..SELEÇÃO DE PROGÊNIES DE MILHO DOCE DE ALTO VALOR NUTRITIVO

COM AuxíLIO DE TÉCNICAS ELETROFORÉTICAS1

EDILSON PAIVA2, MARIA JOSÉ V. VASCONCELOS3, SIDNEY NETTO PARENTONI4,

ELTO EUGÊNIO G. e GAMA e RICARDO MAGNAVACA2

RESUMO - Através do cruzamento da cultivar de milho superdoce BR-400 contendo o genebrittle-I com a população CMS-456 (QPM), de grãos com endosperma vítreo-amarelo porta-dores do alelo opaco-2 modificado, foram selecionadas 48 progênies endogámicas (Sz + 1 sib)com constituição fenotípica doce e grãos de endosperma vítreo-amarelo. Estas progênies foramsubmetidas a análises eletroforéticas e análises quantitativas de lisina e triptofano. Padrõesprotéicos de polipcptídeos do grupo das zeínas foram utilizados com sucesso como ferramentasauxiliares na identificação de progênies de constituição genotípica doce, com altos teores de lisi-na e triptofano e endosperma vítreo-amarelo. Foram discutidas as relações entre padrõesprotéicos das zeínas e conteúdo dos aminoãcidos lisina e triptofano na proteína do endosperrna.

Termos para indexação: Opaco-2 modificado, proteína, lisina, triptofano, brittle-I,

SELECTION OF HIGH QUALITY PROTEIN SWEET CORN PROGENIESTHROUGH ELECTROPHORESIS TECHNIQUES

ABSTRACT - Forty-eight endogamic sweet corn progenies (S2 + 1 sib) with vítreous-yellowkernels were obtained from crosses between a sweet corn cultivar based on the gene brittle-I(BR-400), and a high quality protein maize eQPM) based on a modified opaque-2 allele(CMS-456). These progenies were subjected to gel electrophoresis and quantitative lysine andtryptophan analysis. Protein patterns of zeins were utilized with success as auxiliary tools for theidentification of the sweetcom progenieswith high content of lysine and tryptophan associatedwith a vitreous-yellow kernel characteristic. Relations between electrophoretic protein patternsof zeins and the content of lysine and tryptophan present in the endosperrn protein werediscussed.

Index tcrms: modified Opaque-2, Iysine, tryptophan, brittle-L

INTRODUÇÃO

o milho doce (Zea mays L.) apresenta altosteores de açúcares no endosperma. O caráterdoce no milho se deve à presença de um ou vá-rios genes mutantes que acarretam mudançasno teor e no tipo dos carboidratos presentes noendospcrma dos grãos. O milho doce é consu-mido no estádio de grão pastoso, o qual ocorrecerca de vinte dias após a polinização, na maio-

I Aceito para publicação em 12 de fevereiro de 1992.

2 Eng. - Agr., Ph.D., EMBRAP NCentro Nacional de Pes-quisa de Milho e Sorgo (CNPMS), Caixa Postal 151, CEP35700 Sete Lagoas, MG.

3 Bioquímica, EMBRAP NCNPMS.

4 Eng. - Agr., EMBRAP NCNPMS.

ria das cultivares. Nos Estados Unidos, é umadas hortaliças mais populares (Boyer &Shannon 1983), embora no Brasil o seu consu-mo ainda seja bastante reduzido (Tosello 1978),o que se deve principalmente ao desconheci-mento do produto e à falta de cultivares ade-quadas à comercialização.

Várias mutações genéticas que afetam acomposição química (proteínas e carboidratos)do endosperma de grãos de milho têm sido des-critas (Coe & Neuffer 1977). Dessas, cerca dequatorze têm sido utilizadas no melhoramentodo milho doce (Boyer & Shannon 1983).

Uma avaliação das características genéticasdas cultivares de milho doce existentes mostrouque essas possuem uma base genética bastanteestreita (Garwood 1976). Exceção ocorreu em

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um programa para obtenção de cultivares demilho doce adaptadas a condições tropicais(Brewhaker & Banafunzi 1975, Brewbaker1977), onde a seleção massa I e de "pedigree' foifeita em populações compostas de ampla basegenética.

As cultivares de milho doce tradicionais são,na sua maioria, recessivas para o gene sugary-I,e apresentam ainda duas limitações: um perío-do muito curto de colheita e uma rápida perdano teor de açúcares logo após a colheita (Boyer& Shannon 1983, Brewbaker 1977). Ao contrá-rio, cultivares contendo endosperrna brittle oushrunken mantém altos teores de açúcares porperíodos mais longos e apresentam baixa taxade conversão de açúcares para amido, após a co-lheita. Devido a essa característica, cultivaresque possuem os alelos brittle e shrunken sãochamadas superdoces, enquanto as que contêmo gene sugary são conhecidas como doces(Creech 1965, Jennings & McCombs 1969,Holder et a!. 1974a e 1974b, Tsai & Glover1974, Garwood et a!. 1976, Hannah & Basset1977).

No milho doce a redução no acúrnulo de po-lissacarídeos, principalmente amido, leva a umaumento no teor de proteínas no endosperma(Misra et a!. 1975). As zeínas, do grupo das pro-Iaminas, são as proteínas mais abundantes emgrãos de milho normais, chegando a atingir60% da proteína total do endosperma (Wilson1983). Zeínas são proteínas deficientes em doisaminoácidos essenciais, lisina e triptofano, oque resulta na baixa qualidade nutritiva. Exis-tem, no entanto, linhagens mutantes quecontêm os genes "opaco-Z" e "floury" que re-duzem a síntese de zeínas e, conseqüentemente,aumentam a percentagem de proteínas ricas emlisina e triptofano, no endosperma. Mutantesduplos de milho doce contendo altos teores deaçúcares e proteínas ricas em lisina e triptofanotêm sido desenvolvidos com o objetivo de seremutilizados na alimentação humana como horta-liças de alto valor protéico (Misra et al. 1975,Silva et a!. 1978).

Recentemente, com a finalidade de melhoraras características agronômicas de genótiposopacos, melhoristas têm utilizado modificado-

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res do gene opaco-2 na obtenção de cultivaresque associam alta qualidade protéica com en-dosperma vítreo. Estes genótipos são chamadosde Quality Protein Maize (QPM), (Vasal 1975,Vasal et aí. 1980, Magnavaca et a!. 1988).

O objetivo deste trabalho foi a obtenção demutantes duplos de milho doce de alto valornutritivo, contendo o gene brittle 1 associado aum gene opaco modificado para endosperma ví-treo, utilizando, para sua seleção, padrõesprotéicos das zeínas, obtidos através de técnicaseletroforéticas.

MATERIAL E MÉTODOS

Como fonte do gene brittle-I (bt.bt.) foi utilizadaa cultivar de milho doce BR-400, lançada pelaEMBRAP A (CNPMS/CNPH) com o nome de SuperDoce. A BR-400 é uma variedade derivada do com-posto Hawaiian Super Sweet 9, de ampla basegenética (Brewbaker 1977), adaptada para cultivo nostrópicos e capaz de acumular altos teores de açúcaresnos grãos. A população CMS-456 (QPM) foi utilizadacomo fonte do gene opaco-2 (0,0,). O CMS-456(OPM) foi obtido na EMBRAP NCNPMS através deseleção massal feita na população POOL-26, prove-niente do programa de melhoramento de milho de al-ta qualidade protéica do Centro Internacional de Me-joramiento de Maíz Y Trigo (CIMMYT), México. Apopulação CMS-456 (OPM) possui o gene opaco-2associado a outros alelos que conferem ao endosper-ma uma característica vítreo-amarela. Como controleforam também utilizadas as cultivares BR 106, DoceOpaco e o CMS 20 Opaco.

Dos cruzamentos feitos entre o CMS-456 (QPM) ea cultivar doce BR-400, foram selecionadas inicial-mente 70 progênies Fl' com grãos de fenótipo normale constituição genotípica BtlbtPP2' As quatro me-lhores plantas de cada progênie foram autofecunda-das. De cada espiga SI foram separados, utilizando umdiafanoscópio, grãos de constituição fenotfpica 0202Btl- opaca não-doce. Estes grãos foram plantados, e asplantas resultantes, autofecundadas. A escolha dessegrupo foi feita com a finalidade de aumentar a chancede se obterem progênies S, com grãos doces de coramarelo-vítrea associada a aita qualidade protéica. Fo-ram selecionadas 48 progênies S2' as quais foramsubmetidas a uma geração de cruzamento dentro decada família (Sz + 1 sib) com a finalidade de selecio-nar progênies com sementes doce, amarelo vítreo e al-

SELEÇÃO DE PROGÊNIES DE MILHO DOCE

ta qualidade protéica; grãos desse último cruzamentoforam submetidos a eletroforese e as análises quanti-tativa de Iisina tryptofano e de proteína total.

Para as análises de proteína e aminoácidos, osgrãos foram submersos em água por um período de20 min, após o que removeu-se o pericarpo e embriãocom o auxílio de um bisturi. A porção do endospermarestante foi então triturada em um moinho tipo ciclo-ne, e a farinha obtida, coada em peneira de malha0,35 mm.

A percentagem de proteína das cultivares em estu-do foi determinada multiplicando-se o teor de N, obti-do pelo método de Kjeldahl, pelo fator 6,25 (Associa-tion of Official Agricultural Chemists J 980).

As análises de triptofano e lisina na fração proteínadas amostras foram realizadas de acordo com o méto-do descrito por Hernandez & Bates (1969).

O fracionamento protéico para a separação dos di-ferentes grupos de proteínas foi feito seguindo-se oesquema proposto por Landry & Moureaux (1970),com algumas modificações. Uma amostra de vinte mi-ligramas de farinha foi suspensa por 10 min em200,U..l de uma solução 0,5 M de NaCl sob agitação esumetida a uma centrifugação a 3.000 g por 10 minpara extração das albuminas e globulinas (Fração I).Para a extração das zeínas, o precipitado da fração Ifoi lavado com água, centrifugado e suspenso em 2-propanol 70% (2-PROH), e novamente centrifugado(Fracão 11). A seguir, o precipitado foi novamentesuspenso em solução de 2-PROH 70% e 3% de 2-mercaptoetanol (2-ME), e centrifugado (Fração I1I).Finalmente, para a extração das glutelinas, o precipi-tado da fração III foi suspenso em tampão borato(TB) pH 10, com 3% de 2-ME e centrifugado (FraçãoIV).-Esta foi suspensa em TB pH 10 com 3% 2-ME e0,5% de dodecil sulfato de sódio (SDS), e tambémcentrifugado (Fração V). A proporção 1:10 entre opeso da amostra e o volume da solução extratora,tempo de incubação de 10 min com agitação e a cen-trifugação de 3.000 g por 10 min, utilizados no prepa-ro da fração I, foram mantidos no preparo das demaisfrações.

Fez-se também a extração conjunta das zefnas(Frações II e IlI), ressuspendendo o precipitado daFração I diretamente em solução contendo 2-PROH(70%) e 2-ME (3%).

Para obtenção dos padrões eletroforéticos das pro-teínas presentes nas diferentes frações, os sobrenadan-tes destas foram misturados na proporção 1:1 comuma solução tampão contendo 62,5 mM de tris-HCIpH 6,8, 2,3% de SDS, 5% de 2-ME, 10% de glicerol e0,1% de azul de bromofenol. A mistura foi aquecida

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em banho maria a 1000C por 5 mín, e 50 )J-l foramaplicados no gel.

Os géis foram preparados com 5% de acrilamida,região de formação de camadas (Staking gel), e 15%de acrilamida, região de separação (Running gel). Acorrida foi desenvolvida a temperatura ambiente, apli-cando-se uma corrente constante de 12 mA por umahora, seguida de um período de três horas a 24 mAPara a coloração das bandas protéicas, foi utilizadauma solução de coomassie azul brilhante R-250 a0,1%, diluída em etanoí/ãcido acético/ãgua (50: 10:40VN) por 12 horas. Para lavagem do gel, foi utilizadometanol/ãcido acético/água (5: 10:85 VN).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Fig. 1 são apresentados padrões obtidospor eletroforese das albuminas, globulinas, pro-laminas (zeínas) e glutelinas, extraídos do en-dosperma de grãos de milho doce das cultivaresBR-400 e Doce Opaco. Diferenças marcantesestão presentes nos polipeptídeos das frações IIe III, que constituem o grupo das zeínas, pro-teínas solúveis em álcool (2-PROH) na ausên-cia (Fração 11) e na presença (Fração III) de umagente redutor (2-ME). A quantidade de zeínaspresentes no endosperma da cultivar doce nãoopaca (BR-400) foi maior do que aquela da cul-tivar doce opaca (Doce Opaco). Houve uma re-

FRAÇÕES PROTÉICAS

_1_ _11_ __11_1_ .-J'L_ _v_ABABABA BA B

I'IG. 1. Padrões de eletroforese das proteínas pre-sentes na Fração I (A1buminas e Globulinas),nas frações 11 e 111 (Zeinas) e nas frações IVe V (Glutelinas), extraídas de endospermadas cultivares Doce Opaco (A) e BR-400 (B).

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dução visível no teor das zeínas (Fração 11e III)na cultivar Doce Opaco em relação à cultivarBR 400 Doce não-opaca (Fig. 1). Alguns poli-peptídeos foram mais afetados pela presença dogene Opaco-2 do que outros, à semelhança dodescrito por Larkins (1980) para cultivares opa-cas não-doces. Este efeito do gene opaco-2, re-duzindo diferencialmente a síntese e o acúmulode diferentes polipeptídeos de zeínas na cultivarDoce Opaca, foi explorado como critério de se-leção na obtenção de mutantes duplos de milhosuperdoce de alto valor nutritivo, contendo ogene brittle-I associado a um' gene opaco-2 mo-dificado para endosperma vítreo. Para tal, foifeita uma extração conjunta das zeínas(Frações 11 e I1I) do endosperma de grãos devárias progênies (S2 + 1 sib), de genótipo docee fenótipo de coloração vítreo-amarela.

Na Fig. 2, são apresentados os padrõesprotéicos das diferentes classes de zeínas pre-sentes no endosperma de grãos de dez progê-nies (S2 + 1 sib) escolhidas ao acaso. Há umanítida variação entre as progênies quanto ao ti-po e quantidade dos polipeptídeos de peso mo-lecular 27, 22 e 19 kD. Baseando-se nas va-riações dos padrões eletroforéticos das zeínas(Fig. 1), foi possível agrupar as progênies emtrês grupos distintos. Grupo A, progênies 2, 4 e10, que apresentam baixos teores do polipeptí-deo de peso molecular 27 kD; grupo B, progê-

ProgêniesPeso

moleculardas zeínas

10 (kD)3 4 5 6 7

FIG. 2. Zimogramas dos componentes das zeínaspresentes no endosperma de milhos superdo-ces provenientes de dez progênies (S2 + 1sib) obtidas do cruzamento da cultivarBR-400 com a população CMS-456 (QPM).

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nies 6, 7 e 9, apresentando quantidades equiva-lentes dos três polipeptídeos (27,22 e 19 kD); egrupo C, progênies 1, 3, 5 e 8 com altos teoresdo polipeptídeo 27 kD e reduzidos teores dosde 22e 19 kD.

As progênies agrupadas nos três grupos des-critos A, B e C foram submetidas a análisesquantitativas de proteína total do endosperma edos arninoácídos lisina e triptofano presentesna proteína. Os resultados obtidos (Tabela 1),mostram que os teores de lisina e triptofano fo-ram mais altos nas progênies do grupo C, ou se-ja aquelas que apresentaram altos teores do po-lipeptídeo 27 kD e baixos teores dos de pesomolecular 22 e 19 kD. O conteúdo de lisina etriptofano na proteína dos grãos do grupo C foisemelhante ao encontrado nos progenitoresCMS-456 (QPM) e BR-400, 60% maior do queo das progênies dos grupos A e B, 100% maiordo que a cultivar de endosperma normal(BR-106) e, 40 e 25% menor do que os das cul-tivares Doce Opaco e CMS-20 Opaco, respecti-vamente, as quais possuem o gene Opaco-2 nãomodificado. Os genótipos QPMs são conheci-

TABELA 1. Representação esquemática de padrõeseletroforéticos de zeínas presentes nosgrupos A, B e C de progênies de milhodoce e percentagens de proteína total,lisina e triptofano em cultivares de mi-lho doce, doce opaco, opaco, QPM, nor-mal e progênies dos grupos A, B e C.

Progênies!cultivares

Padrões P' T "I roteína L"" o npto-

e etro- 11 isma- f ?

foréticos tota ano-

Grupo A (doce)Grupo B (doce)Grupo C (doce)BR 400 (doce)CMS 456 (OPM)Doce-opacoCMS-20 opacoBR 106 (normal)

------------------- %15,33

15,914,613,59,6

12,68,68,6

1,9 0,391,9 0,383,1 0,683,1 0,683,1 0,695,0 1,164,1 0,921,5 0,28

1 % no endosperma2 % na proteína total3 Médias de 3 repetições

SELEÇÃO DE PROGÊNIES DE MILHO DOCE

dos por apresentarem teores de lisina e tripto-fano intermediários entre genótipos normais(BR 106) e aqueles contendo o gene Opaco-2 não modificado (CMS 20 Opaco) (Vasal et aI.1980, Magnavaca et aI. 1988, Paiva et aI. 1991),e esta tendência pode também ser observadanas progênies do grupo C, não mostrando açãointeralélica entre o gene brittle 1 e o gene Opa-co-2 modificado nesse grupo. As progênies dosgrupos A e B apresentaram teores de lisina etriptofano comparáveis aos da cultivar de milhode endosperma comum BR-106.

Verificou-se, nas progênies do grupo C, umarelação positiva entre o conteúdo do polipeptí-deo de 27 kD e o alto teor de lisina e triptofanona proteína do endosperma de grãos do grupoC. Este tipo de relação foi também descrita porWallace et aI. (1990) e Paiva et aI. (1991) em es-tudos de extração, quantificação e distribuiçãode zeínas em grãos de milhos normais e QPMs,onde foi demonstrado que, para se ter a carac-terística de endosperma vítreo associada a altosteores de lisina e triptofano, o grão precisa con-ter também altos teores do polipeptídeo de27 kD, denominado por alguns autores de ga-ma-zeína,

O maior teor de proteína total presente nosgenótipos doces (Tabela 1), e atribuído à re-dução do acúmulo de amido, a qual resulta numaumento da participação das proteínas no pesoseco dos grãos doces.

Recombinações entre quinze progênies(S2+ 1 sib) selecionadas e pertencentes ao gru-po C foram feitas, obtendo-se um sintético demilho superdoce, adaptado aos trópicos, deampla base genética, com alta qualidade protéi-ca, coloração amarelo-vítrea do grão e boas ca-racterísticas agronômicas, e que passará a inte-grar o programa de melhoramento de milho do-ce do CNPMS/EMBRAP A e servirá ainda co-mo material básico em trabalhos de biologiamolecular que envolvam estudos de modifica-dores do gene Opaco-2.

CONCLUSÕES

1. Padrões protéicos de zeínas, obtidosatravés de técnicas eletroforéticas, podem ser

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utilizados com sucesso como marcadores na se-leção de milho doce de alta qualidade protéica.

2. Há uma relação positiva entre o teor dezeínas de peso molecular de 27 kD e o alto teorde lisina e triptofano no endosperma de grãosde milho.

3. A utilização da cultivar QPM amarelaCMS-456 permitiu a obtenção de mutantes du-plos de milho superdoce com coloração amare-lo.vítrea associada e característica de alta quali-dade protéica.

4. Nos mutantes duplos de milhos superdo-ces de alta qualidade protéica (grupo C), os ale-los brittle-1 e Opaco-2 não mostraram ação in-teralélica, tendo em vista que os teores dosaminoácidos e proteína foram semelhantes aosprogenitores isolados.

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