Introdução à LC/MS...I. Espectrometria de Massas (MS) ! A espectrometria de massas é uma...

Introdução à LC/MS

Introdução

n LC provém a separação, em fase líquida, de misturas complexas, porém dificilmente fornece a ident i f icação posi t iva de componentes individuais.

n MS é uma técnica que auxilia na elucidação estrutural de compostos em fase gasosa, porém dificilmente é apropriado para a análise de misturas.

n LC opera em fase líquida enquanto que MS opera em fase gasosa, sob alto vácuo.

n O uso de uma interface é necessário para ter compostos seqüencialmente separados em LC e introduzidos para análise no MS.

n Um bom sistema LC/MS pode fornecer informações quali e quantitativas, geralmente com diminutas quantidades de material.

Introdução

Cromatografia Líquida

Espectrometria de Massas

Misturas em MS

Combinando LC com MS

Aquisição dos Dados

Velocidade de varredura

Aquisição dos Dados

Número de espectros por pico

Melhorando os Resultados

Obter a maior eficiência possível


Apresentação de cromatograma de íon selecionado


Monitoramento de íon selecionado (SIM)

Sumário

n O interfaceamento de LC com MS resulta em um instrumento poderoso de LC/MS que pode ser usado para análises de misturas complexas, originada de fontes mais variadas.

n Aplicações de interesse nas áreas de meio ambiente, arqueologia, medicina e forense, além de química e bioquímica.

Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria

de Massas —LC/MS

n  Espectrometria de Massas n  Interfaces n  Analisadores de Massas

I. Espectrometria de Massas (MS)

n  A espectrometria de massas é uma técnica analítica instrumental utilizada para a análise, em fase gasosa, de átomos ou moléculas de uma amostra que são ionizados e separados de acordo com a razão massa/carga quando submetidos a condições específicas de um campo elétrico e/ou magnético.

I. Espectrometria de Massas (MS)

n  A determinação da massa molecular;

n  A caracterização estrutural;

n  O estudo da reatividade em fase gasosa;

n  A análise qualitativa e quantitativa dos componentes de uma mistura complexa;

n  A estrutura de compostos inorgânicos, orgânicos e biológicos;

n  A estrutura e composição de superfície sólida;

n  A razão isotópica de átomos na amostra.

II. O Espectrômetro de Massas

n  Processo de ionização e/ou fragmentação n  Separação dos íons n  Detecção e análise

Amostra

Sistema de introdução de amostra

Fonte de íons

Analisador de massas Detector

Proc. de dados

Sistema de vácuo

Etil benzeno: MM = 106 Da

C6H5CH2CH3 + e- → C6H5CH2CH3• + + 2e-

Informações do Espectro de Massas

n  Separação dos íons pela razão massa/carga

n  Pico do íon molecular

n  Pico do íon base (100%)

n  Padrão de fragmentação

n  Razão isotópica

III. Fontes (Processos) de Ionização

TipoBásico

Nome e Sigla Agente Ionizante

Fase Gasosa Impacto Eletrônico (EI) elétrons energéticosIonização Química (CI) íons gasososIonização de Campo (FI) eletrodo alta voltagem

Dessorção Dessorção de Campo (FD) eletrodo alta voltagemIonização electrospray (ESI) alto campo elétricoIonização/dessorção à laserassistido por matriz(MALD/I)

feixe de laser

Bombardeamento de átomosrápidos (FAB)

feixe átomosacelerados

Ionização termospray (TS) alta temperatura

Impacto Eletrônico ou Ionização por Eletrons

n  A amostra passa por uma “cortina” de elétrons acelerados por um campo de 70 eV

E = 70 eV ≈ 7 × 103 kJ mol-1

n  Energia de ligação típica ≈ 200 - 600 kJ mol-1

Fragmentação

Impacto Eletrônico

Ionização por Elétron

J  Alta produção de íons - boa sensibilidade

J  Fragmentação auxilia na identificação

K  Requer amostra volátil

L  Pico íon molecular nem sempre é evidente

⇒  Uso de Ionização Química (CI):

⇒  produção de íon molecular e a fragmentação é mais amena

Reprodutibilidade de fragmentação

Ionização à Pressão Atmosférica (API)

n  Ionização Electrospray (ESI)

n  Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI)

Vantagens API

n  Informação sobre a massa molecular (MM) dos compostos, inclusive grandes biopolímeros.

n  Sensível; MM obtida com concentrações baixas de analitos.

n  A técnica é compatível com moléculas voláteis, não voláteis, polares e apolares.

n  Excelente para confirmação de compostos conhecidos.

Ionização por Electrospray (ESI)

n  Ionização à pressão atmosférica e temperatura ambiente

n  Aplicação de campo elétrico de vários kV promove a ionização das gotículas do spray

n  Um contra fluxo de gás secante reduz o tamanho das gotículas até o seu colapso eletrostático

n  Produção de íons com elevado número cargas

Interface ESI

Processo de Ionização

Aplicações do ESI

q  Análise de compostos polares e com elevada massa Molecular. Por Exemplo: Saponinas

O

HO

OH

OH

O

OHO

OH

O

O

OH

CH3

CH3CH3

CH3

CH3 OH

CH3

H

O

HOH

H

O

O

HO

O

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Figura 18: Conjunto de espectro de massas das frações eluídas com MeOH/H2O (1:1). Debaixo para cima: fração 12, 24, 49 e 62.

Monitoramento da composição de frações obtidas de extratos de Sapindus saponaria

Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI)

n  Bastante similar a ESI

n  Indicado para obtenção de MM de compostos conhecidos (confirmação de síntese de biblioteca combinatória), porém indução de fragmentação também é possível

n  Compatível com grande faixa de fluxos de fase móvel

n  Robusto para desenvolvimento de método

Interface APCI

Principais Diferenças entre APCI e ESI

n  Mecanismo de Ionização:

n  Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador aquecido e pneumaticamente assistido. A voltagem (~3 kV) é aplicada a uma agulha de metal na saída do spray.

n  A descarga Corona ioniza as moléculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos por transferência de prótons formando [M+H]+ ou [M-H]-


n  Razão de Fluxo:

n  APCI tolera fluxos na ordem de 0,2 a 2,0 mL/min, enquanto que ESI opera no máximo até 1,0 mL/min.

n  ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos quanto 5 µL/min, compatível com acoplamentos capilares (µLC ou CZE).


n  Fragmentação:

n  Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentação, enquanto que ESI pode até formar alguns íons pseudo-moleculares.

n  APCI não produz cargas múltiplas, portanto não é adequado para compostos de alta MM.

n  Sensibilidade:

n  Sem ser uma regra, APCI tende a render melhor sensibilidade para solutos menos polares.

Dessorção/Ionização à Laser Assistida com Matriz (MALD/I)

n  Processo de ionização branda.

n  Apropriado para biomoléculas de elevado peso molecular.

n  Pulso de laser incide sobre uma amostra co-cristalizada com uma matriz apropriada - derivados de ácidos benzóicos.

n  Análise proteômica.

Dessorção/Ionização à Laser Assistida com Matriz (MALD/I)

Espectro MALD/I

IV. Analisadores de Massas

n  Setor magnético (B)

n  Duplo foco (EB ou B2)

n  Quadrupolo (Q)

n  Tempo de vôo (TOF)

n  Captura de íons (MSn)

n  Ciclotron de íons (ICR)

Resolução em MS

RS = 4000 ⇒ 400,0 e 400,1 (40,00 e (40,01)

mmRS Δ

=

Nome Fórmula Nominal Exata Média Methyl Stearate

C19H38O2 298 298.2872 298.5114

Ubiquitin C378H630N105O118S 8556 8560.6254 8565.873

Resolução em MS

Resolução em MS

A resolução necessária depende da aplicação

Analisador tipo Setor Magnético

VerB

zm

2

22

=

Analisador Quadrupolar (Q)

n  Analisador de varredura

n  Normalmente é mais barato e robusto que setor magnético

n  Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofreqüência entre pares, permitindo que apenas um íon atinja o detetor de cada vez


Experimentos de MS/MS com triplo quadrupolo

Tempo de Vôo (TOF)

n  Íons são produzidos em pulsos e injetados no tubo de deslocamento

Tempo de Vôo (TOF)

Tempo de Vôo (TOF)

n  Separação dos íons é temporal e depende da energia cinética dos fragmentos

zmVdv

dt f ⋅== )21(

229,1 dt Vzm

×=

Analisador Trap Iônico (ion trap)

n  Compacto & robusto

n  Funcionamento similar ao quadrupolo

n  Capacidade de efetuar MS tandem temporal

Analisador Trap Iônico (ion trap)

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