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Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia I Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Ciências Biológicas www.lameb.ufsc.br

Campus Universitário Trindade, Ala Nova, Interblocos B-C, 3° Andar, Córrego Grande, Florianópolis, SC, CEP 88040-970

(48) 3721 5226, [email protected]

Curso de Captura e Análise de Dados através do Software ImageLab®/Chemidoc

MP®

Roteiro Aula Presencial 1

Esta aula será ministrada no LAMEB I.

1) Instalação do Software

Instalar o Software ImageLab® através da pendrive fornecido pelo LAMEB I.

Explicar que o software não é livre, que a única extensão de arquivo (.scn) possível de ser

analisada é a gerada por ele mesmo e que os dados gerados por ele só podem ser abertos

no próprio ImageLab®.

2) Apresentação do Equipamento

O Chemidoc MP® BioRad® é um sistema de fotodocumentação de géis e membranas,

composto por um Sistema Óptico (uma Câmera de 16 bit CCD – charge-coupled devide – a

qual tem como fotodetector um chip de silício, altamente, o qual é sensível à luz; um

Compartimento principal chamado Universal Hood III que contém uma lâmpada UV e

lâmpada branca para capturar as imagens sem precisar de uma sala escura – as lâmpadas

necessitam de no mínimo 15 minutos para aquecerem corretamente ; para reações

quimioluminescentes – não requer filtros-, fluorescentes - filtro padrão, para distinguir as

cores precisaria comprar os filtros e os LEDs específicos - e colorimétricas - filtro padrão,

luz branca. O equipamento do LAMEB I não possui filtros, qualquer luz emitida é captada.

Não há distinção de cores!!) e por um Sistema Eletrônico (um computador no qual está

instalado o Software ImageLab® que é utilizado para realizar todas as funções do

equipamento, desde focalização, captura, anotações, recortes e análises de dados). O

equipamento possui botões de controle externos, mas estes não são utilizados uma vez

que é possível ajustar todas essas funções automaticamente através do Software.

3) Tipos de Ensaios e Reagentes Compatíveis

Como dito anteriormente, o Chemidoc MP® possibilita a captura de imagens

quimioluminescentes, fluorescentes e colorimétricas. Todos os reagentes disponíveis no

mercado podem ser utilizados, com exceção do reagente Brometo de Etídio que por

motivos de biossegurança está com seu uso proibido no laboratório!

4) Visão Global do Software ImageLab®

Abrir o Software ImageLab®. Mostrar a caixa de diálogo Start Page, que abre quando o

software é inicializado e serve de atalho para acessar as principais funções, os últimos





arquivos analisados, etc. Fechar esta caixa. Mostrar uma visão geral do software, janela

principal, barra de ferramentas, barra de status, etc.

Abrir a figura de uma membrana (LAMEB 2014-01-22 14hr 48min_Exposure_60.0sec).

Em Analysis Tool Box, estão as ferramentas para as análises/quantificações

das bandas e raias. Para fazer uma análise automática da membrana,

selecionar a opção Auto-Analysis. Em Image Tools, é possível cortar, girar e

inverter as imagens capturadas. Em Lane and Band Tools, detectar bandas,

colunas e raias, redimensionar, ajustar, excluir ou adicionar bandas e raias.

Em Normalization, é possível fazer a normalização das amostras através da

análise de membranas que foram marcadas com dois anticorpos ao mesmo

tempo. Em MV – Molecular Weight, peso molecular, é possível fazer cálculos

para identificar os valores de cada banda, determinar quais são as amostras

padrão e definir qual método de regressão será utilizado para o cálculo. Em

Quantity Tools, é possível fazer a quantificação de bandas através de valores

absolutos ou relativos. Em Annotation Tools, é possível fazer anotações para

chamar a atenção de uma área da figura. Em Volume Tools, é possível

realizar a quantificação manual dentro uma área definida.





Selecione em Menu Commands, File, New Protocol para

abrir um novo protocolo; Open, para abrir um

protocolo já existente; Recent Images, para abrir um

dos últimos arquivos adquiridos; Recent Protocols,

para abrir um protocolo que foi utilizado

recentemente; Save, para salvar; Save As, para

renomear um arquivo salvo e/ou salvar um protocolo;

Close, para fechar a tela que está ativa; Close All, para

fechar todas as telas abertas; Export, para exportar

uma figura ou uma tabela de análises (for publication –

exportar uma figura inclusive com os dados de análise,

pode ser .bmp, .jpg, .png, .tiff; for analysis – exportar

uma figura sem os dados de análise, só é possível

exportar em .tiff; for PulseNet, gera um arquivo de 8 bit

tiff com resolução de 300 dpi); Lane and Band Table to

Excel, dados das raias e bandas são exportados em .xls;

Lane and Band Table to File, os dados são exportados em .csv; Volume Table to Excel,

exporta os dados dos volumes em .xls; Volume Table to File, , exporta os dados dos volumes

em .csv; Image Info, informações sobre o gel/membrana como data, detalhes da captura,

tempo de exposição, etc; Page Setup, orientação, margens, etc; Print, para imprimir; Exit,

fecha o software.

Selecione em Menu Commands, Edit, Undo, para

desfazer a última ação; Redo, para restaurar a última

ação; Screenshot, para capturar a imagem da tela;

Default Imager, para definir a figura como padrão;

Instrument Setup, para visualizar o número de série

do equipamento e os parâmetros de calibração;

Report Settings, para configurar como serão gerados

os relatórios; Preferences, Protocol – para verificar

como está definido o modo de nomeação dos

arquivos; Preferences, Colors, para definir as cores

das linhas e letras das análises feitas.

Selecione em Menu Commands, View, Image

Overview, para abrir uma janela pequena que

mostra toda a imagem capturada com um

retângulo vermelho destacando a área que está





sendo visualizada; Image Transform, para abrir um gráfico histograma que permite ajustar

os valores de claro e escuro da figura, não interfere no dado, interfere somente no modo

de visualização; Operations History, para mostrar a sequência das análises que foram feitas

tanto pelo usuário como pelo software.

Selecione em Menu Commands,

Window, Tile, para alinhar todas

as janelas abertas, todas as janelas

ficam visíveis ao mesmo tempo;

Tile Horizontal, para alinhar todas

as janelas abertas na horizontal;

Tile Vertical, para alinhar todas as

janelas abertas na vertical;

Cascade, para arrumar as janelas

em cascata; Imitate Zoom, para

colocar todas as janelas em cascata; Imitate Transform, para deixar todas as imagens

abertas com o mesmo brilho e contraste; Next, para passar para a próxima imagem aberta;

Previous, para retornar à imagem anterior aberta.

5) Captura de Imagens de Géis e Membranas

Nesta etapa, utilizar a transparência com as bandas e o padrão de peso molecular

impressos.

Selecionar na barra de ferramentas a opção New Protocol e clicar em Single Channel (a

opção Multichannel não está disponível, pois como explicado anteriormente, o

equipamento do LAMEB I possui somente a configuração básica). Ao selecionar essa

opção, abrirá a janela Protocol 1 – Protocol Setup na qual está selecionada, na parte azul e

esquerda da tela, a opção Gel Imaging. Na parte cinza a direita da tela, na opção Application

selecionar o tipo de protocolo que será utilizado (Application, Select, escolher entre Nucleic

Acids Gels (para géis de ácidos nucléicos, SyBr Green, Safe, GelRed...), Protein Gels (para géis

de proteínas, Comassie Blue, Orange, Silver Stain...), Blots (para membranas de blot com

anticorpos conjugados a fluoróforos específicos; reações de quimioluminescênia – Chemi,

Chemi Hi Resolution, Chemi Hi Sensitivity; reações colorimétricas como para avaliação do

padrão de peso molecular – Colorimetric; Custom (para customizar protocolos).





Dica 01: Para os protocolos de Blot, na opção Chemi é a aquisição de imagens sem que seja

realizado nenhum aperfeiçoamento pelo software; na opção Chemi Hi Sensitivity o software

intensifica a sensibilidade do equipamento, assim qualquer sinal de luz presente na

membrana será visualizado; na opção Chemi Hi Resolution o software melhora a resolução

das imagens, define melhor as bandas. Por isso, o padrão do LAMEB I é utilizar a opção

Chemi Hi Resolution, pois não adianta ter sinal de bandas se elas não forem definidas e

comparáveis!

Após a opção desejada ser selecionada, o software mostra os detalhes dos recursos do

equipamento que serão usados para a aquisição das imagens, como o tipo de filtro e o tipo

de lâmpada (Filter, Light, Binning...).

Ainda na parte cinza a direita da tela, através da opção Imaging Area é possível definir as

dimensões do gel/membrana que será documentado. A definição das medidas pode ser

feita através da inserção das medidas específicas em cm, ou selecionando um tipo de

gel/membrana já existente.





A definição não precisa ser exata, pois após colocar o gel na bandeja do

equipamento é possível fazer o ajuste do tamanho através da opção zoom.

Para isso, clicar no botão Position Gel (botão amarelo, ao lado esquerdo da

tela).

Vai aparecer um grid (linhas azuis, com uma cruz central vermelha) para que a

membrana/gel seja facilmente ajustada. Abaixo dessa imagem, existe uma barra de zoom,

através dessa barra é possível aumentar/diminuir o foco para ajustar o tamanho ideal.

Caso a membrana esteja muito fora do grid, é necessário abrir o compartimento principal

e posicioná-la mais para o centro da bandeja. Após posicionar o gel/membrana, clicar no

botão Cancel Run (botão vermelho, ao lado esquerdo da tela) para voltar para a tela

anterior e definir os demais parâmetros.

Dica 02: Para a captura das imagens, o ideal é colocar uma membrana de cada vez. Isso

propicia uma melhor resolução das figuras obtidas, pois o número de pixels que o

equipamento gera em cada imagem capturada é o mesmo. Sendo assim, quanto menor o

tamanho da membrana (e o menor número de membranas expostas ao mesmo tempo),

melhor a resolução final da figura!

Dica 03: Caso mais de uma membrana seja capturada ao mesmo tempo, devem-se

preconizar as que estão marcadas com o mesmo anticorpo! Pois, caso contrário, é possível

que uma das membranas (marcação mais intensa) “roube” o sinal da outra membrana

(marcação mais fraca).

Dica 04: Para fazer capturas de imagens no modo colorimétrico, o ideal é que o

plástico/transparência utilizado como base para colocar a membrana/gel seja altamente

transparente. Assim é possível evitar que seja gerada luz como background na membrana!





Após o posicionamento do gel, é necessário definir a que modo de exposição o

gel/membrana será submetido. Para isso, escolher em Image Exposure uma das três

opções disponíveis (1ª opção: The software will automatically optimize the exposure time

for intense or fait bands – nesta opção o software define automaticamente o melhor tempo

de exposição e faz uma única aquisição de imagem; escolher entre faint bands se o

pesquisador souber que as bandas são fracas e intense bands se as bandas forem fortes; 2ª

opção: Manually set exposure time – nesta opção é necessário definir manualmente um

tempo exato para a captura da imagem; será feita a captura de uma única imagem; 3ª

opção: Signal Accumulation Mode – esta opção de modo de acúmulo de sinal é útil somente

para ensaios quimioluminescentes; nela o usuário define o tempo que a membrana será

exposta e quantas imagens serão feitas nesse período).

Dica 05: Quando a 3ª opção for utilizada, não é bom definir um número muito grande de

imagens a serem capturadas pelo software; isso porque, quanto maior o número de

imagens capturadas, maior será o background que será acumulado nas imagens das

membranas; o acúmulo desse background acaba reduzindo a qualidade da resolução das

figuras que são produzidas.

Na parte cinza a direita da tela, na opção Display Options é possível escolher entre destacar

ou não os pixels saturados nas fotos; para isso, deixar selecionada a opção Highlight

saturated pixels, dessa forma, os pixels saturados são marcados em vermelho; ainda em

Display Options, selecionando a opção Image Color é possível escolher a cor que as bandas

serão mostradas; é possível, por exemplo, definir para que as bandas sejam mostradas em

azul como se o gel estivesse marcado com Comassie Blue; vermelhas como se o gel tivesse

sido marcado com Brometo de Etídio, etc.

Após definir todos os parâmetros, clicar no botão verde à esquerda da tela, Run Protocol.

As imagens são capturadas e ficam expostas na parte inferior da tela; para salvar todas as

imagens clicar em cima da última com o botão direito e selecionar a opção Save All; para

salvar uma figura específica, clicar sobre ela e selecionar a opção Save. Depois que as





imagens de interesse forem salvas, clicar no botão vermelho à esquerda da tela, Cancel

Run.

As imagens capturadas são salvas na extensão .scn. Como dito anteriormente, esta

extensão abre unicamente no Software ImageLab®. As imagens podem ser salvas na

extensão .tiff, mas neste caso não poderão ser analisadas neste software.

6) Armazenamento de Dados

Os dados devem ser gravados em CD-R ou DVD-R. Não é permitido o uso de pendrive. Os

dados não podem ser enviados por e-mail, não é possível instalar antivírus do computador

que está acoplado ao equipamento devido a um conflito de sistemas.

Os dados ficam armazenados no equipamento durante um mês. Após esse período, é

realizado um backup dos dados, no qual somente uma membrana de cada experimento é

salva. Esse backup fica guardado no LAMEB I.

7) Cuidados com o Equipamento

A bandeja do equipamento é feita de um material extremamente sensível e qualquer

arranhão na sua superfície poderá prejudicar a análise dos resultados das imagens

capturadas. Por isso, é obrigatória a exposição das membranas em cima de transparências

plásticas, o uso de pinças é proibido e a limpeza deve ser feita somente com água destilada

e papel extramacio.

Roteiro Aula Presencial 2

Esta aula será ministrada em uma sala de aula.

8) Visão Geral das Imagens Capturadas

Abrir uma figura para realizar as análises (LAMEB 2014-01-22 14hr

48min_Exposure_60.0sec).

Mostrar que ao posicionar o cursor em cima das bandas é possível verificar a posição dos

pontos através dos valores de x e y e determinar um valor numérico da Intensidade (Int)

de cada ponto das bandas. Esses valores podem ser observados através da Status Bar

(barra de status localizada na parte inferior da tela). O valor máximo de intensidade de

cada ponto é de 65535 (varia de 0 a 65535).





Na Barra Results Overview (barra de ferramentas que fica acima da figura, na horizontal),

através da opção Display Gel Options é possível selecionar o que você deseja mostrar ou

omitir nas figuras.

Em Zoom Tools é possível aumentar ou diminuir o tamanho da figura; Fit in Window para

colocar a figura de volta ao seu tamanho original. Em Image Transform para ajustar o

brilho e o contraste da figura, os valores mínimos e máximos dependem dos valores de

claro e escuro presentes na figura; o gráfico inicial é o histograma de distribuição das

frequências de intensidade de luz captada e mostra a variação total do dado; Invert Image

Display, possibilita inverter as cores da figura; em Highlight Saturated Pixels é possível

definir se os pixels saturados serão ou não destacados; Log Histogram muda o eixo y no

histograma para dispor o número de pixels em cada valor de intensidade; através do botão

Auto Scale o software define os valores de brilho e contraste automaticamente.





Em Image Colors dá para selecionar a cor que deseja que as bandas sejam apresentadas

(para simular determinado corante).

Em Switch 3D View para visualizar as bandas em 3D, dá para ver a “altura” das bandas.





Em Image Info mostra os detalhes da figura, definições de análises e anotações.

9) Análise das Imagens Capturadas

Para a análise automatizada dos

dados, selecionar a opção Auto-

Analysis, escolher entre Low

Band Detection Sensitivity, para detectar

bandas que estão bem destacadas, High

Band Detection Sensitivity, para detectar

bandas fracas, ou Custom para definir um

valor de sensibilidade entre 1 e 100; em

Molecular Weight Analysis Settings é

possível definir os dados do padrão de

peso molecular, Standard Lanes para

definir as raias em que os padrões foram

colocados e Regression Method para definir

qual entre quatro tipos de regressão linear (Point to Point, Linear, Cubic Spline ou

Logística) será utilizado para as análises.

Para a análise manual dos dados, selecionar a opção Image

Tools, Flip para inverter a imagem na horizontal ou na

vertical; Rotate para girar para a esquerda, para a direita ou

para customizar para os casos em que a membrana ficou

torta; Crop para recortar a membrana, aparece uma caixa

vermelha que define onde a membrana será cortada; Invert Data

para os casos de membranas/géis que utilizaram corantes negativos

e para zimografias; Merge para sobrepor uma figura

quimioluminescente em cima de uma figura colorimétrica (ex:

membrana que tem o padrão de peso molecular colorido!).





Dica 06: Sempre analisar os dados nas figuras originais, não nas sobrepostas! Elas perdem

resolução!

Dica 07: Só é possível sobrepor figuras que tenham exatamente o mesmo tamanho e

estejam posicionadas exatamente da mesma forma!

Através da opção Lane and Bands é possível detectar as

raias automatica ou manualmente. No modo manual é

necessário identificar o número de raias. As raias podem ser

ajustadas quanto ao tamanho, espessura e inclinação,

podem ser adicionadas ou excluídas; esses ajustes podem ser

realizados conjunta ou separadamente; em Background

Substraction (é como se fosse um disco de rolagem hipotético, para

que o background seja removido; quanto menor o valor do Disk

Size, menor quantidade de background é removida; segundo o

fabricante o valor mais apropriado é 10) é possível retirar ou não a

diferença causada pelo background da membrana/gel,

selecionando a opção Apply to Selected Lane a operação será

realizada somente na raia que está selecionada; As mesmas opções

também estão disponíveis para as análises das bandas.





Através da opção MW (Molecular Weight) Analysis Tools é possível

definir os tipos de padrão de peso molecular/pares de base que

foram usados (marcas e modelos – novos modelos podem ser

inseridos no programa), definir as raias nas quais estão os

padrões e definir o tipo de regressão que será usada para as

análises.

Em Quantity Tools, é possível fazer a quantificação

absoluta e relativa das bandas; selecione Relative Quantity

Tab para fazer a quantificação relativa das bandas; clicar

em Select e em seguida clicar na banda que será usada

como referência; aparecerá um pequeno R na banda

selecionada e a partir dai as outras bandas serão calculadas em

relação a esta; a banda definida como R (Relative) terá um valor

hipotético de 1,00 (100%), para visualizar esses dados é preciso abrir

a função Analysis Table. A quantificação relativa é a razão entre o

volume da banda entre o volume da banda da amostra dividido pelo

volume da banda de referência. Valores maiores que 1,00 indicam que

a banda da amostra alvo é maior (maior quantidade de proteína) do

que a banda da amostra referência, enquanto que valores menores

que 1,00 indicam que a banda da amostra alvo é menor (menor

quantidade de proteína) que a banda referência. Selecione Absolute

Quantity Tab para a quantificação absoluta das bandas; essa





quantificação é baseada em um padrão (padrão de bandas) usando uma curva de

calibração; clicar em Select e selecionar pelo menos duas bandas padrão e definir os

valores de quantificação dessas bandas em Standard Bands. Quando as bandas são

selecionadas aparece um pequeno A (Absolute), o valor de cada banda deve ser informado;

em Units defina a unidade que o dado está sendo analisado e em Regression o tipo de

regressão (Linear, Point to Point ou Cubic Spline) que será utilizada para analisar os dados;

os valores da curva são representados no gráfico, por triângulos verdes e os valores

desconhecidos por triângulos vermelhos.

Em Annotation Tools, é possível anotar/destacar coisas importantes no

gel/membrana; incluir textos (alinhamento, letra, tipo, tamanho, cor,

rotação) e setas (cor, rotação).

Em Volume Tools, é possível quantificar manualmente as

bandas/raias que não estão com formato e tamanho

apropriado, como nos Dot-Blots. Essa ferramenta pode ser

utilizada para identificar a intensidade de sinal de bandas, pontos ou

qualquer outro tipo de dado; para selecionar as bandas podem ser

utilizadas ferramentas de retângulo, círculo ou à mão livre; as

amostras podem ser definidas como Unknown (U, amostras que

precisam ser quantificadas), Standard (Std, amostras de valores

conhecidos) e Background (B, para excluir o background do cálculo

de quantificação – quando o desenho da banda é feito, alguns pixels

que não fazem parte do dado acabam sendo incluídos; esse valor

precisa ser removido da quantificação, ele pode ser

excluído/calculado de dois modos local – calcular um background

para cada amostra, global – um background para todo o gel; para

cada volume, as intensidades dos pixels em 1-pixel da borda ao redor

do volume são adicionados juntos e divididos pelo número total de





pixels da borda), para isso é necessário clicar duas vezes em cima do desenho definido da

banda e selecionar a opção desejada; na opção Custom Label é possível definir um novo

nome para a banda. É necessário definir a unidade que será utilizada nas análises e o tipo

de regressão que essas amostras serão analisadas; a opção Force Through Origin força que

o início da curva seja na origem do gráfico (0,0); os valores corrigidos aparecem em

Adjusted Volume, Analysis Table.

Quantificação Relativa, ainda em Volume Tools, ao clicar

com o botão direito (2x), abre uma caixa de diálogo na qual

é possível selecionar a opção Reference Volume; se

selecionada, o software faz o cálculo e mostra o resultado na

coluna Relative Quantity dentro de Analysis Table; esse é um

modo de quantificação relativa e o cálculo feito pelo

software é o Background – Adjusted Volume dividido pelo

Background – Adjusted Reference Volume; valores acima de

1 indicam que a amostra tem mais daquela proteína do que

a referência enquanto que valores menores que 1 indicam

que a amostra tem menos da determinada proteína do que a

referência.

Quantificação Absoluta, ainda em Volume Tools, ao clicar

com o botão direito (2x), abre uma caixa de diálogo na

qual é possível selecionar o tipo de amostra (Unknown,

Standard ou Background), caso seja selecionada a opção

Standard será necessário atribuir valores a estas

bandas; os padrões ficam identificados na ordem em

que foram criados; para ver a curva, abrir Standard

Curve, Volume Standard Curve Tab.





Após finalizar as análises, é possível gerar um relatório de todos os dados através da opção

Report que está localizada na barra de ferramentas; ao clicar nessa opção, abre uma caixa

de diálogo com um arquivo em pdf; nessa caixa, existe uma barra de ferramentas, através

da qual é possível definir os dados/parâmetros que o usuário deseja incluir no relatório;

gerar um arquivo pdf; imprimir o relatório.

Em Lane Profile, é possível analisar as bandas como gráficos; dentro desta opção, use a

caixa Scale to fit graph para selecionar uma escala fixa ou variável entre as linhas que

estão sendo avaliadas; selecione Include Background para incluir ou excluir o background.





Através da opção Standard Curve, é possível visualizar a curva do padrão de peso

molecular, a curva de quantificação (relativa ou absoluta) ou a curva de volume.

Dica 08: O dado para comparação entre as amostras é o “Volume (Int)”.

Dica 09: Relative Front (RF) é o valor determinado pela distância percorrida pelas

moléculas (RF = distância percorrida pelo soluto/distância percorrida pelo solvente).

Para exportar as imagens adquiridas/quantificadas; selecione File/Export; Export for

publication – exportar uma figura inclusive com os dados de análise, pode ser .bmp, .jpg,

.png, .tiff; for analysis – exportar uma figura sem os dados de análise, só é possível exportar

em .tiff; for PulseNet, gera um arquivo de 8 bit tiff com resolução de 300 dpi); Lane and

Band Table to Excel, dados das raias e bandas são exportados em .xls; Lane and Band Table

to File, os dados são exportados em .csv; Volume Table to Excel, exporta os dados dos

volumes em .xls; Volume Table to File, , exporta os dados dos volumes em .csv; Image Info,

informações sobre o gel/membrana como data, detalhes da captura, tempo de exposição,

etc; Page Setup, orientação, margens, etc; Print, para imprimir; Exit, fecha o software.





Dica 10: Pulsenet é um sistema de eletroforese em campo pulsado, padronizado pelo

Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, para a identificação de padrões de

DNA de determinadas espécies de bactérias que podem ser transmitidas por alimentos.

A opção Normalization tem a possibilidade de ser usada em casos

de análises de membranas que foram marcadas com dois

anticorpos ao mesmo tempo (ensaios Multiplex).

Tipos de Regressão: O tipo de regressão deve ser definido de acordo com o tipo de dado

que está sendo analisado; Linear (Semilog, o slope – inclinação da reta – é calculado através

do primeiro e do último ponto da linha formada; quanto mais próximo de 1 o valor de R,

melhor a curva); Point-to-Point (o slope – inclinação da reta – é calculado através de uma

média obtida dos valores calculados ponto a ponto); Logística (gera uma linha em formato

de S); Cubic Spline (gera uma linha que passa exatamente por todos os pontos da curva).





Roteiro Aula Virtual 1

Repetir as análises realizadas na Aula Presencial 2 com os dados de experimentos

próprios e enviá-los para o e-mail [email protected].

Elaborado por Bibiana Sgorla de Almeida.

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