José Filipe Gonçalves Maciel usados para o cálculo de perfis fermentativos por PCA e por fim para...

outubro de 2013

Universidade do MinhoEscola de Engenharia

José Filipe Gonçalves Maciel

Monitorização do processo cervejeiro por espetroscopia no UV-VIS-SWNIR

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IR

Dissertação de Mestrado Mestrado Integrado em Engenharia Biológica Ramo de Tecnologia Química e Alimentar

Trabalho realizado sob a orientação do Professor Doutor António Augusto Martins de Oliveira Soares Vicentee do Doutor Tiago Luís Monteiro Brandão

outubro de 2013

Universidade do MinhoEscola de Engenharia

José Filipe Gonçalves Maciel


ii

DECLARAÇÃO

Nome: José Filipe Gonçalves Maciel

Endereço eletrónico: [email protected]

Número do Bilhete de Identidade: 13737702

Título dissertação: Monitorização do processo cervejeiro por espetroscopia no UV-

VIS-SWNIR

Orientador(es):

Professor Doutor António Augusto Martins de Oliveira Soares Vicente

Doutor Tiago Luís Monteiro Brandão

Ano de conclusão: 2013

Designação do Mestrado: Mestrado Integrado em Engenharia Biológica – Tecnologia

Química e Alimentar

DE ACORDO COM A LEGISLAÇÃO EM VIGOR, NÃO É PERMITIDA A

REPRODUÇÃO DE QUALQUER PARTE DESTA DISSERTAÇÃO.

Universidade do Minho, ___/___/______

Assinatura: ________________________________________________

mailto:[email protected]

iii

Declaração RepositóriUM: Dissertação de Mestrado

Nome: José Filipe Gonçalves Maciel

N.º do Cartão de Cidadão/BI: 13737702 Telefone/Telemóvel: 253882027/934740166

Correio eletrónico: [email protected]

Curso: Mestrado Integrado em Engenharia Biológica Ano de conclusão da dissertação:2013

Área de Especialização: Tecnologia Química e Alimentar

Escola de Engenharia, Departamento/Centro: Engenharia Biológica

TÍTULO DA DISSERTAÇÃO

Título em PT: Monitorização do processo cervejeiro por espetroscopia no UV-VIS-SWNIR

Título em EN: Monitoring beer production by UV-VIS-SWNIR spectroscopy

Orientador: António Augusto Martins de Oliveira Soares Vicente e Tiago Luís Monteiro Brandão

Número de Unidades ECTS da Dissertação: 30 Classificação em valores (0 a 20): 19

Classificação ECTS com base no percentil (A a F):_______________________________________

Declaro sob compromisso de honra que a dissertação agora entregue corresponde à que

foi aprovada pelo júri constituído pela Universidade do Minho, UM.

Declaro que concedo à Universidade do Minho e aos seus agentes uma licença não-

exclusiva para arquivar e tornar acessível, nomeadamente através do seu repositório

institucional, nas condições abaixo indicadas, a minha dissertação, em suporte digital.

Concordo que a minha dissertação seja colocada no repositório da Universidade do

Minho com o seguinte estatuto:

1. Disponibilização imediata do trabalho para acesso universal;

2. Disponibilização do trabalho para acesso exclusivo na UM, durante o período de

1 ano, 2 anos ou 3 anos, sendo que após o tempo assinalado autorizo o acesso

universal.

3. Disponibilização do trabalho de acordo com o Despacho RT-98/2010 c) (embargo 3

anos)

Braga, ___ de _________ de 2013

Assinatura:

_____________________________________________________________________________________

v

Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos que me ajudaram de diversas formas para a conclusão

deste projeto, em particular:

Ao meu orientador da Universidade do Minho, Professor António Vicente, pelos

ensinamentos, disponibilidade, motivação, paciência e apoio prestado durante todas as

fases da atividade.

Ao meu orientador, Doutor Tiago Brandão, pelo apoio e conhecimento sobre processo

cervejeiro, assim como a ajuda prestada no acesso e uso das instalações da Unicer

bebidas S.A..

Ao Doutor Rui Martins por me permitir trabalhar nesta tecnologia.

Ao João Silva pelo apoio na vertente técnica e avaliação de resultados.

Aos funcionários do laboratório central e da adega da Unicer bebidas S.A. pela

paciência e ajuda diária na análise e recolha de amostras, respetivamente.

À minha família, namorada e amigos pelo amor, alegria e atenção.

vii

Resumo


A cerveja apresenta-se como um dos produtos de origem biotecnológica mais antiga.

Várias são as etapas que constituem este processo que, mediante pequenas variações,

possibilita a obtenção de produtos diferenciados ou de produtos com baixa qualidade

para o cliente. Face à instabilidade do processo e à necessidade crescente de produções

homogéneas com otimização de tempo e custos, torna-se importante a construção de

novas tecnologias de acompanhamento da produção.

O objetivo deste trabalho foi aplicar e verificar se a tecnologia de fibras óticas, baseada

na espetroscopia UV-VIS-SWNIR, apresenta resultados comparáveis aos métodos de

análise clássicos durante a monitorização da fermentação cervejeira. Dois tipos de

cerveja foram acompanhados quanto aos parâmetros de extrato aparente, graus Plato,

atenuação aparente, álcool, pH, cor e diacetilo. A análise foi realizada por recurso a

fibra ótica, sendo os espetros resultantes tratados para diminuição dos efeitos

dispersivos, usados para o cálculo de perfis fermentativos por PCA e por fim para

construção de calibrações de todos os parâmetros por intermédio do PLS.

A análise por PCA permitiu verificar a distribuição de ambas as cervejas ao longo da

fermentação. Pelo PLS os modelos de calibração que apresentaram melhores valores

foram obtidos para a Super Bock, com valores de R2 entre 0.58 e 0.64, para os

parâmetros de extrato aparente, atenuação, pH e álcool. Apesar de valores de correlação

um pouco afastados dos ideais, verificou-se que a tecnologia mediante melhorias de

processamento e análise apresenta boas perspetivas de aplicação.

Em paralelo com este trabalho estudou-se a aplicação das cartas de controlo de Shewart

ao processo fermentativo, verificando-se que este procedimento não é o ideal em

processos com estas características. Analisou-se também a evolução dos parâmetros

cervejeiros usados nas calibrações, confirmando-se que aqueles que apresentam maior

variabilidade ao longo da fermentação estão associados ao extrato, álcool, pH e

diacetilo.

Palavras-chave: Processo cervejeiro, espetroscopia, UV-VIS-SWNIR, calibrações

multivariadas, cartas de controlo.

ix

Abstract

Monitoring beer production by UV-VIS-SWNIR spectroscopy

The beer presents as one of the oldest products with biotechnological origin. There are

several steps that constitute the brewing process, in which by small variations produce

different products or products with low quality for the customer. Due to the instabilities

of the process and the increasing need of homogenous productions, with time and cost

optimization, the construction of new technologies for monitoring the production

becomes important.

The aim of this work was to apply and to check if spectroscopy UV-VIS-SWNIR with

fiber-optic technology presents comparable results to classic methods of analysis during

the beer production. Two kinds of beer were followed regarding parameters as apparent

extract, Plato degrees, attenuated degree of fermentation, alcohol, pH, color and

diacetyl. The analysis was realized across fiber-optic, and the resulting spectra treated to

reduce the dispersive effects, used to the calculation of PCA fermentative profiles and to

the construction of the calibration models by PLS to all parameters.

The PCA analysis allowed to verify the distribution of both beers along the

fermentation. The PLS calibration models that presented the best values were obtained

to Super Bock with R2 values between 0.58 and 0.64 for parameters of apparent extract,

attenuated degree of fermentation, pH and alcohol. Although the correlation values

being far from the ideal ones, was checked that UV-VIS-SWNIR with some treatments

and data analysis improvements have good perspectives of application.

Beyond this work, was also studied the application of Shewart control charts to the

fermentation. It was concluded that this method is not appropriated to this kind of

process. The evolution of parameters fermentation was also studied, being the most

variables associated to extract, alcohol, pH and diacetyl.

Keywords: beer production, spectroscopy, UV-VIS-SWNIR, multivariate calibrations,

Shewart control charts.

xi

Índice

AGRADECIMENTOS ........................................................................................ V

RESUMO ........................................................................................................ VII

ABSTRACT ..................................................................................................... IX

ÍNDICE ............................................................................................................. XI

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................... XIII

ÍNDICE DE TABELAS .................................................................................... XV

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................ XVI

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1

1.1 Espetroscopia Molecular ........................................................................................................... 1

1.1.1 Tipos de espetroscopia ............................................................................................................. 2

1.1.2 Critérios de escolha da região UV-VIS-SWNIR....................................................................... 9

1.1.3 Aplicações da espetroscopia UV-VIS-SWNIR ....................................................................... 10

1.2 Processo cervejeiro .................................................................................................................. 13

1.2.1 Evolução do processo cervejeiro e da cerveja......................................................................... 13

1.2.2 Matérias-primas ..................................................................................................................... 14

1.2.3 Etapas do processo cervejeiro ................................................................................................ 15

1.2.4 Importância da monitorização da fermentação ....................................................................... 19

1.2.5 Aplicação da tecnologia de UV-VIS-SWNIR ao processo cervejeiro ..................................... 21

1.2.6 Vantagens da espetroscopia UV-VIS-SWNIR........................................................................ 22

2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 25

2.1 Fermentação ............................................................................................................................. 25

2.2 Análises fisico-químicas ........................................................................................................... 25

2.3 Aquisição de espetros ............................................................................................................... 26

2.4 Análise multivariada ................................................................................................................ 28

2.4.1 Pré-tratamento ....................................................................................................................... 28

2.4.2 Análise de componentes principais (PCA) ............................................................................. 29

2.4.3 Regressão por mínimos quadrados parciais (PLSR) ............................................................... 29

2.4.4 Validação cruzada ................................................................................................................. 30

2.5 Cartas de controlo .................................................................................................................... 30

xii

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 33

3.1 Monitorização do processo cervejeiro ..................................................................................... 33

3.1.1 Evolução de extrato ............................................................................................................... 33

3.1.2 Evolução do álcool ................................................................................................................ 36

3.1.3 Evolução de pH ..................................................................................................................... 38

3.1.4 Evolução da cor ..................................................................................................................... 39

3.1.5 Evolução do diacetilo ............................................................................................................ 40

3.2 Cartas de controlo .................................................................................................................... 42

3.3 Calibrações multivariadas ....................................................................................................... 43

4 CONCLUSÃO .......................................................................................... 51

5 BIBLIOGRAFIA ........................................................................................ 53

ANEXOS ......................................................................................................... 59

Parâmetros das cartas de controlo ....................................................................................................... 59

Cartas de controlo ................................................................................................................................ 60

Fase de aceleração .............................................................................................................................. 60

Fase exponencial ................................................................................................................................ 61

Fase de desaceleração ......................................................................................................................... 67

Fase estacionária ................................................................................................................................ 69

xiii

Índice de figuras

Figura 1- Regiões do espetro eletromagnético [2]. .................................................................................... 1

Figura 2 - Modos vibracionais de grupo não linear, CH2 [4]...................................................................... 4

Figura 3 - Representação dos diversos intervalos de frequências, overtones, num espetro de absorção na

região NIR [68]. .............................................................................................................................. 7

Figura 4 - Transições eletrónicas na espetroscopia ultravioleta e visível. ................................................... 8

Figura 5 - Reagentes e produtos envolvidos na fermentação cervejeira [21]. ........................................... 17

Figura 6 - Modelos de sondas segundo o tipo de funcionamento que podem apresentar: (a) sonda de

transmissão; (b) sonda de transfletância; (c) sonda ATR. ............................................................... 22

Figura 7 - Alcolyzer Beer. ....................................................................................................................... 25

Figura 8 - Material usado nas análises: a) espetrómetro; b) sonda; c) fonte de luz; d)sistema completo de

análise; e) suporte de análise. ........................................................................................................ 26

Figura 9 - Pré-tratamento de espetros. ..................................................................................................... 29

Figura 10 - Valores de graus Plato para Super Bock, SB, e Super Bock Stout, SBS. ............................... 33

Figura 11 - Evolução do extrato aparente e densidade da cerveja verde da Super Bock, SB, e Super Bock

Stout, SBS, durante a fermentação. ................................................................................................ 35

Figura 12 - Evolução do ADF% da Super Bock, SB, e Super Bock Stout, SBS, durante a fermentação. .. 36

Figura 13 - Evolução dos valores de álcool durante a fermentação da Super Bock, SB, e Super Bock

Stout, SBS. .................................................................................................................................... 37

Figura 14 - Evolução de pH durante a fermentação da cerveja verde da Super Bock, SB, Super Bock

Stout, SBS. .................................................................................................................................... 38

Figura 15 - Evolução da cor, unidades EBC, durante fermentação da cerveja Super Bock, SB, e Super

Bock Stout, SBS. ........................................................................................................................... 39

Figura 16 - Evolução do diacetilo durante a maturação da cerveja Super Bock, SB, e Super Bock Stout,

SBS. .............................................................................................................................................. 41

Figura 17 - Perfis do PCA para Super Bock e Super Bock Stout na região UV-VIS e VIS-SWNIR......... 43

Figura 18 - Calibrações do PLS para Super Bock no VIS-SWNIR para: a) °Plato; b) álcool; c) ADF%;

d)pH; e) cor; f) extrato aparente; g) diacetilo. ................................................................................ 44

Figura 19 - Calibrações do PLS para Super Bock no UV-VIS para: a) ºPlato; b) álcool; c) ADF%; d)pH;

e) cor; f)extrato aparente; g) diacetilo. ........................................................................................... 45

Figura 20 - Calibrações do PLS para Super Bock Stout no VIS-SWNIR para: a) ºPlato; b) álcool; c)

ADF%; d)pH; e)cor; f) extrato aparente; g) diacetilo. .................................................................... 46

Figura 21 - Calibrações do PLS para Super Bock Stout no UV-VIS para: a) °Plato; b) álcool; c) ADF%;

d) pH; e) cor; f) extrato aparente; g) diacetilo. ............................................................................... 47

Figura 22 - Cartas de controlo dos valores médios, , e desvios, s, para o extrato aparente durante a fase

de aceleração. ................................................................................................................................ 60

Figura 23 - Cartas de controlo dos valores médios, , e desvios, s, para o álcool durante a fase de

aceleração. .................................................................................................................................... 60

xiv


exponencial. .................................................................................................................................. 61


exponencial. .................................................................................................................................. 62


exponencial. .................................................................................................................................. 63

Figura 27 - Cartas de controlo dos valores médios, , e desvios, s, para o álcool durante a fase

exponencial. .................................................................................................................................. 64


exponencial. .................................................................................................................................. 65


exponencial. .................................................................................................................................. 66


de desaceleração. ........................................................................................................................... 67


desaceleração. ............................................................................................................................... 68


estacionária. .................................................................................................................................. 69


estacionária. .................................................................................................................................. 70

Figura 34 - Cartas de controlo dos valores médios, , e desvios, s, para o diacetilo durante a fase

estacionária. .................................................................................................................................. 71

xv

Índice de tabelas

Tabela 1 - Divisão do espetro da região infravermelha. ............................................................................. 3

Tabela 2 - Bandas de infravermelho para moléculas orgânicas [1]. ........................................................... 3

Tabela 3 - Composição química da cevada (% extrato seco). .................................................................. 14

Tabela 4 - Estimativas do modelo de regressão por mínimos quadrados parciais para Super Bock no VIS-

SWNIR. ........................................................................................................................................ 48

Tabela 5 - Estimativas do modelo de regressão por mínimos quadrados parciais para Super Bock no UV-

VIS. .............................................................................................................................................. 48

Tabela 6 - Estimativas do modelo de regressão por mínimos quadrados parciais para Super Bock Stout no

VIS-SWNIR. ................................................................................................................................. 49


VIS. .............................................................................................................................................. 49

Tabela 8 - Fatores utilizados para o cálculo dos limites das cartas de controlo dos valores médios, , e dos

desvios, s, de acordo com o número de observações, n, de cada uma das amostras usadas. ............ 59

xvi

Lista de Abreviaturas e Siglas

% (m/m): Percentagem mássica (massa soluto/massa solução).

% (v/v): Percentagem volúmica (volume soluto/volume solução).

°C: Graus Celsius.

°P: Graus Plato.

a.C.: antes de Cristo.

ADF: Grau aparente de fermentação,%,(Apparent degree of fermentation).

AE: Extrato aparente (Apparent extract).

cm: Centímetro.

CSS: Conteúdo em sólidos solúveis.

DNA: Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid)

EBC: European Brewery Convention.

EN: Espetro normalizado.

EO: Espetro original.

ɛ: Coeficiente molar de absorção.

FarIR: Infravermelho distante (Far Infrared).

FT-IR: Infravermelho por Transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared).

g: Grama.

h: Hora.

IR: Infravermelho (Infrared).

L: Litro.

LCL: Limite de controlo inferior (Lower control limit).

LQ: Limite de quantificação.

mg: Miligrama.

xvii

MidIR: Infravermelho médio (Mid Infrared).

mL: Mililitro.

NIR: Infravermelho próximo (Near Infrared).

nm: Nanómetro.

OE: Extrato original (Original extract).

PC: Componente principal (Principal component).

PCA: Análise de componentes principais (Principal components analysis).

PLSR: Regressão por mínimos quadrados parciais (Partial least square regression).

PRESS: Soma dos quadrados dos resíduos previstos (Predicted residual sums of squares).

RE: Extrato real (Real extract).

RMSC: Correção robusta de espalhamento multiplicativo (Robust mean scattering correction).

s: Desvio-padrão da amostra.

: Linha central da carta de controlo dos desvios-padrão das amostras.

SB: Super Bock.

SBS: Super Bock Stout.

SWNIR: Infravermelho próximo de ondas curtas (Short wave near infrared).

TI: Tempo de integração.

UCL: Limite de controlo superior (Upper control limit).

UV: Ultravioleta (Ultraviolet).

VDK: Dicetonas vicinais (Vicinal diketones)

VIS: Visível (Visible).

: Média da amostra.

: Linha central da carta de controlo dos valores médios das amostras.


1

1 Introdução

1.1 Espetroscopia Molecular

A espetroscopia molecular assenta na proposição da teoria quântica, em que os átomos e

moléculas se encontram organizados em estados, denominados níveis de energia.

Baseado neste pressuposto, a espetroscopia é então a análise da radiação

eletromagnética absorvida, emitida ou dispersa pelos átomos ou moléculas durante as

transições entre os níveis de energia. A frequência da radiação associada a estas

transições é calculada por [1]:

,

sendo a variação de energia entre estados, h a constante de Planck e v a frequência.

As radiações envolvidas neste tipo de alterações, podem então ser usadas para descrever

em concreto a composição e a quantidade dos elementos moleculares presentes nas

amostras. De modo a estudar as diferentes grandezas de separação dos níveis de energia,

várias técnicas podem ser usadas nesta análise, sendo a característica diferenciadora

entre elas o espetro de radiação eletromagnética usado, assim como os efeitos

provocados nas diversas ligações [1], Figura 1.

Figura 1- Regiões do espetro eletromagnético [2].

3 × 10

10 3 × 10

8 3 × 10

6 3 × 10

4 3 × 10

2 3

Raios X Raios Ɣ

Ultra violeta

Visível Infravermelho Microondas Ondas de rádio

Transições electrónicas atómicas

Transições electrónicas

atómicas e moleculares

Vibrações moleculares

Rotações moleculares

Níveis de energia nuclear e magnético

Diminuição de energia

Tipo de radiação

Comprimento de onda (m)

Frequência (MHz)

Níveis de energia das transições adequadas

10 -10

10 -9

10 -8

10 -7

10 -6

10 -5

10 -4

10 -3

10 -2

10 -1

10 0

10 1

10 2

10 3


2

1.1.1 Tipos de espetroscopia

1.1.1.1 Espetroscopia de Raman

Descoberta pelo físico C.V. Raman em 1928, fundamenta-se na avaliação do fenómeno

inelástico da dispersão da luz, que resulta na variação de uma pequena fração de

radiação dispersa pelas moléculas, tendo diferente frequência da fonte de luz incidente

[3].

Ou seja, a irradiação de uma molécula com luz monocromática poderá resultar em dois

comportamentos dispersivos, o elástico e o inelástico. No caso do inelástico, este é

acompanhado por uma mudança na frequência dos fotões, devido à excitação ou

desativação das vibrações moleculares. Esta mudança pode resultar num aumento ou

perda de energia para os fotões [3].

Deste comportamento podem originar-se três tipos de fenómenos (dispersão Rayleigh;

anti-Stokes Raman; Stokes Raman) mediante a relação existente entre energia incidente

e dispersa pela molécula, devido aos processos de ganho e perda de energia vibracional

associado à emissão de fotões de luz [3].

Na recolha das informações do espetro Raman poderá usar-se duas tecnologias, a

espetroscopia de Raman e espetroscopia de Raman com transformada de Fourier. Estas

diferem apenas quanto à fonte de luz e a forma como os dados são analisados e

detetados. Várias poderão ser as fontes de luz usadas, como iões árgon e crípton. Para

obtenção de dados satisfatórios, esta técnica deverá ser implementada em moléculas

simétricas e que apresentem mudança de polaridade durante a vibração. Deste modo,

aquelas que apresentam sinal mais intenso serão constituídas por grupos funcionais

como: C-X (X = F, Cl, Br, I), C-NO2, C-S, S-H e CN [3].

1.1.1.2 Espetroscopia IR e FT-IR

A leitura na região IR proporciona um espetro de absorção no intervalo de frequência de

13000 até 10 cm-1

, sendo delimitada pela zona vermelha da radiação visível e pelas

micro-ondas, nas altas e baixas frequências, respetivamente [4].

Esta vasta região pode ser dividida em outras três regiões, o infravermelho próximo

(NIR), o infravermelho médio (midIR) e o distante (FarIR) através das áreas indicadas

na Tabela 1 [4].


3

Tabela 1 - Divisão do espetro da região infravermelha.

A absorção está associada a transições entre estados de energia vibracional e subestados

rotacionais da molécula. Contudo a absorção de radiação infravermelha só ocorre se a

vibração do momento dipolar das moléculas sofrer alteração [1, 5]. Ou seja, quando a

frequência de vibração específica dos átomos é igual à frequência da radiação IR que

está a incidir na molécula, esta absorve radiação [4].

Cada átomo apresenta 3 graus de liberdade, referentes a cada um dos eixos Cartesianos.

Portanto o número total de uma molécula poliatómica será de 3n graus de liberdade,

sendo n o número de átomos. Eliminando os 3 graus de liberdade necessários para o

movimento no espaço, de translação da molécula, mais outros 3 graus de liberdade para

o movimento de rotação da mesma, pode-se estipular a quantidade de modos

vibracionais que a molécula apresenta [4].

Assim sendo, uma molécula não

linear apresenta 3n-6 modos

vibracionais, enquanto uma

molécula linear apresenta 3n-5,

dado que apenas se descontam 2

graus de liberdade para os

movimentos rotacionais. São

estas variedades de modos

vibracionais que poderão

induzir as variações no

momento dipolar das moléculas

e assim resultar na atividade IR

[4].

Cada pico obtido no espetro de absorção está associado à frequência de vibração que

determinada molécula apresenta. Estas vibrações exprimem-se, maioritariamente, sobre

NIR MidIR FarIR

Frequência (cm -1

) 13000 - 4000 4000 - 200 200 – 10

Comprimento de onda (μm) 0.78 – 2.5 2.5 – 50 50 - 1000

Tabela 2 - Bandas de infravermelho para moléculas orgânicas

[1].

Número de onda (cm-1

)

3700 - 3600 Stretching O – H

3400 - 3300 Stretching N – H

3100 - 3000 Stretching C - H aromático

3000 - 2850 Stretching C – H alifático

2300 - 2050 Stretching C≡C

2300 - 2200 Stretching C≡N

1830 - 1650 Stretching C=O

1650 Stretching C=C

1500 - 650 Região fingerprint


4

a mudança na extensão de comprimento (stretching) ou ângulo da ligação (bending), tal

como apresentado na Figura 2 e Tabela 2 [1, 4].

Face a esta diversidade de

comportamentos por parte das moléculas,

a constituição do espetro de IR apresenta-

se diverso, complexo e exprime-se como

um padrão de certos compostos mas

também de certas moléculas [1, 4].

No caso da padronização de compostos,

deve-se ao facto de que o número de

bandas de absorção não é proporcional aos

modos de vibração existentes, dado que

alguns modos não são ativos ao IR, assim

como uma frequência pode originar mais

que um modo de vibração. Para além

disso, é normal ocorrerem bandas que

resultam de diferenças de frequências

fundamentais, interações acopladas de

duas frequências de absorção

fundamentais, múltiplos integrais de

frequências de absorção fundamentais

(overtone), entre outros [4].

Quanto às moléculas, o conjunto de vibrações quantificadas ao longo de grande parte ou

toda a estrutura desta, permite avaliar este comportamento como vibrações esqueléticas

da molécula. Deste modo, as bandas associadas a estas vibrações permitem reconhecer a

molécula como um todo, e não apenas uma parte/grupo da estrutura [1].

A espetroscopia de FTIR é a técnica mais usada, e baseia-se na análise de sinais

denominados interferogramas, ou seja, resulta da interferência entre dois feixes de luz,

que são produzidos pela passagem do mesmo feixe de luz pelo interferómetro. Estes

sinais são produzidos em função das variações ocorridas no comprimento do percurso

Stretching

assimétrico

Stretching

simétrico

Bending no plano

scissoring

Bending fora de plano

wagging

Bending fora de plano

twisting

Bending no plano

rocking

Figura 2 - Modos vibracionais de grupo não

linear, CH2 [4].


5

entre os dois feixes. Através da Transformada de Fourier estes sinais são tratados,

podendo então obter o espetrograma final de absorção [1].

1.1.1.3 Espetroscopia NIR

Tal como referido anteriormente, esta secção está compreendida entre 780 e 2500 nm

[6–9] proporcionando maior quantidade de informação relacionada com o

comportamento vibracional das ligações químicas [8].

As bandas espetrais resultantes são devidas a overtones, transições entre estados

vibracionais não contíguos devido ao comportamento de anarmonicidade, e à

combinação de vibrações fundamentais na região média do infravermelho [6–9].

A vibração das moléculas pode ser descrita pelo modelo de oscilador harmónico, onde a

energia de diferentes níveis energéticos equidistantes pode ser calculado por [9],

(

)

√

onde v é o número quântico vibracional, h a constante de Planck, k a constante de força

e μ a massa reduzida dos átomos de ligação. Considera-se que apenas as transições entre

níveis de energia consecutivos (∆v = ±1) que causam alterações no momento dipolar são

possíveis [9],

sendo v a frequência vibracional fundamental da ligação, que resulta numa banda de

absorção na região média do infravermelho.

Contudo, o modelo do oscilador harmónico não consegue explicar o comportamento das

moléculas atuais, dado não levar em consideração a repulsão de Coulomb entre átomos

ou dissociação de átomos. Deste modo, o modelo que melhor se adequa será o oscilador

anarmónico, em que os níveis de energia não estão igualmente espaçados,

proporcionando então uma diminuição da variação de energia com o aumento de v:

( )


6

onde y é o fator de anarmonicidade. Este comportamento pode resultar em transições

entre estados de energia vibracional, overtones, onde ∆ν=±2, ∆ν=±3... [9].

Estas bandas apresentam-se muito mais fracas quando comparadas com as bandas de

transições fundamentais verificadas na região média do IR. Dependendo da ligação em

causa, a diferença poderá ser entre 10 a 100 vezes [7, 9], sendo a secção do espetro

predominante entre os 780 e 2000 nm, consoante o nível de overtone, a força e natureza

da ligação [9].

Em relação ao outro tipo de bandas presente na região NIR, as bandas de combinação,

estas resultam das moléculas poliatómicas. Podem originar vários modos de vibração

que ao interagirem resultam em mudanças simultâneas de energia dando origem às

bandas de absorção. Estas bandas exprimem-se na região dos 1900 a 2500 nm, sendo

que a frequência de cada banda é o somatório das várias frequências que interagem [9].

Quanto à intensidade de absorção, este fenómeno está diretamente associado à alteração

do momento dipolar assim como à anarmonicidade. Deste modo, ligações moleculares

com átomos leves, como o caso do hidrogénio, apresentam uma elevada absorção na

região NIR, como por exemplo, C-H, O-H, N-H e S-H [1, 6–9]. Isto explica-se pelo

facto de quanto mais leves forem os átomos, maior será a vibração, e por conseguinte

maior o desvio ao comportamento harmónico. Por este princípio, ligações do género

C=O, C-C e C-Cl têm absorções fracas [9].

Para além da informação química, informação física como densidade, viscosidade, entre

outras, pode ser determinada, dado que a estrutura cristalina consegue ser identificada.

Esta identificação surge do facto de que as interações entre átomos de diferentes

moléculas alteram os estados de energia vibracional, alterando e dando origem a novas

bandas de absorção, através de modificações de estrutura [9].

Comparativamente com o mid-IR, o espetro NIR apresenta maior dificuldade de

diferenciação e atribuição das bandas de absorção geradas. Os efeitos que causam estes

problemas, são meio para a distinção de estruturas bastante semelhantes, pois permitem

verificar as diferenças subtis entre as estruturas próximas, mesmo quando as bandas são

extensas e sobrepostas [7].


7

O espetro NIR pode ser subdividido em duas regiões. A primeira, e de maior interesse

para a atividade, é o infravermelho próximo de ondas curtas (SWNIR), 600 a 1100 nm,

que é considera como banda de absorção para o maior overtone, enquanto a região

normal NIR, a 1300 nm, tem bandas de absorção para overtones inferiores (primeiro e

segundo) [8].

Tendo em conta que a intensidade de absorção diminui com o aumento do overtone, o

SWNIR é mais usado na análise de transmissão com longos caminhos, enquanto a outra

região é usada para análises de reflexão difusa [8], Figura 3.

A aquisição de dados na região NIR pode ser realizada de diversas formas consoante a

intenção e finalidade, destacando-se a transmitância, interactância, transfletância,

transmitância difusa e refletância difusa [6].

1.1.1.4 Espetroscopia UV-VIS

Esta secção do espetro compreende dois tipos de radiação. A radiação ultravioleta (UV)

situa-se, aproximadamente, no intervalo de absorção de 200 a 400 nm, enquanto a

radiação visível (VIS) entre os 400 e 800 nm. A absorção no UV-VIS está associada a

transições eletrónicas entre os diferentes níveis de energia a partir dos níveis

moleculares [1, 2, 10].

Várias transições eletrónicas são admitidas, apresentando um coeficiente molar de

absorção (ε) acima de 10000, uma grande probabilidade de ocorrência e grande

Figura 3 - Representação dos diversos intervalos de frequências, overtones, num espetro de absorção na

região NIR [68].

3º Overtone

2º Overtone

1º Overtone

Combinação


8

absorção, desde que o spin do eletrão varie e a simetria não se altere durante a transição

[1, 2]. Contudo, devido a considerações de simetria, existem algumas transições que

ocorrem e apresentam comportamento contrário às anteriores. São muito comuns apesar

de apresentar probabilidade de ocorrência muito baixa, com ε por norma inferior a 1000,

e bandas de absorção muito baixas. Estes casos sucedem-se quando na estrutura da

molécula estão presentes grupos funcionais com capacidade de absorção de radiação

UV-VIS, denominados cromóforos. Exemplo de algumas transições onde isto se

verifica são as n→π* no grupo carbonilo e π→π* nos compostos aromáticos [1, 2].

Por parte das moléculas orgânicas, estas transições encontram-se associadas a eletrões

não ligados (n) ou eletrões presentes em orbitais moleculares encontradas de moléculas

insaturadas [10]. A absorção na região UV-VIS resulta da excitação de eletrões que

passam de orbitais moleculares elevadas (orbital não ligante n e orbital ligante π) para

orbitais moleculares inferiores e livres (orbitais antiligantes π* e σ*) [1]. As transições e

a relação energética entre orbitais pode ser vista na Figura 4.

As ligações químicas apresentam determinadas condições orbitais, que permitem obter

diferentes energias de transição a diferentes comprimentos de onda [11]. Contudo a

energia exata de variação entre orbitais torna-se de difícil previsão, dado estar

dependente dos diferentes grupos de átomos existentes assim como da ligação entre eles

[2].

Se do ponto de vista quantitativo é difícil obter conclusões, do ponto de vista qualitativo

pode-se afirmar que as transições mais comuns são as n → σ* (190 nm), associadas a

ligações moleculares com O, N, S e halogéneos, assim como as transições n → π* (300

Figura 4 - Transições eletrónicas na espetroscopia ultravioleta e visível.

Antiligantes

Ligantes

Ener

gia

Transições Níveis energéticos


9

nm) e π → π* (180 nm), referentes a moléculas com ligações duplas ou conjugadas com

ligações duplas, como o caso dos compostos aromáticos que são os melhores

absorvedores [2, 10].

Para além destas ligações podem-se ainda enumerar outras, que são possíveis de

verificar devido à variedade presente nas amostras. Por exemplo, os alcanos (σ→ σ*;

150 nm) e as ligações carbonilo (σ→ π*; 170 nm) [11].

A leitura eficiente nas regiões, anteriormente, referidas permite uma grande

aplicabilidade da UV-VIS na leitura das moléculas orgânicas pois estas apresentam uma

grande presença das ligações carbonilo e ligações insaturadas. Como exemplo podem

ser referidos: os aminoácidos, os fosfolípidos, ácidos gordos livres, fenóis e os

flavonoides, os peróxidos, os péptidos, as proteínas e os açúcares [11].

A aplicação do UV-VIS acarreta também a exploração de outras propriedades, quer para

algumas moléculas, quer para o estado microbiológico das células. No primeiro caso, a

existência de grupos cromóforos permite um aumento de absorção nesta região. Este

comportamento deve-se aos grupos nitro, nitroso, azo, azo-amino, azoxi, carbonilo e

tiocarbonilo. No caso dos microrganismos, o registo da saída e retorno das orbitais por

parte dos eletrões, resultando em comportamentos vibracionais e de rotação, permite o

aumento de reações fotoquímicas e de fluorescência identificando assim

microrganismos [11].

1.1.2 Critérios de escolha da região UV-VIS-SWNIR

Tendo em conta a descrição de tecnologia realizada anteriormente, aquela que será mais

abordada neste trabalho utilizará a região UV-VIS-SWNIR. Esta escolha baseia-se nas

qualidades químicas que a cerveja apresenta, sendo estas apresentadas nos próximos

capítulos.

Comparativamente com outras tecnologias, como a FTIR, prevê-se que a região UV-

VIS-SWNIR apresente maior sensibilidade para soluções como a cerveja, ou seja, que

são constituídas à base de água. Isto explica-se pois em FTIR, uma das técnicas mais

amplamente usadas, a radiação é fortemente absorvida pelas moléculas de água,

influenciando os resultados finais no que toca à sensibilidade do estudo dos

componentes que constituem a restante solução [11].


10

Deste modo, o facto da região UV-VIS-SWNIR apresentar-se como altamente sensível,

sendo regularmente usada como técnica de análise de medição de metabolismo de

leveduras [11], mais precisamente, componentes químicos como o açúcar, gorduras,

proteínas, análise de atributos de qualidade, como viscosidade, assim como as

propriedades de extrato seco e o conteúdo em sólidos solúveis (CSS), torna esta

tecnologia a mais adequada para esta atividade [11, 12].

Por fim, para além das propriedades já enunciadas, esta tecnologia apresenta-se também

com preços bastante satisfatórios e como vantajosa no que se refere à resistência,

robustez, apresentando ótimos resultados para grandes variações de temperatura [11].

1.1.3 Aplicações da espetroscopia UV-VIS-SWNIR

Nesta fase, dar-se-á maior destaque ao setor agroalimentar, sendo a área petroquímica e

farmacêutica alvo de uma menção breve.

Na indústria cervejeira este tipo de tecnologia tem sido desenvolvida para aplicação na

identificação de tipos de cerveja e controlo de qualidade de alguns parâmetros.

Estudou-se a aplicação da espetroscopia de transfletância na região NIR para confirmar

a identidade de um género especial de cerveja, a Trapista, e dois subgéneros desta, a

Rochefort 8º e 10º, que apresentam regras muito estritas na sua produção. Cerca de 67 e

57 cervejas, não Trapista e Trapista, respetivamente, foram analisadas na região entre

400 e 2498 nm. Usaram-se diversas técnicas de quimiometria, de modo a poder modelar

a caracterização das cervejas. No caso geral da Trapista, os resultados não foram

satisfatórios quanto à sensibilidade, apresentando melhores valores quanto à eficiência.

Avaliou-se ainda, por classificação discriminante, a diferenciação dos dois tipos de

cerveja Rochefort, apresentando valores muito satisfatórios, dado a boa correlação entre

o álcool e a região NIR [13].

A espetroscopia NIR apresenta-se como muito promissora na avaliação da qualidade de

grãos de malte e de milho para produção de cerveja. Essa avaliação pode ser realizada

pelo controlo de parâmetros como humidade e nitrogénio total para o malte, bem como

a humidade e conteúdo lipídico no caso do milho. Diversas amostras foram analisadas

de três tipos de malte diferentes e comparadas com processos homólogos usuais.

Constatou-se que os valores finais dos parâmetros foram aproximados entre os dois


11

métodos, destacando-se neste caso o malte de tipo Pale. Em relação ao milho iguais

conclusões se tiram, dado a semelhança entre repetibilidades e valores finais de

parâmetros, assim como baixos valores de incertezas a nível de humidade e de lípidos

[14].

Utilizou-se a possibilidade de combinação de espetroscopia midIR (4000 a 600 cm-1

) e

NIR (800 a 2400 cm-1

) na tentativa de descobrir se existe melhoria na previsão de

parâmetros como o etanol, extrato original (OE) e real (RE) quando comparados com os

resultados isolados de cada uma das técnicas. A partir de 43 amostras de cervejas,

constatou-se que os resultados obtidos em conjunto pelas duas técnicas apresentam-se

bastante próximos dos valores das técnicas em separado, provando-se que não há muitas

vantagens na utilização em conjunto do midIR e NIR. Para os três tipos de dados

criados, aplicaram-se em separado dois tratamentos quimiométricos, os mínimos

quadrados parciais (PLS) e a análise de redes neurais, sendo esta última aquela que

melhor desempenho apresentou [15].

Para além da aplicação no NIR, também existem estudos de aplicação da região UV-

VIS no estudo da qualidade da cerveja. O processo de deteção da capacidade

antioxidante, que consiste no sequestro de radicais a partir de compostos orgânicos com

posterior absorção na região UV-VIS, tornando o processo lento e trabalhoso foi

modificado. A nova versão da técnica consiste na aplicação de um solvente orgânico

para extração, seguido de absorção a 333 nm. Verificou-se que o extrato alcançado

apresentava elementos intervenientes no envelhecimento da cerveja, como polifenóis e

produtos de reação Maillard. Devido aos elevados coeficientes de correlação entre as

duas tecnologias, concluiu-se que o novo método apresenta condições para ser utilizado

no acompanhamento do envelhecimento de cerveja [16].

Para além do ramo cervejeiro, esta tecnologia tem tido grandes desenvolvimentos e

aplicações em outros ramos da indústria agroalimentar.

Como por exemplo, estão descritas aplicações desta tecnologia na gestão de vinhas,

proporcionando imagens de alta qualidade do metabolismo, de forma a permitir uma

viticultura de precisão [11].

Implementou-se a região VIS-SWNIR no estudo de componentes sólidos solúveis

(CSS), responsáveis pelo sabor final, e de pH de diferentes vinagres de arroz. Em


12

combinação com os modelos quimiométricos do PLS, usado como meio para extração

das variáveis latentes e dos comprimentos de onda mais eficientes, apresentou ótimos

dados, verificando-se melhores resultados para o intervalo de comprimento de onda de

550-1000 nm [17].

Bons resultados foram também obtidos na previsão do conteúdo de açúcar em maçãs

sem casca, a partir do desenvolvimento de modelos de regressão multivariável em CSS,

para maçãs com e sem casca, num espetro de refletância de 800-1700 nm. Análise

similar foi também realizada a frutos kiwi, onde a partir da radiação SWNIR se

conseguiu prever com precisão o extrato seco e CSS. A análise de componentes sólidos

solúveis também se apresentou com ótimos valores para manga, banana e pêssego, em

regiões de 730-995 nm. Foi também avaliada a capacidade de aplicação do VIS-SWNIR

para o estudo e quantificação da firmeza, dureza dos tecidos dos frutos, de modo a

estudar a maturação e respetiva melhor época para a colheita [18].

Para além da melhoria no controlo de maturação e época de colheita, esta tecnologia

pode também ser utilizada para o controlo do nível de fungicida a aplicar nas grandes

plantações. A implementação de espetroscopia da região VIS-SWNIR, em sensores

acoplados a tratores, permite detetar as áreas de necrose, devido às infeções nos

cultivos, assim como é também possível verificar a evolução da densidade de copas e

áreas foliares na região SWNIR. Deste modo, o doseamento de quantidade de fungicida

é realizado tendo em conta apenas o estado da plantação, diminuindo possíveis efeitos

secundários quando estes alimentos chegarem ao consumidor final [19].

A utilização desta técnica como controlo alimentar é também marcante no que toca à

análise de frutos que contenham espécies de insetos. Verificaram-se bons resultados no

controlo de cerejas infetadas por larvas. Foi possível verificar a presença dos insetos,

devido às alterações provocadas por estes nos tecidos da cereja, em comparação com o

fruto não contaminado. Com o aumento da legislação no controlo de parasitas, esta

técnica torna-se uma importante ferramenta de prevenção de perdas económicas [20].

A tecnologia poderá também ser importante na regulação da indústria alimentar animal

e no mercado da preparação da carne crua. No primeiro caso, a espetroscopia será

utilizada no controlo da composição e ingredientes químicos das rações, assim como na

monitorização das dosagens dos aditivos e ingredientes nas misturas durante a


13

produção. No caso da carne, análise precisa e rápida pode realizar-se às características

qualitativas, como por exemplo composição química e atributos sensoriais. Esta análise

justifica-se pela capacidade de obter dados precisos dos níveis de gordura, humidade e

de proteína que a carne apresenta [7].

Existem também outras áreas onde esta tecnologia é usada. Por exemplo, a indústria

petrolífera utiliza a espetroscopia na região NIR em todos os processos envolvidos na

produção de todos os produtos resultantes da destilação do crude, desde a unidade de

refinação até às operações de mistura de combustível. Na área farmacêutica, esta

tecnologia emprega-se em diversas etapas da construção de um medicamento. Por

exemplo, será utilizada na monitorização da homogeneização de misturas sólidas,

através de medições com fibras óticas acopladas ao misturador, assim como a

quantificação do ingrediente ativo nos comprimidos produzidos. Permite criar

uniformidade entre produtos ocorrendo redução de custos e de tempo [7].

1.2 Processo cervejeiro

Dado tratar-se de uma atividade que consiste na aplicação das tecnologias de

espetroscopia ao processo cervejeiro, este será analisado desde as matérias-primas até

ao processo de acabamento da cerveja. Contudo, será dado maior destaque à

fermentação.

1.2.1 Evolução do processo cervejeiro e da cerveja

Considerado como o produto de origem biotecnológica mais antigo, a criação da cerveja

estará associada ao milénio VI a.C.. Com características fortemente turvas e alcoólicas e

devido ao evoluir do seu processamento, foi ganhando muitos adeptos no norte e centro

da Europa. Contudo, só apenas no século XIX, devido a descobertas e estudos de

cientistas como L. Pasteur, E. Buchner, entre outros, a cerveja começou a ser produzida

com maior durabilidade, reprodutibilidade e qualidade mais consistente. Muitas destas

evoluções tiveram como ponto de partida a otimização de utilização de estirpes puras,

inicialmente pela melhoria dos cuidados de manutenção e depois por implementação da

engenharia genética. As condições de fermentação também têm apresentado algumas

evoluções, destacando-se o uso de fermentadores fechados, os mostos de alta

concentração e os processos de imobilização de levedura [21].


14

1.2.2 Matérias-primas

As matérias-primas envolvidas na produção de cerveja são, essencialmente, a água, o

malte de cevada, o lúpulo e a levedura.

A água é a matéria-prima utilizada em maior quantidade na produção cervejeira, não só

pelos volumes usados na fermentação, mas acima de tudo pela sua importância em

outras atividades como limpeza, lavagem, entre outras [22]. Sendo a cerveja um produto

alimentar, essencialmente, constituído por água e desenvolvendo-se todas as reações

químicas e biológicas neste meio, a utilização deste recurso deve ter em conta as

exigências e as propriedades pretendidas pela cerveja final e pelos processos

intermédios de produção, assim como os requisitos sanitários para consumo [22, 23].

Caracterização pormenorizada sobre os iões Ca2+

, Cl-, SO

2-4, é um fator preponderante

na brassagem da cerveja, pois poderão influenciar o pH durante a produção. A

utilização de mostos altamente concentrados, deverá ter em conta a ausência de sais, de

O2 dissolvido, enquanto a presença de por questões de saúde e por influência na

atividade da levedura, deverá ser reduzida na produção de qualquer cerveja [21, 22].

Na categoria dos cereais, aquele

que se apresenta como universal na

produção de cerveja é o malte de

cevada, responsável por fornecer o

amido. Apesar das diversas

variedades deste cereal, originando

cervejas com características

diferentes, destaca-se o uso da

cevada dística. A predominância

deste cereal na cerveja deve-se à sua capacidade de produção, grão com película fina,

grânulos uniformes, conteúdo de extrato elevado e nível polifenólico baixo. A cevada

apresenta todas as características necessárias, tal como apresentado na Tabela 3,

destacando-se o elevado grau de hidratos de carbono e proteínas. Entre as proteínas,

destaca-se a enzima β-amilase, que apresenta ação sacarificante [21, 22].

O processo cervejeiro pode incluir a introdução de adjuntos, ou seja, cereais não

maltados. A quantidade de malte substituída por adjuntos encontra-se por norma entre

os 15 a 20% e sucede-se devido ao facto do potencial enzimático do malte de cevada

Tabela 3 - Composição química da cevada (% extrato seco).

Hidratos carbono totais 70.0 – 75.0%

Proteína 10.5 – 11.5%

Matéria inorgânica 2.0 – 4.0%

Gordura 1.5 – 2.0%

Outras substâncias 1.0 – 2.0%


15

poder consumir todo o amido. Por norma os adjuntos são mais baratos que o malte

podendo-se usar cevada, sorgo, arroz e milho. Estes dois últimos são adicionados de

modo a diminuir o conteúdo global de proteína do mosto, sendo um fator de

diferenciação no produto final [21, 22].

Outra matéria-prima usada em grandes quantidades e com muita influência na cerveja

final é o lúpulo. A adição deste justifica-se pelo aroma e amargor que este empresta à

cerveja. Esta ação deve-se sobretudo à diversidade de componentes que este apresenta,

destacando-se o papel das resinas, ácidos α (fonte de maior amargor) e ácidos β, e os

óleos essenciais [21, 22]. Para além destas propriedades o lúpulo promove maior

estabilidade de espuma e inibe o desenvolvimento bacteriano [22].

A levedura que é adicionada durante o processo cervejeiro pertence ao género

Saccharomyces. A sua função é consumir o substrato, diminuindo os açúcares presentes

no mosto, produzindo o etanol, CO2 e os restantes metabolitos. Mediante o tipo de

cerveja a produzir, ale ou lager, poderão utilizar-se espécies como, S. cerevisiae e S.

carlsbergensis, respetivamente. Entre estas o comportamento diferencia-se no

processamento, mais precisamente, na capacidade de consumir certos tipos de substrato

e nas temperaturas de fermentação [21, 22].

1.2.3 Etapas do processo cervejeiro

Constituído por diferentes processos enzimáticos e biológicos, a produção de um tipo de

cerveja estará dependente das condições que se pretendem obter no final do processo.

Ou seja, avaliar o perfil aromático, o grau alcoólico da cerveja assim como a sua

estabilidade física e química, são alguns dos parâmetros a ter em conta. Este processo

está dividido em três grandes etapas: maltagem; fabricação e tratamento do mosto;

fermentação e acabamento. Estas etapas, constituída cada uma delas por sub-etapas

permite a conversão da cevada em cerveja [21].

1.2.3.1 Maltagem

Este processo tem como característica principal a produção e disponibilização dos

açúcares fermentáveis presentes no grão. Estas alterações devem-se ao processo de

molha que aumenta a humidade do grão, criando as condições para o início da

germinação. Nesta fase, a parede celular é fragilizada de modo a que o amido do grão se

torne mais acessível. Processos enzimáticos induzidos por meios hormonais promovem


16

o início da degradação do amido em açúcar fermentável, tal como a síntese das enzimas

hidrolíticas (α-amilase, dextrina-limite, proteinases e peptidases) intervenientes na

degradação de proteínas com consequente produção de parte dos aminoácidos

necessários à levedura. A ação das peptidases no endosperma tem a capacidade de

influenciar a viscosidade final da cerveja. Por fim, decorre o processo de

secagem/estufagem para parar todos os processos/enzimas participantes na germinação

e fixar as características do malte, o gosto e coloração [21].

Mediante o controlo efetuado neste processo, pode-se obter uma cerveja com

propriedades únicas em relação à espuma (proteínas), aroma/gosto (teor lipoxigenásico)

e coloração (compostos azotados e açúcares) [21].

1.2.3.2 Fabricação do mosto

Finalizada a preparação do malte, a aplicação sequencial de operações unitárias torna-o

apto a ser fermentado sob a forma de mosto. Esta fase pretende hidrolisar por completo

todo o amido presente, proteínas e outros componentes através da otimização do

funcionamento de muitas das enzimas produzidas durante a germinação [21].

Este procedimento inicia-se por um tratamento físico dos grãos, moagem, onde se

pretende destruir a estrutura e tecidos do grão, para melhor extração de amido e

proteínas. Esta farinha é depois misturada com água, onde em processos a diferentes

temperaturas e tempos, se inicia a ação de enzimas do malte, como proteínases, β e α-

amilase, obtendo-se a sacarificação do amido e hidrólise de proteínas. Devido à

transferência do malte empastado, entre diferentes caldas e de temperaturas elevadas, é

possível otimizar a sacarificação e extração dos componentes de interesse [21].

Após este processo de brassagem, o malte tratado é então filtrado de modo a separar a

parte solúvel, denominado mosto doce onde estão todos os açúcares e restantes

componentes químicos, da parte insolúvel, a drêche. O mosto doce é de seguida

colocado a altas temperaturas. Com esta etapa pretende-se evaporar a água do mosto,

compostos voláteis, esterilizá-lo e precipitar grandes proteínas ainda existentes.

Contudo, a ebulição apresenta também importância no aroma e gosto final da cerveja. O

lúpulo é aqui adicionado, sendo alguns dos ácidos provenientes desta matéria

convertidos ou eliminados. Devido à precipitação proteica, torna-se necessário clarificar

o mosto de modo a este ser utilizado nas seguintes etapas [21].


17

Após obter todos os componentes do malte no mosto, este segue para a última fase de

tratamento, onde será arrefecido e arejado, para que atinja temperaturas e níveis de

oxigénio mínimos, de maneira a que a levedura a inocular consiga fermentar [21].

1.2.3.3 Fermentação

Esta etapa apresenta-se como a mais importante na presente atividade, pois ocorre a

passagem do mosto doce a cerveja por ação de microrganismos, tornando-a crucial em

termos de controlo de processos. Ao mosto que agora inicia a fermentação denomina-se

cerveja verde.

A qualidade da cerveja, devido aos processos bioquímicos que aqui decorrem, está

fortemente associada ao perfil aromático que se desenvolve, contribuindo para isso o

elevado nível e a velocidade de fermentação de açúcares no meio, assim como a

assimilação e utilização de aminoácidos [21].

Deste modo, torna-se importante monitorizar o consumo de açúcares, como por

exemplo a glucose, frutose, maltose e maltotriose. A levedura retira todos estes

componentes do meio, utilizando-os para dar início a processos metabólicos, como o

ciclo glicolítico que os converte em ácido pirúvico e, finalmente, em etanol e CO2. Para

além desta utilização do ácido pirúvico, este poderá ainda ser utilizado na obtenção de

outros componentes, como os ácidos, gordos e orgânicos, e aldeído acético [21].

Cetoácidos

Etanol

Ésteres Lípidos

Glúcidos

Ác. Orgânicos

Acetil CoA

Ác. Piruvico

Ác. Gordos

Acil CoA (gord)

Aldeído Acético

Álcoois Superiores

Aminoácidos

VDK

Sulfatos

H2S, SO2

Figura 5 - Reagentes e produtos envolvidos na fermentação cervejeira [21].


18

Sobre a metabolização de aminoácidos, deve-se referir que estes são transferidos

durante a fermentação para o interior da levedura, graças a processos de transaminação,

destacando-se que a eficiência deste processo para a prolina é praticamente nula [21,

22]. O metabolismo proteico é muito importante para a cerveja, pois influencia

positivamente o sabor e a estabilidade [22].

Tal como apresentado na Figura 5, do metabolismo da levedura surgem vários

subprodutos, considerados como toxinas pela estirpe, que apresentam importância no

aroma e sabor final.

Álcoois superiores representam a maior fração volátil e, mediante a disponibilidade de

aminoácidos e o tipo de álcool pretendido, poderão ser produzidos por via catabólica ou

anabólica. A sua produção é também aumentada pelo incremento de temperatura,

agitação, lípidos, aeração intensiva, entre outros. São compostos aromáticos de cerveja

finalizada, pelo que a sua regulação deverá ser realizada durante a fermentação. Como

exemplo, pode-se referir o n-propanol e o 3-metilbutanol [21, 22].

Os ésteres formam-se essencialmente na fase de crescimento, resultando da reação entre

um álcool e a acil-coenzima A ou pela esterificação de ácidos gordos, sendo que a sua

quantidade pode duplicar caso a fermentação secundária seja demasiado longa.

Apresentam resposta semelhante aos álcoois superiores, quando submetidos às mesmas

variações (com exceção da agitação do meio), e manifestam grande importância no

sabor final da cerveja, destacando-se o acetato de etilo, sendo que em altas

concentrações proporcionam sabores desagradáveis como amargor e frutado [21, 22].

Durante a fermentação podem surgir alguns compostos de enxofre, oriundos das

matérias-primas, do metabolismo ou contaminações. O SO2 e H2S, quando provenientes

da levedura são subprodutos da síntese de cisteína e metionina. Embora apresentem

atividade antioxidante, as elevadas concentrações de SO2 por norma resultam de

elevadas concentrações de lípidos, originando gostos pouco agradáveis. Este grupo é

conhecido por dar um sabor não maduro à cerveja [21, 22].

Por fim, destaca-se a presença de aldeído acético, que pode ser facilmente manipulável

com SO2 caso ultrapasse as concentrações máximas. O metabolismo de aminoácidos

proporciona também a presença de um grupo de cetonas associado a dois grupos


19

carbonilo, dicetonas vicinais, que apresentam importante função no gosto da cerveja.

Neste caso, destaca-se a 2,3 pentanodiona e o diacetilo [21, 22].

Apesar de todos os componentes de interesse serem produzidos, a cerveja ainda não está

apta a ser vendida. Para além da maturação, de modo a aprimorar a composição dos

diversos metabolitos explicados anteriormente, em especial o diacetilo, a cerveja recebe

um tratamento a temperaturas reduzidas para a diminuição da carga proteica, de

leveduras e de outros sólidos, de modo a alcançar a estabilização coloidal [21, 22].

Finalizados estes processos, a cerveja poderá ser acondicionada com integração de CO2,

e colocada no mercado [24].

1.2.4 Importância da monitorização da fermentação

É importante acompanhar alguns parâmetros que permitam aferir o correto

funcionamento da fermentação, mais precisamente a quantificação do substrato através

do extrato, o pH e a temperatura [25] pois estes refletem o comportamento do processo

fermentativo.

A avaliação do pH permite verificar o estado de produção dos ácidos orgânicos assim

como a utilização por parte da levedura de determinados iões como fosfato, potássio

entre outros. A partir de variações de pH é também possível aferir informações sobre o

ciclo de vida da levedura, mais precisamente, se está ou não a decorrer a autólise, assim

como a possibilidade de contaminação da cerveja verde [22, 26, 27].

A análise do extrato da cerveja consiste na quantificação das diversas substâncias

dissolvidas, das quais se destacam os açúcares presentes como maltose, glucose,

sacarose, frutose e maltotriose [22, 27]. Esta caracterização pode assumir diferentes

nomes, consoante os pressupostos usados e a finalidade da determinação. Deste modo

pode-se enumerar o OE, expresso em graus Plato, extrato aparente (AE) e o RE.

O OE, segundo o European Brewery Convention (EBC), é calculado segundo a equação

de Balling, sendo necessário conhecer previamente informação relativa ao RE (% m/m)

e ao álcool (% m/m) [27, 28]. Este valor permite aferir a quantidade de extrato presente

no mosto antes da fermentação, sendo este um dos fatores a controlar por algumas

autoridades fiscais [27–29].


20

O acompanhamento ao longo da fermentação da quantidade de extrato, presente na

cerveja verde, pode ser realizada por duas formas, através do RE e/ou através do AE.

No caso do AE, os valores são obtidos através da densidade específica da cerveja

filtrada, não tendo em consideração os efeitos do álcool. Para o RE, analisa-se através

da densidade específica do resíduo de destilação. Neste caso, substitui-se o volume de

álcool presente por igual volume de água. Ambos os parâmetros são obtidos por tabelas

de conversão densidade específica/quantidade de açúcares ou por utilização de

polinómios que associam estas duas propriedades [27, 29, 30].

Através do OE e do AE ou RE os produtores de cerveja conseguem calcular a extensão

da fermentação do extrato. Esta nova variável denomina-se nível de fermentação (ou

atenuação) e quantifica a percentagem de extrato consumido. Também neste caso

teremos duas designações, o nível de fermentação real e nível de fermentação aparente

(ADF%), caso se utilize no cálculo o RE ou AE, respetivamente [22, 29].

O acompanhamento do extrato permite controlar o processo fermentativo, mais

precisamente a passagem da fermentação primária para maturação [22].

Durante a maturação é fundamental a monitorização do nível de diacetilo e

pentanodiona presente na cerveja verde. Representam o aroma mais importante da

cerveja, já que proporciona em altas concentrações aroma amargo, impuro e demasiado

adocicado. Tendo em conta que estes dois elementos se dissipam ao longo da

maturação, devido a quebra das dicetonas vicinais, o acompanhamento da sua evolução

é tido como critério fundamental para o término da fermentação com elevada qualidade

na cerveja final [22].

O não controlo da fermentação implicará a produção irregular de outros produtos

originários do metabolismo das proteínas e de açúcares por parte da levedura [27],

influenciando as características finais da cerveja de tal forma que a uniformização de

produtos para o mercado se torna impossível.

É fundamental verificar a evolução do maior produto de fermentação, o álcool, quer do

ponto de vista comercial quer do ponto de vista biológico e sensorial. A quantidade de

álcool caracteriza a cerveja quanto à sua força, sendo este parâmetro a base para a

atribuição de taxas monetárias sobre a cerveja [27]. Do ponto de vista biológico, a

presença deste produto em quantidades descontroladas poderá influenciar o


21

metabolismo da levedura, levando a uma redução da multiplicação celular [27, 31].

Torna-se importante observar a relação existente entre os açúcares e o etanol. Ou seja,

uma fermentação levada a cabo por leveduras saudáveis deverá ter uma relação inversa

entre estes elementos tal como observado em [32]. Sensorialmente, o não controlo do

etanol promove também alterações organoléticas, como variações da adstringência e

amargura provocada pelos polifenóis, diminuição na volatilidade e percetividade dos

ésteres em altas concentrações alcoólicas e variações na sensação de encorpado durante

a prova da cerveja [33].

Para além do álcool outros subprodutos também podem sofrer algumas variações:

Os ésteres dão um aroma frutado quando em concentrações apropriadas, pelo que em

quantidades elevadas provocam sabor exagerado a fruta ou a cerveja tipo ale [22, 26].

Os ácidos orgânicos da cerveja ao apresentarem importância no sabor, aroma e pH,

influenciarão as propriedades físicas finais, como estabilidade à turbidez não biológica,

a estabilidade do sabor, a suscetibilidade a alterações microbiológicas no caso da

diminuição de pH ao longo da fermentação. Caso ocorra aumento de pH, a perceção do

amargor é alterada [26].

Os álcoois superiores quando presentes em concentrações adequadas contribuem para o

sabor e aroma, colaborando de forma preponderante para o aroma alcoólico típico de

uma bebida fermentada. Contudo, se as concentrações forem demasiado elevadas

provocam alterações estruturais e sensoriais na cerveja, ou seja, reduzem a qualidade da

espuma da cerveja e podem induzir malefícios na saúde dos consumidores [26].

1.2.5 Aplicação da tecnologia de UV-VIS-SWNIR ao processo cervejeiro

1.2.5.1 Sonda

A aplicação prática desta tecnologia deve-se ao uso conjunto de um sistema

multivariado de monitorização com sensores de fibra ótica. Isto é possível graças aos

desenvolvimentos na área destas fibras, que torna viável a acoplação de sistemas de

fotónica miniaturizados de modo a recolher toda a informação espetral detalhada [34].A

leitura da evolução do processo cervejeiro é realizada através do contacto direto da

sonda com o interior do fermentador. Morfologicamente, estas apresentam dimensões

aproximadas entre 1-2.5 cm de diâmetro e 15-25 cm de comprimento. No seu interior


22

estão presentes fibras óticas, que conduzem a radiação

responsável pela análise da amostra [7].

Mediante o tipo de medição realizada, transmitância ou

refletância, e os processos e condições onde serão

introduzidas, as sondas poderão apresentar os formatos

da Figura 6. Por questões de manutenção, devem ser

fáceis de retirar do fermentador, de modo a limpar o

desgaste e fouling que fica acumulado no local de

análise [7].

1.2.5.2 Tratamento de dados

A leitura efetuada pela sonda provocará um grande conjunto de dados a analisar com

diversas variáveis presentes. Neste caso, os processos normais de tratamento estatístico

de uma só variável tornam-se inefetivos. A implementação de métodos quimiométricos

torna-se necessária, recorrendo a software para tratar toda a informação, permitindo a

rápida leitura dos dados. Com o tratamento e seleção de dados e com recurso ao

conhecimento de base teórica do processo cervejeiro, torna-se possível implementar

modelos multivariáveis que representam o perfil evolutivo dos metabolitos e substratos

no interior do fermentador. Desta forma, é possível prever e corrigir o comportamento

da fermentação, face às constantes perturbações que esta etapa sofre [35].

Os procedimentos usados encontram-se descritos na secção Materiais e Métodos.

1.2.6 Vantagens da espetroscopia UV-VIS-SWNIR

Comparativamente aos métodos mais tradicionais de retirada de amostras e envio para

análise em laboratório, a utilização desta tecnologia apresenta-se como vantajosa devido

às seguintes características [9, 35]:

Leitura rápida da amostra, dado que a manipulação da mesma é mínima;

Não necessita de pré-tratamento com reagentes, pelo que reduz custos analíticos

e tempo de amortização;

Técnica não destrutiva e não invasiva;

Devido à utilização de sondas e software adequado, a apresentação de resultados

é próxima do tempo real;

Figura 6 - Modelos de sondas segundo

o tipo de funcionamento que podem apresentar: (a) sonda de transmissão;

(b) sonda de transfletância; (c) sonda

ATR.


23

Avaliação a diversos metabolitos em simultâneo;

Avaliação física da amostra (viscosidade, densidade);

Tecnologia resistente dado não apresentar partes móveis;

Elevada sensibilidade devido à ação da fibra ótica;

Exatidão similar aos métodos tradicionais;

Precisão elevada, face à reduzida manipulação;

Tecnologia robusta, que pode ser submetida a condições adversas.


24


25

2 Material e métodos

2.1 Fermentação

Ao longo da atividade foram acompanhadas 147 fermentações de dois tipos de cerveja,

totalizando cerca de 1170 amostras analisadas. As cervejas analisadas foram a Super

Bock, 141 fermentações, e a respetiva cerveja preta, a Super Bock Stout, 6

fermentações. As amostras, cerca de 30 por dia, foram recolhidas maioritariamente

durante a manhã sendo depois armazenadas à temperatura de 5º C até ao momento de

análise. O volume de amostra necessário foi de 40-50 mL.

2.2 Análises fisico-químicas

As análises comparativas foram analisadas por

cromatografia gasosa com detetor de captura de

eletrões para medição do diacetilo [27, 36], e os

restantes parâmetros por intermédio do sistema de

análise de cerveja Alcolyzer Beer da Anton Paar,

Figura 7. Este aparelho, para além do trocador de

amostras, apresenta dois módulos de medição, um

para a densidade e outro para o nível de álcool da

cerveja, sendo possível realizar a análise completa num ciclo de medição [37].

No caso da medição do álcool o método usado é o processo patenteado (AT 406711; US

6,690,015) que tem como base a medição direta através da espetroscopia NIR. Pelo

densímetro é possivel obter os valores de densidades específicas, densidades simples e

concentrações [38]. Estas propriedades são obtidas e estão relacionadas devido à

presença de tabelas de conversão, assim como polinómios e fórmulas [39].

A medição do pH realizou-se através do pH metro instalado no sistema, enquanto a

quantificação da cor foi calculada através de espetroscopia de absorção e respetiva

conversão para escala de cor EBC [40].

Os parâmetros calculados foram álcool (% V/V e % m/m), OE (g/100 mL e % Plato),

RE (% m/m) e AE (g/100 mL e % m/m), densidade especifica, pH, cor EBC e

percentagem do grau de fermentação (ou atenuação) aparente e real. Para cada análise

Figura 7 - Alcolyzer Beer.


26

as cervejas foram inicialmente filtradas com Kieselguhr e desgasificadas, sendo

necessário um valor final de amostra de 40-50 mL.

2.3 Aquisição de espetros

A aquisição de espetros na região UV-VIS-SWNIR foi realizada através de

espetrómetro multicanal de fibra ótica Avantes (AvaSpec-2048-DT-4 (2048 pixel, 200-

1100 nm)) [41, 42]. Como fonte de luz de deutério e tungsténio foi usada a DH-2000-

BAL, permitindo a aquisição de informação proveniente da região entre 215-2500 nm

[43]. A estes dois aparelhos foi acoplada uma sonda de fibra ótica de transmissão em

imersão T300 – RT – 5 mm UV-VIS e VIS-NIR (200-1100 nm) [44]. A sonda foi

colocada em contacto com a cerveja a analisar através de um suporte que permite a

manutenção da posição horizontal durante as análises, Figura 8. Deste modo, previne-se

a deposição dos resíduos e biomassa presente na cerveja no microespelho da sonda. De

forma a controlar os dados gerados e o espetrómetro, este encontrava-se ligado a um

computador, sendo que todas as operações eram desenvolvidas através do software

AvaSoft versão 6.0 [41].

Antes de iniciar as análises das amostras deixou-se estabilizar as lâmpadas presentes na

fonte de luz. Para a estabilização da lâmpada de tungsténio (VIS-SWNIR) aguardou-se

15 minutos, enquanto que para a lâmpada de deutério (UV-VIS) se aguardou 20

minutos.

a) b) c)

e) d)

Figura 8 - Material usado nas análises: a) espetrómetro; b) sonda; c) fonte de luz; d)sistema

completo de análise; e) suporte de análise.


27

Após estabilização do equipamento iniciou-se o processo de análise da cerveja no UV-

VIS-SWNIR. A amostra foi colocada no tubo de análise onde se encontrava a sonda.

Face à presença de várias matérias suspensas e devido ao gás resultante da fermentação,

tornou-se necessário limpar a zona do microespelho, de modo a que o depósito não

influencie a leitura da amostra, deturpando assim o resultado final. De seguida, tapou-se

o suporte de amostragem de modo a que não ocorra influência de luz externa na

aquisição do espetro.

No software AvaSoft usou-se tecla de comando Start de modo a iniciar a análise da

amostra. Nesta primeira fase o espetro obtido, por norma, encontrou-se fora da escala

dos eixos apresentados, ou então exibiu-se com baixa amplitude ao longo do eixo dos

xx. Isto justifica-se pela quantidade de luz que chega ao espetrómetro . Deste modo,

deve-se ajustar o tempo de integração, através do comando Autoconfigure

Integrationtime para adequar a quantidade de luz envolvida. Como resultado deste

ajuste, o valor máximo de amplitude do espetro alcançado foi cerca de 14500 [41].

Realizado o ajuste e tendo um sinal estável desliga-se a fonte de luz de modo a poder

obter-se o espetro, Dark data. Este foi subtraído ao espetro que se pretende obter com a

luz ligada. O espetro Dark data é apenas uma linha horizontal que não reflecte nenhuma

informação sobre as amostras, pelo que é necessário subtrai-lo pois a sua presença

influencia a amplitude do espetro para todo o intervalo de comprimento de onda.

Com a luz novamente ativa o espetro foi retirado. Na atividade, por questões associadas

à repetibilidade, retiraram-se de forma consecutiva dez espetros por amostra. É um

processo automático, utilizando para tal a opção Autosave Spectra Periodically no menu

Setup. A temporização para aquisição do primeiro espetro, assim como o tempo de

espera entre dois espetros são dois parâmetros a definir nesta funcionalidade do

software. Nesta atividade o valor usado para ambos foi 1 s.

Após aquisição de espetros, através do software, estes foram convertidos para ficheiros

de texto, de modo a que a informação possa ser mais facilmente lida e manipulável.

Todos os passos mencionados e associados ao software foram usados para a aquisição

dos espetros na região UV-VIS, lâmpada deutério, e na região VIS-SWNIR, lâmpada de

tungsténio.


28

2.4 Análise multivariada

2.4.1 Pré-tratamento

Os dados obtidos sofreram um pré-processamento, Figura 9, que pode ser constituído

por cinco etapas com a seguinte ordem: filtração, integração de dados, escolha de dados

relevantes, normalização e estimação de dados em falta. Estes processos aplicam-se

para correção e/ou eliminação de dados com elevada discrepância da amostra, correção

de informação redundante, escolha das variáveis mais importantes para análise, tornar

todas as variáveis comparáveis face à mesma escala e criação de dados quando estes se

encontram em falta [35].

Na atividade, e tendo em conta a variação de propriedades da cerveja ao longo da

fermentação, não se utilizou o mesmo tempo de integração para a normalização de todas

as amostras na fermentação. Todo o intervalo espetral foi normalizado por EN=EO/TI,

(EN o espetro normalizado, EO o espetro original e TI o valor do tempo de integração)

sendo depois aplicado o filtro de Savitzky e Golay (comprimento=15, ordem=2) [45].

De seguida, os espetros foram transformados em absorvância pela equação,

, sendo I0 a intensidade do sinal de referência e I a intensidade do

sinal da amostra.

2.4.1.1 Correção robusta de espalhamento multiplicativo (RMSC)

A última fase do pré-tratamento foi a aplicação da correção robusta de espalhamento

multiplicativo (RMSC). Este método permite a separação e quantificação entre

diferentes tipos de variações físicas e químicas no espetro, assim como correção seletiva

de vários tipos de dispersão e variações indesejáveis [46] que se manifestam em

soluções como a cerveja em fermentação.

Cada espetro é corrigido por xcorr=xb+a=xref, sendo a e b calculados pela minimização

do erro ej = bxj+a-xref, onde xj é o espetro da amostra j e xref é o espetro de referência. O

RMSC baseia-se na aplicação do método robusto dos mínimos quadrados para

determinar as matrizes a e b assegurando que as áreas espetrais que não correspondem a

artefactos de dispersão não são tidos em consideração [47, 48].


29

2.4.2 Análise de componentes principais (PCA)

O uso de PCA é útil na análise de processos, permitindo selecionar as amostras para

colocação em grupos de calibração ou validação [49], assim como verificar se o ponto

final do processo foi atingido ou avaliar se o espetro obtido corresponde a um outlier ou

a um comportamento típico do processo em análise. Esta comparação é realizada

através da “biblioteca espetral”, sendo esta previamente construída e testada para cada

processo [7].

Esta técnica converte as variáveis originais em novas, denominadas componentes

principais (PC), reduzindo a dimensionalidade dos dados da amostra mas mantendo a

variância. O primeiro componente principal (PC1) representa o máximo da variância

total, enquanto o segundo (PC2) representa o máximo da variância residual. Estes dois

não são correlacionáveis. Esta transformação e atribuição de um valor constituinte da

mesma escala a todas as amostras, faz com que esta técnica seja útil na visualização e

interpretação de dados [35].

2.4.3 Regressão por mínimos quadrados parciais (PLSR)

O PLSR foi a metodologia de calibração multivariada usada para estabelecer a relação

quantitativa entre os espetros e a composição química da amostra [7], permitindo

associar o conjunto de dados multivariados Y a um valor de referência X pela equação

Y = X.B + e, sendo B o coeficiente de regressão e e o erro. Normalmente, o X

representa a tecnologia mais cara e com maior necessidade de tempo de preparação, e o

Y a tecnologia de menor custo e de grande produção de dados como a espetroscopia

UV-VIS-SWNIR [47].

É desenvolvido a partir de um conjunto de N de observações com KX variáveis e MY

variáveis, que foram agrupadas e formam as matrizes X e Y de dimensões (N*K) e

(N*M). A matriz X corresponde às variáveis de processo e a Y retrata as variáveis de

a) espetro original

800 820 840

08

00

00

(a)

Wavelength (nm)

Sig

na

l C

ou

nt

800 820 8400

80

00

0

(a)

Wavelength (nm)

Sig

na

l C

ou

nt

800 820 840

20

00

0

(a)

Wavelength (nm)

Sig

na

l C

ou

nt

b) filtro Savitzky e Golay c) RMSC

Figura 9 - Pré-tratamento de espetros.


30

qualidade de produto [35, 50, 51], sendo neste caso os dados das análises químicas

tradicionais e os dados espetrais, respetivamente.

O algoritmo tem como objetivo extrair as variáveis latentes de ambas as matrizes

recalculando-as continuamente, devido ao cálculo do peso correspondente de cada

variável e a processos de normalização, de modo a maximizar a covariância entre X e Y

[35, 50].

Os intervalos de confiança do PLS foram determinados de acordo com [52], e

considerou-se o limite de quantificação (LQ) como dez vezes o valor padrão do erro de

regressão.

2.4.4 Validação cruzada

De modo a verificar o comportamento dos modelos criados, foi realizada uma validação

quimiométrica recorrendo à validação cruzada. Este processo consiste na realização de

várias sub-calibrações a partir de amostras individuais ou segmentos de amostras.

Durante este processo as amostras, alternativamente, vão sendo deixadas fora da

construção da calibração de modo a serem usadas para validação do modelo, sendo

posteriormente calculado o valor médio da validação. Este processo desenvolve-se até

todas as amostras terem sido excluídas do processo de calibração [53].

Neste caso, a validação cruzada foi efetuada usando n-1 blocos, cerca de 90% dos

dados, ficando os restantes blocos para realizar a validação, cerca de 10% dos dados

totais. Os resultados dos modelos de calibração foram usados para o cálculo do PRESS

(soma dos quadrados dos resíduos previstos) através da equação ∑ ( )

, onde Yj

são os dados originais não usados após subtração da amostra i de validação, e a

previsão do modelo para a amostra j [47]. Deste modo, foi possível calcular a

distribuição estatística do critério PRESS para cada modelo, selecionando o número

mínimo de fatores de PLS [47, 54]. Os cálculos foram todos realizados através do

software R [55].

2.5 Cartas de controlo

Tendo em conta o volume de amostras conseguido do processo produtivo da cerveja

Super Bock, tornou-se possível avaliar se a fermentação decorreu em condições


31

controladas. As variáveis analisadas foram as mais características do processo, o AE e

álcool, para todas as fases da fermentação, e a evolução do diacetilo para a fermentação

secundária. Para este processo os dados foram divididos por etapas fermentativas

(aceleração; exponencial; desaceleração; estacionária) sendo a exponencial dividida em

intervalos de 10 h.

A ferramenta usada nesta atividade foi a construção de cartas de controlo de Shewart.

Através destas torna-se possível discriminar se a variabilidade existente, no processo

produtivo, está associada a variação por causas aleatórias (processo em controlo

estatístico) ou associada a variação por causas atribuíveis (processo fora de controlo)

[56].

Tendo em conta que as cartas foram construídas a partir de dados já existentes, o

método de cálculo adotado foi o exposto por [56] para cartas de controlo de , média, e

s, desvio-padrão, com amostras de tamanho variável. As linhas centrais destas cartas

foram calculadas por:

∑

∑

e

[∑ ( )

∑

]

sendo n o número de observações na amostra i, e m o número de amostras total. Os

limites de controlo para a carta de s foram calculados pelas equações,

enquanto para a carta de controlo foram

sendo A3, B3 e B4 constantes dependentes do tamanho da amostra (n). O processo de

cálculo foi realizado individualmente para todos os grupos de amostras existentes.


32


33

3 Resultados e Discussão

3.1 Monitorização do processo cervejeiro

O acompanhamento da fermentação cervejeira foi realizado de forma comparativa entre

o método de referência e espetroscopia UV-VIS-SWNIR para os parâmetros densidade,

extrato original, extrato aparente, álcool, pH, cor EBC, percentagem de atenuação

aparente e diacetilo. Os dados que se seguem foram os obtidos pelos métodos

tradicionais.

3.1.1 Evolução de extrato

3.1.1.1 Extrato original

Pela análise à qualidade do mosto antes da fermentação verificou-se que para a Super

Bock (SB) existem três grandes grupos, Figura 10. Por ordem de representatividade

decrescente verificou-se um intervalo entre 17 e 19.5 ºP, outro com valores entre 15.5 e

16.5 ºP enquanto o grupo mais pequeno apresentou valores próximos de 14 ºP. No caso

da Super Bock Stout (SBS) os valores distribuíram-se por um intervalo mais reduzido,

entre 16 e 17 ºP aproximadamente. Os valores envolvidos são normais para o tipo de

fermentação usada, a fermentação em mostos de altas concentrações, sendo de esperar

uma fermentação com maior quantidade de subprodutos [22].

Figura 10 - Valores de graus Plato para Super Bock, SB, e Super Bock Stout, SBS.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

0 50 100 150 200 250 300 350 400

ºP

Tempo (h) SB

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 100 200 300 400 500 600

ºP

Tempo (h) SBS


34

3.1.1.2 Extrato aparente e densidade

Como se verifica pela Figura 11, pode-se comprovar o comportamento apresentado na

introdução quanto à relação existente entre a obtenção do valor da densidade e o uso

desta, para posterior cálculo do valor do extrato da cerveja verde. O comportamento das

duas propriedades foi idêntico, variando apenas a escala de valores em que cada uma se

expressa. Deste modo, a análise centra-se na evolução do AE.

Verificou-se que as maiores concentrações de extrato encontrado na cerveja verde

situaram-se nos momentos iniciais. Nas primeiras 5 h foi possível encontrar valores

entre 20.77 e 16.38 g/100 mL para a SB. No caso da SBS, e devido ao número de

amostras inferior, o valor mais elevado obtido foi apenas às 23 h com 14.33 g/100 mL.

Após o início da fermentação verificou-se um rápido e acentuado consumo do extrato

pela levedura que se prolongou até, aproximadamente, as 100 h onde para a SB os

valores variaram entre os 6 e os 3 g/100 mL, enquanto a SBS o decréscimo foi até às 85

h para valores próximos de 4.5 g/100 mL.

O consumo de extrato está associado ao elevado crescimento celular durante a

fermentação, que pode resultar num aumento de biomassa até cinco vezes superior ao

inicial [27]. Este gasto energético deve-se à formação de novas substâncias celulares, à

receção e assimilação de substâncias do meio, à quebra e excreção de compostos e

transporte de substâncias dentro das células [22].

A taxa de consumo de extrato diminui após os momentos anteriormente referidos, sendo

esta redução constante em ambas as cervejas até cerca das 150 h. A partir deste

momento o consumo por parte da levedura estabiliza, sendo os valores finais obtidos

para SB próximos de 3.5 g/100 mL. Para SBS os valores finais obtidos foram reduzidos

e díspares, 3.26 e 4.64 g/100 mL, sendo portanto necessária maior quantidade de dados

para obter maior convergência.

A diminuição da taxa de consumo e consequente estabilização do extrato está associada

ao aumento da concentração de produtos do metabolismo que atingem concentrações

inibitórias para a atividade fermentativa e/ou à quantidade de nutrientes no meio ser

reduzida para valores que desaceleram a taxa de crescimento celular [27]. Entre esses

destaca-se o consumo das fontes de carbono e de azoto [57]. Um dos produtos que mais


35

influencia este comportamento é o álcool, sendo este explicado de forma mais detalhada

nas secções seguintes.

Figura 11 - Evolução do extrato aparente e densidade da cerveja verde da Super Bock, SB, e Super Bock

Stout, SBS, durante a fermentação.

A levedura ativa mecanismos de sobrevivência, poupando energia e utilizando outras

fontes para que possam manter ativas algumas vias metabólicas fundamentais para o seu

funcionamento. Como por exemplo, ocorre a utilização das reservas de fonte de

carbono, glicogénio, para produção de energia, assim como processos de produção

proteica que são reduzidos substancialmente. Só após o consumo total destes processos

é que as células entram em autólise [27].

Para além destes fatores, a posterior diminuição de temperatura para inicio da

maturação (aproximadamente pelas 150 h ), terá também beneficiado o comportamento

estável do extrato.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

0 100 200 300 400

EA

(g/1

00 m

L)

Tempo (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

0 100 200 300 400 500E

A (

g/1

00 m

L)

Tempo (h)

1

1,01

1,02

1,03

1,04

1,05

1,06

1,07

1,08

1,09

0 100 200 300 400

SG

Tempo (h)

1

1,01

1,02

1,03

1,04

1,05

1,06

1,07

1,08

1,09

0 100 200 300 400 500

SG

Tempo (h)

SB SBS

SBS SB


36

3.1.1.3 Grau aparente de fermentação (atenuação)

Tendo em conta que se analisou o AE, a percentagem de conversão de açúcares

fermentescíveis em etanol durante a fermentação será analisada pelo ADF%, estando o

comportamento destes relacionados.

Figura 12 - Evolução do ADF% da Super Bock, SB, e Super Bock Stout, SBS, durante a fermentação.

Pela Figura 12 o intervalo de maior conversão foi até às 80 h na SBS e às 100 h na SB.

Nesta salienta-se que até às 15 h a taxa de conversão foi menor quando comparada com

o restante intervalo. Verificou-se a diminuição da conversão até cerca das 150 h, em

ambas as cervejas, sendo que após este momento o ADF% estabilizou,

aproximadamente, entre 80 e 86% para SB e entre 70 e 78% para SBS até final da

maturação.

A rápida obtenção do valor final do ADF% poderá dever-se, em parte, ao tipo de

processo de fermentação usado, fermentação quente-maturação fria. Os valores obtidos

para SB vão de encontro ao pretendido para cervejas do tipo Pilsner, dado que se

encontram próximos do intervalo de 80 a 84% [22].

3.1.2 Evolução do álcool

Verificou-se pela Figura 13 que a partir do momento que se iniciou a fermentação, este

metabolito apresentou uma rápida evolução. Em ambas as cervejas, foi possível

verificar um aumento acentuado desde o instante zero, onde etanol ainda não tinha sido

produzido, até uma concentração nas 100 h entre 7 a 8.5% (v/v) e de 6.5 a 7% (v/v) para

SB e SBS, respetivamente. A partir deste momento ambas as cervejas diminuíram a taxa

de produção do álcool, sendo esse comportamento verificado com maior rapidez no

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400

AD

F %

Tempo (h)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300 400 500 600

AD

F %

Tempo (h) SB SBS


37

caso da SBS. Os valores obtidos ao longo e no final maturação estabilizaram num

intervalo de 8.2 a 9% (v/v) para SB e de 6.5 a 7.3% (v/v) para a SBS.

Esta evolução apresenta-se diretamente ligada à evolução do extrato. A Figura 11,

permite constatar que o forte crescimento da concentração de etanol ocorreu no mesmo

intervalo de tempo em que a concentração de extrato sofreu uma grande diminuição.

Figura 13 - Evolução dos valores de álcool durante a fermentação da Super Bock, SB, e Super Bock

Stout, SBS.

Nesta etapa o álcool é produzido a partir do metabolismo dos diferentes açúcares que a

levedura vai transportando para o seu interior [21, 22, 27, 32]. Aqui após glicólise é

gerado o piruvato, que devido à ação da enzima piruvato descarboxilase é convertido a

acetaldeído. Por fim, este ainda é reduzido pela álcool desidrogenase, resultando como

produto final o etanol [21, 22, 27]. Como parâmetros importantes na manutenção deste

percurso metabólico, está o facto de se ter realizado em condições anaeróbias [22] e da

concentração de glucose no extrato situar-se acima dos 0.2% (m/m), impedindo deste

modo a ativação do processo de respiração metabólica com consequente degradação do

etanol [27].

Tal como referido anteriormente, a partir das 100 h a produção do álcool diminui até

estabilizar. Esta redução poderá ter como causa a possível inibição das células devido à

presença de quantidades crescentes de álcool [27, 31, 32]. Esta inibição poderá

materializar-se em mecanismos celulares como desnaturação de enzimas internas,

efeitos mutagénicos no DNA mitocondrial [27] e alteração da fluidez e morfologia da

superfície celular [22, 31]. As alterações na membrana consistem, entre outras, na

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Álc

ool

(v/v

)

Tempo (h)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 100 200 300 400 500 600

Álc

ool

(v/v

)

Tempo (h)

SB SBS


38

inibição de transporte membranar [27] influenciando os fenómenos de absorção e

excreção celular, enquanto nas enzimas ocorre uma diminuição da conversão de

açúcares como frutose e glucose [32].

Para além destes efeitos bioquímicos que deverão ter estado na origem da diminuição

do álcool, a alteração processual para fermentação secundária, com a diminuição de

temperatura de operação, permitiu a estabilização destes valores até ao final do

processo, dado não estar à temperatura ótima [25, 27].

3.1.3 Evolução de pH

Para a cerveja Super Bock verifica-se que o valor inicial foi, aproximadamente, 4.8

sofrendo este valor uma pequena diminuição até cerca de 4.2 ao final das primeiras 50 h

de fermentação. A partir deste momento o valor de pH manteve-se com flutuações

baixas até ao final da fermentação. O mesmo se passou com Super Bock Stout, sendo

que o valor inicial nesta foi mais baixo, pH de 4.5, e a constância de valores foi

alcançada mais tarde, pelas 75 h. Verificou-se que entre a passagem de fases da

fermentação não ocorreram flutuações de pH, Figura 14.

Figura 14 - Evolução de pH durante a fermentação da cerveja verde da Super Bock, SB, Super Bock

Stout, SBS.

Este comportamento presenciado em ambas as cervejas está associado à fase

exponencial de crescimento da levedura onde acontecem os diversos fenómenos que

provocam a diminuição do pH. Podem-se destacar a formação de ácidos orgânicos por

desaminação [22, 25], o uso dos iões de fosfato primário pela levedura, a absorção de

3,5

3,8

4,1

4,4

4,7

5,0

5,3

0 50 100 150 200 250 300 350 400

pH

Tempo (h)

3,5

3,8

4,1

4,4

4,7

5

0 100 200 300 400 500

pH

Tempo (h) SB SBS


39

iões potássio [22] e NH2 pela levedura e a libertação para o meio de iões de hidrogénio

[22, 58].

O valor final de pH alcançado, entre 4.4 a 4.1, permite tirar algumas conclusões sobre

os processos subsequentes e a qualidade da cerveja. Deste modo, é expectável a

ocorrência de precipitação acelerada de complexos coloidais instáveis proteína-

polifenóis, uma maturação mais rápida com uma estabilidade e sabor da cerveja final

superior. Para além disso, informa que fenómenos como acidificação proveniente de

autólise das leveduras ou da contaminação durante a fermentação não ocorreram [22].

3.1.4 Evolução da cor

Pela análise da Figura 15 verificou-se que ao longo da fermentação da Super Bock

ocorreu uma pequena diminuição da cor. Inicialmente a coloração da cerveja situava-se,

predominantemente, no intervalo de 11 a 18 unidades EBC, sendo este diminuído para

uma amplitude entre 11 a 16 unidades a partir das 150 h. Fora deste comportamento,

verificou-se a existência de alguns valores compreendidos entre 18 a 23 unidades EBC,

contudo tendo em conta a baixa representatividade na amostra total, poderá auferir-se

que a sua origem poderá estar associada a variações pontuais no processo produtivo ou

de análise.

Figura 15 - Evolução da cor, unidades EBC, durante fermentação da cerveja Super Bock, SB, e Super

Bock Stout, SBS.

Quanto à Super Bock Stout a coloração apresentada foi muito elevada situando-se num

intervalo de valores de 220 a 310 unidades EBC. Não existe um comportamento muito

bem delineado, contribuindo para isso o baixo número de amostras.

02468

1012141618202224

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Un

idad

es E

BC

Tempo (h) SB

0

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

0 100 200 300 400 500 600

Un

idad

es E

BC

Tempo (h) SBS


40

A partir destes dados conclui-se que a cor não é um parâmetro que sofra grandes

alterações ao longo da fermentação, indo de encontro ao teoricamente expectável, sendo

que os responsáveis pela formação e manutenção desta são o caramelo e melanoidinas

presentes no malte e adjuntos, que são libertados e produzidos durante os processos de

secagem, moagem e ebulição do mosto [25, 27].

Embora a diminuição da cor não seja muito acentuada na Super Bock, este

comportamento poderá estar associado à descoloração, de algumas substâncias, causada

pela diminuição de pH e pela adsorção de substâncias coloridas nas células de levedura

ou precipitação no fundo do tanque [22, 59].

A diferença de valores de coloração entre cervejas está diretamente associado ao tipo de

cervejas analisadas. No caso da Super Bock, dado tratar-se de uma cerveja do tipo

Pilsner apresenta coloração clara, enquanto a Stout devido à presença de malte torrado e

de malte especial como o de Chocolate [25, 60] a cerveja apresenta uma coloração

escura e pouco transparente [27] levando a valores superiores a 60 unidades EBC [25].

3.1.5 Evolução do diacetilo

Na Figura 16 observa-se a evolução do parâmetro controlador da extensão da maturação

[22, 25, 61]. Embora todos os dados do diacetilo, preferencialmente, tenham sido

retirados nesta fase, no caso da cerveja SB foi possível analisar alguns valores deste

subproduto no início da fermentação. Os valores elevados verificados estão associados à

conversão não enzimática do α-acetolactato presente no meio em diacetilo [22, 27, 62,

63]. Uma das razões para estes valores elevados será a diminuição do pH, como se pode

confirmar pela Figura 14, que proporciona uma rápida conversão [22, 27].

Foi possível verificar que o início da maturação decorreu, aproximadamente, às 140 h

para a SB e às 145 h para a SBS. O início da maturação ocorreu após estabilização do

AE para valores próximos de 3 e 4.5 g/100 mL, para SB e SBS respetivamente, Figura

11. Os valores iniciais de diacetilo foram de 0.15 a 0.43 mg/L para SB e de 0.6 a 0.78

mg/L para SBS. Esta fase marca alterações processuais tendo sido diminuída a

temperatura de fermentação de 12 a 14 ºC para cerca de 7 ºC, fermentação quente-

maturação fria [22].


41

Ao longo da maturação a evolução do diacetilo foi decrescente. O último ponto

analisado para SB foi às 358 h com uma concentração de diacetilo de 0.073 mg/L.

Contudo, o intervalo de término de maior predominância para SB situou-se entre as 300

a 330 h, período no qual o valor estabiliza e se mantêm inferior ou igual à concentração

pretendida de 0.07 mg/L. Este valor será reduzido, posteriormente, devido ao processo

de diluição, característico da fermentação em mostos de alta concentração.

Figura 16 - Evolução do diacetilo durante a maturação da cerveja Super Bock, SB, e Super Bock Stout,

SBS.

Para o caso da SBS o último ponto analisado foi às 576 h com um valor de 0.188 mg/L,

sendo este referente a uma maturação que ainda se encontrava em fermentação no final

da atividade. Tal como observado em outras fermentações desta cerveja, entre as 300 e

400 h o valor de diacetilo inferior a 0.15 mg/L foi alcançado, sendo este comportamento

mais expectável. A diferença de durações pode ser explicada pela possível

contaminação da fermentação por Pediococcus, que permite manter concentrações

elevadas de diacetilo [27, 64], assim como a possível baixa concentração de levedura

viável [22].

Os valores finais de diacetilo obtidos encontram-se abaixo do limite de perceção deste

composto, já que devem ser inferiores a 0.15 mg/L, fornecendo assim um sabor a malte.

Caso este valor seja ultrapassado prevalece o sabor amanteigado [27, 61]. Deste modo,

pode-se considerar que se foi eliminado o sabor do diacetilo, os restantes aromas

indesejáveis da cerveja a fermentar também o foram [22]. A diferença de concentrações

entre cervejas justifica-se pelos diferentes tipos, sendo normal os valores superiores para

o tipo Stout [27].

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

11,11,21,31,4

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Dia

ceti

lo (

mg/L

)

Tempo (h) SB

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 100 200 300 400 500 600

Dia

ceti

lo (

mg/L

)

Tempo (h) SBS


42

Esta diminuição do diacetilo ocorre devido à re-assimilação pela levedura, que no seu

interior é convertida a acetoína e depois a 2,3 butanodiol [22, 25, 27, 62]. As enzimas

envolvidas são a 2,3 butanodiol desidrogenase e algumas ceto redutases [27, 62]. Estes

novos compostos da cerveja, como apresentam elevados limites de perceção não são um

perigo para a cerveja final [22, 62].

Foi possível verificar que à medida que a maturação decorre o valor de diacetilo

apresenta uma variação, conversão cada vez menor. Isto poderá estar associado à perda

de viabilidade da levedura, mais precisamente à perda de competência da membrana,

que deixa de conseguir reabsorver o diacetilo [27].

3.2 Cartas de controlo

As cartas calculadas para as variáveis definidas encontram-se apresentadas na secção

Anexos. A partir destas foi possível verificar a existência de alguns pontos superiores

aos limites, sugerindo que o processo fermentativo se encontra fora de controlo [56, 65]

na respetiva fase. Entre esses pontos podem-se destacar os instantes t=214 h para o

álcool, t=169 h e t=173 h para o diacetilo e o t=143 h para o AE, todos eles obtidos

pelas cartas das médias.

Para além das irregularidades verificadas nas fases acima citadas foi também visível a

existência de comportamentos não aleatórios em grande parte das fases analisadas.

Entre esses podem-se citar alguns como: o comportamento verificado para o diacetilo e

álcool na fase estacionária, onde os valores apresentam uma evolução, tendência ao

longo do tempo; a existência de séries de pontos consecutivos do mesmo lado da linha

central como no caso do AE e álcool na fase de desaceleração; a estratificação dos

pontos em torno da linha média central como em alguns intervalos da fase exponencial.

Alguns destes comportamentos também se verificaram na análise das cartas de s [56,

65].

Face ao elevado grau de defeitos enunciado pelos resultados, seria de esperar um

produto final com elevada heterogeneidade e fraca qualidade, algo que não se verificou

na realidade. Deste modo, deve-se considerar que as cartas de controlo de Shewart não

serão o melhor procedimento para este tipo de dados, mais precisamente dados

dependentes, auto correlacionados e com variáveis associadas entre si [56].


43

3.3 Calibrações multivariadas

Pela metodologia de PCA foi possível obter a distribuição de amostras presentes na

Figura 17. As imagens representam as amostras usadas para o cálculo das calibrações de

todos os parâmetros, à exceção do diacetilo para SB e do diacetilo e cor para SBS.

Em todas as análises foi verificado que as duas componentes principais calculadas

representam a quase totalidade da variância dos dados multivariados, destacando-se a

PC1que quase totaliza 100% da variância. A distribuição de pontos para ambas as

cervejas e regiões espetrais adquiriu forma de elipse, sendo visível uma clara

distribuição ao longo da PC1 quanto ao tempo de amostragem de cada análise.

SBS (VIS-SWNIR)

SBS (UV-VIS)

SB (VIS-SWNIR)

Figura 17 - Perfis do PCA para Super Bock e Super Bock Stout na região UV-VIS e VIS-SWNIR.

SB (UV-VIS)


44

Para SB verificou-se que o valor desta componente aumentou à medida que a

fermentação decorreu, atingindo o valor máximo em amostras da fase exponencial e/ou

desaceleração fermentativa. A partir deste momento ocorreu um decréscimo contínuo

para valores inferiores aos iniciais.

Este tipo de evolução poderá estar associado à biomassa (variável não estudada nesta

atividade). Quanto à distribuição do PC2, verificou-se uma separação bem definida

entre amostras dos momentos iniciais da fermentação, das amostras finais da fase

exponencial e das fases subsequentes. Esta separação poderá justificar-se pela evolução

do extrato na cerveja verde.

g)

16 17 18 19

16

18

20

Ytable[, Comp], 8 comps, validation

measured

pre

dic

ted

0 2 4 6 8

-50

51

0


measured

pre

dic

ted

4.2 4.4 4.6 4.8

4.0

4.4

4.8


measured

pre

dic

ted

0 20 40 60 80

05

0


measured

pre

dic

ted

5 10 15 20

-10

10

30


measured

pre

dic

ted

12 13 14 15 16

10

12

14

16


measured

pre

dic

ted

0.1 0.3 0.5

0.0

0.2


measured

pre

dic

ted

a) b)

c) d)

e) f)

Figura 18 - Calibrações do PLS para Super Bock no VIS-SWNIR para: a) °Plato; b) álcool; c) ADF%;

d)pH; e) cor; f) extrato aparente; g) diacetilo.


45

Na análise por PCA da Stout verificou-se que no VIS-SWNIR o perfil obtido

assemelha-se ao da SB, com exceção dos valores de PC2 para as amostras obtidas perto

do final da fermentação. No UV-VIS a distribuição foi muito diferente das restantes,

dado que os maiores valores de PC1 foram para amostras com tempos de amostragem

superiores e vice-versa.

Tal como observado na Figura 9 os espetros da análise da cerveja apresentam

espalhamento significativo. Como consequência este espalhamento apresenta dois

efeitos nos espetros, ou seja, ao proporcionar o aumento da perda de fotões promove

uma mudança no espetro de absorvância e quanto mais um fotão se difunde, maior será

a sua probabilidade ser absorvido. Estes fenómenos, associados ao comprimento de

onda, modificam a forma do espetro [66].

b) a)

0.1 0.3 0.5

0.00

0.15


measured

pred

icte

d

16 17 18 19

15

17

19

21


measured

pre

dic

ted

0 2 4 6 8

05

15


measuredp

red

icte

d

0 20 40 60 80

01

00


measured

pre

dic

ted

4.2 4.4 4.6 4.8

3.8

4.2

4.6


measured

pre

dic

ted

12 13 14 15 16

11

13

15


measured

pre

dic

ted

5 10 15 20

-10

10


measured

pre

dic

ted

c) d)

e) f)

g)

Figura 19 - Calibrações do PLS para Super Bock no UV-VIS para: a) ºPlato; b) álcool; c) ADF%; d)pH;

e) cor; f)extrato aparente; g) diacetilo.


46

Este espalhamento deveu-se às propriedades altamente dispersivas e ao caráter

heterogéneo do mosto cervejeiro. Mais precisamente, pode ser causado pela presença de

pequenas partículas [49] como o caso da biomassa, acumulação das partículas na sonda

[34, 47] e pela presença de bolhas de CO2 resultantes da fermentação [67].

Este comportamento foi visível nos espetros de ambas as regiões em todo o intervalo de

comprimentos de onda, e tendo em conta que altera os valores de variância, e por

conseguinte a análise química do espetro [34], a robustez das calibrações a efetuar são

muito afetadas, devido à sensibilidade a este tipo de variações [66]. Deste modo, a todas

as amostras analisadas foram aplicadas técnicas de pré-tratamento para correção de

espetros, como o algoritmo RMSC. Contudo, mesmo não sendo possível remover todo o

b)

4.1 4.3 4.5

4.05

4.20

4.35


measured

pred

icte

d

220 260 300

24

03

00


measured

pre

dic

ted

16.0 16.6 17.2

16.2

16.6

17.0


measured

pred

icte

d

4 6 8 12

24

68


measured

pred

icte

d

20 40 60 80

5570

85


measured

pred

icte

d

2 4 6

5.0

6.5

8.0


measured

pred

icte

d

0.1 0.3 0.5 0.7

0.0

0.2

0.4


measured

pre

dic

ted

g)

a)

c) d)

Figura 20 - Calibrações do PLS para Super Bock Stout no VIS-SWNIR para: a) ºPlato; b) álcool; c)

ADF%; d)pH; e)cor; f) extrato aparente; g) diacetilo.

f) e)


47

espalhamento presente, este não influenciou de forma decisiva as regressões PLS já que

a variação da absorvância foi superior ao espalhamento [47].

Os parâmetros estatísticos das regressões do PLS para ambas as cervejas estão presentes

nas Tabelas 4, 5, 6 e 7. Os valores de R2 para Super Bock apresentaram-se todos com

valores inferiores a 0.65 enquanto a Stout, com exceção da cor, apresentou valores

inferiores a 0.45.

Os parâmetros com melhor resultado para SB estiveram associados ao comportamento

do extrato no mosto em fermentação, na forma de AE e ADF, álcool e pH. Estes

parâmetros apresentaram R2 próximos de 0.6. Quanto à comparação entre dados de

diferentes regiões espetrais, não foi possível constatar o mesmo que [47], onde a região

a) b)

4.1 4.2 4.3 4.4 4.5

4.1

04

.25


measured

pre

dic

ted

2 3 4 5 6 75

.06

.5


measured

pre

dic

ted

220 260 300

22

02

80

34

0


measured

pre

dic

ted

4 6 8 10 12 14

35

7


measured

pre

dic

ted

20 30 40 50 60 70 80

55

65

75

85


measured

pre

dic

ted

16.0 16.4 16.8 17.2

16

.21

6.8


measured

pre

dic

ted

0.1 0.3 0.5 0.7

-0.1

0.2

0.5


measured

pre

dic

ted

Figura 21 - Calibrações do PLS para Super Bock Stout no UV-VIS para: a) °Plato; b) álcool; c) ADF%;

d) pH; e) cor; f) extrato aparente; g) diacetilo.

f)

d)

e)

c)

g)


48

VIS-SWNIR apresenta, quer na calibração e percentagens de variância quer em limites

de deteção, valores superiores ao UV-VIS. Contudo, tal como [47] os dados

apresentaram, aproximadamente, o mesmo tipo de relação quanto ao número de

decomposições espetrais, sendo o número de fatores (nPC), inferiores para VIS-

SWNIR, podendo-se concluir que esta região poderá conter informação melhor

correlacionada com os parâmetros em estudo.

Tabela 4 - Estimativas do modelo de regressão por mínimos quadrados parciais para Super Bock no VIS-

SWNIR.

Dados Variância % PRESS Erro LQ R2

°Plato Bloco X 100 5.3725×103 2.4432 24.4324 0.1637

8 nPC Bloco Y 24.91

Álcool Bloco X 100 2.5676×104 5.3412 53.3412 0.6250

7 nPC Bloco Y 66.42

ADF% Bloco X 100 2.4537×106 52.2141 522.1405 0.6360

7 nPC Bloco Y 67.39

pH Bloco X 100 1.0916×102 0.3483 3.4826 0.5829

9 nPC Bloco Y 65.40

Cor Bloco X 100 6.0982×103 2.6030 26.0304 0.2203

8 nPC Bloco Y 29.96

EA Bloco X 100 9.4584×104 10.2515 102.5148 0.6182

7 nPC Bloco Y 67.53

Diacetilo Bloco X 100 92.4648 0.1840 1.8404 0.1094

9 nPC Bloco Y 18.18


VIS.


°Plato Bloco X 100 4.9419×103 2.3433 23.4329 0.3620

9 nPC Bloco Y 41.65

Álcool Bloco X 100 3.1858×104 5.9496 59.4963 0.5850

8 nPC Bloco Y 61.50

ADF% Bloco X 100 3.2667×106 60.2467 602.4665 0.5850

9 nPC Bloco Y 63.82

pH Bloco X 100 1.1180×102 0.3525 3.5245 0.6250

10 nPC Bloco Y 68.58

Cor Bloco X 100 5.2906×103

2.4245 24.2454 0.3710

8 nPC Bloco Y 39.97

EA Bloco X 100 1.1695×105 11.3995 113.9945 0.5870

8 nPC Bloco Y 61.73


6 nPC Bloco Y 11.68


49

Ao contrário da SB, na SBS foi possível identificar que a região UV-VIS apresenta

melhores calibrações para todos os parâmetros sendo o R2 sempre superior a 0.29,

enquanto no VIS-SWNIR ocorreram valores inferiores a 0.20. Estes dados contrariam a

informação que o VIS-SWNIR é a região com melhores resultados [47].

Tabela 6 - Estimativas do modelo de regressão por mínimos quadrados parciais para Super Bock Stout no

VIS-SWNIR.


°Plato Bloco X 100 3.0062×102 0.6963 6.9633 0.1993

8 nPC Bloco Y 25.08

Álcool Bloco X 100 5.6507×103

3.0189 30.1894 0.3622

9 nPC Bloco Y 39.47

ADF% Bloco X 100 6.9455×105 33.4701 334.7013 0.3546

9 nPC Bloco Y 37.92

pH Bloco X 100 34.6139 0.2363 2.3628 0.2735

9 nPC Bloco Y 33.97

Cor Bloco X 100 7.2855×105 44.9862 449.8620 0.7275

8 nPC Bloco Y 79.77

EA Bloco X 100 2.1262×104 5.8561 58.5611 0.3388

9 nPC Bloco Y 36.65


8 nPC Bloco Y 33.18


VIS.


°Plato Bloco X 100 3.9921×102 0.8024 8.0243 0.3492


Álcool Bloco X 100 5.9266×103 3.0918 30.9176 0.4087


ADF% Bloco X 100 6.6455×105 32.7393 327.3927 0.3818

9 nPC Bloco Y 39.95

pH Bloco X 100 49.3248 0.2821 2.8206 0.2904


Cor Bloco X 100 9.5257×105 51.4395 514.3948 0.8139


EA Bloco X 100 2.0377×104 5.7329 57.3288 0.3674

9 nPC Bloco Y 38.62


9 nPC Bloco Y 50.74

Na Stout a variável com melhor R2 foi a cor, contudo este resultado poderá estar

associado à utilização de um procedimento diferente do usado para SB, ou seja, diluição


50

da cerveja e medição da absorvância com posterior correspondência para a escala de cor

EBC. Sobre este tipo de cerveja verifica-se relação semelhante à SB quanto à

decomposição espetral.

Entre os resultados dos dois tipos de cerveja foi possível verificar que a tecnologia em

causa apresentou-se mais adequada para a cerveja do tipo SB do que a SBS, tendo

contribuído para isso a diferença do número de amostras usadas. Nas calibrações das

Figuras 18, 19, 20 e 21 verificou-se elevada dispersão para alguns pontos de

amostragem, sendo as causas para tal comportamento referidas anteriormente.


51

4 Conclusão

Na atividade, a partir das análises em meio industrial confirmou-se a evolução das

diversas variáveis ao longo da fermentação. Face ao comportamento não estacionário de

algumas variáveis concluiu-se a importância destas para o controlo do processo

fermentativo, destacando-se desde logo o papel de monitorização e controlo do AE, para

a fermentação primária, e do diacetilo para a fermentação secundária. Tendo em conta

este comportamento e a correlação existente intra e intervariáveis verificou-se a não

adequação das cartas de controlo de Shewart para o processo fermentativo.

Sobre a aplicação da tecnologia UV-VIS-SWNIR embora os resultados não sejam os

ideais, foi possível verificar correlação entre os dados da tecnologia que foi testada e

dos processos clássicos, permitindo declarar que a utilização da tecnologia UV-VIS-

SWNIR apresenta-se como bastante promissora na implementação e controlo de

processos biológicos. No caso em concreto, e tendo em conta os resultados e as

propostas de melhoria declaradas mais à frente, esta tecnologia apresenta grandes

perspetivas na monitorização das variáveis fundamentais do processo cervejeiro, como

o caso do AE, o álcool e o pH. No que toca à fermentação secundária, o modelo não se

demonstrou muito viável, dado os baixos valores obtidos para diacetilo.

Os processos usados para tratamento do ruído e do espalhamento espetral foram

aplicados satisfatoriamente, permitindo remover grande parte destes fatores. Contudo,

de modo a chegar a valores superiores de correlação algumas melhorias devem ser

aplicadas quer à fase quimiométrica do processo quer à metodologia de análise.

Quanto à quimiometria pode-se sugerir a aplicação de métodos que permitam melhorar

a interpretação entre as relações químicas e espetros, como por exemplo a combinação

da informação da região UV-VIS e VIS-SWNIR através da análise multibloco PLSR e a

aplicação de transformada de Fourier para compressão e modelação de espetros,

permitindo melhor interpretação da variância espetral durante os processos biológicos.

Sobre a metodologia, podem ser efetuadas alterações na sonda, usando para tal uma

sonda de reflexão total atenuada para melhoria de sinal em meios altamente densos.


52


53

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58


59

Anexos

Parâmetros das cartas de controlo

Tabela 8 - Fatores utilizados para o cálculo dos limites das cartas de controlo dos valores médios, , e dos

desvios, s, de acordo com o número de observações, n, de cada uma das amostras usadas.

Carta para médias Carta para desvios-padrão

n A3 B3 B4

2 2.659 0 3.267

3 1.954 0 2.568

4 1.628 0 2.266

5 1.427 0 2.089

6 1.287 0.030 1.970

7 1.182 0.118 1.882

8 1.099 0.185 1.815

9 1.032 0.239 1.761

10 0.975 0.284 1.716

11 0.927 0.321 1.679


60

Cartas de controlo

Fase de aceleração

Extrato aparente (g/100 mL)


de aceleração.

5.1.1.1 Álcool (v/v)


aceleração.

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5

x

Tempo (h)

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5

s

Tempo (h)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

3,5 5,5 7,5 9,5 11,5

x

Tempo (h)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5

s

Tempo (h)


61

Fase exponencial

Extrato aparente (g/100ml)

.


exponencial.

15,0

15,5

16,0

16,5

17,0

17,5

18,0

18,5

19,0

19,5

20,0

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

x

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

s

Tempo (h)

13

14

15

16

17

18

19

20

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

x

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

s

Tempo (h)

9

11

13

15

17

19

32 33 34 35 36 37 38 39 40

x

Tempo (h)

0

1

2

3

4

5

6

32 33 34 35 36 37 38 39 40

s

Tempo (h)


62


exponencial.

9

10

11

12

13

14

15

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

x

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

s

Tempo (h)

4

6

8

10

12

14

16

51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

x

Tempo (h)

0

1

2

3

4

5

6

7

52 53 54 55 56 57 58 59 60

s

Tempo (h)

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

x

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

s

Tempo (h)


63


exponencial.

4

5

6

7

8

9

10

11

70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

x

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

s

Tempo (h)

1

3

5

7

9

11

13

80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90

x

Tempo (h)

0

1

2

3

4

5

6

7

80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90

s

Tempo (h)

1

3

5

7

9

11

13

90 91 92 93 94 95 96 97

x

Tempo (h)

0

1

2

3

4

5

6

90 91 92 93 94 95 96 97

s

Tempo (h)


64

Álcool% (v/v)


exponencial.

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

x

Tempo (h) -0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

s

Tempo (h)

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

x

Tempo (h) -0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

s

Tempo (h)

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

x

Tempo (h)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

s

Tempo (h)


65


exponencial.

3,0

3,2

3,4

3,6

3,8

4,0

4,2

4,4

4,6

4,8

5,0

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

x

Tempo (h)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

s

Tempo (h)

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

x

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

s

Tempo (h)

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

x

Tempo (h)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

s

Tempo (h)


66


exponencial.

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

x

Tempo (h)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

s

Tempo (h)

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

81 82 83 84 85 86 87 88 89 90

x

Tempo (h)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

81 82 83 84 85 86 87 88 89 90

s

Tempo (h)

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

91 92 93 94 95 96 97

x

Tempo (h)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

91 92 93 94 95 96 97

s

Tempo (h)


67

Fase de desaceleração



de desaceleração.

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

98 102 106 110 114 118 122 126 130 134 138 142

x

Tempo (h)

-0,2

0,1

0,4

0,7

1,0

1,3

1,6

1,9

2,2

2,5

2,8

3,1

3,4

98 102 106 110 114 118 122 126 130 134 138 142

s

Tempo (h)


68

Álcool% (v/v)


desaceleração.

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

9,5

98 102 106 110 114 118 122 126 130 134 138 142

x

Tempo (h)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

98 102 106 110 114 118 122 126 130 134 138 142

s

Tempo (h)


69

Fase estacionária



estacionária.

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

x

Tempo (h)

-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1,7

1,9

140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

s

Tempo (h)


70

Álcool% (v/v)


estacionária.

7,3

7,5

7,7

7,9

8,1

8,3

8,5

8,7

8,9

9,1

9,3

140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

x

Tempo (h)

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

s

Tempo (h)


71

Diacetilo (mg/L)

Figura 34 - Cartas de controlo dos valores médios, , e desvios, s, para o diacetilo durante a fase

estacionária.

-0,03

0,00

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0,18

0,21

0,24

150 200 250 300

x

Tempo (h)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

150 170 190 210 230 250 270 290

s

Tempo (h)

José Filipe Gonçalves Maciel usados para o cálculo de perfis fermentativos por PCA e por fim para...

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