompostos como a estabilização do radical nitro ânion (Bollo et

al., 2003, Arguello et al., 2001; Stradins et al., 1983). Ainda neste contexto, de acordo

com Abreu et al. em 2002, este meio é relevante em estudos que avaliam a atividade

biológica de compostos bioativos porque simula o ambiente hidrofóbico presente no

momento da passagem do fármaco através das membranas celulares do parasita.

Ressalta-se, no entanto, que os solventes orgânicos, como o DMSO, são tóxicos e

muito diferentes do meio aquoso intracelular onde, suspeita-se, ocorra a biorredução

in vivo.

Outro meio testado foi a solução mista de DMSO/solução tampão PIPES que

aproxima-se mais do meio e pH biológico. Este meio permite a obtenção do potencial

de redução e até o registro do radical nitro ânion em voltamogramas sob determinadas

condições experimentais. Por outro lado, é sabido, também, que, em alguns casos, o

potencial de redução determinado em solvente não aquoso ou em misturas de

solventes, não apresenta correlação com atividade biológica (Abreu et al., 2002;

Paulino et al., 2002; Bhattacharjee et al., 2002; Goulart et al., 1997). Face a estes

fatos, torna-se importante a determinação dos potenciais de redução dos

nitrocompostos em meio reacional que apresente a maior proximidade possível ao

meio fisiológico intracelular.

Em meio prótico ou aquoso, os experimentos foram realizados a partir do

emprego de técnicas eletroquímicas utilizando-se como eletrodo de trabalho a pasta

de carbono modificada com nitrocomposto. Estes experimentos visam alcançar o

estado de maior proximidade com o meio aquoso e, deste modo, obter correlações

com valores experimentais próximos à realidade. Ressalta-se que a modificação do

eletrodo, caracterizada pela incorporação de nitrocompostos insolúveis na pasta de

carbono, permite o estudo do comportamento redox dos mesmos em meio aquoso de

reação, usando apenas o eletrólito de suporte, tampão no pH desejado.

Para alcançar tal objetivo utilizaram-se as técnicas eletroquímicas: Voltametria

Cíclica (VC) e Voltametria de Onda Quadrada (VOQ). Desse modo, a investigação

eletroquímica dos compostos 5-nitro-heterocíclicos, visando à determinação do

potencial redox do par reversível Ar-NO2/Ar-NO2-, envolveu inicialmente a VC e,

FBT/FCF/USP 59

subseqüentemente, a VOQ com a finalidade de corroborar e complementar os dados

obtidos através da VC.

A comprovação da detecção do par reversível (radical nitro ânion) obtido por

meio de técnicas voltamétricas foi possível em algumas vezes através da avaliação

dos critérios de diagnóstico característicos para a VC e VOQ. Tais critérios permitem

obter o número de elétrons envolvidos na reação de transferência de carga e o caráter

da reação eletródica. Alguns critérios de diagnóstico, utilizados neste trabalho,

específicos para as técnicas voltamétricas são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Critérios de diagnóstico utilizados para identificar o número de elétrons e

caracterizar o tipo de reação eletródica.

Critérios dediagnóstico Voltametria Cíclica Voltametria de Onda Quadrada

ReaçõesReversíveis

1Visualização do pico catódico

e anódico correspondenteVisualização do pico catódico e

anódico correspondente

2 Relação linear (Ip vs 1/2) Relação linear (Ip vs 1/2)

3Epa – Epc = 57,0/n mV

(Eq. 20)Ep/2 = 97/n (adsorção de

produto e reagente) (Eq. 22)

4 Ipa/Ipc 1elétron (Eq. 21) -

Reações quasi-reversíveis

5 Visualização do pico catódicoe anódico correspondente

Visualização do pico catódico eanódico correspondente

6 Epa – Epc 57,0/n mV(Eq. 23) Relação linear (Ip/vs log )

7 Relação linear (Ip vs 1/2) Relação não-linear (Ip vs f1/2)

Em que, Ipa, Ipc, Epa, Epc, n, , e Ep/2 significam, respectivamente, corrente de pico

anódico, catódico, potencial de pico anódico, potencial de pico catódico, número de elétrons,

velocidade de varredura, freqüência e largura do potencial de pico a meia altura de corrente

(Souza et al., 2003; Komorsky-Lovric & Lovric, 1995; Brett & Brett, 1993; Osteryung &

Osteryoung, 1985).

FBT/FCF/USP 60

A redução eletroquímica dos nitrocompostos nos referidos meios é dependente

do pH e do tipo de eletrodo de trabalho utilizado nas determinações, além de envolver

reação reversível de um elétron (Eq. 24), e reação irreversível subseqüente, com

transferência de três elétrons e quatro prótons (Eq. 25) (Julião et al., 2005; Squella et

al., 2005 Mandal, 2004; Bollo et al., 2003; La-Scalea et al., 1999; La-Scalea, 1999;

Squella et al., 1996; Karakus & Zuman, 1995; Monteagudo et al., 1992; Morales et al.,

1987). Ressalta-se que dificilmente é observada a formação do radical nitro ânion, em

reação envolvendo um életron, em meio prótico de reação (aquoso), mas é comum a

ocorrência de reação envolvendo quatro elétrons e quatro prótons (Eq. 26) (Bollo et

al., 2003; Viodé et al., 1998; Squella et al., 1996; Karakus & Zuman, 1995). Em

contraponto, o eletrodo de diamante dopado com boro tem sido descrito na literatura

como ferramenta importante na determinação do radical nitro anion em meio prótico

(Julião et al., 2005).

A VC foi utilizada para obtenção do potencial de redução dos nitrocompostos e,

subseqüentemente, para a investigação do comportamento eletroquímico do radical

nitro ânion gerado. Encontra-se a seguir o esquema simplificado do processo de

redução da referida classe de compostos nitro-heterocíclicos.

Ar-NO2 + 1e- Ar-NO2- (Eq. 24)

Ar- NO2- + 3e- + 4H+ Ar-NHOH (Eq. 25)

ou

Ar-NO2 + 4e- + 4H+ Ar-NHOH (Eq. 26)

4.2.1 Meio aprótico

O primeiro meio investigado é constituído de DMSO contendo Bu4NH4BF4

0,1 mol L-1 como eletrólito de suporte e, como citado anteriormente, foi utilizado porque

permite a estabilização e a visualização do pico de redução do nitrocomposto

correspondente ao radical nitro ânion eletroquimicamente gerado (Bollo et al., 2003;

Arguello et al., 2001; Stradins et al., 1983). Um passo experimental relevante, anterior

à obtenção dos voltamogramas cíclicos no presente meio, é o borbulhamento de N2

pelo período de 30 minutos. Este procedimento promove a desaeração da solução, o

que evita a ocorrência de reação entre o radical nitro ânion e o oxigênio e impede a

formação de radical superóxido, o qual apresenta pico de redução em sobreposição ao

sinal voltamétrico do radical em meio aprótico.

FBT/FCF/USP 61

A determinação dos potenciais de redução dos nitrocompostos em meio

aprótico foi efetuada utilizando-se a VC e a VOQ e eletrodo de carbono vítreo como

eletrodo de trabalho versus eletrodo de referência de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl,

KClsaturado). A Figura 15 apresenta os voltamogramas cíclicos e de onda quadrada

obtidos em meio de reação aprótico.

Para ambas as técnicas utilizadas neste trabalho foram registrados,

primeiramente, voltamogramas em faixa estendida de potencial (Ei = - 0,15 V,

E1 = - 1,5 V, E2 = - 0,05 V e Ef = - 0,1 V para VC e E i = - 0,1 V e Ef = - 1,6 V para

VOQ) visando a obtenção dos picos referentes à formação do radical nitro ânion em

conjunto com os intermediários do processo de redução do composto 5-nitro-2-

tiofilideno benzidrazida em concentração de 0,5 mmol L-1. As condições voltamétricas

otimizadas para esta etapa do experimento foram velocidades de varredura de 500 mV

s-1 para a VC e freqüência de 100 Hz, amplitude de pulso de 50 mV e degrau de

potencial de 0,042 para a VOQ.

Os voltamogramas cíclicos obtidos no presente meio, Figura 15 A,

demonstraram a ocorrência de dois picos de redução e três de re-oxidação dos

produtos de redução dos nitrocompostos. Sugere-se inicialmente que os picos de

redução sejam referentes à formação do radical nitro ânion (Epc 1) e ao intermediário

hidroxilamina (Epc 2) em reações descritas nas equações 24 e 25, respectivamente.

Os picos de re-oxidação podem ser atribuídos a re-oxidação do radical nitro ânion ao

nitrocomposto (Epa 2) e do intermediário hidroxilamina ao intermediário nitroso (Epa

3), sendo Epa 1 objeto de investigação posterior.

Para a investigação da formação do radical nitro ânion a partir dos

voltamogramas cíclicos e de onda quadrada obtidos, foi reduzida a faixa de potencial

(Ei = - 0,15 V, E1 = - 0,9 V, E2 = - 0,05 V e Ef = - 0,1 V para VC e Ei = - 0,1 V e

Ef = - 0,9 V para VOQ) com a finalidade de isolar o par reversível Ar-NO2/Ar-NO2- (Eq.

24). Os voltamogramas obtidos com o emprego de ambas as técnicas voltamétricas,

ilustrados na Figura 15 em linha tracejada, permitem a visualização da formação do

radical nitro ânion em Epc 1 e sua re-oxidação ao respectivo nitrocomposto em Epa 2,

o que indica a existência de reversibilidade característica para a reação Ar-NO2/Ar-

NO2.

FBT/FCF/USP 62

Condições experimentais: (A) Voltametria Cíclica: = 500 mV s-1, faixa de potencial

estendida () Ei = - 0,15 V, E1= - 1,5 V, E2= - 0,05 V e Ef = - 0,1 V, faixa de potencial restrita

(---) Ei = - 0,15 V, E= - 0,9 V, E2= - 0,05 V e Ef = - 0,1 V. (B) Voltametria de Onda Quadrada:

= 100 Hz, amplitude de pulso 50 mV, degrau de potencial 0,042, faixa de potencial estendida

() Ei = - 0,1 V e Ef = - 1,6 V, faixa de potencial reduzida (---)Ei = - 0,1 V e Ef = - 0,9 V.

Figura 15. Voltamogramas cíclicos (A) e voltamogramas de onda quadrada (B)

registrados com eletrodo de carbono vítreo em solução 0,5 mmol L-1 de

5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida (DMSO, contendo Bu4NH4BF4

0,1 mol L-1).

A

B

-1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0,0

0,0

Epc,2

= - 1,20 V

Epa,3

= - 0,25 V

Epa,1

= - 0,82 V

Epa,2

= - 0,57 V

Epc,1

= - 0,67 V

(-) 1 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

-1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0,0

Epa,1

= - 0,60 V

Epc,2

= - 1,19 V Epc,1

= - 0,60 V

corrente reversa

corrente direta

0,0

(-) 4 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

FBT/FCF/USP 63

A redução dos nitrocompostos foi avaliada através da variação de velocidade

de varredura, faixa de 0,05 a 1,0 V s-1, onde observou-se que o par redox apresenta o

mesmo potencial de redução independente da velocidade aplicada. Este fator é

registrado como característica comum a processos reversíveis como é o caso do par

Ar-NO2/Ar-NO2.

Quando aplicada a velocidade de varredura de 2,0 V s-1, no entanto, a resposta

voltamétrica não foi mais observada. Isto pode ocorrer devido a baixa velocidade de

formação do radical nitro ânion no presente meio de reação. O valor calculado da

diferença de potencial (Ep de 100 mV) determinado entre o pico de redução (Epc) e o

pico de oxidação (Epa), (Eq. 20), permite concluir que a reação redox do

nitrocomposto é de caráter quasi-reversível, uma vez que os valores são superiores a

57 mV.

Estes experimentos foram realizados com o objetivo de manter o foco principal

que é a obtenção dos potenciais de redução do nitrocomposto em reação reversível

envolvendo um elétron, uma vez que a atividade antichagásica é resultante da

formação do radical nitro ânion (Eq. 24) (Viodé et al., 1998; Squella et al., 1996).

Diante do exposto, apresenta-se a seguir uma discussão preliminar relativa à

investigação dos demais picos de redução e de re-oxidação dos produtos formados a

partir da redução dos nitroderivados, Figura 15.

O segundo pico obtido na corrente catódica (Epc 2) sofre deslocamento de

acordo com o aumento da velocidade de varredura aplicada durante a obtenção dos

voltamogramas cíclicos. Neste sentido, ressalta-se que a variação do potencial, de

acordo com a velocidade de varredura, é indicativa da ocorrência de reação

irreversível e neste caso, da formação do intermediário hidroxilamina (Eq. 26).

No processo de re-oxidação dos produtos formados na redução dos

nitrocompostos observou-se que o pico Epa 1 não se encontra presente nos

voltamogramas obtidos para outros derivados da série dos nitrocompostos, como a

nifuroxazida por exemplo (dados não apresentados). Supõe-se que Epa 1 seja

proveniente da adsorção de intermediários de redução dos nitrocompostos. Estes

fatores, no entanto, não serão discutidos porque ainda encontram-se em fase de

investigação.

Observou-se, também, que após restringir-se o intervalo de varredura de

potencial onde se registra o radical nitro ânion, o que impede a produção de

hidroxilamina em Epc 2, não ocorre a formação do pico Epa 3. Isto significa que Epa 3

é dependente do pico Epc 2, e de acordo com a literatura, Epa 3 é característico de re-

oxidação da hidroxilamina (Ar-NHOH) ao intermediário nitroso (Ar-NO), em reação de

FBT/FCF/USP 64

Ar-NHOH Ar-NO + dois prótons (H+) e um elétron (Julião et al., 2005; Squella et

al., 2005 Mandal, 2004; Bollo et al., 2003; La-Scalea et al., 1999; La-Scalea, 1999;

Squella et al., 1996; Karakus & Zuman, 1995; Monteagudo et al., 1992; Morales et al.,

1987).

Os voltamogramas de onda quadrada demonstraram a ocorrência de dois picos

de redução (Epc 1 e Epc 2) e somente um pico de re-oxidação (Epa 1). Os picos Epc 1

e Epa 1 podem ser atribuídos ao radical nitro ânion e Epc 2 pode ser considerado

como a redução do referido radical a hidroxilamina, uma vez que valor do potencial de

redução do mesmo se desloca para potenciais negativos quando se aumenta a

frequência empregada em VOQ. Para os picos de re-oxidação Epa 1 e Epa 3 obtidos

nos voltamogramas cíclicos sugere-se que os mesmos não são observados nos

voltamogramas de onda quadrada devido a elevada velocidade em que os mesmos

são obtidos, o que favorece a minimização de adsorção do nitrocomposto. Os valores

dos potenciais de redução e de re-oxidação para todos os picos obtidos nos

voltamogramas cíclicos e de onda quadrada são vistos na Tabela 4.

Tabela 4. Valores dos potenciais de picos catódicos (Epc) e picos anódicos (Epa) dos

nitrocompostos em meio aprótico.

S (H) - 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida;O (H) - 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida.

Os resultados obtidos a partir da utilização de critérios de diagnóstico citados

na Tabela 3 não possibilitaram a determinação do número de elétrons e do caráter da

reação eletródica envolvida no par redox. Este fato, segundo Souza et al., em 2002,

pode ter ocorrido devido à adsorção de reagente e, em alguns casos, dos produtos

formados no decorrer da reação de redução, na superfície do eletrodo de carbono

vítreo. Tal fato impossibilita o emprego daqueles critérios na avaliação do processo de

redução dos nitrocompostos.

Metodologias/

compostos estudados

Epc 1

(mV)

Epc 2

(mV)

Epa 1

(mV)

Epa 2

(mV)

Epa 3

(mV)

VC

S (H) - 0,67 - 1,20 - 0,82 - 0,57 - 0,25

O (H) - 0,72 - 1,22 - 0,80 - 0,62 - 0,20

VOQ

S (H) - 0,60 - 1,19 - 0,60 - -

O (H) - 0,67 - 1,21 - 0,68 - -

FBT/FCF/USP 65

Neste contexto, para comprovar a ocorrência de efeito adsortivo foram

realizadas determinações sucessivas do potencial de redução dos nitrocompostos

empregando-se VOQ em meio aprótico, Figura 16, com as condições voltamétricas

descritas acima e variação da frequência. Foi escolhida a VOQ porque esta

metodologia apresenta melhor resolução dos picos em comparação à VC quando

empregada na investigação de processos adsortivos (Souza et al., 2002; Lovric, 2000).

A ausência de relação não linear entre os valores de corrente de pico obtidos

para o radical nitro ânion e o aumento da frequência indica que os efeitos de adsorção

estão envolvidos no processo eletródico. Este processo, também observado para o

meio misto, resulta em proposição da ocorrência de adsorção na superfície do eletrodo

de trabalho utilizado e na dificuldade de aplicação dos critérios de diagnóstico

utilizados para a confirmação do número de elétrons envolvidos na reação de redução.

* Valores de corrente obtidos para o radical nitro ânion.

Condições Experimentais: variação da frequência = 20-200 Hz, amplitude de pulso 50 mV,

degrau de potencial 0,042, Ei = - 0,1 V e Ef = - 0,9 V. Medidas realizadas com eletrodo de

carbono vítreo sem o polimento realizado entre cada voltamograma de onda quadrada .

Figura 16. Comportamento da corrente em função do acréscimo da freqüência

utilizada em VOQ, na redução da 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida

(Epc 1) em meio aprótico (DMSO).

0 4 8 12 16 20

1

2

3

4

5

6

7

8

9

(-)

I(

)

f1/2 (Hz)

*

FBT/FCF/USP 66

Desde que a utilização do meio aprótico neste trabalho não reflete,

necessariamente, o meio intracelular onde ocorre a atividade antichagásica, os

mesmos experimentos descritos anteriormente foram realizados em meio misto,

utilizando os eletrodos de carbono vítreo e a pasta de carbono como eletrodos de

trabalho. Este procedimento foi efetuado com a finalidade de aproximação, ao máximo

possível, do meio fisiológico do parasita causador da Doença de Chagas. Neste

aspecto, as determinações dos valores do potencial de redução dos nitrocompostos,

em meio misto, podem simular com maior aproximação o meio biológico, sendo mais

significativo para estudos de SAR/QSAR.

4.2.2 Meio misto (DMSO/solução tampão PIPES 50% v/v)

4.2.2.1 Eletrodo de carbono vítreo

A determinação dos potenciais de redução dos nitrocompostos em meio misto

de reação constituíu-se, inicialmente, no emprego da VC e de VOQ utilizando o

eletrodo de carbono vítreo como eletrodo de trabalho versus eletrodo de referência de

prata/cloreto de prata (Ag/AgCl, KClsaturado), e o eletrodo auxiliar de platina. A Figura 17

apresenta os voltamogramas cíclicos (A) e de onda quadrada (B) obtidos em solução

0,5 mmol L-1 de 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida em DMSO/solução tampão PIPES,

50% v/v, pH aparente de 7,4, contendo NaNO3 0,3 moL L-1 como eletrólito de suporte.

As medidas voltamétricas foram efetuadas na ausência de oxigênio, onde, borbulhou-

se o nitrogênio na solução por cinco minutos. Nos experimentos desenvolvidos neste

meio de reação, todavia, o borbulhamento de N2 arrasta o solvente diminuindo sua

concentração na solução. Este processo levou à formação de precipitados de

nitrocompostos testados e a instabilidade dos resultados. Isso provocou a

impossibilidade, em algumas vezes, do emprego das técnicas voltamétricas para a

determinação dos potenciais de redução.

As condições voltamétricas otimizadas para a investigação da formação do

radical nitro ânion a partir da redução dos nitrocompostos foram velocidade de

varredura de 500 mV s-1, faixa de potencial estendida (Ei = - 0,15 V, E1 = - 1,0 V,

E2 = 0,50 V e E f = - 0,15 V) e restrita (E i = - 0,15 V, E1 = - 0,9 V, E2 = - 0,05 V e

Ef = - 0,15 V). A Figura 17.A demonstra a formação de pico catódico durante a

redução (Epc 1) e a ocorrência de pico anódico (Epa 1) na varredura de potencial no

sentido reverso.

A redução dos nitrocompostos em meio misto foi estudada em várias

velocidades de verredura, na faixa de 0,05 a 1,0 V s -1, onde se observou que o pico

FBT/FCF/USP 67

Epc 1 apresenta deslocamento para valores de potencial mais negativos. O pico de

redução obtido, de acordo com comparação com o composto protótipo nifuroxazida,

descrito na literatura (Squella et al., 1996), pode ser caracterizado como a redução do

grupo nitro ao intermediário hidroxilamina em reação envolvendo quatro elétrons e

quatro prótons (Eq. 26).

Quando se restringe a faixa de potencial aplicada ao eletrodo de trabalho até o

potencial de -0,4 V não ocorre a formação do pico anódico Epa 1. Este fato indica que

Epa 1 é dependente da formação de Epc 1 e, de acordo com a redução de

nitrocompostos em meio misto, sugere-se a formação do intermediário nitroso a partir

da re-oxidação da hidroxilamina (Squella et al., 1996; Núñes-Vergara et al., 1995). Em

todos os voltamogramas cíclicos obtidos não foi possível determinar a formação de

pico anódico do radical nitro ânion em qualquer velocidade de varredura testada. Em

decorrência da formação da hidroxilamina, em reação irreversível, não foram aplicados

os critérios de diagnóstico do número de elétrons e do tipo de reação eletródica

característicos para as reações reversíveis e quasi-reversíveis, uma vez que o radical

nitro ânion não é observado com o emprego de VC.

Nos voltamogramas de onda quadrada obtidos com as condições voltamétricas

otimizadas, de freqüência de 100 Hz, amplitude de pulso 50 mV, degrau de potencial

de 0,042 V, reduziu-se a faixa de potencial investigada (E i = - 0,1 a E f = - 1,0 V), com a

finalidade de procurar isolar o par reversível Ar-NO2/Ar-NO2-.

A Figura 17.B demonstra a ocorrência de um pico catódico, Epc 1 (- 0,48 V), e

um pico anódico, Epa 1 (- 0,45 V) na re-oxidação dos produtos de redução dos

nitrocompostos. Adicionalmente, observou-se que a variação da freqüência, na faixa

de 50 a 500 Hz, não exerce influência sobre os potenciais de redução de Epc 1 e Epa

1. Este fato, somado a pequena diferença entre os valores dos potenciais de redução

do pico catódico e o anódico, indica a existência de reversibilidade característica para

o radical nitro ânion, na reação de redução do nitrocomposto a partir do estado

adsorvido. Em contraste, do mesmo modo como descrito para o meio aprótico, os

critérios de diagnóstico do número de elétrons envolvidos na reação eletródica não

puderam ser aplicados devido à ausência de relação linear (da corrente de pico de

redução com a raiz quadrada da freqüência), ou mesmo não linear, correspondente a

reações reversíveis ou quasi-reversíveis.

A diferença observada entre os voltamogramas cíclicos e de onda quadrada

obtidos pode ser devido a maior sensibilidade da VOQ em processos que envolvem

adsorção de reagentes ou produtos de reação (Souza et al., 2002; Lovric, 2000) na

superfície do eletrodo de carbono vítreo.

FBT/FCF/USP 68

Condições experimentais: Voltametria Cíclica = 500 mV s -1, faixa de potencial estendida

(----) E i = - 0,15 V, E1= - 0,9 V, E2= 0,5 V e E f = - 0,15 V e reduzida () E i = - 0,15 V,

E1= - 0,9 V, E2= - 0,05 V e Ef = - 0,1 V, e Voltametria de Onda Quadrada = 100 Hz,

amplitude de pulso 50 mV, degrau de potencial 0,042 e faixa de potencial empregada

Ei = - 0,1 V e Ef = - 0,9 V.

Figura 17. Voltamogramas cíclicos (A) e de onda quadrada (B) registrados com

eletrodo de carbono vítreo em solução 0,5 mmol L-1 da 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazida (DMSO/solução tampão PIPES, 50% v/v).

A

B

-1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4

Epa,1

= 0,10 V

Epc,1

= - 0,58 V

0,0

(-) 5 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0

corrente direta

corrente reversa

Epc, 1

= - 0,48 V

Epa, 1

= - 0,45 V

0,0

( - ) 4 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

FBT/FCF/USP 69

4.2.2.2 Eletrodo de pasta de carbono

O eletrodo de pasta de carbono foi utilizado como alternativa ao eletrodo de

carbono vítreo na determinação da formação do radical nitro ânion a partir dos

nitrocompostos. A escolha deste material foi feita em função da possibilidade deste ser

mais hidrofóbico que o carbono vítreo, o que estabilizaria o radical, além de permitir a

fácil renovação da superfície do eletrodo de trabalho.

Os voltamogramas cíclicos e de onda quadrada obtidos para os

nitrocompostos, com o emprego do eletrodo de pasta de carbono, foram realizados

utilizando-se as mesmas condições dos testes envolvendo eletrodo de carbono vítreo,

entre os quais estão a janela de potencial, a amplitude de pulso e a concentração do

meio misto de reação. A determinação dos potenciais de redução dos nitrocompostos

foi realizada em meio misto de DMSO/solução tampão PIPES, 50% v/v, pH aparente

7,4, e eletrólito de suporte NaNO3 0,3 mmol L-1.

Os voltamogramas obtidos demonstraram resultados muito similares aos

determinados com o emprego do eletrodo de carbono vítreo. Por outro lado, a pasta

de carbono perde consistência em presença de DMSO na solução, apresentando-se

instável em grande parte das medidas voltamétricas. Diante do exposto, foram

descontinuados os estudos com este tipo de eletrodo de trabalho no presente meio de

reação.

4.2.3 Meio prótico (aquoso)

Em virtude da obtenção do potencial de redução do radical nitro ânion nos

meios misto e aprótico partiu-se para medidas em meio 100% prótico, as quais

apresentam maior proximidade ao meio intracelular onde ocorre a atividade

antichagásica. Nestas condições, foi realizada a imobilização dos nitrocompostos em

pasta de carbono, o que permitiu transpor a solubilidadade reduzida dos derivados

estudados e possibilitou a investigação eletroquímica destes em meio aquoso prótico.

A escolha do eletrodo de pasta de carbono modificado com nitrocomposto

ocorreu também devido à facilidade de construção e a possibilidade do emprego de

outras soluções tampão não empregadas até o momento. Este procedimento permitiu,

quando em comparação com o eletrodo de carbono vítreo, a renovação da superfície

eletródica ocorre sem a necessidade de processo complexo de limpeza (Radi, 1999;

Buchberger et al., 1998; Kalcher et al., 1995; Rice et al., 1983).

Esta etapa envolveu a modificação da constituição da pasta de carbono, sendo

preparada com 10% m/v de 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida homogeneizado na

massa da pasta. Assim, nitrocomposto ficou imobilizado na pasta de carbono bem

como na superfície do eletrodo de trabalho. As medidas experimentais otimizadas

FBT/FCF/USP 70

envolveram a redução eletroquímica dos nitrocompostos em meio prótico e pH neutro,

sendo a velocidade de varredura de 2000 mV s-1 e faixa de potencial de Ei = - 0,10 V,

E1 = -0,9 V, E2 = -0,05 V e E f = -0,05 V para a VC e = 500 Hz, amplitude de pulso 50

mV, degrau de potencial 0,0042 V, Ei = - 0,2 V e Ef = - 0,6 V, para a VOQ.

Os critérios de diagnóstico normalmente utilizados para as voltametrias cíclica

e de onda quadrada, Tabela 3, não podem ser utilizados neste caso, uma vez que o

composto analisado encontra-se presente na constituição da pasta de carbono. Este

fato impediu a determinação do número de elétrons envolvidos em cada pico de

redução obtido. Todavia, ressalta-se que o processo eletródico geralmente obtido

infere em reação irreversível com transferência de quatro elétrons e quatro prótons

(Eq. 26). A Figura 18 demonstra os voltamogramas cíclico (A) e de onda quadrada (B)

obtidos nas condições mencionadas anteriormente.

Os voltamogramas demonstraram a ocorrência de dois picos catódicos, Epc

1, e Epc 2, e permitiram a visualização de componente anódico, Epa, 1, na varredura

de potencial no sentido reverso. O potencial de inversão de varredura foi fixado ao

final do processo de redução de Epc 1, justamente antes da formação do segundo

pico de redução (Epc 2). Este procedimento resultou no desaparecimento do

componente anódico anteriormente gerado (Epa 1), demonstrando, portanto, ser este

dependente do pico registrado em Epc 2. Tal comportamento dificultou a comprovação

de que o pico registrado em Epc 1 realmente se deve à formação do radical nitro ânion

a partir da redução do nitrocomposto em meio prótico. Por outro lado, a razão das

correntes de pico catódicos obtidas em Epc 1 e Epc 2 apresentam valores indicando

que o número de elétrons envolvidos no primeiro pico de redução é 1/3 do número de

elétrons envolvidos no segundo pico de redução. Isto indica que o provável

mecanismo envolvido nesta reação é o descrito nas equações 24 e 25.

Em medidas voltametricas que envolvem o aumento da velocidade de

varredura (VC), na faixa de 100 a 2000 mV s-1, e freqüências de 50 a 500 Hz (VOQ),

observou-se que Epc 1 não é visível em velocidades de varredura e freqüências

menores que 500 mV s-1 e 200 Hz, respectivamente. A partir destes resultados sugere-

se que o radical nitro ânion apresenta meia vida muito curta em meio prótico e não

pode ser detectado em voltamogramas realizados em velocidades lentas.

Com a finalidade de verificar se Epc 1 possui componente anódico, elevou-se

o pH do meio prótico para 10,0 (com adição de solução de NaOH 0,1 mol L-1) onde é

esperada maior estabilidade do radical nitro ânion. Utilizou-se, também, a solução de

NaOH, em pH 10,0 para confirmação dos resultados obtidos com o tampão PIPES (pH

10,0). Desse modo, os voltamogramas foram obtidos empregando-se as mesmas

FBT/FCF/USP 71

condições voltamétricas utilizadas para determinar os voltamogramas em meio prótico

de pH 7,0. Os voltamogramas obtidos com a solução tampão PIPES apresentaram o

mesmo perfil voltamétrico e potenciais de redução que o meio constituído de NaOH.

Quando comparados às respostas voltamétricas, no entanto, os picos determinados

em NaOH apresentaram melhor resolução.

A Figura 19 A refere-se aos voltamogramas cíclicos obtidos em meio prótico

de pH 10,0 (meio NaOH). O voltamograma mostra que nesta condição o pico Epc 1

possui componente anódico e que a razão de correntes (Ipc,1/Ipa,1) é próxima da

unidade. Para confirmar a formação do radical nitro ânion reduziu-se a janela de

potencial (VC) e isolou-se o par reversível de redução caracterizando a ocorrência do

par redox. Assim, os picos Epc 1 e Epa 1 podem ser atribuídos à redução do

nitrocomposto ao respectivo radical e re-oxidação deste ao composto original em

reação eletródica envolvendo um elétron.

O segundo pico de redução (Epc 2) não apresentou componente anódico

correspondente nesta janela restrita de potencial, e pode ser atribuído à redução do

radical ao intermediário hidroxilamina em processo envolvendo mais três elétrons e

quatro prótons.

A partir dos voltamogramas de onda quadrada foi possível observar a formação

de dois picos de redução (Epc 1 e Epc 2), assim como dois picos de re-oxidação (Epa

1 e Epa 2), dos produtos eletroquimicamente gerados durante o processo de redução.

O potencial de inversão de varredura foi fixado ao final do processo de redução de Epc

1, justamente antes da formação do segundo pico de redução (Epc 2). Este

procedimento resultou em manutenção do componente anódico Epa 2 e demonstrou,

portanto, que Epa 2 é dependente do pico registrado em Epc 1. A partir deste

resultado sugere-se a formação de radical nitro ânion caracterizado por Epc 1 e sua

re-oxidação ao nitrocomposto de partida (Epa 2).

O primeiro pico anódico (Epa 1) não sofre influência da variação da freqüência

aplicada nos diversos voltamogramas de onda quadrada registrados e foi atribuído a

re-oxidação do intermediário hidroxilamina ao intermediário nitroso. A presença de Epa

1 pode ocorrer em região negativa de potencial devido a ocorrência de processo

adsortivo. A diferença observada entre voltamogramas cíclicos e de onda quadrada

obtidos, mais precisamente na formação de Epa 2, pode ser devido à maior

sensibilidade da VOQ em relação a VC, na detecção do material adsorvido. Este

procedimento experimental encontra-se ainda em fase de investigação no Laboratório

de Bioeletroanalítica e Bioeletroquímica do IQ/USP e envolve o emprego de outras

soluções-tampão e o estudo dos picos obtidos em faixa estendida de potencial.

FBT/FCF/USP 72

Condições experimentais: A) Voltametria Cíclica: = 2000 mV s-1, Ei = - 0,15 V, E= - 0,9 V e

Ef = - 0,1 V, B) Voltametria de Onda Quadrada: = 500 Hz, amplitude de pulso 50 mV,

degrau de potencial 0,0042, Ei = - 0,2 V e Ef = - 0,6 V.

Figura 18. Voltamogramas registrados com eletrodo de pasta de carbono ( ----) e

eletrodo de pasta de carbono modificado com a 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazida () em solução tampão PIPES pH 7,06.

A

B

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0

Epc, 2

= - 0,45 V

Epc, 1

= - 0,33 V

Epa, 1

= - 0,22 V

0,0

(-) 20 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0

corrente reversa

corrente direta

Epa, 1

= - 0,35 V

Epc, 2

= - 0,43 V

Epc, 1

= - 0,31 V

0,0

(-) 20 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

FBT/FCF/USP 73

Condições experimentais: A) Voltametria Cíclica: = 2000 mV s -1, Ei = -0,15 V, E= -0,9 V e

Ef = -0,1 V, B) Voltametria de Onda Quadrada: = 500 Hz, amplitude de pulso 50 mV,

degrau de potencial 0,0042, Ei = -0,2 V e Ef = -0,9 V.

Figura 19. Voltamogramas registrados com eletrodo de pasta de carbono (----) e

eletrodo de pasta de carbono modificado com a 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazida () em solução NaOH (pH 10,0).

B

A

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0

Epa, 1

= - 0,41 V

Epc, 2

= - 0,64 V

Epc, 1

= - 0,41 V

0,0

(-) 10 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0

corrente

reversacorrente

direta

0,0

Epa, 2

= - 0,43 VE

pa, 1= - 0,53 V

Epc, 2

= -0,64

Epc, 1

= - 0,43 V

(-) 10 ()

E vs Ag/AgCl, KClsat.

/ V

FBT/FCF/USP 74

Este estudo envolveu a determinação do potencial de redução (E1/2) e o

potencial de pico catódico (referente ao primeiro pico de redução - Epc 1) de todos os

nitrocompostos escolhidos para o estudo de QSPR e SAR/QSAR. O potencial de

redução de todos os compostos foi determinado por meio da somatória dos valores

dos picos catódico (Epc 1) e anódico (Epa 1) e dividido pela metade. Ressanta-se, no

entanto, que o radical nitro ânion foi determinado em meio prótico apenas para os

derivados 5-nitro-tiofilidenos, uma vez que os 5-nitro-furfurilidenos não apresentaram

resposta voltamétrica para o referido radical no meio de reação estudado.

Os valores dos potenciais de pico catódico (Epc 1) e os potenciais de redução

(E1/2) dos nitrocompostos, determinados nos meios aprótico (utilizando VC) e misto

(utilizando VOQ), em conjunto com os valores dos potenciais de pico catódico (Epc 1)

dos 5-nitro-tiofilidênicos, determinados em meio prótico (utilizando VC), estão

apresentados na Tabela 5.

FBT/FCF/USP 75

Tabela 5. Valores de E1/2 dos nitrocompostos, referente ao par Ar-NO2/Ar-NO2-, e Epc 1

obtidos em meio aprótico (VC), em meio misto (VOQ) e meio prótico (VC).

(X = S ou O) Meio aprótico Meio misto Meio aquoso

Y Epc 1* E1/2** Epc 1* E1/2** Epc 1*

(S) H - 0,67 - 0,62 - 0,48 - 0,46 - 0,33

(S) CH3 - 0,68 - 0,58 - 0,46 - 0,44 - 0,33

(S) Cl - 0,75 - 0,70 - 0,46 - 0,43 - 0,33

(S) F - 0,68 - 0,62 - 0,49 - 0,46 - 0,33

(S) CF3 - 0,65 - 0,61 - 0,47 - 0,44 - 0,33

(S) OCH3 - 0,68 - 0,63 - 0,46 - 0,45 -

(S) OCH2CH3 - 0,68 - 0,63 - 0,48 - 0,45 - 0,33

(S) N(CH3)2 - 0,67 - 0,62 - 0,48 - 0,48 - 0,33

(S) NH2 - 0,70 - 0,64 - 0,47 - 0,47 -

(S) SO2NH2 - - - 0,46 - 0,44 -

(S) OH - - - 0,47 - 0,46 -

(S) CN - - - 0,43 - 0,40 -

(O) H - 0,72 - 0,68 - 0,47 - 0,44 -

(O) CH3 - 0,72 - 0,68 - 0,48 - 0,45 -

(O) Cl - 0,72 - 0,68 - 0,45 - 0,43 -

(O) F - 0,75 - 0,68 - 0,46 - 0,44 -

(O) CF3 - 0,52 - 0,50 - 0,51 - -

(O) OCH3 - 0,72 - 0,68 - 0,46 - 0,44 -

(O) OCH2CH3 - 0,72 - 0,70 - 0,49 - 0,47 -

(O) N(CH3)2 - 0,75 - 0,68 - 0,47 - 0,45 -

(O) NH2 - 0,69 - 0,68 - 0,47 - 0,42 -

(O) SO2NH2 - - - 0,47 - 0,46 -

(O) OH - 0,73 - 0,70 - 0,47 - 0,46 -

* Epc 1 significa potencial de pico catódico (Volts) e ** E1/2 potencial de redução (Volts)

determinados em triplicata e desvio padrão máximo de 0,02V (3,0%).

XO

N N

NO2

Y

FBT/FCF/USP 76

4.3 Modelagem Molecular

4.3.1 Cálculo de otimização de geometria estrutural

As moléculas foram desenhadas nos pacotes computacionais Spartan 02 para

Linux e Spartan 04 para Windows, e as estruturas tridimencionais submetidas ao

processo de otimização de geometria, empregando o método de mecânica molecular

MMFF94 e o método semi-empírico Hamiltoniano AM1.

Adicionalmente, quando necessário, foram utilizados os métodos de mecânica

quântica ab initio em nível Hartree-Fock com conjunto de bases 3-21G* e 6-31G* para

corroborar os resultados obtidos por AM1. Neste contexto, ressalta-se que o processo

de otimização de geometria estrutural dos nitrocompostos por AM1 apresentou a

mesma conformação obtida a partir de cálculos ab initio Hartree-Fock 6-31G*.

Ademais, as formas espaciais obtidas em ambas metodologias foram similares às

obtidas através do método de análise conformacional. Os cálculos da geometria

estrutural otimizada, obtida nesta etapa do trabalho, para todos os nitrocompostos

apresentaram desvios (root mean square – RMS) de, no máximo, 0,1 Kcal/mol. Estes

valores foram similares aos valores obtidos na análise conformacional e no cálculo de

carga de ponto único.

4.3.2 Análise conformacional

A análise conformacional dos nitrocompostos foi realizada por método AM1 em

meio solvatado e vácuo. Inicialmente, os estudos foram direcionados para a obtenção

dos confôrmeros de energia mínima dos derivados 5-nitro-tiofilidênicos no vácuo.

Estes derivados foram representados pela 5-nitro-2-tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida

(S) e são demonstrados na Figura 20.1 (S) por modelo “space filling” (CPK) e em 20.2

(S) por modelo tubo, respectivamente.

A partir da análise conformacional dos derivados 5-nitro-tiofilidênicos foi

observado que estes apresentaram confôrmeros com configuração s-cis entre o

hidrogênio benzidrazídico e os dois átomos de hidrogênio do anel 5-nitro-tiofilidênico.

Observou-se, ainda, que o confôrmero de energia mínima s-cis apresentou valor de

1,10 Kcal/mol menor que o confôrmero s-trans obtido na mesma análise, o que indica

a ocorrência de maior estabilidade do confôrmero s-cis em relação à configuração s-

trans dos isoconfôrmeros obtidos.

Os confôrmeros dos derivados 5-nitro-furfurilidênicos, por outro lado,

representados na Figura 20.2 (O) pela 5-nitro-2-furfurilideno 4-hidroxi-benzidrazida

(nifuroxazida), apresentaram configuração s-trans entre os átomos de hidrogênio

presentes na mesma posição da molécula. Este efeito pode ser atribuído ao maior raio

FBT/FCF/USP 77

atômico e volume do átomo de enxofre em comparação ao átomo de oxigênio,

presentes no anel de cinco membros, o que proporciona maior impedimento estérico

frente à ocorrência de conformação s-trans dos 5-nitro-furfurilidênicos. Assim, a partir

da análise dos valores de energia termodinâmica obtidos, verificou-se que a

conformação s-trans registrada nesta análise apresenta valores de 0,71 Kcal/mol

menores que a configuração s-cis. Este resultado indica tendência de maior

estabilidade da configuração s-trans em meio vácuo para os compostos 5-nitro-2-

fufurilidênicos.

Figura 20. Confôrmeros de menor energia mínima obtidos por AM1 dos 5-nitro-

heterocíclicos (S) e (O): modelos CPK (1) e tubo - visão frontal e lateral

(2). Cor dos átomos: C (cinza); H (branco); N (Azul); O (vermelho); S

(verde).

Em paralelo ao estudo realizado em vácuo, a análise conformacional de

confôrmeros presentes em meio solvatado é relevante para a compreensão dos

mecanismos envolvidos no conjunto da atividade antichagásica, uma vez que os

parasitas encontram-se presentes em ambiente aquoso no organismo humano. O

estudo da interação entre soluto e solvente é geralmente um processo complicado e

poucos métodos matemáticos computacionais são aceitos e utilizados pela

comunidade científica para descrever estas interações (Anadan et al., 2004; Young,

2001). Entre estes, os métodos SCRF (self-consistent reaction field) e o modelo

derivativo contínuo de Born, conhecido como SM5.4 model, apresentam-se como

alternativas viáveis e robustas para investigar o efeito do solvente sobre os

confôrmeros dos nitrocompostos (Cramer, 2002; Yong, 2001; Dixon et al., 1993;

(S)

(O)

1 2

FBT/FCF/USP 78

Cramer & Truhlar, 1992). Desse modo, o modelo SM5.4, presente no programa de

modelagem molecular Spartan, foi utilizado para a investigação dos confôrmeros de

energia mínima em meio solvatado (Cramer, 2002).

A partir da análise dos confôrmeros de menor energia mínima dos derivados

5-nitro-tiofilidênicos e 5-nitro-furfurilidênicos obtidos por método AM1, em meio

solvatado, alcançaram-se compostos que apresentam configuração s-trans entre o

hidrogênio benzidrazídico e os dois átomos de hidrogênio do anel 5-nitro-tiofilidênico.

A diferença observada entre os distintos meios solvatado e vácuo pode ser decorrente

da forma como o programa abrange (ou parametriza) o átomo de enxofre ou como

realiza o cálculo de investigação conformacional.

Os diferentes confôrmeros obtidos na análise conformacional apresentaram

pequena diferença para os valores de energia termodinâmica calculada. Como

demonstrado para a nifuroxazida, 5-nitro-2-tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida, os

confôrmeros que apresentam as configurações s-trans e s-cis registrados em meio

vácuo demonstram valores de energia de 19,24 e 20,34 Kcal/mol, respectivamente.

Para o mesmo composto, em meio solvatado os valores de energia obtidos para os

confôrmeros s-trans e s-cis foram 4,89 e 4,97 Kcal/mol, respectivamente. A partir

destes dados é possível afirmar a ocorrência de isoconfôrmeros, ou seja, não existe

diferença significativa dos valores de energia termodinâmica entre os confôrmeros de

energia mínima obtidos nos meios pesquisados, não ultrapassando valores de 1,6

Kcal/mol entre todos os confôrmeros. Este comportamento foi também registrado para

todos os 5-nitro-heterocíclicos estudados. Desse modo, foi escolhido o meio vácuo

para a continuidade dos experimentos devido a maior variação entre os valores de

energia, em comparação com o meio solvatado, dos diferentes confôrmeros obtidos

através da análise conformacional.

A partir da análise dos confôrmeros obtidos em meios solvatado e vácuo por

método AM1, e dos estudos de otimização de geometria das estruturas das 5-nitro-

2-furfurilideno 4-hidroxi-benzidrazida e 5-nitro-2-tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida em

nível Hartree-Fock com o conjunto de bases 3-21G* e 6-31G*, foi observada a

ocorrência de efeito co-planar da molécula do grupo nitro até a carbonila

benzidrazídica, Figura 20, visão lateral. A molécula sofre deformação angular na

ligação do anel benzênico com a carbonila, ângulo torsional 4 na Figura 12. Esta

observação é compatível com os dados cristalográficos obtidos na literatura para a

nifuroxazida, (O) (Pniewska e Januchowski, 1998). A análise conformacional dos

compostos 5-nitro-2-tiofilideno e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas, através da

FBT/FCF/USP 79

variação de 30º dos ângulos () 1 a 6, revelou orientação espacial em comum a todos

os 5-nitro-heterocíclicos estudados.

A similaridade estrutural com os dados cristalográficos propostos por Pniewska

e Januchowski, em 1998, semelhante à configuração estrutural da nifuroxazida

estudada por Boussac et al., em 2003, se infere somente ao efeito co-planar citado

acima e, no entanto, diferem de forma acentuada quanto à configuração observada. A

nifuroxazida obtida por meio da análise conformacional apresenta configuração s-trans

entre o hidrogênio da porção (HC=N) hidrazídica e os dois átomos de hidrogênio do

anel nitrotiofilidênico. Do mesmo modo, a carbonila se encontra em configuração

s-trans em relação aos átomos de hidrogênio da porção hidrazídica-nitrotiofilidênica.

Para a estrutura retirada da literatura, todos os átomos de hidrogênio da porção

hidrazídica-nitrotiofilidênica se encontram em posição s-cis, Figura 20. Ressalta-se

ainda que a porção hidrazídica tenha sido alvo de estudos que visam definir a sua

configuração real, sendo que alguns autores sugerem, a partir de moléculas similares

aos compostos estudados neste trabalho, a ocorrência simultânea de isoconfôrmeros

de configuração s-cis e s-trans (Carvalho et al., 2004; Ifa et al., 2000).

No presente estudo de modelagem molecular, o confôrmero obtido a partir dos

dados cristalográficos (hidrogênios em configuração s-cis), apresentou a posição de

qüinquagésimo nono lugar em lista contendo todos os confôrmeros de menor energia

obtida por método semi-empírico AM1, com valor de energia de formação de

5,44 Kcal/mol maior que o confôrmero s-trans (1). Desse modo, o confôrmero de

menor energia obtido (1) e o confôrmero extraído a partir dos dados cristalográficos

foram submetidos à nova otimização de geometria empregando-se o método ab initio

6-31G* visando a comprovação da real estrutura presente nos meios estudados.

Os valores de energia para o confôrmero 1 foram -997,13 e -997,15 au2 em

vácuo e em meio solvatado, respectivamente. O confôrmero de número 59 apresentou

valores de energia de -997,12 e -997,14 au2 em ambos os meios estudados. A partir

da análise dos resultados obtidos por métodos AM1 e ab initio é possível concluir que

a configuração de menor energia obtida pelos métodos computacionais é diferente e

teoricamente mais estável do que a configuração determinada quando na forma de

cristais, obtida em meio de DMSO.

FBT/FCF/USP 80

Figura 21. Confôrmero de menor energia mínima obtido por método AM1

(configuração s-trans) e confôrmero (hidrogênios em configuração s-cis)

descrito na literatura para a nifuroxazida: modelo misto de bolas e tubo.

Coloração dos átomos: C (cinza); H (branco); N (Azul); O (vermelho); S

(verde).

O padrão estrutural que visualiza a quebra de efeito co-planar na estrutura da

molécula indica que o efeito eletrônico não se transmite da porção 5-nitro-tiofilidênica

ou 5-nitro-furfurilidênica até a extremidade do anel benzênico molecular, região onde

foi realizada a variação estrutural. Em virtude da ocorrência da citada conformação

dos 5-nitro-heterocíclicos pode-se sugerir que ocorre ausência do efeito mesomérico

conjugado em todo conjunto da molécula.

A conformação que registra a quebra de efeito co-planar na estrutura dos

nitrocompostos sugere a ocorrência de repulsão, por meio de efeito estérico, dos

átomos de hidrogênio do anel benzênico e os hidrogênios da porção hidrazídica da

molécula.

Com o objetivo de avaliar a influência da presença do anel benzênico sobre a

conformação dos nitrocompostos foram realizados estudos de modelagem molecular,

submetidos à otimização de geometria estrutural e análise conformacional, de

compostos que não possuem o anel benzênico em sua estrutura química, a saber:

5-nitro-tiofilideno 4-fluor-di-vinilhidrazida e a 5-nitro-tiofilideno etilhidrazida. A partir

desta análise verificou-se que há ausência de torção na ligação da porção etil ou

4-flúor-divinil ligada à porção hidrazídica, Figura 22, sendo diferente da observada

quando na presença do anel benzênico. Desse modo, pode-se sugerir que o anel

benzênico é fator preponderante à quebra de efeito co-planar na estrutura dos

nitrocompostos.

Átomos de hidrogênio emconfiguração s-cis.

Átomos de hidrogênio emconfiguração s-trans.

FBT/FCF/USP 81

Figura 22. Estrutura química dos nitrocompostos (A) 5-nitro-2-tiofilideno 4-fluor-di-

vinilhidrazida e (B) 5-nitro-2-tiofilideno 4-etilhidrazida utilizados na

investigação da influência do anel benzênico sobre a conformação dos

derivados 5-nitro-heterocíclicos.

Ainda visando obter dados que corroborem a constituição de torção estrutural

da porção do anel benzênico realizaram-se experimentos de espectrofotometria

UV/Visível com o objetivo de obter informações sobre a ocorrência, ou não, de grupos

cromóforos conjugados na estrutura dos nitrocompostos.

Os espectros obtidos com varredura entre 200-750 nm, velocidade 1200 nm

min-1 registraram sinais em valores de comprimento de onda () diferentes, os quais

correspondem a cromóforos característicos de sistemas ressonantes não-conjugados

(Claidem, 2000). Estes resultados sugerem a ausência de efeito mesomérico

conjugado na estrutura dos 5-nitro-heterocíclicos. As bandas registradas nos

espectros UV/Visível (anexo 1) para o composto 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida

foram 1 = 211 nm, máx,2 = 381 nm. Este comportamento foi observado para todos os

compostos estudados.

Em virtude aos resultados descritos acima, foi proposta outra hipótese visando

explicar a ausência de efeito co-planar na estrutura dos nitrocompostos. Esta

proposição, apresentada na Figura 23, propõe a ocorrência de equilíbrio ceto-enólico,

a partir da estrutura padrão da porção 5-nitro-benzidrazídica. Os estudos de

otimização de geometria da estrutura da 5-nitro-2-tiofilideno benzo-enol 1-

metilenohidrazina seguidos pela análise conformacional e cálculo de energia de carga

de ponto único, realizados com emprego dos métodos AM1 e ab initio em nível HF

com conjunto de bases 3-21G*, permitiram observar a quebra do efeito co-planar em

duas porções da molécula do nitrocomposto, sendo a primeira no carbono enólico e a

segunda no anel benzênico. Este resultado comprovaria a ausência de transmissão do

efeito mesomérico através da molécula. Todavia, ao comparar os valores de energia

SO

N N

NO2

H

HH

FH

H

H

SO

N N

NO2

H

H

H H

H H

H

A B

FBT/FCF/USP 82

termodinâmica dos compostos enólico e ceto-benzidrazídicos, foi observado que a

estrutura enólica apresenta valor de 5,0 kcal/mol maior que o valor obtido para a

carbonilica, o que significa maior estabilidade da estrutura padrão dos derivados 5-

nitro-2-heterocíclo benzidrazida. Após este estudo, foi abandonada a hipótese de

formação dos compostos enol-benzidrazícos.

Figura 23. Hipótese de ocorrência de equilíbrio ceto-enólico da estrutura da 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazida.

4.3.3 Cálculo de energia de carga de ponto único

Ao escolher os confôrmeros dos nitrocompostos em vácuo foi calculada em

seguida a energia de ponto único juntamente com diversos parâmetros físico-

químicos, a saber: energia de HOMO e de LUMO, diferença entre os valores de

energia de HOMO e LUMO (bandgap), energia de formação em meio vácuo e

solvatado, momento de dipolo, valores de distâncias intramoleculares e volume

molecular.

A conformação obtida na análise de cálculo de energia de carga de ponto único

é a mesma observada para os confôrmeros de energia mínima determinados pela

análise conformacional. Os parâmetros estruturais dos confôrmeros obtidos em vácuo,

tais como ângulos diedro, O16-C7-C4-C5 (1), N8-C7-C4-C3 (2), que correspondem a

torção das ligações 3 e 4, C10-N9-N8-C7 (3), que corresponde a torção das

ligações 2 e 3, as distâncias interatômicas medidas entre as extremidades das

moléculas, e entre o O1 (oxigênio do grupo carbonila) e o hidrogênio do grupo H-C=N,

encontram-se listados na Tabela 5.

O ângulos diedros 1 e 2 determinados para os nitrocompostos apresentaram

variação de oito a nove graus, na faixa de 34-45 oC para 1 e 36-45 oC para 2, o que

define pequena diferença na conformação entre os compostos estudados. A partir da

análise destes resultados, similares aos obtidos a partir a análise conformacional,

sugere-se que o anel benzênico se apresenta com desvio aproximado de 40o fora do

SO

N N

NO2H

H

SO

N N

NO2

H

HSO

N N

NO2

H

H

FBT/FCF/USP 83

plano da porção 5-nitro-heterocíclico-acilhidrazida, o que corrobora a quebra de efeito

co-planar na estrutura dos nitrocompostos.

Para o ângulo diedro de número 3 a variação angular observada entre os

diversos nitrocompostos foi cerca de 1 grau. Esta diferença poderia indicar que algum

composto apresenta maior quebra de efeito co-planar nesta porção da molécula em

relação às moléculas da mesma classe, entretanto, a variação observada não foi

significativa.

Foram analisadas duas distâncias interatômicas que poderiam estar

influenciando tanto a conformação molecular como a atividade antichagásica

potencial. A determinação da primeira distância intramolecular envolveu os átomos O1

(oxigênio do grupo carbonila) e o hidrogênio da porção H-C=N, os quais poderiam

representar a distância necessária para a formação de ligação de hidrogênio

intramolecular não formal, caracterizando a ocorrência de anel heterocíclico na

molécula dos nitrocompostos. Esta estrutura química hipotética se apresentaria

contorcida e, portanto, sem a ocorrência de efeito co-planar na porção hidrazídica-

nitrotiofilidênica ou hidrazídica-nitrofurfurilidênica.

Embora as distâncias determinadas para todos os 5-nitro-heterocíclicos

apresentem valores de 2,22 a 2,24 Â que favorecem a formação de ligação de

hidrogênio, a partir da análise de otimização de geometria estrutural da 5-nitro-

2-tiofilideno banzidrazida e do análogo anelado, foi descartada esta hipótese devido

aos compostos apresentarem valores de energia mínima maiores que os compostos

sem ligação de hidrogênio interna. Tais resultados significam que a molécula

hipotética seria mais instável que os 5-nitro-heterocíclicos inicialmente propostos neste

trabalho.

A determinação da segunda distância intramolecular envolveu as extremidades

de todos os 5-nitro-heterocíclicos. Como se pode esperar, a distância é tanto maior

quanto maior for o volume do grupo inserido em posição para do anel benzênico da

estrutura dos compostos estudados. Estas medidas podem fornecer subsídios

relevantes para o estudo fármaco-receptor, ou mesmo, definir a influência do tamanho

molecular sobre a atividade antichagásica destes compostos. Os valores calculados

das distâncias intramoleculares e dos ângulos diedro encontram-se ilustrados na

Tabela 6.

FBT/FCF/USP 84

Tabela 6. Valores de ângulos diedros e distâncias atômicas de maior importância para

o estudo dos nitrocompostos.

(X = S ou O) Ângulos diedros (graus)Distâncias

interatômicas (Â)

Substituição

em C1O16-C7-C4-C5 N8-C7-C4-C3 C10-N9-N8-C7 O1-H17 extremidades

(S) H 38,61 40,85 2,62 2,22 14,30

(S) CH3 38,05 39,74 2,53 2,22 15,21

(S) Cl 38,75 41,00 3,13 2,23 14,37

(S) F 38,75 41,00 3,13 2,23 14,37

(S) CF3 40,71 42,87 3,15 2,23 15,54

(S) OCH3 35,88 38,35 3,23 2,22 16,45

(S) OCH2CH3 35,42 37,91 3,44 2,22 16,80

(S) N(CH3)2 34,01 36,55 3,68 2,22 16,59

(S) NH2 34,86 37,28 3,86 2,22 15,22

(S) SO2NH2 43,73 45,20 2,71 2,23 15,95

(S) OH 36,03 38,51 3,34 2,22 15,04

(S) CN 40,07 42,25 3,07 2,23 15,76

(O) H 38,39 41,29 2,18 2,23 14,12

(O) CH3 38,11 40,48 2,34 2,23 14,96

(O) Cl 41,29 41,29 2,71 2,23 14,37

(O) F 37,79 40,30 2,91 2,23 14,37

(O) CF3 40,80 43,80 2,69 2,24 15,20

(O) OCH3 35,62 38,26 2,71 2,23 16,23

(O) OCH2CH3 35,34 38,01 2,71 2,23 16,25

(O) N(CH3)2 35,59 36,31 2,91 2,23 16,32

(O) NH2 34,71 37,25 3,43 2,23 14,94

(O) SO2NH2 45,15 47,43 1,97 2,24 15,49

(O) OH 35,78 38,43 2,49 2,23 14,78

N N

XO H

H H H

H

HH

H

NO2

H

1

2

6

3

7

5

41716

15 14

13

128 9

10 11

28

23

24

22

21

201918

25-27

FBT/FCF/USP 85

4.3.4 Estudo estereoeletrônico

A análise estereoeletrônica é ferramenta importante no estudo de relações

quantitativas entre estrutura química e a atividade biológica de nitrocompostos

(Thakur et al., 2006; Monastérios et al., 2005). A partir desta análise é possível

determinar, com precisão, as regiões envolvidas em interações eletrostáticas e em

mecanismos de transferência de carga entre compostos estudados e receptores

biológicos (Arroio et al., 2005; Foye et al., 1995; Marshall, 1995). Paulino et al, 2002,

estudaram uma série de nitro-heterocíclicos antichagásicos e verificaram que

determinadas propriedades eletrônicas proporcionam melhor entendimento do

mecanismo de ação e podem influenciar a atividade antichagásica destas moléculas.

Em virtude à relevância destes dados, foram obtidas informações eletrônicas

em nível molecular, utilizando o método semi-empírico AM1, a partir do confôrmero de

menor energia mínima calculado em vácuo e submetido à análise de cálculo de

energia de carga de ponto único. Neste processo, foram calculadas, também, as

propriedades físico-químicas de energia de formação em vácuo e meio solvatado,

energia de HOMO e de LUMO, momento de dipolo e cargas eletrônicas de potencial

eletrostático. Os mapas 3D de isossuperfície de HOMO e LUMO, e de potencial

eletrostático estão ilustrados nas Figuras 24.1, 24.2 e 25, respectivamente. Os valores

de energia termodinâmica de formação (calor de formação) calculados para todos os

nitrocompostos estudados encontram-se ilustrados na Tabela 7.

4.3.4.A Energia de LUMO

A propriedade eletrônica de energia orbitalar de LUMO indica a capacidade de

determinada molécula de aceitar um elétron em dada reação, que pode ser

representada pela redução do grupo nitro dos 5-nitro-heterocíclicos ou interação

fármaco-receptor (Marshall, 1995; Rozenski et al., 1995). Segundo Monastérios et al,

2005, quando um nitrocomposto ganha um elétron em processo de redução é no

orbital LUMO onde o mesmo entrará na molécula. A energia utilizada neste processo

indica a maior facilidade ou, até mesmo, dificuldade de redução desta classe de

compostos. Ainda de acordo com Monastérios et al, 2005, alguns 5-nitrofuranos que

apresentam valores de energia de LUMO altamente negativos devem proporcionar

maior reatividade devido a capacidade de ganhar um elétron rapidamente.

Os valores calculados de LUMO, utilizando o método AM1, para toda classe

das 5-nitro-benzidrazidas não apresentaram grande variação, sendo o valor mínimo de

-1,31 eV para o derivado 5-nitro-2-furfurilideno 4-etóxi-benzidrazida e o valor máximo

de -1,69 eV para o derivado 5-nitro-2-tiofilideno 4-trifluormetila-benzidrazida. Os

FBT/FCF/USP 86

valores de energia de LUMO calculados para todos os 5-nitro-heterocíclicos estudados

são observados na Tabela 7.

Os mapas 3D de distribuição de LUMO para os compostos 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazida e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida estão ilustrados na

Figura 24.1 B e 24.2 B, respectivamente. A investigação dos mapas mostra que a

distribuição de energia encontra-se localizada na região 5-nitro-2-heterociclo

hidrazídica da estrutura de ambos nitrocompostos não substituídos.

Os compostos que possuem grupos aceptores de elétrons ligados à posição

para do anel benzênico apresentam a energia de LUMO distribuída por quase toda a

molécula dos nitrocompostos. O anel benzênico e o nitrogênio da porção amídica

apresentam menor intensidade de energia de LUMO em comparação com a região do

anel 5-nitro-heterocíclico.

Os compostos que possuem grupos doadores ligados à mesma porção

molecular dos nitrocompostos apresentam a energia de LUMO distribuída na região

5-nitro-heterocíclica hidrazídica, encontrando-se ausente na porção do anel benzênico

substituído.

4.3.4.B Energia de HOMO

A propriedade eletrônica de energia orbitalar de HOMO indica a capacidade de

determinada molécula de doar um elétron em dada reação (Barreiro et. al., 1997;

Marshall, 1995) a qual é diretamente relacionada ao potencial de ionização e pode ser

relevante na interação fármaco-receptor, resultando, também, em influência direta

sobre a atividade biológica destes compostos.

Os valores calculados de energia orbitalar de HOMO, utilizndo o método AM1,

para toda classe das 5-nitro-benzidrazidas não apresentaram grande variação quando

comparados entre os compostos do mesmo subconjunto, sendo o valor mínimo de -

8,81 eV para o derivado 5-nitro-2-tiofilideno 4-dimetilamino-benzidrazida e o valor

máximo de -9,63 eV para o derivado 5-nitro-2-tiofilideno 4-trifluormetila-benzidrazida.

Os mapas de distribuição orbitalar de HOMO para os compostos 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazida e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida estão ilustrados na

Figura 24.1 A e 24.2 A, respectivamente. Os valores de energia de HOMO calculados

para todos os 5-nitro-heterocíclicos estudados são observados na Tabela 7.

Os mapas 3D de distribuição orbitalar de HOMO para todos os compostos

5-nitro-heterocíclicos demonstram haver vários sítios difundidos na porção 5-nitro-

furfurilidênica ou tiofilidênica hidrazidica da molécula. Os derivados 5-nitro-tiofilidênicos

apresentam sítio de energia de HOMO no átomo de enxofre do anel heterocíclico,

efeito não observado para oxigênio do anel de cinco membros dos derivados 5-nitro-

FBT/FCF/USP 87

furfurilidênicos. Esta característica foi observada entre todos os mapas obtidos a partir

dos derivados 5-nitro-furfurilidênicos e 5-nitro-tiofilidênicos.

A presença de grupos substituintes em posição para do anel benzênico dos

nitrocompostos é fator relevante no estudo do efeito eletrônico destes compostos.

Quando grupos aceptores encontram-se ligados à molécula, a energia de HOMO

apresenta-se distribuída de maneira similar aos compostos não substituídos, ou seja,

localizados na porção 5-nitro-2-tiofilidênico hidrazídica ou 5-nitro-2-furfurilidênico

hidrazídica. Neste contexto, observou-se também que a distribuição da energia de

HOMO apresenta maior intensidade na porção hidrazídica e de menor intensidade na

porção 5-nitro-2-heterocíclica.

Quando grupos doadores de elétrons encontram-se ligados ao anel benzênico

dos nitrocompostos, a energia de HOMO encontra-se distribuída por quase toda a

molécula dos 5-nitro-heterocíclicos, encontrando-se ausente somente na carbonila e

no carbono 18 do anel heterocíclico. Nestes experimentos, o derivado 5-nitro-

2-furfurilideno 4-metill-benzidrazida não apresentou distribuição da energia de HOMO

no anel benzênico.

1A

Figura 24. Mapas de distribuição orbitalar de HOMO (A) e LUMO (B) calculados por

AM1 para os compostos 1) 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida e 2) 5-nitro-2-

furfurilideno benzidrazida, isossuperfície de 0,032 eV. Cor dos átomos: C

(cinza); H (branco); N (Azul); O (vermelho); S (verde).

1A 1B

2A 2B

FBT/FCF/USP 88

4.3.4.C Propriedades eletrônicas obtidas com os valores de HOMO e LUMO

Os valores das propriedades físico-químicas obtidas a partir dos valores de

energia de HOMO e de LUMO como bandgap, dureza química, afinidade eletrônica,

potencial de ionização e potencial químico, encontram-se ilustrados na Tabela 7.

Entre estas propriedades, a análise da dureza química calculada a partir dos

nitrocompostos é relevante para o entendimento da reatividade da molécula e, em

alguns casos, de propriedades importantes (Thanikaivelan et al., 2000; Parr &

Chattaraj, 1991) para este sistema molecular. Para os derivados 5-nitro-2-tiofilideno

benzidrazidas, observou-se a ocorrência de pequena variação de -3,68 eV (derivado

dimetilamino) até -4,01 eV (derivado trifluorometila), o que sugere que a reatividade

seja similar para os compostos estudados.

Para os derivados 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas observou-se a

ocorrência de variação maior dos valores de dureza química, de -3,79 eV (derivado

dimetilamina) até -4,04 eV (derivado trifluorometila) em comparação aos derivados

5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas. Embora tenha sido determinada a ocorrência de

diferença entre os valores da dureza química calculados para os nitrocompostos, tal

propriedade não apresenta diferença significativa entre os resultados obtidos e não

permite, portanto, a determinação de qual molécula apresenta maior reatividade.

A análise das demais propriedades físico-químicas obtidas a partir dos valores

de energia de HOMO e de LUMO encontra-se descrita em conjunto com os resultados

obtidos na análise de QSPR dos nitrocompostos.

4.3.4.D Potencial eletrostático molecular – MEP

O potencial eletrostático molecular (molecular eletrostatic potential – MEP), é

propriedade eletrônica muito utilizada em estudos de relações quantitativas entre

estrutura química e a atividade biológica (Monastérios et al., 2005; Carvalho et al.,

2001). Ademais, a ilustração gráfica dos MEPs, obtida a partir de determinado cálculo

possibilita o entendimento de interações moleculares entre os sítios ricos e/ou pobres

em elétrons com o receptor biológico (Bhattachariee et al., 2000). Desse modo, os

MEPs de todos os nitrocompostos estudados foram obtidos por meio do cálculo de

energia de carga de ponto único e do método semi-empírico AM1. Os MEPs foram

determinados a partir dos confôrmeros de menor energia mínima obtidos na análise

conformacional. Os mapas de isosuperfíce de MEP em três dimensões sobrepostos à

densidade eletrônica total dos 5-nitro-heterocíclicos, obtidos são apresentados na

Figura 25.

FBT/FCF/USP 89

O perfil tridimensional dos MEPs das 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas é

similar ao obtido para os derivados 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas. A Figura 25.1

A (visão frontal) e 25.1 B (visão posterior), demonstra que as porções da carbonila e

dos oxigênios do grupo nitro da molécula são ricos em elétrons, efeito observado em

coloração vermelha nas superfícies das moléculas. Os átomos de hidrogênio ligados

ao anel benzênico, juntamente com os nitrogênios presentes no grupo nitro e na

porção hidrazídica, apresentam distribuição eletrônica reduzida, efeito observado em

coloração azul nas superfícies moleculares ilustradas na Figura 25. Observa-se ainda

maior intensidade de coloração azul sobre o átomo de nitrogênio do grupo nitro ligado

ao anel heterocíclico de cinco membros. Esta diferença de intensidade de coloração

pode ser decorrente da presença do átomo de enxofre ou oxigênio, do anel

heterocíclico, nas vizinhanças do grupo nitro.

Figura 25. Mapas tridimensionais do potencial eletrostático calculado por AM1 para os

compostos 1) 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazidas [(S)OH] e 2) 5-nitro-2-

furfurilidênico benzidrazidas [(O)H], isossuperfície de 0,002 eV. Parte

superior: (A) visão frontal; Abaixo (B) visão posterior. Escala de cor nível

11: vermelha -65,00, verde cerca de -10,00 até azul 41,00 Kcal/mol.

Na comparação dos MEPs, observou-se diferença visual qualitativa na

coloração do anel heterocíclico dos compostos 5-nitro tiofilidenicos, Figura 25.1, e

dos5-nitro-2-furfurilidênicos, Figura 25.2. O átomo de enxofre apresenta exposição

gráfica de coloração azul, representando a ocorrência de região com distribuição

2A

1B

1A

2B

FBT/FCF/USP 90

eletrônica reduzida. Já o átomo de oxigênio do anel heterocíclico, isóstero ao anel

tiofilideno, apresenta coloração verde, indicando a ocorrência de região com

densidade eletrônica elevada, o que caracteriza forte efeito eletrônico. Esta diferença

ocorre devido ao maior raio atômico do átomo de enxofre, de menor eletronegatividade

em relação ao átomo de oxigênio, o que confere maior distância do par de elétrons

livres e, portanto, proporciona maior facilidade de doar o mesmo para a região do

grupo nitro, fortemente aceptora de elétrons.

A visão frontal das moléculas dos nitrocompostos indica que o efeito eletrônico

se transmite fracamente através da estrutura química. Assim, o efeito eletrônico, de

coloração verde intensa e clara apresenta valores de densidade de energia de cerca

de -8,00 e 0,12 Kcal/mol, respectivamente, se inicia no grupo nitro e se transmite até o

grupo carbonila da porção hidrazídica. O anel benzênico apresenta este mesmo efeito,

no entanto, a comunicação do anel de seis membros com a porção hidrazídica se

encontra fraca na visão frontal e ausente na visão posterior da mesma molécula.

A introdução dos grupos substituintes em posição para do anel benzênico,

átomo de carbono denominado C1, não produz modificações significativas dos valores

de densidade de potencial eletrostático. A maior coloração azul ou vermelha registrada

no grupo substituinte é devido à característica intrínseca do grupo ligado ao C1.

No contexto do estudo das propriedades estereoeletrônicas, a análise das

cargas atômicas, especificamente as derivadas do potencial eletrostático,

fundamentadas no cálculo de energia pontual definida ao redor das moléculas

(Cramer, 2002; Guadagnini et al., 1996; Chirlian & Fracl, 1987) são relevantes para o

conhecimento de qual região da molécula é mais reativa ou também qual seria

fundamental para o entendimento das interações fármaco-receptor. Desse modo, as

cargas do átomo do carbono substituído (C1), do anel benzênico (QC1), juntamente

com o carbono localizado no anel heterocíclico de cinco membros ligado ao grupo nitro

(QC14) foram determinadas para todos os compostos estudados. Os valores das cargas

calculados por AM1 encontram-se ilustrados na Tabela 8.

A partir da análise dos resultados obtidos para as cargas de potencial

eletrostático no átomo C14 pode-se constatar que não ocorreu variação grande entre

os valores calculados para todos os compostos estudados (de 0,04 a -0,28). É

possível observar, no entanto, a separação do grupo dos derivados 5-nitro-2-

tiofilidênicos (-0,24 a -0,28) e 5-nitro-2-tiofilidênicos (0,04 a -0,01), o que reflete a

ocorrência da eletronegatividade do heteroátomo ligado ao carbono testado. Para o

átomo C1, os valores calculados para os nitrocompostos demonstram diferença de -

0,17 a 0,62, o que reflete a presença de grupo aceptores ou doadores de elétrons

ligados ao anel benzênico. Esta variação habilita o emprego do valor numérico de

FBT/FCF/USP 91

carga deste átomo em estudos de relação estrutura-atividade antichagásica e pode ser

utilizada no planejamento de novos compostos e no entendimento das interações

biológicas entre o composto químico e sítios ativos que desencadeiam a atividade

antichagásica

Tabela 7. Valores de HOMO, de LUMO dos nitrocompostos obtidos com o método

AM1 e das propriedades eletrônicas calculadas a partir destes.

Nitrocompostos Propridades eletrônicas

HOMOa LUMOa b b AEb PIb

(S) H -9,42 -1,53 -3,94 5,47 1,53 9,42

(S) CH3 -9,38 -1,51 -3,93 5,45 1,51 9,38

(S) Cl -9,49 -1,59 -3,95 5,54 1,59 9,49

(S) F -9,50 -1,59 -3,93 5,55 1,59 9,50

(S) CF3 -9,63 -1,69 -4,01 5,66 1,69 9,63

(S) OCH3 -9,35 -1,50 -3,92 5,43 1,50 9,35

(S) OCH2CH3 -9,33 -1,49 -3,92 5,41 1,49 9,33(S) N(CH3)2 -8,81 -1,43 -3,68 5,12 1,43 8,81

(S) NH2 -9,08 -1,45 -3,81 5,27 1,45 9,08

(S) SO2NH2 -9,38 -1,68 -3,96 5,53 1,68 9,38

(S) OH -9,39 -1,53 -3,93 5,46 1,53 9,39

(S) CN -9,60 -1,67 -3,96 5,64 1,67 9,60

(O) H -9,41 -1,34 -4,03 5,38 1,34 9,41

(O) CH3 -9,38 -1,33 -4,02 5,35 1,33 9,38

(O) Cl -9,49 -1,41 -4,03 5,45 1,41 9,49

(O) F -9,49 -1,41 -4,03 5,45 1,41 9,49

(O) CF3 -9,62 -1,53 -4,04 5,58 1,53 9,62

(O) OCH3 -8,82 -1,32 -4,01 5,07 1,32 8,82

(O) OCH2CH3 -9,33 -1,31 -4,01 5,32 1,31 9,33

(O) N(CH3)2 -9,35 -1,32 -3,79 5,33 1,32 9,35

(O) NH2 -9,10 -1,26 -3,92 5,18 1,26 9,10

(O) SO2NH2 -9,60 -1,55 -4,02 5,57 1,55 9,60

(O) OH -9,39 -1,34 -4,02 5,36 1,34 9,39a HOMO e LUMO = eV. b Dureza (), potencial químico (), afinidade eletrônica (AE),

potencialde ionização (PI) = Kcal/mol.

FBT/FCF/USP 92

Tabela 8. Valores de energia de formação em vácuo e meio solvatado, momento de

dipolo e cargas de potencial eletrostático calculadas pelo método AM1.

a Hf vácuo e Hf hidratado = Kcal/mol.b momento dipolo = debye.

c Cargas de potencial eletrostático = eletrovolts (eV).

Nitrocompostos Hfvácuoa Hf hidratado

a MomentodipoloB QC1

c QC14c

(S) H 63,90 54,73 7,84 -0,02 -0,25

(S) CH3 56,01 47,15 8,32 0,28 -0,28

(S) Cl 57,49 48,40 6,53 0,04 -0,26

(S) F 19,25 11,27 6,20 0,40 -0,24

(S) CF3 -90,31 -98,08 4,22 0,46 -0,25

(S) OCH3 14,91 14,91 8,69 0,48 -0,24

(S) OCH2CH3 9,65 9,65 8,98 0,48 -0,25

(S) N(CH3)2 61,02 61,02 10,34 0,46 -0,25

(S) NH2 60,90 47,60 9,81 0,62 -0,24

(S) SO2NH2 -16,71 -25,45 6,55 -0,77 -0,26

(S) OH 50,16 4,89 8,32 0,47 -0,24

(S) CN 97,05 85,81 4,37 -0,14 -0,26

(O) H 50,16 41,34 8,99 -0,03 0,01

(O) CH3 42,25 33,70 9,39 0,20 0,00

(O) Cl 43,77 35,06 7,86 0,03 0,04

(O) F 5,53 -2,08 7,07 0,39 0,01

(O) CF3 -103,98 -111,23 6,04 -0,17 0,01

(O) OCH3 11,61 1,50 9,05 0,47 -0,01

(O) OCH2CH3 5,94 -3,76 9,19 -0,06 0,44

(O) N(CH3)2 57,47 47,51 11,02 0,46 0,00

(O) NH2 47,09 34,07 10,34 0,62 -0,01

(O) SO2NH2 -16,71 -38,65 5,19 -0,78 0,01

(O) OH 50,16 -8,49 8,44 0,47 0,00

FBT/FCF/USP 93

4.4 Descritor eletrônico de Hammett

Os valores dos descritores eletrônicos p e R dos nitrocompostos utilizados

nos estudos de QSPR e SAR (structure activiy-relationship) encontram-se ilustrados

na Tabela 9.

Os valores de E1/2, calculados por meio da equação 5, utilizados nos estudos

de QSPR, precisamente na análise de correlação Hammett-Zuman, encontram-se

ilustrados na Tabela 9.

4.5 Descritores de Hidrofobicidade

No estudo de QSPR optou-se por testar também a influência da

hidrofobicidade sobre o potencial de redução dos nitrocompostos obtido em meio

misto, uma vez que a formação do radical nitro ânion pode sofrer influência da mistura

de solvente aprótico e tampão PIPES. Os parâmetros utilizados nesta etapa do

trabalho foram a constante de de Hansch, característica para grupos substituintes, e

o coeficiente de partição, expresso pelo ClogP (calculado pelo ClogP Program 4.0,

CyberCop Co. - USA). Ressalta-se que os descritores de hidrofobicidade foram

empregados também nos estudos de relação estrutura-atividade antichagásica dos

nitrocompostos. Os valores dos descritores de hidrofobicidade e ClogP dos

nitrocompostos utilizados nos estudos de QSPR e SAR estão apresentados na

Tabela 9.

FBT/FCF/USP 94

Tabela 9. Valores dos descritores estruturais de caráter eletrônico, p e R, e

hidrofóbico, e Clog P, e do delta do potencial de meia onda, E1/2.

(X = S ou O)

Y p* R** * ClogP *** E1/2 (Map)+ E1/2 (Mm)+

(S) H 0,0 0,0 0,0 2,10 0,00 0,00

(S) CH3 -0,17 -0,13 0,56 2,60 -0,03 -0,02

(S) Cl 0,23 -0,24 0,71 -2,91 0,07 -0,02

(S) F 0,06 -0,46 0,14 2,34 0,00 0,00

(S) CF3 0,54 0,14 -0,02 3,15 -0,01 -0,01

(S) OCH3 -0,27 -0,54 -0,27 2,41 0,00 0,00

(S) OCH2CH3 -0,24 -0,52 0,38 2,93 0,00 -0,01

(S) N(CH3)2 -0,83 -0,89 0,39 2,67 0,00 0,00

(S) NH2 -0,66 -0,78 -1,30 1,55 0,01 -0,01

(S) SO2NH2 0,60 0,14 -1,82 0,98 - -0,01

(S) OH -0,37 -0,66 -0,67 2,15 - 0,00

(S) CN 0,54 0,14 0,57 1,76 - -0,06

(O) H 0,0 0,0 0,0 1,51 0,00 0,00

(O) CH3 -0,17 -0,13 0,56 2,01 0,00 0,01

(O) Cl 0,23 -0,24 0,71 2,42 0,00 -0,01

(O) F 0,06 -0,46 0,14 1,75 0,00 0,00

(O) CF3 0,54 0,14 -0,02 2,56 - -

(O) OCH3 -0,27 -0,54 -0,27 1,70 0,00 0.00

(O) OCH2CH3 -0,24 -0,52 0,38 2,02 0,01 0,02

(O) N(CH3)2 -0,83 -0,89 0,39 1,89 0,00 0,00

(O) NH2 -0,66 -0,78 -1,30 0,63 0,00 -0,01

(O) SO2NH2 0,60 0,14 -1,82 0,21 - 0,02

(O) OH -0,37 -0,66 -0,67 1,18 0,00 0,02

* Hansch & Leo, 1995.

** Valores calculados segundo fórmula (p - I = R).

*** Valores calculados segundo o ClogP Program 4.0, CyberCop Co., USA.+ Valor do delta do potencial meia onda obtido em meio prótico (Map) e misto (Mm) de reação.

XO

N N

NO2

Y

FBT/FCF/USP 95

4.6 Relações entre as propriedades físico-químicas e o potencial de redução ou

potencial de pico catódico dos nitrocompostos, QSPR

4.6.1 Análise de QSPR em meio aprótico

Neste estudo, o potencial de redução (Epc) e o potencial de meia onda (E1/2)

dos nitrocompostos foram escolhidos como variável dependente no decorrer da

análise de QSPR para determinar qual propriedade exerce influência sobre a redução

dos nitrocompostos.

Nesta etapa, os derivados 5-nitro-2-tiofilideno p-R-benzidrazidas e 5-nitro-

2-furfurilideno p-R-benzidrazidas, em que R = H, F, Cl, CH3, OCH3, OCH2CH3, CF3 e

N(CH3)2), em conjunto com a nifuroxazida foram escolhidos para a realização do

estudo de QSPR. Ressalta-se que a seleção dos grupos substituintes ocorreu,

inicialmente, por meio de seleção dos compostos com base no diagrama de Craig.

Esta escolha visou promover o estudo da influência do efeito eletrônico sobre o

potencial de redução dos nitrocompostos buscando não interferir na hidrofobicidade da

série de compostos relacionada.

Após a conclusão deste estudo, optou-se por aumentar o número de

compostos da série e avaliar, indiretamente, a influência da hidrofobicidade e da

polaridade sobre a redução dos nitrocompostos. Este procedimento, devido à

impossibilidade do emprego dos valores dos descritores de hidrofobicidade em meio

aprótico, foi realizado por meio da adição de dois análogos, a 5-nitro-2-tiofilideno

4-amino-benzidrazida, (S) NH2, e a 5-nitro-2-furfurilideno 4-amino-benzidrazida,

(O) NH2, que apresentam valores de hidrofobicidade bastante diferenciados dos

compostos da série originalmente relacionada. Deste modo, a inclusão dos

aminoderivados permitiu, no transcorrer do estudo de QSPR, a análise da influência

tanto do efeito eletrônico como da hidrofobicidade sobre o potencial de redução da

série de compostos.

Observou-se que os valores de Epc 1 e E1/2, determinados em meio aprótico,

Tabela 5, para todo o conjunto de nitrocompostos se encontram na faixa de potencial

de -0,67 V a -0,75 V e -0,58 V a -0,70 V, respectivamente. Ressalta-se que o derivado

5-nitro-2-furfurilideno 4-trifluorometila-benzidrazida, (O) CF3, apresentou perfil

voltamétrico atípico em comparação a todos os outros compostos estudados, com a

observação de picos em excesso no voltamograma. Desta forma, a análise deste

derivado não permitiu a determinação de E1/2 e apresentou valores Epc 1 distantes do

grupo dos furfurilidenos, e devido a estes fatos o composto foi excluído dos estudos de

QSPR. Em análise comparativa dos dados de Epc 1 e de E1/2, preliminar ao estudo de

FBT/FCF/USP 96

QSPR, sugere-se que não há influência da presença de grupos doadores ou

receptores de elétrons ligados ao anel benzênico sobre a redução dos nitrocompostos.

O primeiro passo da análise de QSPR envolveu a determinação da matriz de

intercorrelação entre os valores das propriedades físico-químicas utilizadas. Este

procedimento visou impedir a ocorrência de co-linearidade entre as propriedades

estudadas. Sem a execução deste procedimento, a análise poderia resultar em

obtenção de modelos matemáticos sem representatividade ao fenômeno analisado.

Neste aspecto, ressalta-se que quanto menor o coeficiente de intercorrelação

determinado menor são as chances de se obter co-linearidade entre os descritores

estruturais estudados (Cronin & Chultz, 2003; Kubinyi, 1993). No caso deste trabalho,

estipulou-se que as propriedades inseridas em conjunto em um mesmo modelo não

devem apresentar valores de coeficiente de intercorrelação superiores a 0,70. A matriz

de intercorrelação das propriedades físico-químicas encontra-se apresentada na

Tabela 10.

Através da análise de QSPR foram obtidos cerca de 270 modelos matemáticos

visando comprovar as relações quantitativas entre as diferentes propriedades físico-

químicas, relacionadas aos efeitos eletrônicos e estrutural das moléculas, e o Epc ou o

E1/2. A análise da redução dos nitrocompostos por meio de Epc envolveu a

investigação do emprego de uma, duas ou três propriedades.

O melhor modelo obtido sugere que o potencial de pico catódico (Epc 1) dos

nitrocompostos é influenciado pelo efeito de ressonância, expresso por, R, e da carga

de potencial eletrostático do carbono ligado ao grupo nitro (QC14). O modelo encontra-

se descrito na equação 27 e a correlação está representada na Figura 26.

FBT/FCF/USP 97

Figura 26. Influência da distribuição eletrônica, R, e da carga de potencial

eletrostático do carbono ligado ao grupo nitro (QC14) sobre o potencial de

pico catódico, Epc 1, de nitrocompostos em meio aprótico.

FBT/FCF/USP 98

Tabela 10. Matriz de intercorrelação dos descritores físico-químicos empregados nos estudos de QSPR/SAR

HOMO LUMO Eg VM MD AE PI p R Ehid QC1 QC14 Distintram.

HOMO 1 0,13 0,09 0,13 0,28 0,36 0,13 0,91 0,43 0,32 0,11 0,13 0,01 0,30 0,74

LUMO 1 0,35 0,01 0,00 0,60 1,0 0,21 0,35 0,22 0,10 0,03 0,65 0,1 0,56

Eg 1 0,07 0,14 0,21 0,03 0,11 0,14 0,04 0,86 0,10 0,02 0,07 0,12

VM 1 0,28 0,05 0,01 0,09 0,14 0,12 0,02 0,18 0,12 0,82 0,03

1 0,24 0,00 0,28 0,51 0,39 0,23 0,14 0,20 0,22 0,14

MD 1 0,60 0,44 0,81 0,44 0,39 0,08 0,10 0,18 0,65

AE 1 0,21 0,35 0,22 0,10 0,03 0,65 0,01 0,56

PI 1 0,53 0,39 0,12 0,20 0,00 0,25 0,87

p 1 0,72 0,25 0,31 0,01 0,25 0,61

R 1 0,08 0,51 0,01 0,24 0,43

Ehid 1 0,11 0,00 0,02 0,15

QC1 1 0,00 0,37 0,16

QC14 1 0,04 0,12

Distintram.

1 0,18

1

FBT/FCF/USP 99

Epc 1 = +0,03 (±0,02) R -0,20 (±0,03) QC14 -0,72 (±0,01) (Eq. 27)

(n=16; r=0,938; s=0,01; F=47,66; Q2=0,66; SPRESS=0,02)

Ainda de acordo com a equação 20, ressalta-se que esta foi determinada após

a retirada de dois derivados (S) Cl e (O) NH2 que se apresentam flagrantemente fora

da tendência de correlação (desvio com valor acima de 95%). Estes compostos se

apresentam como outliers, com comportamento atípico em relação a toda a série de

compostos estudada. Porquanto, estes foram retirados desta análise visando à

obtenção de nova correlação com melhor ajuste estatístico.

Outros modelos obtidos a partir da análise de QSPR apresentaram ajuste à

curva de regressão linear somente quando foram retirados três outliers da série de

derivados estudados (desvio com valor acima de 95%), sendo os mesmos

anteriormente citados em conjunto com o (O) OH. Os parâmetros estatísticos

calculados e o número de descritores inserido nos cinco modelos obtidos para

expressar a depndência de Epc e cinco para E1/2 apresentam-se descritos na Tabela

11.

A partir de análise detalhada dos modelos de correlação obtidos para toda a

série de compostos concluiu-se que não há influência significativa dos descritores

relacionados ao efeito eletrônico dos grupos substituintes e as propriedades

estruturais sobre Epc 1 e E1/2 dos nitrocompostos. A apreciação dos parâmetros

estatísticos dos modelos, como o desvio padrão da equação [ou coeficiente de

regressão] (s) e o teste de significância de Fischer (F); dos parâmetros de validação

cruzada, como o coeficiente de correlação cruzada [ou análise dos quadrados parciais]

(Q2) e o desvio padrão de validação cruzada (Spress); em conjunto com a análise dos

resíduos de correlação, comprovaram a ausência de modelos matemáticos

significativos.

FBT/FCF/USP 100

Tabela 11. Modelos correlacionais, parâmetros estatísticos, número de compostos

das dez melhores correlações que expressam a dependência de Epc 1 e

E1/2, determinados em meio aprótico, de descritores estruturais.

Modelos Parâmetros estatísticos da correlação

Epc 1 = MD QC14 n=15; r=0,946; s=0,01; F=50,93; Q2=0,59; SPRESS=0,02.

Epc 1 = QC1 QC14 n=15; r=0,943; s=0,01; F=48,49; Q2=0,53; SPRESS=0,02

Epc 1 = Lumo PI n=15; r=0,933; s=0,01; F=40,19; Q2=0,51; SPRESS =0,02

Epc 1 = Homo PI n=15; r=0,933; s=0,01; F=40,19; Q2=0,51; SPRESS =0,02

Epc 1 = AE n=15; r=0,933; s=0,01; F=40,27; Q2=0,51; SPRESS =0,02

E1/2 = Lumo MD n=16; r=0,96; s=0,01; F=79,85; Q2=0,47; SPRESS =0,02

E1/2 = MD AE n=16; r=0.962; s=0.01; F=79.84; Q2=0.47; SPRESS=0.02

E1/2 = AE n=16; r=0.952; s=0.011; F=62.46; Q2=0.49; SPRESS =0.02

E1/2 = Lumo n=15; r=0,907; s=0,01; F=60,32; Q2=0,46; SPRESS =0,02

E1/2 = Lumo P n=15; r=0,959; s=0,01; F=60,32; Q2=0,41; SPRESS =0,03

Foram avaliados, também, os gráficos que buscam expressar a ocorrência de

linearidade entre os valores dos resíduos de correlação e os valores de Epc 1 e E1/2.

Ressalta-se que um modelo, robusto e com alto valor preditivo, deve apresentar

linearidade entre os valores de descritores, obtidos experimentalmente e, também, por

meio de predição, e os resíduos de correlação (He & Jurs, 2005; Eriksson et al., 2003;

Kubinyi, 1993). As Figuras 27 e 28 ilustram os gráficos, obtidos a partir da equação 27,

que permitiram analisar a ocorrência de linearidade entre os valores dos resíduos de

correlação e os valores determinados e preditos de Epc 1 dos nitrocompostos. Os

gráficos demonstraram a ampla dispersão dos derivados, o que confirma a ausência

de linearidade. Este fato indica que a equação obtida não apresenta robustez e não é

estatisticamente válida. A análise de resíduos de todos os modelos calculados permitiu

observar que a ausência de co-linearidade é uma característica de todas as equações

obtidas. Devido ao presente cenário verifica-se que os modelos não apresentam

validade estatística e, portanto, são considerados como artefatos matemáticos.

FBT/FCF/USP 101

Figura 27. Resíduo de correlação obtido a partir da equação 27 vs potencial de pico

catódico (Epc 1) determinado experimentalmente.

Figura 28. Resíduo da correlação obtido a partir da equação 27 vs potencial de pico

catódico (Epc 1) predito no modelo.

FBT/FCF/USP 102

A partir destes resultados, optou-se pela separação dos derivados tiofilidênicos e

furfurilidênicos em dois grupos distintos, com a finalidade de obtenção de subsídios

que permitam a compreensão do comportamento de formação do radical nitro ânion

gerado eletroquimicamente em meio aprótico.

Foi observado que os valores de Epc 1 e E1/2 determinados em meio aprótico

(Tabela 5), para o conjunto das 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas, se encontram na

faixa de potencial de - 0,67 V a - 0,75 V e - 0,58 V a - 0,70 V, respectivamente. Já os

valores de Epc 1 e E1/2, determinados em meio aprótico (Tabela 5), para o conjunto

dos 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas se encontram na faixa de potencial de - 0,69 V

a - 0,75 V e - 0,68 V a - 0,70 V, respectivamente.

A partir da análise preliminar dos valores de Epc 1 e E1/2, da mesma maneira

como observado para todo o conjunto dos nitrocompostos, é possível sugerir que não

há influência da presença de grupos doadores ou receptores de elétrons ligados ao

anel benzênico sobre a redução dos nitrocompostos. Em análise do conjunto de dados

de E1/2 verifica-se que o derivado (S) Cl, do grupo dos tiofilidênicos, apresenta valor de

- 0,70 V, diferente aos demais compostos presentes no mesmo grupo. Quando retira-

se este derivado da série de compostos observa-se a diferença dos valores de E1/2

existente entre o grupo dos 5-nitro-2-tiofilidenos, - 0,58 a 0,64 V, e dos 5-nitro-

2-furfurilidenos, - 0,68 V a - 0,70 V. Deste modo, a caracterização de diferença entre

os dois grupos de nitrocompostos sugere que a formação do par redox Ar-NO2/Ar-

NO2-, a partir dos tiofilidênicos, em contraste aos furfurilidênicos, encontra-se facilitada

em meio aprótico de reação.

A análise dos modelos matemáticos calculados durante a análise de QSPR

confirmou a ausência de influência significativa de todas as propriedades físico-

químicas estudadas sobre Epc 1 e E1/2 obtidos a partir dos compostos 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazidas ou 5-nitro-2-furfulideno benzidrazidas. Estes resultados

foram confirmados através da análise dos parâmetros estatísticos e da análise de

resíduo de correlação.

Adicionalmente a estes estudos, foi utilizada a equação de Hammett-Zumam

que pode ser definida como uma aproximação matemática da aplicação da equação

de Hammett ao estudo de parâmetros obtidos a partir de técnicas eletroquímicas. Os

resultados obtidos com o emprego desta equação (E1/2), descritos na Tabela 8,

corroboram a ausência de correlação entre as propriedades físico-químicas.

Observou-se também a influência inexpressiva da presença de grupos doadores ou

aceptores de elétrons ligados ao anel benzênico sobre a redução dos nitrocompostos.

A inserção dos derivados amino substituídos em posição para no anel benzênico, (S)

NH2 e (O) NH2, não interferiu em nenhum dos resultados obtidos, o que sugere que a

FBT/FCF/USP 103

hidrofobicidade também não exerce efeito sobre os descritores eletroquímicos

estudados em meio aprótico de reação.

Após execução da análise de regressão linear múltipla nos estudos de QSPR,

partiu-se para a aplicação de quimiometria, através da metodologia de regressão por

PLS, a fim de investigar de forma detalhada a hipótese de influência das propriedades

físico-químicas sobre a redução dos nitrocompostos. Desse modo, a análise de PLS

foi realizada para o mesmo conjunto de nitrocompostos utilizado na investigação das

análises de QSPR em meio aprótico.

A partir do emprego de PLS foram construídos 10 modelos matemáticos com

todas as propriedades físico-químicas estudadas. Neste processo, avaliou-se a

validação interna e a capacidade preditiva dos modelos por meio da aplicação do

método de validação cruzada intitulado “leave-one-out” (Ferreira, 2002; Kubinyi, 2003).

Ressalta-se que os modelos obtidos com o emprego de PLS são também chamados

de variáveis latentes ou componentes, e são obtidos por meio de combinação linear

das variáveis independentes da correlação, neste caso dos descritores estruturais

estudados (Ferreira, 2002; Ferreira et al., 2002; Kubinyi, 1993).

O melhor resultado determinado foi obtido para a somatória dos 10

componentes, onde observou-se a variância acumulada de 99,7%. Isto significa que a

somatória destes componentes pode explicar quase 100% da influência das

propriedades físico-químicas sobre Epc 1. Os outros parâmetros estatísticos de

regressão obtidos foram coeficiente de correlação de 0,91, desvio padrão da

correlação de 0,001 e o desvio padrão da validação cruzada (Spress) de 0,14.

A Figura 29 demonstra a ocorrência de correlação obtida para a somatória dos

dez componentes em conjunto com a correlação obtida através de validação cruzada.

Observa-se que poucos valores de Epc 1 obtidos experimentalmente (pontos em

forma de círculo) encontram-se em concordância com os valores Epc 1 estimados

(quadrados vermelhos). Estes resultados sugerem a ocorrência de modelos instáveis e

de pouco valor preditivo.

A Figura 30 ilustra o gráfico de análise de PLS para seleção de modelos

obtidos na correlação. O gráfico da Figura 30 é utilizado para comparar os valores dos

coeficientes de correlação de regressão do modelo calculado com os modelos obtidos

a partir do mecanismo de validação cruzada. Quanto mais próximo estiverem os

valores de R2 dos modelos calculado e de validação cruzada maior é o poder preditivo.

Adicionalmente, o emprego de número excessivo de componentes utilizados para a

formulação de um modelo, de dez no caso desta análise, pode resultar em situação de

super-ajuste estatístico (Peralta-Zamora et al., 2005) e, portanto não se recomenda a

FBT/FCF/USP 104

sua utilização. Diante do exposto, a partir da análise das Figuras 29 e 30, sugere-se

que o modelo obtido não apresenta validade estatística.

Figura 29. Relação entre os valores de Epc 1 determinados e predito pelo modelo.

Figura 30. Relação entre o erro de predição e o número de componentes do modelo.

Relação de resposta - PLS

Relação da raiz quadrada do erro de prediçãocom o número de componentes do modelo

FBT/FCF/USP 105

A análise de PLS frente ao descritor eletroquímico E1/2 e as propriedades físico-

químicas escolhidas para a investigação de QSPR não resultou em obtenção de

correlação estatisticamente válida.

Do mesmo modo como procedido durante a aplicação da análise de QSPR

inicial, os grupos dos nitro-tiofilidênicos e dos nitro-furfurilidênicos foram analisados

separadamente por meio do emprego de PLS. Os resultados obtidos nesta análise,

que envolveu o Epc ou E1/2, foram similares aos registrados para o grupo que envolveu

o conjunto de todos os nitrocompostos estudados.

Os resultados obtidos permitem observar que a redução dos nitrocompostos em

reação envolvendo um elétron, expressa por meio de Epc 1 ou E1/2, em meio aprótico

não sofre influência dos descritores estruturais estudados. Ademais, a redução dos

nitrocompostos pode sofrer influência de outras propriedades físico-químicas

peculiares desta série de compostos e não estudadas neste trabalho.

4.6.2 Análise de QSPR em meio misto

Nesta etapa, o potencial de pico catódico (Epc 1) e o potencial de redução

(E1/2) dos nitrocompostos foram novamente escolhidos como variável dependente no

decorrer da análise de QSPR. Este estudo visou determinar a ocorrência de

correlação e qual propriedade exerceu influência sobre a redução dos nitrocompostos

em meio misto de reação.

Nesta etapa, os derivados 5-nitro-2-tiofilideno 4-R-benzidrazidas, em que

R = H, F, Cl, CH3, OCH3, OCH2CH3, CF3, CN, SO2NH2, OH e N(CH3)2), e 5-nitro-

2-furfulideno 4-R-benzidrazidas, em que R = H, F, Cl, CH3, OCH3, OCH2CH3, SO2NH2,

OH e N(CH3)2, foram escolhidos para a realização do estudo de QSPR. Ressalta-se

que a seleção dos grupos substituintes ocorreu de acordo com sua dispersão nos

quatro quadrantes do diagrama de Craig. O grupo de compostos escolhidos permitiu a

investigação da influência do efeito eletrônico e hidrofóbico, expressos por de

Hammett e de Hansch, dos grupos substituintes sobre a redução dos nitrocompostos

em meio misto de reação. Todas as propriedades utilizadas no estudo de QSPR em

meio aprótico foram adicionadas a esta etapa do trabalho.

A partir dos resultados do emprego da VOQ, observou-se que os valores de

Epc 1 e E1/2 determinados em meio misto (Tabela 5), para todo o conjunto dos

nitrocompostos se encontram na faixa de potencial de - 0,43 V a - 0,49 V e - 0,40 V a

- 0,48 V, respectivamente. Em análise preliminar dos dados de Epc 1 e E1/2 é possível

sugerir que não há influência da presença de grupos substituintes, doadores ou

FBT/FCF/USP 106

receptores de elétrons, ligados ao anel benzênico sobre a redução dos

nitrocompostos.

Observou-se que os valores de Epc e E1/2, determinados em meio misto

(Tabela 5), para o conjunto dos 5-nitro 2-tiofilideno benzidrazidas se encontram na

faixa de potencial de - 0,46 V a - 0,49 V e - 0,42 V a - 0,47 V, respectivamente. Já os

valores de Epc e E1/2, determinados em meio misto (Tabela 5), para o conjunto dos

5-nitro 2-furfurilideno benzidrazidas se encontram na faixa de potencial de - 0,43 V a

- 0,49 V e - 0,40 V a - 0,48 V, respectivamente. A partir da análise destes dados

observou-se que os valores de Epc 1 e de E1/2 dos derivados tiofilidênicos e derivados

furfurilidênicos se encontram agrupados em uma mesma faixa de potencial, resultando

na ocorrência de grupo homogêneo de compostos.

Através da análise de QSPR foram obtidos cerca de 290 modelos

matemáticos, envolvendo equações lineares, parabólicas e bilineares, visando

identificar a influência de diferentes propriedades físico-químicas, de efeito eletrônico e

estrutural, sobre o Epc 1 ou o E1/2. As análises envolveram inicialmente o conjunto dos

nitrocompostos e, logo após a conclusão desta, avaliou-se os derivados tiofilidênicos e

furfulidênicos separadamente.

Os modelos parabólico e bilinear foram inseridos nesta etapa do experimento

com a finalidade de estudar a influência da hidrofobicidade sobre o processo de

redução do grupo nitro em meio misto. Estes modelos, expressos originalmente para

processos biológicos, foram extraídos da Análise de Hansch visando promover um

estudo preliminar da dependência não linear da lipofilicidade sobre o processo

eletródico envolvido na redução dos nitrocompostos, que pode ser difusivo ou

adsortivo. Ressalta-se que este passo é importante devido a possibilidade de

interferência desta propriedade no processo de difusão dos nitrocompostos do

conjunto da solução para a interface do eletrodo de trabalho (Bard & Falkner, 1980),

influenciando assim, a redução dos nitrocompostos e os valores de Epc 1 e E1/2

obtidos. Destaca-se, ainda, que as determinações foram realizadas por voltametria de

onda quadrada em meio misto de DMSO/solução tampão PIPES 50% v/v.

A análise de QSPR que envolveu Epc ou E1/2 possibilitou a obtenção de vários

modelos matemáticos que apresentaram ajuste à curva de regressão. Por outro lado,

quando foi analisado o coeficiente de correlação da regressão (r) verificou-se que

nenhum dos modelos obtidos apresentou valor deste superior a 0,90. Este fato indica

que os modelos obtidos não podem ser utilizados para confirmar a ocorrência de

correlação entre as propriedades físico-químicas e Epc 1 ou E1/2. Os outros

parâmetros estatísticos destas equações, caracterizados pelos valores baixos de Q2 e

de Spress, juntamente a análise dos gráficos dos resíduos evidenciam a ausência de

FBT/FCF/USP 107

significância estatística em todas as correlações testadas. Este efeito, já observado

para os resultados obtidos a partir da análise de QSPR em meio aprótico de reação,

demonstra que o potencial de redução ou mesmo o potencial de meia onda não

sofrem influência dos descritores físico-químicos estudados.

Observou-se também que a inserção dos descritores de hidrofobicidade e a

aplicação de modelos parabólicos e bilineares não resultou em ocorrência de

correlações significativas. A ausência de modelos que fundamentam a hipótese da

influência da hidrofobicidade sobre Epc 1 ou E1/2 pode ser devido à ocorrência de

processo adsortivo na superfície do eletrodo de carbono vítreo, o que impede a

identificação da difusão dos compostos da solução para o eletrodo.

A etapa subseqüente da análise de QSPR envolveu a utilização da equação de

Hammett-Zumam. Os resultados obtidos com o emprego desta equação (E1/2),

descritos na Tabela 9, confirmaram a ausência de correlação entre as propriedades

físico-químicas e a redução dos nitrocompostos. Não observou-se influência da

presença de grupos substituintes, doadores ou aceptores de elétrons, ligados ao anel

benzênico sobre a redução dos nitrocompostos.

Os testes subseqüentes do estudo de QSPR em meio misto envolveram a

utilização de PLS. A partir do emprego desta metodologia e do descritor Epc foram

construídos 10 modelos matemáticos com todas as propriedades físico-químicas

estudadas. Nesta análise determinou-se que a primeira componente da série obtida foi

considerada ótimo, Figura 31, ou seja, apresentou a menor distância entre os valores

de R2 da correlação e do resíduo obtido com o emprego de validação cruzada.

Ademais, este modelo foi considerado o melhor entre os 10 obtidos por este

apresentar o maior valor de variância, de 40,12%. Em contrapartida, esta componente

apresentou valores de coeficientes de correlação do modelo e de predição de 0,25 e

0,00, respectivamente, o que corroborou a ausência de significância estatística da

correlação obtida.

A análise de PLS frente ao descritor eletroquímico E1/2 em conjunto com as

propriedades estruturais utilizados para a investigação de QSPR em meio misto de

reação, como observado para Epc 1, não apresentou nenhuma correlação

estatisticamente válida.

Do mesmo modo, os grupos dos derivados nitro-tiofilidênicos e derivados nitro-

furfurilidênicos foram analisados separadamente por meio do emprego de PLS. Os

resultados obtidos nestas análises, que envolveram o Epc 1 e E1/2, foram similares aos

registrados para o grupo que envolveu todos os nitrocompostos estudados.

Os resultados obtidos permitiram observar que a redução dos nitrocompostos

em reação envolvendo um elétron, expressa por meio dos descritores Epc 1 e E1/2, em

FBT/FCF/USP 108

meio misto não sofre influência dos descritores físico-químicos estudados. Além

disso, supõe-se que a redução dos nitrocompostos pode sofrer influência de outras

propriedades físico-químicas não estudadas neste trabalho.

Figura 31. Relação entre o erro de predição e o número de componentes do modelo.

4.6.3 Análise de QSPR em meio aquoso

A análise dos potenciais de redução dos 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas em

reação envolvendo um elétron (Eq. 21) indica similaridade entre todos os valores dos

compostos estudados. A análise voltamétrica dos 5-nitro-furfurilidênicos, por outro

lado, não possibilitou a determinação do radical nitro ânion, sendo observada somente

a reação de formação da hidroxilamina a partir dos nitrocompostos. A similaridade dos

valores de Epc para os derivados 5-nitro-2-tiofilidênicos combinado à ausência de

resposta voltamétrica para os 5-nitro-2-furfurilidênicos impediu a ocorrência da análise

de QSPR destes compostos em meio aquoso de reação e pH neutro.

4.6.4 Considerações parciais da análise de QSPR

A partir do diagnóstico do conjunto dos resultados obtidos com a aplicação da

metodologia de QSPR, sugere-se que o potencial de redução e o potencial de meia

onda não sofrem influência significativa de todas as propriedades físico-químicas

Relação da raiz quadrada do erro depredição com o número de componentes

FBT/FCF/USP 109

utilizadas neste trabalho. Além disso, a presença de grupos substituíntes diferentes

ligados ao anel benzênico não é fator que interfere no processo de redução dos

nitrocompostos. Este fato decorre, provavelmente, da quebra do efeito co-planar da

estrutura dos nitrocompostos, o que resulta em transmissão reduzida do efeito

mesomérico conjugado através da molécula, precisamente dos grupos substituintes

até o grupo nitro ligado ao anel heterocíclico. A quebra de efeito co-planar foi

confirmada por meio da análise conformacional, Figura 20, e a transmissão reduzida

de efeito mesomérico pode ser observada nos mapas de densidade de potencial

eletrostático dos nitrocompostos, Figura 25.

4.7 Ensaios de atividade frente ao Trypanosoma cruzi

Os ensaios de suscetibilidade antichagásica foram realizados in vitro, para os

compostos 5-nitro-2-tiofilideno 4-R-benzidrazidas, em que R = H, CF3, OCH3, Cl,

SO2NH2, N(CH3)2, e 5-nitro-2-furfurildeno 4-R-benzidrazidas, em que R = H, Cl, em

concentrações de 1,0, 10,0 e 20,0 g mL-1. Estes ensaios foram realizados também

para o benznidazol, único fármaco utilizado para o tratamento da doença de Chagas

no Brasil, e escolhido como referência nestes experimentos.

Foram adicionados nesta análise os resultados da atividade frente ao

Trypanosoma cruzi dos derivados 5-nitro-2-tiofilideno 4-ciano-benzidrazida e 5-nitro-2-

tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida realizados por Márcia Maria Lima Dias e disponíveis

em sua dissertação de mestrado (Dias, 2005) mediante autorização dos autores. Estes

resultados foram obtidos por meio do emprego da mesma metodologia e mesma cepa

do Tripanossoma cruzi utilizadas nos ensaios acima mencionados.

A escolha das concentrações utilizadas neste trabalho foi dependente da

solubilidade dos nitrocompostos em meio de cultura LIT. Os compostos foram

dissolvidos em DMSO e misturados ao meio LIT até atingir as concentrações

desejadas do composto estudado bem como a concentração de 1,0% de DMSO.

Observou-se que a presença do solvente na referida concentração não interfere nos

resultados obtidos nos ensaios biológicos Ressalta-se que os dados referentes ao

DMSO se apresentam em concordância os resultados obtidos por Tavares e Dias

(Dias, 2005). O aumento das concentrações dos nitrocompostos para valores acima

de 20,0 g mL-1 em solução de meio LIT e DMSO, 1,0%, resultou em precipitação dos

compostos estudados.

Nestes ensaios, investigou-se a atividade antichagásica dos nitrocompostos

por meio da supressão do crescimento da forma epimastigota da cepa Y do

FBT/FCF/USP 110

Trypanosoma cruzi em meio LIT axênico. Elegeu-se este ensaio devido ao uso de

forma parasitária com reduzida capacidade infectante, o que promove maior

segurança aos executores do ensaio. Somam-se a este fato, relatos que indicam a

presença da forma epimastigota do tripanossoma em células de mamíferos (Arán et

al., 2005; Tyler e Engman, 2001; Faucher et. al., 1999; Almeida de Faria et al., 1999),

que tornam o emprego desta forma do parasita uma ferramenta importante para a

avaliação preliminar do efeito anti-proliferativo de cadidatos a agentes antichagásicos.

Os resultados do efeito anti-proliferativo do Trypanosoma cruzi causado pelos

nitrocompostos, expressos por meio de porcentagem de crescimento das parasitas

viáveis em 24 horas, encontram-se descritos nas Tabelas 12 e 13.

Observou-se que não ocorreu crescimento do Trypanosoma cruzi incubado

com nitrocompostos em meio LIT quando o número de parasitas viáveis observados,

em 24 horas, foi igual ou menor que ao valor obtido no tempo inicial (0 horas).

Em investigação inicial, observou-se que a solução controle, que contém os

parasitas incubados em meio LIT e 1,0% de DMSO, com 24 horas, apresentou

crescimento parasitário de cerca de 40%.

Os derivados 5-nitro-2-tiofilideno 4-R-benzidrazidas para-substituídas, R = Cl,

CF3, OCH3, e 5-nitro-2-fufurilidenos 4-R-benzidrazidas para-substituídas, R = H e Cl,

testados apresentaram 100% de inibição de proliferação parasitária nas concentrações

de 10,0 e 20 g mL-1. O composto 5-nitro-2-tiofilideno 4-dimetilamino-benzidrazida,

(S) N(CH3)2, apresentou 100% de inibição de crescimento das formas epimastigotas

na concentração de 20 g mL-1. Estes derivados apresentaram melhor habilidade de

inibir a proliferação do parasita em comparação ao benznidazol, utilizado como

composto de referência, o que evidencia a atividade antichagásica promissora destes

compostos.

FBT/FCF/USP 111

Tabela 12. Atividade frente a cepas Y de Trypanosoma cruzi dos derivados 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazidas determinado pelo método de inibição de

proliferação parasitária.

Nitrocompostos Concentração* O h** 24 h** CP***Atividade

antichagásica

(S) H 1,0 21,4 24,2 13,0 (-)

10,0 15,7 24,7 57,3 (-)

20,0 29,8 29,7 0,0 (-)

(S) Cl 1,0 29,2 30,3 4,0 (-)

10,0 38,3 30,3 0,0 (+)

20,0 45,0 7,0 0,0 (+)

(S) CF3 1,0 48,5 62,3 28,4 (-)

10,0 45,7 5,7 0,0 (+)

20,0 37,0 2,0 0,0 (+)

(S) OCH3 1,0 24,0 49,0 100,0 (-)

10,0 40,7 34,3 0,0 (+)

20,0 35,3 34,0 0,0 (-)

(S) N(CH3)2 1,0 32,3 35,3 10,0 (-)

10,0 28,3 40,6 43,6 (-)

20,0 40,0 31,2 0,0 (+)

(S) SO2NH2 1,0 22,0 25,6 16,0 (-)

10,0 24,1 28,49 18,2 (-)

20,0 35,7 42,5 19,0 (-)

(S) CN**** 10,0 22,5 15,5 0,0 (+)

(S) OH**** 10,0 20,7 32,3 56,6 (-)

Controle (DMSO) - 35,8 50,7 41,7 -

* Concentração em g mL-1 utilizada nos ensaios;** Leituras do número de parasitas viáveis (106) realizadas em triplicata;*** Crescimento parasitário (%);**** Retirado de Dias, 2005, com autorização dos autores.

FBT/FCF/USP 112

Tabela 13. Atividade frente a cepas Y de Trypanosoma cruzi dos derivados 5-nitro-

2-furfurilideno benzidrazidas e do composto de referência benznidazol

determinado pelo método de inibição de proliferação parasitária.

* Concentração em g mL-1 utilizada nos ensaios;** Leituras do número de parasitas viáveis (106) realizadas em triplicata;*** Crescimento parasitário (%).

4.7.1 Estudo das relações estrutura-atividade

Estipulou-se como composto com atividade frente ao Trypanosoma cruzi (+),

aqueles que apresentaram valores das leituras dos números de parasitas viáveis, em

24 horas, menor que os valores obtidos no tempo zero de ensaio (Tabelas 11 e 12).

Neste contexto, observou-se que a 5-nitro-2-tiofilideno 4-trifluoro-benzidrazida, (S)

CF3, em concentração de 20,0 g mL-1 foi o composto mais ativo do conjunto de

compostos avaliados.

Em estudo de SAR verificou-se que o potencial de redução e o potencial de

pico catódico, determinados nos meios aprótico, misto e prótico, para os compostos

considerados com atividade antichagásica não apresentam influência sobre a

bioatividade analisada. Por outro lado, a partir da comparação entre os valores de

porcentagem de crescimento parasitário em presença de 1,0 g mL-1 dos compostos

5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida, (O) H, e 5-nitro-2-furfurilideno 4-cloro-benzidrazida,

(O) Cl, com os compostos 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida, (S) H, e 5-nitro-

Nitrocompostos Concentração* O h** 24 h** CP***Atividade

antichagásica

(O) H 1,0 44,9 43,6 0,0 (-)

10,0 31,7 31,0 0,0 (-)

20,0 38,0 25,6 0,0 (+)

(O) Cl 1,0 48,3 44,0 0,0 (+)

10,0 30,3 30,0 0,0 (+)

20,0 48,0 24,3 0,0 (+)

benznidazol - - - - -

10,0 35,0 50,0 30,0 (-)

20,0 44,3 45,7 3,0 (-)

Controle (DMSO) - 35,76 50,66 41,66 -

FBT/FCF/USP 113

2-tiofilideno 4-cloro-benzidrazida, (S) Cl, sugeriu-se que a série dos derivados

furfulidênicos é mais ativa que a série dos derivados tiofilidênicos. Os resultados

obtidos a partir desta avaliação, no entanto, não são conclusivos e devem ser

confirmados, por meio de protocolos diferentes, em análises subseqüentes.

4.7.2 Considerações da análise da atividade antichagásica dos nitrocompostos

É conhecido que a enzima tripanotiona redutase reduz o substrato oxidado da

tripanotiona (SH) em tripanotiona dissulfeto em potenciais de redução aproximados de

- 0,24 V (Krauth-Siegel et al., 2005, Fairlamb & Cerami, 1992). De acordo com os

valores dos potenciais de redução obtidos em meio aquoso de reação, - 0,33 V,

sugere-se que o radical nitro ânion não é o principal agente responsável pela inibição

complexo tripanotiona-tripanotiona redutase.

De acordo com o mecanismo de ação dos nitrocompostos proposto por Viodé

et al., 1998, e sugerido para o nifurtimox (Maia et al., 2003), o radical nitro ânion

formado a partir da redução do grupo nitro reage com o oxigênio formando superóxido,

o qual é responsável por inibir a enzima tripanotiona redutase (Blumenstiel et al.,

1999) e promover a oxidação do substrato tripanotiona reduzido (Krauth-Siegel et al.,

2005, Viodé et al., 1998).

Nesta linha de raciocínio, aliado a constatação preliminar de que Epc dos

nitrocompostos determinados em meio prótico de reação não apresentam diferença

entre os valores obtidos, sugere-se que estes não demonstram efeito expressivo sobre

a atividade antichagásica. Este fato, combinado à ausência de influência aparente de

Epc 1 e E1/2, determinados em meios misto e aprótico, sobre a atividade biológica,

fornece suporte para questionamentos sobre a relevância do emprego destes

parâmetros no estudo de QSAR.

FBT/FCF/USP 114

5. CONCLUSÕES

FBT/FCF/USP 115

Os procedimentos voltamétricos descritos são adequados para a avaliação do

potencial de redução dos nitrocompostos em diferentes meios de reação. Estas

metodologias podem, também, ser utilizados para a determinação de

parâmetros físico-químicos e no desenvolvimento de metodologia analítica a

ser empregada na determinação dos compostos utilizados neste trabalho.

Os procedimentos voltamétricos efetuados em meio aprótico de reação

forneceram dados que podem ser comparados com valores obtidos em meio

misto (DMSO/solução tampão PIPES) e o meio aquoso (solução tampão

PIPES), o que pode resultar em considerações importantes sobre a reatividade

molécular dos nitrocompostos. Os valores de E1/2 dos derivados 5-nitro-

2-tiofilideno benzidrazidas se encontram em potenciais menores que as 5-nitro-

2-furfurilideno benzidrazidas, o que representa maior reatividade (ou

estabilidade) dos 5-nitro-2-furfurilidênicos neste meio de reação.

Os resultados obtidos em meio misto permitem observar que não existe

diferença entre os valores de Epc 1 e E1/2 dos grupos 5-nitro-2-furfurilideno

benzidrazidas e 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas.

Os estudos de QSPR demonstraram a ausência de correlação das

propriedades físico-químicas e o processo de redução dos nitrocompostos, em

reação envolvendo um elétron, em todas as condições estudadas,

Os estudos de modelagem molecular dos nitrocompostos, utilizando as

metodologias de análise conformacional e análise de mapas de potencial

eletrostático, permitiram a elucidação de características estruturais e

eletrônicas moleculares. Observou-se a quebra do efeito co-planar estrutural

entre as porções benzeno substiuida e a 5-nitro-2-heterocíclo hidrazídica. Esta

característica favorece a redução, ou mesmo o bloqueio, da transmissão do

efeito conjugado através da molécula.

FBT/FCF/USP 116

Os resultados preliminares obtidos a partir dos ensaios antichagásicos

necessitam de estudos subseqüentes visando a sua confirmação. Em análise

prévia, contudo, observou-se que os derivados 5-nitro-2-furfurilideno

4-benzidrazida, (O) H, e 5-nitro-2-furfurilideno 4-cloro-benzidrazida, (O) Cl,

apresentaram maior atividade frente à forma epimastigota da cepa Y do

Trypanosoma cruzi em comparação aos isósteros 5-nitro-2-tiofilideno

benzidrazidas, quando incubados em concentração de 1,0 g mL-1.

FBT/FCF/USP 117

6. PERSPECTIVAS

FBT/FCF/USP 118

Aperfeiçoamento de procedimento voltamétrico com a finalidade de

desenvolvimento de metodologia analítica para a identificação e quantificação

dos nitrocompostos estudados;

Avaliação da atividade antichagásica com o emprego dos valores de inibição

de concentração em 50% (IC50);

Emprego de método espectrofotométrico para a leitura do número de parasitas

viáveis incubados em meio LIT;

Promover o estudo de QSPR e QSAR em três dimensões com o objetivo de

avaliar sob novas perspectivas as interações entre o radical nitro ânion, as

propriedades físico-químicas dos nitrocompostos e a atividade antichagásica.

Neste contexto, sugere-se o emprego das abordagens presentes nos softwares

Volsurf, CoMFA e CoMSIA;

Avaliar a hipótese que indica à ocorrência de interação dos nitrocompostos a

enzima cruzipaína, e a sua inibição subseqüente, a qual seria responsável pela

atividade antichagásica apresentada pelos derivados estudados neste trabalho.

Sugere-se que proposição pode ser avaliada por meio do emprego de ensaio

de inibição enzimática e a aplicação da ferramenta computacional de “docking”

molecular.

FBT/FCF/USP 119

7. BIBLIOGRAFIA

FBT/FCF/USP 120

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FBT/FCF/USP 136

8. ANEXO 1.

FBT/FCF/USP 137

8.1 Espectros de Espectrofotometria UV/Vis

Influência da solução tampão PIPES sobre os espectros de UV/vis obtidos em meio

1,0 mmol L-1 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida dissolvido em DMSO:

Figura 32. Espectro de UV/vis de 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida em meio misto

(DMSO/PIPES 50% v/v), varredura de scan 200-750 nm, velocidade de

scan 1200 nm min-1.

Equipamento: Hawlett Packard Diode Array

Cubetas de quartzo

Absorção máxima obtida em varredura de scan: 381,45 nm

FBT/FCF/USP 138

Figura 33. Espectro de UV/vis de 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida em meio aprótico

(DMSO, 100% v/v), varredura de scan 200-750 nm, velocidade de scan

1200 nm min-1.

Equipamento: Hawlett Packard Diode Array

Cubetas de quartzo

Absorção máxima obtida em varredura de scan: 386,20 nm

FBT/FCF/USP 139

9. Curriculum vitae

FBT/FCF/USP 140

1. Dados pessoais:

Endereço: Rua Borges Lagoa, 908, Apto: 191

Bairro Vila Clementino, CEP: 04038-002. São Paulo – SP CRF-SP: 30.509

e-mail: faverorp@usp.br/ fávero_rpaula@yahoo.com.br

2. Formação Profissional:

2003 - 2007: Doutorado em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica na Universidade de São

Paulo (USP/SP).

2000 - 2002: Mestre em Ciência e Tecnologia Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa

Maria – RS (UFSM).

1995 - 1999: Graduação em Farmácia e Bioquímica – Ênfase em Tecnologia de Alimentos,

Universidade Federal de Santa Maria – RS (UFSM).

3. Experiência Didática:

2006 - Palestra intitulada “Planejamento e desenvolvimento de fármacos: atualizações e

principais metodologias” proferido ao curso de farmácia da FMU, campus Santo Amaro,

São Paulo, SP, 02/10/2006.

2006 - Palestra intitulada “Application of QSAR Studies of New Antimicrobial Drug Design”,

proferida durante o encontro - International Symposium on Drug Discovery and IX

National Meeting of Medicinal Chemistry Professors - na Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade Estadual de São Paulo, Unesp, Araraquara, SP, Brasil,

24/07/2006.

2005 - Monitoria na disciplina de Tecnologia Químico-Farmacêutica I (FBT-0531), Estágio

supervisionado em docência do Programa de Aperfeiçoamento ao Ensino da

Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, SP, 01/07-15/12/2005 (2o semestre de

2005).

2005 - Pós-graduação - Ministrou-se as aulas intituladas “Estatística e Quimiometria

empregadas em QSAR” e “Tópicos de Modelagem Molecular – Aplicação em

Otimização de Fármacos”, no curso de Otimização de Fármacos do Programa de pós-

graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, FCF/USP, sob coordenação do Prof.

Associado Leoberto Costa Tavares, São Paulo, SP, 2o semestre de 2005.

2005 - Curso intitulado “Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos”, com duração de 8

horas aula, proferido ao curso de farmácia da Universidade de Rio Preto, UNIRP, Rio

Preto, SP, 27/09/2005.

2003 - Palestras intituladas “QSAR este estranho” proferidas ao curso de Farmácia da

Universidade Anhembi Morumbi, São Paulo, 15 e 21/09/2003.

2001 - Docência Orientada - Ministrou-se a disciplina de Toxicologia Química (QMC 152), com

duração de 15 horas aula, para o curso de Química Industrial, UFSM, 1o Semestre.

FBT/FCF/USP 141

4. Experiência Profissional:

2005 - Estágio supervisionado em docência do Programa de Aperfeiçoamento ao Ensino

(PAE), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo,

SP, 01/07-15/12/2005 (2o semestre de 2005).

1999 - Tecnologia de Alimentos – Conservas Oderich S.A., São Sebastião do Caí, RS, estágio

com duração de 480 horas.

1998 - Farmácia Hospitalar – Hospital da Brigada Militar, Santa Maria, RS, estágio com

duração de 120 horas.

1997 - Manipulação de medicamentos – Hospital Materno Infantil, São Luiz Gonzaga, RS,

estágio com duração de 90 horas.

5. Atividades extra-curriculares:

1998 - Organização de congresso - XXVIII CONEF/ I ENEF – Conselho Nacional das Entidades

Estudantis de Farmácia/ Fórum Estudantil Nacional sobre Ensino Farmacêutico –

UFSM, Santa Maria, RS.

1997 - Organização da VI Semana Acadêmica da Farmácia – Centro de Ciências da Saúde,

UFSM, Santa Maria, RS, 40 horas.

6. Prêmios e Titulações

2006 - Aprovação em primeiro lugar em concurso público para professor universitário,

disciplinas de Química Farmacêutica e Análises Toxicológicas, da Universidade

Estadual do Centro Oeste do Paraná – Unicentro, Campus Guarapuava, 12/2006.

2006 - Trabalho escolhido como melhor pôster de pós-graduação do departamento de

Farmácia , trabalho intitulado “Planejamento Molecular e Síntese de análogos do

Nitrofural com Atividade Antichagásica”, autores: TROSSINI, G.H.G., PAULA, F.R.,

FERREIRA, E.I., MENESES, C.M.S., (XI Semana Farmacêutica de Ciência e

Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006).

7. Trabalhos apresentados em eventos científicos:

2006 - PAULA, F.R., JORGE, S. D., TAVARES, L. C., ALBUQUERQUE, C. N., Molecular

Modeling Studies and Structure-Activity Relationship of 2,3-pyridinedicarboxamide

Derivatives, 3rd Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, São Pedro, SP, 12-

15/11/2006.

2006 - GRALLERT, S.R., PAULA, F.R., PASSALAQUA, L. F. M., TAVARES, L.C., Studies of

Molecular Reactivity of Flavonoids, 3rd Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry,

São Pedro, SP, 12-15/11/2006.

2006 - PAULA, F.R., TROSSINI, G.H.G., SERRANO, S.H.P., FERREIRA, E.I., MENESES,

C.M.S., TAVARES, L.C., Estudo químico-quântico de propriedades estereoeletrônicas

de derivados nitrocompostos com atividade antichagásica, XI Semana Farmacêutica de

Ciência e Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006.

FBT/FCF/USP 142

2006 - GRALLERT, S.R., PAULA, F.R., PASSALAQUA, L. F. M., CALDEIRA, J.L., TAVARES,

L.C., Estudos de reatividade molecular da flavona, XI Semana Farmacêutica de Ciência

e Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006.

2006 - TROSSINI, G.H.G., PAULA, F.R., FERREIRA, E.I., MENESES, C.M.S., Planejamento

Molecular e Síntese de análogos do Nitrofural com Atividade Antichagásica, 29a

Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, SP, 20-

23/05/2006. (também apresentado na XI Semana Farmacêutica de Ciência e

Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006).

2006 - PAULA, F.R., TROSSINI, G.H.G., SERRANO, S.H.P., FERREIRA, E.I., MENESES,

C.M.S., TAVARES, L.C., Estudo conformacional de derivados 5-nitro-heterocíclicos

com potencial atividade antichagásica, 29a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de

Química, Águas de Lindóia, SP, 20-23/05/2006.

2005 - PAULA, F.R., JULIÃO, M.S.da S., TAVARES, L.C., SERRANO, S.H.P., Redução

Eletroquímica da 5-nitro-2-furfurilidênico 4-cloro-benzidrazida com Atividade

Antichagásica Utilizando Eletrodo de Diamante Dopado com Boro, X Semana

Farmacêutica de Ciência e Tecnologia da FCF/USP.

2005 - JULIÃO, M.S.da S., FERREIRA, E.I., PAULA, F.R., FERREIRA, N.G., SERRANO,

S.H.P., Determinação Voltamétrica de Nitrofurazona sobre Eletrodo de Diamante

Altamente Dopado com Boro Utilizando a Voltametria de Onda Quadrada, submetido

ao 13o Encontro Nacional de Química Analítica/ 1o Congresso Ibero-Americano de

Química Analítica, 12-16/10/2005.

2004 - PAULA, F.R., SERRANO, S.H.P., TAVARES, L.C., Influence of the physicochemical

properties on the reduction potential of the 5-nitro-heterocyclics with antichagasic

activity, 2nd Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, Rio de Janeiro, RJ, 22-

25/11/2004.

2004 - PAULA, F.R., SERRANO, S.H.P., TAVARES, L.C., Influência da distribuição eletrônica

sobre o potencial de redução de compostos 5-nitro-heterocíclicos com atividade

antichagásica, IX Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia. XIX Seminário de

Pós Graduação, São Paulo, SP, 22-27/10/2004.

2004 - PAULA, F.R., TAVARES, L.C., SERRANO, S.H.P., Apresentação oral do trabalho

“Comportamento eletroquímico de Derivado 5-Nitro-2-tioflidênico-4-hidroxibenzidrazida

em meio aquoso” - XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica –

Teresópolis, RJ, 08-12/08/2004.

2004 - PAULA, F.R., TAVARES, L.C., SERRANO, S.H.P., Avaliação do Potencial de Redução

de Nitroradical a partir de Derivado 5-Nitro-2-tioflidênico benzidrazida com Atividade

Antichagásica - 27o Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química/ XXVI

Congresso Latinoamericano de Química - Salvador, Ba, 30/05-02/06/2004.

FBT/FCF/USP 143

2002 - PAULA, F.R., SILVA, F.E.B., SANTOS, E.P., DRESSLER, V.L., FLORES, E.M.M.,

Determinação de Sb(III) por FI-HG-AAS em medicamentos injetáveis para tratamento

de leishmaniose – 25o Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química - Poços de

Caldas, MG, 20-23/05/2002.

2002 - SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., SANTOS, E.P., BARIN, J.S., DRESSLER, V.L., FLORES,

E.M.M., Determinação de arsênio em medicamentos injetáveis contendo elevados

níveis de antimônio pentavelente – 25o Reunião Anual da Sociedade Brasileira de

Química - Poços de Caldas, MG, 20-23/05/2002.

2002 - FLORES, E.M.M., SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., SANTOS, E.P., ROSSI, R.C., BARIN,

J.S., DRESSLER, V.L., Arsenic Determination in Samples of Injectable Drugs

Containing High Levels of Sb(V) - SEVENTH RIO SYMPOSIUM ON ATOMIC

SPECTROMETRY, Florianópolis, SC, 7-12/04/2002.

2001 - SANTOS, E.P., PAULA, F.R., SILVA, F.E.B., BARIN, J.S., DRESSLER, V.L., FLORES,

E.M.M., Avaliação de Procedimentos para a Determinação de Sb (III) em Amostras de

Medicamentos Antimoniais – 11o ENQA – Encontro Nacional de Química Analítica,

UNICAMP, Campinas, SP, 18-21/09/2001.

2001 - SANTOS, E.P., SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., BARIN, J.S., FLORES, E.M.M.,

DRESSLER, V.L., BITTENCOURT, C.F., Determination of Sb (III) in Antimonial Drugs -

VI PHARMATECH/ III ENECQ, Recife, PE, 05-08/08/2001.

2001 - SANTOS, E.P., SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., BARIN, J.S., FLORES, E.M.M.,

BITTENCOURT, C.F., Heavy Metals Determination in Meglumine Antimonate by

Instrumental Methods – VI PHARMATECH/ III ENECQ, Recife, PE, 05-08/08/2001

2001 - BARIN, J.S., KAECHER, L.E., PEDROSO, M.P., FLORES, E.L.M., PAULA, F.R.,

FLORES, E.M.M., Decomposição de Fígado Bovino em Minifrascos de Polipropileno

em Sistema Hermético e Determinação de Cd por GFAAS – 24o Reunião da Sociedade

Brasileira de Química - Poços de Caldas, MG, 28-31/05/2001.

8. Cursos:

2006 - Curso – Estratégias em Química Medicinal: planejamento, síntese e avaliação biológica

de novas substâncias bioativas, ministrado pelos Profs. Dr. Carlos Alberto Montanari

(IQSC), Adriano D. Andricopulo (IFSC-USP) e Luiz Carlos Dias (IQ-Unicamp), 29ª

RASBQ, Águas de Lindóia, SP, 19 - 22/05/2006.

2004 - Curso – Planejamento racional de fármacos: Métodos em quimio-e bioinformática,

ministrado pelos Profs. Dr. Adriano D. Andricopulo (IFSC-USP), Carlos Alberto

Montanari (UFMG) e Glaucius Oliva (IFSC-USP), 27ª RASBQ/XXVI CLAQ, Salvador,

Ba, 31/05-02/06/2004.

2003/2004 - Curso - New Approaches in Drug Design, ministrado pelo Prof. Dr. Hugo Kubinyi

(Basf - University of Heidelberg), IQ/USP, São Paulo, SP, 17-21/11/2003 e 16-

18/11/2004.

FBT/FCF/USP 144

2003 - Workshop - Técnicas de Amostragem na Indústria Farmacêutica, ministrado pelo Prof.

Dr. Humberto Zardo, FEBRAFARMA, São Paulo, SP, 20-21/03/2003.

2002 - Curso - Química de Medicamentos, ministrado pelo Prof. Dr. Eliezer J. Barreiro (UFRJ),

Santa Maria, RS, DQ/UFSM.

2002 - Curso - Hydride Generation Technique, ministrado pelo Prof. Dr. Jiri Dedina (Academy of

Sciences of Czech Republic), SQIA, UFSM, Santa Maria, RS, 15-17/04/2002.

2001 - Curso - Ultra-som e Aplicações em Química Analítica – (Teoria e Prática), ministrado

pelo Prof. Dr. Mauro Körn (Uneb), SQIA, UFSM, Santa Maria, RS, 16-18/10/2001.

2001 - Curso - Troca Iônica - Fundamentos e Aplicações Analíticas, ministrado pelo Prof. Dr.

João Alfredo Medeiros (UFRJ), SQIA, UFSM, Santa Maria, RS, 25-28/11/2001.

2000 - Curso de Biossensores, V Escola de Inverno em Físico-Química e Química Analítica –

UFSCar, São Carlos, SP, 03-08/08/2000.

1999 - Curso Teórico-Prático de Processo Cervejeiro e Produção de Refrigerantes, ministrado

pelo Eng. Quim. MSc Dilson Fronza, CT, UFSM, Santa Maria, RS, 48 horas.

1998 - Curso de Enzimologia – Curso de pós-graduação em Ciência e Tecnologia dos

Alimentos, ministrado pelo Prof. Dr. Raymon Pacovsky, CCR, UFSM, Santa Maria, RS,

30 horas.

1998 - Curso Manipulação Magistral, CCSH, UFSM, Santa Maria, RS, 17 horas.

9. Publicações científicas

- Determination of total arsenic by batch hydride generation atomic absorption spectrometry in

injectable drugs containing high levels of Sb(V) as N-methylglucamine antimoniate,

FLORES, E. M. M., SILVA, F. E. B. da, SANTOS, E. P., BARIN, J. S., PAULA, F. R.,

ZANELLA, R., DRESSLER, V. L., BITTENCOURT, C. S., Spectrochimica Acta Part

B, 57, 2002, p. 2095–2102, Holanda.

- Selective Determination of Sb(III) in Drugs by Flow Injection Hydride Generation AAS,

FLORES, E. M. M., PAULA, F. R., SILVA, F. E. B. da, MORAES, D. P., PANIZ, J. N.

G., SANTOS, E. P., DRESSLER, V. L., BITTENCOURT, C. S., Atomic Spectroscopy,

24 (1), 2003, p. 15-21, Estados Unidos.

- Capítulo de livro intitulado “Biological Electrochemical Applications on Diamond

Electrodes: Solving Old Problems and Oppening New Possibilities”, incluso no livro

“Electrochemistry of Biological Significance Compounds”, Editores Squella J.A., Bollo,

S., ISBN: 81-7895-205-X, Editora Transworld Research Network, Kerala, India, 2006,

Autores: SERRANO, S. H. P., Rita de Cássia Mendes de BARROS, R. C. M., JULIÃO,

M. S. S., PAULA, F. R., (02/2006).

- Regiospecific Synthesis of 5-trichloromethyl-1H-pyrazoles and carboxylic esters derivatives,

MOURA, S., FLORES, A. F. C., PAULA, F. R., MACHADO, P., PINTO, E., MARTINS,

M. A. P., Synlett, submetido, 2007.