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Universidade Federal da Bahia Faculdade de Farmácia Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos Mestrado em Ciência de Alimentos OBTENÇÃO DE NANOFIBRAS VIA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE POLPA DE EUCALIPTO POR CELULASES DE Aspergillus niger E PRODUÇÃO DE BIOMASSA EXTRACELULAR POR FUNGO ISOLADO DE CACAU JOSILEIDE GONÇALVES BORGES Salvador 2012

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  • Universidade Federal da Bahia Faculdade de Farmcia

    Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos Mestrado em Cincia de Alimentos

    OBTENO DE NANOFIBRAS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DE POLPA DE EUCALIPTO POR CELULASES DE Aspergillus niger E PRODUO DE BIOMASSA EXTRACELULAR POR FUNGO ISOLADO DE CACAU

    JOSILEIDE GONALVES BORGES

    Salvador

    1

    2012

  • JOSILEIDE GONALVES BORGES

    OBTENO DE NANOFIBRAS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DE POLPA DE EUCALIPTO POR CELULASES DE Aspergillus niger E PRODUO DE BIOMASSA EXTRACELULAR POR FUNGO ISOLADO DE CACAU

    2

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em Cincias de Alimentos, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obteno do grau de Mestre em Cincia de Alimentos.

    Orientadora: Prof. Dr. Janice Izabel Druzian

    Co-orientadora: Prof. Dr Alase Guimares

    Salvador

    2012

  • TERMO DE APROVAO

    JOSILEIDE GONALVES BORGES

    OBTENO DE NANOFIBRAS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DE POLPA DE EUCALIPTO POR CELULASES DE Aspergillus niger E PRODUO DE BIOMASSA EXTRACELULAR POR FUNGO ISOLADO DE CACAU

    DISSERTAO APROVADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENO DO GRAU DE MESTRE EM CINCIA DE ALIMENTOS, UNIVERSIDADE FEDERAL DA

    BAHIA, PELA SEGUINTE BANCA EXAMINADORA:

    Prof. Dr. Hlio Kamida______________________________________________________

    Doutor em Cincia de Alimentos (UNICAMP)

    Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS)

    Prof. Dr. Giovani Brando Mafra de Carvalho____________________________________

    Doutor em Biotecnologia Industrial (USP)

    Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS)

    Prof. Dra. Janice Izabel Druzian Orientadora_________________________________

    Doutora em Cincias de Alimentos (UNICAMP)

    Universidade Federal da Bahia (UFBA)

    Salvador, 25 de maio de 2012.

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  • 4

    O que sabemos uma gota, o que ignoramos um oceano.

    Isaac Newton

    De tudo ficaram trs coisas: A certeza de que estava sempre comeando, a certeza de que era preciso continuar, e a certeza de que seria interrompido antes de terminar!

    Fernando Sabino

    Tua caminhada ainda no terminou... A realidade te acolhe dizendo que pela frente

    o horizonte da vida necessita de tuas palavras e do teu silncio.

    No faas do amanh o sinnimo de nunca,

    nem o ontem te seja o mesmo que nunca mais.

    Teus passos ficaram. Olhes para trs... mas v em frente pois h muitos que precisam

    que chegues para poderem seguir-te.

    Charles Chaplin

  • AGRADECIMENTOS

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    Quero aqui expressar os meus agradecimentos a todos os que me apoiaram,

    encorajaram e ajudaram ao longo deste projeto.

    Universidade Federal da Bahia, ao Instituto de Qumica e ao Programa de Ps-

    Graduao em Cincias dos Alimentos pelo apoio realizao deste trabalho.

    As professoras Dr Janice Druzian e Dr Alase pela orientao e co-orientao,

    respectivamente.

    A professora Marlia Lordelo da Universidade Estadual de Feira de Santana pela

    disposio e pacincia em sempre tirar minhas dvidas ao longo do trabalho.

    A professora Dr Tnia Barros do Laboratrio de Microbiologia de Alimentos da

    UFBA por disponibilizar fungos para etapa inicial do trabalho.

    Ao CEPLAC pela identificao taxnomica do fungo Lasidioplodia theobromae.

    A Ingrid, Jeff e Tmara pela colaborao na realizao das anlises.

    A Caio e ao Laboratrio de Qumica pela realizao dos ensaios de DR-X.

    A Jnia pela ajuda e pacincia ao longo do trabalho.

    A todos os pesquisadores e funcionrios do LAPESCA em especial aos colegas

    Denilson, Larissa e Lidia e a tcnica de laboratrio Luciane pela prontido em sempre me

    ajudar e pelo carinho e ateno que sempre me dispensaram.

    As amigas Denise e Ariana pela torcida e carinho durante os perodos mais

    estressantes.

    A FAPESB e CAPES pela bolsa e auxlio financeiro, respectivamente.

    Enfim a todos que contriburam de alguma forma para a realizao deste projeto,

    citados e no citados por nome, mais de igual importncia.

    Obrigada!

  • SUMRIO

    INTRODUO GERAL .....................................................................................................18 REFERNCIAS ................................................................................................................19 OBJETIVOS .....................................................................................................................22 Objetivos gerais ..............................................................................................................22

    Objetivos especficos......................................................................................................22

    CAPTULO I .....................................................................................................................23 Reviso bibliogrfica ......................................................................................................23 1. PRODUTOS BIOTECNOLGICOS FNGICOS .........................................................24 1.1 Enzimas ..................................................................................................................24 1.1.1 Produo de enzimas ..........................................................................................25 1. 1. 2 Celulases ............................................................................................................28

    1. 2 Biomassa fngica ..................................................................................................30 1. 2. 1 Biomassa obtida por fermentao fngica..........................................................30 1. 2. 2 Exopolissacardeos e biomassa residual ...........................................................31 1. 2. 3 Fatores de influncia na produo de biomassa fngica ...................................33 2. FUNGOS FILAMENTOSOS .........................................................................................36 2.1 Fungo Aspergillus niger ..........................................................................................38

    2. 2 Fungo Lasidioplodia theobromae .........................................................................39

    3. FIBRAS LIGNOCELULSICAS .................................................................................42 3. 1 Fibra de eucalipto .................................................................................................44 3. 1.1Celulose ..............................................................................................................46 3.1.2 Hemiceluloses .....................................................................................................49 3.1. 3 Lignina ................................................................................................................50

    3. 2 Hidrlise de fibras lignocelulsicas .....................................................................51 3. 2. 1 Hidrlise Qumica ..............................................................................................51 3. 2. 1. 1Hidrlise com cido concentrado ....................................................................51

    3. 2. 1. 2 Hidrlise com cido diludo ............................................................................51 3. 2. 2 Hidrlise enzimtica .........................................................................................52

    3. 2. 3 Nanofibras e microfibras de celulose ................................................................53 3. 2. 4 Filmes biodegradveis (biocompsitos) e nanobiocompsitos .........................56 REFERNCIAS ................................................................................................................58

    6

  • CAPTULO II .....................................................................................................................721.0 INTRODUO ............................................................................................................752.0 Material e Mtodos ......................................................................................................77

    2.1 Material ........................................................................................................................77

    2.2 Micro-organismos ........................................................................................................77

    2.3 Determinao qualitativa da atividade enzimtica .......................................................78

    2.4 Preparo do inculo.......................................................................................................79

    2.5 Produo do extrato enzimtico via fermentao semi-slida de resduos agrcolas..80

    2.6 Determinao da atividade endoglucansica do extrato enzimtico bruto ..................81

    2.7 Determinao da concentrao de protenas no extrato enzimtico bruto ..................82

    2.7.1 Anlise estatstica.................................................................................................82

    2.7.2 Determinao da influncia da temperatura na atividade enzimtica...................83

    2.7.3 Determinao do efeito do pH na atividade enzimtica.......................................83

    2.8 Hidrlises de polpa de eucalipto para obteno de nanofibras de celulose.................83

    2.8.1 Hidrlise cida (controle) ......................................................................................83

    2.8.2 Hidrlise enzimtica..............................................................................................84

    2.8.3 Hidrlise enzimtica com pr-tratamento com cido sulfrico diludo ..................84

    2.9 Caracterizao das nanofibras de celulose de eucalipto .............................................85

    2.9.1 Birrefringncia das suspenses de nanofibras de celulose ..................................85

    2.9.2 Estudo de espectroscopia de infravermelho (FT-IR) ............................................85

    2.9.3 Determinao de massa molecular por cromatografia .........................................86

    2.9.4 Difrao de raio-x (DRX) ......................................................................................86

    2.10 Aplicao das nanofibras de polpa de eucalipto como reforo mecnico de

    Nanobiocompsitos (filmes)...............................................................................................87

    2.10.1 Caracterizao dos nanobiocompsitos .............................................................87

    2.10.1.1 Anlise termogravimtrica (TGA).....................................................................87

    2.10.1.2 Espessura (E)..................................................................................................87

    2.10.1.3 Ensaio de Trao.............................................................................................88

    3.0 ...............................................................................88RESULTADOS E DISCUSSO3.1 Determinao qualitativa da atividade enzimtica dos fungos filamentosos................88

    3.2 Produo de extrato enzimtico de Aspergillus niger via fermentao semi slida.....89

    7

    3.3 Influncia do pH e da temperatura na ao da enzima no ensaio selecionado ...........92

  • 3.4 Produo das nanofibras de polpa de eucalipto obtidas por hidrlise cida e

    enzimtica..........................................................................................................................93

    3.5 Caracterizao das nanofibras de celulose .................................................................95

    3.5.1 Teste de birrefringncia ........................................................................................95

    3.5.2 Estudo de espectroscopia de infravermelho (FT-IR) ............................................96

    3.5.3. Massa Molecular dos hidrolisados de celulose de eucalipto ...............................99

    3.6 Difrao de raio X (DRX) ...........................................................................................103

    3.7 Caracterizao dos nanobiocompsitos reforados com nanofibras de celulose de

    eucalipto (filmes)..............................................................................................................107

    3.7.1Transparncia e espessura dos nanobiocompsitos (filmes) ..............................108

    3.7.2 Propriedades mecnicas dos nanobiocompsitos..............................................110

    3.8 Anlise Termogravimtrica dos nanocompsitos ......................................................113

    4.0 CONCLUSO............................................................................................................116REFERNCIAS ...............................................................................................................116CAPTULO III ..................................................................................................................1241.0 INTRODUO ..........................................................................................................1272.0 MATERIAL E MTODOS..........................................................................................1292.1 Material ......................................................................................................................129

    2.2 Micro-organismo: Isolamento e identificao Taxnomica ........................................129

    2.3 Fermentao submersa para seleo da fonte de carbono.......................................129

    2.3.1 Manuteno e repicagem do fungo ....................................................................129

    2.3.2 Preparo do inculo .............................................................................................130

    2.3.2.1 Inculo preparado com esferas colonizadas ...................................................130

    2.3.2.1 Preparo do inculo com homogeneizao micelial..........................................130

    2.3.3 Fermentao submersa para a seleo das melhores condies do processo .130

    2.3.4 Separao do miclio fngico do caldo Fermentado..........................................131

    2.3.5 Precipitao e quantificao das fraes de biomassa do caldo fermentado.....131

    2.4 Caracterizao das fraes da biomassa do ensaio selecionado .............................132

    2.4.1 Composio centesimal das fraes ..................................................................132

    2.4.2 Determinao de acares redutores das fraes da biomassa ........................132

    2.4.3 Determinao de composio monossacardica da poro polissacardica das

    fraes da biomassa ...................................................................................................132

    8

    2.4.3.1 Preparo das fraes da biomassa para caracterizao cromatogrfica ..........132

  • 2.4.3.2 ....................................133Estudo de espectroscopia de infravermelho (FT-IR)

    2.4.4. Anlise Termogravimtrica ................................................................................133

    2.4.5

    ....................................................133

    Determinao da composio de monossacardeos das fraes por

    cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE-IR)

    3.0 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................1343.1 Identificao taxonmica do fungo isolado do cacau.................................................134

    3.2 Padronizao do inculo............................................................................................135

    3.3 Seleo da fonte de carbono para produo das fraes I e II da biomassa ............138

    3.4 Efeito da variao do pH e da concentrao da fonte de carbono na produo das

    fraes I e II da biomassa................................................................................................139

    3.5 Composio centesimal das fraes I e II da biomassa produzidas por Lasidioplodia

    theobromae do ensaio 10 ................................................................................................141

    3.6 Anlise por FT-IR.......................................................................................................143

    3.7 Anlise Termogravimtrica ........................................................................................144

    3.8 Composio monomrica de acares das Fraes I e II .........................................145

    4.0 CONCLUSO............................................................................................................148REFERNCIAS ...............................................................................................................149

    9

  • LISTA DE FIGURAS

    Captulo I

    Figura 1. Degradao da celulose por ao de enzimas celulliticas...............................28 Figura 2. Fungo Aspergillus niger ....................................................................................38 Figura 3. Botriosferana; -(13, 16)-D-glucana ..........................................................40 Figura 4. Estrutura da parede celular de fibrilas lignocelulsicas .....................................42 Figura 5. Polimorfismo da celulose ...................................................................................47 Figura 6. Projeo da cela uitria da celulose no plano a e b ..........................................48 Figura 7. Regies amorfa e cristalina da fibra de celulose ...............................................48 Figura 8. Ilustrao de hemiceluloses ligadas entre si celulose ....................................49 Figura 9. Hidrlise seletiva das fibrilas de celulose ..........................................................54

    Captulo II

    Figura 1. Representao esquemtica da placa de caracterizao de celulases.............79 Figura 2. Efeito do pH e da temperatura na atividade da celulase de A. niger .................92 Figura 3. Preparo das nanofibras......................................................................................94 Figura 4. Ilustrao de birrefringncia...............................................................................95 Figura 5. Espectros de FT-IR da polpa de eucalipto e do controle ..................................96 Figura 6. Espectros de FT-IR da polpa das nanofibras de polpa de eucalipto produzidas em diferentes condies de hidrlise enzimtica...............................................................97

    Figura 7. Cromatograma CLA GPC-IR do perfil de eluio de padres de dextranas com diferentes pesos moleculares em GPC CLAE-IR usando as colunas Shodex SB 803, 804,

    805 e 806 em srie ............................................................................................................99

    Figura 8. Cromatograma GPC CLAE-IR do perfil de eluio do NFC... ...................... 100 Figura 9. Cromatograma GPC CLAE-IR do perfil de eluio dos hidrolisados celulsicos de polpa de eucalipto em diferentes condies com extrato bruto da enzima fungica .. 101

    Figura 10. Difratogramas de Raios-x da polpa e nanofibras de polpa de eucalipto ........104 Figura 11. Microscopia eletrnica de transmisso das nanofibras resultantes da hidrlise com cido concentrado....................................................................................................106

    Figura 12. Ilustrao da transparncia dos 7 nanobiocompsitos ..................................108

    10

  • Figura 13. Nanobiocompsitos de amido incorporados com nanofibras de polpa de eucalipto em placas de petri ............................................................................................109

    Figura14. Comportamento de tenso e deformao dos nanobiocompsitos ................112 Figura 15. Curvas TGA e DTG da referncia e das nanofibras formulados com amido de mandioca, acar invertido, sacarose e nanofibras de polpa de eucalipto......................115

    Captulo III

    Figura 1. Constituintes do bioprocesso...........................................................................136 Figura 2. Precipitao da frao I e II produzidas em sacarose comercial .................. 137 Figura 3. Efeito da concentrao de sacarose comercial e do pH no meio fermentado na produo da frao I e II da biomassa pelo fungo L.theobromae ....................................141 Figura 4. Espectros de FT-IR produzidos pelas fraes da biomassa do fungo L.theobromae; (A) Frao I; (B) Frao II ........................................................................144

    Figura 5. Curvas de termogravimetria (TG) e DTG da frao I da biomassa produzida pelo fungo L.theobromae.........................................................................................................144

    Figura 6. Cromatograma CLAE-IR dos padres de glicose e de manose .....................146 Figura 7. Cromatogramas CLAE-IR dos hidrolisados das Fraes I (A), e frao II (B) .147

    11

  • LISTA DE TABELAS

    Captulo I

    Tabela 1. Comparao entre Fermentao em estado slido e fermentao submersa .26 Tabela 2. Nomenclatura, substrato, massa molar mdia ponderal, ponto isoeltrico e

    teores relativos das celulases produzidas pelo T. reesei...................................................28 Tabela 3. Proporo dos componentes qumicos estruturais do eucalipto .......................44 Tabela 4. Propriedades fsicas e mecnicas da fibra de eucalipto ...................................44 Tabela 5. Dimenses mdias de nanofibras de celulose de diferentes matrias-primas ..53

    Captulo II

    Tabela 1. Constituio do meio lquido de induo para produo de celulases ..............78 Tabela 2. Constituio da soluo de traos de sais ........................................................78 Tabela 3. Constituio do meio de caracterizao............................................................79 Tabela 4. Condies de hidrlise de polpa de eucalipto com celulases de A. niger .........84 Tabela 5. Condies de hidrlise com pr-tratamento com cido sulfrico.......................85 Tabela 6. Atividade celulsica de fungos filamentosos .....................................................88 Tabela 7. Valores de concentrao de glicose, protenas e atividade especfica da enzima celulase produzida por Aspergillus niger ...........................................................................90

    Tabela 8. Birrefringncia das condies de hidrlise testadas..........................................96 Tabela 9. Tempos de reteno (Tr) dos padres de dextranas de diferentes pesos moleculares (PM) obtidos por CPC CLAE-IR usando as colunas Shodex SB 803, 804, 805

    e 806 em srie ................................................................................................................100

    Tabela 10. ndice de cristalinidade (%) da polpa de eucalipto e nanofibras produzidas por hidrlise cida e enzimtica.............................................................................................103

    Tabela 11. Mdias das anlises de espessura dos filmes e referncia...........................109 Tabela 12. Mdias das propriedades mecnicas das formulaes e referncia .............110

    12

  • Capitulo III

    Tabela 1. Composio do meio fermentativo para produo da frao I e II ..................131 Tabela 2. Efeito da quantidade de inculo na produo da frao I e II da biomassa ....136 Tabela 3. Produo da frao I e II da biomassa em funo da fonte de carbono..........139 Tabela 4. Efeito da variao da concentrao de sacarose comercial e do pH na produo da frao I e II da biomassa pelo fungo L.theobromae ....................................................140

    Tabela 5. Composio centesimal (%) da frao I e II em base seca.............................142 Tabela 6. Acares redutores e neutros e composio monomrica das fraes de biomassa produzidas por L.theobromae..........................................................................148

    13

  • LISTA DE QUADROS

    Capitulo II

    Quadro 1. Seleo das melhores condies de preparo do extrato enzimtico bruto ......81 Quadro 2. Produo das nanofibras de polpa de eucalipto submetidas a diferentes condies de hidrlise .......................................................................................................94

    Quadro 3. Massas moleculares e limites de distribuio das massas moleculares dos hidrolisados celulsicos de polpa de eucalipto obtidos em diferentes condies ............101

    14

  • LISTA DE SIGLAS

    GP- grau de polimerizao

    FS- Fermentao submersa

    FSS- Fermentao semi-slida

    FES- Fermentao slida ou em estado slido

    CMC- Carboximetilcelulose

    HEC- Hidroximetilcelulose

    EPS- Exopolissacardeos

    LPS- Lipopolissacardeos

    CPS- Polissacardeos capsulares

    DCP- Diaporthe phseolorum var. caulivora

    CLAE- Cromatografia Liquida de Alta Eficincia

    IR-ndice de refrao

    TGA- Anlise Termogravimtrica

    BCC-Companhia de Negocios de Comunicao

    IC-Indice de cristalinidade

    NFC- nanofibras

    DTG- Derivada da anlise termogravimtrica

    MET- Microscopia Eletrnica de Transmio

    Tr- Tempo de reteno

    Log PM-logaritmo de peso molecular

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  • RESUMO

    A biotecnologia o conjunto de conhecimentos e tcnicas que permite a utilizao de seres vivos como parte integrante e ativa do processo de produo industrial e servios. Os micro-organismos, incluindo os fungos filamentosos so amplamente utilizados na produo de enzimas e de biomassa microbiana, dentre outros, com ampla aplicao na indstria farmacutica e de alimentos. Uma utilizao inovadora usar as enzimas fngicas para degradar celulose de fibras vegetais e produzir nanofibras. Estas nanofibras so cristais de alta perfeio, que tem como caractersticas alta rigidez, excelente tenso de ruptura e alto grau de cristalinidade, podendo ser utilizados para melhorar as propriedades mecnicas dos filmes biodegradveis. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram produzir e caracterizar novos bioprodutos, com enfoque na extrao de celulases do Aspergillus niger para produo de nanofibras de celulose visando incorpor-las nanobiocompsitos, e na biomassa extracelular obtida por fermentao submersa com fungo isolado do fruto de cacau com morte descendente. Foi selecionado o extrato enzimtico bruto que apresentou melhor atividade, produzido por fermentao de bagao de cana (7 dias, 35C, pH 6,0) por Aspergillus niger, resultando em uma atividade especfica de 12,18 U/ g de protenas. No entanto, o extrato enzimtico apresentou condies timas de atividade em pH 5,0 a 30C que foram usadas na hidrlise enzimtica da polpa de celulose de eucalipto em diferentes condies. As nanofibras de celulose que apresentaram maior percentual de aumento da cristalinidade foi NFC2 (nanofibras produzidas com 90% de enzima por 120 min) com ndice de cristalinidade (IC) de 75,58%. Os nanobiocompsitos contendo nanofibras de polpa de eucalipto apresentaram propriedades mecnicas melhoradas, quando comparadas a referncia (filme sem incorporao de nanofibras). As nanofibras juntamente com o plastificante, foram responsveis por aumentar em at 61% o mdulo de Young dos nanobiocompsitos (F6, Filmes com nanofibras submetidas a pr-tratamento cido diludo, 1%/15 min e hidrlise enzimtica), em relao referncia, devido rigidez destas nanopartculas. O fungo isolado do cacau foi identificado como Lasidioplodia theobromae e na fermentao de diferentes fontes de carbono produziu duas fraes, uma precipitvel em etanol e a outra separada por ultracentrifugao, que mostraram ser excelentes fontes de carboidratos (30,16 e 37,96%), protenas (19,88 e 29,45%) e lipdios (11,07 e 28,79%). A composio de monmeros da frao polissacardica, obtida por CLAE-IR, mostrou tratar-se de glucomananas. As nanofibras de celulose de polpa de eucalipto obtidas por hidrlise com celulases de Aspergillus niger, os nanobiocompsitos reforados mecanicamente com estas nanofibras so alternativas viveis de processo e produtos menos poluentes, e as fraes do exopolmero obtido por fermentao com Lasidioplodia theobromae, so novos bioprodutos que podem ser destinados a uma grande variedade de aplicaes biotecnolgicas.

    Palavras chave: fungos, nanofibras, filmes biodegradveis, biomassa.

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  • ABSTRACT

    Biotechnology is the set of knowledge and techniques that allows the use of living beings as an integral and active part of the process of industrial production and services. The micro-organisms, including the filamentous fungi are widely used in the production of enzymes and microbial biomass, among others, with wide application in the pharmaceutical industry and food. An innovative use and use the fungal enzymes to degrade cellulose plant fibers and produce nanofiber. These nanofibers are crystals of high perfection, which has characteristics such as high stiffness, excellent breakdown voltage and high degree of crystallinity, and can be used to improve the mechanical properties of biodegradable films. In this context, the objectives of this work were produce and characterize new bioproducts, with focus on the extraction of cellulases of Aspergillus niger for production of nanofibers cellulose aiming to embed them in nanobiocompositos, and biomass in extracellular obtained by fermentation submerged with fungus isolated from the fruit of cocoa with descending death. We selected the enzymatic extract gross presented the best activity, produced by fermentation of sugar cane bagasse (7 days, 35 C, pH 6.0) by Aspergillus niger, resulting in a specific activity of 12.18 U/ g protein. However, enzymatic extract presented optimal conditions of activity at pH 5.0 at 30 C that were used in enzymatic hydrolysis of cellulose pulp of eucalyptus in different conditions. The nanofiber pulp that had the highest percentage increase of crystallinity was NFC2 (nanofibers produced with 90% of the enzyme for 120 min) with index of crystallinity (CI) of 75.58 %. The nanobiocompositos nanofibers containing pulp of eucalyptus had mechanical properties improved when compared to reference (movie without the incorporation of nanofibers). The nanofibers together with the plasticizer, were responsible for increase in up to 61% the Young module of nanobiocompositos (F6, Movies with nanofibers subjected to pre-treatment dilute acid, 1 % /15 min and enzymatic hydrolysis), compared to the reference, due to the rigidity of these nanoparticles. The fungus isolated from cocoa was identified as Lasidioplodia theobromae and fermentation of different carbon sources produced two fractions, the precipitable in ethanol and the other separated by ultracentrifugation, which proved to be excellent sources of carbohydrates (30.16 and 37.96 % ), protein (19.88 and 29.45 %) and lipids (11.07 and 28.79 % ). The composition of monomers of polysaccharide fraction obtained by HPLC-IR, revealed that it was glucomananas. The nanofiber cellulose pulp eucalyptus obtained by hydrolysis with cellulases of Aspergillus niger, the nanobiocompositos reinforced mechanically with these nanofibers are viable alternatives to process and least polluting products, and the fractions of exopolimero obtained by fermentation with Lasidioplodia theobromae, are new bioproducts that can be destined for a variety of biotechnological applications.

    Key Words: fungi, nanofibers, biodegradable films, biomass.

    17

  • 18

    Introduo Geral Os processos biotecnolgicos tm sido aplicados em diversos setores, incluindo a

    obteno de enzimas e de biomassa extracelular de fungos, entre inmeros outros.

    O mercado mundial de enzimas de interesse industrial foi de U$ 3,3 bilhes de

    dlares em 2010, devendo chegar a 4,4 bilhes de dlares em 2015, com previso de

    crescimento anual de 6% para os prximos 5 anos, (COMPANHIA E MERCADOS, 2011).

    Sabe-se que mais de 500 tipos de enzimas garantem 50 aplicaes biotecnolgicas para

    diversos segmentos econmicos como curtumes, papel e celulose, txtil e na indstria de

    alimentos, entre outros (BORGES, 2011; HASAN et al., 2006), destacando-se as

    celulases.

    Mundialmente, a quantidade de fibras lignocelulsicas produzidas estimada em

    1,55 bilhes de toneladas/ano (EPOBIO, 2006), e no Brasil de aproximadamente 350

    milhes de toneladas (SILVA et al., 2009). O baixo custo e a grande disponibilidade no

    Brasil de fontes de fibras vegetais ricas em celulose justificam os esforos para viabilizar o

    uso destas para a obteno de materiais biodegradveis. Nanocristais de celulose

    (nanofibras de celulose, nanocelulose, ou whiskers), so os domnios cristalinos da

    celulose, e tm sido usados como reforo em matrizes polimricas para melhorar as

    propriedades mecnicas, pticas, dieltricas, dentre outras (SOUZA, 2004; SAMIR et al.,

    2005). Dentre as vantagens deste tipo de materiais incluem a baixa densidade, seu

    carter renovvel, biodegradabilidade, boas propriedades mecnicas e baixo custo

    quando comparados com nanofibras sintticas.

    Nanofibras de celulose so isolados das fibras lignocelulsicas por meio de

    hidrlise com cidos fortes concentrados (SILVA et al., 2009), que contribuem para

    aumentar os problemas de danos ambientais. Uma alternativa interessante seria a

    hidrlise enzimtica, j que existe uma variedade de celulases produzidas por fungos e

    bactrias, e a especificidade destas vem estimulando muitas pesquisas (VIEIRA et al,

    2011; OLIVEIRA, 2010; ZHANG; LING, 2004).

    Outra inovao bem promissora no campo da biotecnologia a produo de

    biopolmeros fngicos (BERWANGER et al., 2007). As principais caractersticas de

    interesse industrial desses materiais so, em geral, as formaes de gis em meio

    aquoso, mesmo em baixas concentraes, a compatibilidade com uma grande variedade

  • 19

    de sais em ampla faixa de pH e temperatura, a estabilidade em elevadas concentraes

    inicas, alta solubilidade em gua (CLOSS et al., 1999; LUCYSZYN et al., 2005).

    Entre os produtos produzidos por fungos que tm despertado interesse das

    indstrias farmacuticas e de alimentos encontram-se os lipopolissacardeos (LPS),

    polissacardeos capsulares (CPS) e exopolissacardeos (EPS) tais como celulose

    bacteriana e as -glucanas, entre outras (CANILHA et al., 2006; GARCIA-OCHOA et al.,

    2004). Estes biomateriais tm encontrado amplo campo de aplicaes, devido a sua ao

    antitumoral, antiviral, anti-inflamatria, anticoagulante, espessantes, gelificantes, dentre

    outras (HWANG et al., 2003).

    Na produo de celulases e biomassa por fungos, deve ser considerada alm da

    cepa escolhida, as condies ideais que simulem em laboratrio o habitat natural desses

    micro-organismos, como fontes de carbono, nitrognio, macroelementos e

    microelementos, pH de cultivo, aerao e agitao, temperatura, concentrao de

    substrato entre outras, de forma a serem obtidos altos rendimentos e boas propriedades

    (BARBOSA et al., 2004).

    Neste contexto, a proposta do trabalho foi produzir e caracterizar novos

    bioprodutos, com enfoque, na extrao de celulases de Aspergillus niger para produo

    de nanofibras de celulose visando incorpor-las nanobiocompsitos, e na biomassa

    extracelular obtida por fermentao submersa com fungo isolado do fruto de cacau

    apresentando morte descendente.

    Referncias BARBOSA, A. M.; CUNHA, P. D. T; PIGATTO, M. M.; SILVA, M. L. C. Produo aplicaes de exopolissacardeos fngicos. Seminrio: Cincias Exatas e Tecnolgicas, v. 25, n. 1, p. 29-42, 2004. BERWANGER, A. L. S.; SCAMPARINI, A. R. P.; DOMINGUES, N. M.; VANZO, L.; TREICHEL,T.; PADILHA, F. F. Produo de biopolmero sintetizado por Sphigomonas Capsulata a partir de meios industriais. Cincias e Agrotecnologia, v. 31, n. 1, p. 177-183, 2007. BORGES, D. G. Preparao de derivados de -glicosidases por imobilizao em suportes slidos derivatizados. 2011. 118 p. Dissertao (Mestrado em Engenharia Qumica) Universidade Federal de So Carlos, So Carlos. CANILHA, L.; SILVA, D. D.; CARVALHO, W.; MANCILHA, I. M. Aditivos alimentares produzidos por via fermentativa. Parte 3: polissacardeos e enzimas. Revista Analytica, n. 20, 2006.

  • 20

    CLOSS, C. B.; CONDE-PETIT, B.; ROBERTS, I. D.; TOLSTOGUZOV, V. B.; ESCHER, F. Phase separation and rheology of aqueous starch/galactomannan systems. Carbohydrate Polymers, v. 39, p. 67-77, 1999. COMPANHIA E MERCADOS. Enzimas na Indstria de alimentos e bebidas. Disponvel em: http://www.companiesandmarkets.com. Acesso em janeiro de 2012. EPOBIO, Wageningen International Conference Centre. 1st EPOBIO Workshop: Products from Plants - the Biorefinery Future. 2006. Disponvel em: . Acesso em junho de 2010. GARCIA-OCHOA, F.; SANTOS, V. E.; ALCON, A. Chemical structured kinetic model for xanthan production. Enzyme and Microbial Technology, v. 35, p. 284-292, 2004. HASAN, F.; SHAH, A. A.; HAMEED, A. Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, v. 39, p. 235-251, 2006. HWANG, H. J.; KIM, S.W.; CHOI, J. W.; YUN, J. W. Production and characterization of exopolysaccharides from submerged culture of Phellinus linteus KCTC 6190. Enzyme and Microbial Technology, v. 33, n. 2-3, p. 309-319, 2003. LUCYSZYN, N.; REICHER, F.; SIERAKOWSKI, M. R. Carbohydrate Research at the UFPR. Metals Materials And Processes, v. 17, p. 173-182, 2005. MOTTIN, A. C.; CMARA, J. J. D.; DE MIRANDA, C. A. S.; PAGNAN, C. S. O uso de bioplsticos no desenvolvimento de produtos sustentveis. DESENHANDO O FUTURO 2011| 1 CONGRESSO NACIONAL DE DESIGN, 2011. OLIVEIRA, S. L. R. Aproveitamento da casca de coco verde para produo de celulases. 2010, 86 p. Mestrado (Tecnologia de Alimentos) Universidade Federal do Cear. Fortaleza. SAMIR, M. A. S. A.; ALLOIN, F.; DUFRESNE, A. Review of Recent Research into Cellulosic Whiskers, Their Properties and Their Application in Nanocomposite Field. Biomacromolecules, v. 6, p. 612-626, 2005. SILVA, R.; HARAGUCHI, S. K.; MUNIZ, E. C.; RUBIRA, A. F. Aplicaes de fibras lignocelulsicas na qumica de polmeros e em compsitos. Qumica Nova, v. 32, p. 661-671, 2009. SOUZA LIMA, M. M.; BORSALI, R. Rodlike Cellulose Microcrystals: Structure, Properties, and Applications. Macromolecular Rapid Communications, v. 25, p. 771-787, 2004. ZHANG, Y. P.; LYND, L. R. Toward an Aggregated Understanding of Enzymatic Hydrolysis of Cellulose: Noncomplexed Cellulase Systems. Biotechnology and bioengineering, v. 88, n. 7, p. 30, 2004.

    http://www.companiesandmarkets.com/

  • 21

    Objetivos Objetivos gerais

    Produzir e caracterizar novos bioprodutos, com enfoque na extrao de celulases

    de Aspergillus niger para produo de nanofibras de celulose visando incorpor-las

    nanobicompsitos, e na biomassa extracelular obtida por fermentao submersa com

    fungo isolado do fruto de cacau com morte descendente.

    Objetivos especficos

    1. Avaliar se o fungo Aspergillus niger apresenta atividade celulsica pelo mtodo

    cup plate e determinar as melhores condies para a produo e atividade da

    enzima celulase secretada pelo fungo;

    2. Definir condies de hidrlise enzimtica para a obteno de nanofios de

    celulose de polpa de eucalipto, utilizando o extrato bruto enzimtico de

    Aspergillus niger;

    3. Fazer a caracterizao das nanofibras de polpa de eucalipto produzidas por meio

    de tcnicas de anlises morfolgicas, trmicas e de peso molecular, entre outras;

    4. Comparar as propriedades das nanofibras de celulose obtidas por hidrlise

    enzimtica com as obtidas por hidrlise cida convencional;

    5. Incorporar as nanofibras produzidas a filmes biodegradveis de amido

    (nanobiocompsitos) para avaliar a melhoria das propriedades mecnicas;

    6. Isolar e identificar o fungo isolado da fruta de cacau apresentando morte

    descendente;

    7. Avaliar a influncia da composio do meio de cultivo e do pH da fermentao

    submersa na produo de fraes de biomassa precipitveis ou no em etanol

    pelo fungo isolado de cacau;

    8. Caracterizar as fraes de biomassa produzidas eplao fungo isolado do cacau

    que resultaram em maior produo.

  • Captulo I

    Reviso Bibliogrfica

    22

  • 23

    1. Produtos biotecnolgicos fngicos

    A biotecnologia pode ser entendida como o conjunto de conhecimentos, tcnicas e

    mtodos, de base cientfica ou prtica, que permite a utilizao de seres vivos como parte

    integrante e ativa do processo industrial de bens e servios (CARVALHO, 2005). A

    diversidade de linhagens fngicas que, sob condies adequadas e controladas, so

    capazes de produzir substncias ou de provocar alteraes desejveis em outras,

    resultando em produtos ou processos comerciais, tem permitido ao homem fazer amplo

    uso dessa tecnologia (COLEN, 2006). Vrios produtos que foram criados e/ou melhorados

    com o advento da biotecnologia j fazem parte da vida cotidiana da populao como:

    cido ctrico, etanol, iogurte, cido actico, queijos, diacetil, biofrmacos, produtos de

    limpeza, enzimas, gomas microbianas, entre outros.

    1.1 Enzimas

    As enzimas so protenas especializadas em catalisar reaes biolgicas, ou seja,

    aumentam a velocidade de uma reao qumica sem interferir no processo. Elas

    apresentam propriedades que tornam o seu uso altamente desejvel como catalisadores,

    como alta atividade cataltica e seletividade especfica sobre o substrato (LEHNINGER et

    al., 1995). Com isso, conseguem catalisar transformaes moleculares de modo seletivo e

    rpido, em condies brandas de reao sem ocorrncia de reaes paralelas

    indesejveis que so comuns em sntese qumica. Alm disso, a atividade enzimtica

    pode ser regulada com relativa facilidade, bastando modificar a natureza do meio de

    reao, como, por exemplo, pela alterao do pH. Consequentemente, os processos

    industriais que empregam enzimas so, em geral, relativamente simples, fceis de

    controlar, eficientes energeticamente e de baixo custo de investimento (PATEL, 2002;

    PIZARRO; PARK, 2003).

    As enzimas apresentam a capacidade de reagir com determinados constituintes, os

    substratos, formando complexos: enzima-substrato, com subsequente formao do

    produto. Essa cintica do processo vai depender da estrutura da protena, isto , do

    nmero de cadeias peptdicas e arranjo dessas cadeias na molcula, da natureza do

    substrato e ainda, se existir, da natureza do grupo prosttico (KIELING, 2002).

  • 24

    Segundo FELLOWS (1994) a atividade enzimtica tima das enzimas microbianas

    ocorre nas mesmas condies em que se produz o crescimento mximo dos micro-

    organismos. As enzimas microbianas podem ser extracelulares (enzimas eliminadas ao

    meio) ou intracelulares (retidas no interior das clulas microbianas). Grande parte das

    enzimas utilizadas nas indstrias so enzimas extracelulares de origem microbiana.

    1.1.1Produo de enzimas

    O processo de produo das enzimas se d pela extrao de tecidos animais

    (renina, insulina etc) e vegetais (papana, bromelina etc) ou por fermentao. Contudo, a

    maioria das enzimas empregadas na indstria de alimentos e nos processos industriais

    em geral de origem microbiana. As tecnologias existentes para a produo de enzimas

    microbianas utilizam processos fermentativos que podem ser conduzidos tanto em meio

    lquido, chamado de fermentao submersa (FS), quanto em meio slido, fermentao

    semi-slida (FSS) ou em estado slido (FES).

    VINIEGRA (1997) define a fermentao semi-slida (FSS) como o processo de

    crescimento de micro-organismos em um substrato slido, contendo uma umidade

    suficiente apenas para manter o crescimento e o metabolismo do micro-organismo, isto ,

    isento de gua livre. A fermentao semi- slida (FSS) tambm pode ser definida como

    um processo que se refere cultura de micro-organismos sobre ou dentro de partculas

    em matriz slida (substrato ou material inerte), onde o contedo de lquido (substrato ou

    meio umidificante) ligado a ele est a um nvel de atividade de gua que, assegure o

    crescimento e metabolismo das clulas e, no exceda a mxima capacidade de ligao

    da gua com a matriz slida (DEL BIANCHI et al., 2001).

    O uso da fermentao semi-slida (FSS) tem se mostrado particularmente

    vantajoso para o crescimento de fungos filamentosos, uma vez que simula o habitat

    destes micro-organismos. Essa vantagem estendida produo de enzimas,

    proporcionando uma maior produtividade quando comparada ao processo de fermentao

    submersa. Alm disso, as enzimas produzidas pela FSS so menos suscetveis a

    problemas de inibio por substrato e tambm possuem uma estabilidade maior a

    variaes de temperatura e pH (HOLKER, 2004).

    Farelos, cascas, bagaos e outros resduos so materiais considerados viveis

    para a biotransformao, j que so renovveis e produzidos em grandes quantidades. A

  • 25

    estrutura desses materiais tem como principais componentes celulose, hemicelulose,

    lignina, amido, pectina e protenas, o que os caracteriza como materiais extremamente

    heterogneos que serve tanto como fonte de carbono e energia quanto de suporte para o

    crescimento microbiano (PANDEY, 2001).

    O bagao de cana-de acar tem sido o principal substrato usado na produo de

    celulases por Aspergillus niger. Este organismo pode produzir enzimas que so ativas em

    diversas condies ambientais como as pectinases, proteases e amiloglicosidase que

    foram as primeiras a serem exploradas e originalmente produzidas em culturas de

    superfcies (SCHUSTER et al., 2002).

    Isso faz do Brasil um potencial produtor desta enzima via fermentao semi-slida,

    j que no Brasil, planta-se cana do Centro-Sul ao Norte-Nordeste, o que permite dois

    perodos de safra e produo de lcool e acar durante o ano todo (UNICA, 2006). Com

    isso, estima-se uma produo de 651,5 milhes de toneladas de cana-de-acar na safra

    2010/2011 (CONAB, 2010).

    De natureza lignocelulsica, o bagao da cana-de-acar constitudo por trs

    fraes principais, celulose (aproximadamente 47%), hemicelulose (aproximadamente

    27,5%) e lignina (aproximadamente de 20,3 a 26,27%) que, juntas, perfazem mais de

    90% da massa total desse material fibroso. Em geral, o teor de cinzas presente no bagao

    pequeno, mas pode representar acima de 5% da massa total (CANILHA et al., 2007).

    Alm disso, o bagao tambm apresenta, em menores propores, compostos no

    constituintes da parede celular, os quais podem ser extrados com diferentes solventes

    (BROWNING, 1967).

    Sob o ponto de vista ambiental, a vantagem da FSS est relacionada ao menor

    volume de efluente produzido e possibilidade de utilizao de resduos agroindustriais

    como substrato slido, servindo estes como fontes de carbono e energia. A fermentao

    submersa designa-se como um processo pelo qual se utiliza um meio fermentativo lquido

    onde as fontes de nutrientes utilizadas so solveis. Este processo o mais empregado

    para a produo de enzimas lipolticas devido facilidade dos microrganismos de

    crescerem em condies controladas de pH e temperatura (FEITOSA, 2009).

    Na tabela 1 pode-se notar uma comparao entre a fermentao em estado slido

    (FSS) e a fermentao submersa (FES).

  • 26

    Tabela 1. Comparao entre Fermentao em estado slido e Fermentao submersa.

    Fermentao em estado slido Fermentao submersa

    Meio de cultura no flui livremente Meio de cultura sempre flui livremente

    Consumo limitado de gua, baixa aw, sem efluentes

    Grandes quantidades de consumo de gua e descarte de efluentes

    Baixa capacidade de transferncia de calor Fcil controle de temperatura

    Aerao requer elevado fluxo Fcil aerao e grande rea de contato ar/ substrato

    Substrato tampo Fcil controle de pH

    Condies estticas Boa homogeneizao

    Inoculao de esporos em batelada Fcil inoculao, batelada ou processo

    contnuo

    Risco de contaminao por fungos de crescimento lento

    Risco de contaminao por bactrias do cido ltico

    Baixo consumo de energia Elevado consumo de energia

    Pequenos volumes e baixos custos de equipamentos

    Grandes volumes e elevado custo

    tecnolgico

    HOLKER et al., (2004); RAIMBAULT et al., (1997).

    Os tipos de fermentadores podem ser operados de forma contnua, semi-contnua

    ou descontnua. De acordo com PINHEIRO (2006), no regime contnuo h uma

    constncia na entrada de substrato conforme as necessidades do microrganismo e na

    sada do meio fermentado. Os processos descontnuos podem ser conduzidos na forma

    de batelada, quando quantidades nicas de substrato so fornecidas ao microrganismo

    no incio do experimento (SHU et al., 2006).

    A maioria das enzimas comerciais obtida por fermentao submersa, uma vez

    que os mtodos modernos de controle de fermentao so mais facilmente adaptados, os

    rendimentos so maiores e os e riscos de contaminao menores (AGUIAR; MENEZES,

    2000). As numerosas variveis que envolvem o processo de obteno de enzimas

    microbianas vo desde a composio do meio (fonte de carbono, fonte de nitrognio, sais

    e indutores) at as condies operacionais como pH, temperatura, agitao e aerao

    (BURKERT, 2003). Isto ocorre, segundo BORZANI e colaboradores (2001), devido

    estrutura e a forma do stio ativo da enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes

    capazes de provocar mudanas conformacionais na estrutura protica.

  • 1.1.2 Celulases

    Celulases so protenas, podendo ou no apresentar unidades glicosdicas em

    suas estruturas, atuam na hidrlise de substratos celulsicos sinergicamente e

    compreendem trs componentes enzimticos marjoritrios, as endoglucanases (endo-1,4-

    -glucanase), exoglucanases (celobiohidrolases ou exo-1,4--glucanase) e -

    glicosidases, (GOTO, 2007; SOUZA et al., 2008).

    As endo-1,4--D-glucanases hidrolisam randomicamente ligaes -(14)

    intramoleculares da cadeia celulsica, principalmente em regies com baixo grau de

    organizao (celulose amorfa), (ZHANG et al., 2006). Alm disso, as endoglucanases so

    capazes de atuarem sobre celuloses modificadas estruturalmente, como

    carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC), as quais so os substratos

    recomendados para a determinao da atividade enzimtica de endoglucanases

    (GHOSE, 1987). O grupo das exoglucanases hidrolisa as ligaes -(1-4) das unidades

    de celobiose nas terminaes deixadas pelas endoglucanases (Figura 1).

    Figura 1. Degradao da celulose por ao de enzimas celulolticas. ARO, (2005).

    A enzima no ataca outros substitutos da celulose, refletindo numa alta

    especificidade da molcula em comparao com as endoglucanases, tornando as

    celobiohidrolases enzimas de maior afinidade com a celulose. Essa enzima tambm

    capaz de hidrolisar molculas cristalinas de celulose com, aproximadamente 80% de

    degradao (ZHANG, 2006).

    27

    As -glicosidases, tambm denominadas celobiases, possuem a funo de

    desdobrar a celobiose gerada pelas celobiohidrolases e endoglucanases em glicose,

    minimizando a ao inibitria que a presena de celobiose exerce sobre atividades endo e

  • 28

    exo (MEDVE, 1997). Essas trs classes de celulases atuam em sinergismo para hidrolisar

    a cadeia de celulose de forma eficaz. Segundo WOOD (1988) sinergismo quando a

    atividade exibida por misturas de componentes maior que a soma das atividades desses

    componentes avaliadas separadamente.

    Tal sinergismo acontece da seguinte maneira: as endoglucanases atuam de

    maneira aleatria na cadeia celulsica, diminuindo o grau de polimerizao da cadeia de

    celulose, produzindo os celuoligossacardeos e, consequentemente, aumentando o

    nmero de stios de ataque para as exoglucanases. As exoglucanases hidrolisam a

    cadeia celulsica a partir de suas extremidades, liberando principalmente molculas de

    celobiose. As -glicosidases, por sua vez, promovem a hidrlise da celobiose glicose e

    podem tambm clivar unidades glicosdicas a partir de celuoligossacardeos, diminuindo

    problemas de inibio (VLJAME et al., 2003).

    O sistema das celulases de fungos foi largamente interpretado em termos de

    desenvolvimento substancial biolgico molecular e bioqumico a partir do fungo

    Trichoderma reesei, o primeiro fungo a ser utilizado na produo industrial de celulase,

    permanecendo ainda como fonte mais utilizada (Tabela 2).

    Tabela 2. Nomenclatura, substratos, massa molar mdia ponderal (NW), ponto isoeltrico (pI) e teores relativos das celulases produzidas pelo T. reesei. Enzima a Substratos b Famlia MW (Kg/mol) pI Teor relativo (%) EGI (Ce17B) CM, CA, CMC, HEC, xilana 7 48, 2 4,5 6-10 EGII (Ce 15A) CM, CA, CMC, HEC,

    galactomanana 5 44, 2 5,5 1-5

    EGIII (Ce 12 A) CM, CA, CMC, HEC 12 25, 2 7,5

  • 29

    enzimas s fibras constitui o principal problema para desencadeamento desse processo

    de degradao (THIEMANN et al., 1980). 1.2 Biomassa fngica

    Na natureza, algumas espcies microbianas so capazes de secretar

    polissacardeos ou gomas para o meio ambiente, que podem, por exemplo, auxiliar na

    aderncia de um micro-organismo patognico durante a infeco em uma planta ou

    animal (SUTHERLAND, 1998). Polissacardeos tradicionais, tais como alginatos

    microbianos, goma xantana, goma dextrana so muito utilizados na indstria de

    alimentos, farmacutica e qumica como espessantes, estabilizantes, emulsificantes,

    coagulantes, formadores de filmes, gelificantes, agentes de suspenso (GMEZ et al.,

    2007). Juntamente com essas gomas o micro-organismo produz biomassa residual,

    ambas as fraes tm sido comumente estudadas para aplicao biotecnolgica devido

    aos seus constituintes de grande valor agregado que podem ser utilizados para melhorar

    o valor nutricional de alguns alimentos e/ou qualidade de produtos.

    A biomassa residual de bactrias so boas fontes de protenas (50~83%) e cidos

    nuclicos (15~16%), as de algas so boas fontes de protenas (40~60%) e gorduras

    (5~10%), enquanto de fungos so boas fontes de protenas (30~70%) e cido nuclico

    (6~12%), (ANUPAMA; RAVINDRA, 2000). A biomassa fngica tem sido muito explorada

    comercialmente para isolamento de seus componentes celulares e consequentemente de

    seus principais constituintes, tais como enzimas (invertases, glicosidades), nucleotdeos,

    protenas (manoprotenas), polissacardeos (glucanas, mananas, galactanas), alm de

    lipdeos, como fosfolipdeos e ergosterol, pois estas substncias apresentam

    propriedades especficas de interesse biotecnolgico. (PAVLOVA et al., 2005).

    1.2.1 Biomassa obtida por fermentao fngica

    Os polissacardeos microbianos so biomassas renovveis, biodegradveis e,

    geralmente, no txicos. Pela capacidade de reteno de gua, de formar filmes e

    propriedades reolgicas especficas essas molculas tm sido aplicadas na indstria

    especialmente nos ramos alimentcio e farmacutico (FREITAS et al., 2009).

  • 30

    Estes polissacardeos microbianos podem apresentar-se como constituintes da

    parede celular ou secretados para o meio extracelular. Alm disso, os exopolissacardeos

    (EPS) tambm podem proteger contra ataques de organismos, como bacterifagos ou

    protozorios ou evitar desidratao das estruturas celulares (SUTHERLAND, 1998;

    RUAS-MADIEDO et al., 2002).

    Os polmeros mais estudados nos ltimos anos tm sido os de origem microbiana,

    devido a vantagens na obteno em relao s outras gomas de origem vegetal ou

    marinha, tais como: produo independente de condies climticas, possibilidade de

    utilizao de matrias-primas regionais, maior rapidez na obteno do produto acabado e

    necessidade de espao relativamente pequeno. Alm disto, as gomas de origem

    microbiana apresentam maior uniformidade em suas propriedades fsico-qumicas devido

    especificidade do microrganismo utilizado e possibilidade de um rgido controle dos

    parmetros de cultivo (NERY et al., 2008; BRANDO et al., 2010).

    Os polissacardeos fngicos, tanto pertencentes parede celular como os

    extracelulares, tm sido investigados por apresentarem uma variedade de respostas

    biolgicas de defesa, tais como, atividade antitumoral, antiinflamatria e imuno-

    moduladora (WASSER, 2002). A aplicao teraputica parece depender da estrutura

    qumica e da conformao espacial de cada macromolcula, sendo que pequenas

    diferenas estruturais de cada polmero resultam em caractersticas peculiares para novas

    aplicaes biotecnolgicas (COLLEONI et al., 2003).

    1.2.2 Exopolissacardeos e biomassa residual

    Os exopolissacardeos (EPS) so definidos como polissacardeos extracelulares,

    produzidos por alguns fungos e bactrias, os quais so encontrados ligados superfcie

    das clulas ou so excretados para o meio (ZHANG et al., 2006).

    As -glucanas constituem-se como o principal tipo de exopolissacardeos

    produzidos por fungos (BARBOSA et al., 2004). PIERO (2004) e colaboradores propem

    o uso das -glucanas, de baixo contedo calrico uma vez que no so absorvidas no

    intestino delgado, como substitutos de gorduras em alimentos. Diversos autores relatam

    que entre os polissacardeos biologicamente ativos, as glucanas tipo -(13) e -(13;

    16) revelaram-se compostos potentes, sendo efetivos contra tumores autlogos tanto

    quanto alogenicos e singenicos, favorecendo diferentes atividades biolgicas como

  • 31

    antitrombtica, antiviral ou anticoagulante, no entanto o maior obstculo da utilizao

    clnica das -glucanas a baixa solubilidade em meio aquoso (WANG et al, 2006).

    Lentinana e esquizofilana, duas glucanas fngicas -(13; 16), tornaram-se

    clinicamente relevantes como imunoadjuvantes na terapia contra o cncer (CHEN;

    SERVIOUR, 2007).

    Por apresentar ao antitumoral e anti-inlamatria, as glcanas podem ser usadas

    no controle da formao de leuccitos (efeito anti-inflamatrio), no tratamento da artrite

    reumatide, na sntese de antgenos para produo de anticorpos, na proteo contra

    danos oxidativos no DNA e em cosmticos como agentes de hidratao da pele. Estes

    polissacardeos interagem tambm com lipoprotenas de baixa densidade por meio de

    foras de Van der Waals, o que resulta na eliminao da frao lipdica do sangue

    (CHEN; SEVIOUR, 2007; RINAUDO, 2008).

    A biossntese de EPS est diretamente relacionada capacidade de sobrevivncia

    dos micro-organismos em condies adversas de meio ambiente (MOREIRA, 2002),

    sendo que esses EPS desempenham diferentes papis, que incluem: proteger os

    microorganismos contra desidratao; servir de barreira, impedindo que vrus e anticorpos

    se liguem a stios especficos sobre a parede celular; acoplar e neutralizar toxinas

    carregadas ou ons metlicos txicos; atuar como fonte de carbono e energia; converter o

    excesso de carboidratos em massa espumosa que mais difcil de ser metabolizada por

    outros micro-organismos (PACE,1991).

    Nos cultivos para produo do EPS, ocorre abundante produo de biomassa

    residual. O aproveitamento deste material interessante tanto para evitar a gerao de

    resduos, quanto com relao a seu potencial como suplemento alimentar na alimentao

    humana e animal. O interesse tambm na biomassa residual se justifica pela facilidade de

    obteno, velocidade de crescimento muito maior do que animais ou vegetais, por no

    sofrer interferncia de condies ambientais, e pelo alto valor nutricional, sendo boa fonte

    de aminocidos essenciais e vitaminas (SEVIOUR et al., 1992).

    Trabalhos como os realizados por MENDES-COSTA & MORAES (1999) mostram

    que possvel isolar da biomassa de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae

    fraes de carboidratos solveis, e que estas molculas podem ser utilizadas como

    indutoras de mecanismos de defesa em plantas. A biomassa excedente da produo

    industrial de antibiticos por Penicillium chrysogenum, alm de ser aproveitada para rao

    para gado e/ ou no preparo de fertilizantes (MUZZARELLI et al., 2000), tambm vem se

  • 32

    mostrando uma fonte vivel de molculas importantes, como os polissacardeos do tipo

    glucanas (WANG et al., 2007), aplicados na rea medicinal devido a suas atividades

    antitumorais e imunomoduladoras.

    Entretanto, existem desafios para que a biomassa microbiana possa ser utilizada

    como suplemento alimentar. Bactrias podem produzir toxinas, alm do alto contedo de

    cidos nuclicos que pode predispor o indivduo a acumular cido rico. No caso de

    fungos filamentosos a principal limitao seria a produo de micotoxinas por alguns

    gneros. Lasidioplodia theobromae e Botryodiplodia rhodina podem ser patognicos para

    algumas espcies vegetais, entretanto no pela produo de toxinas, mas pela

    colonizao dos tecidos internos da planta e secreo de exopolissacardeos que impede

    a conduo de seiva pelo vegetal, causando necrose (LIMA, 1991apud CAMPIONI et al.,

    2010). No h relatos de toxicidade humana ou animal (MIRANDA, et al., 2008).

    O potencial do emprego da biomassa avaliado atravs de anlises que incluem

    valor nutricional, ausncia de componentes txicos produzidos e as propriedades

    funcionais, a solubilidade, capacidade de emulsificao e digestibilidade protica, dentre

    outras. Estas ltimas avaliaes devem ser feitas para orientar a escolha do processo

    tecnolgico a ser adotado (ROGER, 2001).

    1.2.3 Fatores de influencia na produo de biomassa fngica

    A biomassa fngica normalmente obtida por meio fermentativo cujo foco principal

    tem sido a obteno de exopolissacardeos de origem microbiana. Durante esse processo

    para a produo de exopolissacardeos (EPS), um grande percentual de biomassa

    tambm obtido. Segundo alguns autores o resultado esperado no final do procedimento,

    se biomassa ou EPS, determinar como essas variveis sero aplicadas no cultivo

    microbiano (BARBOSA et al., 2004; SELBMANN et al., 2002).

    A produo de metablicos fngicos exige um conhecimento detalhado da fisiologia

    microbiana e do comportamento celular durante a fase fermentativa. Parmetros como

    temperatura, agitao, pH, O2 dissolvido, vitaminas, fontes de carbono e de nitrognio

    podem ser determinantes no controle de fontes de carbono e nitrognio, viabilizando o

    processo de produo industrial (HE et al., 2004).

    Diversas fontes de carbono (glucose, sacarose, acar comercial, manose,

    galactose, lactose, celobiose, etc) tem sido utilizadas para a produo de EPS fngicos,

  • 33

    embora a glucose e a sacarose sejam as fontes mais utilizadas pelos pesquisadores

    (SELBMANN et al., 2002; CUNHA et al., 2008). As concentraes de glucose e sacarose,

    utilizadas na produo dos EPS variam bastante em relao ao micro-organismo

    empregado, mostrando a importncia de se fazer testes individuais para cada cepa

    estudada e no usar simplesmente um valor padro.

    Durante a fermentao, a fonte de carbono convertida pela clula microbiana em

    biopolmero e biomassa residual sob certos parmetros fixos (pH, temperatura, tempo de

    incubao, etc). Geralmente, concentraes limitantes de alguns nutrientes e excesso de

    carboidrato favorecem a produo de polissacardeos. Obtm-se um alto rendimento

    quando ocorre a converso de 70-80% da fonte de carbono em biopolmero

    (MARGARITIS; PACE, 1985; SUTHERLAND, 1979).

    Outro fator de importncia na produo de EPS a fonte de nitrognio. Vrias

    fontes tm sido citadas na literatura como: peptona, sais de vogel, sais de sabourad,

    extrato de levedura, sulfato de amnio, os nitrato (sdio, potssio e amnio) dentre outros

    (SEVIOUR et al.,1992; GUIMARES et al., 2009).

    GUIMARES et al., (2009) avaliaram diferentes fontes de nitrognio (caldo de

    batata, caldo nutriente, extrato de levedura, peptona, aveia, meio mnimo de sais de vogel

    e de sabouraud) no crescimento e na produo de EPS pelo fungo Diaporthe phseolorum

    var. caulivora (DPC) responsvel pelo cancro de haste na soja. Observou-se que o fungo

    Dpc foi capaz de crescer em todas as fontes de nitrognio avaliadas, embora os meios de

    aveia, vogel e sabouraud apresentassem um maior rendimento. O fungo Dpc tem melhor

    crescimento quando absorve fontes de nitrognio simples, como no meio de Vogel e o

    bom desenvolvimento da biomassa nos meios de aveia e de sabouraud so devido ao

    maior teor de glucose e de outras fontes nutritivas que estes meios proporcionam ao

    microorganismo e no as suas fontes de nitrognio.

    SEVIOUR et al., (1992) relataram que os polissacardeos so produzidos somente

    sob condies de nitrognio limitantes e altos nveis de nitrognio no meio de cultivo

    reprimem a formao de EPS. Embora, acredita-se que este tipo de regulao depende

    da fonte de nitrognio utilizada e do metabolismo de cada micro-organismo. Em geral o

    tipo e a concentrao de nitrognio tm uma influncia mdia no fluxo de carbono, na

    formao de produtos ou na formao de biomassa. Isto j foi relatado no caso da

    produo de xantana, alginato e gelana, onde uma alta proporo C: N favorece um

    acmulo de exopolissacardeos (DRUZIAN; PAGLIARINE, 2007; BRANDO et al., 2010).

  • 34

    Entre os sais inorgnicos mais utilizados para a produo de EPS por fungos

    esto: K2HPO4, KCl, MgSO4, FeSO4, NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MnSO4, entre outros.

    Normalmente o fosfato e o sulfato so requeridos em maiores concentraes pelos micro-

    organismos em comparao com outros sais inorgnicos (GRESHAM et al.,1997).

    Para a produo de EPS devem-se estudar as condies de aerao mais

    apropriadas para cada micro-organismo. Para alguns fungos, a aerao pode no afetar a

    produo, enquanto que para outros, pode aumentar ou mesmo diminu-la (BARBOSA et

    al., 2004). Os autores YANG & LIAU (1998) analisaram diferentes velocidades de rotao

    e relatam que o grau de agitao timo de 150 rpm, para mxima produo de EPS por

    por Ganoderma lucidum em cultivo submerso.

    GIBBS & SEVIOUR (1996) estudaram uma grande variedade de taxas de agitao

    para a produo de pululana pelo Aureobasidium pullulans ATTC 9348, em fermentador.

    Os autores constataram que a produo do referido EPS em velocidades de agitao

    menores como 125 e 250 rpm, sem controle do nvel da presso de oxignio para as

    clulas, foi satisfatria devido aos baixos nveis de oxignio que atingiram as clulas,

    nestas condies de agitao.

    A agitao dos meios de cultivo tem a funo de melhorar a distribuio de

    oxignio e outros nutrientes para as clulas fngicas. Para a produo de EPS pelo fungo

    Botryosphaeria rhondina forma telamorfa L. theobromae a agitao de 180 rpm foi

    satisfatria (CUNHA et al., 2008; SALDANHA, 2006). A temperatura um fator crtico na

    sntese de polissacardeos e exopolissacardeos, por fungos. Sendo que o maior

    crescimento e produo ocorrem na faixa de 25-35C, onde cada espcie microbiana

    apresenta uma temperatura tima (GANDHI et al.,1997; VERMANI et al., 1995).

    O pH do meio de cultivo microbiano pode ser um parmetro de grande relevncia

    em relao ao crescimento micelial e a produo do metablito de interesse, uma vez que

    esse parmetro pode interferir diretamente na solubilidade dos nutrientes, e, portanto na

    capacidade de utilizao destes pelo micro-organismo. Um pH de cultivo desfavorvel

    pode, tambm contribuir para maior gasto de energia pela clula para manter o pH

    intracelular em valores fisiolgicos adequados (FABBRIS et al., 2008). Alm disso, todas

    as enzimas possuem uma faixa de pH e temperatura para exercerem sua atividade,

    sendo o pH e temperatura timo onde produzem o mximo de sua capacidade. Portanto,

    pH e a acidez do meio podem ser fatores fundamentais no rendimento da produo de

    biopolmero por micro-organismos.

  • 35

    A viscosidade das solues de EPS fngicos varia de acordo com alguns fatores

    fsico-qumicos como: pH, temperatura, concentrao do EPS, massa molecular,

    solubilidade, alm das caractersticas morfolgicas dos fungos produtores (CUNHA,

    2002). A viscosidade determinante para a seleo de cepas produtoras de biopolmeros.

    Na indstria o maior interesse por gomas que quando adicionadas em concentraes

    mnimas (0,01 3%), sejam capazes de promover altas viscosidades (PASQUEL, 1999).

    Os exopolissacardeos so recuperados do meio de cultivo por centrifugao,

    filtrao, precipitao, purificao e secagem. Aps a centrifugao, utilizada para separar

    o EPS da biomassa residual, podem ser utilizados agentes precipitantes no sobrenadante,

    entre os quais o etanol tem sido o mais utilizado (em propores de volumes variados),

    embora se possa utilizar tambm cetonas e isopropanol.

    2. Fungos filamentosos

    Estima-se que existam mais de 1,5 milhes de espcies fngicas no mundo,

    embora apenas 80.000 espcies tenham sido descritas (HAWKSWORTH, 2001).

    CARLILE et al., (2001) relatam que a cada ano 700 novas espcies so descobertas. Os

    fungos filamentosos compe o grupo microbiano com maior nmero de espcies e

    apresentam imensa variedade quanto morfologia e quanto aos atributos fisiolgicos e

    bioqumicos (COLEN, 2006).

    Fungos filamentosos so micro-organismos eucariticos heterotrficos.

    Caracterizam-se por formarem estruturas filamentosas denominadas hifas. A reproduo

    normalmente ocorre por meio de esporos, podendo ser sexuada ou assexuada (LIMA,

    1975). Os fungos crescem melhor na ausncia de luz e em ambientes midos. A maioria

    saprfita, assegurando nutrientes de matria orgnica morta e promove a hidrlise da

    celulose glicose atravs das enzimas celulases. So quimiorganotrficos, e utilizam

    compostos orgnicos como fonte de carbono, eltrons e energia (ZHANG et al., 2006).

    A maioria utiliza carboidratos (de preferncia glicose ou maltose) e compostos

    nitrogenados para sintetizar protenas e aminocidos e para satisfazer suas necessidades

    nutricionais requerem carbono, oxignio, hidrognio, nitrognio, fsforo, potssio,

    magnsio, enxofre, boro, mangans, cobre, molibdnio, ferro e zinco. Desempenham

    papel ecolgico preponderante, pois contribuem na degradao de substncias orgnicas,

    acelerando o ciclo biogeoqumico dos elementos na natureza (PRESCOTT et al., 2002).

  • 36

    Entre os micro-organismos que tem despertado o interesse biotecnolgico esto os

    gneros Aspergillus e Botryosphaeria. Os fungos filamentosos do gnero Aspergillus niger

    pertencem ao domnio Eucariota; Reino Fungi; Filo Ascomycota; classe Eurotiomycetes;

    Ordem Eurotiales; Famlia Trichocomaceae (USECHE et al., 2007).

    As espcies so identificadas de acordo com as diferenas morfolgicas

    observadas, quer macroscpicas quer microscpicas. O gnero Aspergillus apresenta

    formas anamorfas (assexuadas ou mittica) e amorfas (sexuadas), (LATGE, 1999).

    Relativamente ao aspecto macroscpico, as colnias apresentam uma superfcie de cor

    branca, na fase inicial de maturao. Dependendo das espcies, a sua cor pode evoluir

    para verde, amarelo, laranja, castanho ou preto. No seu verso, a colnia apresenta-se

    geralmente branca, dourada ou acastanhada. A textura da colnia surge algodoada,

    tornando-se pulverulenta com a produo de esporos, os quais podem apresentar

    rugosidade da parede, caracterstica igualmente importante na identificao de espcie

    (O'FEL, 1997; LARONE, 2002). Este txon possui mais de 200 espcies dentro deste

    gnero, 11 variedades e 9 formas na literatura e distribudas na natureza e cerca de 20,

    normalmente encontradas em pases de clima temperado, tm sido consideradas

    causadoras da doena aspergillose, afetando principalmente indivduos com um status

    imunolgico debilitado. (INDEX FUNGORUN, 2010). Em pases tropicais como o Brasil,

    tem sido mais frequentemente isoladas as espcies Aspergillus flavus e Aspergillus niger

    (O'FEL, 1997) sendo o Aspergillus niger amplamente utilizado em indstrias alimentcias.

    Os fungos do gnero Botryosphaeria so ascomicetos fitopatognicos, com ampla

    distribuio mundial, pertence ao domnio Eucariota; Reino Fungi; Filo Ascomycota;

    classe Pyrenomycetes ou Loculoascomycetes; Ordem Dothideales; Famlia

    Botryosphaeriaceae (GUARRO et al., 1999) causadores de doenas em diversas plantas

    de importncia econmica como: eucalipto (SILVEIRA et al., 2001), accia (ROUX,

    WINGFIELD, 1997), arvores frutferas como pessegueiro, mangueira, macieira, goiabeira

    (KIM et al., 2001; CARDOSO et al., 2002), e ornamentais (SANCHEZ et al., 2003)

    podendo infectar vrias partes da planta hospedeira como caule, folhas e frutos, em

    diferentes estgios do desenvolvimento.

    Por se tratar de um microrganismo com duplo estgio de propagao em seu ciclo

    de vida, fungos da famlia Botryosphaeriaceae podem ser encontrados tanto no estgio

    anamorfo, denominado Lasiodiplodia theobromae ou Botryodiplodia theobromae, quanto

    no estgio teleomorfo, denominado Botryosphaeria (SALDANHA, 2006). As formas

  • anamrficas de Botryosphaeria so: Botryodiplodia (Lasiodiplodia), Dothiorella, Diplodia,

    Macrophoma, Fusicoccum, Lasidio, Macrophoma, Macrophomopsis e Sphaeropsis, que

    afetam caules herbceos e troncos de madeiras. Considera-se Lasidioplodia theobromae

    (Pat.) como anamrfica de Botryosphaeria rhodina (Cook e Arx), e associada grande

    variedade de doenas de plantas (CROUS; PALM, 1999).

    2.1 Fungo Aspergillus niger

    O gnero Aspergillus composto por fungos cujos condios esto presentes no ar,

    mas normalmente no causam doenas muito srias em humanos. Membros do gnero

    Aspergillus, incluindo Aspergillus niger, so distribudos por todo mundo e esto

    comumente presentes em restos vegetais. So caracterizados por conidios escuros,

    geralmente negros e conidiforos hialinos globosos marrons, medindo 4-5 m de dimetro

    (Figura 2). Estes saprfitos degradam molculas complexas de materiais derivados

    celulsicos vegetais por secretarem uma variedade de enzimas hidrolticas (DE VRIES;

    VISSER, 2001).

    Figura 2. Fungo Aspergillus niger.

    As espcies do gnero Aspergillus so de grande importncia econmica graas a

    suas propriedades de produzir enzimas que so utilizadas na indstria de panificao,

    cervejeira, em antibiticos e cidos orgnicos. O uso dirio desses produtos

    considerado seguro pelo OMS (Organizao Mundial da Sade) e outras organizaes de

    referncia no controle alimentar como a FDA (Food and Drug Administration),

    (EMBRAPA, 1996).

    Aspergillus niger cresce em material orgnico em ampla escala de temperatura de

    6 a 47 C, e pH de 1,4-9,8 e o limite de crescimento para atividade de gua 0,88, que

    37

    http://pt.wikilingue.com/ca/OMShttp://pt.wikilingue.com/ca/FDA

  • 38

    relativamente alto quando comparado a outras espcies de Aspergillus (FROST; MOSS,

    1987). Aspergillus niger fonte de celulases destinadas ao uso alimentcio e Trichoderma

    viride usado para aplicaes no alimentcias, embora as enzimas de ambos os fungos

    possam cumprir muitas tarefas. Segundo GOKHALE (1986) Aspergillus niger pode ser

    considerado, algumas vezes, superior aos outros fungos, reconhecidamente bons

    produtores dos complexos celulolticos e hemicelulolticos, como Trichoderma viride.

    2.2 Fungo Lasidioplodia theobromae Lasiodiplodia theobromae um patgeno tpico das regies tropicais e

    subtropicais, atinge numerosas espcies vegetais cultivadas (PEREIRA et al., 2009). No

    cacaueiro, Lasiodiplodia theobromae pode ser encontrado causando a doena

    denominada morte descendente. Esta doena se manifesta inicialmente nos ramos, pela

    formao de manchas midas, de colorao escura, seguida de murcha e queda das

    folhas. Os ramos secam e morrem, apresentando a casca mole que se desintegra e se

    desprende do lenho e os tecidos internos apresentam leses necrticas de colorao

    castanha. A planta morre e nos ramos afetados encontram-se numerosos picndios do

    fungo (BASTOS; EVANS, 1984).

    Em cultura pura de Batata Dextrose Agar (BDA), as colnias de Lasiodiplodia

    theobromae so acinzentadas a negras, com abundante miclio areo e ao reverso da

    cultura em placa de Petri so foscas ou negras, tendo um pleno desenvolvimento em

    temperaturas entre 12C e 25 C (GALET,1977). Existem 19 sinonmias para

    Lasidioplodia theobromae, incluindo Diplodia gossypina Cooke e Botryodiplodia

    theobromae (PUNITHALINGAN, 1976 apud RODRIGUES; PAZ LIMA, 2010).

    De acordo com OKEY & ADISA (1977), as condies timas para a germinao de

    condios de Botryodiplodia theobromae caracteriza-se por 100% de umidade relativa,

    temperatura de 30C e pH 7,0, no sendo influenciada pela luz. GUPTA (1977) verificou

    que a germinao de condios, a 30C, aumenta em funo da concentrao de sacarose

    no meio. Estudos relataram que o EPS secretado no meio de cultivo pelo fungo

    Botryosphaeria rhodina, em concentraes elevadas de glucose (5% (p/v)) tinha

    aproximadamente 22% de ramificaes, as quais consistem de resduos glicosdicos e

    gentiobiosdicos, vinculados cadeia principal por ligaes tipo (16). Este EPS foi

  • ento denominado de botriosferana (Figura 3), (BARBOSA et al., 2004). SELBMAN e

    colaboradores, no mesmo ano, estudando confirmaram os mesmos tipos de ligaes

    glicosdicas e determinaram a massa molecular em 4,8 kDa.

    Figura 3. Botriosferana; -(13,16)-D-glucana. BONGIOVANI, (2009).

    STELUTI e colaboradores (2004) analisaram a influncia de diferentes fontes de

    carbono (glucose, frutose, galactose, manose, manitol, sorbitol, lactose, sacarose,

    sacarose comercial e melao de cana de acar) na produo de botriosferana (1,7 g/L

    aps 72 h de cultivo) e concluram que a sacarose comercial favorecia a formao do

    exopolissacardeos. A produo de EPS com a cepa MAMB-5 tambm foi estudada com

    outras fontes de carbono em substituio glicose, todos com concentraes de 50 g/L,

    como fonte de carbono e em todos os casos, o EPS produzido era unicamente -glucana.

    Alguns pesquisadores estudaram a influncia de diferentes condies de cultivo na

    produo do EPS por L. theobromae, sendo determinados como fatores importantes a

    utilizao de sacarose grau analtico como fonte de carbono, NaNO3 como fonte de

    nitrognio e pH inicial do meio igual a seis (MATTOS, 2009; TSUTSUMI , 2009).

    SILVA et al., (2006) caracterizaram duas botriosferanas produzidas pelo

    Botryosphaeria rhodina, apartir de fermentaes com sacarose e frutose. Demonstraram

    que o grau de ramificao da botriosferana produzida em sacarose foi menor (21%) do

    que a obtida com frutose (31%), o que certamente proporcionar diferentes propriedades

    reolgicas aos respectivos polmeros. Esse metablito foi obtido por precipitao

    etanlica, purificado por cromatografia de filtrao em gel e submetido hidrlise cida

    para determinao de seus constituintes monossacardicos. Os resultados das anlises

    por cromatografia de troca-inica de alta presso revelaram 98% de glicose.

    39

  • 40

    Os espectros de infravermelho e RMN (GLAZER; NIKAIDO, 1995) mostraram que

    todas as ligaes glicosdicas apresentavam configurao . Os resultados das anlises

    de metilao e degradao de Smith indicaram que a botriosferana uma -D-(13)

    glucana com cerca de 22% de ramificaes em C-6. Aps hidrlise cida parcial, foi

    demonstrado que as ramificaes consistem de resduos glucopiranosdicos e

    gentiobiosdicos unidos cadeia principal por ligaes glicosdicas -D-(16), presentes

    a cada cinco resduos da cadeia principal (BARBOSA et al., 2004), (Figura 3).

    Estudos realizados por GIESE e colaboradores (2008) relatam que a botriosferana,

    obtida com a glucose como fonte de carbono, apresenta conformao em tripla hlice,

    que tem sido descrita como necessria para a atividade biolgica de polissacardeos. Os

    primeiros estudos sobre atividade biolgica da botriosferana, obtida com glucose como

    fonte de carbono, mostraram que este EPS no mutagnico e apresenta atividade

    anticlastognica, hipoglicemiante e hipocolesterolmica (MIRANDA et al., 2008).

    Os fungos Botryosphaeria rhodina e o Lasidioplodia theobromae e seu EPS

    produzidos, a botriosferana, compem parte importante do cenrio de pesquisa nacional e

    internacional, com trabalhos de pesquisa relacionados produo e solubilidade de -

    glucanas, caracterizao e aplicao mdica e na rea de alimentos, inclusive vrias

    patentes envolvendo as propriedades biolgicas, mtodos de crescimento dos fungos,

    produo, dentre outros. Em pesquisa realizada no Espacenet foram encontrados 27

    resultados envolvendo a Botryosphaeria, 10 resultados de botriosferana, 12 resultados

    relacionados theobromae. No entanto, a literatura ainda carece de dados publicados

    envolvendo os dois fungos e seu EPS (ESPACENET, 2011).

    Os polissacardeos extracelulares produzidos por fungos lignolticos tem

    importncia no processo de degradao de xenobiticos, uma vez que imobilizam as

    enzimas extracelulares. O gel formado por estes biopolmeros impede a desidratao da

    hifa e permite adeso entre as clulas ou a adeso destas s superfcies, alm de

    selecionar molculas do meio. Vrios exopolissacardeos e biomassa residual produzida

    por microrganismos ainda no foram adequadamente explorados e somente poucos tm

    sido produzidos em larga escala (MAZIERO et al., 1999 apud BARBOSA, 2004).

  • 3. Fibras lignocelulsicas As fibras lignocelulsicas so as mais abundantes no mundo e apresenta um

    potencial enorme para a obteno de produtos de interesse industrial como bioetanol,

    glicose, biomassa proteca e enzimas. Esses resduos so abundantes fontes de

    carboidratos e sua bioconverso tem atrado muito interesse nos ltimos anos (OJUMU,

    2003; AGUIAR, 2010). As fibras lignocelulsicas incluem vrios resduos agrcolas

    (palhas, cascas, bagaos), madeiras duras provenientes de rvores de folhas decduas

    (dicotiledneas), madeiras moles provenientes de conferas e resduos das indstrias de

    papel (TAMANINI, 2004).

    A composio destes materiais bastante varivel, pois os constituintes possuem

    caractersticas qumicas semelhantes s da madeira e so identificados em diferentes

    quantidades percentuais, dependendo da espcie e condies de crescimento (Figura 4).

    Figura 4. Estrutura da parede celular de fibras lignocelulsicas. CANILHA et al., (2010).

    As fibras lignocelulsicas so compostas de celulose (~35-50%), hemicelulose

    (~20-35%), lignina (~10-25%), alm de pequenas quantidades de outros componentes

    (extrativos) (~5-20%) (TAMANINI, 2004). A agroindstria gera inmeras fontes de

    resduos que no so satisfatoriamente e/ou adequadamente aproveitados,

    transformando-os em rejeitos industriais. O setor de produo de biocombustveis, como

    etanol e biodiesel, est entre os segmentos da agroindstria que mais geram esse tipo de

    rejeito (ALBUQUERQUE et al., 2009).

    41

  • 42

    Em geral, a maioria desses materiais, no fim de sua vida til disposto em aterros

    ou lixes, e mesmo incinerados, representam uma forma de poluio por sua combusto

    incompleta, armazenamento inadequado, o que causa um grave problema ambiental.

    Compsitos formados a partir de biomassa vegetal apesentaram aspectos positivos como:

    a possibilidade de serem biodegradveis; dependendo do polmero usado, caractersticas

    interessantes como durabilidade, resistncia e estabilidade; se decompem a uma

    temperatura de degradao maior e ainda pode ser reciclado por inmeras vezes, o que

    contribui para atuarem a favor do meio ambiente (LEO, 2006; CORRA, 2010).

    Diversos processos so desenvolvidos para utilizao desses materiais,

    transformando-os em compostos qumicos e produtos com alto valor agregado como

    lcool, enzimas, cidos orgnicos, aminocidos entre outros. A utilizao de resduo de

    bagao de cana em bioprocessos uma alternativa racional para produo de substratos,

    e uma ajuda para solucionar o problema da poluio ambiental (PANDEY et al., 2000;

    MENEZES et al., 2009).

    A Organizao das Naes Unidas para a Agricultura e a Alimentao (FAO-ONU)

    declarou o ano de 2009 como o ano internacional das fibras naturais. O objetivo era

    estimular a utilizao de fibras naturais, por meio de polticas governamentais de incentivo

    ao setor, alm da relevncia da produo para os pequenos agricultores, especialmente

    aqueles de pases pobres ou em desenvolvimento, na luta diria pelo incremento da

    renda. Algumas plantas que fornecem fibras ocorrem espontaneamente na natureza,

    outras so cultivadas como atividade agrcola e ainda h aquelas que so resduos

    gerados, principalmente, pela agroindstria (SILVA et al., 2009).

    No Brasil, existe uma variedade de fibras vegetais com diferentes propriedades

    qumicas, fsicas e mecnicas. A utilizao de fibras naturais em substituio s fibras

    sintticas como reforo de compsitos polimricos uma possibilidade promissora,

    principalmente por serem biodegradveis, atxicas, de fonte renovvel, o que condiz com

    os atuais esforos de proteo ao meio ambiente (MARTIN et al., 2009).

    As fibras naturais vegetais, originadas ou no de resduos, citadas na literatura

    especializada como potenciais modificadoras de polmeros termoplsticos so: sisal,

    coco, juta, rami, caru, bagao de cana, soja, aa, etc (MARINELLI et al., 2008). Os

    principais benefcios de tecnologias de converso de fibras lignocelulsicas, atravs de

    rotas biotecnolgicas e/ou qumicas para o Brasil, so: fontes abundantes e baratas de

    recursos renovveis; reduo nas emisses gasosas que causam o efeito estufa; so

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    tecnologias mais limpas; promovem benefcios macroeconmicos para as comunidades

    rurais e para a sociedade como um todo; esto inseridas no contexto de Desenvolvimento

    Sustentvel (AGUIAR, 2010).

    A importncia das fibras naturais como reforo para plsticos vem aumentando

    significativamente nas ltimas dcadas devido ao alto preo das fibras sintticas e a

    busca por materiais de baixo custo, provenientes de fontes renovveis de matrias-

    primas, que no causem danos ao meio ambiente e possam competir com os materiais

    tradicionais. As fibras naturais esto sendo bastante estudadas para substituir

    parcialmente e at totalmente as fibras sintticas em muitas aplicaes, especialmente

    aquelas cujas condies de uso so menos severas (LEE et al., 1989; SILVA et al., 1999).

    As fibras naturais quando incorporadas aos plsticos podem ser processadas por

    praticamente todos os mtodos convencionais de processamento de plsticos (extruso,

    injeo, calandragem e prensagem) e possuem menor densidade que as fibras

    inorgnicas tais como as fibras de vidro. O Brasil sem dvida um dos pases que

    possuem uma das maiores biomassas vegetais do