José Daniel de Sousa Maior-08-11-2014-aguardar o aluno
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UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA EFEITOS DA RADIAÇÃO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA PRODUÇÃO DE RADICAIS LIVRES EM CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS HUMANAS CULTIVADAS SOBRE PLACAS DE TITÂNIO JOSÉ DANIEL DE SOUSA MAIOR Orientador: Prof. Dr. Lúcio Frigo Co-Orientador: Prof. Dr. Jeymesson Raphael Cardoso Vieira Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia. SÃO PAULO 2014
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UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
EFEITOS DA RADIAÇÃO LASER DE BAIXA INTENSIDADE
NA PRODUÇÃO DE RADICAIS LIVRES EM
CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS HUMANAS CULTIVADAS
SOBRE PLACAS DE TITÂNIO
JOSÉ DANIEL DE SOUSA MAIOR
Orientador: Prof. Dr. Lúcio Frigo
Co-Orientador: Pro f. Dr. Jeymesson Raphael Cardoso Vieira
Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia.
SÃO PAULO
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
M192e
Maior, José Daniel de Sousa. Efeitos da radiação laser de baixa intensidade na produção de
radicais livres em células osteoblásticas humanas cultivadas sobre placas de titânio / José Daniel de Sousa Maior. -- São Paulo; SP: [s.n], 2014.
88 p. : il. ; 30 cm. Orientador: Lúcio Frigo. Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Odontologia – Terapia a laser de baixa intensidade 2.
Radicais livres 3. Implantodontia 4. Titânio. I. Frigo, Lúcio. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
CDU: 616.314:621.375.826(043.2)
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EFEITOS DA RADIAÇÃO LASER DE BAIXA INTENSIDADE
NA PRODUÇÃO DE RADICAIS LIVRES EM
CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS HUMANAS CULTIVADAS
SOBRE PLACAS DE TITÂNIO
JOSÉ DANIEL DE SOUSA MAIOR
Tese de doutorado defendida e aprovada
pela Banca Examinadora em 26/06/2014.
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Lúcio Frigo
Universidade Cruzeiro do Sul
Presidente
Prof. Dr. Maurício Teixeira Duarte
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr. Pedro Antonio Fernandes
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr. Gustavo Pina Godoy
Universidade Estadual da Paraíba
Prof. Dr. Jeymesson Raphael Cardoso Vieira
Universidade Federal de Pernambuco
Dedico todo este trabalho ao meu Pai João, que dura nte o tempo em
que esteve neste plano foi para mim um grande exemp lo. Não teria chegado
até aqui sem seu esforço e ensinamentos para a minh a formação.
- À minha Mãe Alaide que me dá exemplos diários de que tudo com luta
e responsabilidade, o resultado vai dar certo.
AGRADECIMENTOS
- Ao Prof. Lúcio Frigo, meu orientador pelos ensinamentos, paciência e
compreensão durante todo este período de convivência;
- Ao Prof. Michel da Universidade Cruzeiro do Sul pela presteza ao me
receber para o ingresso no Programade Doutorado;
- Ao Prof. Jeymesson Raphael, meu co-orientador, pela colaboração;
- Ao Prof. Durvanei – Laboratório de Bioquímica da USP pela colaboração
na realização da parte experimental;
- Ao Prof. Maurício Duarte Teixeira pelo fornecimento das placas de titânio,
juntamente com o sistema de implanters Conexão;
- Ao Sistema de Implante Conexão, pelo fornecimento das placas de titânio
para a realização da parte experimental;
- Aos meus familiares pelos momentos de ausência minha em períodos
importantes onde não pude estar presente;
- Aos meus amigos Ana Idalina, Anderson Neves e Teomar Lustosa que
mais uma vez tanto colaboraram no incentivo e organização deste trabalho;
- À Universidade Cruzeiro do Sul pela transparência de informações;
- À minha Universidade Federal de Pernambuco pela liberação de minhas
atividades durante o período em que estive ausente para a realização do Doutorado.
- A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para que este
trabalho acontecesse.
Maior JDS. Efeitos da radiação laser de baixa intensidade na p rodução de radicais livres em células osteoblásticas humanas c ultivadas sobre placas de titânio [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2014.
RESUMO
Buscando a possibilidade de aumentar a formação óssea na superfície dos
implantes dentários, vários tratamentos hoje têm sido propostos, entre eles, a terapia
com laser de baixa intensidade (LBI), pois acredita-se que o sucesso do tratamento
com implantes osseointegráveis depende do processo de reparo da ferida e do
poder osteogênico das células. Neste contexto, o estudo investigou o laser de diodo
de Arseneto-Gálio-Alumínio (AsGaAl), 830nm em culturas osteogênicas humanas
cultivadas sobre placas de titânio, bem como, o nível de produção de radicais livres
identificados pelos marcadores LPO (peroxidação lipídica) e H2O2 (peróxido de
hidrogênio). As culturas foram divididas em seis grupos: grupo controle sem placas
de titânio, grupo controle com placas de titânio e grupos com placas e irradiados
com densidade energética de 2 J/cm2, 4 J/cm2, 6 J/cm2 e 8 J/cm2, nos intervalos de
24, 48 e 72 horas. O spot da ponteira estava a 1cm2 do líquido do meio de cultura e
um único disparo de radiação foi direcionado para cada poço contendo células e
sobre a direção do titânio. Após a irradiação os grupos, foram avaliados nos
seguintes parâmetros: 1) determinação da formação de espécies reativas de
oxigênio (ROS) como o (H202); 2- registro osteoblástico da proliferação celular; 3-
peroxidação lipídica das membranas (LPO) de células osteoblásticas. Na análise
das culturas foi observado em todos os intervalos de tempo e dose, comparando o
grupo teste e os controles possíveis das alterações celulares e seus
comportamentos nas 72 horas de avaliação. Os resultados dos registros
osteoblásticos da cultura celular mostraram que a radiação com (LBI) aumentou a
proliferação. A análise das culturas mostrou que os grupos de controles e irradiados
apresentam comportamentos distintos. No intervalo de tempo de 72h, na densidade
energética de 6 e 8 J/cm2 houve um aumento significativo para o marcador de H2O2
e no intervalo de tempo de 48 horas para todas as doses aumentaram
significativamente o nível de produção de LPO que retornaram aos níveis do
controle no período de 72h. Em conclusão, os resultados indicam que a radiação do
laser de diodo de AsGaAl estimula a produção de expressão H2O2 e que esse
aumento não tem repercussões na peroxidação dos lipídios da membrana, dessa
maneira, aumentando a sobrevida da célula e, consequentemente, aumentado seu
número.
Palavras-chave: Laser de baixa intensidade, Cultura de células, Osteogênese,
Titânio.
Maior JDS. Effects of laser radiation of low intensity in free radical production by human osteoblastic cells cultured on titanium pl ates [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; 2014.
ABSTRACT
Seeking the opportunity to increase bone formation on the surface of dental implants,
nowadays many treatments have been proposed as the therapy with low-level laser
(LLLT), and it is possible that the success of treatment with dental implants depends
on the wound repair process and the osteogenic cell power. In this context, this study
investigated the effect of laser diode Gallium -Aluminum - Arsenide (GaAlAs) 830 nm
in human osteogenic cultures grown on titanium plates and the level of free radical
production identified by markers LPO (lipid peroxidation ) and H2O2 (hydrogen
peroxide hydrogen ). The cultures were divided into six groups: a control group
without titanium plate, titanium plate with control groups and with plates and
irradiated with energy density of 2 J/cm2, 4 J/ cm2, 8 J/ cm2and 6 J/ cm2 at the
intervals of 24, 48 and 72 hours. The spot was about 1cm2 of the tip of the liquid
culture medium and a single shot of radiation was directed to each well containing
cells and on the direction of titanium. After irradiation groups were evaluated on the
following parameters: 1) determining the formation of reactive oxygen species (ROS)
such as (H202); 2 - photographic record of cell proliferation; 3 - lipid membrane
peroxidation (LPO) in osteoblastic cells. In the analysis the cultures was observed at
all doses and time intervals by comparing the test group and the control cell change
and its behavior in 72-hour evaluation. The results of cell culture photographic
recordings showed that the radiation (LBI) increased proliferation and cell viability
was apparently unaffected. The analysis of the cultures showed that the control and
irradiated exhibit distinct behavior. In the time interval of 72h, the energy density of 8
J/cm2 there was a significant increase in the score of H2O2 and the time interval of 48
hours for all doses significantly increased the production level of LPO which returned
to control levels the period of 72h. In conclusion, the results indicate that the radiation
GaAlAs diode laser stimulates the expression and production of H2O2 this increase
has no effect on the peroxidation of membrane lipids, thus increasing the life of the
cell and thereby increasing their number.
Keywords: Low laser intensity, Cell culture, Osteogenesis, Titanium.
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
µ Micrômetro
ALP Fosfatase Alcalina
AsGa Arseneto de Gálio
AsGaAl Arseneto de Gálio e Alumínio
ATF4 Fator de transcrição de aminoácido 4
ATP Adenosina trifosfato
BMPs Proteínas morfogenéticas
Ca10(PO4)6(OH)2 Cristais de hidroxiapatita
cAMP Monofostado de adenosina cíclico
CO2 Gás carbônico
DE Densidade de energia
DNA Ácido desoxirribonucleico
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HeNe Hélio e Neônio
HO Radical Hidroxilo
InGaAIP Índio-Gálio-Alumínio-Fósforo
IV Infravermelho
J cm2 Joules por centímetro quadrado
LASER Luz Amplificada por Emissão Estimulada de Radiação
LBI Laser de Baixa Intensidade
LPO Peroxidação lipídica
mM Nanomoles
mW Miliwatz
NaOH Hidróxido de sódio
nm Nanômetro
RNA Ácido ribonucleico
ROS Espécies Reativas de Oxigênio
TBA Ácido tiobarbitúrico
TCA Ácido tricloroacético
Ti Titânio
λ Comprimento de onda
μL Microlitro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................... .......................................... 16
2.1 Generalidades do Laser ........................ ................................................... 16
2.2 Resposta do Tecido no processo de Osseointegraç ão ........................ 22
2.3 Osteogénese peri-implantar .................... ................................................ 23
2.4 Remodelação Óssea no Periimplante ............. ........................................ 25
2.5 Titânio e alguns fatores no processo de osseoin tegração ................... 25
2.6 Tecido Ósseo .................................. .......................................................... 27
2.6.1 Histofisiologia Óssea ....................... ........................................................ 27
2.6.1.2 Histologia do tecido Ósseo ................ ..................................................... 27
2.6.1.3 Tipos de Tecido Ósseo ..................... ....................................................... 28
2.6.1.4 Metabolismo Ósseo e Nutrição .............. ................................................. 29
2.6.1.5 Estrutura óssea ........................... ............................................................. 30
2.6.1.6 Modelagem e remodelagem óssea ............. ............................................ 33
2.7 Classificação óssea relacionada à implantodonti a ............................... 34
2.7.1 Classificação óssea segundo Lekholm (DARVARPA NAH et al., 2003) 35
2.7.2 Classificação da densidade óssea proposta por Misch (MISCH, 2000). ..
................................................................................................................... 35
2.8 Utilização do Laser na implantodontia ......... .......................................... 35
2.9 Cultura de Células e Laser .................... ................................................... 42
2.10 Laser, Alterações Celulares in Vitro e Radicais Livres ......................... 44
3 OBJETIVOS ....................................... ........................................................ 49
3.1 Objetivo geral ................................ ............................................................ 49
3.2 Objetivos específicos ......................... ...................................................... 49
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................. ............................................ 50
4.1 Radiação laser ................................ .......................................................... 51
4.2 Análise Estatística ........................... ......................................................... 54
4.3 Avaliação das Respostas Celulares ............. .......................................... 54
4.3.1 Fotomicrografia da cultura de células osteobl ásticas .......................... 54
4.3.2 Teste de LPO ................................ ............................................................. 55
4.3.3 Teste de H 2O2 ............................................................................................ 55
4.4 Análise Estatística ........................... ......................................................... 55
5 RESULTADOS ...................................... ..................................................... 56
5.1 Resultados Estatísticos ....................... .................................................... 64
5.1.1 Comparação dos níveis de LPO entre os Grupos de acordo com
Testes de Turkey e ANOVA .......................... ........................................... 64
5.1.4 Comparação dos níveisde H 2O2 entre os intervalos de tempo: ........... 71
6 DISCUSSÃO .............................................................................................. 75
7 CONCLUSÃO ....................................... ..................................................... 79
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 80
APÊNDICE ................................................................................................................ 88
12
1 INTRODUÇÃO
A técnica reabilitadora com implantes osseointegrados foi desenvolvida há
mais de 40 anos, estando consagrada devido a resultados bem-sucedidos obtidos
ao longo desses anos.
Considerando que os implantes osseointegráveis tem sido uma alternativa
segura para reabilitação da função mastigatória, fonação e estética em casos de
perda dentária, o sucesso desses implantes depende de uma osseointegração
adequada, que se caracteriza por aposição íntima de osso neoformado na superfície
do implante, aposição esta que deve ser mantida quando esse implante é submetido
a cargas funcionais (ALBREKTSSON; SENNERBY, 1991).
O processo de reparação da ferida e o potencial osteogênico das células para
induzir a formação óssea em torno do implante são fundamentais para o processo
de osseointegração. Esses fenômenos envolvem uma sequência de eventos tais
como: recrutamento, proliferação e diferenciação celular, seguidos pela deposição e
mineralização de matriz óssea. O Laser de Baixa Intensidade (LBI) surge como uma
alternativa no objetivo de acelerar e/ou aumentar a formação óssea na superfície
destes implantes, tendo em vista várias outras formas de se tentar a adesão
osso/implante estarem em estudo (CANALIS, 1996).
O laser, assim como outras fontes de luz é composto de fótons. Fótons são
pacotes de energia, que embora não tenham massa, se comportam como se a
tivessem, ou seja, se propagam como uma onda, sendo descritos como um campo
eletromagnético oscilante. Cada fóton possui um comprimento de onda (λ), que é a
distância entre duas cristas consecutivas da onda. O comprimento de onda define a
cor do fóton: fótons vermelhos possuem comprimentos de onda ao redor dos 600nm
e fotos infravermelhos possuem comprimento de onda acima de 700nm. As faixas
de cores visíveis aos nossos olhos são de comprimento de onda entre 400 e 700nm;
infravermelho, acima de 700nm, e a faixa ultravioleta, comprimento de onda abaixo
de 400nm (MENEGUZZO, 2007).
Com o avanço das pesquisas e tecnologia observado em vários trabalhos na
13
literatura, o laser tem provado que já é uma realidade, tornando-se ferramenta útil,
no dia-a-dia do cirurgião-dentista (KUCEROVA, 2000; MESTER, 1971; MESTER E.;
MESTER A. F.; MESTER A, 1985; MOREIRA, 2004; THEODORO; GARCIA;
MARCANTONIO JÚNIOR, 2002; WOODRUFF et al., 2004).
Nessa revisão de literatura, destaca-se o laser não-ablativo, designado como
laser não cirúrgico ou de baixa potência, na qual, alguns autores evidenciam o efeito
acelerador do processo cicatricial em tecidos moles (FREITAS et al., 2000;
CAMPANHA, 2002). Outros autores, trabalhando com laser não-ablativo, relatam
efeito positivo da biomodulação do laser em tecidos mineralizados (SILVA JÚNIOR,
2000; LOPES, 2002).
O laser é uma fonte de radiação não ionizante, altamente concentrada, que
em contato com diferentes tecidos resulta, de acordo com o tipo de radiação, em
efeitos térmicos e fotoquímicos (PINHEIRO, 1998). A radiação laser pode ser
classificada de acordo com a potência de emissão onde este Laser de Baixa
Intensidade (LBI) ou laser não cirúrgico são sistemas que permitem radiações de
baixa potência sem poder destrutivo e que possuem ações fotoquímica e
fotobiológica, como analgésica, anti-inflamatória e de bioestimulação (ALMEIDA-
LOPES, 1999; GENOVESE, 2000; LOW; REED, 2001; PINHEIRO, 1998). O uso do
LBI como terapia é distinto do uso do laser em cirurgia, onde os efeitos terapêuticos
aparentemente surgem direta ou indiretamente da interação eletromagnética da luz
com o tecido e não dos efeitos térmicos ou fotoquímicos (ROSENSHEIN, 1997). Os
lasers de baixa potência utilizados na terapia estão situados na porção visível do
espectro eletromagnético e no infravermelho próximo.
Os laseres de diodo representados pelos laseres de Arseneto de Gálio
(AsGa), Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl) e Índio-Gálio-Alumínio-Fósforo
(InGaAI) estão no comprimento de onda (λ) de 600 a 1000 nm (KARU, 1989).
Acredita-se que a energia emitida pelo laser é absorvida por cromóforos
intracelulares e convertida em energia metabólica (ROSENSHEIN, 1997). Assim, as
respostas obtidas com o LBI promovem alterações funcionais na mitocôndria e
estimulação e/ou inibição da transcrição e replicação de DNA (ácido
desoxirribonucleico).
14
Esse mecanismo de fotoestimulação celular tem sido atribuído à ativação da
cadeia respiratória mitocondrial resultando no início de uma cascata que promove a
sinalização celular e aumento de produção de ATP (adenosina trifosfato).
Informações estas já confirmadas desde autores veteranos, aos mais atuais em
experimentos (KARU, 1989; XAVIER et al., 2003).
É importante observar os parâmetros relevantes ao laser, como comprimento
de onda, potência, densidade de potência, densidade de energia, dose ou influência,
tipo de regime de operação (pulsado ou não pulsado) e frequência pulso para que
resultados na utilização do LBI sejam satisfatórios. Em relação ao tecido, é
importante observar: os tipos de reações moleculares e bioquímicas, os cromóforos,
a concentração de água, a irrigação sanguínea local e a localização da área alvo
(KNAPPE; FRANK; ROHDE, 2004).
Diante dessa perspectiva (KNAPPE; FRANK; ROHDE, 2004), para que ocorra
uma transferência de energia é necessário que ocorra absorção do feixe de luz pelo
tecido. Quando as camadas superficiais apresentam alto coeficiente de absorção, a
capacidade da radiação laser em penetrar o tecido se reduz. O coeficiente de
absorção é dado pela concentração de constituintes com capacidade de absorver a
radiação no comprimento de onda empregado, os chamados cromóforos. Seus
principais representantes são: água, hemoglobina e melanina, dentre outras
proteínas, componentes que têm a capacidade de transformar a radiação em outra
forma de energia, produzindo efeitos fotoquímicos, fototérmicos, fotomecânicos e
fotoelétricos, conforme a quantidade, e intensidade da energia absorvida.
Já foram encontrados resultados em que se acreditava que irradiação com luz
visível monocromática no azul, vermelho e vermelho distante pode melhorar
processos metabólicos nas células e ativar proliferação, sendo a luz somente um
gatilho, razão pela qual se necessita de baixas doses com pequenos tempos de
irradiação (KARU, 1989).
Em relação ao reparo ósseo, o LBI vem sendo usado em diversas condições
como em alvéolos após extração dentária, em fraturas ósseas, durante tratamentos
ortodônticos e no pós-operatório de implantes dentários (DAVID et al., 1996;
KAWASAKI; SHIMIZU, 2000; LUGER et al., 1998; TAKEDA, 1988; YAAKOBI;
15
MALTZ; ORON, 1996). Isso tem sido atribuído ao fato de que a terapia com LBI
aumenta a quantidade de cálcio, fósforo e colágeno do osso neoformado, e também
acelera a revascularização da região afetada, promovendo assim a formação e
maturação óssea, dependente dos parâmetros de aplicação do laser (CHEN; ZHOU,
1989; TRELLES; MAYAYO, 1987).
Diversos estudos in vitro foram desenvolvidos para analisar os efeitos da
radiação laser de baixa intensidade sobre diferentes tipos celulares, tendo sido
observado aumento na atividade proliferativa de fibroblastos do ligamento
periodontal (KREISLER et al., 2003; SKINNER et al., 1996), favorecimento da
síntese protéica de fibroblastos humanos embrionários (GULSOY et al., 2006), e
aumento da proliferação de células mononucleares do sangue (GULSOY et al.,
2006).
Em relação ao tecido ósseo, os estudos são predominantemente dirigidos aos
efeitos da radiação laser sobre os osteoblastos. Foi demonstrada aumento da
viabilidade celular e da atividade de Fosfatase Alcalina (ALP), nas células irradiadas
com 2 J/cm2 nas primeiras 24 horas, porém maior expressão de osteopontina e
RNAm (RNAmensageiro) de colágeno tipo I após 72 horas (KAWASAKI; SHIMIZU,
2000).
Nos vertebrados adultos, o osso é constantemente remodelado por um
processo fisiológico chamado remodelação óssea. Dois eventos celulares estão
acontecendo ao mesmo tempo. O primeiro é a reabsorção do osso mineralizado da
matriz óssea por osteoclastos e o segundo é a formação da matriz óssea pelos
osteoblastos (RACHED; MARIE-THERESE et al., 2010).
No processo da digestão celular é comum a produção de radicais livres.
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) são continuamente geradas como um produto
normal de metabolismo aeróbico e pode causar peroxidação lipídica, danos às
proteínas e lesões no DNA levando as células à morte, porém, também serve como
sinalizadores de baixas concentrações no controle da proliferação e diferenciação
celular (AMBROGINI et al., 2009; ALMEIDA, 2012).
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Generalidades do Laser
A palavra LASER é um acrônimo de “Light Amplification by Stimulated
Emission of Radiation”, ou seja, “Luz Amplificada por Emissão Estimulada de
Radiação”. O princípio da emissão estimulada foi proposto primeiramente, sob forma
teórica, por Einstein, em 1917: a emissão estimulada de radiação é causada pela
presença de um fóton indutor de energia interagindo com um átomo em seu estado
excitado, resultando na liberação de dois fótons induzidos (PRETEL, 2005).
Um laser para funcionar precisa de um meio ativo, ou seja, de uma coleção
de átomos, moléculas ou íons, que emitam radiação na parte óptica do espectro e
ter uma condição fundamental que é inversão de população. É gerada por um
processo de excitação denominado bombeamento. Ela transforma o meio ativo em
meio amplificador de radiação (PRETEL, 2005).
A radiação com LBI é um feixe de luz monocromática que tem a capacidade
de produzir efeitos fotobiológicos atérmicos não destrutivos, capaz de penetrar em
estruturas profundas dos tecidos em comprimentos de ondas de 300 a 1300nm
estimulando fotoaceptores que tem capacidade de absorver fótons, provocando
alterações celulares. A fotoativação do LBI ocorre em aproximadamente 1cm2 em
torno do ponto de penetração do feixe de incidência em todas as direções
(TEIXEIRA, 2008).
A resposta fotobiológica obtida com o uso da radiação laser é o resultado das
alterações fotoquímicas e/ou fotofísicas produzidas pela absorção de radiações
eletromagnéticas (LIZARELLI; LAMANO-CARVALHO; BRENTEGANI, 1999).
A primeira publicação sobre LBI aconteceu há aproximadamente trinta anos
atrás, porém, nas décadas de 60 e 70, na Europa, médicos observaram os efeitos
da bioestimulação. Vários cientistas questionavam a credibilidade da terapia de LBI
e sua atuação em nível molecular, mas nos anos 80 estes controversos pontos
sobre laser e bioestimulação foram vistos com mais atenção em novos estudos e a
laserterapia passou a ser mais bem aceita no meio acadêmico (KARU, 2003).
17
As respostas biológicas de células diante do espectro de luz no vermelho ou
próximo ao infravermelho (IV) ocorrem devido às alterações físicas e/ou químicas no
fotoaceptor de moléculas. E células com um baixo pH em comparação com outras
mais próximas da normalidade, são consideradas mais sensíveis. Por este motivo
algumas situações clínicas apresentarem uma melhor resposta que outras
(LIZARELLI; LAMANO-CARVALHO; BRENTEGANI, 1999).
Seguindo essa linha de entendimento o autor (PEREIRA et al., 2002)
descreve as importantes características do LBI nas quais informa que: na coerência
todos os fótons são sincronizados; densidade de energia é a energia em joules
entregue ao tecido por cm2; dose ou fluência de energia é depositada por ponto de
aplicação e potência que é o número de fótons (em mW) que estão sendo emitidos
pela fonte de luz e diretamente relacionada à penetração.
Os primeiros sistemas LBI apresentavam como meio ativo uma mistura
gasosa de gás de Hélio e Neônio (laseres de HeNe) que emitiam no vermelho
(632,8nm), mas que apresentavam também outra linha de emissão no verde
(PRETEL, 2005). Hoje, na sua grande maioria, estes sistemas são constituídos de
um cristal de diodo semicondutor de (AsGa), podendo estar dopado por diversos
outros elementos, dependendo do comprimento de onda desejado.
Vários experimentos sobre o fechamento de feridas em animais
demonstraram a ação do LBI promovendo aumento da transcrição de mRNA de
procolagem tipo I e II (SAPERIA et al., 1986).
Os efeitos LBI na regeneração óssea tem sido foco de muitas pesquisas. Está
baseado na bioestimulação de tecidos com luz monocromática, e síntese de
colágeno. Neste tecido ósseo ele tem demonstrado sua eficiente ação na
proliferação celular (KHADRA et al., 2004a).
O efeito de bioestimulação do LBI teve como seu pioneiro Endre Mester, em
Budapeste nos anos de 1960, que demonstrou aumento na síntese de colágeno em
feridas na pele (MESTER E.; JASZSAGI-NAGT, 1973).
A primeira ação de espectro do LBI promovida por luz visível foi registrado
nos anos 80 com a intenção de investigar os mecanismos que promoveriam a uma
18
bioestimulação, pelo fato do pesquisador ter encontrado aumento na síntese de DNA
e RNA, estimulação de crescimento de Escherichia coli e síntese de proteína
(KARU, 2003).
A intensidade de fluxo de íons que atravessa a membrana depende da
intensidade do sinal recebido do fotoaceptor que depende da reação primária
durante irradiação com luz de diferentes comprimentos de onda (MESTER E.;
JASZSAGI-NAGY, 1973).
A membrana celular participa como transferente do fotosinal de cadeia
respiratória para que aconteça os efeitos esperados do laser. A cadeia respiratória é
o principal fotoaceptor primário para a transmissão do fotosinal da cadeia (KARU,
1989). Quando células são irradiadas, a luz é absorvida pelos componentes da
cadeia respiratória e eventos primários fotoquímicos e fotofísicos ocorrem nas
mitocôndrias em células eucarióticas e na membrana celular nas células
procarióticas.
Na absorção da luz monocromática visível, em nível celular acontece
excitação da molécula citocromo c oxidase, fotoaceptor que é a enzima terminal da
cadeia respiratória da mitocôndria como reação primária, e logo após acontece a
transdução do fotosinal, amplificação ou sinalização celular de cadeia como reações
secundárias, e uma cascata de alterações celulares no núcleo, citoplasma e
membrana passa a estar presente (KARU, 2003).
O LBI foi considerado como terapia de luz, uma vez que quando a luz é
absorvida pelas moléculas porfirinas e flavoproteinas pertencentes à cadeia
respiratória, em altas doses, estas são convertidas em sensibilizadores, estimulando
a síntese de DNA e RNA (KARU, 2003).
Em 1997 o laser teve seu efeito terapêutico confirmado in vivo. A laserterapia,
neste caso apresentou como efeito, a também liberação de substâncias opiáceas
endógenas (alfa e beta endorfinas); induziu a síntese de serotonina, e em algumas
circunstâncias é capaz de potencializar a condução de estímulos como analgésicos
através de fibras aferentes, diretamente relacionado à dor (LIZARELLI; LAMANO-
CARVALHO; BRENTEGANI, 1999), o que comprova o efeito do laser terapêutico no
controle da dor e edema na colocação de implante dentário.
19
A utilização do LBI na pele tem sua importância porque há um efeito direto na
vascularização abaixo dela e uma pequena quantidade de luz pode ser transmitida
através de quase todos os tecidos (TEIXEIRA, 2008).
Como aplicação clínica, a laserterapia com LBI tem sido usada nas diversas
áreas da medicina e paramedicina. Na odontologia é comum no tratamento de
cicatrização de tecidos moles, tratando também diversas úlceras. Atualmente vem
crescendo os estudos no campo das pesquisas da utilização do laser de baixa
intensidade na bioestimulação óssea (TEIXEIRA, 2008).
Na odontologia são diversas as aplicações clínicas como herpes, queilites,
estomatites, trismos, parestesia, dentre outras; e na implantodontia como
bioestimulação óssea (GENOVESE, 2007).
O laser pode controlar fenômenos da dor e inflamação, pela produção de
substâncias liberadas, como prostaglandinas, prostaciclinas, histamina, serotonina,
bradicidina e leucotrienos. Modificam também as reações enzimáticas, tanto no
sentido de excitação no caso de produção de ATP, como de inibição na síntese de
prostaglandinas pela interferência na atividade da ciclooxigenase que intermedia a
produção desta substância pelo ácido araquidônico (PRETEL, 2005).
Na laserterapia, resultados conflitantes podem ser encontrados em nível
celular. Discrepâncias estas que podem ser justificadas pelos experimentos
realizados em diferentes linhagens de células, comprimento de onda, densidade de
energia e tempo de exposição à irradiação (KHADRA, 2004a).
O LBI promove um aumento da microcirculação local e da velocidade de
cicatrização. O assunto ainda pode ser motivo de opiniões controversas sobre seu
efeito bioestimulante, mas a cada dia pesquisas continuam sendo realizadas para
comprovação dos mecanismos que acontecem quando da aplicação da luz em
tecidos, por luz visível monocromática nos fotoaceptores primários das células
(GENOVESE, 2007).
Com o avanço das pesquisas, a laserterapia questiona não mais os efeitos
biológicos já comprovados, mas como estes efeitos ocorrem em nível celular e que
parâmetro ideal de luz deverá ser utilizado em diferentes situações de aplicações
20
(KARU, 2003). Reações secundárias após absorção da luz acontecem quando se
inicia uma cascata de sinalização celular ou transdução de fotosinal e amplificação
de cadeia, como aumento na síntese de DNA por controle do fotoaceptor sobre o
nível de ATP intracelular. Pequenas alterações nestas estruturas podem significar
alterações no metabolismo celular. As reações seguintes são mediadas através do
estado redox celular, como transcrição de fatores redox sensitivos ou cascata de
eventos com sinalização homeostática celulares a partir do citoplasma, via
membrana para o núcleo.
A especificidade da resposta final do fotosinal não é determinada pelo nível
de reações primárias da cadeia respiratória, mas do nível de transcrição durante a
cascata de sinalização celular. Para indução de um efeito, parâmetros como
comprimento de onda, dose, intensidade, tempo de radiação, modo pulsado ou
contínuo, deve ser levada em consideração. Outra possibilidade de ativação de
células seria ativação de células que sinalizariam indiretamente outras células
(espécie de oxigênio reativo produzido por fagócitos, linfocinas e citocinas
produzidas por várias sub populações de linfócitos), ou Óxido Nítrico produzidos por
macrófagos. Estudos têm mostrado também o efeito do LBI na neuroquímica do
sistema neural central e periférico, o que sugere uma analgesia farmacológica
mediata, quando da utilização desta luz (LIZARELLI; LAMANO-CARVALHO;
BRENTEGANI, 1999).
Existem comprovações de alterações celulares em linfócitos periféricos de
humanos quando irradiados com laser HeNe, observando alterações na cromatina
de linfócitos poucas horas após a irradiação (KARU, 2003). O monofosto de
adenosina cíclico (cAMP) tem sido demonstrado como controle de DNA e RNA e
realização de atividades biológicas destas macromoléculas.
O LBI tem o objetivo de acelerar a neoformação óssea com seu efeito de
bioestimulação, para que os resultados da osseointegração de implantes dentários
de titânio aconteçam de forma mais rápida. Portanto, melhor qualidade óssea e
melhor conforto pós-operatório também podem ser alcançados além de conclusão
dos trabalhos de reabilitação mais precocemente. Possui um efeito positivo na
bioestimulação da osseointegração, promovendo maior adesão osso titânio,
proliferação de células osteoprogenitoras em sua direção e significativo aumento da
21
produção de fatores de crescimento celulares e mineralização de osso neoformado
(TEIXEIRA, 2008).
Doses de 1 a 5 J cm2 são usadas no LBI para efeito de bioestimulação óssea,
em concordância com estudos realizados na literatura, e sugeridos para indução de
um efeito positivo em tecidos mole e ósseo (PINHEIRO et al., 2003). Outros autores
afirmam que o efeito modulatório dose dependente (KHADRA et al., 2004); e outros
fatores envolvidos como fases de crescimento de células (OZAWA et al., 1998);
frequência e número de sessões (SILVA JÚNIOR, 2000), também influenciam no
final do resultado com o uso do LBI.
O LBI produz vários efeitos modulatórios como cicatrização de feridas
(MESTER E.; MESTER A. F.; MESTER A., 1985; TRELLES; MAYAYO, 1987),
síntese de colágeno (CHEN; ZHOU, 1989); efeito modulatório em processo
inflamatório (LIZARELLI; LAMANO-CARVALHO; BRENTEGANI, 1999), e aceleração
de proliferação de células (KHADRA, 2004a).
Muitos destes estudos realizados procuram alternativas para uma melhor
formação de matriz óssea e consequentemente melhor osseointegração dos
implantes dentários.
Osseointegração refere-se a uma ligação direta estrutural e funcional entre
osso vivo e superfície de um implante sem interposição de tecido que não seja
ósseo. Um implante é considerado como osseointegrado quando não há movimento
progressivo relativo entre o implante e o osso com o qual ele tem contato direto. Um
contato direto deste osso pode ser observado histologicamente como indicativo da
ausência de uma resposta local ou sistêmica biológica a essa superfície. Por
conseguinte, a osseointegração não é o resultado de uma resposta do tecido
biológico vantajosa, mas sim, a falta de uma resposta do tecido negativo
(MAVROGENIS et al., 2009). E, assim, é definido por meio estrutural e funcional
entre osso e implante (ALBREKTSSON et al., 1981; KIPSHIDZE; NIKOLAYCHIC;
KEELAN, 2001; CARLSSON et al., 1986).
Foi demonstrado que os implantes de titânio podem se tornar permanentes
incorporados dentro do osso, isto é, o osso vivo pode tornar-se tão fundido com a
camada de óxido de titânio do implante que os dois não podiam ser separados sem
22
fratura. Observa-se que essa integração do parafuso de titânio com o tecido ósseo
pode ser útil para apoiar como base de prótese dentária a longo prazo
(MAVROGENIS et al., 2009).
Desde as observações iniciais e os conceitos de osseointegração definidos
por Branemark, tem sido definido em níveis múltiplos, tais como clinicamente,
anatomicamente, histologicamente, e ultraestruturalmente em estudos in vivo e in
vitro de investigação, também com intuito avaliar a biologia da resposta de cura para
a superfície do implante, além das características do material, tais como superfície,
preparação, composição química, revestimentos e esterilização (MAVROGENIS et
al., 2009).
2.2 Resposta do Tecido no processo de Osseointegraç ão
O processo de cicatrização óssea em torno dos implantes envolve uma
cascata de eventos biológicos celular e extracelular na interface osso implante, até a
formação completa do osso na interface. Este evento biológico acontece da mesma
forma que num processo de ativação osteogênica de cicatrização óssea, pelo menos
em termos de resposta inicial. Esta cascata de eventos está diretamente relacionada
pelas células sanguíneas ativadas por citocinas e outros fatores de crescimento e de
diferenciação na interface osso-implante como fenômeno da biologia molecular.
Plaquetas, principalmente, células inflamatórias como polimorfonucleares,
granulócitos e monócitos migram através dos capilares para o tecido envolta do
implante. Há uma interação inicial da célula do sangue com o implante formando o
coágulo (FREITAS et al., 2000).
As plaquetas sofrem alterações químicas e morfológicas, como resposta à
superfície externa incluindo adesão, a agregação, e alterações bioquímicas
intracelulares, tais como a indução de fosfotirosina, aumento intracelular de cálcio, e
hidrólise de fosfolípidos (SILVA JÚNIOR, 2000).
A matriz de fibrina formada atua como uma osteoindução ou andaime para a
migração de células osteogênicas e eventuais diferenciação. Células osteogênicas
formam tecido osteóide e novo osso trabecular que eventualmente remodela em
osso lamelar em contato direto com a maior parte da superfície do implante,
23
acontecendo a osseointegração (MAVROGENIS et al., 2009).
Os osteoblastos e células mesenquimais parecem migrar para se aderir à
superfície do implante a partir de um dia após o implante, depositando proteínas
colagenosas e não colagenosas e criando uma camada de matriz sobre a superfície
do implante, que regula a adesão celular e a ligação de minerais. Esta matriz é uma
camada precoce calcificada fibrilar sobre a superfície do implante, envolvendo
osteóide mal mineralizado semelhante a uma camada 0,5 mm de espessura,
camada esta que é rica em cálcio e fósforo (MAVROGENIS et al., 2009).
2.3 Osteogénese peri-implantar
Refere-se ao trabeculado ósseo recém-formado peri-implantar que se
desenvolve a partir da cavidade osso hospedeiro em direção à superfície do
implante. Em contraste, osteogênese de contato refere-se ao osso recém formado
envolta do implante que se desenvolve a partir do implante para a cicatrização
óssea. A rede recém-formada de trabéculas ósseas segura a fixação biológica do
implante e rodeia espaços medulares contendo muitas células mesenquimais e
amplos vasos sanguíneos. Uma fina camada de tecido calcificado e osteóide é
depositado por osteoblastos diretamente sobre a superfície do implante. Os vasos
sanguíneos e células mesenquimais irão preencher os espaços onde não há tecido
calcificado presente (MAVROGENIS et al., 2009).
Os primeiros achados foram de uma camada fina de 20-50 µm formada por
células osteoblásticas planas, fibras colágenas calcificadas e uma área mineralizada
leve na interface titânio osso-implante como uma grande descoberta no caminho da
osseointegração (MAVROGENIS et al., 2009).
Pesquisas realizadas mostraram que um osso recém-formado depositado
sobre a superfície de implante instalado é positivamente reconhecível de células
osteogênicas como um andaime biomimético que pode favorecer o início da
osteogenese peri-implante. Linhas de cimento mal mineralizado (osteóide) demarca
a área onde a reabsorção óssea é completada em volta do implante e formação de
osso iniciada. Alguns dias após o implante, mesmo osteoblastos em contato direto
com a superfície do implante começam a depositar diretamente a matriz de colágeno
24
(MAVROGENIS et al., 2009).
Os osteoblastos nem sempre podem migrar tão rapidamente para evitar ser
totalmente envolvido pela mineralização frente à calcificação da matriz. Estes
osteoblastos tornam-se agrupados como osteócitos no osso lacunar (MAVROGENIS
et al., 2009).
A deposição precoce da nova matriz calcificada na superfície do implante é
seguida pelo arranjo do tecido ósseo e trabéculas ósseas. Espaços medulalares
ricos em vascularização e células mesenquimais estão muito presentes.
Inicialmente, a formação do novo osso formado ocorre para preencher a abertura
inicial da interface do osso implante (BUSER et al., 1991).
Uma rede óssea tridimensional regular proporciona uma elevada resistência à
carga precoce do implante. Sua arquitetura física incluindo arcos e pontes oferece
uma plataforma biológica para adesão celular e deposição de osso. O início da
formação óssea trabecular peri-implantar assegura ancoragem dos tecidos para a
fixação biológica dos implantes. Este começa entre 10 a 14 dias após cirurgia. A
fixação biológica difere da fixação mecânica primária (que é facilmente obtida
durante a inserção do implante). Fixação biológica envolve condições biofísicas tais
como a estabilidade primária que é mecânica do implante (CARLSSON et al., 1986).
Na Biologia da osseointegração, ocorre na superfície do implante,
prevalentemente em superfície rugosa, formação óssea, que posteriormente é
remodelado e substituído por osso lamelar que pode atingir um elevado grau de
mineralização. Após três meses de instalação do implante pode ser observado um
tecido ósseo com textura de matriz lamelar (CARLSSON et al., 1986).
O tecido ósseo peri-implante contém osteócitos regulares e osso hospedeiro
envolto em osso maduro. A superfície do implante é coberta com celulas achatadas.
A interface osso-implante mostra uma medula com espaços intratrabeculares
delimitados por um lado pela superfície do titânio e por outro por osso recém
formado rico em vasos e células sanguíneas. Os fragmentos ósseos oriundos da
instrumentação de fresagem no momento da inserção do implante são durante o
processo de formação óssea, envoltos em um osso trabecular e parecem estar
envolvidos na formação do osso trabecular durante as primeiras semanas no
25
processo de osseointegração orientando a osteogênese como material ósseo
condutor e ósseo indutor (ALBREKTSSON et al., 1981).
Por isso, pode ser útil na prática clínica a não lavagem com uma solução
salina ou aspiração da cavidade óssea antes ou durante a inserção do implante. Os
principais fatores para o fracasso da osteogênese peri-implante incluem a
diminuição da atividade de células osteogênicas, o aumento da atividade
osteoclástica, o desequilíbrio entre os fatores locais anabólicos e catabólicos que
atuam na formação e remodelação óssea, a proliferação anormal de células ósseas
como resposta a estímulos sistêmicos e locais e stress mecânico, e da
vascularização prejudicada. Esta última tem fundamental importância para o
processo de osseointegração, pois a diferenciação das células osteogênicas
dependem diretamente da vascularização do tecido (MAVROGENIS et al., 2009).
2.4 Remodelação Óssea no Periimplante
O osso em contato com a superfície do implante sofre remodelação
morfológica como a adaptação ao estresse e mecânica em forças imediatas. A
osseointegração é confirmada pela presença de osso medular ou espaços contendo
osteoclastos, osteoblastos, células mesenquimais e linfáticos e vasos sanguíneos ao
lado da superfície do implante. Durante a remodelação do osso peri-implante, novos
osteócitos ao redor do implante com os seus eixos longos paralelos à superfície do
implante e perpendicular ao eixo longo dos implantes estão presentes. Tecido
osteóide é produzido por osteoblastos, sugerindo que a osteogênese está em
processo. O osso remodelado pode se estender até 1 mm a partir da superfície do
implante (MAVROGENIS et al., 2009).
2.5 Titânio e alguns fatores no processo de osseoin tegração
O titânio é amplamente usado como um material ortopédico de implante. Suas
vantagens incluem elevada biocompatibilidade, aumento da resistência à corrosão e
ausência de toxicidade em macrófagos e fibroblastos, e reduz resposta inflamatória
em tecidos peri-implantares. A sua superfície é composta por uma camada de óxido
que fornece a capacidade de se reparar por reoxidação quando danificado
(CARLSSON et al., 1986).
26
Vários fatores podem melhorar ou inibir a osseointegração. Os que colaboram
na osseointegração relacionados aos implantes, estão composição química,
topografia da superfície do implante, material, forma, comprimento, diâmetro,
tratamento de superfície, o estado do leito ósseo e as condições mecânicas de
estabilidade e da carga aplicada no implante (CARLSSON et al., 1986).
O uso de adjuvantes tais como enxertias ósseas e agentes farmacológicos
tais como sinvastatina, antinflamatórios não esteróides, biofosfanatos e radioterapia
podem dificultar o processo de reparação. A sinvastatina é um agente de redução de
lípidos com efeitos osteoanabólicos. Estudos histomorfométricos demonstraram
aumento da desestabilidade na interface e má adaptação óssea na interface osso
implante nos grupos tratados com sivastatina (MAVROGENIS et al., 2009).
Em geral, superfícies ásperas moderadamente favorecem peri-
implantecrescimento ósseo com melhor resultado do que em superfície lisa. Por isto
que carregamento de força no implante leva ao micro movimento na interface osso-
implante. Algum grau de micro movimento é tolerado. Dentro de certos limites, o
carregamento mecânico no implante é tolerado. Estimula formação óssea. A
formação óssea é também uma função de efeitos biomecânicos. A osseointegração
é considerada não como uma reação exclusiva para um material específico de
implante, mas como a expressão de um potencial na base endógena regenerativa
do osso (MAVROGENIS et al., 2009).
A interface osso implante com integração concretizada é fundamental para a
possibilidade de reabilitação protética. Portanto, a laserterapia vem promover
através da bioestimulação melhorar as características ósseas, onde acontece a
indução de processos fotobiológicos atérmicos, não destrutivos (TEIXEIRA, 2008).
O uso do LBI promove um aumento na força, na interface osso implante, pelo
aumento do metabolismo e aceleração no processo de reparação, sugerindo uma
melhor adesão osso implante (KHADRA et al., 2004a). Usando uma energia de raios
X para microanálise, verificou-se um significante aumento de cálcio e fósforo
observado na interface em implantes tratados com LBI após teste de ensaio. Esta
técnica é para detectar a quantidade de cálcio e fósforo depois do teste de tensão. É
possível que o aumento destes minerais na superfície de grupos irradiados com LBI
27
sejam relatados para acelerar diferenciação de osteoblastos (OZAWA, 1984).
A osseointegração pode ser melhorada com a LBI, constatado em testes de
tração realizado em experimentos com animais, verificando-se que há uma melhor
adesão osso/implante, quando estão associados à superfície do titânio, cálcio e
fósforo, sugerindo ser este procedimento uma boa opção para cicatrização óssea
(KHADRA et al., 2004a)
Alguns autores acreditam que a formação óssea na osseointegração interface
osso implante, ser um complexo fisiológico, regulado por hormônios sistêmicos e
fatores locais produzidos por células esqueléticas, onde acontece diferenciação,
proliferação e deposição de matriz óssea (CANALIS, 1996; KARU, 1989).
Em estudos realizados em babuínos, foi observado que com 2.4 J
administrado num ponto de fratura a cada dois dias por três semanas, após 24 dias
foi observada rápida formação de osso com melhor trabeculado, aumento da
vascularização e grande atividades de osteócitos em volta da fratura, comparado ao
grupo controle (DORTBUDAK et al., 2002). Foi observado que nos dias 5 e 6 pós
injúria e aplicação do laser, havia atividade osteoblástica, confirmada pela fosfatase
alcalina, numa quantidade três vezes maior, comparada ao grupo controle.
Biomecanicamente, foi comprovado que o osso neoformado e pós irradiado com LBI
apresentou maior resistência à fratura, comparado a um osso não irradiado.
2.6 Tecido Ósseo
2.6.1 Histofisiologia Óssea
2.6.1.2 Histologia do tecido Ósseo
O osso é um tecido conjuntivo especializado mineralizado, composto por 33% de matriz orgânica, dentre os quais 28% de colágeno tipo Ie 5% de proteínas não colagenosas, como a osteocalcina, osteonectina, sialoproteínas, proteoglicanas e proteínas morfogenéticas ósseas. Os 67% restantes compõem-se de mineral, principalmente por cristais de hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) (PRETEL, 2005).
A função do tecido ósseo é de sustentação e proteção dos órgãos do corpo.
28
Também serve como alavanca para os músculos, promovendo a movimentação. É
um reservatório de mineral, principalmente de íons cálcio (PRETEL, 2005).
Embora o osso não seja diferente histologicamente um do outro, fatores
importantes são justificáveis para o entendimento de sua formação, que pode se dar
de duas maneiras: intramembranosa e endocondral. Na formação intramembranosa,
as células progenitoras diferenciam-se em osteoblastos, que secretam matriz óssea
formando uma malha de espículas e trabéculas ósseas. Na ossificação endocondral
ocorre um adensamento de células mesenquimais, que se diferenciam em células
cartilaginosas formando um molde de cartilagem hialina. Este molde de cartilagem
cresce servindo de esqueleto estrutural para o desenvolvimento do osso, e
posteriormente é reabsorvido (PRETEL, 2005).
2.6.1.3 Tipos de Tecido Ósseo
Independente de qual seja o processo de formação do osso, o tecido
resultante é sempre o mesmo, porém, histologicamente existe o osso primário, que é
embrionário, imaturo, isotrópico, ou osteóite, e o osso secundário, que é maduro,
anisotrópico, ou lamelar. Os dois tipos apresentam as mesmas células, mas com
diferentes orientações das fibrilas de colágeno quando analisados sob microscopia
de luz polarizada (PRETEL, 2005).
O osso primário é o primeiro tecido ósseo a se formar durante o
desenvolvimento fetal, e durante a reparação óssea. Possui grande número de
osteócitos, dispostos irregularmente nas trabéculas ósseas neoformadas. As fibras
colágenas apresentam-se sem organização definida e o teor mineral é menor do que
no osso secundário. O tecido ósseo secundário vai gradualmente substituindo o
tecido ósseo primário, enquanto vai havendo uma deposição de fibras colágenas,
modelação da forma trabecular do osso primário em lamelas dispostas
paralelamente uma das outras, formando ângulos retos que definem pequenos
espaços medulares, o chamado osso esponjoso. Quando as fibras colágenas
encontram-se dispostas em camadas concêntricas, em torno dos capilares
sanguíneos e nervos, denominamos canal de Havers, constituindo o osso compacto
(PRETEL, 2005).
29
2.6.1.4 Metabolismo Ósseo e Nutrição
O remodelamento é um processo que ocorre principalmente por intermédio
dos osteoblastos realizando aposição óssea e com os osteoclastos no processo de
reabsorção. Estas células em atividade promovem uma escavação acompanhada de
liberação óssea, na qual produtos da degradação do tecido são incorporados pelos
capilares sanguíneos, promovendo uma perfeita homeostase tecidual (PRETEL,
2005).
A regeneração óssea não é somente um processo biológico, mas, fatores
elétricos, bioquímicos e mecânicos são também de fundamental importância na
regeneração e manutenção do osso vivo (PRETEL, 2005).
A reparação óssea acontece imediatamente após a injúria, em que acontece a anoxia do tecido; há um aumento da vascularização e presença de maior sangramento na região; forma-se o coágulo e inicia-se a reparação. As células migram para a fibrina do coágulo para favorecer o processo de reparação. Isto indica que as primeiras células que participam deste processo são as plaquetas. Estas células se degranulam e estes grânulos liberam fatores de crescimento como PDGF, TGFB1, TGFB2, e outros. A hipoxia local sinaliza a regulação de produção dos fatores angiogênicos e seus receptores tentando restaurar e suprimento sanguíneo local e fechamento da lesão. Vasos sanguíneos são importantes para formação e manutenção do tecido ósseo. Na cortical óssea tem os canais Harvesianos para a nutrição do osso. Já os canais de Volkmann são responsáveis pela circulação de nutrientes e citocinas, sinalizando reação de osteoblastos e osteócitos (PINHEIRO; GERBI, 2006).
Em reforço a esse posicionamento (PINHEIRO; GERBI, 2006), concluem que
a aceleração da reparação pode ter um resultado por laserterapia na síntese de
matriz óssea devido aumento da vascularização e estágio inicial da resposta
inflamatória.
O osso é reserva primária de cálcio (99% de todo o cálcio do organismo),
tendo capacidade de renovação para responder as necessidades metabólicas do
corpo, sendo crucial para manutenção estável de cálcio no soro, o qual participa de
várias reações químicas. Conjuntamente com os pulmões e rins, mantém o nível pH
do corpo através da produção de fosfatos e carbonatos adicionais, bem como na
condução da carga elétrica em nervos e músculos (BUSER et al., 1991). O meio
metabólico é um componente importante da estrutura biomecânica do osso. Os
maxilares são afetados, como os demais ossos, pela renovação constante como
resposta a reações metabólicas (ROBERTS et al., 2004).
30
O fósforo é um componente mineral ósseo tão importante quanto o cálcio,
sendo retirado da estrutura óssea quando os níveis no soro estão baixos,
prejudicando estrutura e função óssea (ROBERTS et al., 2004).
Interações metabólicas e hormonais são determinantes para manutenção
óssea, principalmente no processo de reabsorção e aposição óssea através das
proteínas morfogenéticas (BMPs), na remodelação óssea diária. A renovação de
todo o esqueleto ocorre a cada 142 dias, sendo mais ou menos 0,7% diariamente
(ROBERTS et al., 2004).
Os osteoblastos além de depositarem matriz óssea, liberam BMPs e estas
proteínas, ácidos-insolúveis, ficam depositadas na matriz até serem liberadas na
reabsorção pelos osteoclastos, quando dissolvem o osso mineral sem afetar as
BMPs. Estas proteínas então aderidas às membranas protéicas de células
indiferenciadas de origem mesenquimal enviam um sinal para se tornarem ativadas
com fosfato adesivo de alta energia, provocando uma diferenciação osteoblástica e
estímulo para produção de osso novo (DARD et al., 2000; DUNN et al., 2005).
As vitaminas também são importantes em todo este processo e a vitamina D
tem um papel fundamental na absorção de cálcio e fósforo. Sua deficiência leva a
uma diminuição na absorção de cálcio e conseqüente aumento dos níveis de
hormônio paratireoidiano, promovendo aumento da reabsorção óssea. A luz solar é
capaz de transformar o 7-deidrocolesterol, substância gordurosa da pele, em um tipo
de vitamina D, sendo posteriormente transformada em sua forma ativa,
didroxicolecalciferol (CARVALHO et al., 2002; FLACH et al., 2005; GARTNER;
HIANT, 2002).
Todo este processo de anormalidade produz um estado de doença e
conseqüente redução no processo normal de renovação óssea, assim,
comprometendo a cicatrização óssea e podendo levar a um fracasso na
osseointergração de implantes dentários ou futura perda (CARVALHO et al., 2002;
DARD et al., 2000; DARVARPANAH et al., 2003; ROBERTS et al., 2004).
2.6.1.5 Estrutura óssea
Tanto o tecido ósseo trabecular quanto o cortical são encontrados em todos
31
os ossos, variando a quantidade e distribuição. Os espaços entre as trabéculas
(placas ósseas) são medulares e as trabéculas são formadas por várias camadas,
denominadas lamelas (DARVARPANAH et al., 2003; MARX; GARG, 1998; MISCH et
al., 1998, 2000).
Osso compacto ou denso é encontrado nas diáfises de ossos longos e
superfícies de ossos chatos, estando organizado em ossos cilíndricos consolidados
em torno de um vaso sanguíneo central (sistema harvesiano). Ossos trabecular ou
esponjoso ocupa a parte interna do tecido ósseo, que constitui a cavidade do osso.
As cavidades são preenchidas com medula: vermelha quando há produção
ativa de células ósseas ou reserva de células mesenquimais; e medula amarela
(adipócitos) quando a cavidade é convertida, com a idade, em um sítio para reserva
de gordura (DARVARPANAH et al., 2003; MISCH, 2000).
O osso é sempre revestido com periósteo, exceto em superfícies articulares,
sendo composto por duas camadas. A externa, fibrosa, feita principalmente de fibras
colágenas densas e povoada de fibroblastos. Essa camada é rica em fibras
nervosas e suprimento sanguíneo. A camada celular mais interna, em contato com o
osso, contém osteoblastos ativos, sendo denominada muitas vezes de camada de
troca. O periósteo é fixo ao osso pelas fibras de Sharpey, feixes colágenos
aprisionados na matriz calcificada (CAMPANHA, 2004).
Os espaços medulares são recobertos pelo endósteo, que é uma camada de
osteoblastos formando uma camada fina e delicada, portanto muito parecida com a
camada de troca celular do periósteo, com presença de células osteoprogenitoras,
osteoblastos e osteoclastos. A medula óssea adulta contém células-tronco, que
contribuem para regeneração dos tecidos de origem mesenquimal, como osso,
cartilagem, músculo, tendões, tecido adiposo e o estroma de muitos órgãos
(PITTENGER et al., 1999).
Em nível de microscopia, o osso pode ser dividido em: imaturo, lamelar
(maduro), fasciculado (fibroso) e composto. O osso imaturo tem a propriedade de se
formar rapidamente (30 a 60μm ao dia), sendo importantíssimo no processo de
cicatrização e, portanto, de estabilização inicial dos implantes, mas, pelo fato do
processo ser rápido, desenvolve uma forma desorganizada sem estrutura lamelar do
32
sistema harvesiano, resultando em osso com pouca resistência biomecânica por
causa da pouca calcificação. Por ser maleável, este osso tolera micromovimentos na
interface implante/osso, todavia não tem resistência para suportar cargas funcionais
(DARVARPANAH et al., 2003).
O osso fasciculado (fibroso) é referido como fase I do osso durante o
processo cicatricial, tendo uma deposição rápida e é reabsorvido rapidamente para
ser substituído por osso maduro (GARTNER; HIANT, 2002).
Osso lamelar (fase II) é o principal tecido de suporte, maduro, que suporta
carga, sendo extremamente resistente. Pelo fato de ter uma formação lenta (0.6 a
1μm ao dia), possui uma estrutura colágena e mineralização muito bem organizadas
(CAMPANHA, 2004).
Osso lamelar, constituído de camadas múltiplas e orientadas, é o principal
formador do osso cortical e trabeculado maduro (GARTNER; HIANT, 2002).
Osso fasciculado (fibroso) é o principal osso encontrado ao redor de
ligamentos e articulações, consistindo em interconexões entre os ligamentos, está
presente adjacente ao ligamento periodontal dos dentes, por exemplo (GARTNER;
HIANT, 2002).
O termo osso composto é usado para descrever o estágio de transição entre
osso trabeculado (imaturo) entrelaçado ao osso lamelar, ou seja, um lamelar
depositado em uma matriz trançada. Durante o processo de cicatrização óssea,
existe a captura de vasos sanguíneos ao longo da superfície do endósteo e
periósteo, a seguir, lamelas bem formadas completam o espaço paravascular do
retículo, resultando em um osso com resistência para suportar cargas (GARTNER;
HIANT, 2002).
O osso é um tecido que possui uma matriz colágena interligada com arranjo
tridimencional múltiplo de suas fibras, e a orientação dessas fibras determina o
padrão de mineralização. O osso adapta-se às forças biomecânicas e projeta
máxima potência na direção que é exigida pelas cargas (GARTNER; HIANT, 2002).
A cortical tem em sua formação 95% de mineralização, enquanto o esponjoso
30%, 70% é medula, ou seja, tecido não mineralizado. Esses dados mostram porque
33
o osso cortical é de 10 a 20 vezes mais resistente que o esponjoso e explica
porquanto o osso cortical suporta melhor os implantes e as cargas funcionais
(SENNERBY, 2001).
2.6.1.6 Modelagem e remodelagem óssea
O processo de remodelação é um processo dinâmico que ocorre no decorrer
de toda vida, e não somente no desenvolvimento do osso ou num processo de
injúria. O osso é um tecido vivo com funções básicas de suporte estrutural,
metabolismo de minerais, principalmente do cálcio e hemopoiese (GARCIA et al.,
2001). Sua formação é uma matriz protéica colágena (90% tipo I e tipo IV)
impregnada de sais minerais como fosfato de cálcio (85%), carbonato de cálcio
(10%) e pequenas quantidades de fluoretos de cálcio e magnésio, bem como
pequenas quantidades (10%) de proteínas não-colágenas (todas as proteínas
morfogenéticas do osso). Sua matriz de colágeno é extremamente complexa e
existe a necessidade de manter quantidade suficiente tanto de proteínas como de
minerais para que se tenha uma estrutura óssea normal (MARX; GARG, 1998;
ROBERTS et al., 2004).
As células ósseas são derivadas dos mesmos precursores (células
indiferenciadas), elas são encontradas no periósteo, endósteo e revestimento dos
canais de Havers, que se diferenciam em: Osteoblastos, Osteócitos e Osteoclastos
(GARTNER; HIANT, 2002).
Os osteoblastos são responsáveis pela síntese de matriz óssea, estando
localizados em áreas próximas à superfície do osso, onde depositam sua matriz.
Quando estes mesmos osteoblastos ficam envoltos pela matriz óssea,
transformamse em osteócitos, os quais são responsáveis pela manutenção óssea.
Apresentam prolongamentos formando uma rede de canalículos finos emergentes
da lacuna dos osteócitos que se comunica com os osteócitos adjacentes e os
espaços tissulares.
No osso maduro, não há quase extensão dessas prolongações, mas os
canalículos continuam a funcionar nas trocas metabólicas e bioquímicas entre os
osteócitos e o sistema sanguíneo, através dos fluidos tissulares que se misturam
34
aos fluidos dos canalículos, conduzindo as trocas metabólicas e bioquímicas entre a
corrente sanguínea e os osteócitos. Esse mecanismo permite aos osteócitos
permanecerem vivos, mesmo estando circundados por tecido mineralizado, sendo o
sistema dependente da distância dos capilares, que não deve ser maior que 0,5mm
ou, então, pelo fornecimento sanguíneo abundante através dos canais de Havers e
de Volkman. Os osteócitos são responsáveis pela homeostase, de curto prazo, de
cálcio e fosfato do organismo, respondendo ao nível de cálcio presente no sangue,
bem como a calcitonina e ao paratormônio liberados pela tireóide e a paratireoide
respectivamente (MARX; GARG, 1998).
Osteoclastos são monócitos fusionados que, histologicamente, aparecem
como células gigantes (células multinucleadas), localizadas em lacunas superficiais,
sendo responsáveis pela reabsorção e, também, pela formação, remodelação e
manutenção óssea em resposta aos hormônios da paratireóide, conjuntamente com
os osteoblastos. Após o processo de reabsorção, os osteoclastos desaparecem,
provavelmente por degeneração (MARX; GARG, 1998).
Autores definem modelagem óssea como qualquer mudança na forma ou
tamanho dos ossos. Podendo ser um processo anabólico com deposição óssea na
superfície; ou catabólico com reabsorção óssea, sempre ocorrendo ao longo das
superfícies periósticas vascularizadas (ROBERTS et al., 2004). A modelagem tem
que ser precedida de reabsorção, podendo ser controlada por fatores mecânicos
como ortodontia ou por fatores de crescimento, como cicatrização de fraturas,
enxertos ósseos e osseointegração (ROBERTS et al., 2004).
Remodelagem está relacionada à maturação óssea, manutenção do
esqueleto e metabolismo mineral (FLACH et al., 2005; MARX; GARG, 1998;
ROBERTS et al., 2004).
2.7 Classificação óssea relacionada à implantodonti a
O volume ósseo existente, sua qualidade e sua densidade são de extrema
importância para o sucesso em implantodontia, com denominações diferentes entre
autores, mas com a mesma intenção, desse modo, visando-se simplificar a
classificação para auxiliar os cirurgiões em seus planos de tratamentos e facilitando
35
a escolha do modelo de implante adequado, o tempo para colocação de carga e
estimar um prognóstico para os casos clínicos (MISCH et al., 1998, 2000; MORRIS,
2003; TOREZAN, 1998; TRISI; RAO, 1999).
Na densidade óssea maior, obtém-se um contato maior osso/implante,
consequentemente, permitindo um melhor travamento inicial do implante, garantindo
também imobilização mecânica durante a cicatrização e após a distribuição e
transmissão de tensões para interface osso/implante. Em ossos tipo IV ou D4,
devesse buscar implantes longos e largos se possível para compensar a falta de
densidade óssea, permitindo melhor prognóstico (DARVARPANAH et al., 2003;
MISCH, 2000; MORRIS, 2003; CHO; JUNG, 2003; COCHRAN, 1999; MEREDITH,
1998; COOMBE et al., 2001).
2.7.1 Classificação óssea segundo Lekholm (DARVARPA NAH et al., 2003)
- Osso tipo I - osso cortical homogêneo quase que exclusivamente;
- Osso tipo II - osso cortical espesso com cavidade esponjosa e trabecular densa;
- Osso tipo III - osso cortical fino com cavidade esponjosa e trabecular densa;
- Osso tipo IV - osso cortical fino envolvendo um osso esponjoso pouco denso.
2.7.2 Classificação da densidade óssea proposta por Misch (MISCH, 2000).
- Osso D1 - osso cortical denso;
- Osso D2 - osso cortical espesso denso a poroso na crista do rebordo e trabecular
fino no interior;
- Osso D3 - osso cortical poroso e fino no rebordo envolvendo um osso trabecular
fino;
- Osso D4 - osso trabecular fino;
- Osso D5 - osso imaturo não-mineralizado.
2.8 Utilização do Laser na implantodontia
A Implantodontia como uma especialidade da odontologia ganhou grande
difusão nos anos 80. Nos anos que antecedem este período o efeito do LBI na
regeneração óssea tem sido alvo de pesquisas e experimentos em animais para
36
comprovação de seu efeito, no intuito de utilização em condições clínicas,
principalmente nos casos de implantes osseointegráveis, para bioestimulação óssea.
A perda óssea é um grande problema na área médica e odontológica. O
organismo conta com o suprimento sanguíneo para uma neoformação óssea
devolvendo a arquitetura óssea original, dentro de um limite de reparação. Muitas
destas perdas ocorrem fisiologicamente com a idade, e muitas das causas são de
origem patológica. Estes defeitos ósseos hoje são reparados, com algumas técnicas,
dentre elas a laserterapia com baixa intensidade (PINHEIRO; GERBI, 2006).
Com o grande aumento da utilização de implantes dentários para reabilitação
de pacientes por elementos dentários perdidos, e também pela necessidade de
regeneração óssea pela reabsorção e remodelação pós exodontias e traumas, faz-
se necessário à utilização de alternativas de tratamento reconstrutivos e indutores
de neoformação óssea. Os autores observaram que a confirmação do sucesso do
tratamento com implante osseointegrado depende do processo de cicatrização da
ferida e potencial osteogênico de células para induzir formação de novo osso envolta
dos implantes. O LBI tem avançado muito nestas pesquisas (KHADRA et al., 2004a).
O laser de baixa intensidade promove bioestimulação induzindo alterações
metabólicas intracelulares, resultando numa rápida divisão celular e produção de
matriz, porém, em altas doses pode resultar em inibição celular (KHADRA et al.,
2004a).
Quando um tecido é irradiado, o cálcio intracelular é o sinal mais comum da
transdução e é susceptível para um rápido e localizado aumento (COOMBE et al.,
2001).
Não se sabia exatamente se o aparecimento de colágeno em tecidos
irradiados com LBI, e efeito de biomodulação da formação óssea, se era um efeito
das células mesenquimais ou uma direta estimulação de osteoblastos (PINHEIRO et
al., 2003). O autor acreditava que para produzir um efeito positivo nos tecidos
irradiados, utilizando-se de 1 a 5 J cm2 seria o suficiente, como são de acordo a
maioria dos autores, embora sugerem altas doses. Observaram que com 21 dias de
aplicações de laser, seguindo o protocolo, a formação óssea em todos os grupos
irradiados não foi equivalente, mas que com 30 dias após o momento cirúrgico e a
37
aplicação a cada 48 h por 14 dias, houve um grande aumento de fibras colágenas e
osso mais maduro comparado com não irradiado. A importância dos resultados
deve-se observar nos experimentos, as doses dependentes, frequência e número de
sessões.
Dependendo do tipo de trauma causado ao tecido ósseo e a intensidade que
o mesmo foi atingido, uma série de eventos é iniciada e o periósteo libera células
osteogênicas que se diferenciam em osteoblastos, dando início ao processo de
reparação (PINHEIRO; GERBI, 2006). E a laserterapia entrando neste processo
facilitando a recuperaçãoóssea.
Alguns autores acreditam que para haver o efeito de bioestimulação, haveria
a necessidade da presença de oxigênio singleto, como radicais livres seguidos de
irradiação com luz laser (DORTBUDAK; HAAS; MAILATH-POKORNY, 2000). A
partir daí, o aparecimento da adenosina trifosfato (ATP) que é influenciada pelo
oxigênio singleto livre (DORTBUDAK et al., 2000).
Através de experimentos em alvéolo de dentes extraídos, autores verificaram
o efeito do LBI em aumentar a deposição de cálcio, sugerindo a importância na
estimulação da ossificação (TAKEDA, 1988; KHADRA et al., 2004a).
A proliferação de osteoblastos é muito importante no processo de reparação
óssea. Trabalhos realizados em ratos mostraram alta concentração de trabeculado
ósseo após três semanas de aplicação do LBI (HeNe), aplicado diariamente
(DORTBUDAK et al., 2000).
Na utilização do LBI foi observado um importante aumento na vascularização
e rápida formação de tecido ósseo com trabeculado denso em animais tratados em
experimentos, sugerindo o efeito modulatório na função de osteócitos a promover
calo ósseo (TRELLES; MAYAYO, 1987).
Mesmo os diversos estudos comprovando a biomodulação do LBI no
processo de reparação óssea, alguns estudos ainda não encontram este efeito
positivo do laser, que provavelmente pode ser devido aos diferentes aspectos de
projetos realizados nos experimentos (PINHEIRO et al., 2003). Ainda segundo o
autor, efeitos sistêmicos não são considerados, assim como também não se
38
verificou efeito de bioestimulação, o que sugere que os resultados foram devidos ao
uso inapropriado do comprimento de onda.
Aplicando o LBI em um paciente com fratura e osteomielite foi comprovado
que a laserterapia promoveu o rápido fechamento ósseo, sugerindo poder ser usado
o laser para cicatrização óssea (ABE, 1990; KHADRA et al., 2004a).
O pesquisador quando utilizou o LBI em seus experimentos em fêmur de
ratos, observou em cortes histológicos grande quantidade de fibras colágenas, o que
indica uma forte evidência de uma neoformação óssea acontecendo, considerando
que na matriz extracelular do osso em formação se concentra grande quantidade de
fibras colágenas. Refere o autor que este efeito de biomodulação é devido às
respostas das células mesenquimais ou estimulação direta dos osteoblastos
(PINHEIRO et al., 2003).
O uso do LBI para diminuição e prevenção de acontecimentos pós trauma
tecidual, tanto em tecido ósseo quanto em tecido mole, faz com que haja uma
absorção pelas estruturas celulares ativando assim o processo bioquímico das
células ósseas e a síntese de proteína DNA-RNA (ácido ribonucleico), acelerando a
normalização das estruturas e promovendo a cicatrização (ROCHKIND et al., 2004).
Com estes resultados comprovados a implantodontia tem muito a ganhar a
cada dia, atingindo um nível de excelência do ponto de vista clínico cirúrgico no
conforto do pós-operatório do paciente, e no fisiológico obtendo uma melhor
qualidade e formação óssea mais rápida.
A laserterapia tem sido usada com bons resultados no processo de
cicatrização de tecidos moles e controle da dor. No tecido ósseo foi observado o
efeito de modulação da inflamação e aceleração do processo de cicatrização óssea
(NICOLAU; JORGETTI; RIGAU, 2003).
Efeito positivo da irradiação Laser de Baixa Intensidade (LBI) no controle da
dor e edema no pós- operatório de implante dentário, foi encontrado, comparado a
um grupo controle, quando os autores avaliaram quarenta e cinco situações clínicas
(LIZARELLI; LAMANO-CARVALHO; BRENTEGANI, 1999).
"É muito importante o uso de laser de baixa potência no pós-cirúrgico de
39
implante dentário, para o controle da dor e edema, podendo também ser utilizado no
pré-cirúrgico com bons resultados" (LIZARELLI; LAMANO-CARVALHO;
BRENTEGANI, 1999).
O positivo efeito de biomudulação em doses dependentes do LBI no processo
de reparação óssea in vivo e in vitro foi encontrado, embora alguns pesquisadores
não tenham encontrado nenhum efeito positivo, o que se acredita ser pelo uso
inapropriado do comprimento de onda (PINHEIROS et al., 2004).
A importância de aplicação de repetidas doses de radiação nos tecidos foi
comprovada, quando em estudos se observou um aumento de proliferação de
atividade celular 24 horas após de irradiação de tecidos, e decréscimo nas 48 e 72
horas. Doses de 1 a 3J/cm2 foram as de escolha para irradiar tecidos para
bioestimulação (KHADRA et al., 2004a).
O LBI quando usado como laserterapia, aumenta as atividades das células
ósseas na formação e reabsorção sem alterar a estrutura do osso (NICOLAU;
JORGETTI; RIGAU, 2003).
A angiogênese, síntese de colágeno e osteogênese são essenciais para o
processo de reparação óssea, e o LBI tem grande influência na modificação destes
fatores, embora pesquisas ainda acontecem para esclarecer melhor o processo o
processo (KHADRA et al., 2004a).
A cicatrização de uma ferida ocorre no competitivo processo de síntese e lise
de fibras colágenas e, quando há um fator local ou sistêmico que interfira neste
processo, como é o caso de desordem hormonal, nutricional ou outro fator que
influencie no processo inflamatório ocorrerá uma desorganização deste fechamento
tecidual (PINHEIRO et al., 2004). E para estimular a função celular para minimizar
estas alterações, estudos estão sendo realizados com laserterapia, com a intenção
de promover reparação no controle da dor, incremento da produção de colágeno,
proliferação de fibroblastos e aumentar a microvascularização local, desde que
usadas doses adequadas, comprimento de onda, densidade de potência e tempo de
exibição do laser.
O LBI estimula condições ambientais que propiciam o fechamento de fraturas
40
e defeitos ósseos (KAWASAKI; SHIMIZU, 2000; LUGER et al., 1998; TRELLES;
MAYAYO, 1987; GUZZARDELLA et al., 2001a; MORRONE et al., 2000
GUZZARDELLA et al., 2001b).
Utilizando LBI no infravermelho (IV), em fêmur de ratos onde foi criado um
defeito ósseo, autores utilizaram 4.8J/cm2 por sessão, encontrando significantes
diferenças em áreas de mineralização óssea, comparadas ao do grupo controle, nos
estágios iniciais de cicatrização, mas que depois de 28 dias não houve diferença
(PINHEIRO; GERBI, 2006). Outro estudo citado pelos autores mostrou que quando
implantes colocados em animais e irradiados a 4.8J/cm2, comprimento de onda de
830nm e 40mW, contínuos, após 45 dias não houve resultados significativos de
bioestimulação comparado ao grupo controle, e que antes deste período houve uma
significância de resultados de organização óssea e vascularização. Os autores
concluem que a resposta fotobiológica pode ser devido à absorção de um específico
comprimento de onda por algum fotorreceptor na célula.
Com aumento da vascularização em áreas irradiadas, maior organização
lamelar na interface perimplantar foi encontrada, e os autores sugerem que o LBI
tem aplicação precisa na implantodontia, melhorando o potencial de regeneração e
maturação óssea. O aumento do suprimento vascular causado pela irradiação foi
verificado em tempo real em humanos num delineamento randomizado, numa
profundidade de 8mm do ponto de irradiação (TORRES; TEIXEIRA, 2008).
Pesquisas em que inseriram ligas de titânio em mandíbula de cães e
promoveram estimulação com GaAlAs para investigar inserção gengival
periimplantar, foi observado um aumento na síntese de DNA e fosfatase alcalina
(GUZZARDELLA et al., 2003).
Trabalhos realizados mostraram que não houve alterações na membrana
celular quando a energia depositada num tecido utilizando um laser de He-Ne foi
numa dose de 0,5 ou 1.0 Jcm2, mas quando utilizou 1.0 Jcm2 em repetidas doses
em intervalos de 24hs, foi capaz de promover alterações na superfície da membrana
celular, sugerindo que o laser pode ser eficiente em doses dependentes (LIZARELLI;
LAMANO-CARVALHO; BRENTEGANI, 1999).
Alguns autores não encontraram efeitos positivos no LBI, enquanto diversos
41
outros em condições diferentes de experimento, vem com o avanço das pesquisas
encontrando um efeito positivo (PINHEIRO et al., 2003). Este efeito negativo pode
está relacionado a baixas ou excessivas doses e diferentes comprimentos de onda.
Para outros na bioestimulação óssea quando da utilização do LBI, são
necessárias altas doses com adequado escolha do nível de energia (WEBER et al.,
2006). O efeito positivo que sinaliza a luz laser ainda não é completamente
entendido, mas que uma das hipóteses é que a luz laser estimula porfirinas e
citocromo c oxidase para aumentar atividade celular, consequentemente
aumentando a concentração de ATP, que tem relação com a formação de cálcio.
Ainda segundo o autor, o efeito biomodulatório depende do estado fisiológico celular
e do tempo de irradiação (KARU, 1989).
Outro estudo mostra um melhor efeito estimulante da luz laser quando as
células são irradiadas na fase inicial de proliferação e diferenciação (OZAWA et al.,
1998). A diferença de resultados em seus experimentos em que melhores resultados
foram encontrados no osso irradiado ainda no leito cirúrgico onde as células estão
em proliferação e diferenciação, em comparação com o fragmento ósseo que foi
irradiado antes da colocação no leito cirúrgico. Mesmo assim, pós este período
inicial de bons resultados do laser, também são alcançados resultados positivos
tardios confirmados pela literatura, motivo pelo qual se seguiu o protocolo para os
experimentos, a cada 48 horas de irradiação, por 15 dias. O autor comenta que não
existe um parâmetro específico para produzir uma resposta fotobiológica, mas sim
uma conjugação de diferentes parâmetros, e que ainda é duvidoso afirmar se
estimulação óssea por luz laser tem efeito geral ou se a estimulação isolada de
osteoblastos é possível. Mas concluiu em seus experimentos que o LBI teve efeito
bioestimulatório na cicatrização de defeitos ósseos no leito cirúrgico com melhores
resultados comparados a fragmentos ósseos autógenos irradiados, e no pós
operatório (WEBER et al., 2006).
Há o alerta para o cuidado com as análises de resultados com a utilização de
LBI em aplicações em pesquisas, tendo em vista não se ter um protocolo padrão
quanto à metodologia de irradiação, tornando a comparação dos resultados difícil ou
mesmo impossível (TORRES; TEIXEIRA, 2008). Os autores ainda afirmam que os
resultados tem mostrado que a resposta vascular aumentada em tecidos irradiados
42
seria um dos principais responsáveis pelo efeito positivo do laser.
2.9 Cultura de Células e Laser
A atual importância do LBI na reparação de tecidos moles já é comprovada,
mas há necessidade de haver mais pesquisas quanto ao uso do laser na reparação
de teciso ósseo, que evidenciem os efeitos do na modulação quando células
osteoblásticas são irradiadas diretamente pela luz laser de baixa intensidade
(DORTBUDAK et al., 2002). Nos seus experimentos, foi utilizado laser sobre os
osteoblastos derivados de células mesenquimais divididas em três grupos de 10
culturas de cada para irradiação nos dias 3, 5 e 7 com um laser de diodo pulsado
macio no comprimento de onda de 690 nm, durante 60 s. Mais 3 grupos de 10
culturas, em que foram utilizadas células de medula, e um grupo controle. Comparou
o crescimento ósseo nas culturas, após um período de 8, 12 e 16 dias,
respectivamente. Verificou-se que todas as culturas irradiadas demonstraram
através da fluorescência, maior crescimento ósseo em comparação ao grupo
controle não irradiado.
Estudos in vitro com culturas de células de ratos e células humanas, tiveram
resultados, com efeito, bioestimulante no crescimento das células osteoprogenitoras
na densidade de energia de 1J/cm2, e doses acima de 2J/cm2 causaram inibição de
crescimento celular (TORRES; TEIXEIRA, 2008).
Em investigação utilizando in vitro osteoblastos, fibroblastos, moedas de
titânio e irradiação com LBI, foram resultados de um maior espalhamento das
células ocorrendo em titânio com tratamento de superfície lisa, do que nas mais
ásperas ou fosco (BAXTER et al., 2002)
Autores relataram a importância positiva do LBI na produção de matriz óssea,
quando estudaram in vitro, culturas de células da medula óssea, em que utilizaram
doses de densidade de energia de 1.6J/cm2 (DORTBUDAK et al., 2002).
Pesquisas comprovaram que a luz do laser, principalmente o LBI tem sido
cada vez mais utilizado para o tratamento de lesões de tecido mole e duro
(DORTBUDAK; HAAS; MAILATH-POKORNY, 2000). No trabalho citado o autor
evidenciou que as descobertas científicas já indicavam boa cicatrização dos tecidos
43
moles, uma rápida regeneração de nervos lesados e um aumento da formação de
novos capilares através da liberação de fatores de crescimento, assim como a
estimulação do DNA e RNA. A proliferação de osteoblastos, em particular seria de
grande interesse clínico na regeneração de osso perdido. Os resultados favoráveis
foram também obtidos em exames de tecido duro, como fraturas ósseas provocadas
em ratos, que mostraram mais rápida formação de tecido ósseo, com um malha
apertada de trabéculas após 3 semanas de irradiação diária com um laser de
HeNe.O mecanismo exato de ação da bioestimulação celular por laser ou luz ainda
não era claro, mas objeto de vários estudos. Concluiu que as células mostraram um
grabde crescimento quando irradiadas, após 12 dias, comparado ao grupo controle,
além de ter efeito bioestimulante em osteoblastos, o que sugere a aplicação do laser
de baixa intensidade para uso em implantes dentários.
O LBI quando utilizado em experimentos em linhagem de células de
osteossarcoma humano, não encontrou significante ativação ou proliferação celular
em nenhum nível de energia utilizado, não observou choque térmico no nível de
energia de 2 J, nem significante efeito precoce ou tardio em relação a proteínas e
fosfatase alcalina (COOMBE et al., 2001). Apenas a concentração de cálcio
intracelular revelou uma tendência de possível alteração pela irradiação. Pesquisas
futuras são necessárias para ratificar estes dados.
Com o objetivo de in vitro investigar o efeito do LBI sobre a proliferação,
diferenciação e da produção de fator de crescimento em células derivadas do osso
mandibular humano, estas foram expostas ao laser de diodo AsGaAl em dosagens
de 1,5 ou 3 J/cm2 semeadas em discos de titânio (KHADRA et al., 2004a). As
culturas dos grupos não irradiados serviram como controle. As células foram
cultivadas por 24 horas em titânio e, em seguida, expostas à irradiação com laser,
durante três dias consecutivos. Após 1, 3 e 24 horas, as células foram coradas,
fixadas e foram contadas sob uma luz de microscópio, a fim de investigar o efeito do
LBI na proliferação das células após 48 h, 72 e 96. A actividade da fosfatase alcalina
específica e a capacidade das células para sintetizar osteocalcina, após 10 dias,
foram investigadas utilizando p-nitrofenilfosfato como um substrato e o ELSA-OST-
NAT kit imunorradiométrico, respectivamente.
Maior proliferação celular em todos os grupos irradiados foi observada
44
primeiro após 96 h, principalmente síntese de osteocalcina sobre as amostras
expostas a 3 J/cm2. No entanto, as atividades da fosfatase alcalina não diferiram
significativamente entre os três grupos. Estes resultados mostraram que, em
resposta ao LBI, as células cultivadas juntamente com material de titânio para
implante, apresentaram uma tendência para aumento de adesão, diferenciação e
proliferação, indicando que in vitro LBI pode modular a atividade das células e
tecidos circundantes ao material de implante.
2.10 Laser, Alterações Celulares in Vitro e Radicais Livres
No processo da digestão celular ROS são continuamente geradas como um
produto normal de metabolismo aeróbico e pode causar peroxidação lipídica, danos
às proteínas e lesões no DNA levando as células à morte. Estas ROS também
servem como sinalizadores de baixas concentrações no controle da proliferação e
diferenciação celular (AMBROGINI et al., 2009; ALMEIDA 2012).
As ROS como o Peróxido de Hidrogênio, o ânio superóxido e radical hidroxilo,
substâncias produzidas durante o metabolismo celular que podem causar severos
danos para o DNA, proteínas e lipídios através da produção de altos níveis de
oxidantes também podem ser formadas por estímulos que perturbem o estado de
equilíbrio redox (o equilíbrio de redução-oxidação) levando as células a um stress
oxidativo. As ROS podem ser a causa de doenças relacionadas à perda óssea pela
supressão da formação óssea, e reabsorção óssea (ZHANG et al., 2013), assim,
podem ser danosas ou não, como resultado do metabolismo aeróbico celular, e
também sinalizando moléculas para propagar sinais de fatores de crescimento
(ALMEIDA, 2012).
Importantes enzimas antioxidantes e várias formas de superoxido dismutase
convertem o ânio superóxido para H2O2, e catalase converte H2O2 em água e
oxigênio. O stress oxidativo é o resultado do desequilíbrio das ROS e outros
oxidantes e a capacidade das células de construir uma efetiva resposta antioxidante.
A peroxidação lipídica também contribui para a diminuição do número e formação de
osteoblastos, o que levaria a uma diminuição da massa óssea e deficiente formação
da matriz e/ou apoptose (ALMEIDA, 2012).
45
Foi observado em pesquisa que a apoptose de osteoblastos por H2O2 foi
associado com desnaturação de DNA de osteoblastos pelas ROS (MANAN et al.,
2012). Outros autores corroboram resultados dos efeitos do H202 no DNA, como
inibição da síntese de DNA (K-NOSE et al., 1994), fragmentação do DNA, e
condensação do núcleo (XU et al., 2011), que são características de apoptose.
Estes acontecimentos tem também sinalização para inibir diferenciação osteogênica
com aumento do nível de ROS (BYUN et al., 2005).
As reações dos radicais livres com biomoléculas, como no caso das reações
do HO. com DNA e lipídios, acontece porque o radical hidroxila gerado pela radiólise
da água inicia a oxidação de lipídios. É a peroxidação lipídica. A importância
fisiológica da peroxidação lipídica ficou mais clara pelo melhor conhecimento sobre
os componentes das membranas biológicas e sobre como suas propriedades podem
ser alteradas pela presença de radicais livres. Estas membranas têm suas funções
comprometidas com a formação de ligações cruzadas por reações de terminação
radical-radical entre lipídio-lipídio e lipídio-proteína e também pelo encurtamento das
cadeias lipídicas por processos degradativos levando a um aumento da rigidez das
membranas celulares, comprometendo suas funções. O HO pode quebrar o DNA e
oxidá-lo, atacando diferentes sítios do mesmo. Como o HO radical reage
indiscriminadamente com biomoléculas, isto ratifica sua condição necessariamente
nociva. Há evidência que nos mamíferos há uma proteína cuja função é consumir
um radical livre, chamada ânio superóxido. Esta proteína contém íons de cobre e
zinco. É uma enzima porque catalisa uma reação, a dismutação do ânion radical
superóxido, a superóxido dismutase. A dismutação é um tipo de reação muito
importante para a decomposição ou consumo de radicais livres: no processo, dois
radicais livres iguais reagem, gerando produtos não radicalares. No caso do radical
superóxido, um transfere elétron para o outro, de forma que o radical que perdeu
elétrons se transforma em oxigênio molecular, e o que recebeu, vira peróxido de
hidrogênio. Mais tarde se comprova que os radicais livres, pelo menos o radical
superóxido, eram constantemente produzidos pelos organismos vivos durante suas
atividades metabólicas normais (AUGUSTO, 2006).
A oxidação lipídica diminue o número de osteoblastos e formação óssea, que
ocorre com a idade (ALMEIDA, 2011). No processo de oxidação lipídica,
lipoxigenase oxida ácido poliinsaturado para formar produtos e gerar pro oxidante. A
46
oxidação lipídica aumenta com a idade no osso.
Os radicais livres quando causam danos nas mitocôndrias levam a um
aumento excessivo de ROS causando stress oxidativo e lesões nas proteínas,
lipídios e DNA, e morte celular. Existe em contrapartida ao stress oxidativo e ação
danosa das ROS uma proteína chamada Fox0. Estes fatores de transcrição Fox0,
ou forkhead box 0 (Fox0) representam uma subclasse de uma grande família de
proteínas. São responsáveis pela síntese de proteínas e diferenciação celular, onde
as mesmas são atenuantes da osteoclastogênese, agindo também nas células
progenitoras de osteoblastos. As do tipo 1, 3, e 4 são abundantemente encontrados
em células ósseas. Sinalizam estímulos integrados no desenvolvimento, como nas
alterações hormonais, inflamação e stress oxidativo dentro de um programa
dinâmico de expressão genica envolvidos em muitos processos fisiológicos e
patológicos. São indispensáveis para uma variedade de processos celulares,
incluindo proliferação, diferenciação, apoptose, autofagia, metabolisto e resistência
ao stress. Permitem reparação de danos no DNA e desintoxicação de células,
estimulando severas expressões gene envolvidas no DNA. Estudos mostran que
Fox0s exercem efeitos autônomos nos osteoblastos e osteoclastos. Estímulos de
ROS pode interferir com as atividades dos Fox0s. Fox03 reduz o stress oxidativo e
promove a sobrevivência de osteoblastos, in vivo. In vitro, os Fox01 produzem
importantes aminoácidos e síntese de colágeno em osteoblastos, além de regular o
stress oxidativo, proliferação de osteoblastos e resultados na formação óssea.
Os resultados dos estudos da manipulação genética de Fox0s em
osteoblastos maduros sugerem fortemente que esta transcrição de fatores são fortes
mediadores em defesa celular contra stress oxidativo contribuindo para a
homeostase. Uma série de recentes descobertas indica que os Fox0s sinalisam um
importante papel na homeostase celular exercendo efeitos dependente e
independente de ROS. Exerce em células de linhagem osteoblásticas regulando a
expressão gene como osteocalcina e a função de outros fatores de transcrição vitais
para osteoblastogenese e protege os osteoblastos maduros (ALMEIDA, 2011).
Através de análise imunohistoquimica, foi observado que os Fox01 e ATF4 se
localizam no núcleo, mas podem ser encontradas no citoplasma. No caso de algum
estímulo, em particular o stress, estes dois fatores de transcrição estarão
47
predominantemente no citoplasma (RACHED et al., 2010). O sinal de stress estimula
sua translocação para o núcleo onde eles operam para iniciar a transcrição de
eventos que protegem a funcionalidade celular. Modulam a balança redox, síntese
de proteína, e diferenciação através de ativação de programas de gene específico e
interação com outros fatores.
Alguns autores (ZHANG et al., 2013) encontraram resultados que afirmam
que o stress oxidativo gerado pelo desequilíbrio do estado redox afeta a viabilidade
celular e diferenciação de osteoblastos, num processo que promove a supressão da
diferenciação dos osteoblastos que se caracteriza pela redução na atividade de
Fosfatase Alcalina (ALP), sendo este um dos primeiros sinais importantes que
regulam a mineralização da matriz óssea. As ROS podem levar à reabsorção óssea
por indução de atividades de osteoclastos, podendo induzir apoptose de
osteoblastos e diminuição de suas atividades, diminuindo sua formação óssea
(JILKA et al., 2009). Observaram que a presença de H2O2 diminuiu significamente a
Fosfatase Alcalina (ALP) celular, mineralização e expressção de gene de
diferenciação osteogênica e que H2O2 leva a disfunção dos osteoblastos. Quando
osteoblastos foram colocados com uma substância antioxidante, por exemplo a
salidroside na presença de H2O2, aumentou significativamente a atividade celular e
expressão de ALP, e que estas células osteoblásticas sofrem influência de
hormônios os quais tem grande controle das ROS.
Existe em contrapartida, contrária ao stress oxidativo a ação danosa das ROS
às proteínas Fox0, atenuantes da osteoclastogênese, agindo também nas células
progenitoras de osteoblastos (JILKA et al., 2009; RACHED et al., 2010).
Os Fox0s sinalizam um importante papel na homeostase celular exercendo
efeitos dependente e independente de ROS (ALMEIDA, 2011). Resultados de
trabalhos indicaram a ativação dos Fox0 nas células progenitoras de osteoblastos e
osteoclastos. Estes efeitos nas células osteoblásticas dependem do seu estágio de
diferenciação. Exercem em células de linhagem osteoblásticas regulando a
expressão gene como osteocalcina e a função de outros fatores de transcrição vitais
para osteoblastogênese e protege os osteoblastos maduros. In vitro os Fox01
interagem com fator de transcrição de aminoácido 4 (ATF4) promovendo síntese de
colágeno nos osteoblastos (ALMEIDA, 2011).
48
Foram encontrados resultados que afirmam que as ROS podem levar à
reabsorção óssea por indução de atividades de osteoclastos, podendo induzir
apoptose de osteoblastos e diminuição de suas atividades, diminuindo sua formação
óssea (ZHANG et al., 2013). Outros trabalhos mostraram também que a presença de
H2O2 diminuiu significamente a Fosfatase Alcalina (ALP) celular, mineralização e
expressão de gene de diferenciação osteogênica e que H2O2 leva a disfunção dos
osteoblastos. Alguns autores avaliaram que quando osteoblastos foram colocados
com uma substância antioxidante, por exemplo a salidroside, na presença de H2O2,
aumentou significativamente a atividade celular e expressão de ALP, e que estas
células osteoblásticas sofrem influência de hormônios os quais tem grande controle
das ROS (JILKA et al., 2009).
No nosso estudo através de análise das culturas foi observado em todos os
intervalos de tempo e dose, comparando os grupos testes e os controle as alterações
celulares e seus comportamentos nas 72 horas de avaliação.
Os resultados dos registros fotomicrográficos das culturas de células
osteoblásticas, mostraram que a radiação com LBI aumentou a proliferação. A análise
das culturas mostrou que os grupos controles e irradiados apresentam comportamento
distintos em relação à proliferação. No intervalo de tempo de 72h, na densidade
energética de 6 e 8 J/cm2 houve um aumento significativo para o marcador de H2O2 e
no intervalo de tempo de 48 horas para todas as doses aumentaram significativamente
o nível de produção de LPO com uma tendência a se aproximarem aos níveis do
controle no período de tempo que se aproxima das 72h tamponando ações do H2O2, e
preservando assim as membranas celulares.
49
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Investigar os efeitos do Laser de Baixa Intensidade em culturas de células
osteoblásticas humanas cultivadas sobre placas de titânio e o nível de produção de
radicais livres identificados pelos marcadores LPO e H2O2 .
3.2 Objetivos específicos
� Analisar os efeitos do LBI em cultura de células osteoblásticas semeadas em
titânio, na formação de radicais livres no processo de osseointegração;
� Estudar a utilização do laser na implantodontia;
� Investigar marcadores de resultados bioquímicos que possam interferir no
crescimento celular.
50
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Com o objetivo de investigar o efeito do LBI em culturas osteogênicas humanas
obtidas de fragmentos de osso do processo alveolar de humanos (explantes), cedidas
pelo Instituto Butantã da Universidade de São Paulo – USP e autorizado a utilização
pelo Comitê de Ética da Universidade Cruzeiro do Sul sob o protocolo de número
CE/UCS-023/2014, as células foram descongeladas e divididas em seis grupos sendo:
grupo controle sem placas de titânio, grupo controle com placa de titânio, grupos
irradiados em 2 J/cm2, 4 J/cm2 , 6 J/cm2 e 8 J/cm2 tratadas na concentração de 2x104
células/poço em placas de 24 poços (Figura 2), diretamente sobre placas de titânio,
cedidas por Conexão Sistemas de Implantes dentários, para serem irradiadas com laser
de acordo com a (Figura 1).
Figura 1 – Esquema dos grupos controles e tratados
Fonte: (material do pesquisador)
Nos grupos irradiados as células em cultura foram colocadas em poços
juntamente com uma placa de titânio, os grupos controles foram divididos em um grupo
com pastilha de titânio e sem pastilha.
1º grupo : controle
2º grupo : controle + placas de titânio
3º grupo : 2 J/cm2 + placas de titânio
4º grupo : 4 J/cm2 + placas de titânio
5º grupo : 6 J/cm2
+ placas de titânio
6º grupo : 8 J/cm2
+ placas de titânio
Avaliados em 24, 48 e 72 horas
(830nm)
51
Figura 2 – Placas de 24 poços divididas em grupos
Fonte: (material do pesquisador)
Figura 3 - Placa de Titânio
Fonte: (material do pesquisador)
Nos grupos irradiados as placas de titânio foram cuidadosamente colocadas
nos poços sobre as células, favorecendo uma melhor acomodação das células no
fundo do poço para serem irradiadas.
4.1 Radiação laser
Para a irradiação celular foi utilizado o aparelho Laser de Diodo de AsGaA1 –
Modelo There Lase – DMC (Figura 4) operando a 830nm – 50mW de potência no
infravermelho. As culturas celulares com relação à irradiação foram divididas em seis
grupos: controles sem placas de titânio e não irradiadas grupos controles com placa de
titânio e grupos com placas e irradiados com densidade energética de 2 J/cm2, 4 J/cm2,
52
6 J/cm2 e 8 J/cm2, nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. O spot da ponteira foi
desinfectados com álcool a 70% sob fricção e estava a 1cm do líquido do meio de
cultura e um único disparo de radiação foi direcionado para cada poço contendo células
sobre a direção do titânio. O tempo de irradiação para cada grupo foi de 01, 02, 03, 04
segundos nos grupos de 2 J/cm2, 4 J/cm2, 6 J/cm2 e 8 J/cm2, respectivamente, de
densidade energética. Seguindo o protocolo de irradiação com laser de AsGaA1
(Quadro 1). Após a irradiação, os grupos foram avaliados nos seguintes parâmetros: 1)
determinação da formação peróxido de hidrogênio (H202); 2- registro fotográfico da
proliferaçãocelular; 3- peroxidação lipídica das membranas (LPO).
Figura 4 - Aparelho de laser de AsGaA1 – Modelo The re Lase – DMC (830mm –
50mW).
Fonte: (material do pesquisador)
Quadro 1 - Protocolo de irradiação com laser de AsG aAl
Parâmetros de irradiação Valores
Densidade de Energia (DE) 2,4,6 e 8 J/cm2
Potência útil do emissor 50mW
Comprimento de Onda 830nm
Área do Feixe 1cm²
Modo de Aplicação Pontual
Tempo: Para 2 J/cm2 = 01 segundo Para 4 J/cm2 = 02 segundos Para 6 J/cm2 = 03 segundos Para 8 J/cm2 = 04 segundos
53
As irradiações foram realizadas no interior da capela de fluxo laminar com a
finalidade de evitar contaminação externa. A incidência da radiação foi orientada
diretamente sobre as células sem a interferência da tampa da placa de cultura e do
meio de cultura. As canetas foram devidamente desinfetadas pela aplicação de
álcool 70% antes do uso. A fim de avaliar o efeito da radiação laser nas culturas, as
células foram plaquetadas na concentração de 2 x 1,04 células/poço sobre discos de
Ti (titânio) posicionados em placas de 24 poços. Após as culturas terem sido
irradiadas nos intervalos de tempo e doses já mencionados, foram realizados os
testes de marcadores para radicais livres. As placas foram agitadas por 5 minutos e
uma alíquota de 100 µl de cada poço foi transferida para uma placa de 96 poços. A
absorbância foi avaliada por meio de um espectrofotômetro µQuant (BioTek
Instruments. mc. Winooski. VT. EUA).
Figura - 5, 6, 7 e 8 painel do aparelho mostrando a densidade energética (2 J/cm 2, 4 J/cm 2, 6 J/cm 2 e 8 J/cm 2 ) no momento da irradiação.
Fonte: (material do pesquisador)
Fonte: (material do pesquisador)
54
Figura 9 - Células sendo irradiadas
Fonte: (material do pesquisador)
No momento da irradiação das culturas as luzes do ambiente de trabalho
foram apagadas para que nenhum tipo de luz pudesse interferir no processo de
irradiação (Figura -9).
4.2 Análise Estatística
Os dados foram submetidos à Análise de Variância (Two Way - ANOVA)
seguidos do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente
significantes para p <0,05.
4.3 Avaliação das Respostas Celulares
4.3.1 Fotomicrografia da cultura de células osteobl ásticas
Para o registro fotomicrográfico foi utilizado microscópio invertido modelo
Binocular Coleman N 120; as fotomicrografias foram realizadas em aumento de 100
x 400x registrando área com presença de placas de titânio.
Os testes foram realizados da seguinte forma:
55
4.3.2 Teste de LPO
Na realização do teste de LPO, as amostras foram descongeladas em
temperatura ambiente; os eppendorfs furados na tampa adiciou-se 50μl de amostra
com 250μl de ácido tricloroacético (TCA) a 20% e, em outro eppendorf 50μl da mesma
amostra com 250μl de ácido tiobarbitúrico (TBA) a 0,86%; e, assim, os eppendorfs
foram colocados em banho-maria (100ºC) por 20 minutos, seguido de resfriamento a
0ºC (gelo) por 20 minutos, bem como os microtubos foram centrifugados a 8000rpm por
4 minutos e o sobrenadante é lido a 535nm.
4.3.3 Teste de H 2O2
A produção de H2O2 foi determinada segundo método descrito (PICK; KEISARI,
1980; PICK; MIZEL, 1981). Foram recolhidos os sobrenadantes de cada grupo
experimental, congelados imediatamente a -20oC. A determinação do peroxido de
hidrogênio foi realizada pela adição solução de vermelho de fenol (140mM de NaCl,
10mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,0), 5,5 mM de dextrose, 0,56 mM de
vermelho de fenol e peroxidase tipo II (0,01 mg/mL), juntamente com 100μL do
sobrenadante por 1h a 37 ºC em estufa umidificada 5% de CO2. Como controle
negativo foi utilizado somente meio de cultura em solução completa de vermelho de
fenol. Após este período , a reação foi interrompida pela adição de 100 μL de NaOH
5N, e a seguir realizadas as leituras em espectrofotômetros UV/Visível de microplacas a
620 nm e os resultados expressos em nanomols de H2O2.
As amostras fotomicrográficas foram realizadas em microscópio óptico num
aumento de 100, 200 e 400 vezes, durante os intervalos de tempo de irradiação e
avaliadas quanto ao crescimento celular.
4.4 Análise Estatística
Os dados foram submetidos à Análise de Variância (Two Way - ANOVA),
seguida do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente
significantes para p< 0,05.
56
5 RESULTADOS
Fotomicrografias mostraram um aumento no número de osteoblastos irradiados
em diferentes intervalos de tempo (24h, 48h e 72h) e doses (2, 4, 6 e 8 J/cm2) com
relação ao grupo controle não irradiado nos tempos de 24h, 48h e 72h. Os registros
fotomicrográficos evidenciaram que nos grupos irradiados com LBI e nos grupos
controle ocorreu formação de grupamentos celulares próximos à placa de titânio.
As Figuras 7 e 8 mostram o grupo controle (osteoblastos não irradiados) com
crescimento em 24 horas. As células apresentam-se espalhadas pela placa e com
formação de pequenos grupos próximos ao titânio.
Figuras 7- 8. Fotomicrografias do grupo controle (o steoblastos não irradiados)
em cultura de células com crescimento em 24 horas ( 100x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador.
As Figuras 9, 10, 11 e 12 mostram o grupo irradiado na dose de 2 J/cm2 com
crescimento em 24 horas. As células apresentam-se espalhadas pela placa e
agrupadas em arranjo de neoformações ósseas evidenciadas na Figura 9 (*) e início de
formação de tapete celular na Figura 10. Nas Figuras 11 e 12 os osteoblastos
apresentam-se espalhados e com algumas células próximas ao titânio.
7 8
100x 400x
57
Figuras 9, 10, 11 e 12. Fotomicrografias do grupo irradiado na dose de 2 J/cm 2
em cultura de células com crescimento em 24 horas ( 100x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
* Células agrupadas em arranjo de neoformação óssea.
As Figuras 13 e 14 mostram o grupo irradiado na dose de 4 J/cm2 com
crescimento em 24 horas. As células apresentam-se espalhadas na placa, com
formação de tapete celular e ausência de grupamentos de células próximas ao titânio.
9
*
10
*
* 100x 400x
100x 400x
11 12
58
Figuras 13 - 14. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 4 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 24 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
As Figuras 15 e 16 mostram o grupo irradiado na dose de 6 J/cm2 com
crescimento em 24 horas. Na Figura 9 observa-se a formação de um tapete celular e
na Figura 10 a formação de grupamentos celulares próximos ao titânio.
Figuras 15 - 16. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 6 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 24 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
13 14
100x 400x
15 16
100x 400x
59
As Figuras 17 e 18 mostram o grupo irradiado na dose de 8 J/cm2 com
crescimento em 24 horas. Observa-se a formação de um tapete celular por toda a
extensão da placa.
Figuras 17- 18. Fotomicrografias do grupo irradiado na dose de 8 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 24 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
As Figuras 19 e 20 mostram o grupo controle (osteoblastos não irradiados) com
crescimento em 48 horas. As células formam um tapete por toda a extensão da placa e
com formação de grupos próximos ao titânio.
Figuras 19 - 20. Fotomicrografias do grupo controle (osteoblastos não
irradiados) em cultura de células com crescimento e m 48 horas (100x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
17 18
100x 400x
100x 400x
19 20
60
As Figuras 21 e 22 mostram o grupo irradiado na dose de 2 J/cm2 com
crescimento em 48 horas. As células formam um tapete por toda a extensão da placa
evidenciando uma maior quantidade de células e formação de grupos com grande
quantidade de células próximos ao titânio.
Figuras 21 - 22. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 2 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 48 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
As Figuras 23 e 24 mostram formação de tapete celular o grupo irradiado na
dose de 4 J/cm2 com crescimento em 48 horas. Obserfva-se grande número de
células por todaa extensão daplaca e próxima ao titânio e grumos próximo ao titânio.
Figuras 23 - 24. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 4 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 48 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
100x 400x
21 22
23 24
61
As figuras 25 e 26 mostram o grupo irradiado na dose de 6 J/cm2 com
crescimento em 48 horas. Há formação de tapete celular com grande número de
células e grande quantidade de células próximo ao titânio.
Figuras 25 - 26. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 6 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 48 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
As Figuras 27 e 28 mostram o grupo irradiado na dose de 8 J/cm2 com
crescimento em 48 horas. Há formação de tapete celular com grande quantidade de
células espalhadas pela placa e próximo ao titânio.
Figuras 27 - 28. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 8 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 48 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
25 26
27 28
62
As Figuras 29 e 30 mostram o grupo controle (osteoblastos não irradiados) com
crescimento em 72 horas. As células formam um tapete celular com grande quantidade
de células espalhadas sobre a placa e adesão de grupamentos com grande quantidade
de células próximo ao titânio.
Figuras 29 - 30. Fotomicrografias do grupo controle (osteoblastos não
irradiados) em cultura de células com crescimento e m 72 horas (100x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
As Figuras 31 e 32 mostram o grupo irradiado na dose de 2 J/cm2 com
crescimento em 72 horas. As células apresentam-se com formação de tapete
espalhadas em pequenos grupamentos próximos ao titânio, porém em menor
quanidade em relação ao grupocontrole não irradiado.
Figuras 31 - 32. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 2 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 72 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
29 30
31 32
63
As Figuras 33 e 34 mostram o grupo irradiado na dose de 4 J/cm2 com
crescimento em 72. horas. As células apresentam-se com formação de tapete e
grande quantidade de células formando grumos por extensão da placa e próximo ao
titânio.
Figuras 33 - 34. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 4 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 72 horas (100 x e 400x ).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
As Figuras 35 e 36 mostram o grupo irradiado na dose de 6 J/cm2 com
crescimento em 72 horas. As células apresentam-se com formação de tapete e grande
quantidade de células formando grumos por extensão da placa e próximo ao titânio.
Figuras 35 - 36. Fotomicrografias do grupo irradiad o na dose de 6 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 72 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
33 34
35 36
64
As Figuras 37 e 38 mostram o grupo irradiado na dose de 8 J/cm2 com
crescimento em 72. horas. As células apresentam-se com formação de tapete
espalhadas sobre a placa e próximo ao titânio.
Figuras 37- 38. Fotomicrografias do grupo irradiado na dose de 8 J/cm 2 em
cultura de células com crescimento em 72 horas (100 x e 400x).
Fonte: Material coletado pelo pesquisador
5.1 Resultados Estatísticos
5.1.1 Comparação dos níveis de LPO entre os Grupos de acordo com Testes
de Turkey e ANOVA
Níveis de LPO:
Intervalo de tempo Estatística
Grupos Controle Cont.
Pastilha 2J 4J 6J 8J ANOVA
p-valor 24h Média 1,973 2,191 3,037 5,048 5,022 4,361 0,2504
Desvio (1,263) (2,407) (0,9511) (4,207) (3,185) (2,409) 48h Média 26,60 26,47 30,52 27,56 26,13 31,65 0,4416
Desvio (2,274) (3,798) (3,144) (6,192) (4,393) (11,77) 72h Média 3,075 4,375 19,81 22,42 12,00 11,96 <0,0001
Desvio (2,149) (2,511) (8,090) (10,19) (7,155) (1,884)
Co vs. Co + Past -1,300 -9,940 to 7,340 No Co vs. 2 J -16,74 -26,07 to -7,405 Yes Co vs. 4 J -19,35 -29,20 to -9,498 Yes Co vs. 6 J -8,925 -18,78 to 0,9259 No Co vs. 8 J -8,885 -18,22 to 0,4471 No Co + Past vs. 2 J -15,44 -24,77 to -6,105 Yes Co + Past vs. 4 J -18,05 -27,90 to -8,198 Yes
37 38
65
Co + Past vs. 6 J -7,625 -17,48 to 2,226 No Co + Past vs. 8 J -7,585 -16,92 to 1,747 No 2 J vs. 4 J -2,612 -13,08 to 7,851 No 2 J vs. 6 J 7,812 -2,652 to 18,27 No 2 J vs. 8 J 7,852 -2,125 to 17,83 No 4 J vs. 6 J 10,42 -0,5046 to 21,35 No 4 J vs. 8 J 10,46 0,0006824 to 20,93 Yes 6 J vs. 8 J 0,04000 -10,42 to 10,50 No
As dosagens de 2J e 4J apresentaram nível de LPO significativamente
diferente em relação às demais de acordo com teste Tukey.
Para o intervalo de 72h há uma diferença significativa em relação ao nível de
LPO entre os grupos analisados. No entanto, nos intervalos de 24h e 48h, não
houve uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos.
Controle: p-valor < 0,0001
24h vs. 48h -24,63 -28,32 to -
20,93 Yes 24h vs. 72h -1,102 -4,800 to 2,596 No 48h vs. 72h 23,53 20,79 to 26,26 Yes
Controle PaStilha: p-valor < 0,0001
24h vs. 48h -24,28 -28,29 to -
20,27 Yes 24h vs. 72h -2,184 -6,063 to 1,696 No 48h vs. 72h 22,10 18,22 to 25,98 Yes
2J: p-valor < 0,0001
24h vs. 48h -27,48 -35,04 to -19,92 Yes 24h vs. 72h -16,78 -24,34 to -9,215 Yes 48h vs. 72h 10,71 3,145 to 18,27 Yes
66
4J: p-valor = 0,001
24h vs. 48h -22,51 -34,83 to -10,20 Yes 24h vs. 72h -17,38 -29,69 to -5,061 Yes 48h vs. 72h 5,136 -7,179 to 17,45 No
6J: p-valor < 0,0001
24h vs. 48h -21,11 -28,69 to -13,53 Yes 24h vs. 72h -6,978 -14,93 to 0,9688 No 48h vs. 72h 14,13 6,186 to 22,08 Yes
8J: p-valor < 0,0001
24h vs. 48h -27,29 -37,09 to -
17,49 Yes 24h vs. 72h -7,599 -17,40 to 2,201 No 48h vs. 72h 19,69 9,520 to 29,86 Yes
Há uma diferença estatisticamente significativa em relação ao nível de LPO
no diferentes intervalos de tempos para todos os grupos analisados. Ou seja, para
todos os grupos verificou-se que o intervalo de tempo interfere significativamente no
nível de LPO.
24h: Não há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de
LPO nas diferentes doses, dado que o p-valor obtido foi de 0,2504 (p>0,05).
48h: Não há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de
LPO nas diferentes doses, dado que o p-valor obtido foi de 0,4416 (p>0,05).
72h: Há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de LPO
nas diferentes doses, dado que o p-valor obtido foi <0,0001.
5.1.2 Comparação dos Níveis de LPO entre ingtervalo s de tempo de 24, 48 e 72hs
67
Gráfico 1 – Níveis de LPO em relação aos diferentes níveis de dosimetria no
intervalo de tempo de 24 horas
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
No intervalo de tempo de irradiação de 24 horas o gráfico 1 mostra uma
comparação entre os níveis médios de LPO (nmoles-MDA) dos grupos controles e
dos grupos com diferentes níveis de dosimetria.
No intervalo de tempo de irradiação de 48 horas o gráfico 2 mostra uma
comparação entre os níveis de LPO (nmoles/MDA) dos grupos controles e dos
grupos com diferentes níveis de dosimetria.
Gráfico 2 – Irradiação de 48 horas
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
Intervalo de tempo de 48h
Intervalo de tempo de 24h
68
No intervalo de tempo de irradiação de 72 horas o gráfico 3 mostra uma
comparação entre os níveis de LPO (nmoles/MDA) dos grupos controles e dos
grupos com diferentes níveis de dosimetria.
Gráfico 3 – Irradiação de 72 horas.
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
Gráfico 4 - Acontecimentos celulares do LPO onde se observa um aumento
nos níveis no intervalo de tempo de 48 horas, com u ma tendência diminuir a
níveis próximos do controle, conforme abaixo.
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
Intervalo de tempo de 72h
69
5.1.3 Comparação dos níveis de H 2O2 entre os grupos de acordo com testes
estatísticos de Turkey e ANOVA
- Níveis de H2O2:
Intervalo de tempo
Estatística Grupos Controle Cont.
Pastilha 2J 4J 6J 8J ANOVA
p-valor 24h Média 3,935 3,811 8,005 7,937 9,256 9,535 0,0004
Desvio (0,336) (0,383) (0,813) (0,682) (1,300) (1,628) 48h Média 4,932 4,800 13,63 19,80 22,55 30,72 <0,0001
Desvio (0,271) (0,878) (1,816) (0,868) (2,175) (4,554) 72h Média 5,525 5,600 33,11 33,58 51,69 81,23 <0,0001
Desvio (0,884) (0,670) (4,263) (12,83) (2,540) (8,929)
Para os intervalos de 24h, 48h e 72h há diferença significativa em relação ao
nível de H2O2 entre os grupos analisados.
24h: Há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de H2O2 nas
diferentes doses, dado que o p-valor obtido foi de 0,0004 (p<0,05).
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff Co vs Co + pastilha 0,1235 No -3.554 to 3.801 Co vs 2 Joules -4,070 Yes -7.427 to -0.7133 Co vs 4 Joules -4,002 Yes -7.359 to -0.6453 Co vs 6 Joules -5,321 Yes -8.678 to -1.964 Co vs 8 Joules -5,601 Yes -8.957 to -2.244 Co + pastilha vs 2 Joules -4,194 Yes -7.551 to -0.8368 Co + pastilha vs 4 Joules -4,126 Yes -7.483 to -0.7688 Co + pastilha vs 6 Joules -5,445 Yes -8.802 to -2.088 Co + pastilha vs 8 Joules -5,724 Yes -9.081 to -2.367 2 Joules vs 4 Joules 0,06800 No -2.934 to 3.070 2 Joules vs 6 Joules -1,251 No -4.253 to 1.751 2 Joules vs 8 Joules -1,530 No -4.533 to 1.472 4 Joules vs 6 Joules -1,319 No -4.321 to 1.683 4 Joules vs 8 Joules -1,598 No -4.601 to 1.404 6 Joules vs 8 Joules -0,2793 No -3.282 to 2.723
As dosagens de 2J, 4J, 6J e 8J apresentaram nível de H2H2 significativamente
diferente em relação aos grupos controle de acordo com teste Tukey. No entanto,
não diferença há diferença significativa entre os grupos de 2J, 4J, 6J e 8J.
48h: Há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de H2O2
nas diferentes doses, dado que o p-valor obtido foi <0,0001.
70
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff Co vs Co + pastilha 0,1315 No -8.368 to 8.631 Co vs 2 Joules -8,695 Yes -16.45 to -0.9361 Co vs 4 Joules -14,87 Yes -22.63 to -7.113 Co vs 6 Joules -17,62 Yes -25.37 to -9.856 Co vs 8 Joules -25,79 Yes -33.55 to -18.03 Co + pastilha vs 2 Joules -8,827 Yes -16.59 to -1.068 Co + pastilha vs 4 Joules -15,00 Yes -22.76 to -7.244 Co + pastilha vs 6 Joules -17,75 Yes -25.51 to -9.988 Co + pastilha vs 8 Joules -25,92 Yes -33.68 to -18.16 2 Joules vs 4 Joules -6,177 No -13.12 to 0.7632 2 Joules vs 6 Joules -8,920 Yes -15.86 to -1.980 2 Joules vs 8 Joules -17,09 Yes -24.03 to -10.15 4 Joules vs 6 Joules -2,743 No -9.683 to 4.197 4 Joules vs 8 Joules -10,92 Yes -17.86 to -3.976 6 Joules vs 8 Joules -8,172 Yes -15.11 to -1.232 72h: Há uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de H2O2 nas
diferentes doses, dado que o p-valor obtido foi <0,0001.
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff Co vs Co + pastilha -0,07500 No -25.58 to 25.43 Co vs 2 Joules -27,59 Yes -50.87 to -4.299 Co vs 4 Joules -28,05 Yes -51.34 to -4.766 Co vs 6 Joules -46,17 Yes -69.45 to -22.88 Co vs 8 Joules -75,71 Yes -98.99 to -52.42 Co + pastilha vs 2 Joules -27,51 Yes -50.80 to -4.224 Co + pastilha vs 4 Joules -27,98 Yes -51.26 to -4.691 Co + pastilha vs 6 Joules -46,09 Yes -69.38 to -22.81 Co + pastilha vs 8 Joules -75,63 Yes -98.92 to -52.35 2 Joules vs 4 Joules -0,4667 No -21.29 to 20.36 2 Joules vs 6 Joules -18,58 No -39.41 to 2.244 2 Joules vs 8 Joules -48,12 Yes -68.95 to -27.30 4 Joules vs 6 Joules -18,12 No -38.94 to 2.711 4 Joules vs 8 Joules -47,66 Yes -68.48 to -26.83 6 Joules vs 8 Joules -29,54 Yes -50.37 to -8.713 Comparação dos níveisde H2O2 entre os intervalos de tempo:
Controle: p-valor = 0,1449
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff 24h vs 48h -0,9970 No -3.391 to 1.397
24h vs 72h -1,591 No -3.984 to
0.8030 48h vs 72h -0,5935 No -2.987 to 1.800 Controle Pastilha: p-valor = 0,1632 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff 24h vs 48h -0,9890 No -3.810 to 1.832 24h vs 72h -1,789 No -4.610 to 1.032 48h vs 72h -0,8000 No -3.621 to 2.021
71
2J: p-valor < 0,0001 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff 24h vs 48h -5,622 No -12.43 to 1.183
24h vs 72h -25,11 Yes -31.91 to -
18.30
48h vs 72h -19,48 Yes -26.29 to -
12.68 4J: p-valor = 0,0159 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff 24h vs 48h -11,87 No -30.50 to 6.764
24h vs 72h -25,64 Yes -44.27 to -
7.009 48h vs 72h -13,77 No -32.40 to 4.857 6J: p-valor < 0,0001 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. Significant? P < 0.05? 95% CI of diff
24h vs 48h -13,29 Yes -18.48 to -
8.102
24h vs 72h -42,44 Yes -47.63 to -
37.25
48h vs 72h -29,15 Yes -34.34 to -
23.96 8J: p-valor < 0,0001 Tukey's Multiple Comparison Test 24h vs 48h 24h vs 72h 48h vs 72h
As dosagens de 2J, 4J, 6J e 8J apresentaram nível de H2O2
significativamente diferente em relação aos grupos controle de acordo com teste
Tukey. No entanto, não há diferença significativa entre os grupos de 2J, 4J, 6J e 8J.
5.1.4 Comparação dos níveisde H 2O2 entre os intervalos de tempo:
Comparação entre os níveis médios de H2O2 (nmoles/mL) dos grupos de
controle e dos grupos com diferentes níveis de dosimetria no intervalo de tempo de
irradiação de 24 horas.
72
Gráfico 5 - Intervalo de tempo de 24h
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
Comparação entre os níveis médios de H2O2 (nmoles/mL) dos grupos de
controle e dos grupos com diferentes níveis de dosimetria no intervalo de tempo de
irradiação de 48 horas.
Gráfico 6 - Intervalo de tempo de 48h
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
Intervalo de tempo de 24h
Intervalo de tempo de 48h
73
Gráfico 7 - Intervalo de tempo de 72h
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
Comparação entre os níveis médios de H2O2 (nmoles/mL) dos grupos de
controle e dos grupos com diferentes níveis de dosimetria no intervalo de tempo de
irradiação de 72 horas.
Gráfico 8 - Acontecimentos celulares do H 2O2 onde se observa um aumento
progressivo nos seus níveis, atingindo um alto perc entual no intervalo de
tempo de 72 de irradiação das culturas.
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
Intervalo de tempo de 72h
74
Gráfico 9 – Comparação gráfica entre os níveis de L PO e H2O2 nos termos de
24h, 48h e 72h.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
24h 48h 72h
Nív
el m
éd
io d
e H
2O
2 n
mo
les/
mL
Intervalo de tempo
H2O2 Co
H2O2 C. Past
H2O2 2J
H2O2 4J
H2O2 6J
H2O2 8J
LPO Co
LPO C. Past
LPO 2J
LPO 4J
LPO 6J
LPO 8J
Fonte: Dados coletados pelo pesquisador
A análise das culturas mostrou que o controle e irradiadas apresentam
comportamento distintos. No intervalo de tempo de 72h, na densidade energética de 8
J/cm2 houve um aumento significativo para o marcador de H2O2 e no intervalo de
tempo de 48 horas para todas as doses aumentaram significativamente o nível de
produção de LPO que tiveram uma tendência a baixarem aos níveis do controle no
período de 72h, conforme gráfico 9 da comparação entre os níveis médios de LPO
(nmoles-MDA) e H2O2 (nmoles/mL) dos grupos controles e dos grupos com
diferentes níveis de dosimetria ao longo dos tempos de irradiação de 24, 48 e 72
horas.
75
6 DISCUSSÃO
No presente trabalho foi avaliado o efeito da radiação laser de diodo de
AsGaAl em culturas osteogênicas derivadas de osso alveolar humano cultivadas
sobre placas de Titânio. A aplicação do LBI foi escolhida por tratar-se de um modelo
in vitro que avalia alterações celulares com indução de tecido ósseo.
A biomodulação na proliferação de células quando investigou o efeito do LBI
sobre a proliferação, diferenciação e a produção de fator de crescimento
transformante em osteoblastos humanos (KHADRA et al., 2004b). Células derivadas
do osso mandibular humano foram expostas ao laser de diodo AsGaAl em dosagens
de 1,5 ou 3 J/cm2 semeadas em discos de titânio, cultivadas por 24 horas e em
seguida, expostas a irradiação com laser durante três dias consecutivos. Confirma-
se atividade da fosfatase alcalina específica e a capacidade das células para
sintetizar osteocalcina, como sinalizadores da formação de matriz óssea.
Nosso estudo visa contribuir na investigação do comportamento de
osteoblastos cultivados sobre superfície de Ti e as alterações que ocorrem no
ambiente redox. As alterações bioquímicas ligadas ao stresse oxidativo podem estar
associadas ao crescimento e diferenciação celular (SCHAFER; BUETTNER, 2001),
quando estes osteoblastos em cultura são irradiados e estimulam a produção de
radicais livres.
Por outro lado, os radicais livres, quando em grandes quantidades, podem
levar as células a apoptose.
A densidade energética de 2, 4, 6 e 8 J/cm2 utilizando o laser de AsGaAl foi
beseada em estudos preliminares em culturas de células osteogênicas onde foram
utilizadas diferentes doses no modelo in vitro visto na literatura (DORTBUDAK;
HAAS; MAILATH-POKORNY, 2000; KHADRA et al., 2004b; FUKUHARA et al.,
2006). O período de 3 dias de exposição ao laser foi escolhido por representar
período de atividade proliferativa mais intensa das células (DE OLIVEIRA et al.,
2003; SCHWARTZ et al., 2007; ROSA et al., 2008; XAVIER et al., 2003).
O ambiente redox de uma célula passa por mudanças ao longo de seu ciclo
76
de vida, e exemplifica através do par redox GSSG/2GSH, estas alterações. Durante
a proliferação celular o potencial de redução para o par redox GSSG/2GSH tem o
valor mais negativo, agindo como “gatilho” para proliferação celular (SCHAFER;
BUETTNER, 2001). Quando o potencial de redução de GSH vem a ser mais
positivo, o “gatilho” pode estar ligado, enquanto proliferação diminui. O potencial
mais positivo de redução (GSH) vem a ser o maior “gatilho” para diferenciação.
Enquanto células se submetem à diferenciação, o “gatilho” de proliferação está
desligado. Neste estágio, as células que não foram totalmente diferenciadas devem
voltar ao estágio de proliferação com um sinal apropriado e associado ao ambiente
redox. Se espera, que estas células parcialmente diferenciadas mudem para um
potencial de redução mais negativo. Se este potencial de redução GSH vierem a ser
muito positivo, o sinal de morte é ativado e a apoptose é iniciada. Este mecanismo
serve para a remoção ordenada de células que perderam sua capacidade para
controlar o seu ambiente redox, e que não estão funcionando normalmente. São vias
de sinalização identificadoras de células desnecessárias. Um valor muito alto de
potencial de redução (GSH) resulta em severo dano de stress oxidativo levando a
célula à necrose e morte (KHADRA et al., 2005).
Os resultados do presente estudo também mostraram que
independentemente do tratamento ao qual foram submetidas, as células derivadas
do osso alveolar proliferaram e desenvolveram, uma vez que apresentaram
significativa formação de H2O2 e LPO. No entanto, a radiação laser produziu
diferenças significativas no comportamento das culturas.
Verificou-se que para todos os grupos o intervalo de tempo interfere
significativamente no nível de LPO e que também há uma diferença estatisticamente
significativa em relação ao nível de H2O2 nos diferentes intervalos de tempo para
todos os grupos analisados, exceto para os controle e controle placa de titânio não
irradiados, e os grupos 6 e 8 J/cm2 que em todos os intervalos de tempo
apresentaram significância. Nestas culturas, numa análise fotomicrográfica foi
observado que em algumas áreas, as células desapareceram após a irradiação
podendo sugerir a ocorrência de morte celular nesta região, mas que posteriormente
estas áreas foram repovoadas.
Houve formação de grupamentos celulares próximos à placa de titânio, devido
77
a possível produção de osteóide pelos osteoblastos sugerindo efeitos mitogênicos.
Trabalhos futuros através da histomofometria e microscopia eletrônica poderão
afirmar estes efeitos.
Alguns autores encontraram resultados que afirmam que o stress oxidativo
gerado pelo desequilíbrio do estado redox afeta a viabilidade celular e diferenciação
de osteoblastos, num processo que promove a supressão da diferenciação dos
osteoblastos que se caracteriza pela redução na atividade de Fosfatase Alcalina
(ALP) (ZHANG et al., 2013). No nosso estudo a avaliação da proliferação celular
entre as primeiras 24 horas e o último dia de irradiação revelou que enquanto
culturas controle apresentaram apenas a manutenção da população celular, culturas
irradiadas se encontravam em atividade proliferativa. Exemplo pôde ser visto quando
avaliamos as culturas irradiadas no intervalo de tempo de 48 horas na investigação
em relação ao LPO em que todas as culturas de todas as doses tiveram seus níveis
aumentados significativamente e partir deste intervalo este índice caiu praticamente
aos índices compatíveis com culturas não irradiadas à medida que se aproximou das
72 horas de irradiação. Este fato é importante quando avaliamos e comparamos
resultados relacionados aos níveis de H2O2 em que todos os intervalos de tempo e
dose tiveram aumento significativo para as culturas irradiadas, com atenção especial
para as do intervalo de tempo de 72 horas de irradiação nas doses de 6 e 8 J/cm2
,onde foi observado um aumento significante atingindo o mais alto nível estatístico
do marcador H202 comparado aos intervalos de tempo de 24 e 48 horas. O que
comprova que mesmo altos níveis de produção de H2O2 em células irradiadas, as
membranas celulares foram preservadas pelos níveis de LPO, e que no intervalo de
tempo de 72 horas tamponando reações do H2O2 e garantindo a viabilidade e
sobrevivência celular com a manutenção de DNA e organelas.
Através de resultados obtidos em nossa pesquisa, podemos afirmar que o
laser estimula a produção de radicais livres quando irradia osteoblastos cultivados
sobre Ti. Isto sugere possíveis benefícios no processo de osseointegração.
Mesmo com os efeitos benéficos apresentados neste trabalho e na revista de
literatura, não se pode descartar que a radiação laser pode ter afetado
negativamente algumas áreas das culturas, apontando a necessidade de mais
estudos avaliando estes resultados e seus efeitos, antes de se estabelecer sua
78
verdadeira contribuição à Implantadontia.
79
7 CONCLUSÃO
- A Irradiação Laser causou produção de H2O2 em todos os tempos estudados;
- Quanto maior a Energia, maior a produção de H2O2;
- A Irradiação causou aumento significativo do Peróxido de Hidrogênio em 72h.
- Quanto maior a Energia, menor a Peroxidação Lipídica em 72h;
- Laser diminui LPO e pode aumentar proliferação celular.
80
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APÊNDICE
Aprovação do Comitê de Ética
