JULIANA GUERRA PINTO -...

UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA

INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

JULIANA GUERRA PINTO

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA TERAPIA FOTODINÂMICA COM

DIFERENTES FOTOSSENSIBILIZADORES EM Leishmania major e Leishmania

braziliensis – ESTUDO in vitro

São José dos Campos, SP

2016

JULIANA GUERRA PINTO


DIFERENTES FOTOSSENSIBILIZADORES EM Leishmania major e Leishmania

braziliensis – ESTUDO in vitro

São José dos Campos, SP

2016

Tese de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Biomédica da Universidade do

Vale do Paraíba, como pré – requisito

necessário para a obtenção do título de

Doutor em Engenharia Biomédica.

Orientadora: Profa. Dra. Juliana Ferreira-

Strixino

Co-orientador: Prof. Dr. Leandro José

Raniero

FICHA CATALOGRÁFICA

FOLHA DA BANCA

Dedico este trabalho aos meus

pais, Regina e Luiz Claudio.

Meus primeiros orientadores,

apoiadores incondicionais e

porto seguro. Amo vocês.

Dedico também a quem muito

me incentivou, querida tia,

Maria José (in memorian).

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelo Dom da vida, pois sinto que sou abençoada infinitamente.

Agradeço aos meus pais, Regina e Luiz Claudio, por todo esforço, carinho,

compreensão em todo o processo. Não fossem os sacrifícios para me manter na

faculdade, me apoiar durante o Mestrado e Doutorado, e em todos os momentos de

minha vida eu não teria chegado ao fim desse projeto. Por me ensinarem mais do que a

falar, andar, por me ensinarem que a felicidade está nos pequenos detalhes. André, meu

irmão, companheiro, implicante, mas que sempre me impulsiona, me enche de orgulho

e me faz sentir especial. Carol minha irmã, companheira, sempre disposta a ajudar,

sempre presente. Obrigada pelo meu maior presente, meu sobrinho amado, Luiz

Eduardo. Saber que você e sua família, incluo aqui meu cunhado e querido amigo

Eduardo, estão sempre ao meu lado e torcendo por mim, me dá forças todos os dias.

Minha avó Elza, que mesmo que não entenda bem o que eu faço, ou porque esse estudo

nunca se acaba, está sempre torcendo por mim. Amo vocês família.

Agradeço e dedico esse trabalho à minha amada tia Maria Jose, in memorian.

Ela que sempre me disse que eu era capaz de grandes coisas, espero um dia estar à

altura de suas expectativas. Carrego em meu coração cada uma de suas palavras.

Agradeço a minha orientadora, Prof.ª Dra. Juliana Ferreira-Strixino. Obrigada por toda

paciência, por compartilhar seu conhecimento e me ajudar a me tornar uma profissional

melhor. Mas, acima de tudo, obrigada pela amizade e carinho com que me tratou por

todo esse tempo. Foram quatro anos maravilhosos, que me construíram como

profissional e como pessoa. Serei eternamente grata pela forma como me acolheu, e por

tudo que fez por mim.

Josane e Marco Antonio, primeiro professores, depois orientadores e agora

amigos. Agradeço por todo o conhecimento que me passaram, por toda a paciência e

carinho em todos esses anos. Jamais poderei retribuir tudo o que me fizeram, mas minha

gratidão e minha amizade são suas.

Os amigos feitos nesse tempo tantos e tão valiosos. Cada um de vocês tem um lugar

especial no meu coração.

Letícia, amiga que virou irmã. Obrigada por me acompanhar nesse período,

pelas risadas, pela companhia e por todo o carinho que teve comigo nesses anos.

Catarina, que falta fez você aqui no laboratório, me lembrando que apesar de parecer

que não, no final tudo da certo. Obrigada pela amizade sincera, pelas risadas, pelos

doces, carrego sua amizade para sempre.

Idália, parte da culpa de eu ter voltado para fazer o doutorado é sua, então muito

obrigada, pelo apoio, amizade e por todos os momentos, nesses últimos seis anos.

André, agradeço pelas longas conversas, filosofando sobre a vida; Lu Cortez, minha

irmã de coração, obrigada pela companhia, pelas conversas e pelo incentivo. Rani, que

veio fazer parte da minha vida como companheira de apartamento e se tornou uma

grande amiga também, obrigada pela companhia.

Mariana, Anna, João Lucas, Danielle, Davi, João Antonio, Valéria Maeda,

Isabelle, Lívia, Maiara, Jaciara, Isabela, obrigada pela amizade, paciência e todo apoio,

seja no laboratório, em conversas, em cada detalhe em que fizeram diferença na minha

vida.

Agradeço ao meu co-orientador, Leandro Raniero, pelo suporte físico e apoio

durante o desenvolvimento desse trabalho e aos professores Cristina Pacheco, Airton

Martin, Maricília Costa, Renata Canevari por cederem tempo e seus laboratórios

contribuindo para o desenvolvimento desse trabalho.

Agradeço ainda a cada professor que passou em minha vida, são tantos que não

me atrevo a nomear. Basta dizer que cada um ensinou um pouco, ajudou a construir

meu conhecimento e agora eu os carrego comigo. Obrigada.

“A ignorância afirma ou nega veementemente. A ciência duvida.”

Voltaire


DIFERENTES FOTOSSENSIBILIZADORES EM L. major e L. braziliensis –

ESTUDO in vitro

RESUMO

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) ou cutânea é uma doença infecciosa,

causada por protozoários do gênero Leishmania, e transmitida através da picada de

insetos hematófagos pertencentes ao gênero Lutzomya. Devido aos efeitos colaterais

indesejáveis e agressivos dos tratamentos quimioterápicos convencionais utilizados para

tratar a LT, o desenvolvimento de tratamentos alternativos é de grande importância. A

Terapia Fotodinâmica (TFD) surge como um tratamento alternativo para Leishmaniose

tegumentar, devido à possibilidade de um tratamento local, não invasivo e seletivo. Esse

estudo teve como objetivo verificar a internalização de curcumina, clorina e6 e

porfirina pelas promastigotas por meio de microscopia confocal de fluorescência e

avaliar o efeito da TFD em promastigotas de L. major e L. braziliensis. Para isso foi

utilizado tempo de incubação de 1 hora com os FSs e fluência de 10 J/cm² para irradiar

cada FS em seu respectivo comprimento de onda. O efeito da TFD foi avaliado

utilizando o teste de MTT para avaliar a atividade mitocondrial, a viabilidade, pelo teste

de exclusão com azul de tripan e as alterações morfológicas do parasito, pela coloração

de Giemsa, após interação com os compostos. Os três FSs testados são internalizados

por ambas as espécies de Leishmania testadas após o período de uma hora. A curcumina

se encontrar no citosol, núcleo e cinetoplasto das promastigotas, a porfirina se

apresentou difusa no citosol e a clorina se apresentou difusa no citosol, com presença de

vacúolos endocíticos e afinidade pelo flagelo. A porfirina e a clorina promoveram a

redução da atividade mitocondrial dos grupos mantidos no escuro e após TFD, enquanto

a curcumina promoveu aumento na atividade mitocondrial em ambos os grupos. O teste

de exclusão com Azul de Tripan permitiu concluir que nenhum dos FSs é tóxico para os

promastigotas no escuro, entretanto a TFD foi diminuiu drasticamente a viabilidade de

ambas as espécies de Leishmania testadas. A morfologia dos parasitos foi drasticamente

alterada após todos os tratamentos de TFD com os fotossensibilizadores testados. Os

testes realizados com os parasitos internalizados demonstraram que o tratamento de

TFD com curcumina, porfirina e clorina foi capaz de, em todas as concentrações

testadas, levar à 100% de morte celular.

Palavras chave: Curcumina, Porfirina, Clorina, Leishmania major, Leishmania

braziliensis, Terapia fotodinâmica

EVALUATION OF PHOTODYNAMIC ACTIVITY WITH DIFFERENT

PHOTOSENSITIZERS IN L. major AND L. braziliensis - in vitro STUDY

ABSTRACT

American cutaneous leishmaniasis (ACL) is an infectious disease caused by protozoa of

the genus Leishmania and transmitted by the bite of hematophagous insects belonging

to the genus Lutzomyia. Due to undesirable side effects of aggressive conventional

chemotherapy treatments used for CL, development of alternative treatments is very

important. The photodynamic therapy (PDT) has emerged as a promising alternative

treatment, allowing a local administration, with less side effects. This study aimed to

verify the internalization of curcumin, chlorin e6 and porphyrin by Leishmania

promastigotes by confocal fluorescence microscopy after one hour incubation and to

evaluate the effect of PDT on promastigotes of L. major and L. braziliensis. For this we

incubated the PSs for one hour and irradiated with a fluence of 10 J/cm² to irradiate

each PS in its respective wavelength. The PDT effect was assessed using the MTT assay

to evaluate the mitochondrial activity, the viability test by exclusion of trypan blue and

the morphological changes of the parasite by Giemsa staining. The three tested PSs are

internalized by both Leishmania species after one hour incubation. Curcumin is in the

cytosol, nucleus and kinetoplast of promastigotes, porphyrin is diffuse in the cytosol

and chlorine appeared diffuse in the cytosol, with the presence of endocytic vacuoles

and affinity for the flagellum. The porphyrin and chlorin promoted reduction of

mitochondrial activity of the groups kept in the dark and after PDT while curcumin

increased the mitochondrial activity in both groups. The Trypan Blue exclusion test

show that none of the PSs is toxic to promastigotes in the dark, however PDT was

dramatically decreased the viability of both Leishmania species tested. The morphology

of the parasites was dramatically changed after PDT treatments with all photosensitizers

tested. Tests conducted with internalized parasites showed that PDT treatment with

curcumin, porphyrin and chlorin, at all tested concentrations lead to 100% cell death.

Key words: Curcumin, porphyrin, chlorine e6, Leishmania major, Leishmania

braziliensis, Photodynamic therapy

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Manifestações clínicas de Leishmaniose ..................................................................... 20

Figura 2: Casos notificados de leishmaníase tegumentar americana, Brasil-1990 a 2014 .......... 22

Figura 3: Porcentagem de casos notificados à Vigilância Epidemiológica em 2014 .................. 22

Figura 4: Forma amastigota (A) e promastigota (B) de Leishmania sp. ..................................... 23

Figura 5: Ciclo biológico de Leishmania sp. ............................................................................... 25

Figura 6: Esquematização do princípio da TFD. ......................................................................... 29

Figura 7: Rota de formação das espécies reativas de Oxigênio. ................................................. 30

Figura 8: Espectro de absorção da curcumina ............................................................................. 32

Figura 9: Espectro de absorção da porfirina ................................................................................ 34

Figura 10: Espectro de absorção da clorina................................................................................. 36

Figura 11: Localização da curcumina no interior de L. major .................................................. 45

Figura 12: Localização da curcumina no interior de L. braziliensis .......................................... 45

Figura 13: Resultados de MTT e Tripan após interação com curcumina.................................... 47

Figura 14: Morfologia de L. major após interação com curcumina ............................................ 48

Figura 15: Morfologia de L. braziliensis após interação com curcumina .................................. 48

Figura 16: Resultados de MTT e Tripan após interação com curcumina em co-cultivo............. 50

Figura 17: Localização da Porfirina no interior de L. major ..................................................... 51

Figura 18: Localização da Porfirina no interior de L. braziliensis .............................................. 51

Figura 19: Resultados de MTT e Tripan após interação com porfirina ...................................... 53

Figura 20: Morfologia de L. major após interação com Porfirina ............................................... 54

Figura 21: Morfologia de L.braziliensisr após interação com Porfirina ..................................... 55

Figura 22: Resultados de MTT e Tripan após interação com porfirina em co-cultivo ............... 56

Figura 23: Localização da Clorina no interior de L. major ...................................................... 57

Figura 24: Localização da Clorina no interior de L. braziliensis ............................................... 57

Figura 25: Resultados de MTT e Tripan após interação com clorina e6 no escuro .................... 58

Figura 26: Morfologia de L. major após interação com clorina e6 ............................................. 60

Figura 27: Morfologia de L. braziliensis após interação com clorina e6 .................................... 60

Figura 28: Resultados de MTT e Tripan após interação com clorina e6 em co-cultivo ............. 61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Grupos experimentais utilizados no desenvolvimento do projeto. ............................ 42

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ALA Ácido aminolevulínico

AlPc Alumínio ftalocianina

AlPcS4 Alumínio ftalocianina tetrasulfonada

AlPcCl Alumínio ftalocianina clorada

BpD Fotossensibilizante derivado de porfirina

DAPI 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole

DNA Ácido desoxirribonucleico

DMSO Dimetil sulfóxido

ELISA Ensaio com imuno adsorvente ligado a enzima

EtNBS Análogo de benzofenoxazina

EtBNSe Análogo de benzofenoxazina

Hp Hematoporfirina

HpD Derivado de hematoporfirina

J774 Linhagem de macrófagos

LED Diodo emissor de luz

LIT Liver triptose infusion – Infusão de fígado e triptose

LTA Leishmaniose tegumentar americana

MTT (3-(4,5 dimetiazol-2il)-2,5 difeniltetrazolium brometo)

μg micrograma

μL microlitro

μM micromolar

OMS Organização mundias de saúde

PBS Tampão fosfato salino

Pp IX Protoporfirina IX

PPA904 (3,7-bis(N,N-dibutilamino) fenotiazino brometo)

RPM Rotações por minuto

SFB Soro Fetal Bovino

SFM Sistema fagocítico mononuclear

SUCEN Superintendência de Controle de Endemias

ZnPc Zinco Ftalocianina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 15

2 OBJETIVO ................................................................................................................ 18

2.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 18

2.2 Objetivos Específicos .............................................................................................. 18

3 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 19

3.1 LEISHMANÍASES ................................................................................................. 19

3.2 DISTRIBUIÇÃO E EPIDEMIOLOGIA ............................................................. 20

3.3 AGENTE ETIOLÓGICO, CICLO BIOLÓGICO E INSETO VETOR ........... 23

3.3.1 Agente etiológico e ciclo biológico ....................................................................... 23

3.3.2 Vetor ...................................................................................................................... 25

3.4 DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO ................................................................... 26

3.6 TERAPIA FOTODINÂMICA .............................................................................. 28

3.7 FOTOSSENSIBILIZADORES ............................................................................ 30

3.8 FONTES DE LUZ .................................................................................................. 36

3.9 TFD NO TRATAMENTO DE LEISHMANÍASE TEGUMENTAR

AMERICANA ............................................................................................................... 37

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 39

4.1 Procedimento experimental ................................................................................... 39

4.2 Cultivo dos parasitos .............................................................................................. 39

4.3 Cultura dos macrófagos ......................................................................................... 39

4.4 Infecção de macrófagos J774 com Leishmania spp. ............................................. 40

4.5 Preparação dos fotossensibilizadores.................................................................... 40

4.6 Internalização dos fotossensibilizadores em promastigotas de Leishmania major

e Leishmania braziliensis .............................................................................................. 41

4.7 Ensaios de TFD: ...................................................................................................... 41

4.8 Análise da viabilidade celular dos parasitos pelo do método de exclusão com

Azul de Tripan: ............................................................................................................. 43

4.9 Determinação da atividade mitocondrial ............................................................ 43

4.10 Análise morfológica – coloração .......................................................................... 44

5 RESULTADOS .......................................................................................................... 45

5.1 Internalização da Curcumina ................................................................................ 45

5.2 Avaliação da atividade mitocondrial e Exclusão com Tripan após tratamento

com a curcumina ........................................................................................................... 46

5.3 Análise morfológica dos promastigotas após tratamento com Curcumina ...... 47

5.4 Avaliação da atividade mitocondrial e Exclusão com Azul de Tripan em co-

cultivo de macrófagos e promastigotas após tratamento com a curcumina ........... 49

5.5 Internalização da Porfirina.................................................................................... 51


com a Porfirina ............................................................................................................. 52

5.7 Análise morfológica após tratamento com Porfirina .......................................... 53


cultivo de macrófagos e promastigotas após tratamento com a Porfirina .............. 55

5.9 Internalização da Clorina e6 ................................................................................. 57


com a clorina e6 ............................................................................................................ 58

5.11 Análise morfológica após tratamento com clorina e6 ....................................... 59


cultivo de macrófagos e promastigotas após tratamento com a clorina e6 ............. 61

15

6 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 63

7 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 69

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 70

15

1 INTRODUÇÃO

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa, não

contagiosa, também conhecida pelos nomes de ferida brava ou úlcera de Bauru. É

causada por protozoários do gênero Leishmania e transmitida pela da picada de insetos

hematófagos pertencentes ao gênero Lutzomyia. Esses protozoários são encontrados em

animais, considerados reservatórios, pois não manifestam a doença, e ocasionalmente

infectam humanos. Uma vez que a pessoa é infectada, os parasitos são internalizados

por células do sistema fagocítico mononuclear (SFM), e passam a se multiplicar em seu

interior, causando diferentes manifestações clínicas, de acordo com a espécie do

parasito. Essas manifestações são divididas em 3: leishmaníase cutânea, leishmaníase

mucocutânea ou leishmaníase cutâneo-mucosa e leishmaníase visceral ou calazar

(GONTIJO; CARVALHO, 2003; PACE, 2014; REY, 2008; VON STEBUT, 2015).

Além da espécie de Leishmania envolvida na infecção, outro fator que influencia

a manifestação clínica é o estado imunológico do paciente. A infecção pode ser

assintomática em indivíduos com saúde estável, e pode se manifestar de forma mais

agressiva em pacientes imunossuprimidos. O processo de infecção ocorre durante o

repasto sanguíneo da fêmea do flebotomíneo, quando as promastigotas são liberadas no

local da picada. As formas promastigotas metacíclicas são fagocitadas por células do

SFM e se multiplicam dentro dessas células por divisão binária, até que a célula não

suporte mais o volume de parasitos em seu interior e se rompa, liberando os mesmos.

Esses são novamente fagocitados e um quadro inflamatório se instala no local,

favorecendo o desenvolvimento de lesões na pele (GONTIJO; CARVALHO, 2003;

PACE, 2014; RODRIGUES et al., 2006; SUCEN, 2006; VON STEBUT, 2015).

A LTA acomete pele e mucosa, suas lesões são ulcerosas, indolores, podem se

apresentar isoladas ou em múltiplas lesões, com bordas bem definidas e nenhum

exsudato (BRITO et al., 2012; GONTIJO; CARVALHO, 2003; SUCEN, 2006;

NEVES, 2005). É considerada um problema de saúde pública em 88 países (distribuídos

nas Américas, África, Europa e Ásia). No Brasil é considerada uma das afecções

dermatológicas que merece mais atenção, por causa do alto risco de ocorrência de

deformidades e impacto social e econômico que acompanham o desenvolvimento da

doença. Amplamente distribuída em todas as regiões brasileiras, afeta em 90% dos

casos, pessoas maiores de 10 anos e indivíduos do sexo masculino representam 60% dos

16

casos (BRASIL, 2007). Pelo fato da Leishmaniose tegumentar ser uma doença

endêmica, e dos tratamentos convencionais com antimoniais, Anfotericina e

Pentamidinas, serem agressivos, principalmente a pacientes cardíacos e gestantes, o

desenvolvimento de tratamentos alternativos, que causem menor impacto no organismo

é de grande importância.

Devido à facilidade de cultivo as formas promastigotas são largamente utilizadas

para a avaliação de FS´s in vitro. Por se tratar de um parasito intracelular, após a

triagem inicial dos FS´s utilizando formas promastigotas de Leishmania, a avaliação do

potencial leishmanicida in vitro contra a forma axênica é o modelo mais próximo do

animal sem requerer a utilização do mesmo. Esta metodologia também fornece

informações sobre a capacidade do FS de chegar, em níveis adequados, ao vacúolo

parasitóforo, mantendo seu efeito leishmanicida. Este tipo de estudo avalia ainda

potenciais efeitos do FS sobre a célula, favorecendo ou inibindo o desenvolvimento das

Leishmanias em seu interior (AKILOV et al., 2006; ESCOBAR et al., 2006; SILVA et

al., 2015).

Diferentes espécies de Leishmania levam à diferentes manifestações clínicas,

sendo elas, cutânea, muco-cutânea e visceral. Espécies como a L. donovanii e L.

chagasii são causadoras da manifestação visceral, mais grave e cujo tratamento é feito

com antimoniais e anfotericina, e quadros graves dessa manifestação podem levar à

morte. Outras espécies, como Leishmania major e Leishmania braziliensis causam

manifestações cutâneas que podem evoluir para lesões mucocutâneas (PACE, 2014;

VON STEBUT, 2015). A proposta de utilização da terapia fotodinâmica no tratamento

de leishmaniose, se aplica aos casos de lesões cutâneas.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma terapia que surge como alternativa no

tratamento da LTA. Essa terapia parte do princípio da interação de um

fotossensibilizador, luz em comprimento de onda adequado e oxigênio tecidual levando

à produção de espécies reativas de oxigênio que induzem à morte das células alvo

(CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004; CHOI; LEE; CHAE, 2010; PELOI et

al., 2011)

Estudos como o de Kosaka e colaboradores (KOSAKA et al., 2007)), Latorre-

Esteves e colaboradores (LATORRE-ESTEVES et al., 2010), e Peloi e colaboradores

(2011) demonstraram em estudos com animais que a utilização da TFD no tratamento

de lesões de leishmaniose cutânea apresentou bons resultados, com diferentes

fotossensibilizadores.

17

Song e colaboradores (SONG et al., 2011) apresentaram um estudo de caso onde

um paciente com lesão causada por Leishmania foi tratado com TFD com AM,

observando que a terapia foi eficiente e diminuiu o tempo necessário para a cura da

lesão, quando comparado com uma lesão que foi tratada convencionalmente, no mesmo

paciente.

Enk e colaboradores (ENK et al., 2015) demonstraram em um estudo clínico que

a DA-PDT (Day-light-activated PDT - TFD ativada pela luz do dia) utilizando uma

solução de 16% methyl aminolaevulinate, onde o paciente se auto administrava a droga,

e ocorria um período de exposição à luz do dia por 2-5 horas, com uma taxa de cura de

92% dos pacientes. Esses estudos demonstram que a TFD é uma alternativa viável. A

busca por fotossensibilizadores mais eficientes e mais baratos visam facilitar o acesso

dessa terapia à população afetada por essa doença.

A busca por fotossensibilizadores (FS) mais adequados e que melhore o

rendimento da TFD é constante. Por esse motivo estudar e comparar a eficácia de

diferentes FS’s frente às formas amastigotas e promastigota do parasito, é de extrema

importância para definir os passos futuros de aplicação dessa terapia em experimentos

in vivo. A escolha de estudar uma porfirina, uma clorina e a curcumina se deve ao fato

da busca pela comparação de compostos mais amplamente testados, como a clorina e a

porfirina, com um que tem sido mais explorado apenas recentemente, como a

curcumina.

18

2 OBJETIVO

2.1 Objetivo geral

Avaliar o efeito fototóxico de Clorina e6, Porfirina e Curcumina em

promastigotas de Leishmania major e Leishmania braziliensis e em co-cultivo com

macrófagos a fim de verificar o potencial desses FS para o uso em terapia fotodinâmica.

2.2 Objetivos Específicos

- Avaliar a internalização dos fotossensibilizadores em promastigotas de L.

major e L. braziliensis por microscopia confocal.

- Avaliar, in vitro, o efeito da TFD com Clorina e6, Porfirina e Curcumina na

viabilidade, atividade mitocondrial e morfologia de promastigotas metacíclicos de L.

major e L. braziliensis.

- Avaliar, in vitro, o efeito da TFD com Clorina e6, Porfirina e Curcumina na

viabilidade, atividade mitocondrial em co-cultivo de Leishmania e macrófagos, a fim de

verificar o efeito da TFD na forma amastigota dos parasitos.

19

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 LEISHMANÍASES

As leishmaníases são doenças infecciosas, não contagiosas causadas por

protozoários do gênero Leishmania, da família Trypanosomatidae. Esses parasitos

causam zoonoses, ocasionalmente infectam a espécie humana e apresentam duas formas

evolutivas: a forma promastigota ou flagelada, encontrada no sistema digestório do

vetor e em meios de cultura artificial, e a forma aflagelada ou amastigota, encontrada no

interior de células dos hospedeiros vertebrados (homem e outros animais superiores).

Esses protozoários parasitam, na sua forma amastigota, as células do Sistema

mononuclear Fagocitário (SMF), principalmente macrófagos. Após serem fagocitados,

apesar da atividade lítica dos vacúolos formados no interior da célula, os parasitos

sobrevivem e se multiplicam (CARVALHO, 2012; FREITAS; PINHEIRO, 2010;

NEVES, 2005; BRASIL, 2007).

A LTA é considerada pela Organização Mundial de Saúde um problema de

saúde pública mundial presente em 80 países (MOTA; MIRANDA, 2011). No Brasil

foram registrados no período de 1999 e 2008, 269.122 casos de LTA, sendo o país com

maior prevalência de todo continente Americano, com estimativa de 65.000 novos casos

por ano (MURBACK et al., 2011; PENNA et al., 2011).

Diferentes espécies de Leishmania causam diferentes manifestações da doença

(Figura 1), que podem ser divididas em quatro grupos:

- leishmaníase tegumentar ou cutânea: produz lesões cutâneas, ulcerosas ou

não e limitadas ao local de inoculação;

- leishmaníase muco-cutânea ou cutâneo-mucosa: produz lesões destrutivas

nas mucosas do nariz, boca e faringe.

- leishmaníase cutâneo difusa: formas disseminadas cutâneas, que se

apresentam em indivíduos anérgicos ou, tardiamente, em pacientes previamente tratados

de calazar.

- leishmaníase visceral ou calazar: nessa manifestação da doença os parasitos

apresentam preferência por células do SMF do baço, fígado, medula óssea e dos tecidos

linfoides, levando ao crescimento anormal desses órgãos.

20

A manifestação cutânea é relativamente benigna e de bom prognóstico, se

tratada corretamente, a muco-cutânea pode levar à mutilação de face, dependendo do

progresso da doença. A manifestação visceral, no entanto, é a forma mais grave e de alta

mortalidade quando não tratada adequadamente (PACE, 2014; REY, 2008; VON

STEBUT, 2015).

Figura 1: A. Caso com ulceração recente e de bordas bem talhadas no dorso da mão. B. Leishmaníase

cutâneo-mucosa envolvendo nariz e lábio superior. C. Paciente com leishmaníase tegumentar difusa. D.

Crianças de Sobral, CE, com Leishmaníase visceral

Fonte: (REY, 2008)

3.2 DISTRIBUIÇÃO E EPIDEMIOLOGIA

A forma visceral da doença está presente em 17 dos 26 estados, sendo a região

Nordeste de maior incidência (92%). Em 19 anos de notificação foram diagnosticados

48.455 casos, sendo 66% ocorridos nos estados da Bahia, Ceará, Maranhão e Piauí.

Estatísticas mostram que a forma visceral da leishmaniose acomete mais

frequentemente crianças menores de 10 anos (BRASIL, 2007; SUCEN, 2006).

A LT constitui um problema de saúde pública em 88 países, distribuídos nos quatro

continentes (Americano, Europeu, Africano e Asiático), com registro anual de 1 a 1,5

1A 1B

1C 1D

21

milhão de casos. A OMS considera a LT uma das seis doenças infecciosas mais

importantes, devido seu alto coeficiente de detecção e capacidade de produzir

deformidades (BRASIL, 2007). No Brasil a Secretaria de vigilância epidemiológica do

ministério da Saúde registrou, no período de 1980 a 2005 ocorrência média anual de

22.738 casos de LTA, mostrando aumento do número de casos na última década,

entretanto, dados recentes não são disponibilizados nos sites do Ministério da

saúde.(BASANO; CAMARGO, 2004; BRASIL, 2007; SUCEN, 2006).

Dados recentes do site demonstram redução dos casos notificados a partir de

2008, embora ainda se mantenha uma média de mais de 20 mil casos notificados no país

em 2014 (Figura 2).

Na década de 50, houve uma diminuição geral da ocorrência de casos de LTA,

porém vem apresentando franco crescimento, observando-se surtos epidêmicos nas

regiões Sul, Sudeste, Centro Oeste, Nordeste e na região Norte (área amazônica),

relacionados ao processo predatório de colonização. Na década de 80, a LTA foi

assinalada em 20 estados, no entanto foi verificada sua expansão geográfica, quando em

2003 foi confirmada a autoctonia em todos os estados brasileiros. No período de 1985 a

1999 foram registrados no país 388.155 casos autóctones de LTA. A região Sudeste

apresentou uma queda gradativa no período de 1994/97, entretanto em 1998 houve um

acréscimo de 27% em relação ao ano anterior (SUCEN, 2006).

Os estados do Espírito Santo e Minas Gerais foram os que apresentaram o maior

percentual de municípios com LTA em 1998, com 50,5% e 46,3% respectivamente. No

sul do país o Paraná vem apresentando aumento gradativo no número de municípios

com casos de LT, passando de 117 municípios em 1994 para 146 em 1998 (BRASIL,

2007).

Dados da Vigilância Epidemiológica demonstram que em 2014 foram

registrados casos de LTA em todas as regiões do país, sendo a região Norte responsável

por mais da metade dos casos notificados (Figura 3).

Essa expansão de casos de LTA se deve principalmente às modificações feitas

pelo homem nos ecossistemas, pela urbanização não planejada, resultando na invasão

do habitat natural dos insetos vetores da leishmaníase.

22

Figura 2: Casos notificados de leishmaníase tegumentar americana, Brasil-1980 a 2014

Fonte: Autora

Figura 3: Porcentagem de casos notificados à Vigilância Epidemiológica em 2014

Fonte: Autora.

23

3.3 AGENTE ETIOLÓGICO, CICLO BIOLÓGICO E INSETO VETOR

3.3.1 Agente etiológico e ciclo biológico

Os protozoários causadores das leishmaníases humanas são da ordem

Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae, e gênero Leishmania. Parasitos desse

gênero apresentam em seu ciclo biológico duas formas distintas, amastigotas e

promastigotas (Figura 4). Esses protozoários são unicelulares, digenéticos, com ciclo

vital incluindo dois hospedeiros, o inseto vetor e um vertebrado que inclui mamíferos

silvestres e domésticos (REY, 2008).

Figura 4: Forma amastigota (A) e promastigota (B) de Leishmania sp.

Fonte: Rey (2008)

As formas amastigotas são aflageladas, encontradas no hospedeiro vertebrado

parasitando células do SMF, principalmente macrófagos, mas também células

dendríticas ou até mesmo fibroblastos. São estruturas ovaladas, com 3,0 a 6,5 µm de

comprimento por 1,5 a 3,0 µm de largura. As formas promastigotas (flageladas) são

encontradas no intestino do inseto vetor, possuem corpo alongado com comprimento

entre 10,0 a 20,0 µm e largura entre 1,5 a 3,0 µm. Ambas as formas se multiplicam por

divisão binária (RANGEL; LAINSON, 2009; VALE; FURTADO, 2005).

A Leishmaniose Tegumentar americana (LTA) é causada por parasitos do

complexo “LEISHMANIA BRAZILIENSIS” que compreende as seguintes espécies:

10

m

A B

24

Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania

(Viannia) panamensis, Leishmania (Viannia) peruviana e outras Leishmanias que

raramente infectam o homem como L. lainsoni, L. shawi, L. naifi, L. colombiensis e L.

equatoriensis. A leishmaníase visceral é causada, por Leishmania (L.) donovani e

Leishmania (L.) infantum no Velho Mundo e nas Américas, a Leishmania (L.) chagasi

tem sido responsável pelas formas clínicas desta patologia (NEVES, 2005; RANGEL;

LAINSON, 2009; REY, 2008; VALE; FURTADO, 2005).

Na microscopia óptica as amastigotas aparecem como organismos ovais

medindo entre 3,0 a 6,5 µm de comprimento por 1,5 a 3,0 µm de largura, sem flagelo

livre. As formas flageladas, denominadas promastigotas, são encontradas no intestino

do inseto vetor e possuem o corpo alongado apresentando uma variabilidade grande nas

medidas do corpo, cujos diâmetros podem ser observados entre 10,0 a 20,0 µm de

comprimento por 1,5 a 3,0 µm de largura. As formas promastigotas e paramastigotas

são encontradas no tubo digestivo dos flebotomíneos livres ou aderidas ao epitélio

intestinal do inseto, respectivamente. A infecção no inseto ocorre quando a fêmea do

flebotomíneo pica o vertebrado (Figura 5) para exercer o repasto sanguíneo e

juntamente com o sangue ingere macrófagos parasitados por formas amastigotas.

Durante o trajeto pelo trato digestivo anterior, ou ao chegarem no estômago, os

macrófagos se rompem liberando as amastigotas, que sofrem divisão binária e se

transformam rapidamente em promastigotas, que continuam se multiplicando no sangue

ingerido, que é envolvido em uma membrana peritrófica secretada pelas células do

estômago do inseto. Após a digestão do sangue essa membrana se rompe e as formas

promastigotas ficam livres (GONTIJO; CARVALHO, 2003; PEREIRA, 2009;

BRASIL, 2007; SUCEN, 2006).

No intestino do inseto as formas promastigotas continuam se multiplicando,

a ponto de causar uma obstrução mecânica ou dificultar a ingestão de sangue pelo

inseto. Quando o inseto tenta se alimentar os músculos da sucção relaxam e o inseto

regurgita o material aspirado, juntamente com as promastigotas, infectando assim um

novo hospedeiro. Rapidamente, dentro do vacúolo fagocitário, os parasitos se adaptam

ao novo meio fisiológico e resistem à ação destruidora dos lisossomos e as formas

promastigotas se transformam em amastigotas, multiplicando-se por divisão binária até

ocupar todo o citoplasma e romper a membrana do macrófago, sendo assim liberadas no

tecido e fagocitadas novamente, iniciando uma reação inflamatória local (REY, 2008;

SOUZA; SOUZA; BOTELHO, 2012).

25

No homem a forma aflagelada encontra-se nos vacúolos digestivos de

macrófagos. Dentro de quatro a oito horas, estes flagelados são interiorizados pelos

macrófagos teciduais, rapidamente se transformam em amastigotas, sofrendo mudanças

bioquímicas, moleculares e morfológicas. Dentro do vacúolo fagocitário, os

amastigotas estão adaptados ao novo meio fisiológico e resistem à ação destruidora de

moléculas microbicidas e enzimas hidrolíticas, além da ação de peróxidos (H2O2),

superóxidos (O2-), oxigênio e o meio ácido (OH

-. Além de se multiplicarem até

destruírem a célula hospedeira, as Leishmanias provocam um aumento considerável dos

histiócitos, que, assim, passam a endocitar mais e mais parasitos, ampliando a extensão

das células infectadas e das lesões leishmanióticas (NEVES, 2005; PACE, 2014; REY,

2008; VON STEBUT, 2015).

Figura 5: Ciclo biológico de Leishmania sp.

Fonte: (PEREIRA, 2009)

3.3.2 Vetor

O hospedeiro intermediário e vetor das leishmaníases nas Américas são dípteros da

família Psychodidae. São insetos popularmente conhecidos por “cangalhinha”,

“mosquito palha”, “birigui” e “tatuíra”, entre outros nomes. São muito pilosos e cor de

palha ou castanho claro e quando pousam, as asas permanecem entreabertas e

ligeiramente levantadas, em vez de se cruzarem sobre o dorso. Das 300 espécies já

descritas nas Américas, muito poucas foram implicadas na transmissão de leishmaníases

26

e apenas dois gêneros são realmente importantes: Lutzomya – vetor das leishmaníases

nas Américas e Plebotomus – vetores de leishmaníases na África, Europa e Ásia

(MESTRE et al., 2011; REY, 2008; SHIMABUKURO; GALATI, 2011; THIES et al.,

2013).

Somente as fêmeas de flebotomíneos são hematófogas, pois o sangue é fonte de

proteínas e aminoácidos necessários ao desenvolvimento dos ovos, porém ambos os

sexos utilizam carboidratos retirados da seiva das plantas como fonte de energia,

podendo ser considerados fitófagos. Em temperaturas inferiores a 20 ºC nota-se que

tanto o desenvolvimento das larvas como a atividade dos adultos ficam muito reduzidos,

razão pela qual a distribuição das espécies está limitada às regiões onde pelo menos um

mês tenha temperatura média superior a 20 ºC. Os principais vetores de LT no Brasil

são Lutzomya whitmani, Lutzomya pessoai, Lutzomya migonei, Lutzomya intermedia,

Lutzomya fischeri e Lutzomya wellcomei (MESTRE et al., 2011; RANGEL; LAINSON,

2009; THIES et al., 2013).

No estado de São Paulo o vetor Lutzomya intermedia foi associado ao interior e

peridomicílio de habitações e abrigos de animais domésticos, enquanto as espécies L.

whitmani e L. mingonei são mais silvestres e também associadas à transmissão de LTA.

Os flebotomíneos têm hábitos noturnos e sua distribuição é influenciada por fatores

ambientais, climáticos e pela vegetação (SILVA; CUNHA, 2007).

3.4 DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO

Avaliações clínicas e laboratoriais são necessárias para o diagnóstico das

leishmaníases, as características das lesões, bem como anamnese do paciente e os dados

epidemiológicos da região ajudam no diagnóstico, entretanto o diagnóstico de certeza é

obtido pela identificação do parasito por métodos diretos ou indiretos. Na pesquisa

direta são realizados esfregaços de material obtido por escarificação, biópsia de borda

de lesão ou aspiração, que são corados por métodos de Romanowsky, Giemsa ou

Leishman, para evidenciação dos parasitos. Pode-se também semear fragmentos de

tecido ou de aspirados de borda de lesão ou de linfonodos de áreas próximas à lesão em

meios de cultura, para evidenciar a presença de parasitos(BHARGAVA; SINGH, 2012;

27

GOTO; LINDOSO, 2010; RANAWAKA; ABEYGUNASEKARA; WEERAKOON,

2012).

Técnicas de imunologia como a reação de Montenegro ou reação intradérmica,

uma reação de imunofluorescência indireta (RIFI), podem ser empregada nas formas

cutânea difusa, mucosa, disseminada e pode ser positiva em pacientes com lesões

cutâneas recentes (ALVES et al., 2008; BHARGAVA; SINGH, 2012). O diagnóstico da

forma visceral da doença pode ser feito por meio de análise histológica de biópsia ou

punção aspirativa de baço, fígado, medula óssea ou linfonodos, isolamento em meios de

cultura, testes imunológicos de aglutinação direta, RIFI e ensaios imunoenzimáticos

sendo que no Brasil os testes mais utilizados no diagnóstico de leishmaníase visceral

humana e canina são a RIFI e ELISA(ALMEIDA; SANTOS, 2011; BHARGAVA;

SINGH, 2012; CARLOS; GUEDES; MELO, 2008).

É possível ainda o diagnóstico utilizando técnicas de biologia molecular como

hibridação de DNA e reação de cadeia da polimerase (PCR). Essas técnicas são mais

sensíveis que as tradicionais, sendo o PCR, por exemplo, capaz de detectar DNA de

Leoshmania em amostras que tenham sido anteriormente negativas para técnicas padrão

de biópsia, entretanto são também técnicas mais caras e que requerem uma

infraestrutura laboratorial adequada.

A primeira linha de ação no tratamento contra leishmaníases são os antimoniais

pentavalentes (Sb 5+

), escolhidos devido a sua rápida depuração renal do Sb

pentavalente e baixa acumulação nos tecidos(ALMEIDA; SANTOS, 2011;

BOAVENTURA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006).

O tratamento da LTA com o uso do antimonial tártaro emético foi introduzido

pelo médico brasileiro Gaspar Viana, em 1912 e foi durante muito tempo a única forma

de tratamento. É realizado com injeção de 17mg Sb 5+/kg peso/dia, durante dez dias,

seguido de intervalo de dez dias e novamente uma série de 10 dias de tratamento. O

número de séries varia de acordo com o processo de cura da lesão. A droga não deve ser

utilizada em pacientes cardíacos e em mulheres grávidas, pois o antimônio pode

provocar alterações eletrocardiográficas e também é abortivo (ABADIR; PATEL;

HAIDER, 2010; MURRAY, 2012).

Os dois produtos mais utilizados são o Estibogluconato de sódio, vendido

comercialmente como Pentostam ® e o antimoniato de meglumine ou antimoniato de

N-metil-glucamina (Glucantime®). Os inconvenientes do tratamento com antimoniais

são o tempo de duração do tratamento (que pode variar de caso a caso), a administração

28

por via parenteral e a severa toxicidade do tratamento que produz efeitos colaterais

diversos, entre eles, náuseas, vômitos, mialgia, variações eletrocardiográficas

transientes, entre outras (ABADIR; PATEL; HAIDER, 2010; MURRAY, 2012).

As pentamidinas são drogas de 2ª escolha, entretanto apresentam poder curativo

inferior ao Glucantime®

e maior toxicidade, exigindo monitoramento constante do

paciente, porém são indicadas na infecção por L. guianensis. As mais utilizadas são

pentamidina-isotionato, hidroxiestilbamidina e estilbamidina. No caso do tratamento

com antimoniais e pentamidinas não funcionar, a terceira linha de tratamento são os

antibióticos Anfotericina B e Rifanpicina (REY, 2008).

Terapias alterativas têm sido pesquisadas tais como a utilização de crioterapia

por LAYEGH e colaboradores (LAYEGH et al., 2009) que a apontam como uma

terapia alternativa para a LTA, devido ao baixo custo, baixa taxa de complicações e alta

tolerabilidade. Já outro estudo (MORAES; VELHO; MAGALHÃES, 2008) questiona a

utilização da criocirurgia no tratamento de leishmaníase cutânea mucosa, devido à

possibilidade de disseminação dos parasitos.

Experimentos com TFD no tratamento de LTA tem sido explorados na última

década testando diversos fotossensibilizadores e diferentes protocolos e obtendo bons

resultados na destruição dos parasitos além de bons resultados cosméticos, apontando a

TFD como uma terapia promissora no tratamento de LTA (AKILOV et al., 2007a,

2009b; DUTTA; WAKI; CHANG, 2012; KOSAKA et al., 2007; PELOI et al., 2011).

3.6 TERAPIA FOTODINÂMICA

A TFD é um tratamento que associa um fotossensibilizador (FS), uma fonte de

luz e oxigênio para produzir uma reação fotoquímica, com o objetivo de causar

destruição seletiva de um tecido por meio deespécies reativas de oxigênio

principalmente, oxigênio singleto, capazes de induzir a inviabilização de células (Figura

6). Essa técnica consiste em duas etapas, onde primeiro é realizada a aplicação da droga

sensibilizadora e em seguida é feita a irradiação com luz visível, para ativar o FS

(ANDREEVA et al., 2010; ISSA; MANELA-AZULAY, 2010)

29

Figura 6: Esquematização do princípio da TFD.

Fonte: Autora.

A TFD começou a ser estudada por Oscar Raab em 1900, mas a era moderna

iniciou com estudos de Lipson e Schwartz em 1960 que injetou preparações de

hematoporfirina e observou fluorescência em lesões malignas a ficarem fluorescentes

(FERREIRA et al., 2009; SIBATA et al., 2000). Os primeiros experimentos envolvendo

TFD em humanos foram realizados por Tappenier e Jesionek em 1903, empregando

eosina como FS. Em 1924, Policard observou que porfirinas podiam ser encontradas em

elevadas concentrações em tumores malignos. Essas porfirinas são completamente

atóxicas, mas na presença de luz visível e oxigênio elas se tornam altamente tóxicas à

célula. Em fins dos anos 70 a TFD passou a ser reconhecida como uma alternativa para

o tratamento de câncer, tendo sido empregada com sucesso no tratamento de lesões

cutâneas(AKILOV et al., 2008; DAI; HUANG; HAMBLIN, 2010).

Castano, Demidova e Hamblin,(CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004,

2005a, 2005b) realizaram extenso trabalho visando esclarecer o modo como os

fotossensibilizadores interagem com as células alvo, como as formas reativas de

oxigênio se formam (Figura 7) e como são capazes de destruir células alvo e os

mecanismos de morte celular que podem ser desencadeados.

O mecanismo de ação da TFD e os campos de aplicação têm sido amplamente

estudados devido ao sucesso nos tratamentos dermatológicos, bem como o processo de

formação de espécies reativas de oxigênio (oxigênio singleto), que interagem com as

estruturas celulares e podem levar a morte celular (DAI et al., 2010; LOPEZ et al.,

2010).

30

Figura 7: Rota de formação das espécies reativas de Oxigênio.

Fonte: (Adaptado de CASTANO; DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004)

Para o sucesso da TFD é necessário levar em conta as características do

fotossensibilizador, como farmacocinética e biodistribuição, a estrutura química, e a

interação do fotossensibilizador com o tecido a ser tratado. Tais características

determinarão o comportamento do fotossensibilizador e os resultados desencadeados

nas células, como a morte celular, que é o efeito desejado(CASTANO; DEMIDOVA;

HAMBLIN, 2004, 2005a, 2005b)

Quanto melhor se conhecer o tecido ou células alvo do tratamento, maiores as

chances de se escolher um fotossensibilizador adequado (AKILOV et al., 2008).

Parâmetros como conformação da membrana celular, tempo de incubação pré-irradiação

e fonte de luz adequada, bem como o comportamento das moléculas

fotossensibilizadoras são características importantes para determinar o agente

fotossensibilizador (KOSAKA et al., 2007; RIORDAN et al., 2006).

3.7 FOTOSSENSIBILIZADORES

A escolha de um FS depende do tipo de tecido que se pretende tratar, das

características físico-químicas dos compostos e sua biodistribuição (CASTANO;

DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004).

Issa e Manela-Azuley (ISSA; MANELA-AZULAY, 2010) descrevem as

características ideais de um FS como sendo a pureza química, especificidade para o

tecido alvo, curto intervalo de tempo entre a administração do FS e o acúmulo máximo

na célula ou tecido alvo, tempo de meia-vida curto, rápida depuração, ativação por

31

comprimento de onda com ótima penetração no tecido alvo e a capacidade de produzir

grande quantidade de produtos citotóxicos com a intenção de maximizar a ação da TFD.

Quando Tappenier e Jodlbauer iniciaram suas pesquisas na área da TFD utilizaram a

eosina tópica numa concentração de 5% e luz artificial para tratamento de câncer

cutâneo não melanoma e postularam que a eosina, bem como a acridina poderiam atuar

como compostos fotossensibilizadores. Na década de 60 um novo composto foi descrito

e empregado como fotossensibilizador, o derivado de hematoporfirina (HpD) obtido a

partir da purificação da hematoporfirina (Hp) (ISSA; MANELA-AZULAY, 2010).

Nos anos 90 o uso de um composto precursor de FS foi descrito por Kennedy e

Pottier, o ácido 5-aminolevulínico (ALA), utilizado como precursor da protoporfirina

IX (PpIX), que produz resposta fotodinâmica localizada. Em 2004 foi aprovado a

utilização de um metil éster de ALA o metilaminolevulinato (MAL) para tratamentos de

TFD (MACCORMACK, 2008)].

Os fotossensibilizantes podem ser distribuídos em três famílias: FS baseados em

porfirinas (p.e. PpIX), FSbaseados em clorofila (p.e. clorinas, purpurinas,

bacterioclorinas) e corantes (p.e. ftalocianinas) (DAI et al., 2010; FERREIRA et al.,

2009).

3.7.1 CURCUMINA

Um pigmento extraído do açafrão da terra e amplamente utilizado na culinária

como conservante e corante a curcumina é extraída do rizoma da Curcuma longa e suas

aplicações médicas vêm sendo estudadas por mais de dois séculos. Essas aplicações

incluem propriedades anticancerígenas,controle microbiológico e até mesmo pesquisas

empregando curcumina no tratamento de Alzheimer, devido às suas propriedades anti-

oxidativa, anti-inflamatória e neuroprotetoras. Atualmente têm sido estudado também

como fotossensibilizador para controle de micro-organismos utilizando TFD (ARAÚJO,

2012; LEITE et al., 2014; PRIYADARSINI, 2014; SORIA-LOZANO et al., 2015;

VENIGALLA; GYENGESI; MUNCH, 2015; WIKENE; BRUZELL; TØNNESEN,

2015).

32

Figura 8: Espectro de absorção da curcumina utilizada nos experimentos, obtido em UV- vis (Denovix

DS-11)

Fonte: Autora.

Seu comprimento de onda de foto ativação, entre 300 e 500 nm, coincide com o

comprimento de biomoléculas como hemoglobina e melanina. Sendo assim, esses

compostos competiriam com a curcumina pela energia incidida (CASTANO;

DEMIDOVA; HAMBLIN, 2004). No entanto, como as lesões de LTA são superficiais,

secas e bem delimitadas, o tratamento com curcumina é uma alternativa viável. Além

disso, a baixa toxicidade da curcumina no escuro é uma qualidade apreciada em

qualquer FS (ARAÚJO et al., 2012; CAMPOS, 2013; MENDONÇA, 2012).

Outro aspecto que vem sendo estudado é a capacidade da curcumina de interagir

com material genético. Nafisi e colaboradores (NAFISI et al., 2009) realizaram um

estudo com a finalidade de determinar se a curcumina era capaz de se ligar ao DNA de

células de Timo de bezerro e ao DNA de levedura utilizando técnicas de FT-IR

(espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier). Foi observado que a

curcumina se liga ao DNA e RNA e promove agregação do ácido nucleico. Ogiwara e

colaboradores (OGIWARA et al., 2013) também demonstraram que a curcumina

interage com o DNA afetando o sistema de reparo e aumentando a apoptose em células

cancerígenas.

Além disso, Das e colaboradores (DAS et al., 2008) relatam que a interação da

curcumina com Leishmania influencia o ciclo celular do parasito e estimula a formação

33

de espécies reativas de oxigênio (EROs) além de aumentar a concentração de cálcio no

citosol, que leva a despolarização do potencial de membrana mitocondrial e liberação de

citocromo c no citosol, dentre outros eventos.

A capacidade da curcumina de induzir a formação de EROs sem a irradiação

pode otimizar os efeitos da TFD. Embora estudos como o de Koide (KOIDE et al.,

2002) e Saleheen (SALEHEEN et al., 2002) tenham demonstrado que a curcumina

possui efeito tóxico em cepas de Leishmania mesmo sem o processo de irradiação o

tempo decorrido para uma resposta positiva é maior que quinze horas. Portanto a TFD

pode potencializar o efeito da curcumina com menor tempo de exposição e menor

tempo de resposta ao tratamento do que a curcumina aplicada sozinha.

3.7.2 PORFIRINA

Porfirinas são compostos macrociclos tetrapirrólicos dos quais se derivam

compostos como o grupo heme e clorofilas. Sua síntese pode ocorrer a partir de

intermediários pirrólicos ou por modificação molecular de pigmentos naturais ou de

porfirinas sintéticas (ALVES, 2014). Porfirinas e seus derivados estão presentes em

compostos como clorofila e bacterioclorofilas, por exemplo, entretanto sua estrutura é

bastante hidrofóbica, o que pode dificultar a formulação de uma medicação que se

acumule apropriadamente no tecido alvo.

A origem da palavra “porfirina” é a palavra grega porphura, que descreve a cor

púrpura, remetendo à cor do corante. Os corantes porfirínicos são de cor vermelha ou

púrpura, podendo ser de origem natural ou sintética e tem em comum a estrutura

composta de macrociclicos conjugados com núcleo base constituído por quatro anéis

pirrólicos unidos entre si por pontes metínicas (ALVES, 2014; SETÚBAL, 2007).

Porfirinas e seus derivados desempenham papéis importantes em sistemas como

a fotossíntese e transferência de elétrons na cadeia respiratória e o transporte e

armazenamento de oxigênio (SILVA, 2007) e sua característica fotossensível a tornou

um fotossensiblizador amplamente estudado para aplicação fotodinâmica.

34

Figura 9: Espectro de absorção da porfirina utilizada nos experimentos, obtido em UV-Vis (Denovix DS-

11)

Fonte: Autora.

As porfirinas e seus derivados pertencem aos fotossensibilizadores de primeira

geração, apresentam espectro de absorção na faixa de 630 nm (Figura 9), alto

rendimento quântico do estado tripleto e são bons geradores de oxigênio no estado

singleto (MENDES, 2008). Além de fotossensível suas características de estabilidade

química e fotoquímica e sua afinidade por estruturas biológicas torna sua aplicação em

TFD ainda mais interessante (PIRES, 2012).

Embora as porfirinas e derivados sejam amplamente estudados na aplicação da

TFD algumas desvantagens são apontadas, como acúmulo em células epiteliais, quando

aplicada sistemicamente, fazendo com que o paciente tenha que ser afastado da luz por

um período aproximado de 4 semanas, além da baixa penetração da luz na pele, no

comprimento de onda na região de 630 nm. Entretanto, como a LTA causa lesões

superficiais na pele, a aplicação do FS seria realizada topicamente, e o acúmulo

observado na aplicação sistêmica pode ser evitado (ALVES, 2014; MENDES, 2008).

35

3.7.3 CLORINAS

Na busca por corrigir os problemas apresentados pelos fotossensibilizadores de

primeira geração foram desenvolvdos novos fotossensibilizadores, mais seletivos e mais

eficientes do que os de primeira geração. Os FS de segunda geração apresentam

absorção em comprimentos de onda maiores, períodos de fotossensibilização mais

curtos e maior rendimento na produção de oxigênio singleto (MORITZ, 2014).

Entre os FS’s dessa geração estão as ftalocianinas, bacterioclorinas e as clorinas.

Clorinas são derivados de porfirinas reduzidas e apresentam banda de absorção intensa

entre 660 e 690 nm. Aclorina e6 é obtida pela oxidação da clorofila-α e apresenta alto

rendimento quântico de formação de oxigênio singleto. As clorinas apresentam um

de seus anéis pirrólicos reduzidos, quando comparada às porfirinas, resultando em

maior absorção próximo à 650 nm (Figura 10) (MORITZ, 2014; PIRES, 2012).

Um exemplo de clorina já utilizada com sucesso e comercializada é o Foscan®

(meso-tetra(3-hidroxifenil)clorina) comercializada pela Biolitec Pharma, empresa

irlandesa. O Foscan® é aprovado para uso na Europa o tratamento de câncer de pescoço

e couro cabeludo com sucesso também no tratamento de câncer de mama, próstata e

câncer. O Verteporfin ou Visudyne®

também é aprovado para uso e comercializado

pela Novartis Pharmaceuticals. Embora ambos sejam clorinas, o método de obtenção

não é o mesmo (OLIVEIRA et al., 2015).

O Photodithazine (PDZ®) Veta-Grand é um fotossensibilizador russo baseado

em uma clorina. É produzido a partir da cianobactéria Spirulina platensis, cuja estrutura

foi modificada pela adição de N-metil-D-glicosamina 0,5% como agente solubilizante e

estabilizante e é encontrada em grande quantidade, sendo assim de baixo custo. O

Photodithazine possui banda de absorção na região do vermelho, no comprimento de

onda (λmax =662 nm). Sua alta eficácia parece estar relacionada com sua capacidade de

penetração através de membranas biológicas. O PDZ é eliminado rapidamente do

organismo, com 94% de eliminação em 24h e 98% em 48h (BERNAL, 2011;

CORREA, 2006; PERUSSI, 2007).

36

Figura 10: Espectro de absorção da clorina e6 utilizada nos experimentos, obtida em UV-Vis (Denovix

DS-11)

Fonte: Autora.

3.8 FONTES DE LUZ

As fontes de luz que podem ser empregadas na TFD são diversas, mas

pertencem a basicamente três grupos: os lasers, as lâmpadas de amplo espectro e

dispositivos à base de diodo (LED - Light Emitting Diode). Inicialmente eram usadas

fontes de luz não coerentes, utilizando filtros ópticos para selecionar um determinado

comprimento de onda (TOMAZINI; SOUZA; TEDESCO, 2007).

Os LEDs são uma fonte de luz popular na TFD e possuem comprimento de onda

variável (+/- 10 nm). Os lasers são fontes de luz monocromática de alta fluência,

apresentam um comprimento de onda específico, que deve ser escolhido de forma a

corresponder com o pico de absorção do FS. A fonte de luz utilizada na TFD, o

comprimento de onda e a aplicação ideal devem ser escolhidos sempre de acordo com o

FS que será utilizado, a fim de maximizar os efeitos positivos da TFD, visando sempre

o melhor para o paciente (DAI; HUANG; HAMBLIN, 2010; ISSA; MANELA-

AZULAY, 2010; MACCORMACK, 2008).

37

3.9 TFD NO TRATAMENTO DE LEISHMANÍASE TEGUMENTAR

AMERICANA

A TFD, usualmente aplicada em tratamentos dermatológicos, (tumores cutâneos,

acne, rejuvenescimento) vem sendo proposta como uma terapia alternativa promissora

no tratamento da LTA (MACCORMACK, 2008; SOHL et al., 2007).

Os efeitos da TFD no tratamento da LTA in vitro e in vivo tem sido alvo de estudos,

com diversos fotossensibilizadores como: Ftalocianinas, Ácido aminolevulínico (5-

ALA) e derivados, entre outros. Existe na literatura uma grande variedade na

concentração das drogas fotossensibilizadoras (0 - 500μM), formas de aplicação (tópica,

endovenosa) e diferentes parâmetros de irradiação (tempo de irradiação, comprimento

de onda, potência, etc.) (AKILOV et al., 2007a; DUTTA et al., 2005; ESCOBAR et al.,

2006). Muitos estudos não apresentam os parâmetros como potência da fonte de

emissão de radiação (laser ou LED) ou o número de sessões ou tempo de aplicação,

dificultando a comparação entre os tratamentos. As doses (J/cm2) empregadas variam de

0,8 a 100 J/cm2.

Quanto aos fotossensibilizadores foram utilizados, análogos de benzofenoxazina

(EtNBS, EtNBSe), PpIX (Protoporfirina IX), molécula porfirinóide (BpD), PPA904

(3,7-bis(N,N-dibutilamino)fenotiazinium brometo), AlPhCl, AlPc e ZnPc. Em seus

estudos Akilov e colaboradores (AKILOV et al., 2006, 2007b) testaram inicialmente a

TFD in vitro com PpIX e BpD e EtNBSe e EtNBS, observando por meio de análise de

viabilidade celular que a atividade fotodinâmica do FS aumentou na seguinte ordem:

PpIX<BpD<EtNBS<EtNBSe. Posteriormente os autores investigaram o EtNBSe e o

PPA904 em estudos in vitro e in vivo (camundongos) e observaram melhores resultados

do composto PPA904 baseado em análises de viabilidade celular após aplicação de

TFD. Em 2009 publicaram um estudo (AKILOV et al., 2009) exclusivamente com a

otimização do uso tópico do PPA904 para leishmaníase cutânea, que apresentou ótimos

resultados com aplicações periódicas, que diminuíram a carga parasitária, de 1 x 106

parasitos para aproximadamente 1x10 4

em 60 minutos após a aplicação da TFD, e

forneceram um bom resultado estético.

Escobar e colaboradores (ESCOBAR et al., 2006) também testaram ftalocianinas

(alumínio e Zinco ftalocianina) em promastigotas de Leishmania in vitro e observaram

que a irradiação com 670nm inibiu efetivamente promastigotas de Leishmania chagasi e

38

Leishmania panamensis, mas também enfatizam que estudos são necessários ainda para

conhecer a fotoatividade desses compostos em amastigotas internalizados por

macrófagos e ainda em modelos animais.

O Metvix® foi a droga escolhida por Sohl et al (SOHL et al., 2007) para o

tratamento experimental de um paciente com leishmaníase cutânea. Foi utilizado 100

J/cm2 em duas aplicações, com uma semana de intervalo, e uma terceira aplicação,

quatro semanas depois, para garantir o sucesso do tratamento. A lesão progrediu para a

cura rapidamente, e com um bom resultado estético.

Latorre-Esteves et al (LATORRE-ESTEVES et al., 2010) realizaram ensaios de

TFD com PPA904 e utilizaram L. major com uma proteína fluorescente verde, para

facilitar a monitorização da carga parasitária nos animais. Observando a fluorescência

logo após a aplicação dos tratamentos e nos dias seguintes eles observaram que a morte

do parasito ocorre no primeiro minuto de tratamento e depois disso a carga parasitária

permanece inalterada, sugerindo ainda que o FS aplicado não foi suficiente para

erradicar o parasito. Gardner e colaboradores (GARDNER et al., 2010) combinaram

acenaftoporfirinas com lipossomos artificiais de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) e a

lipossomos artificiais de uma mistura de DMPC, colesterol e diastearoil

fosfatidilglicerol (DSPG) para avaliar como a composição do lipossomo afeta

associações contínuas. Eles confirmaram que liposomos DMPC transportaram as

porfirinas aos promastigotas de Leishmania tarentolae e os compostos associados com

lipossomos DMPC:Colesterol:DSPG foram efetivos quando testados in vitro contra

amastigotas de Leishmania panamensis.

Todos esses estudos e resultados positivos indicam que a TFD pode ser mais

uma frente de tratamento à LTA, com a vantagem de não ser agressiva como o

tratamento convencional, de agir localmente e ser um procedimento não invasivo.

39

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Procedimento experimental

Os experimentos foram realizados no laboratório de Terapia Fotodinâmica do

IP&D – UNIVAP, em parceria com o Laboratório de Parasitologia e Biotecnologia -

UNIVAP e do IFSC- USP (Instituto de Física de São Carlos) - São Carlos.

4.2 Cultivo dos parasitos

As cepas de Leishmania major (LV39) e Leishmania braziliensis (M2904)

foram mantidas em meio LIT (Liver infusion tryptose) suplementado com 10% de Soro

Fetal Bovino, 2,5 mg/mL de hemina, 2% de urina estéril e 1% de Solução de

Penicilina/Estreptomicina. As cepas foram mantidas em estufa de crescimento a 26ºC, e

repiques de manutenção foram realizados semanalmente, após determinação da fase

logarítmica de crescimento de cada cepa.

4.3 Cultura dos macrófagos

A linhagem de macrófagos J774 foi mantida em meio RPMI- 1640

suplementado com 10% Soro Fetal Bovino, 1% de solução de

Penicilina/Estreptomicina, acondicionados em estufa de cultura a 37ºC com 5% de

CO2.

40

4.4 Infecção de macrófagos J774 com Leishmania spp.

Para a infecção dos macrófagos e posterior tratamento com a Terapia

fotodinâmica os macrófagos foram transferidos para placas de 24 poços, com lamínulas

no fundo, no volume de 1x104 células por poço, e permaneceram aderindo pelo período

da noite. Após o período de adesão das células, promastigotas foram acrescentados na

proporção de 10 parasitos para 1 macrófago e mantidos em estufa por 24 horas a 37ºC e

5% de CO2 (HERNÁNDEZ et al., 2012). Após a internalização dos parasitos, entre 5 a

6 horas, foi realizada a interação com os fotossensibilizadores.

4.5 Preparação dos fotossensibilizadores

Foram utilizadas como fotossensibilizador uma clorina e6, Porfirina e

Curcumina, cedidas pelo laboratório de Biofotônica - Instituto de Física, USP – São

Carlos.

Foram realizadas diluições seriadas (1:2) partindo da concentração de 500 µg/ml

até 7,8 µg/ml para Porfirina e Curcumina, e para clorina e6 foi realizada diluição seriada

(1:)2) partindo de 400 µg/ml até 6,25 µg/ml. A diferença na concentração da clorina

para os outros FS se deve ao melhor efeito observado nos testes iniciais com todos os

FSs. O período de incubação para todos os FS foi de uma hora à 26ºC para os

promastigotas e 37ºC para o co-cultivo de macrófagos e Leishmania.

Cada fotossensbilizador foi diluído conforme as instruções do fornecedor. A

concentração final de DMSO não é tóxica para as células em cultura. A curcumina foi

diluída inicialmente em DMSO (0,1% do volume final) e posteriormente foi diluída em

PBS para utilização nos testes. A clorina foi diluída DMSO (10% do volume final) e

posteriormente diluída em PBS. A porfirina foi diluída diretamente em PBS.

41

4.6 Internalização dos fotossensibilizadores em promastigotas de Leishmania major

e Leishmania braziliensis

Para verificar se após o período de uma hora os fotossensibilizadores foram

internalizados pelas promastigotas, L. major e L. braziliensis foram incubadas com os

FSs na concentração de 125 µg/ml. Após o tempo de incubação o meio com FS foi

retirado, os parasitos foram lavados com PBS por duas vezes e em seguida os parasitos

foram fixados com paraformaldeído a 4%, diluído em PBS, e então aderidos em

lamínulas circulares tratadas com Poli – l –lisina. As lamínulas foram montadas com

Prolong Gold antifading, contendo DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole,

dihydrochloride) para marcação de DNA. Todo o processamento foi realizado no

escuro, e as lâminas foram examinadas em microscópio confocal LSM 700 Zeiss.

Para o marcador DAPI foi utilizada excitação em 358 nm e emissão captada em

461 nm, já para a clorina foram utilizados para excitação o laser de 488 nm e emissão

captada acima de 500 nm. Para a porfirina foi utilizado excitação em 380 nm e a

emissão captada em 637 nm e para a curcumina foi utilizado excitação em 434 nm e

emissão captada em 520 nm.

4.7 Ensaios de TFD:

Foram realizados 3 experimentos independente, cada um em triplicata (n=9), e

os grupos experimentais foram divididos em:

42

Tabela 1 - Grupos experimentais utilizados no desenvolvimento do projeto. Curcumina Porfirina Clorina

Escuro

Controle Controle Controle

500 µg/ml 500 µg/ml 400 µg/ml



62,5 µg/ml 62,5 µg/ml 50 µg/ml

31,25 µg/ml 31,25 µg/ml 25 µg/ml

15,6 µg/ml 15,6 µg/ml 12,5 µg/ml

7,8 µg/ml 7,8 µg/ml 6,25 µg/ml

Irradiado

10 J/cm²

LED LED LED




62,5 µg/ml 62,5 µg/ml 50 µg/ml

31,25 µg/ml 31,25 µg/ml 25 µg/ml

15,6 µg/ml 15,6 µg/ml 12,5 µg/ml

7,8 µg/ml 7,8 µg/ml 6,25 µg/ml

Fonte: Autora.

Os grupos Controle e LED não foram tratados com nenhuma droga, e foram

manipulados da mesma forma que os grupos tratados.

Os grupos Escuro foram mantidos ao abrigo de luz, e os grupos Irradiados

foram submetidos à irradiação com fluência de 10 J/cm². Foram utilizados para irradiar

Biotables constituídos de 48 LEDs, com área de irradiação de 16 cm por 11 cm, capaz

de irradiar uma placa de poços inteira, com a mesma intensidade. Para a curcumina foi

utilizado uma Biotable, em 450 nm, 40 mW/cm² (Biotable, Biopdi) e tempo de

irradiação de 4 minutos e 10 segundos. Para Clorina foi utilizada biotable em 660 nm,

25 mW/cm² (Biopdi) e tempo de irradiação de 6 minutos e 40 segundos, e para Porfirina

foi utilizada biotable em 630 nm, 40mW/cm² e tempo de irradiação de 4 minutos e 10

segundos. Após irradiação as placas foram mantidas ao abrigo de luz em estufa a 26ºC,

bem como os grupos Escuro. Após um período de 18 horas de incubação foram

43

realizados os testes de MTT, Azul de tripan e morfologia, descritos abaixo. O teste de

MTT é realizado 18 horas após a aplicação da terapia, portanto, para a comparação de

todos os testes aplicados, foi respeitado o mesmo período para todos os testes.

4.8 Análise da viabilidade celular dos parasitos pelo do método de exclusão com

Azul de Tripan:

O teste de viabilidade pelo método de exclusão com azul de Tripan parte do

principio de que células viáveis não permitem que o corante entre, enquanto células

mortas permanecem coradas.

Para o método de exclusão com Azul de Tripan 10 μl da cultura de parasitos

submetidos ao tratamento descrito, foram adicionados a 90 μl do azul de Tripan. Após

homogeneizar e aguardar 5 minutos, o número de parasitos vivos e mortos foi contado

em câmara de Neubauer.

4.9 Determinação da atividade mitocondrial

A atividade mitocondrial dos promastigotas e das células infectadas, foi

verificada pelo teste de MTT, que consiste na degradação do sal de MTT ([3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]) em cristais de Formazan, pelas

células viáveis. Foram utilizadas placas de 96 poços. Após a interação com os FSs, e os

tratamentos de TFD foi adicionado a cada poço 50 µL de MTT diluído em PBS

(5mg/mL), suavemente agitado e reincubado por 4h a 26ºC para os promastigotas e

37ºC para os macrófagos, em atmosfera umidificada no escuro (SONG, 2011). Após o

tempo de incubação foi retirada a solução de MTT não metabolizado e foi adicionado

150 µL de DMSO em cada poço para a solubilização dos cristais de formazana e a placa

agitada vigorosamente. O teste foi finalizado medindo a densidade óptica em um leitor

Espectrofotômetro (Biotek® Sinergy HT) em 570 nm (Taylor et al., 2011). Os valores

de absorbância obtidos foram transformados em porcentagem de atividade mitocondrial

em relação ao controle através da seguinte fórmula:

44

4.10 Análise morfológica – coloração

Para avaliação morfológica dos parasitos 18 horas após os tratamentos uma

alíquota de cada grupo foi retirada e foram feitos esfregaços. Os esfregaços secaram por

um período de 12 horas e foram coradas. Para avaliação morfológica dos macrófagos as

células foram aderidas em lamínulas redondas, e após a interação com os FSs as células

foram fixadas e coradas, seguindo o protocolo abaixo.

Para a coloração de Giemsa, inicialmente as amostras foram cobertas com May

Grunwald, por um minuto. Após foi adicionado o mesmo volume de água, e após um

minuto foi retirado. Foi adicionado então o corante Giemsa, diluído em Tampão fosfato,

por 15 minutos. Após o período de 15 minutos o excesso de corante foi retirado, as

lamínulas foram lavadas em água corrente, secas e montadas lâminas permanentes para

análise microscópica da morfologia.

4.11 Análise estatística

Os dados provenientes dos testes acima citados foram submetidos ao teste

ANOVA One Way (BioEstat 5.0), utilizando como nível de significância α = 0,05.

45

5 RESULTADOS

5.1 Internalização da Curcumina

Após uma hora de incubação observou-se a curcumina no interior de ambas as

espécies de Leishmania. Na figura 11 observamos a internalização da Curcumina em L.

major e na figura 12 em L. braziliensis. Observa-se acúmulo de curcumina difuso no

citosol, entretanto, houve uma acumulação de curcumina no núcleo e cinetoplasto.

Figura 11: Localização da curcumina no interior de L. major após uma hora de incubação com

curcumina. (A) Marcação com DAPI, evidenciando núcleo (cabeça de seta) e cinetoplasto (seta), (B)

Fluorescência da Curcumina no citosol, núcleo e cinetoplasto, (C) sinais sobrepostos de DAPI e

curcumina.

Fonte: Autora.

Figura 12: L. braziliensis: (A) Marcação com DAPI, evidenciando núcleo (cabeça de seta) e cinetoplasto

(seta), (B) Fluorescência da Curcumina no citosol, núcleo e cinetoplasto, (C) sinais sobrepostos de DAPI

e curcumina;

Fonte: Autora.

46


com a curcumina

Após a interação de ambas as espécies com a curcumina no escuro foi observado

diferentes padrões de atividade mitocondrial para L. major e L. braziliensis (Figura

13A). Enquanto L. major apresentou maior atividade mitocondrial nos grupos tratados

com curcumina, em relação ao grupo controle (p<0,01), L. braziliensis apresentou

atividade mitocondrial menor, em relação ao grupo controle (p<0,01).

A análise da atividade dos grupos após TFD (Figura 13B) mostrou alteração de

ambas as espécies em relação ao grupo controle. L. major apresentou valores de

atividade mitocondrial acima do valor do grupo controle. L. braziliensis apresentou

atividade mitocondrial menor que o grupo controle para os tratamentos de 500 µg/ml,

250 µg/ml, 125 µg/ml e 7,8 µg/ml, enquanto para as outras concentrações os valores

apresentados estavam acima dos valores do grupo controle. Quando comparado os

dados do teste de Tripan com os resultados do MTT observou-se que as alterações na

atividade mitocondrial nos grupos mantidos no escuro não refletem em alteração da

viabilidade, uma vez que ambas as espécies apresentaram 100% de viabilidade (figura

13C).

Embora o tratamento de TFD com a curcumina tenha aumentado a atividade

mitocondrial de L. major, o número de promastigotas viáveis, avaliado pelo teste de

Tripan, diminuiu. A TFD com concentrações de 500 µg/ml à 31,25 µg/ml diminuíram a

viabilidade em menos de 50% para ambas as espécies testadas e mesmo a concentração

mais baixa utilizada, de 7,8 µg/ml teve impacto na viabilidade dos promastigotas

(Figura 13D). Comparando os resultados de ambas espécies é possível observar que a

viabilidade de L. braziliensis foi mais afetada que L. major no tratamento com as duas

maiores concentrações.

47

Figura 13: (A) Porcentagem de atividade mitocondrial em ambas as espécies após incubação com

curcumina no escuro. (B) Porcentagem de atividade mitocondrial de ambas as espécies após TFD com

curcumina e do grupo controle tratado apenas com LED na fluência de 10 J/ cm². (C) Viabilidade dos

promastigotas de ambas as espécies determinada pelo teste de exclusão com azul de Tripan do grupo

controle e tratados com Curcumina e mantidos no escuro. (D) Viabilidade dos promastigotas determinada

pelo teste de azul de Tripan de ambas as espécies após TFD com curcumina e do grupo controle tratado

apenas com LED na fluência de 10 J/cm² ( • p<0,01) (*p<0,01).

Fonte: Autora

5.3 Análise morfológica dos promastigotas após tratamento com Curcumina

Ambas as espécies apresentaram alterações morfológicas após a TFD com

curcumina (Figura 14). Os controles no escuro (14A) e irradiado (14I) de L. major

exibiram morfologia fusiforme com núcleo e flagelo evidente, além disso, o tratamento

com a curcumina no escuro (14B à 14H) não levou à alterações morfológicas

significativas. O tratamento com TFD (Figura 14J à 14N), causou alterações

significativas na morfologia dos parasitos de L. major. É possível notar as células

arredondadas, nas concentrações mais altas de curcumina.

48

Figura 14: Morfologia de L. major em todos os grupos experimentais, mantidos no escuro e irradiados

com fluência de 10 J/cm². A- controle no escuro, B- 500 µg/ml no escuro, C-250 µg/ml no escuro, D- 125

µg/ml no escuro, E- 62,5 µg/ml no escuro, F- 31,25 µg/ml no escuro, G-15,625 µg/ml no escuro, H- 7,8

µg/ml no escuro, I - LED (10J/cm²), J- PDT 500 µg/ml, K- PDT 250 µg/ml, L- PDT 125 µg/ml, M- PDT

62,5 µg/ml, N- PDT 31,25 µg/ml, O- PDT 15,625 µg/ml, P- PDT 7,8 µg/ml

Fonte: Autora.

Figura 15: Morfologia de L. braziliensis em todos os grupos experimentais, mantidos no escuro e

irradiados com fluência de 10 J/cm². A- controle no escuro, B- 500 µg/ml no escuro, C-250 µg/ml no

escuro, D- 125 µg/ml no escuro, E- 62,5 µg/ml no escuro, F- 31,25 µg/ml no escuro, G-15,625 µg/ml no

escuro, H- 7,8 µg/ml no escuro, I - LED (10J/cm²), J- PDT 500 µg/ml, K- PDT 250 µg/ml, L- PDT 125

µg/ml, M- PDT 62,5 µg/ml, N- PDT 31,25 µg/ml, O- PDT 15,625 µg/ml, P- PDT 7,8 µg/ml

Fonte: Autora.

49

A espécie de L. braziliensis também apresentou morfologia normal nos grupos

controle (Figura 15A) e irradiado (Figura 15I), com aspecto fusiforme, núcleo e flagelo

evidente. Os grupos tratados com curcumina no escuro (Figura 15B à 15H) também

apresentaram morfologia normal. O tratamento de TFD (Figura 15J à 15O) desencadeou

alterações morfológicas significativas em todas as concentrações testadas, com perda do

formato fusiforme (Figura 15J à 13O) e até mesmo do flagelo (Figura 15P).


cultivo de macrófagos e promastigotas após tratamento com a curcumina

Após os testes com promastigotas de ambas as espécies foram selecionadas as

concentrações que apresentaram os melhores resultados na TFD para realizar os testes

de atividade mitocondrial e exclusão com azul de Tripan em co-cultivo de macrófagos e

Leishmania. As concentrações selecionadas para Curcumina foram 500 µg/mL, 250

µg/mL, 125 µg/mL e 62,5 µg/mL.

Foi observado que a atividade mitocondrial das células foi afetada após interação

com a curcumina no escuro (Figura 16A), sendo que houve um padrão de diminuição da

atividade mitocondrial, com as maiores concentrações apresentando menor atividade

mitocondrial. Esse padrão de atividade se repetiu para o grupo apenas de macrófagos

(J774), e para os grupos infectados com L. major e L. braziliensis.

Os grupos que foram irradiados com 10 J/cm² sem nenhuma interação com a

curcumina apresentaram atividade mitocondrial similar ao grupo controle, enquanto os

grupos tratados com TFD apresentaram diminuição da atividade mitocondrial em

relação ao grupo controle (p<0,01). Quando observamos os grupos tratados com TFD,

os macrófagos infectados com L. major tiveram atividade mitocondrial mais baixa que

os grupos apenas de macrófagos ou os infectados com L. braziliensis.

50

Figura 16: (A) Porcentagem de atividade mitocondrial de macrófago J774 e do co-cultivo com ambas as

espécies após incubação com curcumina no escuro e após TFD (irradiado com fluência de 10 J/cm²). (B)

Viabilidade de macrófago J774 e do co-cultivo com ambas as espécies determinada pelo teste de exclusão

com azul de Tripan do grupo controle e tratados com Curcumina e mantidos no escuro e após TFD

(irradiado com fluência de 10 J/cm²) ( • p<0,01) (*p<0,01).

Fonte: Autora.

O teste de Tripan (Figura 16B) demonstrou que embora tenha havido impacto na

atividade mitocondrial após interação com a curcumina no escuro, não houve toxicidade

para nenhum dos grupos, que apresentaram 100% de viabilidade (Figura 16). O

tratamento de TFD entretanto apresentou 100% de toxicidade para todos os grupos

testados, sendo possível observar todas as células fortemente coradas pelo azul de

Tripan, evidenciando que todas as quatro concentrações testadas foram capazes de

inviabilizar macrófagos e Leishmania.

51

5.5 Internalização da Porfirina

Após uma hora de incubação observou-se a Porfirina no interior de ambas as

espécies de Leishmania, difusa no citosol. É possível observar a acumulação de

Porfirina no citosol de L. major (Figura 17) após o período de incubação, bem como em

L. braziliensis (Figura 18).

Figura 17: Localização da Porfirina no interior de L. major após uma hora de. (A) Marcação com DAPI,

evidenciando núcleo e cinetoplasto, (B) Fluorescência da porfirina no citosol, (C) sinais sobrepostos de

DAPI e porfirina;

Fonte: Autora.

Figura 18: Localização da Porfirina no interior de L. braziliensis: (A) Marcação com DAPI, evidenciando

núcleo e cinetoplasto, (B) Fluorescência da Porfirina no citosol, (C) sinais sobrepostos de DAPI e

porfirina.

Fonte: Autora.

52


com a Porfirina

Após a interação com a porfirina foram observados padrões de atividade

mitocondrial semelhante para ambas as espécies. L. major e L. braziliensis

apresentaram redução significativa da atividade mitocondrial, comparada ao grupo

controle (p<0,01) (Figura 19A), com todos os grupos apresentando menos de 40% de

atividade mitocondrial. Após a TFD esses valores são menos de 10% de atividade

mitocondrial para ambas as espécies (Figura 19B), sendo que L. major apresentou

valores inferiores aos de L. braziliensisis. O teste de exclusão com azul de Tripan

demonstrou que a interação da porfirina no escuro com ambas as espécies causou leve

toxicidade nas concentrações mais altas (Figura 19C), comprovando que, embora a

atividade mitocondrial tenha sido drasticamente afetada nos grupos tratados no escuro, a

viabilidade não foi afetada da mesma forma. Os grupos tratados com TFD por sua vez

apresentaram diminuição na viabilidade. L. major apresentou bons resultados nas

concentrações de 500 µg/ml, 250 µg/ml e 125 µg/ml, mas nas concentrações mais

baixas a viabilidade não foi tão afetada quanto em L. braziliensis, que apresentou bons

resultados desde 500 µg/ml até a concentração de 31,25 µg/ml (Figura 19D).

53

Figura 19: Porcentagem de atividade mitocondrial em ambas as espécies do grupo controle e após

incubação com porfirina no escuro. (B) Porcentagem de atividade mitocondrial de ambas as espécies após

TFD com porfirina e do grupo controle tratado apenas com LED na fluência de 10 J/cm². (C) Viabilidade

dos promastigotas de ambas as espécies determinada pelo teste de exclusão com azul de Tripan do grupo

controle e tratados com Porfirina e mantidos no escuro. (D) Viabilidade dos promastigotas determinada

pelo teste de azul de Tripan de ambas as espécies após TFD com Porfirina e do grupo controle tratado

apenas com LED na fluência de 10 J/cm² ( • p<0,01) (*p<0,01).

Fonte: Autora.

5.7 Análise morfológica após tratamento com Porfirina

A morfologia de ambas espécies não se mostrou alterada nos grupos controle

escuro (Figura 20A), no controle irradiado (Figura 20I) ou nos grupos tratados com

Porfirina e mantidos no escuro (Figura 20B à 20H). Nesses grupos é possível observar

o formato fusiforme, presença do núcleo íntegro e flagelo. Após a TFD entretanto, é

possível observar alterações na morfologia. No grupo TFD 500 µg/ml (Figura 20J) é

impossível identificar núcleo, cinetoplasto ou qualquer estrutura interna, mas o flagelo

permanece intacto. Os outros tratamentos de TFD também levaram à alterações

significativas na morfologia de L. major.

Os controles no escuro (Figura 21A) e irradiado (Figura 21I) bem como os

tratamento de L. braziliensis com Porfirina não apresentaram alterações na morfologia

do parasito (Figura 21B à 21H), enquanto os grupos tratados com TFD (Figura 21J à

54

21P) apresentaram alterações morfológicas significativas, com perda do formato de

fuso, e dificuldade em visualizar as estruturas internas do parasito.

Figura 20: Morfologia de L. major em todos os grupos experimentais, tratados com Porfirina, mantidos

no escuro e irradiados com fluência de 10 J/cm². A- controle no escuro, B- 500 µg/ml no escuro, C-250

µg/ml no escuro, D- 125 µg/ml no escuro, E- 62,5 µg/ml no escuro, F- 31,25 µg/ml no escuro, G-15,625

µg/ml no escuro, H- 7,8 µg/ml no escuro, I - LED (10J/cm²), J- PDT 500 µg/ml, K- PDT 250 µg/ml, L-

PDT 125 µg/ml, M- PDT 62,5 µg/ml, N- PDT 31,25 µg/ml, O- PDT 15,625 µg/ml, P- PDT 7,8 µg/ml.

Fonte: Autora.

55

Figura 21: Morfologia de L. braziliensis em todos os grupos experimentais, tratados com Porfirina,

mantidos no escuro e irradiados com fluência de 10 J/cm². A- controle no escuro, B- 500 µg/ml no escuro,

C-250 µg/ml no escuro, D- 125 µg/ml no escuro, E- 62,5 µg/ml no escuro, F- 31,25 µg/ml no escuro, G-

15,625 µg/ml no escuro, H- 7,8 µg/ml no escuro, I - LED (10J/cm²), J- PDT 500 µg/ml, K- PDT 250

µg/ml, L- PDT 125 µg/ml, M- PDT 62,5 µg/ml, N- PDT 31,25 µg/ml, O- PDT 15,625 µg/ml, P- PDT 7,8

µg/ml.

Fonte: Autora.


cultivo de macrófagos e promastigotas após tratamento com a Porfirina



de atividade mitocondrial e exclusão com azul de Tripan. As concentrações

selecionadas para Porfirina foram 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL e 62,5 µg/mL.

Observou-se alteração na atividade mitocondrial dos grupos tratados no escuro

com porfirina, (Figura 22A), com valores acima do grupo controle para todos os grupos,

exceto J774 e J774 infectado com L. braziliensis quando tratados com 500 µg/mL, que

apresentaram valores menores que o grupo controle. Após a TFD com Porfirina

entretanto houve diminuição significativa da atividade mitocondrial em todos os grupos,

sendo que a concentração de 500 µg/ml foi a que apresentou diminuição mais

expressiva pra ambas as espécies. O grupo infectado por L. major apresentou menor

56

atividade mitocondrial que o infectado com L. braziliensis em todas as concentrações

testadas.


espécies após incubação com porfirina no escuro e após TFD (irradiado com fluência de 10 J/cm²). (B)


com azul de Tripan do grupo controle e tratados com porfirina e mantidos no escuro e após TFD

(irradiado com fluência de 10 J/cm²) ( • p<0,01) (*p<0,01).

Fonte: Autora.

O teste de Azul de Tripan demonstrou que houve leve toxicidade no escuro em

todos os grupos tratados com Porfirina, mais expressivas nas concentrações de 500

µg/mL e 250 µg/mL e menos expressivas nas concentrações de 125 µg/mL e 62,5 µg/mL

(Figura 22B). Entretanto o tratamento de TFD com porfirina foi 100% eficaz em todas

as concentrações testadas.

57

5.9 Internalização da Clorina e6

Após uma hora de incubação com a Clorina na concentração de 125 µg/mL

observou-se acumulação no citosol, com aglomerações, possivelmente de vesículas

endocíticas. Ambas as espécies, L.major (Figura 23) e L. braziliensis (Figura 24)

apresentaram acumulação difusa no citosol, e pequenos pontos de acumulação do FS.

Figura 23: Localização da Clorina no interior de L. major após uma hora de incubação. (A) Marcação

com DAPI, evidenciando núcleo e cinetoplasto, (B) Fluorescência da clorina e6 no citosol (C) sinais

sobrepostos de DAPI e Clorina e6

Fonte: Autora.

Figura 24: Localização da Clorina no interior de L. braziliensis: (A) Marcação com DAPI, evidenciando

núcleo e cinetoplasto, (B) Fluorescência da Clorina no citosol (C) sinais sobrepostos de DAPI e Clorina

Fonte: Autora.

58


com a clorina e6

A avaliação da atividade mitocondrial de L. major e L. braziliensis após a

interação com clorina e6 no escuro demonstrou padrões similares para ambas as

espécies. Houve diminuição na atividade, em relação ao grupo controle (Figura 25A),

com L. braziliensis apresentando valores menores que L. major. Após a TFD no entanto

os valores de atividade mitocondrial foram ainda menores do que os valores no escuro

(Figura 25B), para ambas as cepas, que apresentaram menos de 10 % de atividade

mitocondrial.

Figura 25: (A) Porcentagem de atividade mitocondrial em ambas as espécies após incubação com clorina

e6 no escuro. (B) Porcentagem de atividade mitocondrial de ambas as espécies após TFD com clorina e6

e do grupo controle tratado apenas com LED na fluência de 10 J/cm². (C) Viabilidade dos promastigotas

de ambas as espécies determinada pelo teste de exclusão com azul de Tripan do grupo controle e tratados

com clorina e6 e mantidos no escuro. (D) Viabilidade dos promastigotas determinada pelo teste de azul de

Tripan de ambas as espécies após TFD com clorina e6 e do grupo controle tratado apenas com LED na

fluência de 10 J/cm² ( • p<0,01) (*p<0,01)

Fonte: Autora.

O teste de Tripan demonstrou que, embora a atividade mitocondrial dos grupos

tratados com clorina e6 no escuro tenha sido afetada, essa diminuição não afetou

diretamente na viabilidade dos parasitos (Figura 25C). É possível que a interação com o

59

a clorina tenha levado à alterações na atividade mitocondrial, mas que isso não afete a

viabilidade. Após a aplicação da TFD a viabilidade foi afetada em todos os grupos,

sendo que, para L. major a terapia com as concentrações de 400 µg/mL, 200 µg/mL,

100 µg/mL, 50 µg/mL e 25 µg/mL foi mais eficiente (Figura 25D), enquanto as

menores concentrações não mostraram a mesma eficácia. Para L. braziliensis as

concentrações mais eficazes foram as de 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50

µg/mL.

5.11 Análise morfológica após tratamento com clorina e6

Foram observadas alterações morfológicas em ambas as espécies após os

tratamentos de TFD. A espécie de L. major apresentou morfologia característica nos

grupos controle (Figura 26A) e irradiado (Figura 26I), bem como nos grupos tratados

com Clorina e mantidos no escuro (Figura 26B à 26H). Após a TFD foi possível

observar alteração significativa na morfologia de L. major (Figura 26J à 26P), em todas

as concentrações testadas.

L. braziliensis também teve morfologia afetada pela TFD com clorina e6 (Figura

27J à 27P), em todas as concentrações testadas, entretanto, nas concentrações mais altas

as alterações foram mais drásticas, sendo possível observar completa perda da forma de

fuso na concentração de 400 µg/mL (Figura 27J). Os grupos controle escuro (Figura

27A), controle LED (Figura 27I) e todos os grupos tratados com clorina e6 e mantidos

no escuro apresentaram morfologia característica.

60

Figura 26: Morfologia de L. major em todos os grupos experimentais após tratamento com clorina e6 e

controles. A- controle no escuro, B- 400 µg/ml no escuro, C-200 µg/ml no escuro, D- 100 µg/ml no

escuro, E- 50 µg/ml no escuro, F- 25 µg/ml no escuro, G-12,5 µg/ml no escuro, H- 6,25 µg/ml no escuro,

I - LED (10J/cm²), J- PDT 400 µg/ml, K- PDT 200 µg/ml, L- PDT 100 µg/ml, M- PDT 50 µg/ml, N-

PDT 25 µg/ml, O- PDT 12,5 µg/ml, P- PDT 6,25 µg/ml

Fonte: Autora.

Figura 27: Morfologia de L. braziliensis em todos os grupos experimentais após tratamento com clorina

e6 e controles. A- controle no escuro, B- 400 µg/ml no escuro, C-200 µg/ml no escuro, D- 100 µg/ml no

escuro, E- 50 µg/ml no escuro, F- 25 µg/ml no escuro, G-12,5 µg/ml no escuro, H- 6,25 µg/ml no escuro,

I - LED (10J/cm²), J- PDT 400 µg/ml, K- PDT 200 µg/ml, L- PDT 100 µg/ml, M- PDT 50 µg/ml, N-

PDT 25 µg/ml, O- PDT 12,5 µg/ml, P- PDT 6,25 µg/ml

Fonte: Autora.

61


cultivo de macrófagos e promastigotas após tratamento com a clorina e6



de atividade mitocondrial e exclusão com azul de Tripan. As concentrações

selecionadas foram 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL e 50 µg/mL, para Clorina e6.


espécies após incubação com clorina no escuro e após TFD (irradiado com fluência de 10 J/cm²). (B)


com azul de Tripan do grupo controle e tratados com clorina e mantidos no escuro e após TFD (irradiado

com fluência de 10 J/cm²) ( • p<0,01) (*p<0,01).

Fonte: Autora.

62

A analise da atividade mitocondrial dos macrófagos isolados e do co-cultivo

com L. major e L. braziliensis demonstrou que a interação das células com a clorina no

escuro (Figura 28A) promoveu alteração da atividade mitocondrial em todos os grupos,

de forma particular em cada um deles. Os macrófagos isolados apresentaram baixa

atividade mitocondrial para quando tratados com 400 µg/mL e 50 µg/mL, enquanto os

tratamentos com 200 µg/mL e 100 µg/mL promoveram aumento da atividade

mitocondrial, em relação ao controle. O co-cultivo de macrófagos e Leishmania major

apresentou diminuição na atividade mitocondrial para todos os grupos, exceto o tratado

com 50 µg/ml no escuro, que permaneceu com atividade próxima ao controle. Quanto à

atividade mitocondrial dos grupos tratados com TFD (Figura 28A) foi possível observar

diminuição em todas as concentrações, sendo a concentração de 400 µg/mL a que

promoveu menores valores de atividade mitocondrial. Nas maiores concentrações

testadas o grupo que teve menor atividade mitocondrial após TFD foi o de co-cultivo

deJ774 e L. braziliensis.

O teste de Azul de Tripan (Figura 28B) mostrou que as concentrações de 400

µg/mL e 200 µg/mL foram citotóxicas para os macrófagos isolados e em co-cultivo com

ambas as espécies, com 100% de mortalidade para 400 µg/mL para todos os grupos no

escuro, e 100% de mortalidade para J774 e J774 infectados com L. major, e 50% de

mortalidade para J774 infectados com L. braziliensis na concentração de 200 µg/mL. A

TFD com clorina e6 (Figura 28B) promoveu 100% de mortalidade para todos os grupos.

Em nenhum dos experimentos de TFD os grupos controle irradiados (LED)

apresentaram diminuição na viabilidade, comprovando que a fluência usada em todos os

grupos não foi prejudicial para promastigotas ou macrófagos.

63

6 DISCUSSÃO

O presente estudo demonstrou que a TFD com os fotossensibilizadores testados

foi capaz de impactar na viabilidade de promastigotas de Leishmania e em macrófagos

infectados. A informação sobre a localização dos fotossensibilizadores no interior dos

parasitos é importante para explicar os resultados obtidos. Foi observado que cada

fotossensibilizador apresentou comportamento diferente. Após uma hora de incubação a

curcumina se encontra difusa no citosol mas também se concentra no núcleo e

cinetoplasto, em ambas as espécies. A porfirina, por sua vez, encontra-se difusa no

citosol, em ambas as espécies, sem aparente acumulação em organelas específicas,

embora sejam necessárias marcações específicas para se saber com certeza. A clorina

se apresentou fortemente concentrada no citosol, mas também demonstrou afinidade

pela estrutura flagelar da Leishmania.Outros trabalhos também observaram que a

localização do FS varia, de acordo com sua composição. Gardner e colaboradores

(GARDNER et al., 2010) observaram que Acenaftoporfirinas em L. tarentolae e L.

panamensis apresentaram afinidade pelas membranas celulares, além de apontar que a

utilização de lipossomos de Acenaftoporfirina aumentava a internalização do composto,

em comparação à droga livre. A diferença na composição da Acenatoporfirina utilizada

por Gardner e a Porfirina utilizada nesse estudo levam ao acúmulo do FS em diferentes

estruturas, no citosol, no caso da porfirina, e nas membranas, no caso da

Acenatoporfirina, podendo levar à diferentes resultados da terapia.

Uma particularidade da curcumina, seu acúmulo no núcleo e cinetoplasto

chamou atenção, nos resultados obtidos nesse estudo. A interação da curcumina com o

material genético têm sido objeto de estudo de alguns artigos. Nafisi e colaboradores

(NAFISI et al., 2009) realizaram um estudo com a finalidade de descobrir se a

curcumina seria capaz de se ligar ao DNA de células de Timo de bezerro e RNA de

levedura utilizando técnicas de FT-IR e espectroscopia de UV-Visível e observaram que

a curcumina se ligou ao DNA e ao RNA. Ogiwara e colaboradores (OGIWARA et al.,

2013) também demonstraram que a curcumina interagem com o DNA afetando os

sistemas de check points e aumentando a apoptose em células cancerígenas.

O acúmulo de curcumina no núcleo e cinetoplasto das promastigotas pode

explicar os resultados de atividade mitocondrial obtidos após o tratamento com TFD,

que indicaram aumento de atividade mitocondrial, uma vez que a mitocôndria é uma

64

organela muito ativa durante o processo de morte celular. Entretanto, foi possível

observar que as espécies responderam de forma diferente ao teste de atividade

mitocondrial. Enquanto L. major teve atividade mitocondrial aumentada após interação

com a curcumina no escuro, L. braziliensis apresentou valores menores de atividade

mitocondrial, enquanto a interação com Clorina e porfirina promoveram respostas

similares de ambas as espécies. Considerando que a curcumina é capaz de se ligar ao

DNA no núcleo e cinetoplasto, é possível que a atividade mitocondrial aumentada após

TFD seja em decorrência dessa interação.

Diversos estudos utilizam ensaios de MTT para determinar a porcentagem de

células viáveis, entretanto é necessário levar em consideração que nem sempre o teste

de MTT apenas fornece informação precisa sobre a viabilidade das células (DUTTA;

WAKI; CHANG, 2012; DUTTA et al., 2011; GARDNER et al., 2010; HERNÁNDEZ

et al., 2012; SILVA et al., 2015; SONG et al., 2011; TAYLOR et al., 2011). O presente

estudo demonstrou que após o tratamento com a curcumina a atividade mitocondrial foi

afetada tanto nos grupos mantidos no escuro quanto nos tratamentos de TFD, entretanto

as alterações na atividade mitocondrial não refletiram diretamente na viabilidade,

avaliada pelo teste de Azul de Tripan. Nem sempre a presença de atividade

mitocondrial, significa que a célula está viável, ou que irá sobreviver ao tratamento. A

espécie de L. major, por exemplo, apresentou mais de 150% de atividade mitocondrial

após tratamento de TFD com 500 µg/ml de curcumina, mas o teste de Tripan apontou

menos de 20% de parasitos viáveis. Após o tratamento com clorina no escuro, ambas as

espécies apresentaram diminuição na atividade mitocondrial, entretanto o teste de

Tripan demonstrou 100% de parasitos viáveis. O mesmo comportamento foi observado

após a interação com a porfirina. Foi observada diminuição drástica na atividade

mitocondrial dos grupos tratados no escuro, mas o teste de Azul de Tripan demonstrou

que os parasitos estavam viáveis.

O padrão de atividade mitocondrial alterou, no entanto, quando o teste foi

aplicado no co-cultivo de macrófagos e promastigotas. O tratamento com a curcumina

levou à diminuição da atividade mitocondrial dos grupos tratados com curcumina no

escuro e irradiados. Entretanto, o teste de Azul de Tripan demonstrou que, embora a

atividade mitocondrial do grupo escuro tenha diminuído, a viabilidade desse grupo foi

de 100%, enquanto o grupo tratado com TFD apresentou 100% de morte. A porfirina,

por sua vez, levou a um aumento da atividade mitocondrial dos grupos escuros,

enquanto após a TFD foi observada diminuição da atividade mitocondrial. O teste com

65

Azul de Tripan evidenciou uma baixa toxicidade da Porfirina no escuro, enquanto a

TFD desencadeou 100% de morte celular. O padrão de atividade mitocondrial

apresentado pelos grupos tratados com clorina foi similar ao da porfirina. Aumento da

atividade mitocondrial no escuro e diminuição após a TFD. O teste de azul de Tripan no

entanto demonstrou citotoxicidade nas duas concentrações mais alta, no escuro, e 100%

de morte celular após a TFD.

Em seus estudos DUTTA et al. (DUTTA et al., 2005) testaram o efeito da cloro

alumínio ftalocianina in vitro em Leishmania amazonensis em co-cultivo com

macrófagos da linhagem J774 utilizando, entre outros métodos, o de exclusão por Azul

de Tripan. Foi observado que em estágio extracelular e intracelular o FS não era tóxico

ao parasito ou aos macrófagos, entretanto quando irradiados com aproximadamente 3.6

J.cm-2

rapidamente eram mortas. A diminuição do número total de células viáveis

ocorreu em concentrações do fotossensibilizador de 0 a 10 μg/ml e doses de 3,0 J/cm2, o

que demonstra a ação fototóxica e a possibilidade da TFD como terapia alternativa aos

tratamentos convencionais. Além disso, observaram também alterações morfológicas

dos parasitos após aplicação da TFD e diminuição da motilidade dos parasitos. No

presente estudo foi observado que a TFD alterou a morfologia dos parasitos

drasticamente, após os tratamentos com todos os FSs testados, principalmente nas

concentrações mais altas, diminuindo a motilidade dos parasitos e a viabilidade. Deve-

se levar em consideração que não basta apenas um FS ser eficaz. Pelo fato da LTA ser

uma doença negligenciada, que afeta muitas vezes pessoas provenientes de populações

carentes e trabalhadores rurais, é necessário que a terapia seja acessível. Enquanto a

síntese de uma ftalocianina é um processo caro e delicado, a curcumina é um composto

natural, com potencial de ser produzido nacionalmente a menor custo.

Taylor e colaboradores (TAYLOR et al., 2011) utilizaram o teste de MTT para

determinar a viabilidade após o tratamento com Dietil e Dimetil carbaporfirina, e

observaram toxicidade dos compostos no escuro. No presente estudo a interação dos

promastigotas com a Porfirina no escuro promoveu diminuição drástica na atividade

mitocondrial em todas as concentrações testadas, mas quando analisamos os dados do

teste de Tripan, é possível observar que não houve mortalidade nesses grupos,

demonstrando que a Porfirina utilizada nesse estudo pode ser mais apropriada para

aplicação clínica.

Pinto e colaboradores (PINTO; SOARES; MITTMANN, 2011) aplicaram TFD

com Alumínio ftalocianina tetrasulfonada e avaliaram com o teste de azul de Tripan, e

66

observaram que o tratamento foi capaz de diminuir a viabilidade, além de constatar que

L. braziliensis foi mais susceptível ao tratamento que L. major. No presente estudo a

suscetibilidade das cepas variou de acordo com o fotossensibilizador utilizado. L.

braziliensis foi mais afetada pela TFD com Porfirina e clorina em maiores

concentrações, contudo em menores concentrações desses FS sua viabilidade foi maior

do que L. major. No tratamento de TFD com curcumina L. major se mostrou mais

resistente ao tratamento de TFD nas concentrações de 500 µg/ml e 250 µg/ml, e mais

suscetível que L. braziliensis para as outras concentrações.

O resultado da microscopia confocal contribuiu para o entendimento do aumento

da atividade mitocondrial dos grupos tratados com a curcumina. Como a curcumina se

acumula no núcleo e no cinetoplasto, organela que é descrita como uma porção

especializada da mitocôndria (SOUZA, 2009), pode-se sugerir que essa interação com a

curcumina pode ter levado ao aumento da atividade mitocondrial observado em todos

os grupos. Quanto à diminuição da atividade mitocondrial dos grupos tratados com

clorina e porfirina no escuro, claramente são motivadas pela interação dos parasitos com

os compostos, uma vez que os grupos controle apresentam atividade mitocondrial

normal. Foi demonstrado pela microscopia confocal que os FS foram internalizados

pelos parasitos, e embora a atividade mitocondrial fosse baixa, o teste com o azul de

Tripan demonstrou que as células estavam viáveis.

Alterações morfológicas foram observadas em todos os grupos tratados com

TFD, sendo que as alterações mais expressivas ocorreram nos tratamentos com as

maiores concentrações. Além disso, foi possível observar que os grupos controle no

escuro, em todas as concentrações não apresentaram alterações morfológicas

significativas. Após o tratamento de TFD com a curcumina, ambas as espécies

apresentaram drásticas alterações morfológicas, com perda da característica fusiforme.

Embora o tratamento de TFD com a porfirina tenha levado à alterações morfológicas, o

padrão de alterações foi diferente da curcumina. Enquanto a última levou à evidente

perda da forma de fuso, a porfirina parece causar maiores danos no interior da célula,

levando inclusive à presença de células sem núcleo evidente, embora o formato ainda

seja o característico. A forte concentração da clorina no interior de ambas as espécies de

Leishmania e seu acúmulo na membrana flagelar provavelmente contribuíram para o

forte impacto que a TFD teve na morfologia dos parasitos, sendo possível observar,

além da alteração do formato, células sem flagelo.

67

Hernandez e colaboradores (HERNÁNDEZ et al., 2012) observaram alterações

morfológicas em amastigotas após tratamento de TFD com cloro alumínio Ftalocianina.

Embora os amastigotas estivessem internalizados por macrófagos, a TFD foi capaz de

causar alterações no parasito. No presente estudo, após TFD com curcumina foi

observado perda do formato fusiforme, núcleo e cinetoplasto nem sempre estavam

visíveis, e em alguns casos o flagelo estava ausente. Em estudo morfológico Souza

(SOUZA, 1995) demonstrou que tripanossomatídeos possuem uma estrutura formada

por uma camada de microtúbulos abaixo da membrana plasmática. Essa estrutura

garante ao parasito o formato fusiforme e limita a internalização de moléculas, que

ocorre majoritariamente pelo bolso flagelar do parasito. As alterações morfológicas

demonstradas nesse estudo podem sugerir que a TFD foi capaz de afetar essa camada de

microtúbulos, levando à severas alterações no formato das células.

A manifestação cutânea da leishmaniose é caracterizada por intensa resposta

imunológica, com forte presença de macrófagos nas regiões de lesão. A Leishmania é

capaz de resistir e se adaptar à situações extremas, como às proteases presentes no tubo

digestivo do inseto e à presença de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e óxido

nítrico produzidos pelos macrófagos (CARNEIRO et al., 2016).

Estudos utilizando a TFD em modelo de co-cultivo de Leishmania e macrófagos

são de grande importância para determinar a capacidade do tratamento de eliminar não

só os parasitos livres, mas também as formas internalizadas. Dutta e colaboradores

(DUTTA et al., 2011) realizaram estudo para verificar o efeito da TFD com

Ftalocianinas de Zinco e Silício, observando que o parasito internalizado era susceptível

ao tratamento. Em 2012 o mesmo grupo (DUTTA; WAKI; CHANG, 2012) comparou

os efeitos da TFD com Uroporfirina e alumínio ftalocianina em co-cultivo de

macrófagos e Leishmania, com o diferencial de fotossensibilizar os promastigotas antes

da infecção dos macrófagos. Dois dias após a infecção as culturas foram tratadas com

ALA (1 mM) e, um dia após, irradiados com 10 J/cm². Com esse tratamento, foi

observada diminuição significativa da carga parasitária, principalmente com a

associação de Uroporfirina e Alumínio Ftalocianina. Os protocolos testados no presente

estudo foram capazes de eliminar 100% dos macrófagos infectados após a TFD,

indicando que os fotossensibilizadores testados são eficientes e podem ser utilizados

futuramente em modelos animais, para determinar sua eficácia in vivo.

Taylor e colaboradores (TAYLOR et al., 2011) também utilizaram o modelo de

co-cultivo para avaliar a ação de carbaporfirinas em macrófagos infectados com

68

Leishmania amazonensis, obetendo melhor resposta com a Dimetil Carbaporfirina

acetal irradiada por duas horas com lâmpada fluorescente, perfazendo uma fluência de

1.1 J/cm², do que com a Dietil carbaporfirina acetal, com o mesmo tempo de irradiação.

Entretanto, quando foi testado um período de irradiação de quatro horas (2.1 J/cm²), a

resposta de ambos os compostos foi similar, evidenciando que o protocolo utilizado

também pode interferir no resultado final da terapia.

Quando comparamos os tratamentos é possível inferir que todos os FS testados

foram capazes de afetar a viabilidade dos parasitos livres. Entretanto o único tratamento

capaz de matar 100% dos parasitos foi o de TFD com clorina, na concentração de 400

µg/ml na cepa de L. braziliensis. Quando observamos a interação com os macrófagos,

os tratamentos escolhidos foram capazes de reduzir em 100% a viabilidade com os três

fotossensibilizadores. É possível que os macrófagos concentrem mais o FS em seu

interior, potencializando a TFD, ou ainda que a TFD tenha matado os macrófagos e os

parasitos liberados tenham sido retirados nos processos de lavagem e preparação dos

testes. Seriam necessários testes com o sobrenadante original da cultura, para

recuperação de parasitos livres após o tratamento, que deve ser abordado em estudos

futuros do grupo de pesquisa.

Todos os fotossensibilizadores testados nesse trabalho foram capazes de

diminuir a viabilidade dos parasitos livres em co-cultivo com os macrófagos, sendo

possíveis alternativas para a aplicação em testes in vivo, no futuro. Entretanto vale

destacar que a curcumina apresentou a capacidade de penetrar no núcleo e cinetoplasto

dos parasitos além de não apresentar toxicidade no escuro, nem para os promastigotas

livres, nem no co-cultivo.

69

7 CONCLUSÃO

Os três FSs testados são internalizados por ambas as espécies de Leishmania

testadas após o período de uma hora. A curcumina se encontrar no citosol, núcleo e

cinetoplasto das promastigotas, a porfirina se apresentou difusa no citosol e a clorina se

apresentou difusa no citosol, com presença de vacúolos endocíticos e afinidade pelo

flagelo.

A porfirina e a clorina promoveram a redução da atividade mitocondrial dos

grupos mantidos no escuro e de TFD, enquanto a curcumina promoveu aumento na

atividade mitocondrial em ambos os grupos. O teste de exclusão com Azul de Tripan

permitiu concluir que nenhum dos FSs é tóxico para os promastigotas no escuro,

entretanto a TFD foi diminuiu drasticamente a viabilidade de ambas as espécies de

Leishmania testadas. A morfologia dos parasitos foi drasticamente alterada após todos

os tratamentos de TFD com os fotossensibilizadores testados.

Os testes realizados com os parasitos internalizados demonstraram que o

tratamento de TFD com curcumina, porfirina e clorina foi capaz de, em todas as

concentrações testadas, levar à 100% de morte celular.

Dos três fotossensibilizadores testados, a clorina foi a única capaz de eliminar

100% dos parasitos de L. braziliensis, após o tratamento com 400 µg/ml. Entretanto, a

mesma concentração apresentou toxicidade no escuro no tratamento dos macrófagos. A

porfirina também apresentou bons resultados no tratamento de promastigotas, embora

tenha apresentado leve toxicidade na interação com os macrófagos, no escuro. A

curcumina apresentou bons resultados em ambos os modelos, promastigotas livres e

macrófagos infectados, além de não apresentar toxicidade no escuro para nenhum dos

grupos. Desta forma, todos os três fotossensibilizadores testados são promissores para

utilização no tratamento de LTA, entretanto a curcumina se destaca, pela ausência de

toxicidade no escuro.

70

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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