JOÃO ANTONIO MATHEUS GUIMARÃES FINAL revisada pós... · fÊmur com haste intramedular bloqueada...
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS JOÃO ANTONIO MATHEUS GUIMARÃES Tratamento de pseudoartrose diafisária de fêmur com infiltração de concentrado autólogo de células mononucleares de medula óssea NITERÓI - RJ 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
JOÃO ANTONIO MATHEUS GUIMARÃES
Tratamento de pseudoartrose diafisária de fêmur com
infiltração de concentrado autólogo de células
mononucleares de medula óssea
NITERÓI - RJ
2013
ii
JOÃO ANTONIO MATHEUS GUIMARÃES
Tratamento de pseudoartrose diafisária de fêmur com
infiltração de concentrado autólogo de células
mononucleares de medula óssea
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Ciências Médicas
Orientadoras: Profa Dra Isabel Cristina Chulvis do Val Guimarães
Profa Dra Maria Eugenia Leite Duarte
NITERÓI - RJ
2013
G963
Guimarães, João Antonio Matheus
Tratamento de pseudoartrose diafisária de fêmur com
infiltração de concentrado autólogo de células mononucleares de
medula óssea.
88f
Orientador: Isabel Cristina Chulvis do Val Guimarães
Orientador: Maria Eugenia Leite Duarte
Tese (Doutorado em Ciências Médicas) - Universidade Federal
Fluminense, Faculdade de Medicina, 2013.
1. Células sanguíneas 2.Fraturas-tratamento 3. Ortopedia. I.
Guimarães, Isabel Cristina Chulvis do Val. II.Duarte, Maria
Eugenia Leite. III. Título.
CDD617.15
iii
JOÃO ANTONIO MATHEUS GUIMARÃES
Tratamento de pseudoartrose diafisária de fêmur com
infiltração de concentrado autólogo de células mononucleares
de medula óssea
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Ciências Médicas.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________
Prof. Dr. Jorge Paulo Strogoff de Matos
______________________________________________________
Prof. Dr. Priscila Ladeira Casado
______________________________________________________
Prof. Dr. Moisés Cohen
______________________________________________________
Prof. Dr. Maurício Kfuri Junior
______________________________________________________
Prof. Dr. José Sérgio Franco
NITERÓI – RJ
2013
iv
DEDICATÓRIA
Para meus queridos e amados pais, Francisco “in memoriam” e
Hilda, pelo amor, carinho e dedicação com que criaram a mim e
meus irmãos, construindo uma família que foi alicerce para a minha
vida.
Para minha querida esposa, Isabel, parceira, amiga, companheira de
tantas jornadas, com todo meu amor e carinho por estes anos
maravilhosos vividos juntos.
Para minha amada filha, Renata, orgulho e paixão deste pai “coruja”
que tanto a admira por ser uma pessoa linda para quem olha e
maravilhosa para quem a conhece.
Aos meus queridos irmãos, Francisco e Luísa, meus segundos pais,
que sempre me apoiaram com amizade e carinho.
v
AGRADECIMENTOS
Toda minha gratidão a querida orientadora, Profa Isabel Cristina Chulvis
do Val Guimarães, pois sem a sua ajuda e orientação esse sonho em me
graduar nunca se realizaria;
Toda minha admiração a querida orientadora, Profa Maria Eugenia L.
Duarte, por toda a sua competência, sabedoria e tenacidade com que
dedicou seu precioso tempo na elaboração desta tese, superando mesmo
a dor, o meu muito obrigado e gratidão eterna;
Ao Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia que possibilitou toda a
infra-estrutura necessária para a realização deste estudo;
Ao meu amigo e irmão Francisco Matheus por ter apresentado a
Ortopedia, por quem me apaixonei;
Ao amigo e colega Marco Bernardo Cury Fernandes pela ajuda e
orientação na técnica da punção de medula óssea;
À Profa Priscila Ladeira Casado que foi fundamental na orientação e
elaboração da análise sobre o polimorfismo genético dos pacientes
estudados nesta tese;
Ao Prof. Hélio dos Santos Dutra, que de maneira competente e voluntária,
auxiliou em todas as etapas do preparo do concentrado de células da
medula óssea;
A toda equipe do CTCel do INTO: Amanda, Diego, Danielle, Julia, Emma,
Rafaela e Valquiria pela ajuda na realização deste estudo e o carinho da
convivência diária;
vi
Aos meus inúmeros colegas e amigos do INTO, Médicos, Enfermeiras,
Auxiliares, Instrumentadoras, Administrativos, Secretárias, Seguranças,
todo pessoal de apoio, esses maravilhosos profissionais que fazem do
INTO um orgulho da Ortopedia do Brasil;
A Coordenação do Programa de Pós Graduação da Universidade Federal
Fluminense pela oportunidade que me foi oferecida através deste
Doutorado;
Ao Prof. Luis Guillermo Coca Velarde pelo apoio e tempo dedicado ao
estudo estatístico desta tese;
Por fim aos meus pacientes, os quais eu sou muitíssimo grato, pois sem a
ajuda e a confiança deles, eu não teria chegado até aqui.
.
vii
RESUMO
GUIMARÃES, João Antonio Matheus. Tratamento de pseudartrose diafisária de
fêmur com infiltração de concentrado autólogo de células mononucleares de
medula óssea. Niterói, 2013. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) –
Faculdade de Medicina, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2013.
As fraturas da diáfise do fêmur são comuns em adultos jovens e quase sempre
resultam de traumas de alta energia, em consequência de acidentes de trânsito
e de violência urbana. O tratamento deste tipo de fratura é a fixação com haste
intramedular bloqueada (HIMB) visando manter o comprimento, alinhamento e
rotação do fêmur. Apesar do avanço proporcionado pelo uso das HIMB os
índices de pseudartrose permanecem em torno de 13,6%. Considerando-se o
conhecimento atual dos mecanismos biológicos envolvidos no processo de
consolidação óssea, a injeção percutânea de medula óssea autóloga passou a
ser considerada como uma opção para promover um estímulo osteogênico
suplementar em focos de pseudartrose. Neste estudo avaliamos a consolidação
óssea após o tratamento com infiltração local de concentrado autólogo de
células mononucleares da medula óssea (BMMNCs) em 16 pacientes com
pseudartrose após uma fratura da diáfise do fêmur tratadas com HIMB. O
procedimento foi considerado seguro e foi capaz de induzir a osteoformação em
todos os pacientes, embora a magnitude desta resposta não tenha sido
uniforme. A consolidação clínica e radiográfica da pseudartrose foi observada
entre três e oito meses depois do tratamento, em oito pacientes que receberam
um concentrado celular enriquecido com um grande número de BMMNCs. A
evolução do processo de consolidação por um período de até oito meses após a
infiltração celular permite sugerir que as BMMNCs são capazes de restaurar a
biologia do microambiente e o turnover ósseo no foco de pseudartrose. Um outro
resultado deste estudo foi a observação de que a predisposição genética à
pseudartrose, caracterizada pelos polimorfismos dos genes BMP-4, FGFR-1 e
FAM5C, não influenciou na resposta ao tratamento com BMMNCs. A partir
desses resultados acreditamos que a realização de novos estudos randomizados
em maior escala, para aprofundar a investigação neste tipo de tratamento irão
confirmar a nossa hipótese de que o ambiente biológico tem importância
fundamental no processo de consolidação de pseudartrose.
Palavras chave: Concentrado de células mononucleares. Fratura diafisária
femoral. Haste intramedular. Consolidação de fraturas. Pseudartrose.
viii
ABSTRACT
GUIMARÃES, João Antonio Matheus. The effect of autologous concentrated
bone marrow grafting on the healing of femoral shaft nonunions. Niterói, 2013.
Tese (Doutorado em Ciências Médicas) – Faculdade de Medicina, Universidade
Federal Fluminense, Niterói, 2013.
Diaphyseal fractures of the femur are common in young adults secondary to
high-energy trauma and as the result of traffic accidents and urban violence.
The treatment of this type of fracture is the fixation with locked intramedullary
nail (IM nail) to maintain the length, alignment and rotation of the femur. Despite
the advances provided by the use of IM nail pseudoarthrosis indices remain
around 13.6%. Considering the current knowledge of the biological mechanisms
involved in bone healing, percutaneous injection of autologous bone marrow has
been considered as an option to promote a supplementary osteogenic stimulus
in the site of pseudoarthrosis. Thus, this study evaluated the bone healing after
treatment with local infiltration of concentrated autologous bone marrow
mononuclear cells (BMMNCs) in 16 patients with pseudoarthrosis of the femoral
shaft treated with IM nail. The procedure was considered safe and induced new
bone formation in all patients, though the magnitude of the response was not
uniform. Clinical and radiological union was observed between three and eight
months after treatment in eight patients who received a cell concentrate
enriched with a large number of BMMNCs. The progress of bone healing for a
period of up to eight months after cell infiltration may suggest that BMMNCs are
able to restore the biology of the local microenvironment and the bone turnover
in the pseudoarthrosis site. Another outcome of this study was the observation
that the genetic predisposition to nonunion, characterized by polymorphisms of
BMP4, FGFR1 and FAM5C genes, did not influence the response to the
treatment with BMMNCs. Further studies on a larger scale clinical trial, to further
investigate this type of treatment might confirm our hypothesis that the local
biology is of crucial importance in the healing process of pseudoarthrosis.
Keywords: Concentrate mononuclear cells. Femoral shaft fracture.
Intramedullary nailing. Fracture healing. Pseudoarthrosis
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Imagem esquemática dos tipos de pseudartrose vasculares (hipertrófica) e avascular (atrófica). As vasculares podem ser classificadas em (a) “pata de elefante; (b) “pata de cavalo”; (c) oligotrófica. As pseudartroses avasculares são classificadas em (d) cunha de torsão; (e) fraturas cominutivas; (f) perda óssea; (g) “em ponta de lápis”.
26
FIGURA 2 Obtenção do aspirado medular da crista ilíaca posterior. O aspirado foi obtido por aspiração lenta com agulha do tipo Jamishidi, em alíquotas de 2-4 mL. A cada 10 mL de medula óssea aspirada a agulha era reposicionada para evitar a diluição com sangue.
42
FIGURA 3 Sistema fechado de filtração com sequência de filtros (poros 100, 500 e 800 m) para remoção de material particulado.
42
FIGURA 4 Sistema fechado para redução de volume para concentração de medula óssea (Sepax, Biosafe).
43
FIGURA 5 Manipulação em ambiente estéril da bolsa contendo o concentrado de BMMNCs para retirada das amostras para controle microbiológico.
44
FIGURA 6 Aspiração do concentrado de BMMNCs para infiltração no foco de pseudartrose. 44
FIGURA 7 Infiltração do concentrado de BMMNCs no foco de pseudartrose (A) guiada por controle fluoroscópico (B).
45
x
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 Resultados de séries de fraturas da diáfise do fêmur tratadas com haste intramedular anterógrada fresada.
20
QUADRO 2 Avaliação de consolidação óssea pela escala quantitativa RUST. 40
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Variantes genéticas dos genes investigados.
47
TABELA 2 Resumo dos achados clínicos dos pacientes com pseudartrose da diáfise femoral tratados com HIMB.
52
TABELA 3 de Escores radiográficos segundo a escala RUST antes e depois da infiltração de BM BMMNCs no foco de pseudartrose e tempo de consolidação.
54
TABELA 4 Número de BMMNCs presentes em 40mL do concentrado celular injetado no foco de pseudartrose e o segmento dos pacientes.
56
TABELA 5
Análise dos genótipos nos pacientes com pseudartrose não consolidada e consolidada após tratamento com BMMNCs.
59
TABELA 6 Distribuição dos alelos. 60
TABELA 7 Distribuição dos fatores possivelmente relacionados com a consolidação óssea na pseudartrose da diáfise do fêmur, após a infiltração de BMMNCs. (Valor de p calculado pelo qui-quadrado*; teste t** e teste Mann-Whitney*** )
61
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
AA Adenina-Adenina
AG Adenina-Guanina
AO Arbeitsgemeinschaft für Osteosynthesefragen
AP Anteroposterior
BMMNCs Bone Marrow Mononuclear Cells
BMP Bone Morphogenetic Protein
CC Citosina-Citosina
C Citosina
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CI Confidence Interval
CT Citosina-Timina
DNA Deoxyribonucleic Acid
FAM5C Family with sequence similarity 5, member C
FDA Food and Drug Administration
FGF Fibroblast Growth Factor
FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor
GG Guanina-Guanina
HIMB Haste Intramedular Bloqueada
IGF Insulin Growth Factor
IL Interleukin
INTO/MS Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia / Ministério da Saúde
MFA Minor frequency alleles
MFA_PC Minor frequency alleles em pseudartrose consolidada
MFA_PNC Minor frequency alleles em pseudartrose não consolidada
OTA Orthopaedic Trauma Association
PDGF Platelet-derived Growth Factor
PGE-2 Prostaglandin E-2
PTC Peltier Thermal Cycler
RUST Radiographic Union Score for Tibial fractures
SMAD6 Mothers Against Decapentaplegic Homolog 6
SNP Single Nucleotide Polymorphism
TGF-ß Transforming Growth Factor ß
TNF- Tumoral Necrosis Factor
T Timina
TT Timina-Timina
UI Unidade Internacional
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
xii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 14
2 REVISÃO DA LITERATURA 18
2.1 CONSOLIDAÇÃO DE FRATURA DA DIÁFISE DO FÊMUR APÓS OSTEOSSÍNTESE
18
2.2 CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA, FALTA DE CONSOLIDAÇÃO E PSEUDARTROSE
21
2.2.1 Consolidação óssea 21
2.2.2 Pseudartrose 24
2.3 TRATAMENTO DA FRATURA DA DIÁFISE DO FÊMUR COM HASTE INTRAMEDULAR BLOQUEADA
26
2.4 DIAGNÓSTICO DA FALTA DE CONSOLIDAÇÃO APÓS TRATAMENTO COM HASTE INTRAMEDULAR BLOQUEADA
30
2.5 PREDISPOSIÇÃO GENÉTICA NA PSEUDARTROSE 32
2.6 TERAPIA CELULAR E PSEUDARTROSE 34
3 OBJETIVOS 37
4 PACIENTES E MÉTODOS 38
4.1 PACIENTES 38
4.2 DIAGNÓSTICO DE CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA 40
4.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS 41
4.3.1 Obtenção e concentração do aspirado de medula óssea
41
4.3.2 Infiltração do concentrado de BMMNCs 44
4.4 ANÁLISE LABORATORIAL 45
4.4.1 Contagem do número de células 45
4.4.2 Avaliação genética de polimorfismo em pacientes com pseudartrose
46
xiii
4.5 ACOMPANHAMENTO CLÍNICO DOS PACIENTES 48
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA 48
5 RESULTADOS 50
5.1 PACIENTES 50
5.2 AVALIAÇÃO DA CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA APÓS TRATAMENTO COM INFILTRAÇÃO DE BMMNCs NO FOCO DE PSEUDARTROSE
53
5.3 CARACTERÍSTICAS DO INFILTRADO DE BMMNCs 55
5.4 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO PARA INFILTRAÇÃO DE BMMNCs
57
5.5 SUSCEPTIBILIDADE GENÉTICA NA PSEUDARTROSE 57
5.5.1 Caracterização genotípica dos pacientes tratados com BMMNCs
57
5.6 AVALIAÇÃO DAS VARIÁVEIS COMO PREDITORES DE CONSOLIDÇÃO ÓSSEA
60
6 DISCUSSÃO 62
7 CONCLUSÕES 76
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 78
ANEXOS 89
14
1. INTRODUÇÃO
As fraturas da diáfise femoral são lesões frequentes entre adultos em
consequência de traumas de alta energia secundários a acidentes de trânsito,
quedas e lesões por arma de fogo (HILDEBRAND et al., 2004). O tratamento de
escolha para este tipo de lesão é a fixação com haste intramedular bloqueada
(HIMB) visando manter o alinhamento e a rotação do fêmur e evitar o
encurtamento do membro (CLATWORTHY et al., 1998). O emprego da HIMB
contribuiu, também, para a diminuição da incidência de falta de consolidação da
fratura da diáfise do fêmur. Entretanto, com a disseminação do seu uso, aliado a
maiores índices de sobrevida de pacientes com lesões traumáticas mais graves,
os relatos de pseudartroses de fraturas da diáfise do fêmur tratadas inicialmente
com HIMB tornou-se mais freqüente, chegando a índices da ordem de 10-15%
das fraturas de ossos longos. A pseudartrose da diáfise do fêmur resulta em
importante impacto socioeconômico devido ao custo do tratamento e à
incapacidade física gerada por esta condição (LYNCH et al., 2008).
Apesar do crescente avanço no conhecimento dos mecanismos de regulação
biológica da consolidação óssea e de novas tecnologias no desenvolvimento de
implantes ortopédicos, o tratamento da pseudartrose em ossos longos envolve
procedimentos agressivos como a troca de osteossíntese e a enxertia óssea
autóloga. Esses procedimentos quase sempre constituem um importante desafio
para o cirurgião e nem sempre resultam em uma resposta favorável por parte do
paciente (BRINKER e O'CONNOR, 2007).
15
Para ocorrer consolidação óssea é necessário que uma sequência de eventos
biológicos, promovidos por células e moléculas bioativas, ocorra sequencialmente
no foco de fratura. A biologia da consolidação da fratura é um processo complexo
desencadeado por uma resposta regenerativa específica que envolve a
expressão de milhares de genes. Este processo é influenciado por inúmeros
fatores, alguns já compreendidos e outros ainda não elucidados (MARSELL e
EINHORN, 2011).
Uma vez excluídos fatores mecânicos e vasculares como causas principais da
pseudartrose, a falta de um estímulo biológico adequado assume papel central na
falha da consolidação óssea. Por isso, é possível observar na clínica que um
grupo específico de pacientes, inicialmente fora do grupo de risco ao
desenvolvimento de pseudartrose, apresenta falta de consolidação adequada de
uma fratura diafisária do fêmur (SOMFORD et al., 2013).
Baseando-se na premissa da possível influencia da variação genética na resposta
individual à consolidação das fraturas e uma potencial predisposição genética ao
desenvolvimento de pseudartrose, cada vez é mais investigada a associação
entre polimorfismo genético e falta de consolidação. No entanto, é importante
considerar que diferentes genes e regiões específicas do DNA orquestram
diferentes fases do processo de consolidação, incluindo a reposta inflamatória, a
proliferação fibroblástica e a diferenciação de células osteoprogenitoras, sendo
esta última etapa de importância inquestionável para a regeneração tecidual
(DIMITRIOU et al., 2011; ZECKEY et al., 2011).
16
Levando-se em consideração o conhecimento atual sobre o potencial das terapias
celulares no reparo biológico de lesões ósseas, a infiltração de células obtidas da
medula óssea no local da fratura passaram a ser vistas como uma importante
opção terapêutica. Além de ser um procedimento cirúrgico pouco invasivo, por ser
realizado através da infiltração de pequenos volumes de concentrado celular, a
sua natureza autóloga exclui riscos adicionais de infecção cruzada. O racional da
técnica é simples e baseado no fato de que ao dotar a região da fratura com
elementos celulares adicionais, que irão prover um estímulo osteogênico e
possivelmente angiogênico suplementares, as diversas etapas do processo de
consolidação óssea serão localmente recuperadas e provavelmente reinstaladas
(POUNTOS et al., 2010).
Em casos de predisposição genética ao desenvolvimento da pseudartrose, a
terapia com células da medula óssea pode ser determinante no processo de
consolidação. Dessa forma, constituiu o objeto do presente estudo avaliar em
uma série de pacientes com pseudartrose da diáfise do fêmur, submetidos
previamente a estabilização com HIMB, os índices de consolidação óssea após o
tratamento com infiltração de concentrado autólogo de células mononucleares da
medula óssea (BMMNCs ou bone marrow mononuclear cells).
O melhor conhecimento dos fatores genéticos associados a consolidação de
fraturas poderá servir de base para futuros tratamentos que envolvam
comprometimento intrínseco na reestruturação da função óssea, ultrapassando,
em parte, a base genética da doença. Por este motivo, este estudo irá também
analisar a possível influencia do polimorfismo de alguns genes que participam
17
diretamente no processo de consolidação óssea e o resultado do tratamento
proposto.
18
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CONSOLIDAÇÃO DE FRATURA DA DIÁFISE DO FÊMUR APÓS
OSTEOSSÍNTESE
O fêmur é o maior e mais forte osso tubular do esqueleto, (MOORE, 1992;
BUCHOLZ e BRUMBACK, 1996; SCHATZKER, 1996; PLATZER, 2003) e um dos
principais ossos de suporte de carga na extremidade inferior (WHITTLE e WOOD,
2003).
A fratura da diáfise do fêmur está entre as lesões mais comuns do sistema
musculoesquelético (GOZNA, 1982; WHITTLE e WOOD, 2003), sendo na maioria
dos casos resultado de um trauma de alta energia, geralmente associado a lesões
de outros órgãos (BUCHOLZ e JONES, 1991; BUCHOLZ e BRUMBACK 1996;
WHITTLE e WOOD, 2003). É uma lesão que pode ser fatal por conta da
complexidade que envolve a lesão de partes moles, risco de infecção em caso de
fratura exposta, embolia gordurosa, síndrome da angústia respiratória do adulto
(ZALAVRAS et al., 2005) ou mesmo falência múltipla de órgãos resultante de
politraumatismo (BUCHOLZ e JONES, 1991; BUCHOLZ e BRUMBACK, 1996;
KEEL e TRENTZ, 2005). Este tipo de fratura pode ainda determinar grande
incapacidade física, seja pela falta de ocorrência de consolidação ou pela
deformidade óssea decorrente de tratamento inadequado (BUCHOLZ e
BRUMBACK, 1996). As deformidades, mesmo quando acarretam apenas
pequenos graus de encurtamento do membro e desvio angular, podem evoluir
19
para artrose pós-traumática (BUCHOLZ e JONES, 1991; BUCHOLZ e
BRUMBACK, 1996).
A arte do tratamento de uma fratura da diáfise do fêmur é o equilíbrio entre a
estabilização óssea, através do alinhamento anatômico, e a reabilitação funcional
precoce do membro (BUCHOLZ e BRUMBACK, 1996). A evolução técnica da
fixação interna mudou por completo o protocolo clássico dos últimos trinta anos
no que se refere ao tratamento da fratura da diáfise do fêmur. A opção pela
estabilização óssea precoce, seja temporária ou definitiva, é o atual padrão ouro
de tratamento destas fraturas, principalmente no paciente politraumatizado (PAPE
et al., 2009).
O emprego da haste intramedular (HIM) fresada para tratamento da fratura da
diáfise do fêmur foi popularizado por Gerhard Küntscher, na Alemanha após a
segunda Guerra Mundial (KÜNTSCHER, 1948). Mais tarde, KLEMM e
SCHELLMANN (1972) introduziram o conceito de parafusos de bloqueio da HIM
que foi, posteriormente, difundido mundialmente (KEMPF et al.,1978).
WINQUIST et al. (1984), analisaram uma série de 300 fraturas de fêmur tratadas
com haste intramedular bloqueada (HIMB) e observaram uma incidência de 6.3%
de consolidação viciosa, 0.7% de infecção e 0.3% de falta de consolidação. A
partir desses excelentes resultados, que foram confirmados por outros relatos em
diversas partes do mundo (QUADRO 1), este procedimento foi definido como a
melhor opção de tratamento para esta lesão.
20
QUADRO 1 - Resultados de séries de fraturas da diáfise do fêmur tratadas com haste intramedular anterógrada fresada.
Autores N Aberta
(%)
Consolidação
(semanas)
Cirurgia
Secundária
(%)
Consolidação
Viciosa (%)
Infecção
(%)
JOHNSON et al.,1984 24 16.7 13.8 4.2 12.5 0
KLEMM e BÖRNER, 1986 293 16 - 2.4 - 2.4
WISS et al., 1986 112 28.5 - 1.8 9.5 0
KEMPF et al., 1985 52 36.5 19.5 9.6 1.7 2.1
CHRISTIE et al, 1988 120 20 17 1.7 2.5 0
BRUMBACK et al, 1988 87 23 19 2.3 0 1.1
SØJBJERG et al, 1990 40 27.5 12 0 15 0
ALHO et al, 1991 123 12.2 13 0 8.1 0.8
WISS et al, 1990 33 21.2 32 3.3 6.1 0
BRÄTEN et al, 1995 120 10 - 0.8 13.3 0.8
CLATWORTHY et al, 1998 22 14 28.6 14 - 0
REYNDER e BROOS, 2000 54 - 19.6 5.6 0 0
GIANNOUDIS et al, 1997 15 - 20.5 6.7 0 0
TORNETTA e TIBURZI, 2000 83 51.8 11.4 0 2.4 0
Quando comparado com os resultados do tratamento da fratura da tíbia, a falta de
consolidação óssea após a osteossíntese intramedular é um problema clínico um
pouco mais frequente nas lesões do fêmur (WINQUIST et al., 1984; THORESEN
et al., 1985; BRUMBACK et al., 1988; CHRISTIE et al., 1988; SØJBERG et al.,
1990; BRUMBACK, 1996). Em consequência do uso mais disseminado de HIMB
para o tratamento de fraturas diafisárias do fêmur, associado ao aumento do grau
de energia das fraturas que determinam maior lesão tecidual e perda de
segmentos ósseos, o aumento da incidência desta complicação foi objeto de
21
diversos relatos (CURYLO e LINDSEY, 1994; BHANDARI et al., 2000;
HERSCOVICI et al., 2000; TORNETTA e TIBURZI 2000).
2.2 CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA, FALTA DE CONSOLIDAÇÃO E
PSEUDARTROSE
2.2.1 Consolidação óssea
A consolidação óssea é um processo regenerativo único no organismo e ocorre
de maneira altamente organizada através de duas vias que dependem da
estabilidade mecânica local. A primeira via ocorre em situações especiais,
quando de maneira cirúrgica, se obtém redução anatômica seguida de
estabilidade absoluta dos fragmentos ósseos fraturários, acarretando a
consolidação óssea direta, também denominada de consolidação primária ou
intramembranosa. A segunda via, mais frequente e natural, ocorre quando existe
uma estabilidade relativa no foco de fratura que determina uma consolidação
indireta, denominada de secundária ou endocondral (GIANNOUDIS et al., 2007a).
Independente da maneira que ocorre o reparo ósseo, este processo é
influenciado por vários fatores, alguns conhecidos e outros ainda não descritos,
compreendendo quatro estágios bem definidos, a saber: (1) fase de resposta
inflamatória inicial, (2) formação do calo mole, (3) união óssea inicial e, por fim, (4)
remodelação óssea (MARSELL e EINHORN, 2011). O primeiro estágio inicia-se
com a formação do hematoma resultante da fratura, a partir do sangramento de
origem intramedular e da lesão dos tecidos circundantes. O hematoma formado
no foco de fratura constitui o molde para o futuro calo ósseo e o seu
22
desenvolvimento é acompanhado por uma resposta inflamatória local. Durante
esta fase inflamatória local, macrófagos e plaquetas infiltram o foco de fratura e
liberam citocinas pró-inflamatórias, incluindo fatores de crescimento derivados de
plaquetas (PDGF), fator beta de crescimento transformante (TGF-ß), interleucinas
1, 6, 11 e 18 (IL-1, IL-6, IL-11 e IL-18), prostaglandina E2 (PGE-2) e fator alfa de
necrose tumoral (TNF-α), que são responsáveis pelo recrutamento de células
inflamatórias e promoção de angiogênese. Esta fase inflamatória precoce inicia-
se nas primeiras 24 horas após o trauma e está completa no sétimo dia. A seguir,
células tronco mesenquimais são recrutadas da medula óssea para o foco de
fratura onde proliferam e se diferenciam em células osteogênicas com objetivo de
promover a neoformação óssea juntamente com a população local de
osteoblastos periosteais, para dar prosseguimento a estruturação do calo ósseo
(PHILLIPS, 2005).
A proliferação das células mesenquimais e dos osteoprogenitores está
intimamente associada à expressão de diversas moléculas reguladoras,
particularmente as proteínas morfogênicas do osso (BMPs), TGF-ß e Fator de
crescimento fibroblástico (FGF). Com a maturação do hematoma há deposição de
matriz colágena que serve de suporte para neoformação vascular. Esta fase
coincide com o aumento da expressão do fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF). Os vasos neoformados viabilizam o acesso de novas células
osteoprogenitoras e de células que através da liberação local de fatores de
crescimento mantêm ativo o processo de recrutamento e de diferenciação de
células mesenquimais em progenitores comprometidos com uma das linhagens
23
mesenquimais. Através desta via, células mesenquimais se diferenciam em
condrócitos que promovem a deposição de cartilagem que é substituída
gradativamente por osso (ossificação endocondral). Nesta fase, predomina a
expressão local de colágenos tipos I e II. Após a fase proliferativa, os condrócitos
hipertrofiam e liberam fatores que estimulam a ossificação da matriz cartilaginosa
recém-depositada no foco de fratura. A conversão da cartilagem hipertrófica em
osso é mediada por diversos fatores, incluindo BMPs, TGF-ß, Fator de
crescimento insulina-like (IGF), osteocalcina e colágenos tipos I, V e XI. A medida
que o osso é formado ocorre aumento da angiogênese local e morte dos
condrócitos por apoptose. A seguir inicia-se gradualmente a ação coordenada
entre osteoblastos e osteoclastos visando a remodelação do osso recém-formado.
Para conclusão desta fase é fundamental que o suprimento sanguíneo seja
adequado e que haja estabilidade mecânica no foco de fratura. A falta de um
desses fatores pode alterar esta sequência de eventos coordenados e acarretar
em pseudartrose (BORRELLI et al., 2012).
A consolidação direta não é um processo natural e só é obtida através de
um procedimento cirúrgico. Para que ocorra a consolidação direta de uma fratura
é necessário que haja uma redução perfeita sem a ocorrência de lacuna entre os
fragmentos ósseos, aliada a uma estabilidade rígida no foco de fratura. Quando
estes requisitos são obtidos, a consolidação ocorre por remodelação direta do
osso neoformado no foco de fratura. Este tipo de consolidação, dependendo do
local do foco de fratura, ocorrerá por contato ou por fenda (ou gap), pois mesmo
após uma redução anatômica e compressão do foco de fratura, sempre existirá
24
uma pequena fenda em alguma área do traço de fratura. O limite para
consolidação primária óssea direta por fenda (gap) é cerca de 0,5 mm (SCHENK
e WILLENEGGER, 1977).
O tipo de consolidação que ocorre em uma fratura de um osso longo depende do
tipo de tratamento efetuado. Quando a opção é a osteossíntese com uma HIMB,
visando a estabilidade mecânica, será conferida ao foco de fratura uma
estabilidade relativa. Os movimentos controlados pelo implante propiciam a
formação do calo ósseo periosteal (McGIBBIN, 1978; ARO et al., 1985). Com a
estabilidade absoluta através da fixação com placa de compressão, a
consolidação ocorre por formação óssea primária sem a formação intermediária
de um calo periosteal (ALLGÖWER e SPIEGEL, 1979; PERREN, 1979; McKEE,
2000).
2.2.2 Pseudartrose
Embora exista uma grande variação do tempo de consolidação de uma fratura
entre os diferentes sítios do esqueleto, quase todas consolidam em um período
de três a quatro meses após a ocorrência da lesão. Para a Food and Drug
Administration (FDA), a falta de consolidação é diagnosticada “quando uma
fratura não apresenta sinais visíveis de progressão para a consolidação nos
últimos três meses e que tenha, no mínimo, nove meses de evolução desde o
momento do trauma inicial”. A distinção entre retarde de consolidação e falta de
consolidação é arbitrário e pode não existir diferença qualitativa entre as duas
expressões, sendo apenas um lapso temporal que na prática clínica pode ser
25
impossível de ser distinguido. Já a pseudartrose, está relacionada ao estágio final
de uma falta de consolidação e deve ficar restrita a condições onde existam sinais
radiográficos clássicos, tais como esclerose dos bordos da fratura e um espaço
sinovial entre estes, simulando uma articulação neoformada (FRÖLKE e PATKA,
2007).
A falta de consolidação óssea pode ser classificada de acordo com o padrão
vascular no foco de fratura em hipervascular (hipertrófica) ou avascular (atrófica).
No primeiro grupo existe um potencial biológico de reação através da
vascularização local, ao contrário do segundo grupo que caracteristicamente
possui um baixo suprimento vascular (BRINKER e O`CONNOR, 2008).
Tomando por base algumas das características individuais das faltas de
consolidação, WEBER e CECH (1976) propuseram uma subdivisão das lesões
com potencial biológico em três subtipos: hipertrófica ou em “pata de elefante”,
quando há formação de calo ósseo exuberante devido a uma instabilidade
acentuada do foco de fratura; hipertrófica ou em “pata de cavalo” quando o calo
ósseo é menos exuberante. Este subtipo ocorre quando há instabilidade
mecânica moderada no foco da fratura e o calo não produz estabilidade suficiente
para que ocorra a consolidação óssea total. No terceiro subtipo, oligotrófico, não
há formação de calo ósseo apesar de existir viabilidade no foco de fratura. Este
tipo ocorre em fraturas com desvios acentuados, quando há distração do foco
após realização de osteossíntese ou quando a redução da fratura é inadequada.
As lesões com padrão atrófico (avascular) foram também divididas em quatro
subtipos: (1) lesão com cunha de torsão, quando um fragmento em cunha
26
apresenta consolidação óssea em apenas uma de suas faces; (2) fraturas
cominutivas, caracterizada pela presença de um ou mais fragmentos ósseos
intermediários desvascularizados; (3) o tipo resultante de perda óssea decorrente
de fraturas expostas ou infecção óssea; e (4) o tipo denominado de pseudartrose
“em ponta de lápis”, que geralmente corresponde a evolução final de um dos
outros tipos de falta de consolidação atrófica (FRÖLKE e PATKA, 2007). A
representação esquemática dos tipos de falta de consolidação estão
representados na FIGURA 1.
FIGURA 1- Imagem esquemática dos tipos de pseudartrose vasculares (hipertrófica) e
avascular (atrófica). As vasculares podem ser classificadas em (a) “pata de elefante; (b)
“pata de cavalo”; (c) oligotrófica. As pseudartroses avasculares são classificadas em
(d) cunha de torsão; (e) fraturas cominutivas; (f) perda óssea; (g) “em ponta de lápis”.
2.3 TRATAMENTO DA FRATURA DA DIÁFISE DO FÊMUR COM HIMB
Devido ao enorme avanço das técnicas cirúrgicas e das opções atuais de
tratamento, a incidência de falta de consolidação óssea da fratura da diáfise do
fêmur após a osteossíntese é um evento raro. Relatos da literatura mostram que
a incidência desta complicação varia entre 0 a 6% (CROWLEY et al., 2007;
TZIOUPIS e GIANNOUDIS, 2007).
27
A osteossíntese com HIMB, propicia altas taxas de consolidação óssea, sendo
atualmente o padrão ouro de tratamento destas lesões. A opção de osteossíntese
mais utilizada é a haste com bloqueio estático (parafusos de bloqueio proximal e
distal ao foco de fratura) para evitar qualquer tipo de desvio ou encurtamento
ósseo durante o período de consolidação. Mesmo em fraturas mais distais ao
istmo, que é o local mais estreito do canal medular do osso é possível evitar o
desvio com este tipo de osteossíntese. Quando se utiliza haste intramedular
dinâmica (sem bloqueio distal ao foco de fratura), a estabilidade é menor,
podendo ocorrer desvios rotacionais ou mesmo encurtamento do osso em fraturas
com cominuição óssea (BRINKER e O’CONNOR, 2007).
A fresagem do canal medular que é feita durante o procedimento cirúrgico para a
inserção da HIMB pode favorecer a formação do calo ósseo através de dois
mecanismos: por um efeito biológico direto e por um efeito mecânico. O efeito
biológico seria através do aumento da circulação sanguínea periosteal,
consequente a destruição da circulação endosteal, pela ação direta da fresagem.
O aumento do fluxo sanguíneo periosteal no foco de fratura é um estímulo direto
para a neoformação óssea. O efeito mecânico é obtido pela própria haste
intramedular, pois através da fresagem é possível aumentar o diâmetro desta
haste, acarretando maior estabilidade e rigidez da síntese e possibilitando a
colocação de parafusos de bloqueio de maior diâmetro, que permitem suportar
melhor a sobrecarga mecânica durante o período de consolidação. A fresagem do
canal medular pode ainda favorecer a consolidação da fratura através de um
terceiro mecanismo que seria a liberação no foco de fratura de restos celulares e
28
teciduais decorrente da destruição mecânica do endósteo. O aporte de células
multipotentes da medula óssea e a consequente liberação local de fatores de
crescimento induziriam uma resposta inflamatória altamente favorável à
instalação da cascata da consolidação óssea (BHANDARI e SCHEMITSCH,
2002; WENISCH et al., 2005).
Desta maneira, quando a consolidação óssea não ocorre no tempo previsto, entre
quatro e seis meses, a HIMB passa a sofrer uma maior sobrecarga mecânica.
Esta sobrecarga pode acarretar em fadiga do metal e quebra dos parafusos de
bloqueio, ocorrendo a dinamização do sistema. Esta complicação acarreta
aumento da instabilidade da síntese e perpetua a falta de consolidação óssea. As
causas de fadiga do implante são a falta de consolidação óssea decorrente de
uma perda óssea extensa, redução inadequada da fratura, erros técnicos de
colocação da HIMB e infecção óssea após a osteossíntese (SOMFORD et al.,
2013).
A falta de consolidação ou retarde de consolidação de uma fratura da diáfise
femoral é uma complicação grave, com alta morbidade e resultados funcionais
insatisfatórios. A maioria dos relatos sobre a falta de consolidação de uma fratura
da diáfise do fêmur são constituídos por grupos heterogêneos de pacientes, sem
levar em consideração o tipo de tratamento inicial da fratura (CHRISTIENSEN,
1973; HARPER, 1984; HEIPKE et al., 1985; KEMPF et al., 1986, KLEMM, 1986;
CURYLO e LINDSEY, 1994). Isto torna difícil a caracterização dos aspectos
típicos e dos problemas que geram pseudartrose após o emprego de HIMB. Em
um estudo de uma série de casos em 35 pacientes (PIHLAJAMÄKI et al., 2002),
29
foi observado que a pseudartrose da diáfise do fêmur estava relacionada com o
padrão da fratura, com lesão de partes moles e erros técnicos decorrentes da
introdução da HIMB.
CALORI et al. (2007), descreveram dois tipos de fatores de risco para a falta de
consolidação de uma fratura. Os riscos gerais tais como idade, gênero, dieta,
diabetes, osteoporose, tabagismo, uso de anti-inflamatórios não hormonais e
álcool e os riscos relacionados ao mecanismo inicial da lesão como tipo de
fratura, lesão de partes moles, infecção local e grau de energia do trauma.
TAISTSMAN et al. (2009), em estudo de caso-controle com 45 pacientes com 46
faltas de consolidação de fraturas femorais (casos) e 92 pacientes com fraturas
femorais consolidadas (controle), concluíram que tabagismo, fratura exposta e a
demora em iniciar carga no membro fraturado após a osteossíntese, eram fatores
de risco para falta de consolidação óssea da fratura do fêmur tratadas com a
HIMB.
Após osteossíntese as principais causas da falta de consolidação óssea de uma
fratura do fêmur são a mobilidade devido a uma fixação inadequada, a
desvascularização óssea por lesão das partes moles circundantes, a perda óssea
resultante do trauma, por distração iatrogênica com a HIMB e infecção óssea pós-
cirúrgica (LYNCH et al., 2008).
30
2.4 DIAGNÓSTICO DA FALTA DE CONSOLIDAÇÃO APÓS TRATAMENTO COM
HIMB
Devido à estabilidade que a HIMB propicia ao fêmur, o paciente pode
caminhar e reabilitar o membro mesmo na ausência de consolidação total da
fratura. O diagnóstico de falta de consolidação, em alguns casos, ocorre apenas
quando o paciente refere dor local e o exame radiográfico revela que houve
quebra do metal por fadiga de um parafuso de bloqueio (BRINKER e
O´CONNOR, 2008).
A radiografia convencional continua a ser o exame complementar mais
simples e útil para o diagnóstico da falta de consolidação de uma fratura. Em uma
revisão de 122 estudos de tratamento de fraturas, que utilizaram critérios
radiográficos para avaliar a consolidação, as radiografias convencionais foram
utilizadas em 98% dos estudos. Apenas 1% dos estudos se baseou em imagens
de tomografia computadorizada e ultrassom (CORRALES et al., 2008). Em casos
especiais a cintilografia óssea, ultrassonografia e tomografia computadorizada
são alternativas que podem auxiliar a esclarecer algum aspecto do diagnóstico.
A tomografia computadorizada talvez seja o exame de maior acurácia,
porém sua aplicação é limitada pelo custo elevado e pela dose excessiva de
radiação sobre o paciente, quando comparada com as radiografias convencionais.
Já a ressonância nuclear magnética, devido a grande quantidade de artefatos que
surgem na imagem devido a presença do implante metálico intramedular, não é a
melhor opção para o diagnóstico (CORRALES et al., 2008).
31
A análise precisa do calo ósseo, mesmo na radiografia convencional é
dificultada pela posição intramedular do implante metálico. Por este motivo, na
investigação da consolidação se utiliza preferencialmente um critério de avaliação
radiográfica que considera a análise de cada cortical em separado. A
continuidade cortical, a perda da visibilidade da linha de fratura e a presença de
calo ósseo são os principais achados radiográficos utilizados pela maioria dos
escores para avaliar a consolidação óssea após o uso de HIMB (DIJKMAN et al.,
2010).
Entretanto, foi demonstrado que a aparência radiográfica de consolidação
de uma fratura não está diretamente relacionada à estabilidade mecânica do
osso. McCLELLAND et al. (2007), ao observar a falta de correlação entre os
achados radiográficos e as medidas de rigidez no foco de fratura concluíram que
a avaliação da consolidação óssea, através de radiografias por si só é inexata.
Portanto, a definição de consolidação óssea, depende da associação da
avaliação radiográfica e funcional. A avaliação clínica se baseia na ausência de
dor e mobilidade no foco de fratura, associado a uma boa função do membro,
caracterizada por boa mobilidade articular do quadril e joelho ipsilateral e
capacidade para suportar a carga corporal sem auxílio de muletas no membro
fraturado (BHANDARI et al., 2002).
Face a estas dificuldades em estabelecer critérios para o diagnóstico
preciso de falta de consolidação, KOOISTRA et al. (2010) desenvolveram um
escore para avaliação radiográfica da fratura tibial após osteossíntese
intramedular. Nesta avaliação cada cortical é analisada separadamente, utilizando
32
as incidências radiográficas em anteroposterior e perfil, levando em consideração
a presença de calo ósseo e a visualização da linha de fratura. Baseado neste
escore considera-se que uma fratura diafisária de um osso longo do membro
inferior, estabilizada com HIMB, encontra-se consolidada quando o somatório da
pontuação na análise de cada cortical é maior ou igual a 10 pontos.
2.5 PREDISPOSIÇÃO GENÉTICA NA PSEUDARTROSE
Embora a associação de pseudartrose de um osso longo com alguns
fatores de risco já esteja bem estabelecida na literatura, ainda persistem diversas
incógnitas relacionadas com o desenvolvimento da doença. Independente da
presença de fatores de risco, por que apenas um determinado grupo de pacientes
desenvolvem pseudartrose? Será que fatores sistêmicos ou deficiência na função
celular podem desencadear consolidação inadequada da fratura? (HOFMANN et
al., 2008; DIMITRIOU et al., 2011).
Com o objetivo de avaliar a possibilidade de variantes genéticas
influenciarem no processo de consolidação e, consequentemente, predispor a
pseudartrose, alguns estudos avaliaram a correlação entre genes relacionados
com consolidação óssea. Dentre os resultados encontrados, foram observados
polimorfismos nos genes PDGF (ZECKEY et al., 2011), NOGGIN e SMAD6 na via
de ativação de BMP (DIMITRIOU et al., 2011), que foram apontados como fatores
que podem contribuir para a ocorrência de pseudartrose. Um possível mecanismo
envolvido com a patogenia da pseudartrose seria a existência de polimorfismos
em regiões específicas do DNA relacionadas com algumas fases da
33
consolidação, como a resposta inflamatória, a proliferação fibroblástica e a
diferenciação de células osteoprogenitoras (ANEXO V).
Na fase inicial da consolidação, a proliferação de osteoprogenitores e
fibroblastos estão intimamente associados à expressão de BMPs e FGF. A BMP4
é um membro da superfamília TGF-β, está localizada no cromossomo 14q22-23 e
tem origem, estrutura e funções semelhantes a BMP2. Foi demonstrado que a
sua haploinsuficiência pode resultar em alterações esqueléticas em camundongos
(DUMN et al., 1997). Outra característica da BMP4 é o aumento da sua
expressão durante o processo de consolidação de fraturas (NAKASE et al., 1994;
BOSTROM et al., 1995). Em estudo realizado entre membros de uma mesma
família, FURUSHIMA et al. (2002), avaliaram sessenta e quatro genes associados
ao metabolismo ósseo e observaram que apenas a BMP4 preenche os critérios
sugestivos de relação com o metabolismo ósseo.
O FGF regula a resposta celular através da ligação e ativação de um grupo
de quatro receptores tirosina-quinase (FGFR1-FGFR4), que possuem diferentes
funções biológicas (JOHNSON e WILLIAMS, 1993). Os fibroblastos, por sua vez,
são capazes de expressar um amplo número de fatores angiogênicos e
osteogênicos, diretamente envolvidos com o processo de reabsorção óssea.
(TUNYOGI-CSAPO et al., 2007). O antagonismo entre os sistemas de sinalização
de FGF e BMP já foi descrito em diversos estudos (FURTHAUER et al, 2004;
DELAUNE et al., 2005; WEISENGER et al., 2008).
34
O gene FAM5C (family with sequence similarity 5, member C) é uma
proteína mitocondrial induzida pelas vias de BMP e ácido retinóico, localizada no
cromossomo 1q31.1, originalmente identificada em cérebros de camundongos
(KAWANO et al., 2004). Este gene está relacionado com a mediação do processo
inflamatório (RIBEIRO et al., 2012) através de diversas funções celulares, tais
como proliferação, migração e apoptose celular. O FAM5C também está
relacionado com algumas doenças como ateroesclerose (SHORTS-CARY et al.,
1997), infarto do miocárdio (CONNELLY et al., 2008) e periodontite agressiva
(CARVALHO et al., 2010). Apesar do gene FAM5C induzir a diferenciação
fibroblástica in vitro a sua função no processo de consolidação óssea ainda é
desconhecida (TANAKA et al., 2012).
2.6 TERAPIA CELULAR E PSEUDARTROSE
Diante do grande número de pacientes que sofrem traumas de diversas
origens nos grandes centros urbanos, a pseudartrose e o retarde de consolidação
passaram a constituir uma patologia de alta prevalência nos centros
especializados em Ortopedia e Traumatologia (EINHORN, 1995). As
complicações musculoesqueléticas a curto e em médio prazo geram um alto custo
social por exigirem acompanhamento médico permanente e incapacidade física,
impedindo que os pacientes, em grande parte jovens, tenham uma vida produtiva
normal. Como o tratamento convencional baseia-se em um procedimento
cirúrgico agressivo, caracterizado pela troca da HIMB por um diâmetro maior, com
fresagem do canal medular e em alguns casos o emprego da enxertia óssea do
ilíaco, a qual pode determinar sequela na área doadora, torna-se necessário que
35
novas opções terapêuticas menos invasivas sejam desenvolvidas para melhorar a
eficácia das opções já existentes (NAUTH et al., 2011).
As células multipotentes são encontradas principalmente na medula óssea e
tem a capacidade para se diferenciar em gordura, músculo, cartilagem e osso,
dentre outros tecidos especializados (PITTENGER et al, 1999). IWAKURA et al.
(2009) demonstraram que o hematoma fraturário contem células progenitoras
mesenquimais multipotentes, cruciais para a regeneração óssea. O tratamento da
pseudartrose da diáfise do fêmur através da infiltração de concentrado autólogo
de medula óssea, foi descrito como uma opção minimamente invasiva ao
tratamento convencional (HEALEY et al., 1990; CONNOLLY et al., 1991;
HERNINGOU et al., 2005; KIM et al., 2009; CENTENO et al., 2011 ).
Parece existir uma demanda universal por procedimentos cirúrgicos mais
efetivos e menos invasivos, capazes de regenerar as perdas ósseas e de tecidos
musculoesqueléticos em geral, decorrentes de traumas, ressecções cirúrgicas ou
condições ortopédicas que comprometem o esqueleto. Dentro deste contexto, a
bioengenharia ortopédica surgiu como uma alternativa altamente promissora,
capaz de atender integramente a esta demanda através de estratégias que
incluem a utilização de proteínas morfogênicas, fatores de crescimento, citocinas,
suportes estruturais e, principalmente, células. Várias combinações destes
diferentes componentes, adaptados para aplicações específicas em ortopedia e
traumatologia, mostram-se bastante promissores em modelos pré-clínicos e
clínicos. Independentemente da estratégia utilizada, o objetivo final é sempre
induzir a reconstrução tecidual endógena, reduzindo a necessidade de outros
36
procedimentos cirúrgicos. Entretanto a medida ideal de cada um desses
componentes dentro de uma única proposta terapêutica seria aquela onde fosse
possível manter o efeito local a longo prazo, sem que houvesse ocorrência de
efeitos colaterais. Em condições favoráveis a estratégia poderia resultar
diretamente na regeneração de perdas ósseas ou na recuperação do potencial de
consolidação óssea. Dentre os elementos que classicamente fazem parte dos
protocolos de bioengenharia ortopédica, as células têm um papel de destaque,
uma vez que qualquer regeneração tecidual requer a presença de células
capazes de formar o tecido desejado. Em consequência, as terapias celulares
constituem a primeira linha de escolha por serem capazes de suprir os locais com
um número substancial de células com características que permitam, não
somente a formação de osso e dos tecidos musculoesqueléticos mas que
principalmente, seja capaz de manter o turnover ósseo durante toda a vida.
Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar a viabilidade
de um protocolo alternativo a cirurgia convencional, menos invasivo, baseado na
infiltração de concentrado de medula óssea autóloga, e sua efetividade na
consolidação de pseudartroses da diáfise do fêmur previamente estabilizadas
com HIMB.
37
3. OBJETIVOS
Geral
Avaliar a consolidação óssea após o tratamento com infiltração de
concentrado autólogo de células mononucleares da medula óssea (BMMNCs) em
uma série de pacientes com pseudartrose da diáfise do fêmur tratadas com HIMB.
Específicos
1. Avaliar se a idade, gênero, tipo de fratura do fêmur, número de cirurgias
prévias, tipo e duração da pseudartrose e presença de comorbidades
influenciaram na resposta ao tratamento com a infiltração de BMMNCs autólogas.
2. Avaliar a neoformação óssea no foco de pseudartrose por critério radiográfico.
3. Avaliar se o número de BMMNCs injetadas no foco de pseudartrose tem
influencia na ocorrência de consolidação óssea.
4. Avaliar a possível relação entre o polimorfismo dos genes BMP4, FGFR-1 e
FAM5C e pseudartrose da diáfise do fêmur.
38
4. PACIENTES E MÉTODOS
4.1 PACIENTES
Fizeram parte do presente estudo dezesseis pacientes de ambos os sexos
(11 homens) com idade entre 18 e 60 anos, portadores sintomáticos de
pseudartrose oligotrófica ou atrófica da diáfise femoral e que não responderam ao
tratamento com a inserção de HIMB. Todos foram recrutados no Centro de
Trauma do Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia Jamil Haddad
(INTO/MS) no Rio de Janeiro no período entre janeiro/2010 a janeiro/2011. Antes
de ingressarem no estudo, mediante a assinatura do termo de consentimento livre
e esclarecido, os voluntários foram informados sobre os benefícios e alertados
para possíveis complicações do procedimento com a infiltração de BMMNCs no
foco de pseudartrose. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do INTO (CEP/INTO no123/06) (ANEXO I).
Todos os pacientes foram diagnosticados com pseudartrose asséptica da
diáfise femoral, tratada com HIMB e com estabilidade mecânica do foco de
fratura. A lesão inicial da diáfise femoral foi classificada segundo os critérios da
Arbeitsgemeinschaft für Osteosynthesefragen (AO) e da Orthopaedic Trauma
Association (OTA) (MARSH, 2007) (ANEXO II). As fraturas expostas foram ainda
categorizadas segundo os critérios de Gustilo-Anderson (GUSTILO e
ANDERSON, 1976) (ANEXO III).
O diagnóstico de pseudartrose foi estabelecido em radiografias simples,
oblíquas, anteroposterior (AP) e perfil do fêmur e definida como a ausência de
39
consolidação num período de até nove meses após a ocorrência da fratura, e que
evoluiu nos últimos três meses sem sinais de progressão do calo ósseo
(BRINKER e O´CONNOR, 2008). Foram considerados como critério de exclusão
deste estudo:
pacientes com idade menor de 18 anos ou maior de 60 anos;
ausência de estabilidade no foco de fratura;
falha do implante metálico;
outro tipo de osteossíntese que não HIMB;
uso continuado de qualquer medicação que pudesse interferir com o
processo de consolidação óssea como glicocorticóide sistêmico;
tratamento com terapia imunossupressora;
portadores de doenças sistêmicas inflamatórias e autoimunes;
fraturas patológicas;
infecção local ou sistêmica de outra natureza;
portadores de discrasias sanguíneas ou doenças hematológicas
graves;
portadores de neoplasias malignas exceto carcinoma basocelular;
diabetes descompensada;
insuficiência renal crônica;
transplantados renais, cardiopatia grave descompensada;
icterícia à esclarecer;
alcoolismo.
40
4.2 DIAGNÓSTICO DE CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA
Para monitorizar o desenvolvimento e a evolução do calo ósseo, os
pacientes foram acompanhados através de radiografias simples em AP e perfil
seis semanas, quatro, seis e doze meses após infiltração das células no foco de
pseudartrose. O diagnóstico clínico de consolidação óssea foi estabelecido no
paciente sem queixa álgica no local da fratura e que fosse capaz de sustentar o
peso e deambular sem auxílio ou uso de muletas. O diagnóstico radiográfico de
consolidação da fratura foi feito utilizando-se a escala RUST (KOOISTRA et al.,
2010). Este escore radiográfico de consolidação de fratura diafisária baseia-se na
avaliação de radiografias em AP e perfil, na presença/ausência de ponte óssea
unindo o foco de fratura e na presença/ausência de linha de fratura visível. Esses
parâmetros são quantificados e pontuados segundo a QUADRO 2:
QUADRO 2 – Avaliação de consolidação óssea pela escala quantitativa RUST.
ESCALA DE AVALIAÇÃO DE CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA*
CALO ÓSSEO LINHA DE FRATURA PONTUAÇÃO
Ausente Visível 1
Presente Visível 2
Presente Não visível 3
* Avaliação é feita em cada uma das quatro corticais. A pontuação mínima é de quatro pontos e a máxima de 12 pontos.
41
O diagnóstico de consolidação radiográfica foi estabelecido nos pacientes
com escore ≥10 na avaliação pela escala RUST. Foram considerados como não
tendo respondido à terapia celular, pacientes que ao final do período de segmento
ainda apresentavam evidência radiográfica de não consolidação da fratura
(escore ≤10) e que permaneceram com limitação clínica devido a dor no local da
fratura.
4.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
4.3.1 Obtenção e concentração do aspirado de medula óssea
A aspiração da medula óssea foi feita com o paciente sob efeito de
anestesia geral, no centro cirúrgico, com o paciente posicionado em decúbito
lateral. Após assepsia local, foi feita uma incisão cutânea, com cerca de 5 mm na
porção posterior da crista ilíaca, onde a agulha de punção (11G x 10cm,
Bloodline, Medolla, Italy) foi introduzida sob pressão, para a aspiração da medula
óssea. As amostras de medula óssea foram obtidas em seringas de 10 mL
homogeneizadas com heparina (2.500UI) em alíquotas de 2-3 mL, para reduzir o
grau de diluição com sangue periférico (MUSCHLER et al., 1997; HERNIGOU et
al., 2006). Para permitir que a aspiração atingisse um amplo território ósseo, a
agulha foi regularmente reposicionada na crista ilíaca (FIGURA 2).
42
O conteúdo de cada seringa foi coletado em uma bolsa plástica contendo
heparina (2.500UI) até atingir o volume de 200 mL de medula óssea total. A
seguir, o aspirado medular foi filtrado em um sistema fechado (Bone marrow kit,
R4R 2107; Baxter, Deerfield, Illinois) através de uma sequência de três filtros com
poros progressivamente menores, constituintes do próprio sistema do kit. Através
desta filtração foram removidas partículas de grandes dimensões como glóbulos
de gordura, fragmentos ósseos e coágulos sanguíneos (FIGURA 3).
FIGURA 2 - Obtenção do
aspirado medular da crista
ilíaca posterior. O aspirado foi
obtido por aspiração lenta com
agulha do tipo Jamishidi, em
alíquotas de 2-4 mL. A cada
10 mL de medula óssea
aspirada a agulha era
reposicionada para evitar a
diluição com sangue.
FIGURA 3 - Sistema fechado de
filtração com sequência de filtros
(poros 100, 500 e 800 m) para
remoção de material particulado.
43
Após a filtração as células foram coletadas na última bolsa do kit (bolsa de
transferência) e submetidas à centrifugação por cerca de 20 minutos em um
sistema separador de células (Sepax, Biosafe, Geneva, Switzerland) (FIGURA 4).
Através da centrifugação removia-se do aspirado total a maior parte das
hemácias, a maior parte do plasma e de neutrófilos, permanecendo a fração de
células mononucleares onde os progenitores mesenquimais e hematopoéticos
estão contidos. Desta forma, o volume inicial aproximado de 200 mL de aspirado
medular foi reduzido para 40 mL de BMMNCs. Em ambiente estéril (fluxo laminar,
FIGURA 5) e em sistema fechado, as BMMNCs foram coletadas na bolsa coletora
do kit e, no centro cirúrgico, foram aspiradas para uma seringa de 50 mL para a
infiltração no foco de pseudartrose (FIGURA 6).
FIGURA 4 - Sistema fechado
para redução de volume
para concentração de
medula óssea (Sepax,
Biosafe).
44
4.3.2 Infiltração do concentrado de BMMNCs
Ainda sob efeito da anestesia geral e no mesmo procedimento cirúrgico
para aspiração da medula óssea, o paciente foi reposicionado na mesa cirúrgica e
colocado sob um intensificador de imagens para o controle radiográfico do
procedimento. A seguir, cerca de 40 mL da suspensão celular foi injetada
lentamente, por via percutânea, no foco da pseudartrose e nas extremidades do
osso adjacente (FIGURA 7A). A injeção da suspensão celular foi guiada por
FIGURA 5 - Manipulação em
ambiente estéril da bolsa contendo o
concentrado de BMMNCs para
retirada das amostras para controle
microbiológico.
FIGURA 6 - Aspiração do concentrado de
BMMNCs para infiltração no foco de
pseudartrose.
45
fluoroscopia biplanar e feita de forma circunferencial no foco de fratura (região
medial, lateral, posterior e anterior) com uma agulha de punção idêntica à
utilizada para aspiração da medula óssea (FIGURA 7B).
O intervalo de tempo entre o final da coleta do aspirado de medula e a
infiltração das células foi de cerca de 60 minutos.
4.4 ANÁLISE LABORATORIAL
4.4.1 Contagem do número de células
O número de BMMNCs injetadas no foco de pseudartrose foi calculado
multiplicando o volume do concentrado celular pelo número de células
mononucleares obtido no hemograma pós-concentração. A viabilidade celular foi
avaliada numa pequena alíquota pela técnica de exclusão do Azul de Trypan
antes da injeção e expressa em % do total de células. Também foram realizados
FIGURA 7 – Infiltração do concentrado de BMMNCs no foco de pseudartrose
(A) guiada por controle fluoroscópico (B).
46
teste de esterilidade (hemocultura para identificação e caracterização de agentes
microbianos) numa alíquota de 3 mL da suspensão celular, antes e após o
procedimento de concentração.
4.4.2 Avaliação genética de polimorfismo em pacientes com pseudartrose
Foi realizado um estudo preliminar com 66 pacientes portadores de
pseudartrose e 101 pacientes com fratura consolidada de um osso longo,
selecionados no Centro de Trauma do Instituto Nacional de Traumatologia e
Ortopedia Jamil Haddad durante um ano. A característica genética dos 16
pacientes foi estudada individualmente e correlacionada aos resultados clínicos
obtidos pós-tratamento com BMMNCs, como forma de conhecer a influência da
predisposição genética à pseudartrose no resultado do tratamento. Os dezesseis
pacientes participantes desta série estavam incluídos nesta amostra inicial
(GUIMARÃES et al., 2013).
Seleção do polimorfismo em um único nucleotídeo (SNP) e genotipagem
O DNA genômico foi extraído de amostras de saliva dos pacientes, de
acordo com protocolo já estabelecido (KUCHLER et al., 2012). A quantidade e a
pureza do DNA foram determinadas em espectrofotômetro tipo Nanodrop®
(Thermo Scientific, Wilmington, USA). Todas as amostras de DNA apresentaram
razão A260nm/A280nm maiores do que 1.9, tendo aproveitamento de 100%.
Para genotipagem desses pacientes, foram consideradas as análises das
regiões polimórficas que demonstraram correlação significativa com o
desenvolvimento de pseudartrose (BMP4 rs17563 e FGFR1 rs13317) ou com
47
proteção à doença (FAM5C rs1342913) (ANEXO V). Estes SNPs (Single
Nucleotide Polymorphisms) foram selecionados com base no registro do banco de
dados do Centro Nacional de Informação em Biotecnologia
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/), apresentando menor frequência alélica maior
do que 0.2. A seleção destas regiões teve como base a distribuição étnica e a
participação destes genes no processo de regeneração óssea. O detalhamento
das variantes genéticas está descrito na TABELA 1.
TABELA 1 – Variantes genéticas dos genes investigados.
Gene Cromossoma SNP ID Tipo SNP* Posição do par de base
Alteração na Base **
MFA***
BMP4 Ch14 rs17563 Exon 54417522 C>T
0.371
FAM5C Ch1 rs1342913 Intron 190121025 A>G
0.379
FGFR1 Ch8 rs13317 3`UTR 38269514 C>T
0.275
*Single Nucleotide Polymorphisms; **Segundo Applied Biosystem; ***MFA: frequência do menor alelo segundo o GenBank;
48
A genotipagem das regiões selecionadas foi realizada através da reação
em cadeia de polimerase em tempo real utilizando sistema TaqMan (Applied
Biosystems, Foster City, CA) em um total de 1,5 mL / reação em termociclador
PTC-225 (Peltier Thermal Cycler, Bio-Rad Life Science, Corston, UK).
4.5 ACOMPANHAMENTO CLÍNICO DOS PACIENTES
Após a infiltração das células, os pacientes foram submetidos à avaliação
clínica e radiográfica com duas e quatro semanas, respectivamente, depois do
procedimento. A seguir as avaliações tornaram-se mensais até o oitavo mês e
semestral até o final do segundo ano. A avaliação da evolução do processo de
consolidação da fratura e a comparação com o padrão inicial da lesão antes do
tratamento foi realizado em radiografias simples (AP e perfil). O desfecho primário
do estudo foi à ocorrência de consolidação radiográfica avaliada pela escala
RUST e pela avaliação clínica.
4.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A significância das variáveis nominais entre os pacientes foi verificada pelo
teste do qui-quadrado (χ2). O teste de Shapiro-Wilk foi empregado para avaliar a
normalidade da distribuição dos dados das variáveis numéricas. O teste t de
Student foi utilizado para determinar diferenças entre a idade dos pacientes, entre
a variação do valor dos escores radiográficos antes e depois da terapia celular e
entre o número de células injetadas na lesão. O teste não paramétrico de Mann-
Whitney foi utilizado para determinar diferenças entre os tempos de evolução da
pseudartrose. A análise estatística foi feita utilizando-se o programa STATA 11.1
49
(StataCorp, Texas USA). Foram consideradas estatisticamente significativas
diferenças com valor de p menor do que 0.05.
50
5. RESULTADOS
5.1. PACIENTES
Todos os pacientes preencheram os critérios de inclusão/exclusão do
protocolo do estudo e compareceram a todas as etapas do acompanhamento
clínico (consultas e exames de imagem). Em todos os pacientes o tratamento
com infiltração com concentrado autólogo de BMMNCs foi realizado utilizando-se
o mesmo método de obtenção e concentração dos aspirados de medula total.
Tanto os procedimentos cirúrgicos como laboratoriais foram realizados
integralmente no Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia Jamil Haddad,
pela mesma equipe cirúrgica e laboratorial. Em nenhum dos pacientes foi
observado qualquer tipo de complicação local ou sistêmica, precoce ou tardia.
Todos os pacientes receberam alta hospitalar em menos de 24 horas após o
procedimento cirúrgico.
A fratura da diáfise femoral em doze dos 16 pacientes era fechada e em
quatro pacientes era exposta. A distribuição dos pacientes segundo o tipo de
fratura de acordo com a classificação da AO/OTA foi de oito pacientes portadores
de fratura tipo 32-A, de seis pacientes eram portadores de fratura tipo 32-B e de
dois pacientes do tipo 32-C. Quatro pacientes apresentavam fratura concomitante
(tipo 31-B) do colo femoral já consolidada no momento da terapia celular. O tipo
de fratura exposta presente inicialmente em quatro pacientes foi classificado de
acordo com os critérios de Gustilo-Anderson em tipo I (n=3) e tipo II (n=1).
51
Antes do procedimento para infusão das BMMNCs, todos os pacientes,
foram diagnosticados, através da análise de radiografias convencionais nas
incidências anteroposterior e lateral, como tendo estabilidade mecânica do foco
de pseudartrose. Para o diagnóstico de estabilidade mecânica consideramos a
integridade dos implantes, o alinhamento do eixo e da rotação do fêmur e
ausência de sinais de reabsorção óssea em torno dos componentes do implante.
O tipo de pseudartrose classificada segundo o critério de WEBER e CECH
(1976) demonstrou que em sete pacientes a falta de consolidação óssea era do
tipo atrófica e em nove pacientes era do tipo hipotrófica. O tempo médio de
evolução entre a ocorrência da fratura e o tratamento com BMMNCs foi de 41,8
meses (faixa entre 09-97 meses).
Além da intervenção cirúrgica para colocação da HIMB, os pacientes foram
submetidos a um (n=4), dois (n=3) e a três (n=2) procedimentos cirúrgicos
adicionais para tratar eventos relacionados com a consolidação da fratura da
diáfise femoral. Em cinco pacientes havia relato de comorbidades: tabagismo em
quatro e tabagismo e diabetes em um paciente. Os dados demográficos dos
pacientes estão resumidos na TABELA 2.
52
TABELA 2. Resumo dos achados clínicos dos pacientes com pseudartrose da diáfise femoral tratados com HIMB.
Sexo/
Idade
Mecanismo
inicial lesão
Tipo fratura
G-A AO/OTA
Cirurgias
prévias
Pseudartrose
Comorbidades
Tipo Tempo*
F, 35 Acidente Auto Fechada, 32A 2 Oligo 95 Não
F, 43 Acidente Auto Fechada, 32A 2 Oligo 50 Não
F, 44 Acidente Auto Fechada 32B, 31B 3 Oligo 71 Não
M, 27 Acidente Moto Fechada, 32B 4 Oligo 48 Não
M, 52 Queda Fechada, 32A 3 Oligo 62 Não
M, 45 Atropelamento Fechada, 32C, 31B 1 Oligo 60 Não
F, 54 PAF Exposta GII, 32B 1 Atrófica 22 Não
M, 28 Acidente Moto Exposta GI, 32A 3 Oligo 69 Não
M, 44 Acidente Moto Fechada, 32C, 31B 1 Atrófica 15 Não
M, 24 Acidente Auto Fechada, 32B 1 Atrófica 09 Tabagismo
M, 45 Acidente Auto Fechada 32A, 31B 1 Atrófica 14 Tabagismo/DM
M, 37 Acidente Moto Exposta GI, 32B 4 Oligo 97 Tabagismo
M, 19 Atropelamento Fechada, 32A 1 Atrófica 15 Tabagismo
M, 30 Acidente Moto Fechada, 32B 1 Atrófica 15 Não
F, 19 Acidente Moto Fechada, 32A 2 Atrófica 12 Não
M, 59 Queda Exposta GI, 32B 2 Oligo 15 Tabagismo
* Tempo em meses.
F = feminino; M = masculino; PAF = projetil de arma de fogo; G-A = Gustilo-Anderson;
AO/OTA = Arbeitsgemeinschaft für Osteosynthesefragen (AO) / Orthopaedic Trauma Association (OTA);
Oligo = oligotrófica; DM = diabetes mellitus.
53
5.2. AVALIAÇÃO DA CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA APÓS TRATAMENTO COM
INFILTRAÇÃO DE BMMNCs NO FOCO DE PSEUDARTROSE
A consolidação da pseudartrose da diáfise femoral ocorreu em oito dos 16
pacientes tratados com infiltração de BMMNCs. A avaliação pela escala RUST foi
maior do que 10 pontos em todos os pacientes que evoluíram para consolidação
óssea. Os demais oito pacientes que não consolidaram apresentaram pontuação
menor do que 10 (faixa entre 4 e 9 pontos).
O diagnóstico de consolidação da pseudartrose nos oito pacientes que
responderam ao tratamento foi estabelecido através dos achados radiográficos
quantitativos (RUST) e por exame físico através da demonstração da capacidade
de deambular sem auxílio de muletas e ausência de dor no foco de fratura. Em
todos os pacientes que participaram do estudo, independentemente da ocorrência
ou não de consolidação, a infiltração de BMMNCs no foco de pseudartrose
promoveu aceleração da produção local de osso após 4.75±1.75 meses (faixa 3-8
meses). A variação nos valores do escore da escala RUST foi significativamente
maior nos pacientes que consolidaram em relação àqueles que não responderam
ao tratamento (p<0,00002). Os aspectos radiográficos da fratura antes da injeção
de BMMNCs bem como o segmento individualizado dos pacientes estão
ilustrados no ANEXO III.
A partir do oitavo mês não observamos evolução do processo de formação
óssea, equivalendo dizer que nos oito pacientes que responderam ao tratamento
a consolidação ocorreu num prazo máximo de oito meses. Os valores individuais
da avaliação através da escala RUST antes e depois da infiltração de BMMNCs e
o tempo para atingir a consolidação estão discriminados na TABELA 3.
54
TABELA 3. Escores radiográficos segundo a escala RUST antes e depois da infiltração de BMMNCs no foco de pseudartrose e tempo de consolidação.
Escore radiográfico segundo
escala RUST Tempo de consolidação (meses)
Pré Pós* Variação
1 4 8 2 -
2 5 7 2 -
3 5 9 4 -
4 5 11 6 6
5 6 10 4 8
6 6 12 6 6
7 4 11 7 4
8 6 7 1 -
9 4 4 0 -
10 6 12 6 4
11 4 12 8 5
12 4 4 0 -
13 5 7 2 -
14 4 7 3 -
15 5 12 7 6
16 6 12 6 4
* Avaliação feita 12 meses após a injeção de BMMNCs.
55
5.3. CARACTERÍSTICAS DO INFILTRADO DE BMMNCs
Apesar da padronização de todas as etapas da coleta e do
processamento da medula óssea, observamos uma ampla variação no
número de células mononucleares injetadas nos pacientes. O número
individual de células e a resposta ao tratamento estão resumidos na
TABELA 4. Em nenhum dos pacientes houve crescimento bacteriano nas
amostras de medula óssea total ou no concentrado mononuclear pré e pós-
processamento laboratorial.
56
TABELA 4. Número de BMMNCs presentes em 40mL do concentrado celular
injetado no foco de pseudartrose e o segmento dos pacientes.
BMMNCs injetadas no
foco de pseudartrose (x 108)
Resposta ao tratamento
(consolidação)
1 10.6 Não
2 7 Não
3 7.4 Não
4 34 Sim
5 17 Sim
6 15.4 Sim
7 8 Sim
8 12.5 Não
9 8 Não
10 22 Sim
11 19 Sim
12 15 Não
13 10.3 Não
14 7.7 Não
15 23 Sim
16 17 Sim
57
5.4. PROCEDIMENTO CIRÚRGICO PARA INFILTRAÇÃO DE BMMNCs
Um total de 40 mL de concentrado celular mostrou-se suficiente para
originar um hematoma no foco de pseudartrose, mimetizando uma situação
inicial de uma fratura recente. Os casos sintomáticos ou aqueles que não
apresentaram sinais de evolução radiográfica para a consolidação óssea
foram submetidos, posteriormente, à cirurgia convencional para troca de
haste intramedular e enxertia óssea autóloga para correção da pseudartrose.
5.5. SUSCEPTIBILIDADE GENÉTICA NA PSEUDARTROSE
5.5.1 Caracterização genotípica dos pacientes tratados com BMMNCs
Todas as frequências dos alelos e dos genótipos para todos os 16
SNPs avaliados estavam dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os
resultados evidenciaram que não houve diferença estatisticamente
significativa entre os grupos com e sem consolidação pós-tratamento com
BMMNCs, considerando a distribuição dos genótipos (TABELA 5) e dos
alelos (TABELA 6). Os genótipos dos pacientes tratados seguiu o mesmo
padrão de distribuição observado na amostra inicial de 66 pacientes
(ANEXO V), confirmando os resultados da genotipagem genética na
associação da doença: (1) os genótipos polimórficos (CT+TT) foram
predominantes para os genes BMP4 rs17563 (56.2%) e FGFR1 rs13317
(81.2%); (2) não houve diferença entre a distribuição dos alelos menos
frequentes T e C, para os genes BMP4 e FGFR1; (3) o genótipo não
polimórfico em homozigose AA, para o gene FAM5C rs1342913, foi o mais
58
frequente (total de 68.7%), confirmando a ausência de associação entre este
polimorfismo e pseudartrose.
58
TABELA 5. Análise dos genótipos nos pacientes com pseudartrose não consolidada e consolidada após tratamento com BMMNCs.
Total Frequência (%)
Gene SNP Genótipos n=16 Consolidada
n=8
Não Consolidada
n=8
P Odds ratio
95%IC
BMP4
rs17563
CC/CT/TT
CT+TT
7(43.8)/4(25)/5(31.2)
9(56.2)
3(37.5)/3(37.5)/2(25)
5(62.5)
4(50)/1(12.5)/3(37.5)
4(50)
0.51
0.50
1.6
0.22-12.22
FAM5C rs1342913 AA/AG/GG
AG+GG
11(68.7)/3(18.8)/2(12.5)
5(31.3)
5(62.5)/2(25)/1(12.5)
3(37.5)
6(75)/ 1(12.5)/1(12.5)
2(25)
0.80
0.49
1.8
0.21-15.40
FGFR1 rs13317 CC/ CT/TT
CT+TT
3(18.8)/6(37.4)/7(43.8)
13(81.2)
1(12.5)/4(50)/3(37.5)
7(87.5)
2(25)/2(25)/4(50)
6(75)
0.56
0.49
2.3
0.16-32.58
59
60
TABELA 6. Distribuição dos alelos.
Gene SNP ID A1 Total MFA_PC MFA_PNC p Odds Ratio
95% CI
BMP4 rs17563 T 0.43 0.44 0.43 0.75 0.96 0.22-4.1
FAM5C rs1342913 G 0.17 0.25 0.07 0.20 0.23 0.02-2.3
FGFR1 rs13317 C 0.40 0.38 0.43 0.52 1.25 0.28-5.4
A1: Menor alelo (baseado na amostra total)/ MFA_PC: menor frequência alélica nos pacientes com pseudartrose consolidada (PC) e MFA_PNC: menor frequência alélica nos pacientes com pseudartrose não consolidada (PNC). *p calculado pelo teste do qui-quadrado.
5.6 AVALIAÇÃO DAS VARIÁVEIS COMO PREDITORES DE
CONSOLIDAÇÃO ÓSSEA
A idade, gênero dos pacientes, tipo de fratura, número de cirurgias
prévias à infiltração celular, tipo e tempo de evolução de pseudartrose e
presença de comorbidades não influenciaram na resposta do paciente ao
tratamento com BMMNCs. A análise estatística mostrou que a variação no
escore RUST e o número de BMMNCs injetado no foco de pseudartrose foi
significativamente maior nos pacientes que responderam ao tratamento
(p<0,00002 e p<0,0005 respectivamente). Os oito pacientes que responderam
ao tratamento, receberam através da injeção percutânea no foco de
pseudartrose 19.42±7.47 x108 BMMNCs enquanto que os pacientes que não
responderam ao tratamento receberam 9.81±2.84x108 (TABELA 7).
61
TABELA 7. Distribuição dos fatores possivelmente relacionados a consolidação óssea da pseudartrose da diáfise do fêmur, após a infiltração de BMMNCs. (Valor de p calculado pelo teste do qui-quadrado*; teste t** e teste Mann-Whitney*** ).
CASUÍSTICA
P Consolidado
(n=8)
Não Consolidado
(n=8)
Idade (anos)
Média±DP
Mediana
(Min;Max)
35±8,94
36
(19; 44)
40,6±15,18
45
(19; 59)
0,38**
Gênero masculino
6 (75%) 5 (62,5%) 0,50*
Tipo de Fratura Fechada
Exposta
6 (75%)
2 (25%)
6 (75%)
2 (25%)
0,70*
>1 procedimento cirúrgico
4 (50%) 5 (62,5%) 0,50*
Tipo de Pseudartrose
Oligotrófica
Atrófica
4 (50%)
4 (50%)
5 (62,5%)
3 (37,5%)
0,50*
Tempo de evolução (meses)
Média±DP
Mediana
(Min;Max)
30,25±22,54
18,5
(9; 62)
53,12±34,74
59,5
(15; 95)
0,08***
Tabagismo
2 (25%) 3 (37,5%) 0,50*
Diabetes
1 (12,5%) 0 (0%) 0,50*
Variação escore RUST
Média±DP
Mediana
(Min;Max)
6,25±1,16
6
(4; 8)
2±1,6
2
(0; 4)
0,00002**
Número BMMNCs injetadas (x108)
Média±DP
Mediana
(Min;Max)
19,42±7,47
18
(8; 34)
9,81±2,84
9,15
(7; 15)
0,0005**
62
6. DISCUSSÃO
Apesar do avanço na tecnologia dos implantes ortopédicos e do
aprimoramento das técnicas cirúrgicas, o tratamento das pseudartroses de
ossos longos ainda é um problema de difícil solução na prática ortopédica. Por
cursar com um quadro de dor e incapacidade física importante, frequentemente
a pseudartrose de ossos longos está associada com alcoolismo, abuso de
drogas e o uso excessivo de medicamentos analgésicos. Outra consequência
direta da falta de consolidação de uma fratura de um osso longo é o alto custo
do tratamento para o sistema público e privado devido aos períodos
prolongados de hospitalização, com procedimentos cirúrgicos e pelo longo
tempo de inatividade física.
No nosso meio o problema pode ser dimensionado pelo elevado número
de pacientes com pseudartrose que aguardam cirurgias atualmente no Instituto
Nacional de Traumatologia e Ortopedia, órgão vinculado ao Ministério da
Saúde. A maior parte desses pacientes são indivíduos jovens com sequelas de
fraturas de ossos longos decorrentes de acidentes de transito e violência
urbana, que geram um alto custo social e financeiro para o SUS.
Alguns conceitos sobre o processo de consolidação das fraturas foram
recentemente revisados por CALLORI e GIANNOUDIS (2011). Através de uma
nova ótica, designada pelos autores de “Conceito Diamante” foi proposto um
conjunto de elementos complementares e indispensáveis para que ocorra a
consolidação de uma fratura: células osteogênicas, moléculas osteoindutoras,
condições estruturais para osteocondução, estabilidade mecânica e
vascularização adequada no foco de fratura. A falta ou o déficit de um ou mais
63
desses elementos, numa extensão capaz de comprometer a sequência
fisiológica do processo de consolidação, poderia predispor a ocorrência de não
consolidação em 5-30% dos pacientes com fratura de um osso longo
(GIANNOUDIS et al., 2008).
A importância da vascularização no foco de fratura para o processo de
consolidação óssea já está bem estabelecida na literatura especializada
(COURT-BROWN et al, 1995). O potencial tecidual local para desenvolver uma
rede vascular é mediado principalmente pelo fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) e repercute diretamente sobre o processo de consolidação.
Em termos gerais, é atribuída ao VEGF a mediação da invasão capilar que
constitui um pré-requisito para o processo de ossificação endocondral
(JACOBSEN et al., 2008).
A fratura exposta normalmente determina uma maior desvascularização
local. Na nossa série, em quatro pacientes a fratura diafisária do fêmur era
exposta, sendo que ocorreu consolidação óssea em dois casos. Nos pacientes
com fratura fechada (n=12) seis responderam ao tratamento com a infiltração
de BMMNCs. Acreditamos que a diáfise do fêmur, por apresentar uma melhor
cobertura muscular e consequentemente um bom aporte sanguíneo, mesmo
nas fraturas expostas graus I e II de Gustillo, não ocorre desvascularização
significativa. Por outro lado, nas fraturas expostas da diáfise da tíbia, a qual
apresenta uma extensa face subcutânea, a desvascularização é um achado
frequente que pode estar relacionado com o desenvolvimento de pseudartrose
(CHATZIYIANNAKIS et al., 1997). Da mesma forma, o número de cirurgias
prévias ao tratamento com BMMNCs não influenciou o resultado desta série.
Este achado provavelmente também está relacionado com a presença deste
64
envelope de partes moles, que garante uma vascularização adequada à diáfise
do fêmur e protege a região das agressões cirúrgicas.
A importância da genética como causa ou fator predisponente para
certas doenças é um fato inquestionável, sendo atribuído à constituição
genética individual os diferentes comportamentos e variações biológicas. As
alterações na sequência de informação contida em um segmento de uma base
de DNA no gene ou na região promotora, o polimorfismo genético, podem estar
relacionadas com a falta de consolidação óssea (GIANNOUDIS et al., 2007b).
Os dezesseis pacientes desta série foram selecionados aleatoriamente
de uma matriz inicial de 66 pacientes com pseudartrose (ANEXO V). Esta
etapa do estudo objetivou identificar se mesmo na presença de predisposição
genética, o tratamento com células seria capaz de promover a consolidação
óssea e, se os diferentes genótipos associados aos pacientes com
pseudartrose diferenciariam a resposta ao tratamento. Os resultados do
tratamento com BMMNCs mostraram, do ponto de vista genético, que os
pacientes que consolidaram e os que não consolidaram, não diferiram em
relação à distribuição dos genótipos para BMP4 rs17563, FGFR1 rs1342913 e
FAM5C rs13317, assim como a distribuição dos alelos. No entanto, o
percentual genotípico foi semelhante ao encontrado na matriz primária,
sugerindo que o tratamento com BMMNSc ultrapassa a predisposição genética
individual, considerando a função dos genes alvo deste estudo.
Os achados genéticos dos pacientes da matriz favorecem a hipótese de
que existe uma associação entre pseudartrose e BMP4/FGFR1, além de
evidenciar que FAM5C pode participar do processo de consolidação óssea,
65
agindo como fator protetor ao desenvolvimento de pseudartrose. No entanto,
para estabelecer uma relação precisa entre genética e pseudartrose serão
necessários estudos futuros com um maior número de amostras, de forma a
confirmar estes resultados. Pode-se especular que a biologia local deficiente no
foco da fratura representa uma predisposição genética que reduz o potencial
regenerativo do osso. Consequentemente, o maior conhecimento dos genes
envolvidos com o processo de consolidação poderá ampliar o conhecimento
atual da medicina genômica no âmbito da ortopedia.
Em contrapartida, apesar de este estudo confirmar a predisposição
genética à pseudartrose, o tratamento com BMMNCs, mesmo na presença de
predisposição genética, foi capaz de promover a consolidação óssea em
metade dos pacientes estudados. Este fato pode significar que a predisposição
genética a uma determinada condição não é expressa igualmente em todos os
tipos celulares. Apesar do DNA ter as mesmas características em todas as
células de um mesmo organismo, as regiões expressas diferenciam um tipo
celular do outro, explicando porque as células infiltradas, mesmo apresentando
os polimorfismos intrinsecamente, atuaram de forma a possibilitar a
consolidação óssea. Além disso, dependendo do número de células infiltradas
no foco da pseudartrose, os diferentes mediadores que dificultam a
consolidação óssea, no caso de predisposição genética, não influenciam na
permanência da pseudartrose. É possível que as características das BMMNCs,
com seus mediadores, suprimam a expressão inicial associada ao
desenvolvimento de pseudartrose no foco de fratura, possibilitando a
consolidação óssea. É importante salientar que a predisposição genética é um
dos fatores responsáveis, mas nem sempre o fator determinante para a
66
presença de doença.
Além da interferência das variações genéticas individuais, o
desenvolvimento de pseudartrose pode estar relacionado com outros fatores de
risco. PATEL et al. (2013) avaliaram o possível impacto do tabagismo sobre a
consolidação óssea a partir de relatos extraídos da literatura ortopédica. Treze
dentre dezessete relatos concluíram que o habito de fumar induz ao retarde de
consolidação e pseudartrose em fraturas localizadas em diversos sítios
anatômicos. Entretanto, GIANNOUDIS et al. (2000) em um estudo realizado
com 32 fumantes com fraturas da diáfise do fêmur não confirmaram a
associação entre o tabagismo e a falta de consolidação óssea. Apesar da
nossa série incluir cinco pacientes tabagistas, dos quais três evoluíram para a
consolidação após a infiltração de BMMNCs, o tamanho da nossa amostra não
nos permite considerar o tabagismo como um fator de risco para pseudartrose.
Similarmente, apesar de o diabetes mellitus estar bem estabelecido na
literatura como sendo um fator que interfere negativamente com a consolidação
óssea (HERNANDEZ et al., 2012), a inclusão de apenas um paciente diabético
na nossa série não nos permite confirmar ou afastar esta hipótese.
O atual padrão ouro para o tratamento de pseudartrose do fêmur
estabilizada com HIMB consiste na troca da haste. A haste original é
substituída, após fresagem do canal medular, por outra haste bloqueada de
maior diâmetro (CROWLEY et al., 2007). Entretanto, o percentual de
consolidação de fraturas assépticas da diáfise femoral, tratadas com este
método, varia de 58 a 100% como demonstrado em diversas casuísticas (WU e
CHEN, 1997; FURLONG et al., 1999; HAK et al., 2000; WERESH et al., 2000;
67
WU e CHEN, 2002; PIHLAJAMÄKI et al., 2002; FINKEMEIER e CHAPMAN,
2002; BANASZKIEWICZ et al., 2003; CROWLEY et al., 2007; SHROEDER et
al., 2009). Na nossa casuística excluímos fatores mecânicos como causa da
pseudartrose. Previamente ao tratamento com a infiltração de BMMNCs, foi
feita em todos os pacientes uma avaliação radiográfica criteriosa que mostrou
que a HIMB estava bem posicionada, sem osteólise e com componentes
íntegros. Além da estabilidade mecânica, também garantimos em todos os
pacientes que as células foram injetadas da mesma forma no local da lesão.
Utilizamos uma broca canulada através de um fio guia, criando um túnel
através do qual as células eram injetadas circunferencialmente na lesão.
Através desta estratégia, descrita previamente por HERNIGOU et al. (2006),
garantimos o acesso das células ao local da pseudartrose, estabelecendo um
compartimento com alto potencial biológico no centro e na periferia da lesão.
No momento da terapia com BMMNCs, sob o ponto de vista ortopédico,
os pacientes desta série de casos era constituída por um grupo homogêneo de
indivíduos. Nenhum deles apresentava fatores que pudessem estar
relacionados com a falta de consolidação da fratura, tais como instabilidade
mecânica por falha da síntese prévia, desvios rotacionais ou angulares,
presença de infecção óssea ou de partes moles, perda óssea maior que 10 mm
e sinais clínicos de doença sistêmica que pudesse comprometer a formação de
calo ósseo. Considerando ainda que todos eram portadores de fraturas da
diáfise do fêmur, que evoluíram para pseudartrose com características
oligotróficas e atróficas, ou seja, de baixa perfusão vascular, com baixo aporte
celular através da circulação sistêmica, nos parece razoável considerar que as
deficiências biológicas no microambiente da fratura possam ter interferido com
68
o processo de consolidação.
Na nossa série de casos, o suprimento de uma população extra de
células osteoprogenitoras no local da pseudartrose resultou em uma resposta
osteoformadora em todos os pacientes. Observamos, contudo, que esta
resposta osteogênica não foi uniforme. Oito dos dezesseis pacientes tratados
com a infiltração de BMMNCs apresentaram consolidação clínica e radiográfica
da pseudartrose entre três e oito meses (média de 5,3 meses) após o
tratamento e retornaram a sua plena condição funcional de anterior à fratura.
Nos outros oito pacientes a resposta osteoformadora no foco de pseudartrose
não foi suficiente para promover a consolidação óssea.
Outra observação de cunho prático do nosso estudo foi a possibilidade
de avaliar a magnitude da resposta osteoformadora utilizando a escala RUST.
Os valores obtidos pré e pós-infiltração de BMMNCs mostraram uma relação
direta com a ocorrência de consolidação (p<0,00002). Independentemente da
observação ou não deste desfecho favorável, 14 dos 16 pacientes
apresentaram aumento do escore radiográfico da escala RUST após a terapia
celular, o que confirmou a osteoformação no foco de pseudartrose sem,
contudo atingir a consolidação óssea. Um bom exemplo foi o caso 3 (ANEXO
III), em que ocorreu um grande estímulo a formação óssea, comprovado
radiograficamente, mas que devido a falha da síntese por quebra da haste não
ocorreu a consolidação. A correlação entre o diagnóstico clínico de
consolidação e a avaliação radiográfica mostrou que todos os pacientes
assintomáticos, quanto a dor no foco de pseudartrose e capacidade para
deambular sem auxilio de muletas, apresentavam um escore igual ou maior do
que 10 pontos pela escala RUST.
69
A técnica clássica para obtenção de aspirado de medula óssea com a
finalidade de concentrar no produto final o maior número possível de
osteoprogenitores preconiza que a aspiração seja feita por punções repetidas
de pequenos volumes (1-4 mL) para evitar a diluição excessiva com sangue
periférico (MUSCHLER et al., 1997). Esta técnica foi recentemente confirmada
por HERNINGOU et al. (2013) ao demonstrar que a frequência de
osteoprogenitores era 300% maior em aspirados totais obtidos por punções
repetidas de volumes menores em relação àqueles obtidos por volumes
maiores. Na nossa experiência, o único inconveniente da aspiração da medula
em pequenas amostras foi o tempo para a obtenção de 200 mL de medula
óssea total. A punção de pequenas amostras de 3-4 mL, com
reposicionamento da agulha a cada 30-40 mL demorou em média 40-60
minutos. Se considerarmos que os pacientes que foram tratados com um maior
número de células e, potencialmente, com um maior número de
osteoprogenitores, responderam favoravelmente ao tratamento, a coleta em
pequenas amostras foi preponderante sobre o tempo demandado no
procedimento.
Além da técnica de coleta do aspirado de medula óssea, um outro
aspecto que pode influenciar na qualidade do produto final é o sítio anatômico
aonde é realizada a punção óssea. HYER et al. (2013) compararam a
frequência de osteoprogenitores em aspirados obtidos da crista ilíaca, metáfise
tibial e calcâneo e observaram que a frequência de progenitores osteogênicos
no ilíaco era significativamente maior. Em outro estudo, PIERINI et al. (2013)
compararam os aspirados de medula óssea obtidos da crista ilíaca anterior e
posterior e observaram que na região posterior a concentração de progenitores
70
osteogênicos é 1,6 vezes maior do que na região anterior. Sob o ponto de vista
de potencial biológico, os autores não observaram diferença entre as células
obtidas das duas regiões anatômicas. Considerando este conjunto de relatos
da literatura e a nossa experiência no tratamento desta série de pacientes,
sugerimos que para o tratamento de condições ortopédicas onde haja
necessidade de neoformação óssea, que o aspirado de medula óssea total seja
obtido da crista ilíaca posterior, por punções repetidas em pequenas alíquotas
de 3-4 mL, sempre com o reposicionamento da agulha no osso a cada 30-
40mL de medula aspirada.
A infiltração de BMMNCs autóloga no foco de pseudartrose mostrou ser
um procedimento clinicamente seguro. Nenhum dos pacientes desta série
apresentou qualquer tipo de complicação local ou sistêmica, imediata ou tardia,
relacionada com a infiltração do concentrado celular. Acreditamos que a coleta
da medula óssea total, se feita como no presente estudo em um sistema
fechado contendo uma sequência de filtros com poros progressivamente
menores, capaz de remover do aspirado glóbulos de gordura e espículas
ósseas, praticamente elimina riscos de complicações como embolia gordurosa
ou de medula óssea.
A implantação percutânea de BMMNCs para o tratamento da
pseudartrose é um procedimento de baixo custo, com pouco risco para o
paciente e com um alto potencial biológico (NISHIMORI et al., 2001). O
primeiro relato do uso clínico de medula óssea para tratar pseudartrose foi
publicado na década de 80. CONNOLLY et al. (1986) relatam a consolidação
de oito dentre dez pacientes com pseudartrose de tíbia após a injeção de 100-
71
150mL de medula óssea total. A partir deste relato, a técnica foi reproduzida
por outros grupos para o tratamento de pseudartrose em outros sítios
anatômicos como úmero (GARG et al., 1993; SIM et al., 1993; SIWACH et al.,
2001; WILKINS et al., 2003), antebraço (GARG et al., 1993; SIWACH et al.,
2001; SEN et al., 2007), clavícula (TETREAULT e OUELLETTE, 2007), fêmur
(MATSUDA et al., 1998; SIWACH et al., 2001; WILKINS et al., 2003), além da
tíbia (GARG et al., 1993; SEBECIC et al., 1999; SIWACH et al., 2001; WANG et
al., 2001; GOEL et al., 2005). Neste conjunto de relatos foram tratados 327
pacientes com pseudartrose distribuídos entre tíbia (75.7%), fêmur (9.8%),
antebraço (8.2%) e úmero (6.1%), com índices de consolidação que variaram
entre 57-94%. A diversidade das características dos pacientes, dos sítios
anatômicos das lesões e, sobretudo, pelo tratamento ter sido realizado com
medula óssea total, constituída em cerca de 50% por hemácias, torna difícil
estabelecer um paralelo com estes resultados.
A casuística que mais se assemelha com a nossa, sob o ponto de vista
do tipo de produto celular injetado no foco de pseudartrose, foi publicada por
HERNIGOU et al. (2005). Esta casuística incluiu 60 pacientes com
pseudartrose atrófica asséptica de tíbia, tratados com BMMNCs, obtido da
crista ilíaca e concentrado em volume em um sistema fechado de separação de
células. A técnica de aspiração e o processamento para a obtenção do produto
final foram similares a presente série. Contudo, os autores incluíram no estudo
pacientes com seis meses de evolução de falta de consolidação, lesões
mecanicamente instáveis tratadas com diferentes formas de estabilização
(fixação interna e externa) e lesões localizadas em diferentes locais anatômicos
da tíbia. A despeito da heterogeneidade da amostra os autores relatam um
72
índice de consolidação de 88% dos pacientes.
A nossa casuística, embora menor, é representada por uma amostra
mais homogênea. Todos os pacientes da nossa série foram diagnosticados
com pseudartrose com mais de nove meses de evolução, a fratura era
localizada na mesma região anatômica do fêmur e em todos havia
estabilização mecânica do foco de fratura através da inserção de uma HIMB
antes do tratamento com BMMNCs. Além dessas características em comum,
os nossos pacientes não diferiram quanto a idade, gênero, tempo de evolução
e tipo da pseudartrose, natureza da fratura (fechada ou exposta), número de
cirurgias prévias antes da injeção de BMMNCs e ainda quanto a associação
com comorbidades que pudessem interferir com a consolidação óssea
(diabetes e tabagismo). A única diferença observada entre os pacientes que
consolidaram a fratura e os que não responderam ao tratamento foi o maior
número de BMMNCs injetadas no foco de pseudartrose (19,42±7,47 versus
9,81±2,84, p<0,0005). A variação no escore radiográfico RUST, como previsto,
refletiu a consolidação clínica nos pacientes que responderam ou não ao
tratamento (6,25±1,16 versus 2±1,6 respectivamente, p<0,00002).
A relação entre o número de células osteoprogenitoras injetadas no foco
de pseudartrose e a ocorrência de consolidação já foi descrito anteriormente
por HERNIGOU et al. (2005). Neste relato pioneiro, eles demonstraram que
existe uma relação direta entre o numero de osteoprogenitores que é injetado
em um foco de pseudartrose e o percentual de pacientes que consolidam a
fratura. Eles também salientam que poderia ser considerada uma vantagem
deste tipo de produto celular, para o tratamento de falhas de consolidação
73
óssea, o fato do concentrado de BMMNCs conter progenitores osteogênicos e
angiogênicos.
Mais recentemente, FERNANDEZ-BANCES et al. (2013) relataram que
a associação de enxerto de osso de banco com BMMNCs promoveu a
consolidação de pseudartrose de um osso longo em uma série de casos com
sete pacientes. Apesar da limitação dos resultados deste estudo pelo pequeno
tamanho da amostra, pela falta de padronização do local e da forma de
estabilização das fraturas e pela obtenção de BMMNCs a partir de um pequeno
volume inicial de medula óssea total (50-60 mL), é possível que, como nos
nossos pacientes, a resposta favorável ao tratamento esteja relacionada com o
componente celular adicionado ao foco de pseudartrose. Em outro estudo
clínico, ALVAREZ-VIEJO et al. (2013) relataram a ocorrência de consolidação
em três pacientes tratados com BMMNCs sem contudo especificar o local das
pseudoartroses, o volume inicial e final do concentrado celular, a forma de
injeção e os critérios clínicos de consolidação da pseudartrose.
Já é fato bem estabelecido na literatura que a medula óssea humana
possui características próprias no que diz respeito à composição celular. Essas
características individuais podem ser ainda modificadas por fatores como
idade, sexo e associação com doenças sistêmicas (QUARTO et al., 1995;
MUSCHLER et al., 1997; D’IPPOLITO et al., 1999; MUSCHLER et al., 2001;
HERNIGOU e BEAUJEAN, 1997; HERNIGOU e BEAUJEAN, 2002;
HERNIGOU e BEAUJEAN, 2003). O resultado final é uma grande variação da
celularidade e na capacidade de diferenciação dos progenitores angiogênicos e
osteoblásticos, mesmo entre indivíduos de uma mesma etnia (PHINNEY et al.,
74
1999; SIDDAPPA et al., 2007).
Alguns relatos da literatura apontam para uma relação inversa entre
idade e redução na capacidade de formação óssea, atribuída à redução do
número de células com potencial pró-angiogênico e pró-osteogênico, ou seja, a
uma redução funcional gradativa da medula óssea (STENDERUP et al., 2003;
KHAN et al., 2011; CHOUDHERY et al., 2012). STOLZING et al (2008)
observaram uma relação inversa entre idade e o número de progenitores
mesenquimais presentes na medula óssea. Já HYER et al. (2013) não
confirmam que a idade, sexo, tabagismo e diabetes sejam fatores preditivos do
número destes progenitores no concentrado de BMMNCs.
Como já mencionado anteriormente, o número de células injetadas no
foco de pseudartrose dos pacientes desta série foi significativamente maior no
grupo que consolidou a fratura. Apesar das limitações impostas pelo tipo de
estudo e pelo tamanho amostral, podemos sugerir que o ambiente biológico,
renovado pelas BMMNCs no local da pseudartrose, atuou favoravelmente no
processo de consolidação. Nesta linha de raciocínio, nos sentimos tentados a
especular que o efeito biológico positivo no microambiente da pseudartrose
exercido pelas BMMNCs foi real e autossustentável uma vez que se manteve
ativo durante pelo menos 3-8 meses, período no qual ocorreu a consolidação
nos pacientes que responderam ao tratamento.
Em conclusão, acreditamos que a terapia com infiltração de BMMNCs
autólogas, como tentativa para induzir a consolidação de pseudartrose
diafisária asséptica do fêmur é um procedimento consideravelmente menos
invasivo do que a maioria das opções cirúrgicas, inclusive a troca de HIMB.
75
Com a padronização da técnica para a infiltração das BMMNCs e com a
exclusão de fatores mecânicos como causa da pseudartrose, nossa hipótese é
de que a falta de um estímulo biológico adequado possa estar relacionado com
a não consolidação das fraturas nesta série de casos. A não consolidação
óssea, por ausência de um ambiente biológico e/ou genético favorável poderia,
a princípio, ser revertida através da suplementação local com um estímulo
osteogênico. Este estímulo pode ser implementado através da infiltração local
de BMMNCs autólogas, que podem ser obtidas da crista ilíaca, concentradas e
injetadas no paciente em um único procedimento cirúrgico. Apesar de termos
observado a ocorrência de consolidação em oito dos 16 pacientes estudados
será necessário o desenvolvimento de um estudo clínico randomizado em
maior escala para aprofundar os nossos achados e confirmar a nossa hipótese.
Um dos maiores desafios de estudos futuros nesta linha de pesquisa será a
padronização dos produtos celulares. A grande variação individual na
composição da medula óssea deverá ser compensada por métodos
laboratoriais reproduzíveis que permitam que, em um mesmo volume,
possamos concentrar um número elevado de BMMNCs rico em progenitores
osteogênicos e angiogênicos.
76
7. CONCLUSÕES
1- A infiltração de BMMNCs autólogas, obtidas por aspiração de medula óssea
e concentradas por centrifugação fracionada no mesmo tempo cirúrgico,
mostrou ser um procedimento seguro e desprovido de complicações locais ou
sistêmicas.
2- A infiltração de BMMNCs autólogas no foco de pseudartrose da diáfise
femoral induziu a osteoformação em maior ou menor extensão, na maioria dos
pacientes desta série.
3- A evolução do processo de consolidação por um período de até oito meses
após a infiltração celular, constitui uma observação indireta de que a infiltração
de BMMNCs é capaz de restaurar a biologia do microambiente e o turnover
ósseo no foco de pseudartrose.
4- Nesta série de pacientes, a variável idade, gênero, tipo de fratura, número
de cirurgias prévias, tipo e duração da pseudartrose, tabagismo e diabetes não
influenciaram a resposta ao tratamento com a infiltração de BMMNCs.
77
5- A escala radiográfica RUST mostrou ser uma boa ferramenta para avaliação
e acompanhamento da progressão da consolidação de pseudartroses de fêmur
tratadas com HIMB, por correlacionar numericamente a imagem radiográfica
com o quadro clínico.
6- A osteoformação resultou em consolidação da pseudartrose nos pacientes
que receberam um concentrado celular enriquecido com um grande número de
BMMNCs.
7- O aporte biológico através da infiltração de BMMNCs foi capaz de superar a
predisposição genética à pseudoartrose identificada pelos polimorfismos dos
genes BMP-4, FGFR-1 e FAM5C.
78
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ANEXOS
ANEXO I
Ministério da Saúde
Secretaria de Atenção à Saúde
Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia
Rua Washington Luis, 61 – Centro – Rio de Janeiro – RJ CEP: 20230-024
Tel.: 55 (21) 3512-4703 | Fax: 55 (21) 2242-1069
www.into.saude.gov.br / [email protected]
COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
Rio de Janeiro, 29 de maio de 2006,
Certifico que a pesquisa intitulada “tratamento da falta de consolidação de fratura diafisária dos ossos
longos com infiltração com concentrado de medula óssea autóloga”, protocolo número 123/2006, sob a
responsabilidade do Dr. João Antonio Matheus Guimarães, está de acordo com os Princípios de Ética em
pesquisa estabelecidos pela Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, e foi aprovada em
29/05/2006 pelo Comitê de Bioética do Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia do Ministério da
Saúde (INTO-MS).
Sérgio Eduardo Vianna
Presidente do Comitê de Bioética
Instituto Nacional de Traumatologia e Ortopedia
Ministério da Saúde
ANEXO II
Classificação da fratura da diáfise do fêmur pela AO/OTA (MARSH, 2007).
Fêmur = 3 / Diáfise = 2
ANEXO III
Classificação de Gustilo-Anderson (GUSTILO e ANDERSON, 1976)
Tipo I – Lesão de baixa energia, ferida limpa com menos de 1 cm, mínima lesão de partes moles e cominuição óssea.
Tipo II – Lesão de energia intermediária, ferida com mias de 1 cm, com moderada lesão de partes moles e cominuição. O grau de comprometimento de lesão das partes moles frequentemente define uma ferida com menos de 10 cm e sem descolamento periosteal.
Tipo III A – Fratura com ferida com mais de 10 cm de extensão, com tecido esmagado e contaminação, mas geralmente com adequado tecido para a cobertura óssea.
Tipo III B – Fratura com ferida com mais de 10 cm de extensão, com tecido esmagado e contaminação, sem tecido para a cobertura óssea e associado a descolamento periosteal, frequentemente necessitando de transferência de tecido vascularizado para a cobertura.
Tipo III C – Fratura exposta associada a uma maior lesão vascular que requer reparo para o salvamento do membro.
ANEXO IV Radiografias dos pacientes estudados.
Caso 1 - Mulher, 35 anos, vitima de acidente automobilístico, com fratura fechada do
fêmur (32A), submetida a 2 cirurgias antes da infiltração com BMMNCs.
Pseudartrose oligotrófica com 95 meses de evolução. Após a infiltração de 10.6x108
BMMNCs o escore RUST variou 4 pontos (4 para 8). Ausência de consolidação.
Caso 2 - Mulher, 43 anos, vitima de acidente automobilístico, com fratura fechada do
fêmur (32A), submetida a 2 cirurgias antes da infiltração com BMMNCs.
Pseudartrose oligotrófica com 50 meses de evolução. Após a infiltração de 7x108
BMMNCs o escore RUST variou 2 pontos (5 para 7). Ausência de consolidação.
Caso 3 - Mulher, 44 anos, vitima de acidente automobilístico, com fratura
fechada da diáfise (32B) e do colo do fêmur consolidada (31B), submetida a 3
cirurgias na diáfise antes da infiltração com BMMNCs. Pseudartrose oligotrófica
com 71 meses de evolução. Após a infiltração de 7.4x108 BMMNCs o escore
RUST variou 4 pontos (5 para 9). Ausência de consolidação e quebra da HIMB.
Caso 4 - Homem, 27 anos, vitima de acidente de motocicleta, com fratura fechada do
fêmur (32B), submetido a 4 cirurgias antes da infiltração com BMMNCs. Pseudartrose
oligotrófica com 48 meses de evolução. Após a infiltração de 34x108 BMMNCs o
escore RUST variou 6 pontos (5 para 11). A consolidação clinica e radiográfica ocorreu
seis meses após a infiltração celular.
Caso 5 - Homem, 52 anos, vitima de queda, com fratura fechada do
fêmur (32A), submetido a 3 cirurgias antes da infiltração com BMMNCs.
Pseudartrose oligotrófica com 62 meses de evolução. Após a infiltração de
17x108 BMMNCs o escore RUST variou 4 pontos (6 para 10). A
consolidação clinica e radiográfica ocorreu oito meses após a infiltração
celular.
Caso 6 - Homem, 45 anos, vitima de atropelamento, com fratura fechada da diáfise
(32C) e do colo (31B) do fêmur consolidada, submetido a 1 cirurgia da diáfise antes
da infiltração com BMMNCs. Pseudartrose oligotrófica com 60 meses de evolução.
Após a infiltração de 15.4x108 BMMNCs o escore RUST variou 6 pontos (6 para
12). A consolidação clinica e radiográfica ocorreu seis meses após a infiltração
celular.
Caso 7 - Mulher, 54 anos, vitima de PAF, com fratura exposta do fêmur (GII,
32B), submetida a 1 cirurgia antes da infiltração com BMMNCs. Pseudartrose
atrófica com 22 meses de evolução. Após a infiltração de 8x108 BMMNCs o
escore RUST variou 7 pontos (4 para 11). A consolidação clinica e radiográfica
ocorreu quatro meses após a infiltração celular.
Caso 8 - Homem, 28 anos, vitima de acidente de motocicleta, com fratura exposta
do fêmur (GI, 32A), submetido a 3 cirurgias antes da infiltração com BMMNCs.
Pseudartrose oligotrófica com 69 meses de evolução. Após a infiltração de
12.5Cx108 BMMNCs o escore RUST variou 1 ponto (6 para 7). Ausência de
consolidação.
Caso 9 - Homem, 44 anos, vitima de acidente de motocicleta, com fratura
fechada da diáfise (32C) e do colo (31B) do fêmur consolidada, submetido a 1
cirurgia da diáfise antes da infiltração com BMMNCs. Pseudartrose atrófica com
15 meses de evolução. Após a infiltração de 8x108 BMMNCs o escore RUST
permaneceu inalterado (4 e 4). Ausência de consolidação.
Caso 10 - Homem, 24 anos, vitima de acidente automobilístico, com fratura
fechada do fêmur (32B), submetido a 1 cirurgia antes da infiltração com
BMMNCs. Pseudartrose atrófica com 9 meses de evolução. Após a infiltração de
22x108 BMMNCs o escore RUST variou 6 pontos (6 para 12). A consolidação
clinica e radiográfica ocorreu quatro meses após a infiltração celular.
Caso 11 - Homem, 45 anos, vitima de acidente automobilístico, com fratura
fechada da diáfise (32A) e do colo (31B) do fêmur consolidada, submetido a 1
cirurgia da diáfise antes da infiltração com BMMNCs. Pseudartrose atrófica com
14 meses de evolução. Após a infiltração de 19x108 BMMNCs o escore RUST
variou 8 pontos (4 para 12). A consolidação clinica e radiográfica ocorreu cinco
meses após a infiltração celular.
Caso 12- Homem, 37 anos, vitima de acidente de motocicleta, com fratura
exposta do fêmur (GI, 32B), submetido a 4 cirurgias antes da infiltração com
BMMNCs. Pseudartrose oligotrófica com 95 meses de evolução. Após a
infiltração de 15x108 BMMNCs escore RUST permaneceu inalterado (4 e
4). Ausência de consolidação.
Caso 13 - Homem, 19 anos, vitima de atropelamento, com fratura fechada do
femur (32A), submetido a 1 cirurgia antes da infiltração com BMMNCs.
Pseudartrose atrófica com 15 meses de evolução. Após a infiltração de
10.3x108 BMMNCs o escore RUST variou 2 pontos (5 para 7). Ausência de
consolidação.
Caso 14 - Homem, 30 anos, vitima de acidente de motocicleta, com fratura fechada
do fêmur (32B), submetido a 1 cirurgia antes da infiltração com BMMNCs.
Pseudartrose atrófica com 15 meses de evolução. Após a infiltração de 7.7x108
BMMNCs o escore RUST variou 3 pontos (4 para 7). Ausência de consolidação.
Caso 15 - Mulher, 19 anos, vitima acidente de motocicleta com fratura fechada
do fêmur (32A), submetida a 2 cirurgias antes da infiltração com BMMNCs.
Pseudartrose atrófica com 12 meses de evolução. Após a infiltração de 23x108
BMMNCs o escore RUST variou 7 pontos (5 para 12). A consolidação clinica e
radiográfica ocorreu seis meses após a infiltração celular.
Caso 16 - Homem, 59 anos, vitima de queda, com fratura exposta do fêmur (GI,
32B), submetido a 2 cirurgias antes da infiltração com BMMNCs. Pseudartrose
oligotrófica com 15 meses de evolução. Após a infiltração de 17x108 BMMNCs o
escore RUST variou 6 pontos (6 para 12). A consolidação clinica e radiográfica
ocorreu quatro meses após a infiltração celular.
