Isolamento de fungos e bactérias fitopatogênicos

ISOLAMENTO DE FUNGOS E BACTÉRIAS

FITOPATOGÊNICOS

Dr. Giovani de Oliveira Arieira

Disciplina: Métodos Fitopatológicos

Londrina, 13 de julho de 2016

ESTRUTURA DA AULA

Importância do isolamento de microrganismos fitopatogênicosConceitos Aspectos importantes

Isolamento de fungosFungos fitopatogênicosMétodos de isolamento

Isolamento de bactérias Bactérias fitopatogênicasMétodos de isolamento

IMPORTÂNCIA DO ISOLAMENTO

DIAGNOSE E ISOLAMENTO

Separação do local onde um agente está sobrevivendo, obtendo-se culturas puras a partir de tecidos doentes, solo ou substrato

A cultura pura é essencial para ter o organismo disponível:- Estudos de morfologia e taxonomia

- Reprodução e fisiologia

- Testes de patogenicidade

- Resistência genética

DIAGNOSE E ISOLAMENTO

POSTULADOS DE KOCH• Agente fitopatogênico deve estar associado em

todos os casos com a doença;

• Agente fitopatogênico associado aos sintomas deve ser isolado da planta doente, em cultura pura;

• Hospedeiro sadio deve ser inoculado, em condições favoráveis, e reproduzir os sintomas característicos da doença, anteriormente observados;

• Agente fitopatogênico deve ser isolado novamente das plantas inoculadas artificialmente, em cultivo puro, e identificado com o isolado primitivo.

PROCEDIMENTOS PRÉVIOS

• Assepsia para evitar contaminações externas

• Escolha dos tecidos infectados Isolamento de tecidos com sintomas característicos da

doença Fragmentos de tecido da região limítrofe entre a área

lesionada e a área sadia

• Desinfestação superficial dos tecidos Tecidos em álcool 50 – 70% e tratamento com hipoclorito

de sódio (1 a 2%)

ESCOLHA DOS TECIDOS INFECTADOS

ISOLAMENTO E REPICAGEM

ISOLAMENTO

REPICAGEM

ISOLAMENTO DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS

FUNGOS FITOPATOGÊNICOS Grupo mais numeroso e diversificado de microrganismos

fitopatogênicos

Sintomas extremamente variáveis e característicos para cada tipo de doença:

Amarelecimento, encharcamento, manchas, murchas, cancros, tombamentos, gomoses, morte de ponteiros, perfurações, podridões, pústulas, enfezamentos, mosaicos, galhas, superbrotamentos, verrugoses, etc

FUNGOS FITOPATOGÊNICOS Diagnose

Direta: amostra analisada tem sintomas característicos ou típicos e/ou sinais.

Indireta: ausência de sintomas característicos de nenhuma doença particular (murcha, clorose) e/ou não apresenta sinais instalação de testes de laboratório (tecidos em câmara úmida, isolamento, inoculação etc.)


Presença de sinais: exame inicial dos tecidos identificação preliminar

Estruturas podem ser usadas no isolamento direto

Aguarda-se que as colônias formadas desenvolvam estruturas de frutificação para seu reconhecimento sob microscopia


Espécies que necessitam de meios ou técnicas para frutificação

Luz negra, raspagem da superfície da cultura na placa, etc

Ausência de sinais câmara úmida, indução da esporulação

Sacos plásticos umedecidos com algodão embebido em água

Fragmentos do material sobre papel filtro umedecido com água, depositado no fundo de placas de vidro

MÉTODOS DE ISOLAMENTO

1. ISOLAMENTO DIRETO

Quando o patógeno apresenta frutificações (conídios, picnídios, peritécios, apotécios, acérvulos, etc) ou quando não as apresenta mas é possível obtê-las, deixando os órgãos infectados em câmara úmida

Os órgãos com as estruturas são observados sob microscópio e, com auxílio de uma agulha, estilete ou microbisturí recolhe-se algumas frutificações, que são transportadas para os tubos de ensaio ou placas de Petri com o meio.

MÉTODOS DE ISOLAMENTO1. ISOLAMENTO DIRETO

A estrutura fúngica deve ser visualizada em lupa estereoscópica, e com estilete flambado, e transferida assepticamente para placas ou tubos com meio de cultura.

Câmara úmida em placa de Petri ou gerbox com tampa translúcida com algodão ou papel de filtro embebido em água.

Manter de 1 a 3 dias a 25ºC sob luz contínua.

Alfenas et al., 2007

Se esporos não estão presentes na amostra pode-se estimular a esporulação mantendo o material em câmara úmida.

Obtenção do organismo puro, isento de contaminações de microrganismos saprófitas associados ao tecido infectado

Permite saber exatamente qual organismo está sendo transferido para o meio.

Comparações entre as estruturas do organismo formadas na superfície do hospedeiro e as formadas na cultura.

Vantagens do isolamento direto

ISOLAMENTO DIRETO



2. ISOLAMENTO INDIRETO

Material muito contaminado por organismos secundários e é difícil a desinfestação superficial

Separação preliminar do patógeno, antes de isolá-lo.

Inoculação com a mistura de patógeno e os organismos secundários em um organismo suscetível sobre o qual o microrganismo de interesse se desenvolve mais rápido

Isolamento de Phytophthora infestans, de folhas de batatinha, inoculando ou colocando a folha infectada entre dois pedaços de tubérculo de batata desinfestados


Transferência de porções infectadas de tecido do hospedeiro ou amostras de solo para o meio de cultura

Os métodos variam com o tipo de órgão ou tecido infectado ou substrato de onde o organismo é recuperado.

A superfície de tecidos mortos é invadida por saprófitas que dificultam a obtenção do patógeno em cultura pura.

Utilizar, sempre que possível, material recém-infectado para evitar contaminantes, retirado da região limítrofe entre as partes infectadas e sadias.



Desinfestação superficial do tecido em hipoclorito de sódio, seguido de lavagens sucessivas em água destilada

Folhas cerosas: imersão inicial em solução de álcool 70% para quebrar a tensão superficial no tecido e facilitar a ação do hipoclorito

Concentração da solução desifestante depende do tipo de material

Tecidos de órgão lenhosos (ramos): concentrações + altas do que usadas para folhas (0,5%)



A) Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos lenhosos ou carnosos (tronco, raízes, galhos grossos e frutos).

A incidência de contaminantes superficiais é evitada pela remoção dos tecidos expostos e transferência de apenas fragmentos tissulares mais internos, retirados das margens da lesão, para o meio de cultura.


ISOLAMENTO INDIRETO – Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos lenhosos ou carnosos (tronco, raízes, galhos grossos e frutos)



B) Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos não-lenhosos ou não-carnosos (folhas, ramos finos, radicelas).

Os organismos saprófitos na superfície do órgão lesionado são eliminados pela desinfestação superficial dos fragmentos de tecidos em solução desinfestante.

O patógeno, que se encontra no interior dos tecidos, não é afetado pelo desinfestante, a menos que o tempo de desinfestação seja excessivamente longo.


ISOLAMENTO INDIRETO - Isolamento de fungos dos tecidos de órgãos não-lenhosos ou não-carnosos (folhas, ramos finos e radicelas).



3. DILUIÇÃO EM PLACA DE PETRI

Técnica generalizada, aplicando-se mais particularmente a suspensões de esporos

FRUTIFICAÇÕES PRESENTES: Remoção de alguns esporos para o interior de uma placa de Petri, derramando sobre eles, cerca de 20 cc do meio de cultura, agitando antes da solidificação do meio

FRUTIFICAÇÕES AUSENTES: Câmara úmida prévia a fim de obter as frutificações ou remoção fragmentos da margem do tecido infectado, dilaceração com água destilada esterilizada e procedimento conforme o método com frutificações presentes


4. PLANTAÇÃO DIRETA

Quando não existem frutificações (esporos) do organismo a isolar

• Remoção, com auxílio de pinça ou bisturi, para o meio de cultura (pobre em nutrientes), pequenos fragmentos dos tecidos infectados

• Apenas o organismo presente em maior concentração no tecido vegetal deve crescer, com nutrientes fornecidos pelo próprio hospedeiro

• Após 24 – 48 horas de incubação, pontas de hifas são transferidas para um meio rico em nutrientes (repicadas)


5. ISOLAMENTO À PARTIR DO SOLO

Suspensão de água destilada esterilizada (100 cc) e uma porção (1 g) do solo em exame

Diluição e plaqueamento, com meio cultura acidificado com ácido lático ou antibióticos para inibir o desenvolvimento de bactérias


6. ISOLAMENTO COM ISCAS

Utilizado para organismos difíceis de isolar e microrganismos do solo que não podem ser isolados pela diluição em placas de Petri.

O organismo desejado se desenvolve na “isca” pela exclusão dos outros organismos, permitindo então o isolamento por métodos comuns.

Agrobacterium e Thielaviopsis basicola são isolados do solo pelo uso de discos de cenoura.

Inserção de material doente ou solo em maça é usado para isolar algumas espécies de Phytophthora.

Frutos de limão são usados para isolar espécies de Phytophthora, que causam doença em citrus.

MÉTODOS DE ISOLAMENTO6. ISOLAMENTO COM ISCAS


7. ISOLAMENTO À PARTIR DE SEMENTES

Estruturas misturadas às sementes ou sobre elas: suspensão agitando as sementes em água destilada esterilizada, e isolamento por diluição em placas de Petri.

Estruturas no interior das sementes: desinfestação, câmara úmida para provocar a formação de esporos e/ou corpos frutíferos, fazendo-se então o isolamento.


8. ISOLAMENTO MONOSPÓRICO

Para trabalhar com culturas provenientes de um só esporo.

Suspensão de esporos em água destilada esterilizada e semeadura em em estrias com auxílio de espátula esterilizada em meio de

Localização dos esporos isolados, marcação na parte inferior da placa e extração de discos do meio

Transferência dos discos para um tubo de ensaio com meio de cultura


9. ISOLAMENTO COM INOCULAÇÃO NO HOSPEDEIRO

Utilizado para parasitas biotróficos ou quando o material está muito contaminado ou quando o organismo é difícil de isolar através dos métodos comuns

Inoculação direta no hospedeiro elimina os microrganismos não parasitas, “purificando” o patógeno, permitindo seu posterior isolamento pelos métodos anteriormente impraticáveis.

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS

BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS

Maioria das BACTÉRIAS: benéficas

FITOPATOGÊNICAS: altamente destrutivas = condições ambientais favoráveis

Doenças causadas por bactérias: estudos sobre métodos de detecção, isolamento e inoculação:

Diagnóstico correto e preciso

Comprovar etiologia, viabilizar outros estudos, determinação das condições ambientais favoráveis à infecção e otimização de medidas de controle

Isolamento: cuidados com assepsia grande número de operações envolvidas e associação com bactérias saprofíticas (lesões mais velhas)

Inoculação: quantificação de inóculo e cuidados durante acondicionamento das plantas pré e pós inoculação

É possível induzir a reação de hipersensibilidade para comprovar a patogenicidade de colônias obtidas no isolamento


Padrão sintomatológico de manchas foliares (bacterianas): Muito variável

Comprovação de fitobactérias é feita após visualização de sinais (exsudação de células bacterianas);

Dependendo do órgão infectado técnicas são usadas para expor as células bacterianas ou para expor a exsudação ao meio

Exsudação: comprovar a etiologia, permite realizar o isolamento direto do agente etiológico, pp de órgão de maior volume (caule de plantas arbóreas)


Detecção de fitobactérias em folhas: Nas lesões em folhas, teste em gotas são mais apropriados Cortar as margens da lesão (fragmento retangular) 0,4x0,5cm e

colocar numa gota de água limpa sobre uma lâmina microscópica; cobrir o fragmento com lamínula e observar ao microscópio no menor aumento com diafragma fechado e condensador abaixado

Bactérias podem exsudar com > ou < intensidade

CUIDADOS: outras substâncias como gomas ou látex; massa de esporos diminutos de algum fungo no tecido lesionado


Detecção de bactérias em tecido foliar:

A – Variação sintomatológica de lesões em folhas de Eucalyptus spp.;

B – Detecção microscópica de pus bacteriano em gota d’água

Detecção de fitobactérias em caule: Murcha bacteriana em caule (Ralstonia solanacearum)

Comprovação pode ser feita ainda no campo de doenças em folhas = laboratório

Cortar a região lesionada e colocar a secção do caule num recipiente com água limpa

Dependendo da quantidade de células bacterianas = pus bacteriano

Visualização ao microscópio


Detecção de fitobactérias em caule:

Ramos: retirar a secção longitudinal na extremidade do tecido sadio = colocar o corte em contato com a parede de um copo ou becker com água limpa.

quando presente, a bactéria escorre como um filete de pus para o fundo do recipiente


Detecção de Ralstonia solanacearum em tecido infectado:

A – Escurecimento do lenho;

B – Pus bacteriano na superfície seccionada;

C – Exsudação de pus bacteriano em copo com água;

D – Observação microscópica de pus bacteriano;

E – Exsudação de pus bacteriano

Método direto: Transferência direta das células bacterianas para o meio de

isolamento

Isolamento a partir de tecidos internos sem a necessidade de desinfestação.

Método indireto:

Isolamento a partir de tecidos superficiais e obrigatoriamente necessitar de desinfestação.


1. ISOLAMENTO DIRETO

Órgãos volumosos como caules e frutos, com porções relativamente espessas de tecidos que poderão ser retiradas, para eliminar as contaminações externas.

Obtenção de grande número de colônias individuais, a partir das quais são repicadas para tubos contendo meio agarizado.

Isolamento a partir do pus exsudado dos feixes vasculares para o meio de cultura 523, semeando-se a massa de células em meio sólido, com alça flambada.

Diluição do pus bacteriano em solução salina (NaCl a 0,85%), seguido da semeadura com alça de Drigalsky sobre o meio sólido.


2. ISOLAMENTO INDIRETO (Romeiro, 2001) Lavagem com água e detergente neutro e secagem com papel

toalha.

Remoção de parte do tecido infectado e, a partir das bordas da lesão, retirar fragmentos de aprox. 0,5x0,5 cm.

Assepsia dos fragmentos em álcool 50% por 20-30 s, em solução de hipoclorito de Na ou Ca (2%) por 1 a 5 min e, 3 vezes em água destilada esterilizada.

Deposição de uma gota de água destilada esterilizada em placa esterilizada e transferência de 3 - 4 fragmentos para essa gota

Maceração dos fragmentos e semeadura da suspensão na superfície do meio de cultura (após 20-30 min)


Diluição a partir de uma população de colônias de forma que novas colônias individualizadas possam ser formadas.

Facilita a inspeção visual, onde será possível comparar características morfológicas com o tipo de colônia esperada ou descrita na literatura

Permite maior homogeneidade das características genotípicas e fenotípicas dos isolados originados a partir da uma única célula.

Tipo de semeadura: Semeadura pelo método de estrias ou riscas Semeadura pelo método de diluição em placas Semeadura pelo uso de alça de Drigalsky

SEMEADURA DA SUSPENSÃO DE CÉLULAS EM MEIO DE CULTURA SÓLIDO

O OBJETIVO É A OBTENÇÃO DE COLÔNIAS INDIVIDUALIZADAS

SEMEADURA DA SUSPENSÃO DE CÉLULAS EM MEIO DE CULTURA SÓLIDA

Objetivo: diluir a concentração de células para possibilitar o desenvolvimento de colônias individualizadas.

Semeadura pelo método de estrias ou riscas (Mafia, Alfenas e Gonçalves, 2007)

Semeadura pelo método de estrias simples

Semeadura pelo método de estrias compostas


A. SEMEADURA PELO MÉTODO DE ESTRIAS SIMPLES

Com alça previamente flambada e resfriada, toque na suspensão de células e deposite o excesso em um ponto próximo à borda da placa.

Toque na suspensão depositada e, a partir daí, realize movimentos de zigue-zague aproveitando ao máximo a superfície do meio de cultura até o outro polo da placa.

B. SEMEADURA PELO MÉTODO DE ESTRIAS COMPOSTAS

Com alça previamente flambada e resfriada, toque na suspensão de células e deposite o excesso em um ponto próximo à borda da placa.

Sem flambar a alça, trace 3 ou 4 riscas paralelas espaçadas 0,5 cm.

Flambe a alça, resfrie a sua ponta e realize mais 3 a 4 estrias paralelas em ângulo reto em relação às primeiras, partindo da primeira risca da primeira série.

Proceda da mesma forma até fazer 4 séries de riscas.

Semeadura pelo Método de estrias compostas

Mais trabalhoso e requer mais materiais que o método de estrias.

Diluição da suspensão de células antes da semeadura.

Deposição de uma gota de água estéril em 3 ou + placas

Transferência, com alça, de uma alíquota da suspensão para a gota de água

Homogeneização e transferência de uma alíquota dessa suspensão para outra placa (e assim sucessivamente).

Aplicação do meio de cultura (48-50ºC) sobre as gotas no fundo das placas movimentos rotatórios suaves para incorporar a suspensão de células ao meio.

C. SEMEADURA PELO MÉTODO DA DILUIÇÃO EM PLACAS

Diluição da suspensão em solução salina (NaCl a 0,85%) estéril ou em PBS (solução salina em tampão de fosfato 0,1 M, pH = 7,0) estéril.

Transferência de 0,5 mL da suspensão para 1º tubo, com pipeta estéril e agitação.

Trensferência de 0,5 mL desse tubo para o segundo tubo

Sucessivas diluições (diluição 1:10) até ter diluições de 10-10.

D. SEMEADURA PELO USO DA ALÇA DE DRIGALSKY

Retirada de 0,1 mL (começando da maior diluição para as menores) e deposição na superfície do meio em placa (pelo menos 1 placa para cada diluição).

Com alça de Drigalsky flambada em álcool várias vezes e resfriada, espalhar a suspensão sobre a superfície do meio, sem ferí-lo

D. SEMEADURA PELO USO DA ALÇA DE DRIGALSKY

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Laboratório de Fitopatologia – Universidade Estadual de

Londrina

(43) 3371 – 4724

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