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ISMAEL NONATO JUNIOR
PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos
taurus indicus) COM A ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS IN
VIVO E IN VITRO
Londrina - Paraná 2005
ISMAEL NONATO JUNIOR
PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos
taurus indicus) COM A ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS IN
VIVO E IN VITRO
Dissertação apresentada ao programa
de Pós-graduação em Ciência Animal, Área de concentração Sanidade Animal, da Universidade Estadual de Londrina como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda
Londrina - Paraná 2005
PRODUÇÃO DE EMBRIÕES EM VACAS NELORE (Bos
taurus indicus) COM A ASSOCIAÇÃO DOS MÉTODOS IN
VIVO E IN VITRO
Candidato: Ismael Nonato Junior
Comissão Examinadora:
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda
Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia
Dr. José Lázaro da Rocha
UEL Londrina – Paraná
2005
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a meus pais Ismael Nonato e Maria de Lourdes Nonato, que são minha
luz, guiando-me em direção aos meus sonhos, e sempre estiveram presentes sem medir
esforços. Aos meus irmãos Juliana Nonato e Paulo André Nonato, que sempre me serviram
de exemplo de determinação. Sem vocês nada seria possível!
AGRADECIMENTOS
A Deus em primeiro lugar, por me dar o privilégio da existência para poder caminhar em
busca dos meus sonhos.
A meus pais e irmãos, que nunca mediram esforços e sempre estiveram presentes na busca
de meus objetivos.
A minha amada Maria Cláudia, pelo otimismo e carinho em momentos que necessitei de
apoio.
A meus avós, tios, primos e amigos, que sempre compreenderam minha ausência em busca
de um sonho.
Ao meu dileto orientador Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda, pelo apoio e amizade na
realização deste trabalho.
Ao médico veterinário José Henrique Fortes Pontes, que me orientou, apoiou e se revelou
um grande amigo.
Aos colegas Bruno Valente Sanches e Fabiana de Almeida Rufino, que foram leais
companheiros e não mediram esforços em me ajudar.
A todos os funcionários da Fazenda São Francisco e In Vitro Brasil, que me deram
condições para realização deste trabalho.
A todos os alunos, funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciência
Animal.
Minha eterna gratidão a todos vocês!
NONATO JUNIOR, Ismael. Produção de embriões em vacas Nelore (Bos taurus indicus) com a associação dos métodos in vivo e in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Dissertação de Mestrado em Ciência Animal).
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda
RESUMO
Este trabalho comparou os métodos in vivo e in vitro associados para
obtenção de embriões na raça Nelore, por meio do número de embriões produzidos, taxas
de gestação, morte embrionária e avaliação da razão macho e fêmea dos fetos. Trinta
doadoras foram submetidas a 96 sessões de aspiração folicular e produção in vitro de
embriões (3,2/doadora) e 43 colheitas de embriões (1,43/doadora). Foram obtidos 910
embriões in vitro (9,48/aspiração) e 289 embriões in vivo (6,72/colheita - P<0,05). Obtêve-
se 341 gestações pelo método in vitro (3,55/aspiração) e 132 pelo método in vivo
(3,07/colheita - P<0,05). A mortalidade embrionária foi avaliada pela diferença das taxas de
gestação aos 30 e 60 dias, com percentuais de 10,56% para embriões produzidos in vitro e
9,09% para os obtidos in vivo (P=0,12). A relação macho:fêmea foi de 52,48% para machos
e 47,52% para fêmeas, pelo método in vitro (P=0,07), e 1:1 pelo método in vivo. A média
mensal de gestações obtidas por doadora foi de 2,7 para o método in vitro e 1,9 para o
método in vivo. Os resultados obtidos permitem concluir: 1) vacas Nelore produziram
maior número de embriões pelo método in vitro em comparação ao método in vivo 2) as
taxas de gestação aos 30 e 60 dias foram mais altas para os embriões obtidos in vivo
(132/289; 120/289) do que para os embriões produzidos in vitro (341/910; 305/341) 3) o
método de produção in vitro resultou em maior número de gestações por doadora em um
mesmo período de tempo 4) a relação macho-fêmea foi similar nos dois métodos estudados
5) a utilização intercalada das técnicas de produção de embriões in vitro e in vivo pode ser
vantajosa, pela possibilidade de agregação dos aspectos favoráveis de cada uma delas.
Palavras-chave: produção in vitro de embriões; colheita de embriões; gestação
NONATO JUNIOR, Ismael. Embryo production in Nelore (Bos taurus indicus) cows
with the association of the methods in vivo and in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Msc
Dissertation).
Adviser: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda
ABSTRACT
In the present work were compared the in vitro embryo production with
conventional approach method associated to obtain embryos in Nelore breed, evaluating
number of producted embryos, pregnancy rates, embryonic mortality and percentage male
vs female of fetus. The donor animals (30) were submitted to 96 ultrasound guided
transvaginal ovum pick-up sessions and in vitro production of embryos (3,2/donor) and 43
embryo collections (1,43/donor). Were obtained 910 in vitro embryos (9,48/session) and
289 in vivo embryos (6,72/collection – P<0,05).The in vitro method yielded 341
pregnancies (3,55/session) and 132 using the conventional method (3,07/collection –
P<0,05).The embryonic mortality was evaluated comparing the pregnancy rate at day 30
and day 60 after transfer, with percentage of 10,56% to in vitro embryos and 9,09% to in
vivo embryos (P=0,12). The IVF approach used in the present study produced 52,48%
males and 47,52% females (P=0,07) while were obtained 50% males : 50% females using
in vivo method. The monthly average of pregnancies obtained per donor was 2,7 to in vitro
method and 1,9 to in vivo technique. The results showed that: 1) Nelore cows produced
higher number of embryos using in vitro method compared with in vivo embryo production
2) pregnancy rates at day 30 and day 60 were higher in the case of in vivo produced
embryos (132/289; 120/289) that to in vitro produced embryos (341/910; 305/910) 3) the in
vitro embryo production method resulted in higher number of pregnancy per donor in the
same period 4) the percentege of males and females was similar in both methods 5) the
alternate utilization of embryo production techniques in vitro and in vivo can be gainful, at
possibility of aggregation of the favourable aspects of them everyone.
Key-words: in vitro embryo production; embryo collection; pregnancy
SUMÁRIO
1- REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 11
1.1 Aspectos importantes das biotecnologias da reprodução ........................ 12
1.2 Referências .............................................................................................. 20
2- OBJETIVOS .......................................................................................................... 29
2.1 Objetivo geral ........................................................................................... 30
2.2 Objetivos específicos .............................................................................. 30
3- ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO ........................................................................ 31
3.1 Resumo .................................................................................................... 32
3.2 Abstract ................................................................................................... 33
3.3 Introdução ............................................................................................... 34
3.4 Material e Métodos .................................................................................. 36
3.4.1 Animais .................................................................................................... 36
3.4.1.1 Preparo dos animais ................................................................................. 37
3.4.2 Produção in vitro dos embriões ............................................................... 37
3.4.2.1 Aspiração Folicular ................................................................................. 37
3.4.2.2 Seleção dos oócitos ................................................................................. 38
3.4.2.3 Maturação dos oócitos ............................................................................ 38
3.4.2.4 Fecundação dos oócitos .......................................................................... 39
3.4.2.5 Desenvolvimento ..................................................................................... 39
3.4.3 Produção in vivo dos embriões ................................................................ 40
3.4.3.1 Superovulação das doadoras .................................................................... 40
3.4.3.2 Colheita dos embriões ............................................................................. 40
3.4.4 Transferência dos embriões .................................................................... 41
3.4.5 Diagnóstico de gestação, avaliação da morte embrionária e sexagem fetal...
................................................................................................................. 41
3.4.6 Análise Estatística ................................................................................... 42
3.5 Resultados ............................................................................................... 42
3.6 Discussão ................................................................................................ 45
3.7 Referências ............................................................................................. 47
4- CONCLUSÕES .................................................................................................. 49
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Produção média de embriões para os métodos in vitro e in vivo ............ Pg. 43
TABELA 2- Taxas de gestação aos 30 e 60 dias para os embriões produzidos in vitro e in
vivo ................................................................................................................................ Pg. 43
TABELA 3- Morte embrionária entre 30 e 60 dias de gestação .................................. Pg. 44
TABELA 4- Relação macho-fêmea para os embriões produzidos in vitro e in vivo ... Pg. 44
TABELA 5- Produção média mensal de gestações por doadora para os métodos in vitro e
in vivo ............................................................................................................................ Pg. 45
LISTA DE ABREVIATURAS
IA – Inseminação artificial
TE – Transferência de embriões
PIV – Produção in vitro
FIV – Fecundação in vitro
MIV – Maturação in vitro
BSA – Albumina sérica bovina
FSH – Hormônio folículo estimulante
BE – Benzoato de estradiol
1. REVISÃO DE LITERATURA
1.1 Aspectos importantes das biotecnologias da reprodução
As modificações na reprodução dos animais possivelmente
ocorrem desde sua domesticação, uma vez que o cativeiro por si
próprio já seria capaz de alterar o comportamento reprodutivo.
Atualmente o homem tem realizado esforços para incrementar a
produtividade na exploração das espécies domésticas, e isto tem
sido verificado de diversas formas: modificações na nutrição,
instalações, manejo sanitário e reprodutivo (BOLS, 1997).
Em relação aos machos da espécie bovina, um grande avanço quali e quantitativo no aspecto reprodutivo ocorreu em 1939, quando Phillips tornou viável a inseminação artificial (IA) em larga escala, com o uso de diluidores adequados para o
sêmen e evoluindo com sua congelação em 1949 por Polge et al. (PÉREZ, 1985). As fêmeas bovinas também têm sido alvo de várias pesquisas, para que o
aproveitamento de um número maior de gametas seja possível. Segundo Gordon (2003), as
fêmeas bovinas nascem com mais de 100.000 oócitos em seus ovários, que pelas vias
naturais, podem gerar perto de 0,01% de produtos viáveis, ou seja, um número próximo a
dez descendentes em toda sua vida reprodutiva (BOLS, 1997).
Dentre as alternativas propostas para um maior
aproveitamento dos gametas de vacas e novilhas, destaca-se a
transferência de embriões (TE), que vem sendo usada com
sucesso desde 1958, quando Averill & Rowson fizeram o primeiro
relato de um produto nascido por esta técnica (PÉREZ, 1985).
Sendo inicialmente um procedimento cirúrgico, a TE
posteriormente foi adaptada para uma técnica não invasiva
(GREVE, 1977), e desta forma é utilizada até os dias atuais. Em
um programa de TE, cada doadora pode multiplicar em mais de
três vezes o número de descendentes de sua vida reprodutiva
(BOLS, 1997).
No entanto, a TE apresenta algumas restrições. Relatos de cistos ovarianos,
endometrites e lesões iatrogênicas foram situações observadas em doadoras submetidas
consecutivamente à técnica (BAK et al., 1989). Kruip et al. (1991) observaram uma grande
variação no número de estruturas recuperadas. Tal aspecto parece estar relacionado com os
achados de Meintjes et al. (1995). Estes autores relataram como problemas maiores a
contínua interrupção do ciclo estral e as terapias gonadotróficas, capazes de comprometer a
fertilidade da doadora. Outro aspecto crítico é reportado por Bols et al. (1997), quanto à
variabilidade de respostas ao estímulo gonadotrófico, além da frequente colheita de
estruturas não fecundadas.
A ausência de resposta ao tratamento superovulatório ocorre em aproximadamente
20 a 30% dos animais, enquanto que outros 20 a 30% respondem apenas modestamente e
com baixas taxas de fertilização (< 6 embriões viáveis por colheita). Uma resposta de no
mínimo seis embriões viáveis por colheita tem sido obtida em apenas um terço das
doadoras (REICHENBACH, 2003). Torna-se válido considerar que a colheita de embriões
mostra-se inviável em algumas situações de infertilidade extra-ovariana, como
hidrosalpinge bilateral (BOLS et al., 1996) e nas obstruções uterinas (SENEDA et al.,
2000).
Embora a TE continue sendo amplamente utilizada, o
número de embriões obtidos por colheita tem se mantido estável
desde o início da década de oitenta, de 4,5 a 5, verificando-se
pouca eficiência nas tentativas de se obter mais embriões por
procedimento (HASLER et al., 1995). Desta forma, a produção de
embriões pela técnica de superovulação produz um número
médio inferior a 100 embriões durante toda a vida de uma
doadora (KRUIP et al., 1994).
As limitações da TE impulsionaram a busca por um melhor aproveitamento dos
oócitos bovinos. Um evento importante ocorreu em 1982, quando Brackett et al. relataram
o nascimento do primeiro bezerro obtido pela produção in vitro (PIV) de embriões. A PIV
de embriões, a partir de oócitos de matadouro, tem sido utilizada desde então com
perspectivas promissoras, tendo viabilizado o nascimento de expressivo número de
produtos (GALLI & LAZZARI, 1996).
Apesar da possibilidade de se obter mais descendentes de doadoras que vieram ao
óbito, a PIV de embriões a partir de oócitos de matadouro possui limitações, como o tempo
de transporte do matadouro ao laboratório, o desconhecimento acerca do estado sanitário,
do padrão hormonal dos animais e, principalmente, a impossibilidade de repetição da
técnica para um mesmo animal, já que os ovários são obtidos com o óbito do mesmo.
Segundo Pieterse et al. (1988), a recuperação de oócitos é a base do programa de
fecundação in vitro (FIV) e com as limitações dos oócitos obtidos de matadouro,
alternativas foram propostas para o aproveitamento de oócitos de animais vivos (BOLS et
al. 1995; BROGLIATTI & ADAMS, 1996).
Valendo-se das possibilidades da ultra-sonografia, Callesen et al. (1987) relataram
pela primeira vez o uso desta técnica para a obtenção de oócitos bovinos. Pela manipulação
transretal, os ovários foram posicionados dorso-lateralmente na cavidade abdominal,
viabilizando sua visualização com um transdutor de 3.5 MHz posicionado sobre a pele, na
região da fossa paralombar, local de introdução da agulha capaz de puncionar os folículos.
Apesar do êxito deste procedimento, a recuperação de oócitos bovinos com uso da ultra-
sonografia só ganhou grande impulso um ano mais tarde, com nova modificação que tornou
o procedimento de mais fácil e rápida aplicação. Pieterse et al. (1988) alteraram a técnica
descrita para humanos (FEICHTINGER & KEMETER, 1986) e descreveram a aspiração
folicular via transvaginal através da ultra-sonografia, que tornou viável o aproveitamento de
oócitos bovinos, sem as limitações dos procedimentos existentes até então.
Após as primeiras avaliações, a técnica mostrou-se simples e segura, viabilizando a
recuperação, maturação e fecundação de oócitos imaturos, podendo ser repetida várias
vezes em um mesmo animal (KRUIP et al., 1991; PIETERSE et al., 1991). Contudo,
avaliações posteriores em animais submetidos consecutivas vezes à técnica mostraram um
aumento de tecido conjuntivo no parênquima ovariano (RODRIGUES & GARCIA, 2000).
A possibilidade de obtenção de embriões em situações de infertilidade extra-
ovariana motivou vários grupos à realização do procedimento, tendo-se verificado o
nascimento de diversos produtos (LOONEY et al., 1994; HASLER et al. , 1995; BOLS et
al., 1996; SENEDA et al., 2000), confirmando as observações de Dawson (1977), a respeito
de que a maioria das fêmeas bovinas classificadas como inférteis mostrava-se capaz de
produzir gametas viáveis. A aspiração folicular apresentou-se viável para fêmeas com
limitações reprodutivas, e a sua aplicação mostrou-se mais ampla quando utilizada em
fêmeas saudáveis, produzindo quatro vezes mais embriões em relação à TE (KRUIP et al.,
1994), embora com maior custo por embrião (RODRIGUES & GARCIA, 2000).
O ganho genético acumulado obtido em programas de melhoramento animal
através do emprego de tecnologias de embriões foi estimado em 18 a 22% (LOHUIS,
1995). Em torno de 80 a 90% dos embriões bovinos transferidos mundialmente nos últimos
anos foram obtidos através da TE. O restante, 10 a 20% dos embriões transferidos
comercialmente, têm sido produzidos in vitro (THIBIER, 2001; THIBIER, 2002).
Na tentativa de maior exploração do potencial genético das doadoras, vários
grupos vêm associando as técnicas de produção de embriões. Bousquet et al. (1999)
obtiveram resultados semelhantes de produção embrionária com a PIV e a TE, 4,7 e 4,3
embriões viáveis por sessão, respectivamente. A associação entre as técnicas PIV e TE em
vacas da raça Gir, produziu uma média de 3,91 embriões viáveis na TE, e 7,83 embriões
viáveis na PIV (VIANA et al., 2004).
A produção in vitro de embriões é possível em animais jovens, em vacas em início
de gestação, em período pós-parto inicial e em doadoras que não respondem a
superovulação (PEREZ et al., 2000). Katsa & Smorag (1984), trabalharam com ovários de
matadouro e não encontraram diferenças na qualidade dos oócitos entre animais jovens (a
partir de 18 meses) e senis (até 17 anos), embora tenham notado redução na produção de
gametas nos animais mais velhos. Looney et al. (1994) relataram a possibilidade de
aspiração folicular nos animais bastante jovens, e Brogliatti & Adams (1996) obtiveram
oócitos de bezerras com apenas seis semanas de idade com a utilização de um transdutor
adequado. No entanto, os animais bem jovens têm mostrado reduzida competência de seus
oócitos para chegar até blastocisto (REVEL et al., 1995), embora Armstrong et al. (1994)
tenham conseguido resultados animadores com bezerras de apenas três semanas de idade
através do estímulo gonadotrófico. Meintjes et al. (1995) constataram que vacas gestantes
podiam ser submetidas à técnica durante o primeiro trimestre de gestação e, Sauvé (1998)
até o sexto mês de prenhez, sem que fosse notado qualquer prejuízo à gestação ou às vacas.
Parece haver um consenso quanto a condição corporal, em que animais
subnutridos seriam doadores de oócitos com menor capacidade para desenvolverem - se até
blastocisto (LOPES RUIZ et al., 1996) e há indícios de que animais submetidos à situações
de estresse também seriam doadores de oócitos menos competentes (SENEDA et al., 2000).
Dominguez (1995) mostrou melhor recuperação de oócitos em fêmeas da raça Holandesa,
quando comparado com fêmeas zebuínas, enquanto Dayan et al. (1999) relataram altas
taxas de recuperação de oócitos viáveis em fêmeas da raça Nelore.
Tamassia et al. (2003) relataram que a doadora influencia a produção de
blastocistos, confirmando os achados de Bousquet et al. (1999), e também demonstraram
que a doação de oócitos e a produção de embriões são fatores independentes. Watanabe et
al. (1998) demonstraram variação entre touros utilizados na PIV de embriões bovinos, de
acordo com a taxa de clivagem e desenvolvimento até blastocisto, porém, não observaram
diferenças nas taxas de eclosão.
O intervalo entre as sessões de aspiração folicular influencia a quantidade e a
qualidade de oócitos colhidos (MERTON et al., 2003). Hasler et al. (1995) observaram uma
tendência para a diminuição do número de oócitos após muitas sessões de aspiração em
uma mesma doadora. Looney et al. (1994) relataram aumento nos números de folículos
aspirados (12,3 contra 8,9) e oócitos recuperados (8,6 contra 6,2), em doadoras com
problemas específicos, tratadas com FSH. Também houve maior produção de embriões
viáveis por aspiração, comparando-se com a média de doadoras não tratadas com FSH
(1,38 contra 0,96).
A fase reprodutiva, incluindo o período gestacional, tem sido alvo de diversos
estudos propostos para apontar um momento mais favorável à realização da aspiração
folicular. Pelo fato do ciclo estral do bovino apresentar geralmente duas a três ondas de
crescimento folicular (BUNGARTZ & NIEMAN, 1994; GINTHER, 2000), podendo
chegar até quatro a cinco ondas sob tratamento com progestágenos (BOLS, 1997), a
dinâmica folicular tem sido analisada na tentativa de se estabelecer relações que permitam
melhor aproveitamento dos oócitos. Bols (1997) observou que os oócitos apresentavam
diferentes capacidades de desenvolvimento, conforme a fase do ciclo estral em que eram
colhidos. Um número maior de embriões foi obtido após cultivo de oócitos recuperados
entre os dias 14 e 16 do ciclo estral, segundo Machatkova et al. (1995). No entanto,
trabalhando com ovários de abatedouro, Smith et al. (1996) analisaram a dominância
folicular, relatando que a produção in vitro de embriões não era afetada pela presença ou
ausência do folículo dominante. Assey et al. (1994) analisaram a ultra-estrutura de oócitos
de folículos dominantes e subordinados, e relataram degenerações prematuras no oócito
dominante, embora Rhodes et al. (1997) não tenham constatado diferenças na competência
para o desenvolvimento entre oócitos obtidos de folículos dominantes ou folículos
subordinados. Boediono et al. (1995) relataram maior competência dos oócitos quando a
punção era realizada em fase luteínica. Resultados semelhantes foram obtidos por Moreno
et al. (1993), descrevendo as doadoras gestantes com maior número de oócitos de boa
qualidade, embora Thonon et al. (1993) e Dayan et al. (1999) tenham mostrado resultados
opostos.
A qualidade dos oócitos, taxa de clivagem e desenvolvimento até blastocisto não
difere entre folículos de diferentes tamanhos, possibilitando aspiração de folículos de
menor diâmetro (SENEDA et al., 2001). As relações entre dinâmica e atresia foliculares
também têm sido estudadas, com relatos de presença de oócitos saudáveis em folículos
claramente atrésicos (KRUIP & DILEMAN, 1982; BLONDIN & SIRARD, 1995;
MERTON et al., 2003). Na TE, a remoção do folículo dominante antes do tratamento de
superovulação melhora o número de embriões viáveis por sessão de 3,9 para 5,4 em vacas
mas não em novilhas (MERTON et al., 2003).
Posteriores à fase laboratorial, problemas nas demais etapas têm sido atribuídos
aos embriões produzidos artificialmente. As taxas de gestação após a transferência de
embriões PIV têm sido geralmente mais baixas em comparação às obtidas com embriões
produzidos pela TE (KRUIP & DEN DASS, 1997; MERTON et al., 2003). Na PIV de
embriões bovinos, obtem-se um maior número de machos em relação a fêmeas, já na TE, os
números são mais próximos. Isto foi confirmado nos achados de Bousquet et al. (1999) que,
para PIV, obtiveram 56,8% de embriões machos, sexados por PCR, 37,5% de embriões
fêmeas e 5,7% de embriões sem sexo conhecido. Com relação aos embriões produzidos in
vivo, 47,3% eram machos, 47,4% fêmeas e 5,0% dos embriões não tiveram seu sexo
conhecido. O aumento na incidência de abortos, prolongamento da gestação, anormalidades
congênitas e uma maior mortalidade perinatal representam as anomalias mais citadas
(WAGTENDONK-DELEEUW et al., 2000).
Combinar PIV e TE representa uma boa opção para se obter um maior número de
embriões viáveis (REICHENBACH, 2003). A utilização de tecnologias de produção de
embriões bovinos maximiza a exploração do potencial das doadoras, buscando um maior
número de descendentes, acelerando a seleção e o melhoramento genético.
1.2 Referências
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
• Avaliar a associação dos métodos in vivo e in vitro para a produção de embriões em
vacas da raça Nelore.
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar o número de embriões produzidos através de cada método
• Avaliar as taxas de gestação e de morte embrionária entre 30 e 60 dias de gestação,
para os embriões obtidos in vivo e in vitro
• Considerar as gestações obtidas por cada método em relação ao intervalo de tempo
• Avaliar a razão macho/fêmea nas gestações produzidas.
3. ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO
NONATO JUNIOR, Ismael. Produção de embriões em vacas Nelore (Bos taurus indicus) com a associação dos métodos in vivo e in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Dissertação de Mestrado em Ciência Animal).
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda
RESUMO
Este trabalho comparou os métodos in vivo e in vitro associados para obtenção de
embriões na raça Nelore, por meio do número de embriões produzidos, taxas de gestação,
morte embrionária e avaliação da razão macho e fêmea dos fetos. Trinta doadoras foram
submetidas a 96 sessões de aspiração folicular e produção in vitro de embriões
(3,2/doadora) e 43 colheitas de embriões (1,43/doadora). Foram obtidos 910 embriões in
vitro (9,48/aspiração) e 289 embriões in vivo (6,72/colheita - P<0,05). Obtêve-se 341
gestações pelo método in vitro (3,55/aspiração) e 132 pelo método in vivo (3,07/colheita -
P<0,05). A mortalidade embrionária foi avaliada pela diferença das taxas de gestação aos
30 e 60 dias, com percentuais de 10,56% para embriões produzidos in vitro e 9,09% para os
obtidos in vivo (P=0,12). A relação macho:fêmea foi de 52,48% para machos e 47,52%
para fêmeas, pelo método in vitro (P=0,07), e 1:1 pelo método in vivo. A média mensal de
gestações obtidas por doadora foi de 2,7 para o método in vitro e 1,9 para o método in vivo.
Os resultados obtidos permitem concluir: 1) vacas Nelore produziram maior número de
embriões pelo método in vitro em comparação ao método in vivo 2) as taxas de gestação
aos 30 e 60 dias foram mais altas para os embriões obtidos in vivo (132/289; 120/289) do
que para os embriões produzidos in vitro (341/910; 305/341) 3) o método de produção in
vitro resultou em maior número de gestações por doadora em um mesmo período de tempo
4) a relação macho-fêmea foi similar nos dois métodos estudados 5) a utilização intercalada
das técnicas de produção de embriões in vitro e in vivo pode ser vantajosa, pela
possibilidade de agregação dos aspectos favoráveis de cada uma delas.
Palavras-chave: produção in vitro de embriões; colheita de embriões; gestação
NONATO JUNIOR, Ismael. Embryo production in Nelore (Bos taurus indicus) cows
with the association of the methods in vivo and in vitro. Londrina : UEL, 2005. (Msc
Dissertation).
Adviser: Prof. Dr. Marcelo Marcondes Seneda
ABSTRACT
In the present work were compared the in vitro embryo production with conventional approach method associated to
obtain embryos in Nelore breed, evaluating number of producted embryos, pregnancy rates, embryonic mortality and percentage
male vs female of fetus. The donor animals (30) were submitted to 96 ultrasound guided transvaginal ovum pick-up sessions and in
vitro production of embryos (3,2/donor) and 43 embryo collections (1,43/donor). Were obtained 910 in vitro embryos
(9,48/session) and 289 in vivo embryos (6,72/collection – P<0,05).The in vitro method yielded 341 pregnancies
(3,55/session) and 132 using the conventional method (3,07/collection – P<0,05).The embryonic mortality was evaluated comparing the pregnancy rate at day 30 and day 60 after transfer,
with percentage of 10,56% to in vitro embryos and 9,09% to in
vivo embryos (P=0,12). The IVF approach used in the present study produced 52,48% males and 47,52% females (P=0,07) while
were obtained 50% males : 50% females using in vivo method. The monthly average of pregnancies obtained per donor was 2,7
to in vitro method and 1,9 to in vivo technique. The results showed that: 1) Nelore cows produced higher number of embryos using in vitro method compared with in vivo embryo production 2) pregnancy rates at day 30 and day 60 were higher in the case of in
vivo produced embryos (132/289; 120/289) that to in vitro produced embryos (341/910; 305/910) 3) the in vitro embryo
production method resulted in higher number of pregnancy per donor in the same period 4) the percentege of males and females was similar in both methods 5) the alternate utilization of embryo
production techniques in vitro and in vivo can be gainful, at possibility of aggregation of the favourable aspects of them
everyone.
Key-words: in vitro embryo production; embryo collection; pregnancy 3.3 Introdução
Com os avanços das biotécnicas reprodutivas, a produção de embriões apresenta-se
em contínua expansão, verificando-se expressivo crescimento na América Latina,
particularmente no Brasil (REINCHENBACH, 2003). Desde o primeiro relato de colheita
de embriões pelo método transcervical (GREVE, 1977) até a descrição da aspiração
folicular transvaginal pela ultra-sonografia (PIETERSE et al., 1988), diversos grupos de
trabalho dedicam-se à busca pela maior eficiência em cada uma dessas técnicas.
Apesar dos embriões produzidos in vivo propiciarem taxas de gestação superiores
às obtidas com os embriões produzidos in vitro, o número de embriões obtidos por colheita
tem se mantido estável desde o início da década de oitenta (4,5 a 5,0) verificando-se pouca
eficiência nas tentativas de se obter mais embriões por procedimento (HASLER et al.,
1995). Além disso, 40-60% das doadoras não respondem ao tratamento superovulatório ou
respondem com números insatisfatórios (REICHENBACH, 2003).
Em decorrência desta limitação, a produção in vitro (PIV) de embriões expandiu-se
nos últimos anos, como método alternativo para aumentar o número de embriões obtidos,
pela possibilidade de se repetir a técnica em um menor período de tempo, além de ser
viável em doadoras com problemas de infertilidade extra-ovariana (BOLS et al., 1996).
Uma maneira para se obter um maior número de embriões em um menor período
de tempo é a associação dos métodos de produção de embriões in vivo e in vitro,
maximizando a exploração do potencial das doadoras, acelerando a seleção e o
melhoramento genético (BOUSQUET et al., 1999).
Visando este objetivo, analisamos a associação dos métodos in vitro e in vivo para a
produção de embriões em vacas da raça Nelore, bem como as taxas de gestação e a morte
embrionária entre 30 e 60 dias de gestação, e a razão macho/fêmea nas gestações
produzidas.
3.4 Material e Métodos
3.4.1 Animais
O experimento foi realizado nas Fazendas São Francisco e Império, nos municípios
de Mogi Mirim/SP e Vargem Grande do Sul/SP, respectivamente, durante o período de
abril de 2003 a abril de 2004.
Vacas da raça Nelore (n=30) de alto valor genético, livres de doenças infecciosas e
reprodutivas, doadoras, não gestantes, com idades variando de 2 a 8 anos (média de 5 anos)
e novilhas cruzadas, livres de doenças infecciosas e reprodutivas, receptoras, foram
utilizadas neste experimento.
Todos os animais foram submetidos intercaladamente às técnicas de colheita de
embriões e aspiração folicular, com intervalo médio de 45 dias. As aspirações foram
realizadas em média 3,2 procedimentos/animal, sendo o mínimo de uma e o máximo de
cinco vezes em cada animal, em um período médio de 4,2 meses / doadora. Em relação à
colheita de embriões, o mínimo foi de uma e o máximo de três, sendo a média 1,4
procedimentos/animal, em um período médio de 2,3 meses / doadora. Cada doadora, nos
procedimentos in vivo e in vitro, foi submetida ao mesmo touro, através de sêmen
congelado de fertilidade comprovada, proveniente de centrais de colheita de sêmen.
3.4.1.1 Preparo dos animais
Antes de cada procedimento, esvaziava-se o reto dos animais e a higienização da
região perineal era feita com água corrente e álcool etílico 70º GL. Para redução dos
movimentos peristálticos e o menor desconforto do animal, eram injetados 5 ml de
lidocaína 2 % no espaço epidural.
3.4.2 Produção in vitro dos embriões
3.4.2.1 Aspiração folicular
Os procedimentos de aspiração folicular transvaginal (PIETERSE et al., 1988)
foram realizados com o auxílio de ultra-som 485 Anser (Pie Medical, Holanda) com
transdutor setorial (convexo) de 7,5 MHz. O transdutor era acoplado em dispositivo próprio
para utilização transvaginal (Ceafepe Tecnologia Veterinária Ltda., Brasil). Para aspiração
dos folículos eram utilizadas agulhas hipodérmicas descartáveis 40 mm x 20 G (Becton
Dickinson Ltda., Brasil) e mangueira de silicone com 2 mm de diâmetro interno e 80 cm de
comprimento. A pressão de vácuo era de 65 a 75 mm de Hg, mantida com uma bomba de
aspiração (Cook, Nova Zelândia). O meio de aspiração era constituído por DPBS
(Nutricell, Brasil) acrescido de 20.000 UI/L de heparina sódica (Liquemine, Roche, Brasil),
mantido à 30 ºC durante a aspiração. Este meio era utilizado para lavagem prévia do
sistema para prevenir a coagulação de sangue. Após a visualização e avaliação numérica, os
folículos eram aspirados em ambos ovários.
3.4.2.2 Seleção dos oócitos
Imediatamente após a aspiração folicular, o material recuperado era lavado em
filtros para colheita de embriões (Em Com) com DPBS (Nutricell, Brasil), e depositado em
placas de petri 90mm x 15 mm (Inlab, Brasil). Os oócitos recuperados eram classificados,
lavados em meio TCM 199 Hepes (Gibco, EUA ) suplementado com 10 % de Soro Fetal
Bovino (Gibco, EUA), 22 µg/mL de piruvato, 0,5 µg/mL de hormônio folículo estimulante
(FSH - Folltropin-V, Vetrepharm, Canadá), e 50 µg/mL de hormônio luteinizante (LH –
APL, Bélgica), e transferidos para criotubos de 2 mL (Corning/Coastar, EUA) onde
permaneciam, durante o transporte até o laboratório, em incubadoras de transporte
(Minitub, Alemanha) à 38 ºC.
3.4.2.3 Maturação dos oócitos
Os oócitos eram colocados em placas de petri 60 mm x 15 mm (Corning, EUA), em
gotas de 100 µL de meio TCM 199 Bicarbonato (Gibco, EUA) suplementado com 10 % de
Soro Fetal Bovino (Gibco, EUA), 22 µg/mL de piruvato, 0,5 µg/mL de hormônio folículo
estimulante (FSH - Folltropin-V, Vetrepharm, Canadá), e 50 µg/mL de hormônio
luteinizante (LH - APL, Bélgica), recobertas com óleo mineral e mantidas à 38,8 ºC em
incubadoras (Thermo Forma, EUA) com atmosfera de 5% de CO2 em ar, durante 24 horas.
3.4.2.4 Fecundação dos oócitos
Após a maturação in vitro (MIV), os oócitos eram colocados em gotas de 100 µL de
meio Tyrodes, suplementado com 0,6 % de albumina sérica bovina (BSA - Fraction V,
Sigma, EUA), gentamicina, 22 µg/mL de piruvato, e 10 µg/mL de heparina (PARRISH et
al., 1986). A heparina é utilizada para capacitar os espermatozóides bovinos, através de
mudanças bioquímicas na membrana plasmática do espermatozóide. Palhetas contendo
sêmen eram descongeladas por 20 segundos em água aquecida à 35 ºC, depositadas em
tubo cônico de 15 ml e centrifugadas a 900g por 30 minutos através de um gradiente de
Percoll 45-90% (Sigma, EUA). Após a centrifugação o sêmen era diluído para 106
espermatozóides vivos/mL e adicionado às gotas de fecundação, a 38,8 ºC e atmosfera de
5% de CO2 em ar. Os touros utilizados eram de fertilidade comprovada tanto para o método
in vitro como para o método in vivo.
3.4.2.5 Desenvolvimento
Após a fecundação in vitro (FIV), os oócitos e as células do cumulus eram
transferidos para gotas de 100 µL de meio de cultura de embriões, um fluido de oviduto
sintético modificado SOFaa BSA (TERVIT et al., 1972), contendo 8 mg/mL de BSA
(Sigma, EUA) livre de ácido graxo e 1 mM de glutamina, nas mesmas condições da FIV. A
osmolaridade foi mantida em 270 – 280 mOsmol e o pH em 7,4. A taxa de
desenvolvimento foi considerada pelo número de embriões obtidos a partir do total de
oócitos maturados.
3.4.3 Produção in vivo dos embriões
3.4.3.1 Superovulação das doadoras
Considerando como dia zero (D0) o dia para colocação do implante intravaginal de
1,9 g de progesterona (CIDR, Pfizer, Nova Zelândia) além da aplicação de 2 mg de
benzoato de estradiol (BE - Estrogin, Farmavet, Brasil). Entre o dia quatro (D4) e o dia sete
(D7), as doadoras receberam 333 UI de FSH (Pluset, Serono, Itália), em doses decrescentes.
No dia 6 (D6), receberam duas doses de 250 mg de cloprostenol sódico (Ciosin, Coopers,
Brasil) com intervalo de 12 horas entre as aplicações. Na manhã do dia 8 (D8), foram
administrados 25 µg de lecirelina (Gestran Plus, Tecnopec, Brasil), e as doadoras foram
inseminadas 36 e 48 horas após a retirada do implante intravaginal no D7. No dia quinze
(D15), foram realizadas a colheita e a transferência dos embriões.
↓CIDR + BE Cloprostenol↓↓ ↑CIDR ↓Lecirelina Colheita e transferência ↓
�___________________�____�____�____�____�_____IA 36 e 48 hs__________________�
D0 D4 D5 D6 D7 D8 D15
�_____FSH____�
3.4.3.2 Colheita dos embriões
A colheita dos embriões foi realizada pelo método transcervical (GREVE, 1977),
utilizando-se DPBS (Nutricell, Brasil) para a lavagem uterina. O material drenado era
filtrado e depositado em placas de petri 90 mm x 15 mm (Inlab, Brasil). Posteriormente,
com o auxílio de uma lupa esteroscópica, selecionou-se os embriões, e então, somente os
embriões viáveis (segundo padrões da INTERNATIONAL EMBRYO TRANSFER
SOCIETY – 1998) foram envasados e transferidos.
3.4.4 Transferência dos embriões
Os embriões obtidos pelos dois métodos foram transferidos a receptoras cruzadas,
livres de doenças infecciosas e reprodutivas, previamente sincronizadas e preparadas como
no item 3.4.1.1. As receptoras foram sincronizadas através da aplicação de 500 mg de
cloprostenol sódico (Ciosin, Coopers, Brasil), em dose única, administradas dois antes da
aspiração folicular, no caso dos embriões produzidos in vitro, e dois dias antes da IA, no
caso dos embriões produzidos in vivo. Os embriões foram transferidos através de
inovulação transcervical no corno uterino ipsilateral ao ovário com corpo lúteo.
3.4.5 Diagnóstico de gestação, avaliação da morte embrionária e sexagem fetal
Tanto no método in vitro como in vivo, o diagnóstico precoce de gestação e a
sexagem fetal foram realizados com o auxílio de ultra-som 485 Anser (Pie Medical,
Holanda), utilizando-se transdutor linear de 5,0 MHz. A sexagem fetal foi realizada através
da identificação da localização do tubérculo genital. O feto era avaliado ventralmente e, o
tubérculo genital localizado próximo ao umbigo, conferia o sexo masculino ao feto, e
feminino, se próximo a cauda. O diagnóstico precoce era realizado aos trinta dias de
gestação e o sexo dos fetos era conhecido nas gestações confirmadas aos sessenta dias. A
morte embrionária foi calculada pela diferença de percentual entre as taxas de gestação com
30 e 60 dias.
3.4.6 Análise estatística
A comparação entre os métodos in vitro e in vivo de produção de embriões
quanto às proporções de gestação, morte embrionária e sexo fetal foi realizada pelo método
do qui-quadrado. A variável número de embriões foi analisada utilizando-se um modelo
linear geral, que incluiu os efeitos de tratamento (in vitro e in vivo), de animal e a interação
entre ambos, sendo que a comparação foi realizada pelo teste de Tukey.
3.5 Resultados
Foram obtidos 2.463 oócitos em 96 sessões de aspiração folicular, com média de
25,66 oócitos / aspiração. As médias de oócitos viáveis e inviáveis foram 22,92 e 2,74
respectivamente. Um total de 36,95 % dos oócitos atingiram estágio embrionário,
completando um total de 910 (9,48 / aspiração) embriões viáveis.
Das 43 colheitas de embriões, obtêve-se 376 estruturas totais (8,74 / colheita) e
289 (6,72 / colheita) embriões viáveis. O número médio de embriões viáveis por
procedimento variou de 0 a 24 para o método in vitro e de 2 a 19 para o método in vivo.
O número médio de embriões viáveis produzidos foi de 9,48 para o método in
vitro e 6,72 para o método in vivo (P<0,05) (Tabela 1). As taxas de gestação aos 30 dias
foram de 37,47% (341/910) para os embriões oriundos do método in vitro, e 45,67%
(132/289) para os embriões obtidos pelo método in vivo. Aos 60 dias, as taxas de gestação
foram de 33,52% (305/910) para os embriões produzidos pelo método in vitro, e 41,52%
(120/289) para os embriões produzidos pelo método in vivo. Houve diferença significativa
nas taxas de gestação aos 30 dias entre os métodos analisados e também nas taxas de
gestação aos 60 dias (P<0,05), conforme ilustrado na Tabela 2.
Tabela 1. Produção média de embriões para os métodos in vitro e in vivo.
Método Produção média de embriões In Vitro 9,48a In Vivo 6,72b
P < 0,05
Tabela 2. Taxas de gestação aos 30 e 60 dias para os embriões produzidos in vitro e in
vivo.
Origem dos embriões
In Vitro In Vivo
Nº de embriões transferidos 910 289
Gestações aos 30 dias (%) 341 (37,47)a 132 (45,67)b
Gestações aos 60 dias (%) 305 (33,52)a
120 (41,52)b
Valores com sobescritos diferentes na mesma linha diferem entre si P < 0,05
A diferença entre as taxas de gestação aos 30 e 60 dias retrata a morte
embrionária. Embora esta taxa tenha sido numericamente maior para os embriões
produzidos in vitro, do que para os embriões produzidos in vivo, sendo, respectivamente,
10,56% (36/341) e 9,09% (12/132), não houve diferença significativa (P=0,12) (Tabela 3).
Tabela 3. Morte embrionária entre 30 e 60 dias de gestação.
Método Morte embrionária (%)
In Vitro 10,56
In Vivo 9,09
P = 0,12
Para o método in vitro, a percentagem de machos e fêmeas foi, respectivamente,
52,48% (159/303) e 47,52% (144/303) (P=0,07). Para o procedimento in vivo, a relação
macho:fêmea foi exatamente 1:1 (60/120) (Tabela 4).
Tabela 4. Relação macho – fêmea para os embriões produzidos in vitro e in vivo.
Método Machos (%) Fêmeas (%)
In Vitro 52,48 47,52
In Vivo 50,0 50,0
P = 0,07
O número médio de gestações obtidas por doadora por mês foi de 2,7 para o
método in vitro e 1,9 para o método in vivo (Tabela 5).
Tabela 5. Produção média mensal de gestações por doadora para os métodos in vitro e
in vivo.
Método Produção mensal de gestações (gestações/doadoras/meses) média
In Vitro (341/30/4,2) 2,7
In Vivo (132/30/2,3) 1,9
3.6 Discussão
A aspiração folicular guiada por ultra-sonografia para produção in vitro de
embriões bovinos mostrou-se eficaz com média de 25,66 oócitos recuperados por sessão de
aspiração. Na produção in vivo de embriões obteve-se média de 8,74 estruturas totais por
sessão de colheita de embriões. Hasler et al. (1995) obtiveram média de 5,03 oócitos por
sessão de aspiração, sendo que 17,83% dos oócitos atingiram estágio embrionário. No
presente trabalho, 36,95% dos oócitos Bos indicus tornaram-se embriões, mostrando
diferença de aproximadamente 20% em relação aos números para Bos taurus obtidos por
Hasler et al. (1995).
A média de embriões produzidos in vitro foi de 9,48 por sessão de aspiração
folicular, porém, foi obtida média de 6,72 embriões viáveis produzidos in vivo por colheita
de embrião. Hasler et al. (1995) obtiveram média bem mais baixa de embriões produzidos
in vitro (0,72 / aspiração folicular). Bousquet et al. (1999) obtiveram resultados
semelhantes de produção embrionária in vitro (4,7) e in vivo (4,3). VIANA et al. (2004)
utilizaram vacas da raça Gir e conseguiram média de 3,91 embriões viáveis produzidos in
vivo, e 7,83 embriões viáveis produzidos in vitro. Neste trabalho, o maior número de
embriões produzidos in vitro, possivelmente ocorre pelo fato dos animais Bos indicus
apresentarem maior quantidade de folículos em seus ovários, permitindo maior recuperação
de oócitos e maior produção embrionária.
Aos 30 dias de gestação, 341 dos 910 embriões produzidos in vitro foram
confirmados gestantes, representando uma taxa de gestação de 37,47%. No entanto,
embriões Bos taurus biopsiados produzidos in vitro, mesmo considerando-se a injúria
causada pela biópsia, apresentaram taxa de gestação de 53,4% (BOUSQUET et al., 1999).
A taxa de gestação aos trinta dias, para embriões produzidos in vivo, foi de 45,67%, um
pouco inferior aos 53% reportado por Bousquet et al. (1999).
O presente estudo apresentou taxa de gestação aos 60 dias de 33,52% para
embriões produzidos in vitro, e de 41,52% para embriões produzidos in vivo. Hasler (1994)
obteve taxa de gestação similar aos sessenta dias (54%), para embriões produzidos in vitro
tanto biopsiados quanto intactos, levando-se em consideração a injúria causada pela
biópsia. Em outro estudo, embriões produzidos in vitro tiveram taxa de gestação aos 60 dias
notavelmente inferior ao mesmo número de embriões produzidos in vivo, respectivamente,
37% e 79% (FARIN, 1995).
A morte embrionária que ocorre entre 30 e 60 dias de gestação foi considerada
normal para os embriões produzidos in vitro (10,56%) e para os embriões produzidos in
vivo (9,09%). Bousquet et al. (1999) relataram morte embrionária superior para embriões
produzidos in vitro (9,6%) do que para embriões produzidos in vivo (2,9%), porém, todos
esses embriões foram injuriados por biópsia.
Nas gestações confirmadas aos 60 dias, o sexo dos fetos era conhecido obtendo-
se satisfatória relação macho-fêmea, com 52,48% de machos e 47,52% de fêmeas, para
embriões produzidos in vitro. Na produção in vivo de embriões, a relação macho:fêmea foi
de 1:1. Bousquet et al. (1999) obtiveram 60,2% de embriões machos produzidos in vitro e,
para os embriões produzidos in vivo, 49,8% eram machos. Uma vez que a demanda é maior
por fêmeas na raça em questão, estes resultados nos mostram uma quantidade de fêmeas
próxima a de machos, o que também é favorável para a produção in vitro de embriões, já
que é uma técnica que rotineiramente produz mais machos.
3.7 Referências
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techniek: geboorte van de eerste OPU kalveren in België. Vlaams Diergeneeskunding
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VIANA, J.H.M.; ARASHIRO, E.K.N.; FREITAS, C.; PALHÃO, M.P.; FONSECA, J.F.
Associação entre as técnicas de punção folicular e colheita de embriões em vacas gir.
Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS, v. 32, n.1, p. 193, 2004. (Resumo).
4. Conclusões
Os resultados obtidos nos permitem concluir que:
1) Vacas Nelore produziram maior número de embriões pelo método in vitro em
comparação ao método in vivo
2) As taxas de gestação aos 30 e 60 dias foram mais altas para os embriões obtidos in
vivo
3) O método de produção in vitro resultou em maior número de gestações por doadora
em um mesmo período de tempo
4) A relação macho-fêmea foi similar nos dois métodos estudados
5) A utilização intercalada das técnicas de produção de embriões in vitro e in vivo pode
ser vantajosa, pela possibilidade de agregação dos aspectos favoráveis de cada uma
delas.