Isana Rodrigues Silva

AVALIAÇÃO DO PERFIL DE METILAÇÃO DO DNA EM GENES SUPRESSORES TUMORAIS E

SEQUENCIAS REPETITIVAS EM TRABALHADORES DA CONSTRUÇÃO CIVIL EXPOSTOS A AGENTES

CARCINOGÊNICOS AMBIENTAIS E OCUPACIONAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação do Hospital de Câncer de Barretos Fundação

PIO XII para obtenção do Título de Mestre em Ciências da

Saúde.

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Prof. Dr. Henrique César Santejo Silveira

Barretos, SP 2016

Isana Rodrigues Silva

AVALIAÇÃO DO PERFIL DE METILAÇÃO DO DNA EM GENES SUPRESSORES TUMORAIS E

SEQUENCIAS REPETITIVAS EM TRABALHADORES DA CONSTRUÇÃO CIVIL EXPOSTOS A AGENTES

CARCINOGÊNICOS AMBIENTAIS E OCUPACIONAIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação do Hospital de Câncer de Barretos

Fundação PIO XII para obtenção do Título de Mestre

em Ciências da Saúde.

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Prof. Dr. Henrique César Santejo Silveira

Barretos, SP 2016

FICHA CATALOGRÁFICA Preparada por Martins Fideles dos Santos Neto CRB 8/9570

Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos

S586a Silva, Isana Rodrigues.

Avaliação do perfil de metilação do DNA em genes supressores tumorais e sequências repetitivas em trabalhadores da construção civil expostos a agentes carcinogênicos ambientais e ocupacionais / Isana Rodrigues Silva. - Barretos, SP 2016.

105 f. : il. Orientador: Dr. Henrique César Santejo Silveira. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital

de Câncer de Barretos, 2016. 1. Metilação. 2. Biomarcadores. 3. Epigenética. 4. Pirosequenciamento. 5.

Câncer. 6. Construção Civil I. Autor. II. Silveira, Henrique César Santejo. III. Título

FOLHA DE APROVAÇÃO

Isana Rodrigues Silva

Avaliação do perfil de metilação do DNA em genes supressores tumorais e sequências repetitivas em

trabalhadores da construção civil expostos a agentes carcinogênicos ambientais e ocupacionais.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de

Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde - Área de Concentração: Oncologia

Data da aprovação: 01/04/2016

Banca Examinadora:

Prof.ª Dra. Elza Tiemi Sakamoto Hojo

Instituição: Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Departamento de Biologia - USP

Prof.ª Dra. Mariana Brait Rodrigues de Oliveira

Instituição: Johns Hopkins University

Prof. Dr. Henrique Cesar Santejo Silveira

Orientador

Prof. Dr. Adhemar Longatto Filho

Presidente da Banca

SUPORTE À PESQUISA POR AGÊNCIA DE FOMENTO

Este trabalho recebeu apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

através de Auxílio à Pesquisa – Regular (processo número 2012/24279-1).

As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de

responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão da FAPESP.

“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós-

Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento do

Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações e Teses

do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este trabalho foi

realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP), não havendo nada

em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou falsificação de dados. As

opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de

responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão da Fundação Pio XII –

Hospital de Câncer de Barretos.”

“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha

realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia

estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade dos

pesquisadores envolvidos. Os pesquisadores declaram não ter qualquer conflito de interesse

relacionado a este estudo.”

Dedico este trabalho a Deus, por dar sabedoria todos os dias

para que eu pudesse suportar momentos e situações difíceis.

Aos meus amados pais Elisabete Rodrigues Silva e Ari Souza

da Silva que sempre acreditaram na minha capacidade, sem

eles nenhum dos meus objetivos teriam se tornado realidade.

Ao meu irmão Igor Rodrigues Silva por acreditar na

profissional que sou. E ao meu avô José Rodrigues (em

memória) que esteve presente comigo quando precisei, com

vibrações positivas.

AGRADECIMENTOS

“Você pode sonhar, criar, desenhar e construir o lugar mais bonito do mundo. Mas é

necessário ter pessoas para transformar seu sonho em realidade.” (Walt Disney). Neste momento,

venho expressar todo meu agradecimento e gratidão, do fundo do meu coração à todas as

pessoas que contribuíram com a realização desse trabalho. Com toda certeza, sem vocês esse

sonho não teria se concretizado. A gratidão é o único tesouro dos humildes. (William

Shakespeare). Muito obrigada.

Agradeço a Deus, por me conceder sabedoria e me ajudar a suportar momentos difíceis. E

no final você vai olhar para trás e agradecer cada tropeço. Acredite, Deus não falha.

A minha mãe, Elisabete, que de tudo sabe um pouco e qualquer situação ou problema que

eu estava passando, sempre tinha a palavra certa nos momentos certos que me faziam pensar.

Sempre acreditou em mim, na minha capacidade, quantas vezes, só de estar ao seu lado eu

recuperava todas as minhas energias para continuar.

Ao meu pai, Ari, meu grande herói, que sempre acredita no meu potencial, que sou capaz de

realizar minhas metas, reconhecendo meu esforço e auxiliando em tudo que precisava. Meu total

suporte. Obrigada por torcer por mim.

Ao meu irmão, Igor, que uma vez disse que sou um exemplo para ele. Espero estar sendo o

melhor exemplo possível, mesmo com defeitos, mas tentando acertar sempre. Obrigada pela

torcida.

Quantas vezes voltei para casa apenas para poder sentir a vibração positiva de vocês e

recarregar minhas energias para poder voltar e conseguir prosseguir.

Ao meu grande amigo, inesquecível, Luiz Manoel, que acompanhou todos os meus

momentos bons e ruins de muito perto, aguentando muitas vezes lágrimas e também sorrisos.

Também me escutando, o que me aliviava muitas vezes. Fazia de tudo para me distrair e me deixar

feliz. Obrigada por entender os momentos em que precisava estudar. Obrigada por estar comigo

em todos os momentos. Fez a diferença. Obrigada por tudo.

A toda minha família que de alguma forma me proporcionaram chegar até aqui, minha tia

Silvia, onde morei por um ano, minha avó Mileide (em memória), que também me cedeu moradia

por um ano no começo dos estudos. Obrigada.

Se você passar por uma guerra no trabalho, mas tiver paz quando chegar em casa, será um

ser humano feliz. Mas, se você tiver alegria fora de casa e viver uma guerra na sua família, a

infelicidade será sua amiga. (Augusto Cury).

Ao meu orientador, Dr. Henrique César Santejo Silveira, que me cedeu a oportunidade de

realizar o mestrado em uma instituição respeitada e contribuiu para mais um avanço na minha

formação profissional.

Ao grande amigo e profissional, Msc. André Van Helvoort Lengert, desde o início me

incentivando, acreditando em mim sempre, na minha capacidade. Foi um dos responsáveis pelo

grande aprendizado que obtive durante esse tempo. Sem sua ajuda eu não teria concluído essa

dissertação. Meus sinceros agradecimentos, muito obrigada.

À Dra. Adriane Feijó Evangelista, pela grande ajuda e disponibilidade. Pronta sempre a me

socorrer em momentos tensos, mesmo estando de férias. Obrigada pelas dicas e por passar seus

conhecimentos que não são poucos todas as vezes que precisava.

À Dra. Lídia Maria Rebolho Batista Arantes, por toda ajuda com seus conhecimentos e

sempre disposta a auxiliar, seja qual fosse a questão. Com certeza umas das pessoas essenciais

para a concretização desse trabalho. Meu muito obrigada.

Costumo dizer que devo ter acumulado alguns carmas positivos ao longo da vida, por ter

tantas pessoas boas que me rodeiam e estão dispostos a ajudar. Sempre que estava precisando de

algo, Deus colocava alguém especial no meu caminho pronto a me ajudar e se tornando mais um

amigo(a), foi assim com a Dra. Hellen Kuasne, que me deu muito auxílio na parte de metodologia,

sua ajuda foi essencial para o decorrer desse trabalho. Obrigada por cada dúvida sanada, sempre

com muito carinho e prontidão. Muito obrigada.

Aos amigos que vou levar no meu coração para toda a vida, que estiveram presentes

durante minha caminhada, minha eterna amiga, amiga de alma, de outras vidas, Manoela

Catarina Aguena Souza Ramos, o maior presente que ganhei durante minha caminhada foi ter

conhecido você e hoje poder te chamar de “amiga”. Obrigada por cada momento, foram os

melhores, por toda ajuda, por me socorrer várias vezes no início nos meus desesperos, por querer

ajudar mesmo estando morta de cansaço. Eu me considero uma pessoa de muita sorte por ter te

conhecido e ter tido a oportunidade de conviver com você. Mesmo não estando presente, não

teve um dia sequer que não pensava “Ah, se a Manú estivesse aqui”. Finalizo esse trabalho com

orgulho e também dedico à você. Obrigada amiga.

À minha amiga, Aline Oliveira da Rocha, obrigada por cada momento de desabafo que

tivemos, paciência e carinho, por acreditar que eu chegaria até o fim, o reconhecimento é

essencial, obrigada. Às amigas, Msc.Taciane, Fernanda Franco Munari, Isabella Alves Brunetti,

Karen Borba, Msc. Tatiane Siqueira, Rhafaella Causin, Caroline Rogeri e Msc. Danielle, obrigada a

todas por todo o auxílio e ajuda, contribuindo com seus conhecimentos e parceria. Vocês fizeram

o meu dia-a-dia que não eram fáceis, se tornarem mais leves com os sorrisos e descontrações.

Ficou mais fácil com vocês.

Agradeço à família CPOM pela convivência nesses últimos anos, Adriana Carlone (Dry),

Adriana Lorenzi, Mathias, Maraisa, Ana Luiza, Rafael Tiveron, Renato, Carolzinha, Carol Laus,

Vânia, Estela, Paula, Paulinha, Karina, Natália Campacci, Nathália Campanella, Tati Honda,

Marcela, Viviane, Ana Laura, Ana Gabriela, Aline Coelho, Úrsula, Weder, Cintia, Vitor, à

Fernanda Cury, pelas conversas e toda paciência no início.

A todos os pesquisadores do CPOM e IEP, pelas sugestões em reuniões e journal.

Aos membros da banca de acompanhamento, Dra. Mariana Brait, sempre muito gentil,

contribuindo para o trabalho se concretizar de maneira excelente. Dr. Rui Reis também se

disponibilizando a ajudar através de críticas, sugestões e contribuições a este trabalho. Foi uma

honra tê-los em minha banca.

Ao programa de pós-graduação, em especial à Silvana Rodrigues e Brenda Honda.

Aos amigos e colaboradores do Núcleo de Apoio ao Pesquisador (NAP), por todo

comprometimento, desde o início, meu muito obrigada a toda a equipe, Tamira, Thaís, Cleyton,

Marcos, Jamile e meu amigo Marco por toda colaboração na parte estatística, me ajudando a ter

vários raciocínios, deixando a estatística mais fácil de ser entendida (se é que isso é possível), por

todos os e-mails, principalmente os fora de horário de expediente e também finais de semana,

pronto sempre a me ajudar e sanar minhas dúvidas. Obrigada por tudo. Aos amigos do

condomínio, Ronaldo, Monise, Kleyton, obrigada por fazer meus dias mais divertidos.

Por fim, chego ao final de mais um desafio que tracei em minha vida e com muito esforço e

dedicação, concluo com êxito. Durante toda a jornada, aprendi muito, aprendi como ser e como

não ser, como lidar com várias situações. Chorei muito, mas também sorri muito. Conheci e

convivi com pessoas maravilhosas que me fizeram ser alguém melhor. E agora o sentimento é

apenas de gratidão à todos que contribuíram e muito orgulho por ter realizado um trabalho com

muita ética. “Aquele que é possuidor de verdadeira sabedoria não se envaidece por seus êxitos;

ele mantém sempre a humildade, atribuindo a Deus o mérito da sua vitória.” (Masaharu

Taniguchi).

O aprendizado é constante.

O meu sincero Muito Obrigada a todos.

O AMOR

Quando propus a teoria da relatividade, muito poucos me entenderam e o que vou agora revelar a você,

para que transmita à humanidade, também chocará o mundo, com sua incompreensão e preconceitos.

Peço ainda que aguarde todo o tempo necessário, anos, décadas, até que a sociedade tenha avançado o

suficiente para aceitar o que explicarei em seguida para você.

Há uma força extremamente poderosa para a qual a ciência até agora não

encontrou uma explicação formal. É uma força que inclui e governa todas as outras, existindo por trás de

qualquer fenômeno que opere no universo e que ainda não foi identificada por nós.

Esta força universal é o AMOR.

Quando os cientistas estavam procurando uma teoria unificada do Universo esqueceram a mais invisível e

poderosa de todas as forças.

O Amor é Luz, dado que ilumina aquele que dá e o que recebe.

O Amor é gravidade, porque faz com que as pessoas se sintam atraídas umas pelas outras.

O Amor é potência, pois multiplica (potencia) o melhor que temos, permitindo assim que a humanidade

não se extinga em seu egoísmo cego.

O Amor revela e desvela. Por amor, vivemos e morremos. O Amor é Deus e Deus é Amor.

Esta força tudo explica e dá SENTIDO à vida. Esta é a variável que temos

ignorado por muito tempo, talvez porque o amor provoca medo, sendo o único poder no universo que o

homem ainda não aprendeu a dirigir a seu favor.

Para dar visibilidade ao amor, eu fiz uma substituição simples na minha

equação mais famosa. Se em vez de E = mc², aceitarmos que a energia para curar o mundo pode ser obtido

através do amor multiplicado pela velocidade da luz ao quadrado (energia de cura = amor x velocidade da

luz ²), chegaremos à conclusão de que o amor é a força mais poderosa que existe, porque não tem limites.

Após o fracasso da humanidade no uso e controle das outras forças do

universo, que se voltaram contra nós, é urgente que nos alimentemos de outro tipo de energia. Se

queremos que a nossa espécie sobreviva, se quisermos encontrar sentido na vida, se queremos salvar o

mundo e todos os seres sensíveis que nele habitam, o amor é a única e a resposta última.

Talvez ainda não estejamos preparados para fabricar uma bomba de amor, uma criação suficientemente

poderosa para destruir todo o ódio, egoísmo e ganância que assolam o planeta. No entanto, cada indivíduo

carrega dentro de si um pequeno, mas poderoso gerador de amor, cuja energia aguarda para ser libertada.

Quando aprendemos a dar e receber esta energia universal, provaremos que o amor tudo vence, tudo

transcende e tudo pode, porque o amor é a quintessência da vida.

Albert Einstein

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Câncer Ocupacional 1

1.2 Exposição ocupacional em trabalhadores da construção civil 3

1.3 Epigenética 7

1.4 Metilação do DNA para determinação dos sujeitos com alto risco ao desenvolvimento de câncer 12

2 JUSTIFICATIVA 15

3 OBJETIVOS 16

3.1 Objetivo geral 16

3.2 Objetivos específicos 16

4 MATERIAL E MÉTODOS 17

4.1 Local de estudo 17

4.2 Desenho do estudo 17

4.3 Sujeitos da pesquisa 17

4.4 Critérios de inclusão 17

4.5 Critérios de exclusão 18

4.6 Coleta de dados 18

4.7 Coleta de sangue 18

4.8 Determinação da metilação do DNA na região promotora de genes 18

4.9 Análise estatística dos dados 24

4.10 Aspectos Éticos 25

5 RESULTADOS 26

5.1 Coleta e caracterização sócio-demográficas dos grupos 26

5.2 Avaliação do perfil de metilação do DNA entre trabalhadores da construção civil (expostos) e

controles não-expostos (caso x controle) 30

5.3 Avaliação do nível de metilação dos genes com as covariáveis hábito de bebida e fumante passivo

para os grupos caso e controle. 39

5.4 Avaliação do nível de metilação dos genes considerando as covariáveis hábito de bebida, fumante

passivo e ex-fumantes para os grupos caso/controle. 42

5.5 Análise do perfil de metilação do DNA nos trabalhadores da construção civil expostos no 1º dia de

trabalho da semana (segunda- feira) e 5º dia de trabalho da semana (sexta- feira). 44

6 DISCUSSÃO 47

7 CONCLUSÕES 52

REFERÊNCIAS 53

ANEXOS

Anexo A – Questionário sócio-demográfico aplicado aos grupos 62

Anexo B – Condições estabelecidas de ciclagem da PCR dos genes supressores tumorais e sequências

repetitivas (°C). 67

Anexo C - Sequência dos primers e região analisada dos genes analisados 68

Anexo D – Sequência genômica dos genes de acordo com o banco de dados da UCSC 69

Anexo E – Matriz de exposição aplicado aos trabalhadores da construção. 71

Anexo F – Parecer consubstanciado do CEP 73

Anexo G – Análise dos motifs das regiões promotoras dos genes CDKN2A, MLH1 e APC utilizando o banco

de dados JASPAR. 80

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquerda: Representação esquemática de modificações epigenéticas. no DNA e nas histonas.

Direita: Esquema representando os microRNAs, que são pequenos RNAs não-codificantes, que reconhece

um RNAm alvo por homologia de sequência, levando a clivagem e o bloqueio da tradução. (Adaptado de

Mansuy et al., 201162). 8

Figura 2 – Representação da ligação do grupo CH3 no carbono 5 da citosina (C) gerando a 5-metilcitosina,

sendo este processo mediado pelas enzimas DNA metiltransferases (DNMT’s). (Retirado e modificado de

Lorincz73). 10

Figura 3 – Representação esquemética do protocolo de conversão por bissulfito de sódio. Adaptado de

Epitech Bisulfite kit (Qiagen)111. 20

Figura 4 - Representação esquemática do sistema enzimático de pirosequenciamento. Cada dNTP é

incorporada na cadeia de DNA pela enzima polimerase, a qual adiciona as bases de acordo com a fita

molde, liberando assim a molécula de pirofosfato (PPi). A enzima ATP sulfurilase converte o PPi em ATP que

serve como substrato para a produção de luz pela enzima luciferase. A luz produzida é detectada como

evidência de que a incorporação de nucleotídeos foi eficiente (Retirado e adaptado de Ahmadian et al.113).

22

Figura 5 – Representação dos pirogramas de cada região promotora analisada para cada gene. (A)

Pirograma representando a região da sequência ALU. (B) Pirograma representando a região promotora do

gene RASSF1A. (C) Pirograma representando controle metilado. (D) Pirograma representando controle não-

metilado. (E) Pirograma representando a região promotora do gene APC. (F) Pirograma representando a

região da sequência LINE-1. (G) Pirograma representando a região promotora do gene MGMT. (H)

Pirograma representando a região promotora do gene MLH1. (I) Pirograma representando a região

promotora do gene CDKN2A. (J) Pirograma representando a região promotora do gene TP53. 23

Figura 6 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho atual

(1º grupo). 28

Figura 7 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho em

empregos anteriores (1º grupo). 28

Figura 8 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho atual

(2º grupo). 30

Figura 9 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho em

empregos anteriores (2º grupo). 30

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Características sócio-demográficas dos participantes do primeiro grupo coletado (caso x

controle). 27

Tabela 2 - Características sócio-demográficos dos participantes do segundo grupo coletado (curto período

de exposição no ambiente da construção civil). 29

Tabela 3 - Avaliação do perfil de metilação do DNA na região promotora dos genes TP53, MGMT, RASSF1A

e sequência repetitiva ALU em trabalhadores da construção civil e no grupo controle. 31

Tabela 4 – Avaliação dos níveis de metilação do DNA da região promotora dos genes CDKN2A, MLH1, APC e

sequência LINE-1 em trabalhadores da construção civil e do grupo controle. 34

Tabela 5 - Nível de metilação do gene CDKN2A analisado de acordo com agentes expostos no ambiente de

trabalho atual. 35

Tabela 6 - Nível de metilação do gene CDKN2A analisado de acordo com agentes ocupacionais no ambiente

de trabalho em empregos anteriores. 35

Tabela 7 - Nível de metilação do gene MLH1 analisados de acordo com agentes ocupacionais no ambiente

de trabalho em empregos anteriores. 36

Tabela 8 - Nível de metilação do gene MLH1 analisados de acordo com agentes expostos no ambiente de

trabalho atual. 36

Tabela 9 - Nível de metilação do gene APC (Hot CpG sites) analisados de acordo com agentes ocupacionais

no ambiente de trabalho em empregos anteriores. 37

Tabela 10 - Nível de metilação do gene APC (Hot CpG sites) analisados de acordo com agentes ocupacionais

no ambiente de trabalho atual. 38

Tabela 11 - Nível de metilação da sequência repetitiva LINE-1 analisado de acordo com agentes

ocupacionais no ambiente de trabalho em empregos anteriores. 38

Tabela 12 - Nível de metilação da sequência repetitiva LINE-1 analisado de acordo com agentes

ocupacionais no ambiente de trabalho atual. 39

Tabela 13 - Níveis de metilação das regiões promotoras dos genes CDKN2A, MLH1, APC e da sequência

repetitiva LINE-1 em relação à exposição passiva ao fumo (grupo caso). 41

Tabela 14 - Níveis de metilação das regiões promotoras dos genes CDKN2A, MLH1, APC e da sequência

repetitiva LINE-1 em relação ao hábito de bebida (grupo caso). 41

Tabela 15 - Modelo de Regressão Linear Múltipla para porcentagem (%) de metilação dos genes CDKN2A,

MLH1, APC e sequência repetitiva LINE-1 em relação a hábito de fumante passivo, bebida alcoólica e ex-

fumantes (grupo caso x controle). 43

Tabela 16 - Exemplo de predição de acordo com o modelo de regressão linear para a média de

porcentagem (%) de metilação. 43

Tabela 17 - Análise da metilação do DNA da região promotora dos genes MGMT, RASSF1A, APC, MLH1 e

sequências ALU e LINE-1 em trabalhadores expostos no 1º e 5º dia da semana. 45

Tabela 18 - Análise da metilação do DNA da região promotora do gene CDKN2A em trabalhadores expostos

no 1º e 5º dia da semana. 46

LISTA DE ABREVIATURAS

ADP Adenosina difosfato

ALU Elementos intercalados curtos

APS Adenosina 5-fosfosulfato

ATP Trifosfato de Adenosina

CCD Charge Coupled Device

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DNMTs DNA metiltransferases

dNTP Desoxirribonucleotídeos Fosfatados

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

EPA Agência de Proteção Ambiental

HPAs Hidrocarboneto Policíclicos Aromáticos

IARC Agência Internacional de Investigação do Câncer

KB Quilobase (1000 pares de bases)

LINE1 Elementos Intercalados longos

miRNA Micro ácido ribonucleico

mL Mililitro

MMR Mecanismo de reparo

MNs Micronúcleos

MP Material Particulado

NaOH Cloreto de Sódio

NAP Núcleo de Apoio ao Pesquisador

OMS Organização Mundial da Saúde

OSHA Segurança Ocupacional e administração da Saúde

PB Pares de bases

PBS Solução Salina fosfatada tamponada

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

PIB Produto Interno Bruto

PPi Pirofosfato

RNA Ácido Ribonucléico

RNAm RNA mensageiro

RPM Rotação por minuto

siRNA Small interfering RNA

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

UV Ultra-violeta

LISTA DE SÍMBOLO

% Porcentagem

R$ Real

µm Micrometro

°C Graus Celsius

mL Mililitro

µL Microlitro

Nm Nanometro

µg Micrograma

µM Micromolar

M Molar

> Maior que

≥ Maior ou igual a

< Menor que

≤ Menor ou igual a

ᵝ Beta

RESUMO

Rodrigues IS. Avaliação do perfil de metilação do DNA em genes supressores tumorais e

sequências repetitivas em trabalhadores da construção civil expostos a agentes carcinogênicos

ambientais e ocupacionais. Dissertação (Mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos;

2016.

JUSTIFICATIVA: A exposição ambiental tem sido associada a um risco aumentado de

desenvolvimento de câncer, onde a metilação do DNA em regiões promotoras de genes

supressores de tumor tem surgido como possível biomarcador promissor para câncer, incluindo o

câncer de pulmão. No setor da construção civil a exposição dos trabalhadores a materiais

contendo amianto, sílica e metais, além da exposição à radiação solar, são fatores capazes de

interferir na estabilidade do genoma humano, provocando quebras no DNA e mudanças nos

padrões epigenéticos. Até o momento, nenhum estudo avaliou os níveis de metilação do DNA em

trabalhadores da construção, os quais podem estar associados ao desenvolvimento de câncer de

pulmão devido a exposição ocupacional. OBJETIVO: Este trabalho buscou avaliar possíveis

biomarcadores epigenéticos para associação do potencial risco de desenvolvimento de câncer em

trabalhadores da construção civil expostos a agentes carcinogênicos ambientais e ocupacionais.

Além disso, também foi avaliado o perfil de metilação do DNA no grupo de trabalhadores no

primeiro dia de trabalho da semana e no quinto dia de exposição, a fim de detectar diferenças na

metilação em um curto período de tempo. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram selecionados seis

genes supressores de tumor (APC, RASSF1A, CDKN2A, TP53, MGMT, MLH1) e duas sequências

repetitivas (ALU e LINE-1), que já foram demonstrados hipermetilados e hipometilados,

respectivamente, em diversos tipos de exposição. O DNA foi extraído a partir de leucócitos de 58

amostras de trabalhadores do setor da construção (caso) e 50 trabalhadores do setor

administrativo (controle). Além disso, foram extraídas 39 amostras dos trabalhadores do setor da

construção, no primeiro e quinto dia da semana de trabalho. Posteriormente, as amostras foram

submetidas a conversão de bissulfito de sódio e os níveis de metilação das amostras foram

avaliadas pela metodologia de pirosequenciamento. Foram utilizados modelos de regressão linear

múltipla para verificação da relação conjunta de alguns fatores de confusão como: fumante

passivo, ex-fumante, etilismo. Para as análises estatísticas foi considerado um nível de significância

de 5%, p valor <0,05. RESULTADOS: Verificamos nas análises de metilação, médias maiores para os

genes CDKN2A (p=0,05), MLH1 (p=0,007), APC (p<0,001) e média menor dos níveis de metilação

da sequência repetitiva LINE-1 (p=0,005), para o grupo caso em relação ao controle. Sugere-se que

tais diferenças nos níveis de metilação são decorrentes da exposição a concreto (p=0,03), pó de

madeira (p=0,02) e sílica (p=0,05). Fatores de confusão, tais como, hábito de bebida, exposição

passiva ao cigarro e o critério de ser ex-fumante não influenciaram nos níveis de metilação dos

genes. Nos trabalhadores da construção coletados no 1º e 5º dia da semana, observaram-se níveis

maiores de metilação para o gene CDNK2A (p=0,04) no 5º dia de exposição, sugerindo que um

curto tempo de exposição pode influenciar nos níveis de metilação desse gene. CONCLUSÃO:

Estes achados sugerem que o ambiente da construção civil pode influenciar no perfil de metilação

de genes envolvidos no processo de carcinogênese. Além disso, pode levar a alterações na

metilação global, proporcionando instabilidade genômica. Nossos resultados sugerem que a

hipometilação de LINE-1 e hipermetilação de APC, CDKN2A e MLH1 podem ser utilizados como

biomarcadores para exposição ambiental e ocupacional, porém, investigações adicionais são

necessárias a fim de confirmar nossos achados.

Palavras Chave: Metilação do DNA; Biomarcadores; Epigenética; Pirosequenciamento; Câncer;

Trabalhadores da Construção.

ABSTRACT

Rodrigues. IS. Evaluation of DNA methylation profile in tumor supressor genes and repetitive

sequences on construction workers exposed to environmental and occupational carcinogens.

Dissertation (Master’s degree). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2016.

BACKGROUND: The environmental exposure has been linked to an increased risk of cancer, where

the DNA methylation in promoter regions of tumor suppressor genes has emerged as promising

potential biomarker for cancer, including lung cancer. In the construction sector the exposure of

workers to materials containing asbestos, silica and metals, and exposure to solar radiation, are

factors that can affect the stability of the human genome, causing breaks in DNA and epigenetic

alterations. To date, no study has evaluated the DNA methylation levels in construction workers,

which may be associated to the risk of lung cancer development due to the work environment.

OBJECTIVE: This study aimed to evaluate possible epigenetic biomarkers for association of the

potential risk of developing cancer in construction workers exposed to environmental and

occupational carcinogens. Furthermore, it was also evaluated the DNA methylation profile in

workers in the first and fifth day of exposure in a working week in order to detect the methylation

differences within a short period of time. MATERIALS AND METHODS: We selected six tumor

suppressor genes (APC, RASSF1A, CDKN2A, TP53, MGMT, MLH1) and two repetitive sequences

(ALU and LINE-1), which have been demonstrated hypermethylated and hypomethylated,

respectively, in various types of exposition. DNA was extracted from white blood cells of 58

samples of construction sector workers (case) and 50 workers in the administrative sector

(control). In addition, samples were collected from 39 workers from the construction sector in the

first and fifth day of the working week. Subsequently, the samples were subjected to sodium

bisulfite conversion and sample methylation levels were assessed by pyrosequencing

methodology. Multiple linear regression models were used to check the joint relationship of some

confounding factors such as passive smoker, ex-smoker, alcohol consumption. For statistical

analysis it was considered a significance level of 5%, p value <0.05. RESULTS: We verified higher

methylation levels for CDKN2A (p = 0.05), MLH1 (p = 0.007), APC (p <0.001) and lower methylation

levels of LINE-1 repetitive sequence (p = 0.005) for the case group compared to control. It is

suggested that such differences in methylation levels are from exposure to concrete (p = 0.03),

wood powder (p = 0.02) and silica (p = 0.05). Confounding factors, such as alcohol consumption,

passive smoker and ex-smoker did not influence the methylation levels of genes. In the

construction workers collected on 1st and 5th day, there were higher levels of CDKN2A

methylation (p = 0.04) on the 5th day of exposure, suggesting that a short exposure time can

influence the methylation levels of this gene. CONCLUSION: These findings suggest that the

construction environment can influence the methylation profile of genes involved in

carcinogenesis. Moreover, it can lead to changes in global methylation, providing genomic

instability. Our results suggest that hypomethylation of LINE-1 and hypermethylation of APC,

MLH1 and CDKN2A can be used as biomarkers for environmental and occupational exposure,

however, further investigations are needed to confirm our findings.

Keyword: DNA methylation; Biomarkers; Epigenetics; Pyrosequencing; Cancer; Construction

workers.

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer Ocupacional

O câncer está entre as doenças que mais acometem a população mundial, sendo que no ano

de 2016/2017 as estimativas apontam para aproximadamente 600 mil novos casos, onde traquéia,

brônquios e pulmão em homens estima-se 17.330 novos casos e 10.890 em mulheres1.

Hoje no país, o câncer é um problema de saúde pública, sendo assim, controle e prevenção

deverão ser priorizados em todas as regiões, desde as mais desenvolvidas socioeconomicamente

até às mais desiguais2.

Podemos salientar que aproximadamente 80% dos casos de câncer estão relacionados a

fatores ambientais, em maior ou menor grau, evitáveis3. Esses fatores envolvem água, terra, ar,

ambiente de consumo (alimentos, medicamentos, fumo, álcool e produtos domésticos), ambiente

cultural (estilo, costumes e hábitos de vida) e ambiente ocupacional. Muitas substâncias ou a

mistura destas presentes no ambiente ocupacional e que levam ao aumento da incidência de

neoplasias ou uma redução no período de latência entre a exposição e o aparecimento da doença,

são consideradas substâncias com um potencial cancerígeno ocupacional4. Estima-se que

aproximadamente 10,8% dos casos de câncer (excluindo pele não melanoma) em homens e 2,2%

dos casos de câncer em mulheres são causados por exposição ocupacional5.

De acordo com a Occupational Safety and Health Administration (OSHA), é considerado um

potencial carcinógeno ocupacional qualquer substância, combinação ou mistura de substâncias

que causem aumento da incidência de neoplasias ou redução substancial no período de latência

entre a exposição e o aparecimento da doença em humanos ou mamíferos6.

No Brasil, estima-se que cerca de 23.040 dos casos de câncer para o ano de 2015 serão

desenvolvidos devido ao seu ambiente de trabalho1. A primeira observação entre a ocupação e

câncer foi descrita por Pott em 1775, que observou uma grande frequência de câncer da bolsa

escrotal em limpadores de chaminé em Londres, na Inglaterra, relacionando a incidência de câncer

nesta classe de trabalhadores decorrente a exposição a fuligem7. Atualmente, principalmente no

ambiente de trabalho industrial são introduzidas um número grande de substâncias e pouco se

sabe sobre a relação dos efeitos tóxicos ou não que essas substancias podem ocasionar9.

Entre os cânceres ocupacionais, pelo menos 19 tipos de tumores estão relacionados à

ocupação e ao ambiente de trabalho, entre eles os tipos, de pulmão, pele, fígado, laringe, bexiga e

2

leucemias3. Em relação ao câncer de pulmão, 90% dos casos em homens são atribuídos pelo

hábito de fumar8,9. Além disso, hoje é sabido que a influência ambiental e ocupacional são fatores

que contribuem como fator de risco para o câncer de pulmão. Entre os casos de câncer de pulmão

causadas decorrentes da exposição ocupacional podemos salientar que tem sido relatado em

cerca de 7,9% a 16,5% nos homens e 1,4% para 4,5% em mulheres10. Os principais fatores que

contribuem para esta porcentagem, são as exposições a amianto, as emissões dos motores diesel,

e outras misturas contendo hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, sílica cristalina, arsênico e

alguns metais pesados11,12.

A grande maioria das associações da incidência de câncer e causas ocupacionais tem sido

demonstrada por estudos epidemiológicos. Em 1965 a IARC (International Agency for Research on

Cancer) foi criada pela Organização Mundial da Saúde (OMS), assim, o objetivo da IARC é

promover a colaboração internacional na pesquisa do câncer, reunindo competências em

epidemiologia, ciências laboratoriais e bioestatística para identificar as causas do câncer de modo

que podem ser adoptadas medidas de prevenção. Dessa forma, a agência ficou a cargo de

reconhecer o potencial ou provável caráter cancerígeno das substâncias, agentes ou outras formas

de exposição. Em relação a exposição ocupacional a IARC tem o papel de reconhecer os ambientes

complexos e as múltiplas exposições que ocorrem no ambiente de trabalho e que permitem a

caracterização de agentes isolados6. A IARC reúne anualmente grupos de especialistas

internacionais para elaborar suas publicações de monografias temáticas, possibilitando a

elaboração de um consenso das pesquisas6. Os resultados servem de referência para

recomendação da OMS. Os agentes ou substâncias são classificados em quatro grupos: o Grupo 1

o agente (mistura) é cancerígeno para humanos (evidência epidemiológica suficiente para

carcinogenicidade em seres humanos). O Grupo 2A, o agente é provavelmente cancerígeno para

humanos (provavelmente cancerígeno em seres humanos, segundo evidências limitadas em seres

humanos e evidências suficientes em animais). O grupo 2B possivelmente cancerígeno em seres

humanos segundo evidência suficiente em animais, porém, evidências inadequadas em seres

humanos ou limitada nesses com evidência suficiente em animais. O grupo 3 o agente não é

classificado como cancerígeno para humanos. E o grupo 4 o agente ou mistura é provavelmente

não cancerígeno para humanos6.

A questão saúde-trabalho deixou de ser analisada apenas como um simples indicador. Hoje

as condições do ambiente e segurança do trabalho e suas influências na saúde do trabalhador

3

passam a ser compreendidas como garantias essenciais para a qualidade de vida e os direitos dos

trabalhadores13.

Ao longo das últimas décadas, ocorreu um declínio nos cânceres atribuíveis a exposição

ambiental e ocupacional a carcinógenos, tais como, amianto, arsênico e poluição do ar em países

desenvolvidos. Por outro lado, em países em desenvolvimento ou subdesenvolvidos, à medida

que industrialização se expande ocorrerá o aumento da exposição a substancias e agentes

carcinogênicos o que tornará as populações mais susceptíveis ao câncer14. Um estudo realizado

por Ziech et al.15 sugere que a exposição ambiental, a agentes químicos e biológicos

desempenham um importante papel na ocorrência de câncer, como os fatores de estilo e hábito

de vida contribuindo como uma parte do todo. Por outro lado, os agentes carcinogênicos

presentes no meio ambiente e na ocupação estejam envolvidos significativamente e contribuindo

para a carcinogênese humana, interpretações quanto à extensão de tal contribuição permanecem

em grande parte obscura.

1.2 Exposição ocupacional em trabalhadores da construção civil

Uma população que apresenta risco ao câncer ocupacional são os trabalhadores da

construção civil, devido à exposição diária e por longos períodos a diversos agentes reconhecidos

como nocivos à saúde. Esses trabalhadores utilizam materiais que são constituídos por diversas

substâncias classificadas pela IARC como carcinogênico ou potencialmente carcinogênico aos seres

humanos. Uma destas substâncias é a sílica cristalina na forma de pó de quartzo, no ambiente de

trabalho pode ocorrer à exposição através de diversas tarefas como a mistura de concreto, corte,

furação, jateamento, demolição e limpeza e quando inalada pode levar a silicose e potencialmente

aumentar o risco ao desenvolvimento de câncer de pulmão e de outras doenças autoimunes18.

A sílica é um mineral duro e dos mais abundantes na crosta terrestre, sendo encontrado em

rochas e areias, muito utilizado como produto final, subproduto ou matéria prima em vários

processos industriais, como na indústria do cimento (argila, areia, pedras e terra diatomácea), de

construção civil, fundição e indústria de mineral não metálico (cerâmicos vidros e fundições).

Segundo a OMS (Organização Mundial da Saúde) a sílica cristalina está classificada como Grupo I,

reconhecidamente cancerígena para seres humanos. A exposição ocupacional a esta substância

ocorre por meio de inalação de poeira, podendo ocasionar a silicose, que é uma fibrose pulmonar

difusa, nodular, intersticial, causada por uma reação dos tecidos à inalação do pó, aumentando o

risco ao desenvolvimento de câncer pulmonar e de outras doenças autoimunes. A sílica é capaz de

4

ativar processos inflamatórios que podem resultar em hiperplasia epitelial associada a

neoplasias19.

Sellappa et al.20 sugerem que trabalhadores expostos aos constituintes do cimento e

concreto podem ter um risco aumentado para o desenvolvimento de câncer de pulmão, tumores

gastrointestinais e dermatites, além de ocasionar alterações genéticas nas células somáticas e

germinativas.

Outro efeito nocivo à saúde dos trabalhadores da construção é o contato com a poeira

composta por metais, como o cobalto e tungstênio. Estes são responsáveis por doenças

pulmonares, com significativas taxas de morbidade e mortalidade. Os principais sintomas

relatados pelos trabalhadores com doença pulmonar por metais são inespecíficos: tosse seca,

dispneia progressiva aos esforços, cianose, dor no peito, fadiga e perda de peso21.

Outra substância presente no ambiente ocupacional destes trabalhadores e potencialmente

carcinogênica é o amianto, também chamado de asbesto, e está relacionado ao desenvolvimento

de câncer de pulmão e de pleura, além da asbestose, mesotelioma pleural e peritoneal, câncer de

laringe, ovário, colo retal, faringe, estômago e lesões pleurais benignas, além de câncer de

estômago, intestino, esôfago, pâncreas, rins e mesotelioma7-22,24,25,25-26.

A exposição ao amianto no ambiente da construção civil pode ocorrer através de tarefas

específicas como o isolamento, a demolição e renovação da construção, e ainda, está presente na

confecção de caixas d’água, telhas onduladas e planas, tubulações, divisórias, tintas e

revestimentos18,19. A Organização Mundial da Saúde (OMS) e IARC classificam este agente como

potencialmente carcinogênico para os humanos em qualquer estágio de produção, transformação

e utilização. Dentre os casos de câncer ocupacional, 70% representam o câncer de pulmão, onde

de 1% a 2% das mortes são atribuídas ao asbesto27,28. O Brasil é o quinto maior produtor de

asbesto, é autossuficiente e exporta 30% do excedente da produção. Estima-se que a população

brasileira exposta diretamente seja de 500 mil pessoas, sendo 20 mil ligadas à exposição

ocupacional em mineração e produção de cimento-amianto. Este produto já foi proibido em todos

os países membros da União Européia, desde 2005 e em alguns países da América latina, com

exceção do Brasil, que apenas instituiu normas regulamentadoras19.

O amianto se divide em dois grupos: as serpentinas e os anfibólios. As serpentinas se

apresentam em fibras curvas e maleáveis chamadas de crisotila ou “amianto branco”, os anfibólios

representam menos de 5% do amianto consumido no mundo, ambos são carcinogênicos para os

humanos29. A asbestose é uma doença causada pelas fibras de asbestos que se depositam nos

5

alvéolos pulmonares e provocam uma reação inflamatória e em seguida uma fibrose, acarretando

em uma rigidez e reduzindo a capacidade de se realizar trocas gasosas, ocorrendo a perda da

elasticidade pulmonar e respiratória. Menegozzo et al.25 realizaram um estudo a fim de se verificar

as causas de mortalidade entre os trabalhadores expostos ao asbesto. Foram analisados 1247

trabalhadores entre os anos de 1950 e 2005 e observaram que as principais causas de morte

foram: câncer do trato respiratório e peritoneal, pleural, de laringe e estômago, além das doenças

respiratórias, como pneumoconiose e asbestose. Foi observado um maior número de asbestose

entre os trabalhadores com até nove anos de exposição e a incidência de câncer de pulmão, maior

entre aqueles com 20 a 29 anos em contato com a substância. Barbieri et al.30 observaram que

pessoas nunca expostas ao amianto, porém que residem próximas a uma fábrica de cimento,

estavam desenvolvendo mesotelioma maligno. Além disso foi encontrado altos níveis da

substância nos pulmões destas pessoas. Consonni et al.201531 avaliaram o risco de

desenvolvimento de câncer de pulmão em pedreiros considerando os efeitos em conjunto dos

agentes cancerígenos ocupacionais, dentre eles sílica e amianto, e evidenciaram o aumento do

risco de câncer de pulmão em pedreiros, sendo a maior associação pela exposição a sílica cristalina

e em menor grau para o amianto.

Além disso, análises moleculares em trabalhadores expostos ao asbesto revelaram que, os

polimorfismos de deleção no gene GSTT1 e GSTM1 estão relacionados com alterações fibróticas e

maior espessura das placas pleurais respectivamente32. Já os polimorfismos nos genes XRCC1,

XRCC3, XPD e OGG1 estão relacionados com a incidência de mesotelioma maligno em sujeitos

expostos ao asbesto33.

Outro fator de exposição que atinge esses trabalhadores é a exposição à luz solar diária, que

quando tomada as devidas precauções é extremamente útil ao nosso organismo, pois estimula a

produção de vitamina D34,35-36. Além disso, ajuda a prevenir doenças autoimunes, infecções,

doenças cardiovasculares, câncer de mama, próstata e cólon36,37-38. No entanto, quando a

exposição solar ocorre frequentemente e em excesso, acarreta graves danos à saúde, como o

câncer, cujos tipos mais frequentes são os de pele e de lábio37. Outra consequência da exposição

solar são os danos aos olhos, como cataratas, neoplasias da conjuntiva e melanoma ocular35,36-38.

Além disso, em relação ao carcinoma basocelular também é uma consequência causada pela

exposição a luz solar, e representa 75% dos tumores de pele não melanoma. Mais de 80% dos

casos de carcinoma de células basais são localizadas em áreas expostas ao sol, tais como a cabeça

6

e pescoço. Este tipo de câncer é raro em áreas sem exposição aos raios ultravioleta, especialmente

nas regiões genitais e perianais40.

Outro agente nocivo a saúde dos trabalhadores da construção civil é o comprometimento da

qualidade do ar, causado pela emissão de contaminantes ou poluentes atmosféricos, também

pode ser um fator para o desenvolvimento de diversas doenças, entre elas o câncer de pulmão.

Segundo Lim et al.41 em 2010 foram registrados mais de 3 milhões de mortes em consequência

dessa exposição. Os poluentes atmosféricos podem ser categorizados em gases, poluentes

orgânicos resistentes, metais pesados e material particulado (MP)42. Nos Estados Unidos, a

Environmental Protection Agency (EPA) realizou uma caracterização genérica das fontes de

emissão do MP e concluíram que o setor da construção civil representou 13% da origem deste

poluente. Neste setor o MP pode ser constituído por pó de cimento, gesso, cal, argamassa

industrializada, poeira devido às escavações ou circulação de veículos ou vento, amianto e outras

fontes43.

Em um estudo realizado por Cardoso & Araújo44, foram relacionados os principais aspectos

ambientais do canteiro de obras de edificações aos incômodos e poluição gerados em diferentes

fases e atividades da obra, a emissão de MP foi relevante nas fases de serviços preliminares,

infraestrutura, estrutura, revestimentos verticais, pinturas, assentamento de pisos e

pavimentação. Também são fontes de MP os setores de produções dos materiais utilizados no

ramo da construção civil, tais como na extração de agregados ou na moagem de matérias primas e

na produção de cal e cimento.

O material particulado (MP) é uma mistura complexa de componentes como ácidos,

produtos químicos orgânicos, metais e poeiras do solo, que podem ser partículas sólidas e

líquidas, em suspensão na atmosfera45. Suas composições químicas e físicas variam de acordo com

origem, localização, clima e época do ano46,47-48. O MP pode ser emitido tanto de fonte

antropogênica ou biogênica, resultando em uma mistura complexa de partículas extremamente

pequenas e de gotículas líquidas. Quando emitidas diretamente na atmosfera são denominadas de

partículas primárias e quando formadas a partir de reações químicas entre componentes

preexistentes são chamadas de secundárias. As emissões atmosféricas destes compostos têm sido

associadas a efeitos adversos agudos e crônicos na saúde humana49,50.

Uma das categorias do MP são as partículas inaláveis, apresentando diâmetro aerodinâmico

menor ou igual a 10µm e são classificadas em partículas grossas (10-2.5 µm), finas (≤ 2.5µm) e

ultrafinas (≤ 0.1µm). O tamanho é um fator importante, o qual influência a forma como as

7

partículas vão se depositar no trato respiratório: MP10 depositam-se principalmente no trato

respiratório superior, enquanto partículas finas e ultrafinas são capazes de atingir os alvéolos

pulmonares. Estudos epidemiológicos demonstram forte associação entre exposição ao MP fino e

ultrafino com a morbidade e mortalidade de doenças cardiorrespiratórias50,51.

Recentemente, a IARC classificou o MP presente na poluição do ar como carcinogênico para

humanos (Grupo 1). Esta determinação foi baseada em evidências sobre a relação do MP2.5 e MP10

ao risco de câncer de pulmão52.

Diversos mecanismos são propostos para explicar a ligação entre MP e o risco de câncer de

pulmão, incluindo a alteração na expressão de genes, respostas inflamatórias e o estresse

oxidativo, no entanto esta relação permanece mal compreendida44-53,54,51,55-56. O MP pode levar a

inflamação e induzir a liberação de espécies reativas de oxigênio, tanto local como

sistemicamente, o que por sua vez, pode contribuir para alterações epigenéticas e instabilidade

genômica51-52,53,57,58-59.

1.3 Epigenética

O genoma humano possui cerca de 25.000 genes e a expressão de cada gene é fortemente

regulada para controlar a função de cada célula. No núcleo, o modelo para informação genética é

codificado em segmentos de DNA, os quais são transcritos em moléculas de RNA. Estas moléculas

são transportadas a partir do núcleo para o citoplasma, onde eles são traduzidos em proteínas. A

atividade dos genes é controlada ao nível do DNA, RNA, e proteína. No nível do DNA, a atividade

do gene pode ser estruturalmente regulada, com histonas para controlar tanto a acessibilidade

física dos fatores de transcrição a um segmento de DNA, quanto para a disponibilidade de fatores

de transcrição. (ARTIGO SYLVIA K. SHENOUDA & SURESH K. ALAHARI)

Aparentemente, há muitas maneiras pelas quais a função do gene pode ser alterada, o que

reflete a relativa facilidade com que a função do gene pode ser perdida. Em contraste, a ativação

de um proto-oncogene pode exigir alterações mais específicas que conferem novas propriedades

ao produto do gene. Além disso, a conversão de 5-metilcitosina à timina em sequências CpG,

podem ser utilizado para estimar a taxa espontânea de alterações de bases induzidas. A metilação

de resíduos citosina em regiões CpG, é um processo endógeno, uma vez que nenhum fator

exógeno foi encontrado ainda que altere a frequência de desaminação de citosinas metiladas em

CpG ou a eficácia de reparação de mutações. Assim, é razoável supor que uma diminuição da

8

proporção de CpG seria indicativo de um efeito direto sobre o DNA exercido por um agente

químico ou físico.

A epigenética refere-se ao estudo de mecanismos que alteram a expressão dos genes, sem

qualquer alteração na sequência primária do DNA60, esses mecanismos epigenéticos são herdáveis

e reversíveis.

Os mecanismos epigenéticos são essenciais para o desenvolvimento normal e manutenção

dos padrões de expressão gênica específicos para os tecidos em mamíferos. A alteração de

processos epigenéticos podem desencadear a função alterada dos genes levando a transformação

celular. As mudanças globais no panorama epigenético são uma marca registrada do câncer,

envolvidas na iniciação e progressão da doença, tradicionalmente, visto como uma doença

genética, tornou-se uma realidade o envolvimento de anormalidades epigenéticas juntamente

com alterações genéticas61. Os principais fenômenos classificados como alterações epigenéticas

são: a metilação do DNA (metilação sobre as bases de citosina do DNA, em dinucleotídeos CG,

comumente referido como CpG), modificações de histonas (modificações pós-traducionais que

alteram a sua interação com proteínas nucleares, tais como acetilação e metilação), RNA não-

codificadores e (miRNA, siRNA)60(Figura1).

Figura 1 - Esquerda: Representação esquemática de modificações epigenéticas. no DNA e nas histonas. Direita: Esquema representando os microRNAs, que são pequenos RNAs não-codificantes, que reconhece um RNAm alvo por homologia de sequência, levando a clivagem e o bloqueio da tradução. (Adaptado de Mansuy et al., 2011

62).

9

As modificações das histonas é uma alteração epigenética frequentemente encontrados nas

células tumorais. As histonas são proteínas conservadas evolutivamente que têm domínios

globulares carboxi-terminal cruciais para a formação do nucleossomo, e as caudas amino-

terminais flexíveis que se projetam a partir da parte central do nucleossomo e conectando os

nucleossomos adjacentes para formarem e ordenarem as estruturas da cromatina63. Cerca de oito

modificações pós-traducionais ocorrem nas histonas incluindo a metilação, acetilação,

fosforilação, ubiquitinação, sumoilação, biotinilação, e ribosilação de ADP, e foram identificados

no núcleo das histonas H2A, H2B, H3, H4, e na família das histonas ligantes H164,65. Estas marcas

nas histonas são essenciais para a organização da cromatina, manutenção da estabilidade do

genoma, silenciamento de sequencias repetitivas do DNA, que regulam a progressão do ciclo

celular, o reconhecimento de sítios de danos e reparação do DNA e manutenção de expressão

adequada de informação genética63.

Outra classe de moléculas que participam dos eventos epigenéticos são os microRNAs. De

acordo com os estudos da última década, os microRNAs emergiram como moléculas-chave na

regulação das funções celulares em mamíferos. Os microRNAs são reguladores fundamentais

relacionados a várias doenças, estas moléculas são sequencias curtas de DNA (aproximadamente

22 nucleotídeos) que regulam a transcrição de genes no nível pós-transcricional66. Desde a

primeira descoberta dos microRNAs em Caenorhabditis elegans Lee et al.38, centenas de

microRNAs foram identificados em eucariotos por influenciarem processos fisiológicos, tais como,

o desenvolvimento, crescimento, diferenciação, reações imunológicas, e a adaptação ao

stress39,66.

Os estudos demonstram que a expressão alterada dos microRNAs pode promover condições

patológicas. O papel dos microRNAs na biologia do câncer tem sido verificada nos últimos anos e

os estudos demonstram sua importância no controle da expressão de RNAm alvo que promovem

ou facilitam o crescimento do tumor, invasão, angiogênese67. Além disso, o perfil de expressão dos

microRNAs nos tumores tem sido relacionados por definirem subtipos, sobrevivência do paciente,

metástases e resposta ao tratamento67,68. Por outro lado, sabe-se que a exposição ambiental,

química, biológica ou agentes físicos podem ser responsáveis por doenças humanas, incluindo o

câncer, o descobrimento das relações entre a exposição aos carcinógenos ambientais e a

expressão de microRNAs pode contribuir para melhor elucidar os mecanismos iniciais da doença e

pode potencialmente conduzir ao desenvolvimento de indicadores úteis de exposição a

substâncias tóxicas ou novos biomarcadores para testes de carcinogenicidade69,70.

10

1.3.1 Metilação do DNA

A metilação do DNA é o mecanismo de regulação epigenética mais estudado e é crucial para

o desenvolvimento normal e manutenção da homeostase celular71,72. Além disso, desempenha um

importante papel em vários processos biológicos, que incluem a inativação do cromossomo X,

regulação da expressão gênica, imprinting e manutenção da estabilidade cromossômica.

Biologicamente consiste na ligação covalente de um radical metil (CH3) em resíduos de citosina

em dinucleotídeos CpG60 (Figura 2).

Figura 2 – Representação da ligação do grupo CH3 no carbono 5 da citosina (C) gerando a 5-metilcitosina, sendo este processo mediado pelas enzimas DNA metiltransferases (DNMT’s). (Retirado e modificado de Lorincz

73).

Os dinucleotídeos CpG não estão uniformemente distribuídas em todo o genoma humano,

mas estão concentradas em trechos curtos do DNA ricos em CpG chamados de ilhas CpG e nas

regiões de sequencias repetitivas, como por exemplo, repetições centroméricas e elementos

retronsposons61. Existem cerca de 28 milhões de sítios CpG no genoma e a maioria dos

dinucleotídeos CpG (70 a 80%) são metilados nas células normais74,75-76. As ilhas CpG são grupos de

sítios CpG que variam entre 200 a 3000 pb e que apresentam uma porcentagem maior que 50 %

de CG61,67. Além disso as ilhas de CpG estão preferencialmente localizadas na região 5’ dos genes

ocupando as regiões regulatórias ou promotoras, cerca de 60% das regiões promotoras dos genes

humanos contem em sua estrutura ilhas CpG55,68. Usualmente nas células normais, as ilhas CpG

não metiladas na região promotora está associada com a expressão dos genes durante a

diferenciação. Por outro lado, ilhas CpG metiladas nas regiões promotoras estão diretamente

ligadas a repressão da expressão dos genes61,77. Além disso, no genoma margeando as ilhas CpG

existem as shores, regiões de baixa densidade em CpG que estão localizadas aproximadamente a 2

Kb das ilhas CpG78. Ainda podemos salientar que além das shores e ilhas CpG são encontradas as

shelves, regiões de 2 Kb que flanqueiam as shores. Perfis de metilação diferencial encontrados nas

shores em vários tipos de câncer tem sido associado com alterações na expressão gênica76,79.

11

As DNA metiltransferases têm um motivo catalítico altamente conservado que estabelece as

padrões de metilação do DNA em sequências alvo do genoma. A distribuição de dos grupamentos

metil demarca regiões de silenciamento da transcrição genica ou de potencial transcrição, criando

uma assinatura epigenética estável76. Alterações nos padrões de metilação do DNA são bem

estudadas em câncer e uma redução global de metilação e hipermetilação em genes específicos,

tais como, em genes supressores tumorais, tem sido descrito como uma característica marcante

de neoplasia80. Sabe-se que o mecanismo de metilação do DNA também pode alterar padrões de

expressão gênica81,82. A metilação do DNA é mitóticamente estável e pode ser propagada pela

divisão celular. Entretanto, estudos têm demonstrado que a metilação do DNA pode alterar

rapidamente em resposta a fatores ambientais. A hipermetilação em genes supressores tumorais

é amplamente caracterizada por representar um dos primeiros passos envolvidos na

carcinogênese humana83. Cada alteração transitória na metilação do DNA pode refletir em uma

condição de estresse na célula, associado com alterações no processo de apoptose, no controle do

ciclo e na proliferação celular. Isto pode levar ao acúmulo de danos genéticos e epigenéticos

persistentes, depois de repetidas exposições a possíveis agentes carcinogênicos82.

Além da análise de genes pontuais, a avaliação dos padrões de metilação do genoma como

um todo, são realizadas em sequências repetitivas de DNA, como os elementos retrotransposons

Alu repeats e LINE-1 (Long Interspersed Nuclear Element-1), são de grande interesse82,84.

Anteriormente, considerado como sequencias sem função no genoma, elementos repetitivos têm

se tornado cada vez mais reconhecido como uma importante classe de reguladores da expressão

gênica72,85-86. Além disso, a hipometilação global em elementos repetitivos pode levar a rearranjos

cromossômicos e ativação de oncogênese87,76. Por serem abundantes no genoma humano, em

torno de 55% consiste destes elementos, o padrão de metilação nestas sequências é considerado

um possível preditor da metilação global84,88. Adicionalmente, sabe-se que a hipometilação destes

elementos aumenta sua atividade retrotranspositiva, o que pode acarretar alterações genômicas,

tais como, mutagênese insercional, interferência na transcrição, e a instabilidade genômica com

consequente variação da regulação transcricional72-75,90,78,84-80. Além disso, a ativação de

sequencias repetitivas de DNA por meio da hipometilação também pode contribuir para

translocações destas sequencias hipometiladas, levando afrouxamento da cromatina91. Elementos

repetitivos compreendem quase a metade de todo o genoma e são um dos principais

contribuintes na hipometilação relacionada ao câncer. A associação entre a hipometilação de

12

elementos repetitivos e exposição à vários fatores ambientais tem sido claramente demonstrada

tanto na população geral quanto em indivíduos expostos ocupacionalmente51,92-93.

1.4 Metilação do DNA para determinação dos sujeitos com alto risco ao desenvolvimento de

câncer

A exposição de trabalhadores a determinados ambientes ocupacionais pode estar associado

ao aparecimento de vários tipos de doenças, como o câncer. Alguns agentes presentes nos

ambientes ocupacionais são classificados como carcinogênicos com potencial bem reconhecido,

no entanto, os mecanismos moleculares subjacentes às suas associações com os riscos de câncer

permanecem pouco compreendidos. Dessa forma a utilização de biomarcadores genéticos e

epigenéticos podem elucidar mecanismos envolvidos com a iniciação da carcinogênese, em

populações expostas.

Um estudo realizado em trabalhadores com elevada exposição aos hidrocarbonetos

policiclicos aromáticos (HPAs), revelou uma hipometilação na região promotora do gene p53, que

pode estar envolvido com mecanismos adicionais associados a instabilidade genética induzidos

por HPAs, e pode mediar o risco de câncer de pulmão93. Em trabalhadores de fundição, com alta

exposição ao material particulado (MP), foram comparados os padrões de metilação nos

leucócitos do sangue dos genes supressores tumorais APC, p16, p53 e RASSF1A, no primeiro dia e

no último dia da semana de trabalho, período de curta exposição ao MP e foi observado

hipermetilação dos genes p16 e APC e hipometilação de RASSF1A e p5382. O padrão alterado de

metilação do DNA em genes supressores tumorais, como o APC, p16, p53 e RASSF1A é geralmente

observada em DNA de leucócitos do sangue de pacientes com câncer de pulmão73-94,95-96.

Umemura et al.97 demonstraram hipermetilação em genes supressores de tumor no DNA do soro

de pacientes com silicose e câncer de pulmão. Este estudo sugere que a aberrante metilação em

genes supressores de tumor pode facilitar a detecção precoce do câncer de pulmão em pacientes

com silicose. O p16 foi o primeiro gene identificado como hipermetilado, nos cânceres de

pulmão96. Estudos tem demonstrado que a expressão de p16 é inativado pela metilação em uma

prevalência de 60% a 70% em câncer de pulmão primário e com baixa frequência de mutações28,98.

Estudos em animais demonstraram a hipermetilação global do DNA em esperma de camundongos

após a exposição à poluição do ar, bem como a hipermetilação no p16 em pulmões de ratos, após

a exposição ambiental ao MP2.5 concentrado56,99.

13

Um estudo de meta-análise avaliou o papel da metilação dos genes em pacientes com

câncer de pulmão de não pequenas células e a relação com o hábito de fumar. Foi verificada uma

associação significativa no perfil de metilação entre os genes CDKN2A, RASSF1, MGMT, RARB,

DAPK, WIF1 e FHIT e o tabagismo em pacientes com câncer de pulmão. A hipermetilação de p16

foi um fator de risco comum ao tabagismo nos pacientes100. Vários investigadores têm

demonstrado que ilhas CpG nas regiões promotoras dos genes MGMT e MLH1 são hipermetiladas

em vários tipos de câncer e a aberrante hipermetilação reprime a expressão de ambos os

genes101,102-103. O gene MLH1 é um dos participantes da via de reparo MMR, essa via é um sistema

essencial pelo qual as células corrigem erros na replicação do DNA para manutenção da fidelidade

do genoma104,105. O MGMT codifica a O6-metilguanina-DNA-metiltransferase enzima de reparo

que desempenha um importante papel na defesa do DNA celular contra efeitos citotóxicos e

carcinogênicos de agentes alquilantes103. Em um estudo realizado na China em trabalhadores da

indústria do plástico, ambiente rico em cloreto de vinila, reconhecido como agente carcinogênico

para humanos, foi detectada a hipermetilação de MGMT em grupo destes trabalhadores que

obtiveram uma aumentada instabilidade cromossômica avaliada por MNs103. Por outro lado Duan

et al.106 verificaram a hipometilação do gene MGMT em um grupo de trabalhadores expostos ao

MP associado a HPAs comparados aos indivíduos não expostos. Outro estudo realizado em uma

população com prolongada exposição ao arsênio foi verificado o aumento da metilação do DNA

em genes supressores tumorais, como, p16 e no gene de reparo MLH1107.

A avaliação dos padrões de metilação entre as sequências repetitivas de DNA, como os

elementos Alu e LINE-1, são utilizadas como biomarcadores epigenéticos73,75. Estudos in vitro e in

vivo tem demonstrado uma hipometilação nestes elementos em resposta à exposição a partículas

de poluição ambiental, sendo a variação na metilação um evento sistêmico consequente da

cascata de reações inflamatórias desencadeada pela inalação de partículas poluentes, esses

resultados demonstram a possibilidade de que essas mudanças sejam responsáveis por respostas

adaptativas e determinem efeitos ambientais na saúde humana92. No trabalho de Duan et al.106 foi

determinado em trabalhadores com alta exposição a hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

(HPAs), a hipometilação da sequência repetitiva LINE-1, sendo assim os autores sugeriram a

utilização deste marcador para avaliação da exposição aos HPAs. Demetriou & Vineis91

evidenciaram que a poluição do ar influência nos níveis de metilação globais, e essas mudanças

epigenéticas podem contribuir para a carcinogênese tanto quanto as alterações genéticas.

14

A grande maioria dos estudos envolvendo marcadores de metilação do DNA em populações

expostas ocupacionalmente são realizados em leucócitos do sangue periférico, devido a estas

células serem as primeiros a responderem aos mediadores inflamatórios liberados nos pulmões

após a exposição ambiental108. A metilação do DNA regula as funções dos leucócitos em nível

transcricional e, portanto, afeta a migração e o recrutamento dos leucócitos da corrente

sanguínea para o pulmão109. A metilação do DNA no sangue periférico tem sido apontada como

um marcador sensível para mudanças agudas e de curto prazo no epigenoma108.

Sendo assim, a utilização da análise de metilação do DNA como um possível biomarcador,

com intuito de predizer a incidência de risco de câncer em populações expostas como os

trabalhadores da construção civil, pode melhorar a avaliação da exposição mas também aumentar

a compreensão dos mecanismos subjacentes a esta tipo de exposição que esta classe de

trabalhadores estão submetidos, podendo elucidar o risco de câncer.

15

2 JUSTIFICATIVA

O universo de empresas na indústria da construção civil, abrange em torno de 11,9 mil

empresas ativas que empregaram cerca de 3 milhões de pessoas. Somente na região Sudeste o

número total de empresas da construção civil é de 50.008, com 1.611.861 pessoas trabalhando no

setor 110.

Diante da representatividade do setor da construção civil no cenário da economia brasileira,

responsável por considerável parte no PIB em nosso país e sua relação social, tendo em vista o

grande número de empregos gerados, é essencial pensar na qualidade de vida e no impacto a

saúde dos trabalhadores deste setor. Haja vista, que milhões de trabalhadores estão expostos

ocupacionalmente a diversos fatores e agentes nocivos à saúde. A busca de possíveis

biomarcadores para avaliação de danos citotóxicos é uma importante ferramenta para a

determinação de populações de risco para o possível desenvolvimento de câncer. Além disso, o

aparecimento do câncer é provocado por mutações no DNA e também por mudanças

epigenéticas. Sendo assim, os estudos de metilação do DNA em regiões promotoras de genes

alvos podem contribuir na elucidação dos mecanismos moleculares importantes para o processo

de carcinogênese e apontar potenciais biomarcadores.

16

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliação de possíveis biomarcadores epigenéticos para associação do potencial risco de

desenvolvimento de câncer em trabalhadores da construção civil expostos a agentes

carcinogênicos ambientais e ocupacionais.

3.2 Objetivos específicos

Avaliar o perfil de metilação do DNA nos leucócitos do sangue dos trabalhadores da

construção civil em comparação ao grupo controle (não expostos), nas regiões

promotoras dos genes APC, RASSF1A, p16, p53, MGMT, MLH1 e das sequencias

repetitivas ALU e LINE-1, utilizando a metodologia de pirosequenciamento.

Comparar o perfil de metilação do DNA dos genes alvos escolhidos nos leucócitos do

sangue no grupo de trabalhadores da construção civil no primeiro dia de trabalho da

semana e no quinto dia de exposição.

Correlacionar os dados do questionário ocupacional, com os níveis de metilação dos

genes supressores tumorais analisados e das sequências repetitivas ALU e LINE-1.

17

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local de estudo

O estudo foi realizado no Hospital de Câncer de Barretos, localizado na cidade de Barretos,

estado de São Paulo.

4.2 Desenho do estudo

O estudo é observacional prospectivo.

O estudo foi dividido em dois grupos, sendo o primeiro grupo de 58 trabalhadores da

construção civil (caso) e 50 trabalhadores do setor administrativo (controle), sendo a primeira

etapa do estudo uma comparação caso x controle.

No segundo grupo foram analisados 39 trabalhadores da construção civil, que foram

coletados em dois dias diferentes da semana, a coleta foi realizada do mesmo indivíduo sendo a

primeira no 1° dia de trabalho da semana (segunda-feira) e a segunda coleta no 5° dia de trabalho

(sexta-feira), a fim de detectar as potenciais diferenças no nível de metilação do DNA dos genes

propostos em curto período de tempo de exposição ocupacional no ambiente de trabalho da

construção civil. Além disso, as análises com este grupo proporcionam a verificação do nível de

metilação do DNA dos indivíduos trabalhando no mesmo local de trabalho sem interferentes de

outros participantes que não tem a exposição e com características socioeconômicas diferentes.

4.3 Sujeitos da pesquisa

Os sujeitos da pesquisa foram os trabalhadores da construção civil do Hospital de Câncer de

Barretos (grupo estudo) e trabalhadores do setor administrativo desta mesma instituição (grupo

controle) pareados por idade. O tamanho amostral foi calculado para homens não fumantes com

nível de 5% de significância e 10% de precisão. O número do cálculo amostral foi calculado pelo

NAP (Núcleo de apoio à pesquisa do Hospital de Câncer de Barretos), considerando os critérios de

inclusão e exclusão descritos abaixo.

4.4 Critérios de inclusão

Foram incluídas no estudo homens com mais de 18 anos, trabalhadores da construção civil

do Hospital de Câncer de Barretos e ex-fumantes com pelo menos um ano de término do hábito.

18

4.5 Critérios de exclusão

Foram excluídos todos os indivíduos fumantes, usuários de drogas, trabalhadores com

doenças infecciosas ou doenças crônicas (como as doenças autoimunes), expostos a outros

agentes, como raios X e xilol. E para análise do segundo grupo, também, foram excluídos do

estudo os trabalhadores que faltaram no trabalho durante os cinco dias de exposição.

4.6 Coleta de dados

Para este estudo cada participante respondeu um questionário que continha questões

referentes às características sócio-demográfico, rotina ocupacional e a saúde geral e bucal, o

questionário pode ser visualizado no anexo (A). No preenchimento do questionário foi

apresentado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para assinatura, e tanto os

trabalhadores da construção civil quanto os trabalhadores do administrativo foram informados

dos potenciais fatores de risco. O questionário utilizado foi adaptado a partir de Boffeta et al. 1999

e Sartor, 2003.

4.7 Coleta de sangue

Foram coletados 2 tubos de 5mL de amostras biológicas (sangue) para cada indivíduo, em

tubos Vacutainer contendo EDTA, que posteriormente foram submetidos a extração do DNA

genômico.

4.8 Determinação da metilação do DNA na região promotora de genes

4.8.1 Extração de DNA de sangue periférico

A partir da amostra coletada, o tubo Vacutainer foi centrifugado a 3500 rpm por 10 minutos

à 4°C. O sobrenadante contendo o anel de leucócitos, com aproximadamente 500uL, foi retirado e

transferido para um tubo falcon de 15 ml. Foi adicionado 12 ml de solução de lise composta por

bicarbonato de amônio (1X) e cloreto de amônio (10X) que posteriormente foram imersos em gelo

por 20 minutos. Após esse período, os tubos foram homogeneizados e centrifugados por 10

minutos a 3500 rpm a 4°C e o pellet obtido foi ressuspendido em 20uL de PBS 1X e transferido

para tubos de 1,5 mL. Os próximos passos foram seguidos de acordo com o DNeasy Blood&Tissue

Kit (Qiagen), conforme instruções do fabricante e a amostra final foi eluída em 60uL em água

19

estéril deionizada (milliQ). O DNA extraído foi quantificado por espectrofotometria em NanoDrop

2000C (ND-1000 Spectrophotometer v.3.0.1, Termo Scientific). Este aparelho quantifica ácidos

nucleicos e proteína através da leitura do comprimento de onda absorvido. A absorbância de

260nm indica o pico de absorbância de UV do DNA, a absorbância de 280nm o pico de absorção de

UV de proteínas e 230nm o pico de absorção de UV para contaminantes orgânicos.

Posteriormente, calculando as razões 260/280 e 260/230 é possível obter a pureza do DNA a ser

analisado. As amostras foram quantificadas utilizando 1uL de DNA e estavam dentro dos valores

de razões aceitáveis para trabalhar com o DNA, entre 1,6 e 2,3. Os DNA’s foram estocados em

freezer (-80°C).

4.8.2 Conversão de Bissulfito

O DNA genômico foi submetido ao tratamento de conversão por bissulfito de sódio de

acordo como descrito no kit Epitech Bisulfite kit (Qiagen) conforme instruções do fabricante. O

tratamento consiste em converter as citosinas não metiladas em uracilas através da perda do

grupo amina na base citosina. Enquanto que as citosinas metiladas permanecem protegidas e

inalteradas.

O método é composto pelas seguintes etapas: desnaturação, sulfonação, deaminação,

purificação, dessulfonação e eluição das amostras. Foram utilizados 1ug de DNA, obtendo um

volume final de 20 uL, estes foram colocados em microtubos de 0,2uL, em seguida adicionado

85uL de bissulfito mix e 35uL de “DNA Protect” Epitech Bisulfite kit (Qiagen) formulado para evitar

a fragmentação do DNA geralmente associada ao tratamento com bissulfito a altas temperaturas e

de baixo valores de pH. Ele também fornece a desnaturação efetiva de DNA, resultando na cadeia

simples do mesmo, necessário para a conversão completa de citosinas. Além disso, o DNA Protect

Buffer contém um corante indicador de pH, tal como uma mistura de controle para permitir

confirmação do pH correto para conversão de citosinas. Após a adição do bissulfito mix e DNA

Protect, as amostras foram homogeneizadas e incubadas em termociclador. O programa de ciclo

térmico fornece uma série de passos de incubação necessários, otimizados para a desnaturação

térmica do DNA e subsequente dessulfonação e desaminação de citosinas, permitindo maiores

taxas de conversão das mesmas. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas e transferidas

para tubos limpos de 1,5mL e adicionado buffer BL que promove a ligação do DNA convertido na

membrana da coluna de spin-MinElute DNA de cadeia simples. Subsequente a este passo, o DNA é

ligado à membrana que é lavada utilizando o buffer BW que remove eficientemente o bissulfito de

20

sódio residual. Logo após, a dessulfonação ocorre usando Buffer BD, a membrana é novamente

lavada utilizando tampão BW antes da eluição a partir da membrana da coluna utilizando tampão

EB (Figura 3).

Figura 3 – Representação esquemética do protocolo de conversão por bissulfito de sódio. Adaptado de Epitech Bisulfite kit (Qiagen)

111.

4.8.3 PCR e eletroforese em gel de agarose

Após extração de DNA e tratamento com bissulfito de sódio, cada amostra foi submetida à

amplificação pela metodologia de PCR com um dos primers marcados com biotina. As reações de

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foram realizadas em um volume de 50 uL contendo: 2 uL

do DNA convertido, 25uL de HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 1uL de cada primer na concentração

de 10 uM (foward e reverse). As condições de ciclagem foram estabelecidas para cada conjunto de

Reação Bissulfito

DNA com DNA Protect

Ciclo término (5h)

Transferir DNA para o microtubo de 1,5mL

com tampão BL.

Adicionar etanol

Transferir para coluna do Kit

Adicionar Buffer BW

Vincular

Lavagem

Dessulfonação Adicionar Buffer BW

Lavagem (2X) Adicionar Buffer BW

Adicionar etanol

Adicionar Buffer EB

Eluição

21

primers (Anexo B). Cinco uL do produto de PCR foram submetidos a análise por eletroforese

utilizando-se gel de agarose 2%. O marcador molecular de 1Kb (Invitrogen) foi utilizado para

verificação do tamanho do amplicon e a imagem foi visualizada no Imagem Quant LAS 4000 Mini.

Foram utilizados os desenhos dos primers dos genes APC, RASSF1A e TP53 conforme descrito

por Baccarelli et al.112. Para os conjuntos de primers do gene MGMT foram desenhados utilizando-

se o Software PyroMark Assay Design (Qiagen) seguindo os parâmetros recomendados: tamanho

dos primers entre 18 e 21 pares de bases, com mais de 50% de G+C, temperatura de anelamento

55 a 62°C, evitando a formação de harpain e loop. Os genes MLH1, CDKN2A e as sequências

repetitivas ALU e LINE-1 foram utilizados os primers conforme gentilmente cedidos os desenhos

pelo Prof. Dr. Zdenko Herceg do IARC (Anexo C e D).

4.8.4 Pirosequenciamento

Para a preparação das amostras para o pirosequenciamento, os 45uL de produto da PCR

foram transferidos para uma placa de 96 poços e agitados em um mix contendo beads de sefarose

(Strepatavidin Sepharose GE Healthcare) e tampão de ligação (binding buffer – Qiagen) de acordo

com a quantidade de amostra. A seguir a placa foi submetida a agitação por 10 minutos a 1.400

rpm. Logo após, a placa contendo o produto de PCR foi submetida a bomba vácuo (PrepStation).

Na ferramenta PrepStation o produto de PCR é ligado nas beads, ficando preso a mesma.

Assim, foi iniciado as etapas de lavagem, primeiro em 100mL de solução etanol 70%, segundo em

100mL de solução denaturante de NaOH 0,2M (Qiagen) e em seguida lavado com tampão de

lavagem Wash buffer (Qiagen). Após as lavagens, os produtos são transferidos para placa de

pirosequenciamento (PSQ 96 low plate) (Qiagen) contendo primer de sequenciamento na

concentração de 0,4uM diluídos em tampão de anelamento (anneling buffer – Qiagen).

Após a transferência, a placa é colocada em um termo bloco à 80ºC por 5 minutos a fim de

proporcionar o anelamento dos primers. Em seguida, a placa é colocada em temperatura

ambiente por 10 minutos. Por fim, a placa contendo os produtos ligados aos primers de

sequenciamento foram transferidos para o equipamento pirosequenciador PyroMark Q96 ID

System (Qiagen) acompanhado do cartucho contendo as enzimas (ATP sulfurilase, luciferase e

apirase), substratos (adenosina 5fosfosulfato (APS) e luciferina) e dNTPs.

O primeiro dos quatro dessoxinucleotide (dNTPs) é adicionado a reação. A DNA polimerase

catalisa a incorporação da dNTP à fita de DNA. Cada evento de incorporação é acompanhada da

liberação do pirofosfato (PPi) em uma quantidade equimolar à quantidade de nucleotídeos

22

incorporados. A enzima ATP sulfurilase converte o PPi em ATP na presença de APS. Este ATP dirige

a conversão mediada pela luciferase da luciferina em oxiluciferina que gera uma luz visível numa

quantidade proporcional à quantidade de ATP. A luz produzida é detectada por uma câmera CCD

(charge coupled device) que é vista como um pico no pirograma. A Apirase, uma enzima que

degrada nucleotídeos, degrada constantemente os dNTPs não incorporados e o excesso de ATP,

quando a degradação é completada, outro dNTP é adicionado. A adição de dNTPs é realizada uma

de cada vez. À medida que o processo continua, a fita de DNA complementar é formada e a

sequência é determinada a partir dos picos do pirograma (Figura 4).

A metodologia de pirosequenciamento, é um procedimento qualitativo quanto quantitativo.

É possível identificar a quantidade exata de metilação de dinucleotídeos CpGs específicos de

maneira rápida e eficaz. É possível verificar a qualidade da conversão por bissulfito de sódio, uma

vez que podem ser inseridos na ordem de dispensação de nucleotídeos controles que podem

indicar a ocorrência de conversão parcial do DNA conforme exemplificado na Figura 5.

Figura 4 - Representação esquemática do sistema enzimático de pirosequenciamento. Cada dNTP é incorporada na cadeia de DNA pela enzima polimerase, a qual adiciona as bases de acordo com a fita molde, liberando assim a molécula de pirofosfato (PPi). A enzima ATP sulfurilase converte o PPi em ATP que serve como substrato para a produção de luz pela enzima luciferase. A luz produzida é detectada como evidência de que a incorporação de nucleotídeos foi eficiente (Retirado e adaptado de Ahmadian et al.

113).

23

Figura 5 – Representação dos pirogramas de cada região promotora analisada para cada gene. (A) Pirograma representando a região da sequência ALU. (B) Pirograma representando a região promotora do gene RASSF1A. (C) Pirograma representando controle metilado. (D) Pirograma representando controle não-metilado. (E) Pirograma representando a região promotora do gene APC. (F) Pirograma representando a região da sequência LINE-1. (G) Pirograma representando a região promotora do gene MGMT. (H) Pirograma representando a região promotora do gene MLH1. (I) Pirograma representando a região promotora do gene CDKN2A. (J) Pirograma representando a região promotora do gene TP53.

24

4.8.5 DNA controle metilado e não-metilado

Para as análises realizadas no pirosequenciador foram utilizados DNA controles obtidos da (Qiagen).

O controle utilizado de DNA metilado passa pelo processo de metilação in vitro e após este passo por

conversão de bissulfito. Também é utilizado um DNA não-metilado. A fonte do DNA são de sangue humano

constituído por um pool de vários doadores anônimos, onde todo o genoma é representado. O DNA foi

preparado a partir de células do sangue periférico (baixo grau de metilação). O sangue foi coletado de

doadores diferentes, tanto homens como mulheres, para evitar possíveis mutações de apenas um doador.

O DNA não metilado é obtida por amplificação de todo o genoma. Os controles utilizados possuem uma

faixa de porcentagem de metilação do DNA aceitável, o qual no controle metilado é acima de 85% e no

não-metilado igual ou abaixo de 5%, quando submetidos no pirosequenciador.

4.9 Análise estatística dos dados

Para as análises dos dados foi utilizado o software SPSS para Windows versão 21.0.

Inicialmente, os dados foram tabulados considerando as estatísticas descritivas (média, desvio

padrão, mediana, mínimo, máximo) para os dados quantitativos e tabelas de frequência para os

qualitativos.

Basicamente existem dois tipos básicos de distribuição dos dados: Normal ou Anormal,

também conhecida como distribuição livre. A distribuição normal ou Gaussiana (relativo à Carl

Gauss) apresenta uma forma semelhante a uma curva em sino quando os dados contínuos estão

dispostos em uma curva de distribuição. Desta forma, podemos visualizar os dados que se

concentram em torno de uma média e se dispersam simetricamente a partir desse ponto central.

Muitos testes estatísticos, como o teste t de Student, requerem uma distribuição normal. Quando

a curva de distribuição dos dados não apresenta uma forma de sino é chamada de assimétrica,

anormal ou de livre distribuição. Os testes usados para dados com distribuição anormal são

conhecidos como estatísticas não-paramétricas (exemplo: teste de Mann-Whitney). Assim, torna-

se imprescindível, antes da escolha do teste estatístico para dados contínuos, examinar a

distribuição dos dados que neste trabalho foi realizada através do teste Shapiro-Will e

Kolmogorov-Smirnov. Se dados contínuos apresentam uma distribuição anormal, é necessário

escolher um teste não-paramétrico ou transformar os dados em uma distribuição normal,

aplicando, como exemplo, uma transformação logarítmica114.

Contudo, antes de realizar o teste estatístico para comparar a associação entre a metilação e

o desfecho (Caso ou Controle) realizamos um teste para verificação da normalidade dos dados e

25

baseado nesses resultados optamos pelo Teste T (paramétrico) ou Teste Man-Whitney (não

paramétrico). Com isso, para as análises das diferenças entre os grupos considerando as

características demográficas foram utilizados os testes não paramétrico Qui-quadrado ou Exato de

Fisher, optando pelo Exato de Fisher apenas quando os pressupostos do teste de Qui-quadrado

não foram contemplados.

Para a análise do perfil de metilação dos trabalhadores da construção civil e do grupo

controle, foram realizadas as análises da distribuição dos grupos se paramétrico ou não

paramétrico, assim foram utilizados para as análises os testes estatísticos Teste-T ou Mann-

Whitney, respectivamente. Para as análises de metilação do DNA foram calculados as médias e/ou

mediana geral de cada gene para cada grupo e também foi calculado as diferenças para cada sítio

de cada gene. Para as análises de correlação entre o perfil de metilação do DNA dos genes que

apresentaram significância, o grupo de trabalhadores da construção civil foi dividido pela média,

de acordo com o hábito de bebida e a informação se fumantes passivo. A partir desta divisão foi

aplicado o Teste-T e/ou Mann-Whitney para avaliação estatística.

Para avaliar a metilação do DNA nos genes dos trabalhadores da construção civil (caso) no 1º

e 5º dia de exposição foi utilizado o Teste T pareado (paramétrico) ou Teste de Wilcoxon (não

pareado), após a verificação da normalidade através do teste Shapiro-Wilk. Em todas as análises

foi considerado um nível de significância de 5%, p valor <0,05.

Nas análises realizadas para verificação da presença ou ausência de motifs ligantes para

fatores de transcrição foi utilizado o banco de dados JASPAR e as análises foram realizadas em

ambiente R utilizando-se o pacote R/Bioconductor conforme descrito por Mathelier et al.115

4.10 Aspectos Éticos

Este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Câncer de

Barretos e encontra-se aprovado (586/2012). Os pesquisadores garantem o sigilo de todos os

participantes da pesquisa, não divulgando o nome ou qualquer outra informação que possa

identificar os envolvidos no estudo.

26

5 RESULTADOS

5.1 Coleta e caracterização sócio-demográficas dos grupos

A população do estudo foi composta por indivíduos do sexo masculino e não tabagista. No

primeiro grupo analisado foram incluídos 58 indivíduos no grupo dos trabalhadores da construção

civil (caso) e 50 trabalhadores do setor administrativo (controle), totalizando 108 indivíduos. No

segundo grupo foram analisados 39 indivíduos da construção civil no primeiro dia de trabalho da

semana e no quinto dia para avaliação do perfil de metilação dos genes propostos em curto

período de tempo de exposição no ambiente da construção civil.

Os participantes da pesquisa de ambos os grupos responderam a um questionário referente

as características sócio-demográficas, dados ocupacionais, tais como, histórico ocupacional, tempo

de duração no emprego atual e anteriores e aos hábitos de tabagismo e consumo de bebida

alcoólica. O grupo da construção civil respondeu a um questionário contendo perguntas

referentes a algumas substâncias possivelmente presentes no ambiente da construção e que de

acordo com a literatura podem contribuir com efeitos genotóxicos e na carcinogênese. Além disso,

foram entrevistados também em relação ao uso de EPI (equipamento de proteção individual),

tempo de exposição (em anos trabalhados) e quantidade (em horas) de exposição aos materiais e

substâncias conforme apresentados no (anexo D). O grupo de funcionários do setor administrativo

(grupo controle) também responderam ao mesmo questionário. No entanto, dados referentes à

exposição não foram aplicados, pois na função atual eles não tem nenhum contato com poeira,

fumaça ou substâncias tóxicas que façam parte do ambiente ocupacional, como estabelecidos nos

critérios de inclusão e exclusão do estudo.

Os trabalhadores da construção civil e do setor administrativo, pertencentes ao primeiro

grupo analisado, apresentaram médias de idade semelhantes (caso: 39 ± 13 anos; controle: 32 ±

10 anos). A média de duração de exposição ocupacional no grupo caso foi de 10 anos, enquanto

que no grupo controle não foi reportado histórico de exposição para os carcinógenos relacionados

com a construção civil ou qualquer agente físico ou químico no local de trabalho. A maioria dos

participantes, sendo 61% dos casos e 83% dos controles, consumiam bebidas alcoólicas. Além

disso, 62,7% dos casos e 31,1 % dos controles foram expostos à fumaça do cigarro como fumantes

passivos (Tabela 1).

27

Tabela 1 - Características sócio-demográficas dos participantes do primeiro grupo coletado (caso x controle).

Variáveis Caso (n=59) Controle (n=49) p-valor

Idade

< 35

25 (46,3)*

24 (49)*

0,60ᵃ

≥ 35

29 (53,7)*

25 (51)*

Tempo de exposição (Média anos) 10 _ _

Fumante passivo

Sim

37 (62,7) 14 (31,1)* 0,001ᵃ

Não

22 (37,3)

31 (68,9)*

Consumo de álcool Sim

36 (61) 40 (83,3)*

0,01ᵃ

Não/Passado

23 (39)

8 (16,7)*

Etnia

Branco

36 (63,2) 28 (73,7)

0,28ᵇ

Negro

8 (14)

2 (5,3)

Pardo

13 (22,8)

7 (18,4)

Oriental

0

1 (2,6)

N - Número de participantes * Variável com ausência de resposta de todos os participantes ᵃ Teste Qui-quadrado foi utilizado para análise estatística ᵇ Teste Exato de Fisher foi utilizado para análise estatística Valores em negrito estatisticamente significante

Conforme descrito acima, os trabalhadores foram entrevistados pelo questionário em

relação as substâncias e materiais presentes no ambiente de trabalho atual. Foi encontrado como

demonstrado na figura 6 os materiais e substâncias que apresentaram maior frequência de

exposição nos 58 trabalhadores da construção civil analisados no primeiro grupo, dentre eles,

podemos destacar: areia (70,7%), concreto (83,1%), sílica (33,9%), pó de madeira (41,4%) e raios

ultravioleta (84,7%). Na figura 7 foi avaliado a exposição destes trabalhadores as mesmas

substâncias e materiais em empregos anteriores e apresentou-se maior frequência para os

seguintes componentes: concreto (45,8%), ao pó da madeira (40,7%), HPA’s (33,9%) e a radiação

ultravioleta (87,7%).

28

Figura 6 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho atual (1º grupo). As barras em preto representam a porcentagem dos indivíduos não expostos. As barras em cinza representam a porcentagem dos indivíduos expostos.

Figura 7 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho em empregos anteriores (1º grupo). As barras em preto representam a porcentagem dos indivíduos não expostos. As barras em cinza representam a porcentagem dos indivíduos expostos.

Para o segundo grupo, foi analisado o perfil de metilação do DNA dos genes e das sequências

repetitivas propostas de acordo com os objetivos, em um curto período de tempo de exposição no

ambiente de trabalho da construção civil. O mesmo questionário foi aplicado aos trabalhadores da

construção civil pertencentes a este grupo. Sendo assim, as análises revelaram, uma média de

54,2 59,3

66,1

12,3

35,6

66,1

45,8 40,7

33,9

87,7

64,4

33,9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Concreto Madeira HPA's Ultravioleta Areia Fuligem

%

Não Sim

29,3

16,9

66,1 58,6

15,3

70,7

83,1

33,9 41,4

84,7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Areia Concreto Sílica Madeira Ultravioleta

%

Não Sim

29

idade dos participantes de 38 (± 11) anos. A média de exposição ocupacional no ambiente da

construção civil destes trabalhadores foi de 13 anos. A maioria dos participantes consumiam

bebidas alcóolicas, compreendendo 31 participantes (81,6%), e apenas 10 casos (26,3%) foram

expostos à fumaça do cigarro como fumantes passivos (Tabela 2).

As substâncias e materiais que foram presentes no ambiente de trabalho atual e que

apresentaram maior frequência de exposição entre os 39 trabalhadores da construção do segundo

grupo, foram: areia (66,7%), concreto (82,1%), sílica (51,3%) e raios ultravioleta (79,5%) (Figura 8).

A exposição desses trabalhadores a empregos anteriores apresentou maior frequência de: areia

(84,6%), concreto (84,6%), sílica (56,4%), pó de madeira (38,5%) e radiação ultravioleta (87,2%)

(Figura 9).

Tabela 2 - Características sócio-demográficos dos participantes do segundo grupo coletado (curto período de exposição no ambiente da construção civil).

Variáveis

Caso (n=38)

Idade (Média anos) 38

Tempo de exposição (Média anos) 13

Fumante passivo Sim

28 (73,7)

Não

10 (26,3)

Consumo de álcool

Sim

31 (81,6)

Não/Passado

7 (18,4)

Etnia

Branco

8 (21,6)

Negro

15 (40,5)

Pardo

13 (35,1)

Oriental

1 (2,7)

N - Número de participantes

30

Figura 8 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho atual (2º grupo). As barras em preto representam a porcentagem dos indivíduos não expostos. As barras em cinza representam a porcentagem dos indivíduos expostos.

Figura 9 - Frequência das exposições às substâncias e materiais encontrados no ambiente de trabalho em empregos anteriores (2º grupo). As barras em preto representam a porcentagem dos indivíduos não expostos. As barras em cinza representam a porcentagem dos indivíduos expostos.

5.2 Avaliação do perfil de metilação do DNA entre trabalhadores da construção civil (expostos)

e controles não-expostos (caso x controle)

Para análise e comparação do perfil de metilação do DNA entre os grupos de trabalhadores

da construção civil e o grupo controle (trabalhadores do setor administrativo do Hospital de

Câncer de Barretos), todas as amostras foram submetidas ao pirosequenciador, todos os

pirogramas originados foram analisados pelo programa Pyro Q-CpG (Qiagen) e definido a

porcentagem dos sítios CpG analisados para cada gene. Sendo assim, foram avaliadas o perfil de

33,3

17,9

48,7

20,5

66,7

82,1

51,3

79,5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Areia Concreto Sílica Ultravioleta

%

Não Sim

15,4 15,4

43,6

61,5

12,8

84,6 84,6

56,4

38,5

87,2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Areia Concreto Sílica Madeira Ultravioleta

%

Não Sim

31

metilação dos genes TP53, RASSF1A, MGMT, APC, CDKN2A e MLH1. Para verificarmos o perfil de

metilação global do genoma foram utilizadas as sequências repetitivas ALU e LINE-1. Uma análise

inicial (piloto) foi realizada para avaliar o comportamento do perfil de metilação dos genes. Para

isto, foram utilizados aproximadamente 20 amostras do grupo de trabalhadores da construção

civil e 20 amostras do grupo controle. Foi verificado que a análise do nível de metilação do DNA da

região promotora dos genes TP53, MGMT, RASSF1A e da sequência repetitiva ALU, não obtivemos

diferenças estatisticamente significantes nos níveis de metilação entre os grupos, como podemos

observar na tabela 3. Diante destes achados estes genes não foram analisados em todo o grupo,

somente analisou-se os genes que apresentaram diferenças estatisticamente significantes.

Tabela 3 - Avaliação do perfil de metilação do DNA na região promotora dos genes TP53, MGMT, RASSF1A e sequência repetitiva ALU em trabalhadores da construção civil e no grupo controle.

Gene CpG N Trabalhadores expostos N Controle P

Média(SD) Mediana Max-Min Média(SD) Mediana Max-Min

TP5

3

Sítio 1 18 5,43(0,74) 5,43 3,71 - 6,98 21 5,38(1,04) 5,33 3,31 - 7,50 0,86ᵃ

Sítio 2 18 5,48(2,15) 4,94 1,99 - 10,18 21 4,72(1,55) 4,50 2,46 - 8,37 0,22ᵇ

Sítio 3 18 4,81(0,80) 4,69 3,32 - 6,29 21 4,62(1,01) 4,55 2,88 - 6,49 0,52ᵃ

Sítio 4 18 11,48(1,43) 11,45 9,25 - 14,75 21 11,20(2,01) 11,38 7,09 - 14,49 0,62ᵃ

Média 18 6,80(1,14) 6,81 4,96 - 9,49 21 6,48(1,19) 6,35 4,00 - 8,20 0,40ᵃ

MG

MT

Sítio 1 20 23,44(4,49) 22,98 15,99 -33,35 21 21,52(3,00) 20,91 16,62 - 27,00 0,11ᵃ

Sítio 2 20 15,07(3,33) 14,63 8,83 - 22,03 21 14,17(2,37) 14,48 9,59 - 18,87 0,32ᵃ

Sítio 5 20 13,39(2,14) 13,24 9,32 - 17,22 21 12,56(2,62) 12,44 7,34 - 17,63 0,27ᵃ

Sítio 6 20 7,67(1,59) 7,57 4,66 - 10,96 21 6,91(1,44) 6,96 4,91 - 10,26 0,11ᵃ

Sítio 7 20 11,01(2,61) 10,61 6,33 - 17,31 21 9,91(1,85) 9,87 6,94 - 13,89 0,13ᵃ

Sítio 8 20 23,40(3,03) 23,58 15,30 - 27,54 21 22,26(4,84) 22,39 11,22 - 31,00 0,37ᵃ

Média 20 14,42(1,80) 14,38 10,81 - 17,79 21 13,43(2,11) 13,25 9,08 - 17,96 0,11ᵃ

RA

SSF1

A

Sítio 1 20 11,94(5,48) 10,82 5,66 - 24,09 21 19,54(14,29) 16,89 6,99 - 65,65 0,02ᵇ*

Sítio 2 20 7,04(3,06) 5,69 4,17 - 14,03 21 6,95(3,41) 6,30 2,85 - 14,98 0,76ᵇ

Sítio 3 20 3,15(1,14) 2,72 1,83 - 5,74 21 3,54(1,27) 3,59 1,82 - 6,06 0,29ᵇ

Sítio 4 20 5,22(1,87) 4,96 2,72 - 10,41 21 5,22(1,87) 4,96 2,72 - 10,41 0,96ᵇ

Sítio 5 20 3,62(1,27) 3,08 2,56 - 6,45 21 3,65(1,32) 3,52 2,27 - 7,56 0,88ᵇ

Sítio 6 20 4,45(2,06) 3,66 2,29 - 9,20 21 4,44(2,43) 3,65 2,23 - 10,79 0,61ᵇ

Sítio 7 20 2,82(1,12) 2,37 1,71 - 5,47 21 2,82(1,40) 2,68 1,09 - 6,31 0,84ᵇ

Média 20 5,48(1,97) 4,97 3,48 - 10,49 21 6,59(2,78) 6,34 2,96 - 13,69 0,27ᵇ

ALU

Sítio 1 18 84,41(1,10) 84,56 81,89 - 86,01 19 84,96(0,79) 84,74 83,67 - 86,63 0,08ᵃ

Sítio 2 18 86,82(1,27) 87,09 83,11 - 89,15 19 86,93(0,87) 87,03 85,52 - 88,60 0,93ᵇ

Sítio 3 18 93,48(2,97) 93,22 89,44 - 100,0 19 92,32(3,08) 91,44 88,02 - 100,0 0,25ᵃ

Sítio 4 18 88,06(0,74) 87,99 86,74 - 89,44 19 87,89(0,73) 87,96 86,40 - 89,46 0,48ᵃ

Média 18 88,19(1,03) 87,90 86,00 - 90,30 19 88,03(1,08) 87,62 86,54 - 90,46 0,63ᵃ

ᵃ Test T foi utilizado para análise estatística

ᵇ Mann Whitney foi utilizado para a análise estatística

* Significância estatística

32

5.2.1 Avaliação do perfil de metilação do DNA nos grupos caso e controle dos genes que

apresentaram significância estatística nas análises iniciais.

Para os genes verificados com níveis de metilação do DNA estatisticamente significantes no

piloto foram analisados a amostragem total de ambos os grupos. Sendo assim, foram verificados

os níveis de metilação dos genes CDKN2A, MLH1, APC e avaliação da metilação global pela

sequência repetitiva LINE-1.

Nas análises da região promotora do gene CDKN2A foram avaliados 57 indivíduos da

construção civil (caso) e 44 trabalhadores do setor administrativo (controle) e foi observado uma

média = 4,79%, mediana = 4,44 (0 – 10,73), para o grupo de trabalhadores da construção civil,

quando comparado ao grupo controle com média = 3,63%, mediana = 3,68 (0 – 7,47). Foi

verificada uma média estatisticamente significante no grupo de trabalhadores da construção civil

comparado aos controles. Apesar da significância estatística na média geral considerando todos os

sítios, nas análises sítio por sítio , o padrão dos níveis de metilação do DNA foram inconsistentes.

Dos 7 sítios analisados, somente os sítios 2 e 7 apresentaram diferenças estatísticas significantes

entre os grupos, apresentando p-valor = 0,02 e p-valor = 0,005, respectivamente . Os demais sítios

não demonstraram alterações significantes nos trabalhadores expostos comparados com o

controle, indicando que os outros 2 sítios CpG podem ser os Hot CpG sites e que provavelmente

podem estar participando da regulação da expressão gênica, seguindo conforme descrito por

Duan et al. 106 (Tabela 4) .

Para as análises da região promotora do gene MLH1 foram avaliados 56 indivíduos da

construção civil (caso) e 41 trabalhadores do setor administrativo (controle) e foi observado uma

média = 5,04%, mediana = 5,03% (1,61 – 9,76) para o grupo de trabalhadores da construção civil

quando comparado ao grupo controle com média = 4,22%, mediana = 4,00% (1,74 – 7,49).

Verificou-se uma diferença estatisticamente significante entre os grupos, sendo os níveis de

metilação maiores encontrados no grupo caso comparados com o controle. Para as análises

realizadas para cada sitio CpG, 4 sítios apresentaram diferenças estatísticas significantes entre os

grupos caso e controle, sendo eles os sítios 3 (p= 0,02), sítio 4 (p=0,01), sítio 5 (p=0,001) e sítio 6

(p=0,001). Dois sítios (1 e 2) não demonstraram alterações significantes nos trabalhadores

expostos comparados com o controle. Dessa forma, os 4 sítios que apresentaram diferença

estatística entre os grupos provavelmente são os Hot CpG sites e que possivelmente podem estar

participando da regulação gênica (Tabela 4).

33

Na verificação dos níveis de metilação da região promotora do gene APC, foram avaliados 58

indivíduos da construção civil (caso) e 47 trabalhadores do setor administrativo (controle) e foi

observado uma média = 6,43%, mediana = 5,73% (1,17 – 15,48) para o grupo de trabalhadores da

construção civil quando comparado ao grupo controle com média = 5,47%, mediana = 6,13% (1,29

– 11,54). Não observamos uma diferença estatisticamente significante entre os grupos na média

geral, porém, para esse gene foram analisados 3 sítios CpG. Nas análises para cada sítio CpG,

foram encontrados 2 sítios que apresentaram valores significantes entre os grupos, sendo eles,

sítio 2 (p=0,002) e no sítio 3 (p=0,013) significantes entre os grupos caso e controle. O que pode

indicar serem sítios (Hot CpG sites), que provavelmente podem estar participando da regulação da

expressão gênica. Sendo assim, foram recalculados somente os sítios que apresentaram diferença

estatística (Hot CpG sites) e observou-se uma média aumentada = 4,29%, mediana = 4,29%, (0,81 –

9,61) para grupo dos trabalhadores da construção quando comparado ao grupo controle com

média = 3,11%, mediana = 2,61, (0 – 10,82) com p<0,001 (Tabela 4).

Para verificação da hipótese de participação dos sítios analisados na regulação gênica, foram

realizadas análises in sílico afim de confirmarmos a presença de motifs de ligação de fatores de

transcrição nas sequencias que foram analisadas no pirosequenciador, para os genes CDKN2A,

MLH1 e APC. (Anexo F).

Para as análises de avaliação da metilação global da região repetitiva LINE-1 foram avaliados

57 indivíduos da construção civil (caso) e 44 trabalhadores do setor administrativo (controle) e foi

observado uma média = 66,83%, mediana = 65,93 (62,48 – 72,48) para o grupo de trabalhadores

da construção civil, quando comparado ao grupo controle com média = 68,04%, mediana = 68,63

(64,98 – 70,37). Verificamos uma diferença estatisticamente significante entre os grupos. Dessa

maneira foi observado a média menor nos níveis de metilação do DNA global no grupo caso em

comparação ao grupo controle (p=0,005). Nas análises para cada sítio CpG, foram verificados 5

sítios para a sequência LINE-1, sendo que 2 sítios apresentaram diferenças estatísticas

significantes entre os grupos caso e controle, sendo eles os sítios 1 (p= 0,01), sítio 5 (p=0,005)

(Tabela 4).

34

Tabela 4 – Avaliação dos níveis de metilação do DNA da região promotora dos genes CDKN2A, MLH1, APC e sequência LINE-1 em trabalhadores da construção civil e do grupo controle.

Gene

CpG N Trabalhadores expostos

N Controle

P Média(SD) Mediana Max-Min Média(SD) Mediana Max-Min

CD

KN

2A

Sítio 1 57 3,48(2,57) 2,97 0 - 10,06 44 2,85(1,89) 2,81 0 - 5,75 0,48ᵇ

Sítio 2 57 6,56(3,03) 6,82 0 - 13,58 44 5,11(2,81) 5,39 0 - 10,35 0,02ᵇ*

Sítio 3 57 3,25(2,57) 2,81 0 - 9,97 44 2,51(2,31) 2,50 0 - 6,53 0,24ᵇ

Sítio 4 57 5,02(2,00) 5,08 0 - 10,01 44 4,42(1,51) 4,40 0 - 7,58 0,11ᵇ

Sítio 5 57 5,33(2,86) 5,30 0 - 11,62 44 4,12(2,76) 4,66 0 - 9,47 0,08ᵇ

Sítio 6 57 2,47(2,29) 2,15 0 - 8,00 44 1,93(1,84) 1,97 0 - 5,14 0,40ᵇ

Sítio 7 57 5,87(2,37) 5,68 0 - 12,22 44 4,46(2,35) 4,67 0 - 8,87 0,005ᵇ*

Média 57 4,79(2,57) 4,44 0 - 10,73 44 3,63(2,04) 3,68 0 - 7,47 0,05ᵇ*

MLH

1

Sítio 1 56 5,20(1,48) 5,26 0 - 8,10 41 4,76(1,54) 4,35 2,32 - 8,63 0,15ᵃ

Sítio 2 56 3,70(1,29) 3,64 0 - 6,42 41 3,69(1,29) 3,62 0 - 5,85 0,76ᵇ

Sítio 3 56 3,90(1,27) 4,03 0 - 7,25 41 3,02(1,80) 3,27 0 - 6,25 0,02ᵇ *

Sítio 4 56 6,18(1,57) 6,26 2,53 - 9,70 41 5,29(2,02) 5,13 0 - 9,50 0,01ᵃ *

Sítio 5 56 5,90(1,50) 5,92 2,42 - 9,59 41 4,61(1,87) 4,10 0 - 8,34 0,001ᵇ *

Sítio 6 56 3,86(1,47) 3,95 0 - 8,47 41 1,91(2,01) 2,06 0 - 5,72 0,001ᵇ *

Média 56 5,04(1,38) 5,03 1,61 - 9,76 41 4,22(1,55) 4,00 1,74 - 7,49 0,007ᵃ *

AP

C

Sítio 1 58 8,08(3,26) 8,13 2,59 - 21,49 47 8,78(10,14) 7,48 0 - 68,05 0,65ᵇ

Sítio 2 58 3,43(2,21) 3,57 0 - 11,01 47 1,99(2,72) 0,00 0 - 9,46 0,002ᵇ*

Sítio 3 58 5,13(1,66) 5,03 1,61 - 11,51 47 4,22(2,20) 4,00 0 - 12,18 0,013ᵇ*

Média 58 6,43(3,33) 5,73 1,17 - 15,48 47 5,47(2,43) 6,13 1,29 - 11,54 0,29ᵇ

"CpG hot" 58 4,29(1,83) 4,29 0,81 - 9,61 47 3,11(2,10) 2,61 0 - 10,82 <0,001ᵇ*

LIN

E-1

Sítio 1 57 73,20(5,08) 73,83 36,54 - 73,17 44 74,45(1,36) 74,72 70,72 - 76,94 0,01ᵇ*

Sítio 2 57 72,52(7,78) 67,84 64,95 - 85,26 44 73,42(7,30) 68,87 66,92 - 84,14 0,16ᵇ

Sítio 3 57 62,00(7,16) 58,20 49,44 - 74,35 44 63,13(6,68) 58,82 55,87 - 73,13 0,08ᵇ

Sítio 4 57 59,17(4,38) 61,24 48,66 - 64,35 44 59,08(5,04) 62,30 50,52 - 64,39 0,34ᵇ

Sítio 5 57 67,26(1,11) 67,14 63,51 - 70,59 44 66,18(2,41) 66,47 57,53 - 72,28 0,005ᵇ*

Média 57 66,83(2,33) 65,93 62,48 - 72,48 44 68,04(1,55) 68,63 64,98 - 70,37 0,005ᵇ*

ᵃ Test T foi utilizado para análise estatística

ᵇ Mann Whitney foi utilizado para a análise estatística

* Significância estatística

Afim de correlacionarmos os dados obtidos do questionário e possivelmente determinar a

influência dos agentes que os trabalhadores da construção civil estão expostos para o perfil de

metilação do gene CDKN2A, MLH1, APC e da sequência repetitiva LINE-1, foram considerados para

as análises os agentes mais frequentes no ambiente de trabalho atual e também nos empregos

anteriores. Para estas análises o grupo de trabalhadores da construção civil foi dividido de acordo

com os agentes mais frequentes determinados pelo questionário. Após a divisão foi realizada uma

média dos níveis de metilação de acordo com os indivíduos que apresentavam exposição ou não

para cada agente. Para as análises do gene CDKN2A, a partir da categorização entre os agentes

35

ocupacionais e o nível de metilação da região promotora, não foi verificado nenhuma diferença

estatística. Dessa maneira, não foi estabelecida uma relação entre os níveis de metilação do gene

CDKN2A e a exposição aos agentes mais frequentes de exposição no ambiente da construção civil

(Tabelas 5 e 6).

Tabela 5 - Nível de metilação do gene CDKN2A analisado de acordo com agentes expostos no ambiente de trabalho atual.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 16 4,47(2,31) 4,27 0,46 - 9,58 0,59 Sim 40 4,89(2,71) 4,45 0 - 10,73

Concreto Não 10 4,02(2,10) 3,98 0,46 - 8,28 0,30 Sim 47 4,96(2,65) 4,50 0 - 10,73

Madeira Não 33 4,93(2,71) 4,44 0,46 - 10,73 0,69 Sim 23 4,36(2,17) 4,10 0 - 9,46

Sílica Não 37 4,71(2,67) 4,44 0 - 10,03 0,83 Sim 20 4,94(2,43) 4,46 1,88 - 10,73

Ultravioleta Não 8 4,78(3,65) 4,77 0 - 9,88 0,95

Sim 49 4,79(2,40) 4,42 0,71 - 10,73

* Significância estatística ᵃ Mann Whitney para análise estatística

Tabela 6 - Nível de metilação do gene CDKN2A analisado de acordo com agentes ocupacionais no ambiente de trabalho em empregos anteriores.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 20 4,99(2,59) 4,52 0 - 9,88 0,66 Sim 37 4,68(2,59) 4,14 0,46 - 10,73

Concreto Não 31 4,61(2,43) 4,42 0 - 9,88 0,56 Sim 26 5,00(2,76) 4,47 0,71 - 10,73

Madeira Não 34 4,75(2,60) 4,46 0 - 10,73 0,91 Sim 23 4,84(2,59) 4,42 0,46 - 10,03

Fuligem Não 37 4,97(2,91) 4,10 0 - 10,73 0,92 Sim 20 4,47(1,82) 4,53 0,46 - 9,15

HPA's Não 37 4,82(2,87) 4,44 0 - 10,73 0,98 Sim 20 4,73(1,97) 4,45 1,88 - 9,46

Ultravioleta Não 8 3,83(1,97) 3,91 0,46 - 6,46 0,51

Sim 49 4,95(2,66) 4,48 0 - 10,73

* Significância estatística ᵃ Mann Whitney para análise estatística

Nas análises da possível influência dos agentes no perfil de metilação do gene MLH1, a partir

da categorização entre os agentes ocupacionais e o nível de metilação do gene, verificou-se uma

média (4,38%) no nível de metilação do gene MLH1 significantemente maior em trabalhadores

36

expostos ao concreto em funções anteriores (Tabela 7). E também foi possível verificar o nível de

metilação com diferenças estatísticas significantes (média= 4,35%) em trabalhadores expostos ao

pó de madeira comparados aos não expostos na função atual (Tabela 8). Dessa maneira, foi

possível estabelecer uma relação estatisticamente significante entre os níveis de metilação do

gene MLH1 e a exposição aos agentes concreto e pó de madeira (Tabelas 7 e 8).

Tabela 7 - Nível de metilação do gene MLH1 analisados de acordo com agentes ocupacionais no ambiente de trabalho em empregos anteriores.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 20 3,61(1,49) 4,13 0 - 5,28 0,69 Sim 36 4,00(1,46) 3,79 0 - 8,47

Concreto Não 30 3,42(1,45) 3,50 0 - 5,46 0,03* Sim 26 4,38(1,35) 4,15 2,39 - 8,47

Madeira Não 33 3,50(1,46) 3,60 0 - 5,50 0,06 Sim 23 4,39(1,35) 4,43 2,63 - 8,47

Fuligem Não 36 4,00(1,23) 4,03 0 - 6,16 0,24 Sim 20 3,62(1,84) 3,52 0 - 8,47

HPA's Não 36 4,06(1,40) 4,03 0 - 8,47 0,22 Sim 20 3,51(1,56) 3,51 0 - 6,16

Ultravioleta Não 6 4,49(0,70) 4,49 3,36 - 5,46 0,15

Sim 48 3,77(1,55) 3,72 0 - 8,47

* Significância estatística ᵃ Mann Whitney para análise estatística

Tabela 8 - Nível de metilação do gene MLH1 analisados de acordo com agentes expostos no ambiente de trabalho atual.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 15 3,62(1,40) 3,71 0 - 5,55 0,49 Sim 40 3,96(1,52) 4,13 0 - 8,47

Concreto Não 10 3,87(0,89) 3,90 2,70 - 4,94 0,80 Sim 46 3,86(1,58) 3,95 0 - 8,47

Madeira Não 32 3,54(1,70) 3,38 0 - 8,47 0,02* Sim 23 4,35(0,97) 4,43 2,22 - 6,16

Sílica Não 36 3,85(1,65) 4,03 0 - 8,47 0,86 Sim 20 3,90(1,14) 3,66 2,22 - 6,16

Ultravioleta Não 7 3,31(1,72) 3,36 0 - 5,28 0,42

Sim 49 3,94(1,44) 4,01 0 - 8,47

* Significância estatística ᵃ Mann Whitney para análise estatística

37

Considerando as análises realizadas para o gene APC, somente os valores obtidos dos 2 sítios

Hot CpG sites, foram avaliados. Também considerou-se para estas análises os agentes mais

frequentes no ambiente de trabalho atual e também nos empregos anteriores.

A partir da categorização entre os agentes ocupacionais e o nível de metilação do gene APC,

verificou-se diferenças estatísticas nos níveis de metilação com média maior para os trabalhadores

não expostos aos agentes concreto e aos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos no ambiente de

trabalho em empregos anteriores (Tabela 9).

Na Tabela 10, não foi estabelecida uma relação entre os níveis de metilação do gene APC e a

exposição aos agentes mais frequentes de exposição no ambiente de trabalho atual,

possivelmente estes agentes não influenciam nos níveis de metilação do gene APC (Tabela 9 e 10).

Tabela 9 - Nível de metilação do gene APC (Hot CpG sites) analisados de acordo com agentes ocupacionais no ambiente de trabalho em empregos anteriores.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 20 4,20(1,40) 4,32 1,50 - 6,87 0,74 Sim 38 4,33(2,03) 4,24 0,81 - 9,61

Concreto Não 32 3,94(1,78) 4,19 0,81 - 9,61 0,13 Sim 26 4,68(1,83) 4,55 1,55 - 9,25

Madeira Não 35 4,10(1,80) 4,35 1,50 - 9,61 0,62 Sim 23 4,55(1,86) 4,24 0,80 - 9,25

Fuligem Não 38 4,57(1,77) 4,53 1,56 - 9,61 0,05* Sim 20 3,74(1,87) 3,64 0,81 - 9,12

HPA's Não 38 4,69(1,94) 4,56 1,50 - 9,61 0,02* Sim 20 3,52(1,32) 3,63 0,80 - 5,54

Ultravioleta Não 9 4,94(1,09) 4,81 3,70 - 6,87 0,20

Sim 49 4,20(1,92) 4,24 0,80 - 9,61

* Significância estatística

ᵃ Mann Whitney para análise estatística

38

Tabela 10 - Nível de metilação do gene APC (Hot CpG sites) analisados de acordo com agentes ocupacionais no ambiente de trabalho atual.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 16 4,23(2,00) 4,32 1,56 - 9,61 0,86 Sim 41 4,30(1,81) 4,21 0,81 - 9,25

Concreto Não 10 3,79(1,34) 3,98 1,79 - 5,58 0,54 Sim 48 4,39(1,91) 4,32 0,81 - 9,61

Madeira Não 33 4,17(2,18) 4,25 0,81 - 9,61 0,24 Sim 24 4,45(1,28) 4,45 1,50 - 7,05

Sílica Não 38 4,56(1,97) 4,58 1,56 - 9,61 0,08 Sim 20 3,76(1,42) 3,87 0,81 - 6,65

Ultravioleta Não 8 4,56(2,54) 4,29 1,59 - 9,61 0,79

Sim 50 4,24(1,72) 4,29 0,81 - 9,25

* Significância estatística ᵃ Mann Whitney para análise estatística

Para as análises de verificação da influência dos agentes ocupacionais nos níveis de

metilação das sequencias repetitivas LINE-1, verificou-se diferenças estatísticas nos níveis de

metilação com média menor para os trabalhadores expostos a sílica no ambiente de trabalho

atual. Sendo assim, este agente pode estar influenciando nos níveis de metilação global das

sequencias repetitivas LINE-1 (Tabela 12). Na tabela 11 não foi estabelecida uma relação entre os

níveis de metilação da sequência repetitiva LINE-1 e a exposição aos agentes mais frequentes de

exposição no ambiente de trabalho em ocupações anteriores.

Tabela 11 - Nível de metilação da sequência repetitiva LINE-1 analisado de acordo com agentes ocupacionais no ambiente de trabalho em empregos anteriores.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 20 67,17(2,23) 66,39 63,70 - 70,61 0,35 Sim 37 66,65(2,39) 65,72 62,48 - 72,48

Concreto Não 31 66,90(2,14) 66,00 63,70 - 70,61 0,71 Sim 26 66,74(2,58) 65,71 62,48 - 72,48

Madeira Não 34 66,70(2,29) 65,90 62,48 - 70,61 0,86 Sim 23 67,02(2,43) 66,29 64,06 - 72,48

Fuligem Não 37 66,80(2,18) 66,29 62,48 - 70,53 0,71 Sim 20 66,89(2,65) 65,63 63,70 - 72,48

HPA's Não 37 66,58(2,24) 65,93 62,48 - 72,48 0,47 Sim 20 67,30(2,48) 66,22 64,06 - 70,62

Ultravioleta Não 8 65,58(0,55) 65,48 64,95 - 66,43 0,21

Sim 49 67,03(2,45) 66,29 62,48 - 72,48

* Significância estatística ᵃ Mann Whitney para análise estatística

39

Tabela 12 - Nível de metilação da sequência repetitiva LINE-1 analisado de acordo com agentes ocupacionais no ambiente de trabalho atual.

Agentes Ocupacionais N Média(DP) Mediana Min-Max pᵃ

Areia Não 16 67,27(2,01) 66,51 65,03 - 70,53 0,15 Sim 40 66,68(2,47) 65,68 62,48 - 72,48

Concreto Não 10 67,22(2,30) 66,36 65,15 - 70,61 0,38 Sim 47 66,75(2,35) 65,86 62,48 - 72,48

Madeira Não 33 67,34(2,60) 66,43 62,48 - 72,48 0,15 Sim 23 66,19(1,75) 65,72 63,70 - 70,62

Sílica Não 37 67,21(2,35) 66,49 62,48 - 72,48 0,05* Sim 20 66,14(2,19) 65,54 62,79 - 70,49

Ultravioleta Não 8 66,68(2,07) 65,56 65,03 - 70,26 0,81

Sim 49 66,86(2,39) 66,00 62,48 - 72,48

* Significância estatística ᵃ Mann Whitney para análise estatística

5.3 Avaliação do nível de metilação dos genes com as covariáveis hábito de bebida e fumante

passivo para os grupos caso e controle.

Para analisar a possível relação entre a porcentagem de metilação do DNA com a associação

em relação ao hábito de consumo de bebida e exposição passiva ao fumo, foi realizada uma

divisão do grupo de acordo com os hábitos acima e calculada uma média dos níveis de metilação

de cada gene de acordo com a exposição. Estas análises foram realizadas somente para os genes

que apresentaram significância estatística nas análises caso x controle, ou seja, CDKN2A, MLH1,

APC e sequência LINE-1.

Nas análises do gene CDKN2A, foi observado que dentre os 57 trabalhadores analisados, 10

indivíduos não eram expostos a fumaça do cigarro com média = 3,58 e mediana = 3,37 e 46

indivíduos eram expostos a fumaça do cigarro como fumantes passivo apresentando média dos

níveis de metilação = 4,95% e mediana = 4,53% (Tabela 13). Para as análises em relação ao hábito

de bebida, 22 não apresentavam o hábito de ingerir bebida alcoólica com média dos níveis de

metilação = 4,36% e mediana = 4,49%, e 34 declararam ingerir bebida alcoólica com média = 4,93

e mediana = 4,26 (Tabela 14). Mesmo a média dos indivíduos expostos apresentando-se maior,

não foram revelados valores significativos, evidenciando que o nível de metilação do gene não

está sendo influenciado pelos hábitos de ser fumante passivo e ingerir bebida alcoólica.

Para as análises do gene MLH1, foi observado que dentre os 56 trabalhadores analisados, 10

indivíduos não eram expostos a fumaça do cigarro com média dos níveis de metilação = 3,71% e

mediana = 3,97% e 46 indivíduos eram expostos a fumaça do cigarro como fumantes passivo

40

apresentando média de metilação = 3,90% e mediana = 3,88% (Tabela 13). Quando foi verificado

em relação ao hábito de bebida, 22 não apresentavam o hábito de ingerir bebida alcoólica com

média = 3,84 e mediana = 4,09, e 34 declararam ingerir bebida alcoólica com média = 3,88% e

mediana = 3,82% (Tabela 14). Mesmo a média dos indivíduos expostos apresentando-se maior, a

análise estatística não foi significativa, evidenciando que o nível de metilação do gene não está

sendo influenciado diante do hábito de bebida e exposição a fumaça do cigarro.

Na análise do gene APC (somente os Hot CpG sites foram considerados), foi observado que

dentre os 58 trabalhadores analisados, 10 indivíduos não eram expostos a fumaça do cigarro

apresentando média dos níveis de metilação = 4,17% e mediana = 4,56% e 48 indivíduos foram

expostos a fumaça do cigarro como fumantes passivo apresentando média = 4,31% e mediana =

4,24% (Tabela 13). Para as análises com o hábito de bebida, 23 não apresentavam o hábito de

ingerir bebida alcoólica com média = 4,35% e mediana = 4,19%, e 35 declararam ingerir bebida

alcoólica com média dos níveis de metilação = 4,24% e mediana = 4,30% (Tabela 14). Mesmo a

média dos indivíduos expostos apresentando-se maior, não foram evidenciados valores

estatisticamente significativos, dessa forma, possivelmente o nível de metilação do gene não está

influenciado com os hábito de bebida e de exposição como fumante passivo.

Para a análise da sequência repetitiva LINE-1, foi observado que dentre os 57 trabalhadores

analisados, 10 indivíduos não eram expostos a fumaça do cigarro com média dos níveis de

metilação = 65,81% e mediana = 65,37% e 46 indivíduos eram expostos a fumaça do cigarro como

fumantes passivo apresentando média dos níveis de metilação = 66,98% e mediana = 66,15%

(Tabela 13). Para as análises em relação ao hábito de bebida, 22 não apresentavam o hábito de

ingerir bebida alcoólica com média dos níveis de metilação = 66,33% e mediana = 65,79%, e 34

declararam ingerir bebida alcoólica com média = 67,06% e mediana = 65,97% (Tabela 14). Mesmo

a média dos indivíduos expostos apresentando-se maior, não se obteve significância estatística,

evidenciando que o nível de metilação do elemento repetitivo não está sendo influenciado com os

hábito de bebida e exposição a fumaça do cigarro.

41

Tabela 13 - Níveis de metilação das regiões promotoras dos genes CDKN2A, MLH1, APC e da sequência repetitiva LINE-1 em relação à exposição passiva ao fumo (grupo caso).

Gene F. Passivo N Média (SD) Mediana Min. - Max. P

CD

KN

2A

Não 10 3,58(2,68) 3,37 0 - 9,76

0,06ᵇ Sim 46 4,95(2,43) 4,53 0,46 - 10,73

MLH

1 Não 10 3,71(1,66) 3,97 0 - 5,38

0,71ᵃ Sim 46 3,90(1,44) 3,88 0 - 8,47

AP

C Não 10 4,17(1,53) 4,56 1,67 - 5,92

0,71ᵇ Sim 48 4,31(1,90) 4,24 0,81 - 9,61

LIN

E-1

Não 10 65,81(1,99) 65,37 62,48 - 70,30 0,56ᵇ

Sim 46 66,98(2,34) 66,15 62,79 - 72,48

ᵃ Test T foi utilizado para análise estatística

ᵇ Mann Whitney foi utilizado para a análise estatística

* Significância estatística

Tabela 14 - Níveis de metilação das regiões promotoras dos genes CDKN2A, MLH1, APC e da sequência repetitiva LINE-1 em relação ao hábito de bebida (grupo caso).

Gene Hábito bebida N Média (SD) Mediana Min. - Max. P

CD

KN

2A

Nunca/Só Passado 10 3,58(2,68) 3,37 0 - 9,76 0,06ᵃ

Sim 46 4,95(2,43) 4,53 0,46 - 10,73

MLH

1

Nunca/Só Passado 22 3,84(1,33) 4,09 0 - 5,54 0,93ᵃ

Sim 34 3,88(1,57) 3,82 0 - 8,47

AP

C Nunca/Só Passado 23 4,35(1,76) 4,19 1,50 - 9,25

0,94ᵃ Sim 35 4,24(1,89) 4,30 0,81 - 9,61

LIN

E-1

Nunca/Só Passado 22 66,33(2,33) 65,79 62,48 - 70,61 0,46ᵇ

Sim 34 67,06(2,28) 65,97 64,66 - 72,48

ᵃ Test T foi utilizado para análise estatística ᵇ Mann Whitney foi utilizado para a análise estatística

* Significância estatística

42

5.4 Avaliação do nível de metilação dos genes considerando as covariáveis hábito de bebida,

fumante passivo e ex-fumantes para os grupos caso/controle.

Afim de verificar a influência nos níveis de metilação dos trabalhadores do grupo caso em

relação a serem ex-fumantes, fumantes passivos e consumir bebida alcoólica, para os genes que

apresentaram significância estatística nas análises caso x controle, foi realizada uma análise

seguindo o modelo de regressão linear múltipla, considerando as variáveis citadas a cima. Dessa

forma, foi ajustado um modelo para cada gene analisado, tendo como resposta a porcentagem

média de metilação do DNA.

Nas análises do gene CDKN2A, quando analisou-se as quatro variáveis em conjunto,

observou-se que, apesar de não significativa, o grupo apresenta um valor de significância menor,

sendo p = 0,06, enquanto as outras variáveis ex-fumantes, fumantes passivos e hábito de bebida,

apresentam valores maiores, sendo, p = 0,18, p = 0,70 e p = 0,22, respectivamente. (Tabela 15).

Para as análises do gene MLH1, após a análise das quatro variáveis, observamos que a

variável “grupo” apresenta valores significativos, sendo, p < 0,001 quando analisado em conjunto

com as outras variáveis que não foram significativas. (Tabela 15).

Nas análises do gene APC (Hot CpG sites), foi observado que na correlação entre as variáveis,

o grupo apresenta valores significativos, sendo p = 0,03 e quando consideradas as outras variáveis

os valores não são estatisticamente significantes. (Tabela 15).

Para a análise da sequência repetitiva LINE-1, foi observado que dentre as quatro variáveis, o

grupo apresentou um p = 0,03, sendo estatisticamente significantes em relação as outras

variáveis. Para ex-fumantes observamos p = 0,95, fumante passivo p = 0,38 e hábito de bebida p =

0,18. (Tabela 15).

Baseado no modelo de regressão linear múltipla, constatou-se que os níveis de metilação de

todos os genes sofrem uma influência significativa do grupo (exposição) quando as outras

variáveis são mantidas constantes, isso pode ser verificado na tabela 16. Quando analisou-se os

grupos independentes, mantendo-se as variáveis constantes, verificamos que os genes CDKN2A,

MLH1, APC apresentaram média de porcentagem de metilação maiores no grupo caso, sugerindo,

mais uma vez, que os níveis de metilação desses genes estão influenciados pela exposição dos

trabalhadores. O mesmo ocorre quando verificou-se a sequência repetitiva LINE-1, foi observado

que mantendo-se as variáveis constantes e analisando apenas o grupo, os níveis de metilação no

grupo caso são menores, sugerindo também, que a exposição influência nos níveis de

porcentagem de metilação.

43

Tabela 15 - Modelo de Regressão Linear Múltipla para porcentagem (%) de metilação dos genes CDKN2A, MLH1, APC e sequência repetitiva LINE-1 em relação a hábito de fumante passivo, bebida alcoólica e ex-fumantes (grupo caso x controle).

Gene Variáveis Β DP(β) p-valor

CD

KN

2A

(n=1

01

)

Constante

2,69

0,74

<0,001* Grupo (Caso/Controle)

1,14

0,61

0,06

Ex-fumantes (Sim/Não)

0,82

0,61

0,18 Fumo Passivo (Sim/Não)

0,23

0,60

0,70

Hábito Bebida 0,72 0,59 0,22

MLH

1

(n=9

7)

Constante

2,00

0,55

<0,001* Grupo (Caso/Controle)

1,86

0,45

<0,001*

Ex-fumantes (Sim/Não)

0,13

0,45

0,78 Fumo Passivo (Sim/Não)

-0,07

0,44

0,88

Hábito Bebida 0,01 0,43 0,98

Ho

t_A

PC

(n=1

05

)

Constante

3,33

0,61

<0,001* Grupo (Caso/Controle)

1,05

0,50

0,03*

Ex-fumantes (Sim/Não)

0,44

0,51

0,39 Fumo Passivo (Sim/Não)

-0,44

0,49

0,37

Hábito Bebida 0,16 0,49 0,74

LIN

E-1

(n=1

01

)

Constante

67,22

0,64

<0,001* Grupo (Caso/Controle)

-1,12

0,53

0,03*

Ex-fumantes (Sim/Não)

-0,17

0,53

0,75 Fumo Passivo (Sim/Não)

0,46

0,52

0,38

Hábito Bebida

0,69

0,51

0,18 * Signicância estatística

= 0.10,

= 0,22 , = 0,07 ,

= 0,09.

Tabela 16 - Exemplo de predição de acordo com o modelo de regressão linear para a média de porcentagem (%) de metilação.

Genes Grupos (Variáveis)

% média esperada de metilação

CDKN2A

Controle (Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 4,45

Caso (Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 5,60*

MLH1 Controle_(Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 1,46

Caso_(Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 3,32*

Hot APC Controle (Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 3,49

Caso (Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 4,54*

LINE-1 Controle (Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 68,20

Caso (Ex-fumante, Hábito de bebida, F.passivo) 67,08*

44

5.5 Análise do perfil de metilação do DNA nos trabalhadores da construção civil expostos no

1º dia de trabalho da semana (segunda- feira) e 5º dia de trabalho da semana (sexta- feira).

Para análise e comparação do perfil de metilação do DNA desse segundo grupo, foram

coletados sangue dos trabalhadores da construção civil em dois dias diferentes da semana, a

coleta foi realizada do mesmo indivíduo no 1° dia de trabalho da semana e a segunda coleta no 5°

dia de trabalho, a fim de detectar as potenciais diferenças nos níveis de metilação do DNA dos

genes propostos em curto período de tempo de exposição no ambiente de trabalho da construção

civil. Além disso, as análises com este grupo proporcionam a verificação do nível de metilação do

DNA dos indivíduos trabalhando no mesmo local de trabalho sem interferentes de outros

participantes que não tem a exposição e com características socioeconômicas diferentes. Sendo

assim, foram avaliadas o perfil de metilação dos genes MGMT, RASSF1A, APC, MLH1 e CDKN2A e

das sequências repetitivas ALU e LINE-1.

Nas análises das regiões promotoras dos genes MGMT, RASSF1A, APC, MLH1 e do elemento

repetitivo ALU foram analisados 38 indivíduos da construção civil no 1º dia de trabalho da semana

e no 5º dia de trabalho da semana. Para análise de LINE-1 analisou-se 39 trabalhadores da

construção civil. Conforme pode-se observar na Tabela 17 as análises dos genes MGMT, RASSF1A,

APC, MLH1 e sequências ALU e LINE-1 em trabalhadores expostos no 1º e 5º dia da semana, não

foram verificadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos.

Para as análises da região promotora do gene CDKN2A foram analisados 38 indivíduos da

construção civil no 1º dia de trabalho da semana e foi observado uma média = 2,88%, mediana =

2,62% (1,39 – 5,56) e comparado ao 5º dia de trabalho da semana com média = 3,31%, mediana =

3,15 (1,35 – 6,17), verificamos uma diferença estatisticamente significante entre os grupos no 1º e

5º dia de exposição. Nas análises de cada sítio CpG, foram avaliados 7 sítios para o gene CDKN2A,

sendo que 4 sítios apresentaram diferenças estatísticas significantes entre os 1º e 5º dia de coleta,

sendo eles os sítios 1 (p= 0,02), sítio 4 (p=0,06), sítio 5 (p=0,01) e sítio 6 (p=0,008). Também foi

observado a média maior com valores significantes na metilação do DNA no grupo exposto no 5º

dia de exposição (p=0,04), o que possivelmente nos leva a considerar que um curto tempo de

exposição pode alterar o nível de metilação do DNA desses trabalhadores (Tabela 18). Estes dados

confirmam com os achados encontrados nas análises do primeiro grupo (caso x controle), onde a

região promotora de gene CDKN2A apresenta níveis de metilação significantes entre os grupos.

45

Tabela 17 - Análise da metilação do DNA da região promotora dos genes MGMT, RASSF1A, APC, MLH1 e sequências ALU e LINE-1 em trabalhadores expostos no 1º e 5º dia da semana.

Gene

CpG N Expostos 1º dia/semana

N Expostos 5º dia/semana

P Média(SD) Mediana Max-Min Média(SD) Mediana Max-Min

MG

MT

Sítio 1 38 21,67(4,17) 21,46 13,01 - 30,68

38 21,70(4,11) 21,73 11,99 - 31,11

0,94ᵃ

Sítio 2 38 13,07(3,15) 12,93 7,04 - 22,06

38 12,85(2,77) 12,72 7,73 - 20,98

0,56ᵃ

Sítio 3 38 9,69(2,02) 9,40 5,30 - 14,13

38 9,21(2,21) 9,19 5,04 - 13,66

0,13ᵃ

Sítio 4 38 7,12(1,57) 7,18 3,93 - 10,36

38 6,65(1,77) 6,46 3,73 - 10,74

0,08ᵃ

Sítio 5 38 7,49(2,13) 7,04 3,62 - 12,71

38 7,26(2,18) 6,82 3,74 - 13,00

0,40ᵇ

Sítio 6 38 5,69(2,08) 5,46 0 - 10,15

38 5,52(1,76) 5,68 0 - 8,75

0,49ᵃ

Sítio 7 38 8,89(2,39) 8,63 3,85 - 14,08

38 8,83(2,14) 9,04 4,11 - 13,32

0,80ᵃ

Sítio 8 38 12,95(4,55) 11,67 7,23 - 24,64

38 12,01(4,55) 10,23 7,13 - 23,47

0,11ᵇ

Média 38 10,78(2,13) 10,61 5,80 - 14,84 38 10,54(1,97) 10,46 5,78 - 14,97 0,36ᵃ

RA

SSF1

A

Sítio 1 38 0,55(0,98) 0,00 0 - 3,60

38 0,56(1,02) 0,00 0 - 3,71

0,75ᵇ

Sítio 2 38 3,54(1,82) 3,18 0 - 9,02

38 3,48(2,16) 2,96 0 - 9,67

0,84ᵇ

Sítio 3 38 0,78(1,12) 0,00 0 - 4,47

38 0,43(0,80) 0,00 0 - 2,89

0,03ᵇ*

Sítio 4 38 3,10(1,51) 2,72 0 - 6,97

38 2,71(1,50) 2,66 0 - 6,66

0,07ᵇ

Sítio 5 38 0,71(0,99) 0,00 0 - 3,67

38 0,88(1,06) 0,92 0 - 3,64

0,42ᵇ

Sítio 6 38 2,04(1,87) 1,96 0 - 6,70

38 1,86(1,74) 1,82 0 - 6,58

0,42ᵇ

Sítio 7 38 0,89(1,06) 0,00 0 - 3,72

38 0,83(0,90) 1,10 0 - 3,00

0,68ᵇ

Média 38 1,62(1,19) 1,21 0 - 4,69 38 1,32(1,28) 1,10 0 - 5,05 0,10ᵇ

AP

C

Sítio 1 38 3,25(1,61) 3,04 0 - 7,05

38 3,01(1,49) 2,58 0 - 7,61

0,39ᵇ

Sítio 2 38 1,93(2,21) 1,76 0 - 13,79

38 1,40(1,09) 1,61 0 - 3,51

0,29ᵇ

Sítio 3 38 1,81(1,23) 2,03 0 - 3,99

38 1,87(1,09) 1,90 0 - 4,68

0,94ᵇ

Média 38 2,33(1,24) 2,24 0 - 5,40 38 2,09(1,12) 2,01 0 - 4,73 0,34ᵃ

MLH

1

Sítio 1 38 4,38(1,33) 4,32 0 - 7,10

38 3,91(2,26) 4,65 0 - 7,96

0,92ᵇ

Sítio 2 38 2,99(1,49) 3,23 0 - 5,61

38 3,00(1,83) 3,63 0 - 6,26

0,57ᵇ

Sítio 3 38 3,43(1,45) 3,69 0 - 6,52

38 3,51(1,81) 3,86 0 - 7,49

0,22ᵇ

Sítio 4 38 5,52(1,60) 5,46 0 - 8,56

38 5,36(2,64) 5,57 0 - 11,15

0,80ᵇ

Sítio 5 38 5,45(1,58) 5,24 0 - 8,25

38 5,89(3,03) 5,71 0 - 14,03

0,08ᵇ

Sítio 6 38 3,31(2,38) 3,24 0 - 7,54

38 2,68(2,13) 2,89 0 - 7,88

0,37ᵇ

Média 38 4,18(1,25) 4,12 1,03 - 6,50 38 4,06(1,78) 4,38 0 - 8,64 0,70ᵇ

ALU

Sítio 1 38 86,38(1,35) 86,55 83,20 - 89,32

38 85,74(1,44) 86,03 81,17 - 87,76

0,004ᵇ*

Sítio 2 38 89,36(1,12) 89,29 85,93 -91,91

38 89,26(1,22) 89,22 85,82 - 92,55

0,62ᵃ

Sítio 3 38 89,74(2,97) 89,96 83,23 - 96,35

38 89,56(3,16) 89,16 83,83 - 97,47

0,79ᵃ

Sítio 4 38 89,49(0,62) 89,45 87,77 - 90,71

38 89,40(0,83) 89,55 85,85 - 90,68

0,84ᵇ

Média 38 88,44(2,21) 88,70 77,30 - 91,64 38 88,49(1,41) 88,60 84,17 - 91,83 0,34ᵇ

LIN

E-1

Sítio 1 39 75,13(1,21) 75,02 72,84 - 77,86

39 74,89(1,46) 74,64 72,30 - 78,12

0,18ᵇ

Sítio 2 39 67,96(1,04) 67,73 66,05 - 69,93

39 67,75(1,03) 67,42 65,90 - 69,99

0,39ᵇ

Sítio 3 39 57,87(1,45) 57,63 55,71 - 61,10

39 57,78(1,23) 57,56 55,36 - 60,75

0,87ᵇ

Sítio 4 39 64,25(0,84) 64,25 62,24 - 66,56

39 63,80(1,27) 63,94 60,87 - 66,10

0,03ᵇ*

Sítio 5 39 68,55(0,85) 68,46 67,23 - 71,18

39 68,31(0,87) 68,36 66,31 - 70,03

0,33ᵇ

Média 39 66,88(0,89) 66,71 65,52 - 69,12

39 66,86(1,17) 66,54 64,62 - 69,62

0,95ᵇ

ᵃ Test T pareado foi utilizado para análise estatística

ᵇ Wilcoxon (pareado) foi utilizado para a análise estatística

* Significância estatística

46

Tabela 18 - Análise da metilação do DNA da região promotora do gene CDKN2A em trabalhadores expostos no 1º e 5º dia da semana.

CpG N Expostos 1º dia/semana

N Expostos 5º dia/semana

P Média(SD) Mediana Min-Max Média(SD) Mediana Min-Max

Sítio 1 38 2,39(1,09) 1,87 1,13 - 5,29

38 2,80(1,23) 2,52 0,75 - 5,44

0,02ᵇ *

Sítio 2 38 3,87(1,64) 3,40 1,22 - 8,04

38 4,28(1,91) 4,20 1,07 - 8,79

0,36ᵇ

Sítio 3 38 1,65(1,01) 1,50 0 - 4,62

38 1,84(1,25) 1,62 0 - 5,22

0,42ᵇ

Sítio 4 38 3,40(0,85) 3,49 1,45 - 5,74

38 3,86(1,17) 3,62 1,14 - 6,15

0,06ᵃ *

Sítio 5 38 3,61(1,31) 3,29 1,13 - 6,69

38 4,35(1,47) 4,24 1,33 - 7,10

0,01ᵃ *

Sítio 6 38 1,14(0,80) 1,08 0 - 3,13

38 1,61(1,00) 1,33 0 - 5,24

0,008ᵇ *

Sítio 7 38 4,07(1,51) 3,65 1,13 - 8,36

38 4,47(1,41) 4,52 1,26 - 7,03

0,10ᵇ

Média 38 2,88(1,01) 2,62 1,39 - 5,56 38 3,31(1,15) 3,15 1,35 - 6,17 0,04ᵇ *

* Significância estatística ᵃ Teste T pareado foi utilizado para análise estatística

ᵇ Wilcoxon (pareado) foi utilizado para análise estatística

47

6 DISCUSSÃO

A indústria da construção civil continua a ser uma das principais fontes de emprego nos

países industrializados. Trabalhadores da construção podem ser agrupados em, qualificados, tais

como, pintores, carpinteiros, encanadores, eletricistas e trabalhadores de ferro, e não

qualificados, "operários", que executam uma variedade de tarefas de trabalho em apoio. Tais

trabalhadores são expostos a numerosos agentes físicos e químicos, como o amianto, sílica, outras

poeiras, solventes e outros produtos químicos116. Desde 1990, vários estudos de coorte realizados

em diferentes países encontraram resultados significativos de mortalidade para o câncer de

pulmão entre os trabalhadores da construção civil117. Um grande número de exposições

comumente encontrados no ambiente da indústria da construção têm demonstrado um possível

risco para o desenvolvimento de câncer, incluindo o de pulmão, entretanto, muitos destas

exposições não possuem avaliação para o risco de câncer. A metilação do DNA é uma modificação

epigenética que desempenha um papel essencial no estabelecimento da identidade celular

influenciando na expressão dos genes118. Sabe-se que este processo de metilação do DNA pode

sofrer alterações frente a fatores ambientais, bem como em populações expostas

ocupacionalmente.

No presente estudo nós avaliamos o perfil de metilação do DNA da região promotora dos

genes APC, RASSF1A, CDKN2A, TP53, MGMT, MLH1 e das sequências repetitivas ALU e LINE-1 em

leucócitos de sangue periférico dos trabalhadores da construção civil, utilizando-se o método de

pirosequenciamento que tem a vantagem de outros ensaios por produzir medidas individuais em

mais de um dinucleotídeo CpG, refletindo mais precisamente a metilação do DNA na região

estudada. Portanto, esse método foi escolhido por ser um ensaio quantitativo e qualitativo, e por

também apresentar controle para eficácia da conversão de bissulfito.

Os genes de interesse em nosso estudo estão envolvidos em controle do ciclo celular

(CDKN2A), invasão e metástase (APC), apoptose (TP53), via sinalização RAS (RASSF1A), via de

reparo e erros na replicação (MLH1), enzima de reparo e defesa de efeitos citotóxicos e

carcinogênicos (MGMT) e todos eles tem mostrado os níveis de metilação alterados no sangue de

pacientes com câncer de pulmão82,103. Considerando a primeira análise realizada comparando os

trabalhadores da construção com o grupo controle sem exposição, os níveis de metilação dos

genes MGMT, RASSF1A, TP53 e a sequência ALU, não foram encontrados valores significativos

entre os grupos. Somente os genes CDKN2A, MLH1, APC e a sequência LINE-1 foram significativos

48

nas análises entre o grupo caso x controle. Hossain et al.107 avaliaram os efeitos epigenéticos de

exposição ao arsênio nos genes relacionados a câncer, entre eles, CDKN2A, MLH1 e na sequência

repetitiva LINE-1 em indivíduos que tenham sido expostos através da ingestão de água. Foi

verificado que a exposição ao arsênio, aumenta os níveis de metilação do DNA dos genes CDKN2A

e MLH1 e diminui os níveis de metilação da sequência repetitiva LINE-1. Além disso, neste estudo

com as análises de regressão linear múltipla foi possível uma associação positiva entre a fração de

arsênio dosado na urina e a metilação de p16. Em nossos resultados, não encontramos uma

associação significativa quando correlacionamos certas substâncias presentes no ambiente de

trabalho da construção civil aos níveis de metilação da região promotora de CDKN2A. Por outro

lado, para os níveis de metilação do gene MLH1 foram encontradas associações significativas para

os indivíduos expostos ao concreto e ao pó de madeira.

O gene CDKN2A é um regulador do ciclo celular e hipermetilação deste gene tem sido

encontrada em tumores de cólon, do fígado, da pele, bem como em lesões pré-malignas119-120,121-

122-107. Adicionalmente, a hipermetilação de CDNK2A tem sido retratada não somente em tecidos

tumorais, mas também, em leucócitos do sangue periférico em indivíduos expostos a arsênio,

cromato, tabaco, radônio e ao material particulado contendo HPAs e radiação107-123,124-125-126-82.

Nossos resultados corroboram com estes estudos e foi verificado hipermetilação do gene CDKN2A

em leucócitos do sangue periférico no grupo exposto ao ambiente de trabalho da construção civil

em relação ao grupo controle.

O MLH1 é um componente importante na manutenção de estabilidade genômica e é

membro de um conjunto de genes conhecidos como os genes de reparação de emparelhamentos

incorretos (MMR). A metilação do gene MLH1 é relacionado no desenvolvimento câncer gástrico e

colorretal127-128,129-107. Como descrito anteriormente os níveis de metilação do gene MLH1 foram

significantes para os indivíduos expostos ao arsênio. No trabalho de Wu et al.103 foi analisado a

instabilidade cromossômica, avaliada por micronúcleos, e a metilação da região promotora do

gene MLH1 de trabalhadores expostos ao cloreto de vinila (plástico), onde o gene MLH1 não

apresentou valores significativos para indivíduos expostos e que apresentavam maiores danos

cromossômicos. Contrariamente aos nossos resultados onde os níveis de metilação do gene MLH1

foram significantes nas análises caso x controle.

No supressor tumoral APC foi verificado em nossos resultados a presença dos maiores níveis

de metilação no grupo de trabalhadores da construção civil quando comparado ao grupo controle.

No gene APC ocorre hipermetilação em estágios iniciais da tumorigénese e é um processo

49

estudado em câncer de pulmão82. No estudo desenvolvido por Ali et al.130 foi detectado níveis de

metilação aumentados nos supressores tumorais APC, MLH1 e CDKN2A em pacientes com câncer

de pulmão e com confirmado histórico de exposição ao crômio (trabalhadores da indústria),

comparado a pacientes com câncer de pulmão sem o mesmo histórico de ocupação. Os autores

sugeriram que o câncer de pulmão provocado pela exposição ao crômio é ligado a progressiva

metilação de alguns supressores tumorais. Ding et al.131 verificou que em pulmão de ratos

expostos a mistura de MP do trafego de veículos de acordo com o aumento do número de dias de

exposição, ocorreu o aumento dos níveis de metilação dos genes APC e CDKN2A e diminuição dos

níveis de metilação na sequência repetitiva LINE-1. Nossos resultados também encontraram

aumento da metilação do DNA nestes supressores tumorais e uma diminuição nos níveis de

metilação significativa de LINE-1 nos trabalhadores da construção civil expostos a uma mistura de

agentes no ambiente de trabalho. Estes dados sugerem que o conjunto de agentes no ambiente

de trabalho podem estar relacionados com as alterações nos níveis de metilação do DNA. Além

disso, essa mistura pode estar relacionada a instabilidade genômica, conforme descrito por Ramos

et al.132 que verificou em trabalhadores da construção civil uma maior frequência de micronúcleos

quando comparado a um grupo sem exposição.

Elementos repetitivos LINE-1 são retrotransposons altamente repetidos no genoma e seu

nível de metilação em sítios CpGs podem ser usados como uma medida da metilação global133.

Estudos têm utilizado metilação de LINE-1 como um biomarcador de susceptibilidade à câncer134.

A hipometilação de LINE-1 em leucócitos tem sido associado a um risco aumentado de vários tipos

de câncer135. Salas et al.133, avaliaram indivíduos expostos a trihalometano, uma classe de

subprodutos de desinfecção (solventes), e sugeriram uma associação positiva entre os níveis de

metilação de LINE-1 e a exposição a esse solvente.

No presente estudo nós avaliamos o perfil de metilação do DNA da região promotora dos

genes APC, RASSF1A, CDKN2A, TP53, MGMT, MLH1 e das sequências repetitivas ALU e LINE-1 em

leucócitos de sangue periférico dos trabalhadores da construção civil no primeiro dia da semana

de trabalho e no quinto dia. Somente obtivemos significância estatística nesta análise para o gene

CDKN2A, que apresentou maiores níveis de metilação no quinto dia de exposição. Para estas

análises optamos por um curto período de tempo de exposição dos trabalhadores ao ambiente de

trabalho da construção civil. Além disso, as análises com este grupo proporcionam a verificação do

nível de metilação do DNA dos indivíduos trabalhando no mesmo local de trabalho sem

interferentes de outros participantes que não tem a exposição ou com características

50

socioeconômicas diferentes. Hou et al.82 demonstraram em trabalhadores de fundição expostos

ao material particulado rico em partículas metálicas, que os níveis de metilação dos genes APC e

CDKN2A foram significativamente maiores no quarto dia de exposição ao ambiente de trabalho

quando comparado com o primeiro dia da semana (baseline). Existem evidências em seres

humanos entre as rápidas alterações na metilação do DNA frente as exposições ambientais, como

já discutido acima. Tais alterações podem persistir ao longo do tempo, até mesmo na ausência das

condições que as estabeleceram e acumular-se em resposta à exposição contínua.

Byun et al.112 realizaram um estudo de estabilidade temporal de vários marcadores

epigenéticos, em trabalhadores expostos ao MP, avaliando o 1° e 4° dia de trabalho da semana.

Foi demonstrado que a estabilidade do perfil de metilação do DNA é dependente do marcador

testado e também associado com as características das sequencias analisadas. Ainda neste estudo

APC, CDKN2A e CDH13 demonstraram pequenas diferenças estatisticamente significantes entre o

1° e o 4° dia. Nossos resultados foram encontrados somente alterações nos níveis de metilação do

gene CDKN2A, sugerindo que no ambiente da construção civil foi possível detectar alterações no

processo de metilação em curto período de tempo. Além disso, nossos resultados não podem ser

aplicados a mudanças progressivas e lentas na metilação do DNA, tais como, as associadas com o

envelhecimento112. A realização de estudos com maior número de tempos ao longo da exposição

podem fornecer achados mais consistentes sobre alterações acumulativas de longo prazo.

Neste trabalho nossos resultados foram inconsistentes para a grande maioria dos sítios CpG

analisados, sendo as diferenças encontradas em sítios isolados para cada gene, estes foram

chamados de Hot CpG sites. Estes resultados sugerem que existem hot spots, ou seja, CpG que

respondem aos estímulos tóxicos ambientais. Yang et al.136 avaliaram em trabalhadores expostos

aos HPAs que em 35 sítios CpG analisados na região promotora do gene CDKN2A foi verificado que

22 sítios CpG foram hipermetilados. Estes sítios estavam localizados em uma região a

aproximadamente a 230 pb do sitio de iniciação do gene e os autores sugerem que estes sítios é

que estão participando da regulação da expressão genica.

No estudo realizado por He et al.137, foi avaliado os níveis de metilação do gene RASSF1A no

sangue periférico de indivíduos expostos aos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Foram

avaliados 87 sítios CpG e somente 5 foram hipermetilados nos trabalhadores expostos e estes

foram designados como hot CpG sites. Além disso, foi confirmado a hipermetilação destes sítios e

a diminuição da expressão de RASF1A in vitro em linfócitos humano e na linhagem celular de

pulmão HBE expostas a HPAs, dessa forma, confirmando a participação destes hot CpG sites na

51

regulação da transcrição. Sendo assim, a identificação de hot CpG sites para determinados genes

podem ser cruciais para afinidade de ligação de fatores de transcrição. Dessa forma, para os genes

em nosso trabalho que demonstraram diferenças estatísticas significantes e que foi possível

identificar os hot CpG sites, foi realizada uma análise de busca de motifs nas sequencias analisadas

e verificou-se vários sítios ligantes de fatores de transcrição, como podemos observar no anexo F.

Como mencionado acima em nossas observações, nossos resultados demonstram que a

detecção dos níveis de metilação do DNA em genes supressores tumorais, bem como, em

elementos repetitivos LINE-1, em leucócitos do sangue periférico, podem ser um valoroso

indicador de especificas exposições e efeitos adversos a saúde. Além disso, a identificação de

níveis alterados de metilação do DNA podem ser utilizados como potenciais biomarcadores para

detecção de alterações em indivíduos expostos ocupacionalmente. Estudos futuros devem ser

realizados para comprovar nossos achados. Análises in vitro, utilizando cultura de linfócitos e

linhagem celular de pulmão expostas ao MP captado no ambiente da construção civil, podem

elucidar os nossos achados sobre o perfil de metilação dos genes CDKN2A, APC, MLH1 e também

comprovar a influência na regulação da expressão destes genes. Ainda pretendemos avaliar o

perfil de metilação do DNA destes genes em pacientes com câncer de pulmão e com reconhecido

histórico de ocupação por longo período de tempo no ambiente da construção civil, e compara-los

com indivíduos com câncer sem este histórico. Dessa forma, relacionando o papel destes

resultados na carcinogênese.

52

7 CONCLUSÕES

Com base em nossos dados podemos concluir que:

1) Foi possível pela aplicação do questionário, caracterizar o ambiente da construção civil e

correlacionar estes dados com os níveis de metilação do DNA.

2) Diante dos nossos achados, não encontramos alterações nos níveis de metilação na

região promotora dos genes TP53, MGMT, RASSF1A e da sequência repetitiva ALU.

3) Foi possível verificar alterações nos níveis de metilação dos genes CDKN2A, MLH1, APC e

da sequência repetitiva LINE-1 em trabalhadores da construção civil comparados ao

grupo controle.

4) Além disso, foi encontrado alterações no perfil de metilação da região promotora do

gene CDKN2A no grupo de trabalhadores da construção civil durante curto tempo de

exposição.

5) Nossos resultados sugerem que o ambiente da construção civil pode influenciar no perfil

de metilação de genes envolvidos no processo de carcinogênese e também pode levar à

alterações na metilação global, proporcionando instabilidade genômica.

53

REFERÊNCIAS

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Anexo A – Questionário sócio-demográfico aplicado aos grupos

63

64

65

66

67

Anexo B – Condições estabelecidas de ciclagem da PCR dos genes supressores tumorais e

sequências repetitivas (°C).

Etapas APC MLH1 CDKN2A TP53 RASSF1A MGMT

Denaturação 95° - 15' 95° - 15' 95° - 15' 95° - 15' 95° - 15' 95° - 15'

Denaturação 95° - 30"

50

ciclos

95° - 30"

50

ciclos

95° - 30"

40

ciclos

95° - 30"

40

ciclos

95° - 30"

40

ciclos

95° - 20"

45

ciclos

Anelamento 55° - 30" 51° - 30" 65° - 30" 58° - 30" 60° - 30" 53° - 20"

Extenção 72° - 30" 72° - 30" 72° - 30" 72° - 30" 72° - 30" 72° - 20"

Extenção 72° - 10' 72° - 10' 72° - 10' 72° - 10' 72° - 10' 72° - 5' Incubação 4° - ∞ 4° - ∞ 4° - ∞ 4° - ∞ 4° - ∞ 4° - ∞

Etapas ALU LINE

Denaturação 95° - 10' 95° - 15'

Denaturação 95° - 30" 5

0 ciclo

s 95° - 30"

50

ciclos

Anelamento 49° - 30" 58° - 30"

Extenção 72° - 30" 72° - 30"

Extenção Final 72° - 10' 72° - 10'

Incubação 18° - ∞ 18° - ∞

68

Anexo C - Sequência dos primers e região analisada dos genes analisados

Gene Primers T°C Amplicon

(pb) Sequência Analisada

APC

Foward - TTTTGTTTGTTGGGGATTG Reverse Biot. - CTCCAACACCTACCCCATTT Sequenciamento – GGGGTTTTGTGTTTTA

55 311 TTGC/TGGAGTGC/TGGGTC/TGGGAAGC/TGGAG

TP53

Foward Biot. - TTAGGAGTTTATTTAATTTAGGGAAG Reverse - TATCCAACTTTATACCAAAACCTC Sequenciamento - TCCAAAAAACAAATAACTACTAAACTC

58 220 CG/AAAAACACTTTACG/ATTCG/AAACTAAAAACG/ATACT

TT

RASSF1A

Foward - TTAGTGGGTAGGTTAAGTGTGTTG Reverse Biot. - TACCCTTCCTTCCCTCCTTC Sequenciamento - AAAGTTGGTTTTTAGAAATA

60 198 C/TGGGTATTTTC/TGC/TGTGGTGTTTTGC/TGGTC/TGTC/T

GTC/TGTTGTG

ALU

Foward - AGATTATTTTGGTTAATAAG Reverse Biot. - AACTACAACTACAATAAC Sequenciamento - GTTTGTAGTTTTAGTTATT

49 254 C/TGGGAGGTTGAGGTAGGAGAATGGC/TGTGAATTC/TGG

GAAGC/TGGAGTTTGTAGTGAGT

MLH1

Foward - TTTAGGAGTGAAGGAGGT Reverse Biot. - CCCTATACCTAATCTATC Sequenciamento -GTTTTGAGTAGAGTTTTATTAGGGT

51 173 C/TGC/TGC/TGTTC/TGTC/TGTTC/TGTTATATATC/TGTT

LINE-1

Foward Biot - TAGGGAGTGTTAGATAGTGG Reverse - AACTCCCTAACCCCTTAC Sequenciamento - CAAATAAAACAATACCTC

58 120 G/ACCCTACTTCG/AACTCG/ACG/ACACG/AATAC

CDKN2A

Foward - GAGGGGTTGGTTGGTTATTAGA Reverse Biot - TACAAACCCTCTACCCACCTAAAT Sequenciamento - TGGTTATTAGAGGGTG

65 262 GGGC/TGGATC/TGC/TGTGC/TGTTC/TGGC/TGGTTGC/TG

GAGA

MGMT

Foward - GGTATTAGGAGGGGAGAGATT Reverse Biot - TACCAAATAACCCCTACCTTTTCCTATCAC Sequenciamento - AGTAGGATAGGGATTTTTATTAAG

53 187 C/TGGGC/TGTC/TGTTTTAC/TGATTTTC/TGC/TGC/TGTTTT

TAGGATTATTC/TGGGTA

69

Anexo D – Sequência genômica dos genes de acordo com o banco de dados da UCSC

Gene APC

Gene TP53

Gene RASSF1A

70

Gene CDKN2A

Gene MGMT

Gene MLH1

71

Anexo E – Matriz de exposição aplicado aos trabalhadores da construção.

Areia seca

Metal

Aço doce

Ferro fundido

cobre

Bronze

Cromo

Níquel

Alumínio

Outros

Carvão em pó

Concreto

Sílica livre

Madeira

Asbesto ou amianto

Fuligem

Motores a gasolina

Motores a álcool

Motores a diesel

Combustão de coque

Combustão de

carvão

Queima de plástico

Queima de madeiraQueima de

combustívelHidrocarbonetos

policíclicos

aromáticos (HPAs)

Outros

HO

RAS/

SEM

AN

A

EXPOSIÇÃO

Luva

s

Más

cara

Capa

cete

Roup

as

long

as

POEI

RAS

COM

BUSTÃ

O e

SU

BPRO

DU

TOS

DE

COM

BUSTÃO

Sim

Não

OCUPAÇÃO ANTERIOR

POR

QU

AN

TOS

AN

OS?

HO

RAS/

SEM

AN

A

Capa

cete

Roup

as

long

as

OCUPAÇÃO ATUAL

Não

EPI

Empr

esa

forn

ecia

?

Fazi

a us

o

corr

eto?

Ócu

los

EPI

Empr

esa

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ece?

Faz

uso

corr

eto?

Luva

s

Ócu

los

Más

cara

Sim

POR

QU

AN

TOS

AN

OS?

72

Aguarrás

Solventes clorados

Benzeno

Thinner

Querosene

Creosoto

Gasolina

Asfalto e betumePiche ou alcatrão de

hullha

Ácidos

Colas

Álcool

Produto de limpezaProdutos

desinfetantes

Hipoclorito de sódio

Óleos minerais

Resinas sintéticas

Agrotôxicos

Parafinas

Ionizantes

Não-Ionizantes

Ultravioleta

Sim

Não

POR

QU

AN

TOS

AN

OS?

HO

RA

S/

SEM

AN

A

Empr

esa

forn

ecia

?

Más

cara

Capa

cete

Rou

pas

long

as

Sim

Não

POR

QU

AN

TOS

AN

OS?

HO

RA

S/

SEM

AN

A

Empr

esa

forn

ece?

Faz

uso

corr

eto?

RAD

IAÇÃ

OSO

LVEN

TES

SUBS

TÂN

CIA

S

Luva

s

Ócu

los

Fazi

a us

o

corr

eto?

Luva

s

Ócu

los

Más

cara

Capa

cete

Rou

pas

long

asEXPOSIÇÃO

OCUPAÇÃO ANTERIOR EPI OCUPAÇÃO ATUAL EPI

73

Anexo F – Parecer consubstanciado do CEP

74

75

76

77

78

79

80

Anexo G – Análise dos motifs das regiões promotoras dos genes CDKN2A, MLH1 e APC

utilizando o banco de dados JASPAR.

Gene APC

81

Gene MLH1

82

Gene CDKN2A