Laboratório Nacional de Computação Científica - LNCC ESTUDO...
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Laboratório Nacional de Computação Científica - LNCC Programa de Pós-Graduação em Modelagem Computacional Mestrado em Modelagem Computacional com Ênfase em Bioinformática e Biologia Computacional ESTUDO ESTRUTURAL E TERMODINÂMICO DE MUTANTES DA PROTEÍNA c-ABL RESISTENTES AO IMATINIB Por Elen Gomes Pereira Junho de 2009 Petrópolis, RJ - Brasil
Transcript of Laboratório Nacional de Computação Científica - LNCC ESTUDO...
Laboratório Nacional de Computação Científica - LNCC
Programa de Pós-Graduação em Modelagem Computacional
Mestrado em Modelagem Computacional com Ênfase em Bioinformática e Biologia Computacional
ESTUDO ESTRUTURAL E TERMODINÂMICO DE MUTANTES DA PROTEÍNA c-ABL RESISTENTES AO IMATINIB
Por Elen Gomes Pereira
Junho de 2009 Petrópolis, RJ - Brasil
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ESTUDO ESTRUTURAL E TERMODINÂMICO DE MUTANTES DA PROTEÍNA c-ABL RESISTENTES AO IMATINIB
Elen Gomes Pereira
DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO LABORATÓRIO NACIONAL DE COMPUTAÇÃO CIENTÍFICA COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS EM
MODELAGEM COMPUTACIONAL
Aprovada por:
________________________________________ Prof. Ernesto Raúl Caffarena, PhD (presidente)
______________________________________
Prof. Laurent Emmanuel Dardenne, PhD
__________________________________________ Prof. Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, PhD
_____________________________ Prof. Paulo Mascarello Bisch, PhD
PETRÓPOLIS, RJ – BRASIL JUNHO DE 2009
Pereira, Elen Gomes
P436e Estudo estrutural e termodinâmico de mutantes da proteína c- Abl
resistentes ao Imatinib / Elen Gomes Pereira - Petrópolis, RJ:
Laboratório Nacional de Computação Científica, 2009.
xvii, 156 p. : il. ; 29 cm. Orientador : Ernesto Raúl Caffarena. Dissertação (Mestrado) – Laboratório Nacional de Computação
Científica, 2009. 1. Metabolismo energético. 2. Células – Metabolismo. 3. Leucemia
Mielóide Crônica. I. Caffarena, Ernesto Raul. II. LNCC/MCT. III.Título.
CDD – 572.4
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Agradecimentos
Amor sem Conhecimento é mera boa vontade, Conhecimento sem Amor pode ser na maioria
das vezes perda de tempo e possivelmente irá produzir algo muito distante do que chamamos Vida.
Viva ao Amor, ao Conhecimento e à Vida !!!
Pertenço a tudo para pertencer cada vez mais a mim próprio
E a minha ambição era trazer o universo ao colo
Como uma criança a quem a ama beija.
Eu amo todas as coisas, umas mais do que as outras,
Não nenhuma mais do que outra, mas sempre mais as que estou vendo
Do que as que vi ou verei.
Acordar – Álvaro de Campos
Agradeço aos acasos inesperados de percurso e à todas as pessoas que me conhecem e me
ajudaram diretamente na realização desse trabalho… assim como ao povo brasileiro, que com seus
impostos pagaram minha bolsa e as viagens aos congressos. Certamente continuarei retribuindo à
sociedade o conhecimento adquirido.
M U I T O O B R I G A D A !!!
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Resumo da Dissertação apresentada ao MCT/LNCC como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências (M.Sc.)
ESTUDO ESTRUTURAL E TERMODINÂMICO DE MUTANTES DA PROTEÍNA c-ABL
RESISTENTES AO IMATINIB
Elen Gomes Pereira
Junho/2009
Orientador: Ernesto Raúl Caffarena, Ph.D
Co-orientador: Miguel Ângelo Martins Moreira, D.Sc.
Modelagem Computacional
As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes
caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao
desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica
ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica
associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o
cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22
[t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC.
A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator
causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e
testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib
(STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra
a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto
muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os
mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo
o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de
mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência.
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Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes
encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação
(A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o
mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os
mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e
termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL
selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente
(com particular interesse na molécula de água – denominada Cw - que medeia a interação fármaco-
proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-
empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre
diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE
obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) α = 0,2169; β = 0,0654;
γ = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) α = 0,0394; β = 0,0077; γ = -
2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição
inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre
absoluta da proteína c-ABL selvagem ( exp( )selG∆ ) ser sempre um número mais negativo quando
comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método
LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação
entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não
existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL:
SH2 e SH3.
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Abstract of Dissertation presented to LNCC/MCT as a partial fulfillment of the requirements for the
degree of Master of Sciences (M.Sc.)
STRUCTURAL AND THERMODYNAMIC STUDY FROM C-ABL MUTANT PROTEINS
RESISTANT TO IMATINIB
Elen Gomes Pereira
June, 2009
Advisor: Ernesto Raúl Caffarena, Ph.D.
Co-advisor: Miguel Ângelo Martins Moreira, D.Sc.
Leukemias are a proliferative disorder of hematopoiethic steam cells caracterized by mutations
that disturbing myeloid and lymphoid precursors resulting in similar phenotypes (Mieloid or Linfoid)
and type (Chronic or Acute). Described in 1960, Philadelphia chromosome (Ph) was the first
chromosomic anomaly associated to a neoplasia, the Chronic Myeloid Leukemia (CML). In 1973, was
demonstrated that Ph-chromosome results from a reciprocal translocation between the long arms of
chromosome 9 and chromosome 22 [t(9;22)(q34;q11)], producing the chimeric gene BCR-ABL, found
in 95% of CML cases. The encoded chimeric protein, BCR-ABL, with an uncontrolled kinase activity,
is the casual factor of CML. During the late 1990's, a series of synthetic molecules were developed and
tested for specifically inhibiting BCR-ABL kinase activity; Imatinib (STI-571 or Gleevec) was the first
of these drugs approved and used as a therapeutic agent against CML, showing reduction of the number
of leukemia cells in almost all patients. However, despite its effectiveness in CML treatment, several
patients with primary refractory disease or secondary resistance were frequently reported. The
mechanisms underlying resistance are probably heterogeneous, and at least two mechanisms
encompassing the gene BCR-ABL have been described in studies done in vivo: gene amplification and
occurrence of mutations resulting in aminoacid substitutions associated with resistance. Different levels
of resistance are frequently associated to recurrent point mutations found at the c-ABL kinase domain,
being mutations at the catalytic site, activation loop (A-loop), and ATP phosphate-binding loop (P-
loop), frequently reported in patients. The first computational studies were carried out with Thr334Ile
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and P-loop point mutation and helped to understand, at molecular level, the mechanisms of resistance.
Herein we report a structural and thermodynamic study of Imatinib and Nilotinib interactions at the
active site of c-ABL protein (wild type and 12 mutants) and the relevance of the solvent (with
particular interest in a water molecule - namely Cw - that helps drug-protein interactions) in the process
of drug resistance. We used a semi-empirical method of linear interaction energy (LIE) and obtained
the results of molecular dynamics based in the diference of ligand interaction in bound and free states.
In the present work, we used LIE method in alternative approach: to analyse interactions between
different ABL mutants and one inhibitor (Imatinib or Nilotinib). LIE coefficients were as follow: Fixed
Cw (restrained initial position) α = 0,2169; β = 0,0654; γ = 1,4159; and Free Cw (non-restrained
initial position) α = 0,0394; β = 0,0077; γ = -2,0503. The best fit was obtained with simulations
carried out with Cw non-restrained, as the value of absolute free energy with the wild-type c-ABL
protein ( exp( )selG∆ ) was more negative in comparison with absolute free energy values for the c-ABL
mutants ( exp( )mutG∆ ). The use of the LIE method in this strategy was efficient to analyze the effect of
interaction between different c-ABL mutants and one ligand (Imatinib or Nilotinib). At the present time
there is no molecular dynamics simulation including other BCR-ABL domains: SH2 and SH3.
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Índice do texto
1 Introdução..............................................................................................................................................1
1.1 Leucemias e o gene BCR-ABL.................................................................................................1
1.2 Estrutura da proteína c-ABL....................................................................................................6
1.2.1 O domínio quinase da proteína c-ABL......................................................................9
1.2.2 Inibidores da atividade tirosina quinase..................................................................12
1.3 Mecanismos moleculares de inibição do Imatinib e Nilotinib...............................................18
1.3.1 Resistência aos inibidores........................................................................................21
1.4 Dinâmica Molecular da proteína c-ABL................................................................................27
1.5 Planejamento Racional de Fármacos Baseado em Estrutura.................................................28
1.6 Química computacional e Modelagem Molecular.................................................................29
1.6.1 Mecânica Molecular................................................................................................29
1.6.2 Campo de força........................................................................................................30
1.6.3 Dinâmica Molecular................................................................................................31
1.7 Energia livre de Gibbs............................................................................................................35
1.7.1 Tratamento quantitativo da energia livre de Gibbs..................................................36
2 Objetivo................................................................................................................................................38
2.1 Objetivo Geral........................................................................................................................38
2.2 Objetivos Específicos.............................................................................................................38
3 Metodologia.........................................................................................................................................39
3.1 Cálculo da energia livre pelo método de LIE.........................................................................39
3.1.2 Adequação do método LIE para aplicação neste trabalho.......................................41
3.2 Escolha das estruturas e inibidores.........................................................................................42
3.2.1 Escolha dos mutantes..............................................................................................42
3.3 Escolha dos parâmetros utilizados nas simulações de dinâmica molecular...........................43
3.4 Análise do comportamento de Cw e mobilidade dos resíduos do sistema ABL/Imatinib.....44
x
4 Resultados............................................................................................................................................45
4.1 Diferenças nas energias (Eletrostática e Lennard-Jones) dos fármacos (Imatinib e Nilotinib)
livres na água...........................................................................................................................................45
4.2 Escolha das amostras de energia para calibração dos coeficientes de LIE............................47
4.2.1 Estimativas das energias (Eletrostática e Lennard-Jones) de proteína c-ABL
selvagem e dos 12 mutantes complexados aos fármacos Imatinib ou Nilotinib......................................50
4.2.2 Comparação dos valores de energia livre relativa e absoluta da proteína c-ABL
selvagem e dos mutantes ligados ao Imatinib ou Nilotinib..........................................................54
4.2.3 Comparação dos modelos com e sem restrição na posição de Cw..........................56
4.3 Comparação das energias livres relativas calculadas ( calc(mut/sel)∆∆G ) versus experimentais
( exp(mut/sel)∆∆G ) com Cw livre................................................................................................................57
4.4 Diferenças nos valores das energias (Eletrostática e Lennard-Jones) nas simulações com e
sem restrição da posição inicial de Cw....................................................................................................59
4.5 Comportamento de Cw na proteína c-ABL selvagem e nos 12 mutantes complexados ao
Imatinib ou Nilotinib em simulações com Cw livre................................................................................62
4.5.1 Raiz do desvio quadrático médio dos resíduos das proteínas c-ABL selvagem e
mutantes.......................................................................................................................................65
4.6 Efeito alostérico das mutações pontuais.................................................................................66
4.7 Interações específicas entre os ligantes Imatinib e Nilotinib e a proteína c-ABL.................68
5 Discussão..............................................................................................................................................69
5.1 Valores das energias (Eletrostática e Lennard-Jones) nas simulações sem restrição de Cw
pelo método de LIE..................................................................................................................................79
5.2 Análise do mecanismo molecular de resistência....................................................................80
5.3 Análise da permanência das ligações de hidrogênio dos fármacos (Imatinib e Nilotinib) com
a proteína c-ABL......................................................................................................................................82
6 Conclusões e Perspectivas..................................................................................................................83
Referências Bibliográficas.....................................................................................................................85
xi
Índice de Figuras
1.1 Diagrama esquemático da origem e diferenciação das células sanguíneas na medula óssea.............1
1.2 Representação da translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22, gerando os cromossomos
não naturais 9q+ e 22q- (Ph- Cromossomo Philadelphia).
http://www.unesp.br/prope/projtecn/Saude/Imagens/Saude48_1.jpg ................................................3
1.3 Representação esquemática dos genes ABL e BCR. Os éxons estão representados em retângulos
pelas cores cinza claro e escuro nos genes ABL e BCR, respectivamente, e os íntrons pelas retas. As
quebras no ABL, ilustradas pelas setas, quase invariavelmente ocorrem entre os éxons Ia e a2. O
gene BCR contém 25 éxons, incluindo as isoformas alternativas (e1') e (e2'). Os pontos de quebra
no gene BCR usualmente ocorrem dentro de uma das 3 regiões agrupadas de quebra (m-bcr, M-bcr
e µ-bcr) indicadas pelas duplas setas horizontais. Raramente, a quebra se dá na região indicada pela
dupla seta horizontal pontilhada. Abaixo, a estrutura de vários RNAm transcritos de BCR/ABL, os
quais são formados de acordo com a posição do ponto de quebra no BCR e darão origem às
proteínas p190, p210, p210 e p230 respectivamente..........................................................................4
1.4 a) Esquema simplificado dos domínios da proteína c-SRC: SH3 (amarelo), SH2 (verde), quinase
(violeta), da proteína c-ABL1b: cap (rosa), SH3 (amarelo), SH2 (verde) e quinase (violeta) e da
proteína BCR-ABL: BCR (verde musgo), SH3 (amarelo), SH2 (verde) e quinase (violeta). Sítios de
fosforilação (P) dos resíduos tirosina estão indicados em círculos vermelhos. b) Representação dos
domínios da proteína c-ABL nos estados Inativo, Intermediário e Ativo: domínio quinase (azul),
SH3 (verde) e SH2 (amarelo); na proteína ativa os domínios quinase (azul), SH2 (verde) e SH3
(amarelo) estão orientados verticalmente. (Nagar et al., 2003; Harrison et al., 2003, modificado). c)
Diagrama esquemático de um modelo de ativação da quinase c-SRC baseado em estrutura da forma
não fosforilada e estudos de RMN (Ressonância Magnética Nuclear)...............................................8
1.5 Descrição das regiões mais importantes do domínio quinase na sua conformação inativa (PDB 10PJ
1,75 Å, Imatinib foi retirado): A-loop (alça de ativação) em azul, P-loop (alça de fosforilação) em
vermelho, motivo DFG em azul, ponte salina entre Lys290 e Glu305, resíduo onde ocorre a
fosforilação Tyr412 no A-loop, região catalítica em ciano com o resíduo catalítico aceptor de próton
Asp382, estruturas secundárias alfa hélice (em magenta) dando destaque à Hélice α-C e todas as
folhas beta (em marrom) que vão de β-1 à β-9..................................................................................10
1.6 Os quatro principais inibidores da atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL: Imatinib,
xii
Nilotinib, Dasatinib e Bosutinib. Detalhe para a estrutura do Imatinib e do Nilotinib, onde metade
da estrutura, referente à ligação no sítio catalítico e que mimetiza a estrutura do ATP, é mantida
idêntica...............................................................................................................................................13
1.7 Arranjo tridimensional dos PDBs: (a) 1OPJ (proteína c-ABL inativa, Asp-out), (b) 3CS9 (proteína
c-ABL inativa, Asp-out) e (c) 2GQG (proteína c-ABL ativa, Asp-in) complexados com Imatinib,
Nilotinib e Dasatinib respectivamente. Estruturas secundárias: α -hélices (magenta), folhas- β
(marrom) e alças (verde). Numeração dos resíduos conforme variante Ib da proteína c-ABL. Em
destaque, os resíduos Tyr412 do A-loop (azul), P-loop (vermelho) e Alça catalítica (ciano) com o
resíduo Asp382 catalítico aceptor de próton em destaque. Resíduos do motivo DFG (Asp400-
Phe401-Gly402) estão destacados em azul. A hélice α -C está indicada em magenta. A ponte salina,
Lys290-Glu305, ajuda na estabilização da estrutura da proteína c-
ABL...................................................................................................................................................17
1.8 Representação das interações entre os átomos do Imatinib (carbono em laranja, nitrogênio em azul
e hidrogênio em branco) e os resíduos do cristal PDB1OPJ. Numeração conforme variante 1b da
proteína c-ABL. Oxigênio da água (Cw) presente no cristal que medeia interações entre a proteína e
o Imatinib...........................................................................................................................................19
1.9 Representação das interações entre os átomos do Nilotinib (carbono em laranja, nitrogênio em azul
e hidrogênio em branco) e os resíduos do cristal PDB 3CS9. Numeração conforme variante 1b da
proteína c-ABL. Oxigênio da água (Cw) presente no cristal PDB 1OPJ que medeia interações entre
a proteína e o Imatinib......................................................................................................................21
1.10 Mutações na proteína c-ABL e suas posições homólogas em outras quatro quinases (c-SRC, c-
HCK, c-KIT e PDGF-R). As estruturas secundárias também estão ilustradas: hélices (cilindros) e
folhas- β (caixas com seta). As mutações identificadas em ensaios in vitro estão coloridas
aleatoriamente. As mutações encontradas em pacientes estão identificadas acima do resíduo com o
seu número respectivo e uma seta. Numeração dos resíduos conforme variante Ib da proteína c-
ABL. O asterisco indica o resíduo autorregulatório Tyr412 onde ocorre a fosforilação e
consequentemente a ativação da proteína pela abertura da alça de ativação (Activation loop ou A-
loop)...................................................................................................................................................24
1.11 O algoritmo global de MD..............................................................................................................34
3.1 Ciclo termodinâmico....................................................................................................................40
xiii
4.1 a) Média FINAL das 20 amostras de energia do Imatinib livre na água Ele_TOT = -85,09
kcal/mol (1,85) e Evdw_TOT = -38,96 kcal/mol (0,53); Média FINAL das últimas 5 amostras
de energia do Imatinib ligado na proteína ABL (em rosa) Ele_TOT = -65,84 kcal/mol (4,51) e
Evdw_TOT = -69,87 kcal/mol (0,60). b) Média FINAL das últimas 5 amostras de energia do
Imatinib ligado na proteína ABL mutante Met263Val (em rosa) Ele_TOT = -69,88 kcal/mol
(1,84) e Evdw_TOT = -64,86 kcal/mol
(0,36)............................................................................................................................................49
4.2 Predições da energia livre relativa ( ( / )calc mut selG∆∆) e absoluta ( ( )calc selG∆
ou ( )calc mutG∆) para
Imatinib e Nilotinib ligados à proteína c-ABL selvagem e 12 mutantes. (a) Predições de
( / )calc mut selG∆∆ entre a proteína selvagem e cada proteína mutante ligadas ao Imatinib ou ao
Nilotinib com restrição na posição inicial de Cw. b) Predições de ( / )calc mut selG∆∆ para Imatinib ou
ao Nilotinib ligados à proteína c-ABL selvagem e 12 mutantes sem restrição na posição inicial
de Cw. (c) Predições de ( ( )calc selG∆ e ( )calc mutG∆ ) para Imatinib e Nilotinib ligados à proteína c-
ABL selvagem e 12 mutantes sem restrição na posição inicial de
Cw.................................................................................................................................................56
4.3 Distância do átomo C15 (centro da esfera utilizada nas simulações) até as mutações localizadas
em várias regiões da proteína c-ABL. Módulo dos valores da diferença entre a energia livre
relativa experimental e calculada ( ( / ) exp( / )D calc mut sel mut selG G G∆∆ = ∆∆ −∆∆ ) dos 12 mutantes da
proteína c-ABL em relação à
selvagem.......................................................................................................................................58
4.4 Interações entre Cw e os resíduos Lys290, Glu305 e motivo DFG (Asp400). a) Proteína c-ABL
complexada com Imatinib obtida do PDB 1OPJ. b) Proteína c-ABL e Cw foram obtidos por
homologia da estrutura PDB 1OPJ. O Nilotinib foi obtido da estrutura PDB
3CS9.............................................................................................................................................62
4.5 Troca de Cw (Molécula de HOH 278) por outra molécula de água para as proteínas Selvagem,
Thr334Ile e Leu267Arg................................................................................................................63
4.6 Flutuação dos últimos 250 ps da proteína (a) Selvagem, (b) Leu247Arg e (c) Tyr272Hix
complexada com Imatinib............................................................................................................67
xiv
Índice de Tabelas
1.1 Espectro e incidência de mutações no domíno quinase da proteína BCR-ABL na presença de
Imatinib, Nilotinib e Dasatinib. Sendo N (número de amostras) = 372, 173 e 181 respectivamente.
*Não foram observadas mutações a Nilotinib 10 nM. Mutações pertencentes ao P-loop†. Mutações
pertencentes ao A-loop††...................................................................................................................25
4.1 Média das energias eletrostáticas ( eleU< ∆ > e Lennard-Jones ( LJU< ∆ > ), realizadas a cada 50 ps,
dos 1000 ps de simulação por DM do Imatinib e Nilotinib em solução............................................46
4.2 Média dos valores das energias eletrostáticas e van der Waals (Lennard-Jones) dos últimos 250 ps
de simulação por DM do Imatinib e Nilotinib ligados ao domínio quinase da proteína c-ABL
(selvagem e dos 12 mutantes), com (Cw fixo) e sem (Cw livre) restrição na posição inicial de Cw.
Desvio padrão amostral (N=5) entre parêntesis. Unidades em kcal/mol...........................................51
4.3 Comparação dos valores de energia livre de Gibbs relativa (em kcal/mol). Experimentais
( exp( / )mut selG∆∆ ) e calculadas computacionalmente ( ( / )calc mut selG∆∆ )...................................................53
4.4 Comparação do RMSD dos modelos com e sem restrição na posição inicial de Cw, nas simulações
da proteína c-ABL com Imatinib. Sendo N = 12. ( )
2
exp1
N
calcG G
N
∆∆ −∆∆∑ ....................................57
4.5 Média das energias eletrostáticas ( eleU< > ) e Lennard-Jones ( LJU< > ) para a proteína c-ABL
selvagem e 12 mutantes em diferentes regiões do domínio quinase ( β 1, P-loop, β 5, contato-SH2,
A-loop e hélice-J) obtidos a partir das simulações com Cw livre e Cw fixa para os fármacos
Imatinib e Nilotinib. Sendo U< ∆ > a diferença das energias nos estados ligado e livre e U< ∆∆ >
a diferença de U< ∆ > nas simulações com a proteína selvagem e mutantes...................................60
4.6 Comparação da distância (Å) entre o centro da esfera e o Cα do respectivo mutante com o índice
de hidropatia.......................................................................................................................................64
5.1 Comparação da metodologia dos trabalhos de Pricl et al. 2005 e Lee et al. 2008 com o trabalho
desenvolvido nessa dissertação..........................................................................................................70
xv
Lista de símbolos
Å: Ångströms
AMN107: Nilotinib
Abl: gene ABL (Abelson Leukemia)
A-loop: Activation-loop (Alça de ativação)
Bcr: gene Break Cluster Region (Região Agrupada de Quebra)
BMS-354825: Dasatinib
c-ABL: proteína ABL citoplasmática
c-BCR: proteína BCR citoplasmática
CB: Crise Blástica
Chr9: cromossomos 9
Chr22: cromossomo 22
EPHB4: ephrin-B
Energia Livre Absoluta da proteína selvagem (calculado pelo método de LIE): ∆Gcalc(sel)
Energia Livre Absoluta da proteína mutante (calculado pelo método de LIE): ∆Gcalc(mut)
Energia Livre Relativa (calculado pelo método de LIE): ∆∆Gcalc(mut/sel)
Energia Livre Absoluta da proteína selvagem (baseado em valores experimentais): ∆Gexp(sel)
Energia Livre Absoluta da proteína mutante (baseado em valores experimentais): ∆Gexp(mut)
Energia Livre Relativa (baseado em valores experimentais): ∆∆Gexp(mut/sel)
FC: Fase Crônica
FDA: Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos da América (Food and Drug
Administration)
GEF: Fatores de Troca de Guanina (Guanine Exchange Factor)
ISCN: Sistema Internacional de Nomenclatura para a Citogenética (International System for Human
Cytogenetic Nomenclature)
IC50: Concentração, de um composto, necessária para reduzir o crescimento celular em 50 %
xvi
FGR: Gardner-Rasheed feline (Gardner-Rasheed Felina)
FYN: Feline yes-related protein (Proteína felina yes-related)
HCK: Human Cervical Keratinocyte (Queratinócito Cervical Humano)
LCK: Lymphocyte-Specific Protein-Tyrosine Kinase (Proteína Tirosina Quinase Linfócito-Específica)
LYN: Yamaguchi sarcoma viral related
LMC: Leucemia Mielóide Crônica
LLA: Leucemia Linfóide Aguda
LMA: Leucemia Mielóide Aguda
Motivo DFG: Asp400-Phe401-Gly402
P-loop: Alça de fosforilação (Phosphate-loop)
PQs: Proteínas Quinases
PFs: Proteínas Fosfatases
Ph: Filadélfia (Philadelphia)
PDGFR: Receptor de Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (Platelet-Derived Growth Factor
Receptor)
STI571: Imatinib, Gleevec
SRC: Sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2)
v-Abl: oncogene do vírus Abelson presente em murinos
YES: Oncogene V-yes-1 Yamaguchi sarcoma homólogo 1(V-yes-1 Yamaguchi sarcoma viral oncogene
homolog 1)
xvii
Apêndices
A – Alinhamento entre as sequências das isoformas a e b da proteína c-ABL......................................104
B - Código das estruturas do domínio quinase da proteína c-ABL depositadas no PDB (Protein Data
Bank), nome dado pelo banco de dados, data do depósito, resolução (em Å) e a respectiva
referência................................................................................................................................................105
C - Parâmetros utilizados na simulação com Cw fixo. Imposição de força constante de 5 kcal/(molÅ2 )
no átomo pesado de Cw (oxigênio, átomo 2913 nesse caso).................................................................108
D – Média do desvio quadrático médio (RMSD) dos resíduos a 4 Å de distância do Imatinib............113
E.1 a E.7 – Flutuação dos últimos 250 ps de simulação em DM dos resíduos da proteína c-ABL
(selvagem e mutantes) complexada com Imatinib.................................................................................122
F - Troca de Cw por outra molécula de água do solvente em função do tempo de simulação (1000 ps)
com o Imatinib complexado nas proteínas Selvagem e 10 mutantes: Met263Val, Met263Ile, Gln271His,
(Tyr272 nas protonações Tyr272His e Tyr272Hip), Glu274Lys, Thr334Ile, Thr334Ser,Met370Thr,
Met370Ile e Gly417Arg)........................................................................................................................129
G.1 a G.4 - Manutenção das ligações de hidrogênio entre os fármacos Imatinib (linha preta) e Nilotinib
(linha vermelha) e a proteína c-ABL durante os 1000 ps de DM..........................................................131
1
Capítulo 1
Introdução
1.1 Leucemias e o gene BCR-ABL
A produção de todas as células do sangue ocorre a partir de uma célula tronco comum, que se
autorrenova e dá origem às células descendentes das linhas progenitoras Mielóide e Linfóide (Figura
1.1).
Figura 1.1: Diagrama esquemático da origem e diferenciação das células sanguíneas na medula óssea
(Alberts et al., 2004).
2
Em adultos, este processo se passa na medula dos ossos planos ou chatos, principalmente no
esterno, e nos ossos ilíacos. Depois, seus precursores são distribuídos em órgãos especializados, os
órgãos linfóides, que são constituídos por células que formam seu arcabouço de sustentação e abrigam:
1. células provenientes da linhagem progenitora mielóide que durante a hematopoiese darão
origem aos neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, plaquetas e eritrócitos.
2. células provenientes da linhagem progenitora linfóide que durante a hematopoiese darão
origem aos linfócitos T e linfócitos B.
As leucemias são desordens proliferativas nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes
caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao
desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica
ou Aguda) (Michael e Moshe, 2008). Por várias razões, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é
provavelmente uma das neoplasias humanas mais estudadas (Melo e Bardes, 2007; Mughal et al.,
2007; Sawyers et al., 2001), constituindo 15% das leucemias adultas com uma incidência de
aproximadamente 3000-5000 novos casos por ano nos Estados Unidos. Segundo o Instituto Nacional
do Câncer (INCA), o Brasil tem uma taxa estimada de sete casos para cada 100.000 habitantes por ano.
A predominância é masculina e a média de idade ao diagnóstico é de 67 anos (Menzin et al., 2004). A
LMC pode ser considerada um paradigma e se caracteriza por um processo patogênico em três fases
(O'Dwyer et al., 2002): usualmente é diagnosticada durante a fase crônica (FC) que dura em média de 4
a 6 anos, de onde progride para uma fase acelerada e, posteriormente, caso não haja tratamento, chega à
fase aguda e fatal, crise blástica (CB), onde a média de sobrevida é de 18 semanas (Kantarjian e Talpaz,
1988). O mecanismo de transformação que leva à crise blástica é desconhecido e ainda carece de
explicações para o seu total entendimento (Melo e Deininger, 2004). No entanto, sabe-se que ocorrem
diferenciações celulares deficientes e anormais, instabilidade genômica, encurtamento dos telômeros e
perda da função de genes supressores de tumor (Savona e Talpaz, 2008).
A LMC se caracteriza em 95% dos casos pela presença do cromossomo Philadelphia, resultante
da translocação entre os cromossomos 9 (Chr9) e 22 (Chr22), originando a formação de um gene
quimérico decorrente da justaposição do gene BCR, presente no cromossomo 22, e do proto-oncogene
c-ABL (Westbrook, 1988), presente no cromossomo 9. A presença deste gene quimérico e de sua
proteína (BCR-ABL) é o fator causal da LMC. Isto constitui uma evidência impactante para a LMC,
pois 95% das pessoas com essa neoplasia possuem o cromossomo Philadelphia em células leucêmicas
(Sawyers, 1999; Laurent et al., 2001). Os 5% restantes são decorrentes de eventos distintos não
relacionados ao cromossomo Philadelphia (Deininger et al., 1996). No entanto, sua presença não é
suficiente para especificar o diagnóstico da LMC, pois ele também é encontrado na Leucemia Linfóide
3
Aguda (LLA) e ocasionalmente na Leucemia Mielóide Aguda (LMA).
O cromossomo Philadelphia foi observado pela primeira vez em 1960 por Peter Nowell da
University of Pennsylvania School of Medicine e David Hungerford do Fox Chase Cancer Center's
Institute for Cancer Research, e foi nomeado assim por ser a cidade onde se localizam os dois
estabelecimentos. Foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia (Nowell e
Hungerford, 1960) e sua origem foi esclarecida em 1973, como sendo o resultado da translocação
recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e cromossomo 22 (Rowley, 1973). De acordo com
o International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN), essa translocação é denominada
t(9;22)(q34.1;q11.2) (Figura 1.2). Curiosamente, uma rara associação dessa neoplasia com a herança
genética foi evidenciada em 3 casos de LMC em 3 gerações consecutivas (Lillicrap e Sterndale, 1984).
Figura 1.2: Representação da translocação recíproca entre os cromossomos 9 e 22, gerando os
cromossomos não naturais 9q+ e 22q- (Ph- Cromossomo Philadelphia).
http://www.unesp.br/prope/projtecn/Saude/Imagens/Saude48_1.jpg
A demonstração de que o proto-oncogene ABL (Abelson Leukemia) é translocado do
cromossomo 9 para o cromossomo 22 sugeriu um possível desvio de seu comportamento como fator
desencadeador da leucemia (De Klein et al., 1982). Em 1984, com o desenvolvimento da citogenética,
detectou-se pela primeira vez uma diferença no padrão de translocação na região do Chr22, que passou
então a ser denominada de região agrupada de quebra (Break Cluster Region - BCR) (Groffen et al.,
1984; Prakash e Yunis, 1984). Embora a posição de quebra no cromossomo 9 seja praticamente
4
invariável, a quebra no cromossomo 22 para geração do cromossomo Philadelphia é variável (Erikson
et al., 1986) e se deve aos diferentes locais de quebra como mostrado na Figura 1.3: M-BCR, m-BCR,
ou µ-BCR (Melo et al., 1996; Shtivelman et al., 1985; Hermans et al., 1987; Chissoe et al., 1995).
Figura 1.3: Representação esquemática dos genes ABL e BCR. Os éxons estão representados em
retângulos pelas cores cinza claro e escuro nos genes ABL e BCR, respectivamente, e os íntrons pelas
retas. As quebras no ABL, ilustradas pelas setas, quase invariavelmente ocorrem entre os éxons Ia e a2.
O gene BCR contém 25 éxons, incluindo as isoformas alternativas (e1') e (e2'). Os pontos de quebra no
gene BCR usualmente ocorrem dentro de uma das 3 regiões agrupadas de quebra (m-bcr, M-bcr e µ-
bcr) indicadas pelas duplas setas horizontais. Raramente, a quebra se dá na região indicada pela dupla
seta horizontal pontilhada. Abaixo, a estrutura de vários RNAm transcritos de BCR/ABL, os quais são
formados de acordo com a posição do ponto de quebra no BCR e darão origem às proteínas p190, p210,
p210 e p230 respectivamente (Melo, 1996).
O gene BCR normal se estende por 23 éxons no cromossomo 22 (22q11.2) (Prakash e Yunis,
1984); é expresso constitutivamente em células normais e codifica para uma proteína (BCR) com 160
kD (Hariharan e Adams, 1987) que tem atividade serina/treonina quinase e capacidade autofosforilativa
(Li et al., 1989; Maru e Witte, 1991). O primeiro íntron do gene BCR possui dois éxons alternativos e1'
e e2' que codificam para duas isoformas protéicas (Stam et al., 1985; Romero et al., 1989)
5
denominadas 160kDa e 130kDa (Dhut et al., 1988), predominantes no citoplasma e no núcleo
respectivamente (Laurent et al., 2000).
A proteína BCR possui um domínio de oligomerização parcialmente responsável pela
localização e tetramerização da proteína quimérica BCR-ABL (McWhirter e Wang, 1991). A formação
do homotetrâmero BCR-ABL está correlacionada com a ativação da função tirosina quinase da proteína
quimérica, presente na região correspondente à proteína c-ABL, e sugere que os oligômeros são as
entidades ativas nas células linfóides (McWhirter et al., 1993; Guo et al., 1998). A parte central da
proteína BCR denomina-se GEF (Guanine Exchange Factor), pois essa região no gene BCR possui
similaridade a fatores de troca de guanina (Adams et al., 1992), que são componentes da rede de
sinalização intracelular e funcionam como ativadores de pequenas GTPases (família das hidrolases que
se ligam e hidrolisam GTP por um domínio G altamente conservado, comum em todas GTPases). O
domínio GAP terminal regula a proteína p21Rac, importante para reorganização do citoesqueleto
(Diekmann et al., 1991).
O proto-oncogene ABL, assim denominado pela semelhança funcional e estrutural ao oncogene
do vírus Abelson (v-Abl) (Abelson et al., 1970), causador de leucemia em murinos, está localizado na
região 9q34.1 e possui 11 éxons (Figura 1.3). O gene ABL (Mes-Masson et al., 1986) codifica para
duas isoformas protéicas: a variante 1b (que contém a região codificada pelo éxon Ib), resultante de
processamento pós-transcricional que se encontra predominantemente no núcleo, e a variante 1a (que
contém região codificada pelo éxon Ia) que se encontra majoritariamente no citoplasma celular
(Wetzler et al., 1993). A numeração dos aminoácidos da variante 1a foi arbritariamente adotada por
Schindler et al. (2000) na publicação original da estrutura do domínio quinase da proteína c-ABL e tem
sido perpetuada em novos trabalhos, no entanto a variante 1b é a forma majoritariamente expressa nas
células e a descrição da sua estrutura cristalográfica (Nagar et al., 2003) recomenda para a adoção desta
numeração em publicações futuras. O segundo aminoácido codificado pelo transcrito 1b, uma glicina,
pode ser miristilado (Nagar et al., 2006). Com essa miristilação estima-se que há uma maior afinidade
do N-terminal com a parte C-terminal da proteína (Figura 1.4 b), o que ajuda a manter o complexo
inativo (Harrison, 2003). O miristil também tem afinidade pela membrana plasmática e essa ligação é
necessária para manter o complexo ativo (Figura 1.4 c). No Apêndice A apresenta-se o alinhamento
entre as variantes 1a e 1b, onde se podem observar as diferenças com relação à numeração e à parte N-
terminal dos dois transcritos. Para facilitar a compreensão nessa dissertação faremos referência à
numeração dos aminoácidos conforme a variante 1b, publicada por Azam et al. (2003).
Em pacientes com LMC o gene quimérico BCR-ABL (Figura 1.3) geralmente codifica uma
6
proteína de 210 kDa (p210), enquanto pacientes com Leucemia Linfóide Aguda (LLA) usualmente
expressam uma proteína BCR-ABL de 190kDa (p190). Para determinar se a p210 induz a leucemia,
fez-se reinfusão em camundongos de células tronco transfectadas com retrovírus recombinante para
este gene quimérico, determinando assim que a presença deste, e de sua proteína, é o principal evento
que leva ao desenvolvimento da LMC (Daley et al., 1990; Heisterkamp et al., 1990). A indução de
leucemia pelo gene p190, utilizando a estratégia "knock-in" (Huettner et al., 2000), evidenciou que uma
leucemia letal foi desenvolvida em todos animais e a remissão completa foi adquirida por supressão da
expressão do gene BCR-ABL. Esses resultados demonstraram que o gene quimérico é necessário para a
indução e a manutenção da leucemia (Gunz, 1977) e sendo assim, terapias direcionadas contra esse
alvo, particularmente à atividade tirosina quinase da proteína c-ABL, começaram a ser desenvolvidas.
1.2 Estrutura da proteína c-ABL
A proteína c-ABL apresenta 42% de identidade à Src (Feller et al., 1994), uma família de
tirosina quinases proto-oncogênicas, originalmente descoberta por J. Michel Bishop e Harold E.
Varmus, que receberam o prêmio Nobel em 1989. A descoberta da família de proteínas SRC tem sido
um moderno instrumento para o entendimento do câncer. O gene que codifica essa proteína é similar ao
gene v-src de Rous sarcoma vírus e pode ter um papel na regulação do desenvolvimento e crescimento
celular (Furstoss et al., 2002; Hunter, 1980).
7
Os domínios das proteínas c-ABL e c-SRC estão ilustrados na Figura 1.4:
a)
b)
8
c)
Figura 1.4: a) Esquema simplificado dos domínios da proteína c-SRC: SH3 (amarelo), SH2 (verde),
quinase (violeta), da proteína c-ABL1b: cap (rosa), SH3 (amarelo), SH2 (verde) e quinase (violeta) e da
proteína BCR-ABL: BCR (verde musgo), SH3 (amarelo), SH2 (verde) e quinase (violeta). Sítios de
fosforilação (P) dos resíduos tirosina estão indicados em círculos vermelhos. b) Representação dos
domínios da proteína c-ABL nos estados Inativo, Intermediário e Ativo: domínio quinase (azul), SH3
(verde) e SH2 (amarelo); na proteína ativa os domínios quinase (azul), SH2 (verde) e SH3 (amarelo)
estão orientados verticalmente. (Helma et al., 2002; Nagar et al., 2003; Harrison et al., 2003,
modificado). c) Diagrama esquemático de um modelo de ativação da quinase c-SRC baseado em
estrutura da forma não fosforilada e estudos de RMN (Ressonância Magnética Nuclear).
As principais regiões e funções do domínio da c-ABL, exceto o domínio quinase, são as
seguintes:
CAP – Nome dado à sua localização na extremidade N-terminal da proteína c-ABL, que traduzindo
para o inglês significa chapéu (Pluk et al., 2002). Exerce papel fundamental na autoinibição da proteína
c-ABL, pois a deleção do CAP torna a proteína c-ABL uma oncoproteína, perdendo o grupo miristil
(Myr) (Figura 1.4 b). Essa alça autorregulatória da atividade tirosina quinase está ausente na proteína
BCR-ABL, facilitando a ativação da atividade tirosina quinase e levando ao processo oncogênico do
qual participa a proteína quimérica (Maru e Witte, 1991).
SH3 - Tem afinidade com ligantes ricos em prolina (motivo PxxP) e atua na regulação de enzimas.
Membrana celular
9
(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/do_annotation.pl?DOMAIN=SH3&BLAST=DUMMY)
SH2 – Regula a cascata de sinalização intracelular interagindo com grande afinidade com alvos
peptídicos que contêm fosfotirosinas em uma sequência específica e dependente rigorosamente da
fosforilação de Tyr245 (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/do_annotation.pl?DOMAIN=SH2&BLA
ST=DUMMY) (Pendergast et al., 1991).
Ao todo, esses domínios CAP, SH2, SH3 e quinase (veremos detalhadamente mais adiante)
atuam sobre as funções de regulação do citoesqueleto durante a diferenciação, divisão e adesão
celulares e sobre o reparo do DNA pela ativação de um caminho proapoptótico, quando o DNA é
severamente mutado (Hantschel e Superti-Fuga, 2004; Van Etten, 2003). Também alteram a estrutura
da actina e fosforilam proteínas como, por exemplo: CRK e CRKL, que juntas participam na cascata de
fosforilação de RELN (proteína que ajuda na regulação de migração neuronal e desenvolvimento do
cérebro), DOK que possui 5 membros (Dok, Dok-R, DokL, Dok4, e Dok5) cujas características
estruturais são muito similares às da família de receptores de insulina (Cong et al., 1999; Galperin et
al., 1999).
O mecanismo catalítico das tirosinas quinase não é totalmente compreendido (Burnett e
Kennedy, 1954; Hunter e Cooper, 1985), mas a proteína c-ABL1 é classificada como transferase, pois
sua função é a de receber o grupo fosfato do ATP (Witte et al., 1980) e transferi-lo para outro substrato.
No banco de dados de classificação enzimática (http://ca.expasy.org/enzyme/2.7.10.2) ela recebeu o
código 2.7.10.2 e a definição de proteína tirosina quinase não específica.
1.2.1 O domínio quinase da proteína c-ABL
As células respondem aos estímulos externos e internos modificando o padrão de expressão das
proteínas, o que pode levar a mudanças morfológicas e bioquímicas. O termo "sinalização celular"
refere-se aos mecanismos envolvidos na transmissão de um estímulo dentro da célula (Pawson, 1995),
sendo a fosforilação de proteínas reconhecida como um dos mecanismos principais em eucariotos, onde
as proteínas alvo são fosforiladas em regiões específicas por uma ou mais Proteína(s) Quinase(s) (PQs)
em um processo reversível e os fosfatos são controladamente removidos pelas Proteínas Fosfatases
(PFs) (Hunter, 1995). Esse comportamento mimetiza um circuito elétrico, sendo as proteínas quinase os
10
transistores que impulsionam o sinal de um lugar a outro permitindo a amplificação, troca de
informação e espalhamento dos eventos até o alvo final que gera uma resposta (Hunter, 1987).
Figura 1.5: Descrição das regiões mais importantes do domínio quinase na sua conformação inativa
(PDB 10PJ 1,75 Å, Imatinib foi retirado): A-loop (alça de ativação) em azul, P-loop (alça de
fosforilação) em vermelho, motivo DFG em azul, ponte salina entre Lys290 e Glu305, resíduo onde
ocorre a fosforilação Tyr412 no A-loop, região catalítica em ciano com o resíduo catalítico aceptor de
próton Asp382, estruturas secundárias alfa hélice (em magenta) dando destaque à Hélice α-C e todas as
folhas beta (em marrom) que vão de β-1 à β-9.
O domínio quinase (Figura 1.5) contém 262 aminoácidos e está compreendido entre os resíduos
254 e 515 da proteína c-ABL. Nesse intervalo estão contidas várias regiões, sendo as mais importantes:
11
(1) o P-loop (resíduos 266 a 276, entre as folhas β -1 e β -2) localizado na extremidade N-terminal do
domínio catalítico, rico em glicina na vizinhança de lisinas; (2) região localizada na parte central do
domínio catalítico (297 a 310, entre as folhas β -3 e β -4), sendo que o resíduo Asp382, presente
próximo à região da folha β -9 (aceptor catalítico de próton), auxilia na transferência do fosfato-γ para
o substrato (Adams, 2001); e (3) alça de ativação, A-loop, compreendendo os resíduos 400 a 420, entre
as folhas β -7 e β -8. A região carboxi-terminal, está relacionada à adesão da proteína c-ABL ao
citoesqueleto celular via actina filamentar ou globular, à ligação ao DNA e à localização/exportação
nuclear (Nagar et al., 2003).
Na folha β -3 encontra-se a Lys290 que facilita a transferência do grupo fosfato sem
influenciar na interação entre o ATP e a proteína c-ABL. A proteína é então estabilizada por uma ponte
salina entre os resíduos conservados Lys290 (folha β -3) e Glu305 (hélice α -C); esta conformação é
denominada "α C-Glu In". Na sua ausência, a conformação denomina-se "α C-Glu Out", onde ocorre
deslocamento da Hélice α -C para fora da proteína, então a proteína c-ABL assemelha-se a uma
proteína SRC (Src-like; Levinson et al., 2006). No A-loop encontra-se o motivo DFG, ou Asp400-
Phe401-Gly402, conservado em diferentes quinases (Hanks et al., 1988; Hanks et al., 1995), também
chamado de alça de ligação do Magnésio. Acredita-se que o Asp400 seja responsável pela coordenação
do íon magnésio (como também manganês) que auxilia no posicionamento dos fosfatos do ATP para a
fosfotransferência.
Quando a proteína está inativa (Figura 1.5), denomina-se conformação "DFG-Asp Out" e
quando a proteína está ativa (Figura 1.6 c), ou seja, há a coordenação do Asp400 com o íon magnésio
(Cowan-Jacob, 2006), denomina-se conformação "DFG-Asp In". Para assumir a forma ativa é
necessária a fosforilação do aminoácido Tyr412 localizado no A-loop (Alça de ativação –Activation
loop), o que permite a entrada do ATP no sítio catalítico. A Phe401 do motivo DFG é importante para o
correto posicionamento do ATP, ajudado pela Hélice α -C. O aminoácido Gly402 auxilia na
movimentação desse motivo. Na literatura há evidências de que um segundo íon magnésio (ou
manganês) seja fundamental para a ativação da proteína c-ABL (Xiaofeng et al., 2005). O sítio
catalítico é o único que não muda, permanecendo idêntico nos estados ativo e inativo (Adams, 2001).
Do ponto de vista molecular, não há unanimidade sobre as cascatas fosforilativas desencadeadas
pela proteína quimérica BCR-ABL (Blume-Jensen et al., 2001), a qual mantém o domínio quinase
intacto, nem mesmo um padrão diferencial para as isoformas (p190, p210, p230), porém há vários
12
relatos de suas atividades (mitogênicas, de propriedades de adesão e antiapoptose) que levam à
transformação celular (Gordon et al., 1987; Dai et al., 1998; Furstoss et al., 2002; Melo e Hughes,
2003; Calabretta e Perrotti, 2004; Steelman et al., 2004; Sonoyama et al., 2002; Hoover et al., 2001;
Deininger et al., 2000). O Apêndice B mostra os códigos das estruturas do domínio quinase da proteína
c-ABL no banco de dados de proteínas PDB (Berman et al., 2000).
1.2.2 Inibidores da atividade tirosina quinase
O uso de substâncias químicas como medicação data da época do médico persa Muhammad ibn
Zakarīya Rāzi (ou Rasis), que no século X introduziu o uso de substâncias químicas como o ácido
sulfúrico, cobre, mercúrio, sais de arsênico, sal amoníaco, ouro, cré, argila, coral, pérola, alcatrão,
betume e álcool para propósitos médicos (Al-Ghazal, 2007). A primeira droga usada para a
quimioterapia do câncer, entretanto, data por volta do início do século XX, através de uma substância
relacionada diretamente com a busca de agentes químicos para a guerra. Dois farmacologistas, Louis S.
Goodman e Alfred Gilman, foram recrutados pelo Departamento de Defesa dos Estados Unidos para
investigar aplicações terapêuticas do Gás Mostarda ou iperita. Trata-se de uma substância incolor,
líquida, oleosa, muito solúvel em água e muito tóxica. Capaz de causar cegueira, abertura dos poros da
pele, rompimento dos vasos sanguíneos (veias e artérias) e morte dolorosa de 3 a 5 minutos se estiver
em contato direto com a mesma. Observações da autópsia de pacientes expostos a esse gás revelaram
profunda supressão de células linfóide e mielóide. Goodman e Gilman chegaram à hipótese de que esse
agente poderia ser usado contra células tumorais. Primeiramente, fizeram-se testes com ratos e em
seguida, em colaboração com o cirurgião Gustav Linskog, injetaram o protótipo quimioterápico em
pacientes observando uma dramática redução dos tumores. Apesar desse fato não se prolongar ao longo
do tempo, essa foi a primeira tentativa de tratamento do câncer por agentes farmacológicos (Goodman
et al., 1946).
Nos seres humanos, aproximadamente 1,7% do número total dos genes são destinados à
expressão das PQs (Manning et al. 2002), representando uma das maiores famílias de proteínas
(Drennan e Ryazanov, 2004; Pendergast, 2002). Foram detectadas 518 sequências codificantes de
quinases no genoma humano e 428 destas foram associadas a uma função conhecida ou a uma função
provável (Hanks, 2003). Portanto, qualquer processo de transmissão de sinal realizado envolve uma
cascata de fosforilação (Hunter, 1998; Krebs e Beavo, 1979) e sugere que a inibição da atividade das
13
quinases pode resultar em uma resposta fisiológica imprecisa (Zhang et al., 2009). As tirosinas
quinases compõem o maior subgrupo de quinases humanas, com aproximadamente 90 membros
(Manning et al., 2002), sendo que 58 proteínas quinases são receptores presentes nas membranas
celulares e 32 estão presentes no citoplasma (como a proteína c-ABL) e respondem a estímulos
externos (Cowan-Jacob, 2006). Apesar do alto grau de conservação na região de ligação ao ATP das
diferentes quinases, surpreendentemente, a inibição da atividade quinase em células normais
frequentemente é tolerada, o que sugere a presença de uma janela terapêutica adequada para matar
seletivamente apenas as células tumorais dependentes da atividade alterada de quinases específicas
(Bilanges et al., 2008).
Os quatro principais inibidores da atividade tirosina quinase são: Imatinib, Nilotinib, Dasatinib
e Busotinib. Basicamente, os inibidores das quinases são do Tipo I (Dasatinib e Busotinib), que se
ligam na conformação ativa das quinases ou do Tipo II (Imatinib e Nilotinib), que reconhecem apenas a
forma inativa das quinases (Zhang et al., 2009).
Figura 1.6: Os quatro principais inibidores da atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL:
Imatinib, Nilotinib, Dasatinib e Bosutinib. Detalhe para a estrutura do Imatinib e do Nilotinib, onde
metade da estrutura, referente à ligação no sítio catalítico e que mimetiza a estrutura do ATP, é mantida
idêntica.
O Imatinib® (Gleevec®), formalmente referido como STI571, foi aprovado pelo FDA (Food
14
and Drug Administration) em maio de 2001 como alternativa para o tratamento da LMC. Este fármaco,
também chamado de Mesilato de Imatinib (C29H31N7O.CH3SO3H, 589,7 g/mol, nome proposto pela
INN - International Nonproprietary Name), é um sal do ácido metanossulfônico (CH3SO3H) e foi
designado quimicamente pela IUPAC como 4-[(4-Metil-1-piperazinil)metil]-N-[4-metil-3-[[4-(3-
piridinil)-2-pirimidinil]amino]-fenil] metassulfonato de benzamida. Em fevereiro de 2002, também foi
utilizado para o tratamento de tumores gastrointestinais (Gastrointestinal Stromal Tumors - GISTs)
causados pela translocação do gene c-KIT, que codifica uma proteína tirosina quinase chamada KIT ou
CD117 (receptora de citosinas; Savage e Antman, 2002) e está presente na superfície das células
hematopoiéticas, além de outras células. Além desses casos, o fármaco também inibe as tirosina
quinases TEL-PDGFR β e FIP1L1-PDGFRα (Stover et al., 2005). Vários estudos clínicos (Gorre et
al., 2001) demonstraram que muitos pacientes em estágio avançado de LMC respondiam inicialmente
ao fármaco, mas frequentemente apresentavam recaídas dos sintomas (Deininger e Druker, 2003).
Até o momento o órgão responsável pela liberação de fármacos nos EUA (FDA) já aprovou 11
inibidores das proteínas quinase para o tratamento do câncer (Zhang et al., 2009), sendo que vários
esforços têm sido realizados com o intuito de desenvolver moléculas inibidoras mais seletivas. Todas as
quinases possuem uma alça de ativação (A-loop) que regula sua atividade, onde se encontra o motivo
de aminoácidos Asp-Phe-Gly (DFG) presente em todas elas. Os inibidores das quinases exploram sua
flexibilidade (Cowan-Jacob, 2006) onde há um equilíbrio entre as formas ativa (A-loop aberto) e
inativa (A-loop fechado) (Kannan e Neuwald, 2005) (Figura 1.7).
15
(a) Conformação Inativa (PDB 1OPJ 1,75 Å)
16
(b) Conformação Inativa (PDB 3CS9 2,21 Å)
17
(c) Conformação Ativa (PDB 2GQG 2,40 Å)
Figura 1.7: Arranjo tridimensional dos PDBs: (a) 1OPJ (proteína c-ABL inativa, Asp-out), (b) 3CS9
(proteína c-ABL inativa, Asp-out) e (c) 2GQG (proteína c-ABL ativa, Asp-in) complexados com
Imatinib, Nilotinib e Dasatinib respectivamente. Estruturas secundárias: α -hélices (magenta), folhas-
β (marrom) e alças (verde). Numeração dos resíduos conforme variante Ib da proteína c-ABL. Em
destaque, os resíduos Tyr412 do A-loop (azul), P-loop (vermelho) e Alça catalítica (ciano) com o
resíduo Asp382 catalítico aceptor de próton em destaque. Resíduos do motivo DFG (Asp400-Phe401-
Gly402) estão destacados em azul. A hélice α -C está indicada em magenta. A ponte salina, Lys290-
Glu305, ajuda na estabilização da estrutura da proteína c-ABL.
18
O fármaco Nilotinib é um inibibor do Tipo II aprovado recentemente pelo FDA (Zhang et al.,
2009) que atua com maior potência e seletividade nas proteínas ABL, KIT, PDGFR, EPHB4 (Weisberg
et al., 2007), minimizando os efeitos colaterais causados pelo Dasatinib como, por exemplo, redução da
imunidade, devido à redução de histamina (Hantschel et al., 2007) e retenção de fluidos que leva ao
derrame pleural, edema pulmonar e/ou efusão pericárdica (Weisberg et al., 2007). Esses efeitos podem
culminar em uma toxicidade suficientemente alta a ponto de prejudicar a qualidade de vida do paciente.
O Dasatinib (BMS-354825) (Joseph et al., 2004; Talpaz et al., 2006; Cortes et al., 2007;
Hochhaus et al., 2007; Cortes et al., 2006; Lombardo et al., 2004) inibe as proteínas ABL, PDGFR
(Platelet-Derived Growth Factor Receptor), KIT, FGR, FYN, HCK, LCK, LYN, SRC, YES e EPHB4
(Weisberg et al., 2007). Apesar de já aprovado pelo FDA por exibir uma maior potência quando
comparado ao Imatinib, possui reduzida seletividade (Shah et al., 2004). A resistência ao tratamento e
efeitos colaterais indesejáveis provocados tanto pelo Imatinib quanto pelo Dasatinib tem levado ao
desenvolvimento de novas moléculas competidoras pelo ATP e inibidoras da atividade tirosina quinase
(Von Mehren, 2005). Estudos recentes por RMN da quinase complexada com Imatinib, Nilotinib e
Dasatinib comprovam que o Dasatinib se liga na conformação ativa e não em ambas as formas (ativa e
inativa) (Fendrich et al., 2008). Bosutinib (SKI-606) (Cortes et al., 2006), ao contrário do Dasatinib,
não inibe as proteínas KIT e PDGFR, inibindo as proteínas ABL, FGR, LYN e SRC (Weisberg et al.,
2007). Em estudos de fase clínica 1 e 2, o Bosutinib mostrou evidências de eficácia com doses bem
toleradas (Cortes et al., 2006).
1.3 Mecanismos moleculares de inibição do Imatinib e Nilotinib
Brian Druker, trabalhando na Universidade de Oregon, estudou extensivamente a atividade
anormal da proteína BCR-ABL em LMC e sugeriu a hipótese de que inibindo precisamente a atividade
quinase com uma droga, ter-se-ia o controle da doença afetando muito pouco as células normais.
Druker, em colaboração com um químico da indústria farmacêutica Norvatis, Nick Lydon, desenvolveu
alguns possíveis candidatos a inibidores, que juntamente com outros grupos ao redor do mundo
demonstraram que um derivado da classe 2-fenilaminopirimidina (Imatinib) evidenciou sucesso no
tratamento de pacientes com LMC (Druker et al., 1999).
O Imatinib teve seu mecanismo de inibição primeiramente publicado por Schindler et al.
(2000). Foi necessária a otimização da estrutura inicial do Imatinib pela adição de um grupo
19
metilpiperazina, parcialmente exposto ao solvente, para conferir maior solubilidade e afinidade do
fármaco à proteína BCR-ABL (Figura 1.8) (Cowan-Jacob et al., 2007).
Figura 1.8: Modo de ligação do Imatinib (em laranja) no sítio da proteína c-ABL inativa (DFG-Asp
Out) (em verde). Numeração dos resíduos conforme variante 1b da proteína c-ABL. Representação das
possíveis ligações de hidrogênio (linhas tracejadas) entre os átomos do Imatinib e os resíduos Met337,
Thr334, Asp400 e Glu305 do cristal PDB1OPJ, assim como o oxigênio da água conservada (Cw),
presente no cristal 1OPJ, interagindo por ligação de hidrogênio com os resíduos Asp400 e Lys290.
Representação da ponte salina (linha tracejada) entre os resíduos Lys290 e Glu305. Todas ligações de
hidrogênio foram descritas previamente em Schindler et al., 2000 e Cowan-Jacob et al., 2007. Detalhe
para o grupo N-metil-piperazina (retângulo cinza), que se mantém exposto para o solvente, e que foi
incorporado durante otimização da molécula no intuito de aumentar a solubilidade.
As ligações de hidrogênio entre Imatinib e a proteína c-ABL: átomo de nitrogênio do grupo
piridinil e o nitrogênio do resíduo Met337, o grupo anilino NH e a cadeia principal da Thr334, o grupo
NH e a cadeia lateral do Glu305 (hélice α -C) (Figura 1.8). Essas ligações de hidrogênio são
complementadas por interações de van der Waals que normalmente seriam realizadas pela ocupação da
adenina do ATP no sítio ativo, assim como a mediação de uma molécula de água Cw entre Asp400,
20
Lys290, Glu305 e o fármaco (Schindler et al., 2000).
A substituição do grupo N-metilpiperazina do Imatinib pelo trifluorometil/imidazol, baseado na
estrutura cristalográfica de inibidores complexados com a proteína c-ABL (Cowan-Jacob et al., 2007),
levou ao desenvolvimento do fármaco Nilotinib (AMN107; Novartis) (C28H22F3N7O.HCl.H2O, 565,98
g/mol), formalmente reconhecido pela IUPAC como 4-metil-N-[3-(4-metil-1H-imidazol-1-il)-5-
(trifluorometil)fenil]-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-benzamida, monohidroclorídrico,
monohidratado (Le Coutre et al., 2006) que mantém interações de ligação de hidrogênio a Glu305,
Asp400, Met337 e Thr334, possuindo potenciabilidade superior ao Imatinib in vitro e in vivo (Weisberg
et al., 2006). Como o Imatinib, o Nilotinib se liga à conformação inativa da proteína c-ABL (Figura
1.9) e a diferença na maior afinidade do Nilotinib é consequência de um melhor ajuste do Nilotinib na
proteína, constratando com a necessidade de desolvatação/deprotonação do grupo altamente básico N-
metilpiperazina. A afinidade contribuída pelos grupos piridinil e pirimidil é grande para o Imatinib, e
pequena comparando com a afinidade total do Nilotinib, onde o trifluorometil/imidazol contribui
enormemente para a maior potência (Weisberg et al., 2005).
21
Figura 1.9: Representação das interações entre os átomos do Nilotinib (em laranja) e os resíduos do
cristal PDB 3CS9 (em verde). Numeração conforme variante 1b da proteína c-ABL. Manutenção do
oxigênio da água (Cw) presente no cristal PDB 1OPJ que medeia interações entre a proteína e o
Imatinib. Grupo trifluorometil/imidazol (retângulo cinza), se mantém exposto ao solvente.
1.3.1 Resistência aos inibidores
Apesar dos avanços obtidos, existem vários relatos de resistência ao Imatinib associada à
reativação da atividade quinase da proteína BCR-ABL, devido a mutações pontuais que levam à troca
de aminoácidos no domínio quinase (Branford et al., 2002). A utilização de técnicas sensíveis como
PCR auxiliam na detecção dessas mutações, em pacientes com resistência ao Imatinib, o que pode ser
útil para a intervenção e a alteração do melhor tratamento a ser empregado para os mesmos (Hughes et
al., 2006). A origem da resistência se deve ao aparecimento, previamente ou após o início do
22
tratamento com o Imatinib, de células leucêmicas com mutações em um nível não detectável (menos
que 1% das células tumorais), que aumentam durante a terapia com esse fármaco devido à pressão
seletiva imposta (Hofmann et al., 2003; Roche-Lestienne et al., 2002; Roche-Lestienne e Preudhomme,
2003).
Ao nível molecular, mutações pontuais na proteína BCR-ABL podem reduzir a afinidade do
Imatinib pela proteína por dois mecanismos: direto e indireto (Weisberg et al., 2007). No caso do
mecanismo direto, as mutações ocorrem próximas ao sítio de ligação do Imatinib, e geralmente no sítio
de ligação do ATP (Branford et al., 2003; Hoffmann et al., 2003; Nicolini et al., 2007; Skaggs et al.,
2006), reduzindo a afinidade do fármaco devido à presença de cadeias laterais de aminoácidos que
contribuem desfavoravelmente aos contatos lipofílicos ou interações por ligação de hidrogênio. Isto
resulta em mudanças topográficas que impedem estericamente a ligação do fármaco. As mutações que
inibem a ligação do Imatinib pelo mecanismo indireto se relacionam à alteração da conformação da
proteína c-ABL, necessária para ligação do Imatinib (Schindler et al., 2000). Por exemplo, mutações
que desestabilizam a conformação inativa com relação à ativa, aumentam a energia livre do complexo
Imatinib-ABL, reduzindo assim a afinidade de ligação.
Azam et al. (2003) sequenciaram o gene BCR-ABL de pacientes que haviam recaído após o
tratamento com Imatinib e revelaram mutações no domínio quinase, associadas à resistência à droga.
Para obter uma maior compreensão das substituições de aminoácidos que conferem resistência ao
Imatinib Azam et al. (2003) realizaram várias mutações sítio dirigidas no gene BCR-ABL in vitro
(Figura 1.10).
23
24
Figura 1.10: Mutações na proteína c-ABL e suas posições homólogas em outras quatro quinases (c-
SRC, c-HCK, c-KIT e PDGF-R). As estruturas secundárias também estão ilustradas: hélices (cilindros)
e folhas- β (caixas com seta). As mutações identificadas em ensaios in vitro estão coloridas
aleatoriamente. As mutações encontradas em pacientes estão identificadas acima do resíduo com o seu
número respectivo e uma seta. Numeração dos resíduos conforme variante Ib da proteína c-ABL. O
asterisco indica o resíduo autorregulatório Tyr412 onde ocorre a fosforilação e consequentemente a
ativação da proteína pela abertura da alça de ativação (Activation loop ou A-loop) (Azam et al., 2003).
Além das mutações encontradas nos pacientes foram identificadas, através de mutações sítio
dirigidas, outras substituições de aminoácidos no domínio quinase que também influenciam o estado
conformacional, conferindo um mecanismo de resistência alostérico. Azam et al. (2003) sugeriram a
hipótese de que várias mutações da proteína c-ABL desestabilizam a conformação autoinibitória à qual
o Imatinib preferencialmente se liga, mudando o equilíbrio na direção da conformação ativa que é
inadequada para o reconhecimento do fármaco.
Na Tabela 1.1 tem-se o espectro de mutações pontuais em pacientes com resistência associada
ao tratamento com Imatinib, Nilotinib e Dasatinib, segundo Bradeen et al. (2006).
25
Tabela 1.1: Espectro da incidência e inibição de proteínas BCR-ABL mutantes na presença de
Imatinib, Nilotinib e Dasatinib. Sendo N (número de amostras) = 372, 173 e 181 respectivamente.
*Não foram observadas mutações a Nilotinib 10 nM. Mutações pertencentes ao P-loop†. Mutações
pertencentes ao A-loop††. (Bradeen et al., 2006)
Imatinib (µM) Nilotinib* (nM) Dasatinib (nM)
Incidência
(%)
2
4
8
16
Incidência
(%)
50
500
2000
5000
Incidência
(%)
5
10
25
100
500
Met263Val
1 (0,27)
1
0
0
0
0(0)
0
0
0
0
0(0)
0
0
0
0
0
Leu267Arg†
2 (0,54) 1 0 1 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Leu267Val† 3 (0,81) 3 0 0 0 1(0,58) 1 0 0 0 3(1.66) 3 0 0 0 0
Gly269Glu† 4(1,08) 3 1 0 0 5(2,89) 5 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Gln271His† 5 (1,34) 0 4 0 1 0(0) 0 0 0 0 1(0,55) 0 1 0 0 0
Tyr272His† 168
(45,16)
56 65 31 16 64
(36,99)
14 50 0 0 0
(0)
0 0 0 0 0
Glu274Lys† 22 (5,91) 12 8 1 1 5
(2,89)
5 0 0 0 2
(1,1)
2 0 0 0 0
Glu274Val† 1 (0,27) 0 1 0 0 1(0,58) 0 1 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Asp295Gly 2 (0,54) 2 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Val318Leu 0 (0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 3(1,66) 0 0 0 0 0
Phe330Ile 4(1,08) 4 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Phe330Val 3(0,81) 3 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Thr334Ile 139
(37,37)
39 56 29 15 88
(50,87)
13 29 36 10 141
(77,9)
20 33 32 39 17
Phe336Cys 0 (0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 7(3,87) 1 6 0 0 0
Phe336Ile 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 12(6,63) 2 10 0 0 0
Phe336Leu 2(0,54) 2 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 10(5,52) 6 4 0 0 0
Phe336Val 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 2(1,11) 1 0 1 0 0
Met370Thr 1(0,27) 1 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Glu274Gly 1(0,27) 1 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Phe378Cys 6(1,61) 6 0 0 0 6(3,47) 6 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Phe378Val 3(0,81) 3 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
26
Val398Ile 2(0,54) 2 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Leu403Met†† 1(0,27) 1 0 0 0 1(0,58) 1 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
Leu406Phe†† 0(0) 0 0 0 0 1(0,58) 1 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
His415Arg†† 2(0,54) 1 1 0 0 0(0) 0 0 0 0 0(0) 0 0 0 0 0
As regiões da quinase (A-loop e P-loop) mostradas na Tabela 1.1 foram definidas de acordo
com Cowan-Jacob et al. (2007). Ao todo se percebe que as substituições mais frequentes nos pacientes
com resistência foram a Thr334Ile (localizada na folha β -5) e as presentes no P-loop (Tyr272 e
Glu274). Mutações que levaram à resistência na presença de 50 nM de Nilotinib, foram: Leu267Val,
Gly269Glu (P-loop), Tyr272His (P-loop), Glu274Lys (P-loop), Thr334Ile, Phe378Cys, Leu403Met e
Leu406Phe. A 5nM de Dasatinib, a resistência ao fármaco foi observada em mutantes para os resíduos
Leu267Val, Gln271His, Glu274Lys, Val318Leu, Tyr334Ile e Phe336Leu. Têm-se informações de que o
mecanismo de resistência da mutação Met370Thr seja indireto, pois o movimento na Hélice-E da parte
C-terminal da quinase e a perda da afinidade do Imatinib podem ser devido ao aumento na entropia da
proteína, que poderia causar uma mudança no equilíbrio entre as formas ativa e inativa (Weisberg et al.,
2005). Já o mecanismo de resistência da mutação Thr334Ile é direto, pois a isoleucina (muito próxima
ao Imatinib) fica impedida estericamente de se ligar ao fármaco. Com essa troca, há também a perda de
uma ligação de hidrogênio entre o Imatinib e a proteína c-ABL.
Tanto o Imatinib quanto o Nilotinib, Dasatinib e Busotinib não são eficazes contra a mutação
Thr334Ile. Atualmente o fármaco MK-0457 (VX-680), o qual possui estrutura cristalográfica
depositada no PDB (Protein Data Bank: 2F4J) (Apêndice B), é o primeiro inibidor da atividade tirosina
quinase que atua sobre este mutante, porém ainda não é usado clinicamente e se encontra em fase de
testes in vitro e in vivo (Giles et al., 2006; Akahane et al., 2008).
A estratégia terapêutica de se utilizar múltiplas drogas é efetiva no tratamento da AIDS e há um
crescente interesse em administrar múltiplos inibidores da proteína c-ABL também no tratamento da
LMC (Sausville, 2003; Bradeen et al., 2006; Ohlstein et al., 2000).
27
1.4 Dinâmica Molecular da proteína c-ABL
Simulações computacionais têm se tornado uma ferramenta poderosa para entender detalhes das
interações intermoleculares em sistemas biológicos. As estruturas cristalográficas do complexo c-ABL
com os fármacos Imatinib, Nilotinib e Dasatinib (Tabela 1.1) nos dão informações do modo de ligação
dos mesmos, porém o cristal requer que as moléculas estejam orientadas em padrões repetidos e não
necessariamente representa a estrutura da macromolécula no seu ambiente natural (celular),
especialmente se há um equilíbrio entre diferentes conformações como é o caso da proteína c-ABL.
Além do mais, pode diferir significantemente da estrutura in situ já que as condições experimentais de
um cristal são diferentes das condições no metabolismo celular.
A técnica de dinâmica molecular (DM) considera os átomos como esferas e as ligações como
molas. Moléculas passam a ser descritas por modelos matemáticos onde as posições dos átomos, raios,
massas e cargas assim como as ligações covalentes (comprimento e ângulos) são referidos na sua
topologia. Na DM ocorre a troca de energias potencial e cinética de forma que a energia total é
conservada no ensemble. Para um sistema de N partículas com coordenadas ( , , )X x y z=���
e velocidades
( , , )x y zV V V V=��
as forças que atuam em cada partícula podem ser calculadas pelo gradiente negativo de
U( X���
), onde U( X���
) é a função de energia potencial de um sistema em função das coordenadas x, y, z
das partículas, dada pelo campo de força. As forças são utilizadas para calcular as acelerações sendo
que as velocidades e posições atômicas são obtidas pela integração das equações de movimento em
passos pequenos. A iteração é atualizada constantemente (dependente do passo anterior) permitindo
assim a evolução do sistema com relação ao tempo. Alguns algoritmos de integração usuais são o Verlet
(Verlet, 1967) e Leap Frog (Hockney, 1970). Após a dinâmica molecular, a fase de produção é
executada e as propriedades macroscópicas (energias potencial e cinética, pressão, temperatura,
densidade, etc) do sistema são calculadas para análise posterior. Deve-se observar que há métodos que
usam DM para calcular uma propriedade macroscópica importante no planejamento racional de
fármacos tal como a energia livre de ligação.
O estudo computacional da proteína c-ABL complexada com o Imatinib realizado por Pricl et
al. (2005) elucidou que a resistência ao fármaco associada à mutação Thr334Ile, conhecida pela alta
incidência e pior prognóstico, não é somente devido à perda de uma ligação de hidrogênio entre o
resíduo Thr334 e o Imatinib, mas também por outras interações induzidas pelo reajuste de toda
proteína, necessárias para a acomodação do resíduo mutante. Utilizou-se o campo de força AMBER 7
28
(Case et al., 2000) e calcularam-se as energias livres absolutas ( ( )calc selG∆ e ( )calc mutG∆ ) nos últimos 400
ps (após equilibração), tendo como estrutura inicial o PDB 1IEP (2,10 Å de resolução), incluindo 178
águas cristalográficas.
Estudos recentes (Lee et al., 2008) de DM em larga escala (20 ns, após 10 ns de equilibração)
calcularam a energia livre relativa ( ( / )calc mut selG∆∆ ) para as mutações Thr334Ile e da região do P-loop
removendo todas as águas cristalográficas da estrutura inicial (PDB 1IEP). Esse estudo demonstrou que
as mutações localizadas na região do P-loop resultam principalmente em mudanças conformacionais na
hélice α -C reduzindo significativamente a interação dos resíduos Glu305 e Met309.
Nessa dissertação utilizamos a metodologia de LIE (Linear Interaction Energy) para o cálculo
da energia livre com o intuito de comparar com os resultados obtidos nos trabalhos de Pricl et al., 2005
e Lee et al., 2008, os quais utilizaram a metodologia MM-PBSA (Molecular Mechanics-Poisson-
Boltzmann-Surface-Area). Calculamos os valores de ( )calc selG∆ e ( )calc mutG∆ ; e ( / )calc mut selG∆∆ a partir de
dados de IC50 (em mM) retirados de uma mesma fonte: Azam et al. (2003). Descrevemos as energias
livres relativa de ligação entre a proteína BCR-ABL selvagem e 12 mutantes (incluídas as mutações no
P-loop); e não apenas para o mutante Thr334Ile realizada no trabalho de Pricl et al., 2005 e para o P-
loop realizada por Lee et al., 2008.
1.5 Planejamento Racional de Fármacos Baseado em Estrutura
A primeira aplicação do planejamento racional de fármacos baseado em estrutura que levou a
uma droga no mercado foi o inibidor da anidrase carbônica (IAC) dorzolamide (Greer et al., 1994;
Gubernator e Böhm, 1998), aprovado em 1995 para uso oftalmológico (agente antiglaucoma). Outro
importante estudo em planejamento racional de fármacos é o Imatinib, desenvolvido por químicos do
laboratório Novartis no final dos anos 90 após a identificação da proteína alvo BCR-ABL e de um
high-throughput screenning de biblioteca química (Druker e Lydon, 2000). Deve ser destacado que o
Imatinib também é inibidor de outras quinases: c-KIT, EGF e PDGF (Platelet-derived growth factor)
(Carter et al., 2005). Devido ao surgimento de resistência ao Imatinib, associado às mutações pontuais
na proteína alvo, uma segunda geração de fármacos tem sido estudada por métodos computacionais na
tentativa de melhorar a sua eficácia, alterando sua estrutura química, seja adicionando, removendo ou
substituindo novos grupos químicos de forma a inibir com mais potência a maior diversidade de
proteínas mutadas, além da selvagem. Apesar do fracasso nos casos relacionados ao mutante Thr334Ile,
em pacientes em fase aguda, o Imatinib é notoriamente diferente das drogas previamente utilizadas
29
para o combate do câncer, pois é uma das poucas capazes de inibir especificamente seu alvo,
diferentemente dos quimioterápicos que simplesmente não diferenciam entre células tumorais e
normais.
1.6 Química computacional e Modelagem Molecular
Modelagem molecular é um termo genérico utilizado para se referir a métodos teóricos e/ou
técnicas computacionais que modelam e/ou mimetizam o comportamento de moléculas, com o objetivo
de entender e predizer propriedades macroscópicas baseadas no conhecimento detalhado em nível
atômico. O uso de computadores na solução de problemas relacionados à química, baseando-se nos
resultados de química teórica para calcular as propriedades de moléculas, geralmente pode
complementar informações obtidas de experimentos e até prever a ocorrência de certo fenômeno
químico, ou seja, tem importante papel na descoberta e melhoramento de drogas relacionadas a
moléculas biologicamente ativas.
O objetivo da química teórica, e consequentemente da química computacional, é minimizar
erros residuais e ao mesmo tempo tornar os cálculos plausíveis de serem solucionados, para que custos
de triagem e síntese de um novo fármaco sejam minimizados. O Imatinib, por exemplo, foi aprovado
em maio de 2001 pelo FDA (Food and Drug Administration) nos Estados Unidos e no Brasil pela
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), de acordo com publicação no Diário Oficial da
União em junho/2008. O custo de 160 comprimidos é de aproximadamente R$ 10.000 (Capdeville et
al., 2002).
1.6.1 Mecânica Molecular
A mecânica molecular (MM) é um exemplo de técnica de modelagem molecular que descreve a
base física por trás dos modelos. Os sistemas estudados podem variar desde uma simples molécula em
solução até sistemas biológicos grandes como aglomerado de proteínas ou bicamadas lipídicas. Em
muitos casos, sistemas moleculares grandes podem ser modelados com sucesso sem levar em conta os
elétrons dos cálculos de mecânica quântica. Mas, independente do tamanho do sistema, em ambos os
casos, faz-se necessário o uso de um campo de força, crucial para o sucesso do cálculo da mecânica
molecular. Os parâmetros do campo de força são elaborados de forma a conter uma coleção de
diferentes tipos de átomos, parâmetros (para comprimento e ângulos de ligação, torções, etc) e funções
para calcular a energia potencial do sistema. A energia potencial total de uma molécula é representada
30
pela soma de termos de energia individuais, cujos parâmetros devem obrigatoriamente ser obtidos de
dados experimentais ou de cálculos quânticos (ab initio). Esses dados, junto com as formas funcionais
que os relacionam, formam o chamado campo de força ou função potencial. Um campo de força
parametrizado para uma classe específica de molécula, por exemplo, proteína, deve ter relevância na
descrição de outras moléculas da mesma classe (princípio da transferabilidade). Portanto, os mesmos
parâmetros de um campo de força podem ser aplicados a diferentes proteínas permitindo o estudo da
interação de uma possível droga ao seu alvo, sem a necessidade de definir novos parâmetros para cada
molécula. Para drogas não peptídicas, maioria dos casos, há a necessidade de adicionar parâmetros não
existentes no campo de força para simulação de proteínas.
1.6.2 Campo de força
Em um determinado campo de força, um dado elemento da tabela periódica pode ter diferentes
"tipos de átomos" como, por exemplo, o etilbenzeno onde há átomos de carbono com hibridização sp3 e
átomos de carbono aromáticos (sp2). Os átomos de carbono com hibridização sp3 apresentam uma
geometria de ligação tetraédrica, enquanto átomos de carbono aromático têm uma geometria trigonal
(planar). O comprimento de ligação entre os átomos de carbono (C-C) no grupo etil difere do
comprimento no grupo fenila e o comprimento da ligação entre o átomo de carbono etila e o átomo de
carbono da fenila ligados diretamente é diferente de todos os comprimentos de ligação no etilbenzeno.
Os campos de força contêm parâmetros para estes diferentes tipos de ligação e são descritos
comumente por uma função potencial. No nosso caso, o conjunto é formado por seis potenciais, onde
( )iV r é o potencial total:
2 2 21 2 0 0 0
1 1 1
61212 6
1 0
1 1 1({ }) ( , ,..., ) ( ) ( ) ( )
2 2 2
( , )( , )[1 cos( )] [ ]
4
b
at n n n n n
at
n
ij
NN N
i N bn n n
n n n
N Ni j
n n n
n i j ij ij r ij
V r V r r r K b b K K
q qC i jC i jK n
r r r
ξθ
ϕ
θ ξ
ϕ
θ θ ξ ξ
ϕ δπε ε
= = =
= <
= = − + − + −
+ + − + − +
∑ ∑ ∑
∑ ∑ (1.1)
A função de energia potencial total de um sistema molecular constituído de Nat átomos com
vetores posição ri (i = 1,2, 3, ..., Nat) está representada na Equação 1.1 e seus potenciais são:
1) Potencial harmônico linear descreve o movimento vibracional da ligação química: bnK é a constante
de força, bN é o número total de ligações, nb é a distância entre dois átomos ligados, 0nb é a distância
31
da ligação no equilíbrio
2) Potencial harmônico angular: nKθ é a constante de força, nθ é o ângulo entre duas ligações, 0n
θ é o
ângulo de ligação no equilíbrio,
3) Potencial diedral impróprio: nKξ é uma constante de força do ângulo diedral impróprio nξ tendo
como referência o ângulo 0nξ
4) Potencial diedral próprio: nKϕ é a constante de força rotacional do ângulo diedral, nn é a
multiplicidade do ângulo diedral (número de mínimos por volta), nϕ é o ângulo diedral próprio entre
planos formados por quatro átomos consecutivos, nδ é fase ( /n nδ dá a localização do primeiro
máximo).
5) Potencial de Lennard-Jones: i e j são pares de átomos excluindo-se os primeiros e segundos vizinhos
quimicamente ligados, sendo rij a distância que separa esses átomos. 6( ( , ) / )ijC i j r é o termo atrativo
(interação de van der Waals) e 12( ( , ) / )ijC i j r é o termo repulsivo (principio de exclusão de Pauli).
6) Potencial de Coulomb: iq e jq são as cargas parciais dos átomo i e j separados pela distância rij, 0ε é a
permissividade elétrica do vácuo e é a constante dielétrica relativa do meio.
1.6.3 Dinâmica Molecular
De uma forma simplificada, podemos dizer que as interações entre os átomos são de natureza
eletrostática e quântica. A Dinâmica Molecular (DM) trata-se de uma técnica numérica com a qual se
fazem simulações deterministas que modelam o sistema através do conhecimento do potencial de
interação entre os átomos que o compõem.
A Hamiltoniana H(qi, pi) de um sistema molecular clássico pode ser escrita como a soma das
energias cinética T e potencial V, como função das séries de coordenadas generalizadas iq e de
momentos generalizados ip de todos os Nat átomos do sistema:
({ , }) ({ }) ({ })H T V= +i i i iq p p q (1.2)
onde , ,...,=ati 1 2 Nq q q q e , ,...,=
ati 1 2 Np p p p
32
A Equação Hamiltoniana H (Equação 1.2) de um sistema molecular clássico é a soma das
energias cinética T e potencial V em função das séries de coordenadas generalizadas iq e de momentos
generalizados ip de todos os N átomos (Nat) do sistema.
A energia potencial ({ })V iq contém os termos de interação inter e intramoleculares, de curto e
longo alcance, e pode ser substituída pela função potencial ({ })iV r da Equação 1.1, tal que as
coordenadas iq sejam as coordenadas cartesianas ir e ip seus momentos conjugados.
Os algoritmos utilizados nas simulações por DM evoluíram e, junto ao crescimento
considerável da velocidade dos computadores, o tratamento de sistemas maiores e mais complexos se
tornou possível. O entendimento da função de uma proteína relacionada ao seu comportamento em
solução utilizando DM foi realizado pela primeira vez no estudo do inibidor da tripsina pancreática
bovina (McCammon et al. 1977), uma das mais estudadas em termos de folding e cinética. Trata-se de
um método útil por estabelecer uma interface entre experimentos em laboratório e teoria, podendo ser
entendida como um experimento virtual onde as propriedades macroscópicas (entalpia, densidade,
energia total, pressão, temperatura, etc) são obtidas pelas médias efetuadas sobre ensembles estatísticos
(coleção de sistemas replicados que diferem microscopicamente mantendo as propriedades gerais) de
sistemas moleculares:
(i) No ensemble canônico, em que os estados de equilíbrio são caracterizados por serem mínimos
da função energia livre de Helmholtz (NVT), o número de mols (N), volume (V) e temperatura
(T) são conservados. A energia dos processos endo e exotérmicos é controlada por um
termostato.
(ii) No ensemble isotérmico-isobárico no qual os estados de equilíbrio são caracterizados por serem
mínimos da função energia livre de Gibbs (NPT), o número de mols (N), pressão (P) e
temperatura (T) são conservados. Em adição ao termostato, a aplicação de um barostato faz-se
necessária.
O método de DM é apropriado para sucessões de estados, pois o valor médio do ensemble
equivale ao valor médio temporal (hipótese ergódica). Se a configuração inicial estiver muito longe da
forma estável, a simulação por DM pode falhar devido à existência de forças excessivamente altas, e
nesses casos faz-se necessário um processo de minimização de energia para que comprimentos e
ângulos de ligações estejam nas configurações energeticamente favoráveis, assim como que átomos
33
não ligados possam interagir de forma a diminuir o impedimento estérico. Os algoritmos de
minimização de energia, Steepest-Descent (Wiberg, 1965) e Conjugate Gradient (Hestenes e Stiefel,
1952), entre outros, utilizam o gradiente para caracterizar a energia mínima local. Porém, a
conformação “estável” pode estar separada de outra, ainda mais estável, por uma barreira de energia,
que o algoritmo de minimização é incapaz de sobrepujar.
Para identificar a conformação mais estável a temperaturas não baixas, com uma energia
mínima global, é necessário gerar várias conformações de uma molécula e comparar os valores de
energias obtidos a cada modificação. Neste processo ocorrem estiramentos das ligações e alterações
angulares, como se a molécula estivesse sendo “aquecida” e, desta forma, as barreiras de energia entre
as conformações podem ser vencidas. O algoritmo global associado a uma simulação de DM pode ser
resumido, basicamente, no esquema abaixo (Figura 1.11):
34
Figura 1.11: O algoritmo global de MD.
Figura 1.11: Figura modificada (Van der Spoel et al., 2002)
A produção de uma trajetória usualmente envolve 3 passos: a inicialização do sistema, sua
equilibração e a fase de produção. Quando não há velocidades iniciais disponíveis de simulações
prévias, elas são calculadas de acordo com a distribuição de Maxwell-Boltzmann compatível com uma
dada temperatura. Durante a importante fase de equilibração, o sistema é deixado evoluir durante certo
tempo para que suas velocidades sejam ajustadas levando o sistema para o equilíbrio térmico,
necessário na fase de produção.
É crucial tomar certos cuidados ao preparar os sistemas, dada a necessidade de simular essas
r
v
v
ri
ri
ri
vi
vi
r
v
v
ri
ri
ri
vi
vi
35
macromoléculas em solvente explícito, onde certo número de moléculas de água deve ser adicionado
ao redor da proteína, principalmente aquelas que têm papel importante na estabilização do seu inibidor.
Prévio à fase de equilibração, o sistema inteiro precisa ser energeticamente minimizado para evitar
contatos estéricos desfavoráveis e só então uma primeira etapa de DM é realizada para relaxar o
solvente enquanto os átomos da proteína são mantidos nas suas posições iniciais. O próximo passo
consiste em aquecer o sistema até a temperatura desejada e ajustar as velocidades. No ensemble de
Gibss (NPT) o sistema é equilibrado à pressão e temperatura constantes utilizando algoritmos que
ajustam as velocidades e posições em intervalos definidos para alcançar os valores de referência em um
dado período de tempo. O algoritmo descrito por (Berendsen et al., 1984) é geralmente utilizado para
os banhos de pressão e temperatura, porém há ainda outros algoritmos específicos para determinadas
situações como, por exemplo, Nosé-Hoover (Nosé, 1984; Hoover, 1985) para o banho de temperatura e
Parrinello-Rahman (Parrinello e Rahman, 1981) para o banho de pressão. Dependendo do tamanho da
macromolécula estudada, faz-se necessário o uso de condições periódicas de contorno simulando um
sistema pseudo-infinito, onde a célula de simulação central é circundada por réplicas transladadas com
comportamente idêntico.
1.7 Energia livre de Gibbs
O reconhecimento molecular seja computacional ou experimental, está baseado no profundo
conhecimento do sistema biológico (Hopkins e Gromm, 2002), das ferramentas computacionais
existentes, assim como no interesse particular em determinada proteína (Hansson e Johan, 1995; Kolb
et al., 2008). Em 1894, quando Emil Fischer demonstrou o primeiro modelo de reconhecimento
molecular baseado no famoso princípio de chave fechadura, ele não pôde antecipar que após 100 anos
os pesquisadores produziriam compostos sintéticos que atuassem de acordo a esse modelo. Atualmente
muitos grupos ao redor do mundo estão se esforçando para encontrar estruturas adequadas para um
alvo específico assim como há um enorme esforço para determinar se essas estruturas possuem
afinidade pelo seu alvo (Böhm e Schneider, 2003). Um dos grandes desafios do tratamento quantitativo
da energia livre por métodos computacionais está relacionado à descrição do papel de solvatação e
desolvatação. Em particular, a contribuição de ligações de hidrogênio entre a proteína, uma molécula
de água e o ligante podem ser cruciais no cálculo da energia livre.
Ao iniciar uma simulação a partir do cristal, ou a partir de uma configuração obtida por
modelagem por homologia (Hillisch et al., 2004), faz-se necessário um período de equilibração do
solvente. A orientação das moléculas de água, principalmente no sítio ativo da proteína, geralmente não
36
é aleatória. A extensão dessa aleatoriedade assim como quanto o sítio de ligação é modificado pela
ligação/não ligação de um ligante, irá afetar enormemente no cálculo do termo eletrostático da energia
livre de Gibbs pelo método de LIE (Åqvist et al., 2006). Durante a simulação de dinâmica molecular é
possível predizer posições de moléculas de água conservadas (Cw – conserved water) no sítio ativo e
assim obter um dado, a priori, microscópico.
1.7.1 Tratamento quantitativo da energia livre de Gibbs
Termodinâmica (do grego termo = calor e dinâmica = potencial) é um ramo da física que estuda
os efeitos de mudanças na temperatura, pressão e volume de um sistema físico em nível macroscópico
analisando o movimento coletivo das suas partículas. As reações químicas que ocorrem entre as
substâncias devem ser entendidas tanto do ponto de vista cinético, isto é, através das taxas com que
ocorrem as reações, como do ponto de vista do equilíbrio termodinâmico, ou seja, do resultado final
das proporções dos reagentes e produtos, resultantes de uma mistura inicial.
No estado de equilíbrio, embora os choques e transformações químicas se realizem
continuamente, as concentrações macroscópicas das substâncias envolvidas atingirão um valor de
equilíbrio. Neste sentido, as concentrações finais das substâncias reagentes serão incluídas como
variáveis termodinâmicas no estudo do comportamento dos sistemas macroscópicos.
No equilíbrio químico existe uma relação precisa entre as concentrações das substâncias
reagentes que nos leva a considerar o número de mols presente na mistura como variáveis
termodinâmicas, da mesma forma que a pressão, volume e temperatura. As funções e potenciais
termodinâmicos passam então a depender também destas variáveis e em um processo que ocorre a
pressão e temperatura constantes, a variação da energia livre de Gibbs ( G∆ ), torna-se um critério para
a espontaneidade de uma reação química. Quando seu valor é negativo, indica que a reação é favorável
(espontânea), resultando em energia disponível para processos biológicos como, por exemplo, a ligação
de um fármaco no sítio de uma proteína.
A variação de entropia ( S∆ ), a temperatura (T) e a variação de entalpia ( H∆ ) se relacionam
com a variação da energia livre de Gibbs ( G∆ ), a fim de prever o acontecimento de uma reação
química do ponto de vista termodinâmico através da Equação 1.3:
G H T S∆ = ∆ − ∆ (1.3)
37
O controle termodinâmico versus cinético para a espontaneidade de uma reação leva em conta a
temperatura da mesma, porém em todas as temperaturas os processos que ocorrem com a diminuição
da entalpia (processo exotérmico) e aumento da entropia são considerados espontâneos (exergônico).
As contribuições entrópicas e energéticas da reorganização das moléculas de água do solvente
influenciam na predição da afinidade de ligação de um fármaco ao sítio ativo de uma proteína devido
ao efeito hidrofóbico (Kauzmann, 1959): os resíduos hidrofóbicos são direcionados ao interior da
proteína favorecendo o aumento da entropia da proteína assim como a diminuição da quantidade de
moléculas de água ao redor da proteína, levando ao aumento da entropia do solvente. O aumento da
entropia é desejado para que o valor da energia livre (Equação 1.3) se torne mais negativa.
Quanto maior a hidropatia (tendências hidrofóbicas e hidrofílicas combinadas de cada
aminoácido) maior a tendência do aminoácido ocupar o interior da proteína. Esse fato está diretamente
relacionado à energia livre, que será sempre mais negativa quando houver aumento da entropia do
sistema como um todo (proteína + solvente + ligante). A perda de mobilidade conformacional do
ligante após se ligar ao sítio ativo também contribui para que o processo seja exergônico. As diferenças
de energia livre entre os estados ligado e livre também estão relacionadas ao componente entálpico
(quebra e formação de ligaçõs de hidrogênio), pois o processo exotérmico contribui para a diminuição
da energia livre.
38
Capítulo 2
Objetivos
Realizar um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e
Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além
de determinar a importância do solvente no processo de resistência aos fármacos.
2.1 Objetivos Específicos
� Calcular a energia livre relativa ( ( / )calc mut selG∆∆
) e absoluta ( ( )calc selG∆
e ( )calc mutG∆
) utilizando o
método de LIE ainda não utilizado para estudar a influência de mutações na estrutura da
proteína c-ABL, utilizando duas abordagens distintas: com e sem restrição da posição inicial da
molécula de água Cw (Figura 1.8).
� Monitorar as ligações de hidrogênio entre os fármacos (Imatinib e Nilotinib) e a proteína c-
ABL.
� Observar o comportamento de Cw em função do tempo nas proteínas Selvagem e nas 12
mutantes complexadas com o Imatinib.
� Investigar a flexibilidade do sítio de ligação ao Imatinib.
� Sugerir hipóteses sobre o correto estado de protonação do resíduo de Histidina na mutação
Tyr272His.
� Verificar o efeito alostérico das 12 mutações na proteína c-ABL.
39
Capítulo 3
Metodologia
3.1 Cálculo da energia livre pelo método de LIE
Diferentemente dos métodos utilizados para cálculo de energia livre (Schunzhou et al., 2005), o
método de Energia de Interação Linear (LIE) (Åqvist et al., 1994) desenvolvido para predição da
afinidade de inibidores endotiapepsina (EP) a uma proteína pertencente à família aspartil proteinase, é
baseado nas médias da energia de interação e nas amostras conformacionais utilizando dinâmica
molecular para o cálculo da energia livre. Esse método empírico se baseia no cálculo da energia de
interação entre o ligante e o meio (proteína, solvente, etc), dividida em eletrostática e de Lennard-
Jones. A idéia principal do método é dividir as contribuições polares (eletrostáticas) e apolares
(Lennard-Jones) para o cálculo da energia livre de ligação ( ( )calc selG∆
ou ( )calc mutG∆ ) aproximando-o por
uma medida linear dos termos correspondentes às médias temporais dessas interações intermoleculares,
representadas por < >, do ligante nos dois estados termodinâmicos do equilíbrio: ligado e em solução.
O ∆ representa a diferença entre essas médias. (Equação 3.1).
( ) (l s l s l s l sLJ LJ el el
calc ligado livre ligado livreG U U U Uα β γ− − − −∆ = < > − < > + < > − < > + (3.1)
Equação de LIE para o cálculo da energia livre absoluta ( ( )calc selG∆ ou ( )calc mutG∆ )
A abordagem é esquematizada na Figura 3.1 (Åqvist et al., 1998), onde as duas barras verticais
do ciclo denotam as energias livres associadas ao turning on (colocar carga elétrica positiva ou negativa
nos resíduos que possuem estado de protonação na forma iônica em pH fisiológico: Lys, Arg, Glu e
Asp) das interações eletrostáticas entre o ligante e o meio, nos estados ligado e livre em solução,
respectivamente. A energia livre de ligação corresponde à diferença entre esses dois estados, mais uma
contribuição não polar representada pela barra horizontal.
40
Figura 3.1: Ciclo termodinâmico. Fonte: Åqvist et al. 1998.
Os coeficientes de LIE: α , β e γ (Equação 3.1) estão intimamente relacionados ao modelo em
estudo e originalmente o método foi utilizado calibrando os coeficientes para vários ligantes
empregando apenas uma proteína. O cálculo da contribuição eletrostática para a energia livre relativa
foi realizado utilizando β = 0,5 de acordo com a aproximação linear, porém valores diferentes para
esse coeficiente têm sido encontrados dependendo da estrutura química do ligante: 0,33 (com dois ou
mais grupos hidroxila), 0,37 (um grupo hidroxila), 0,43 (sem grupos hidroxila) e 0,50 (carregado)
(Åqvist et al., 1998). A contribuição van der Waals (apolar) correspondente ao coeficiente α é
determinada de forma empírica e mantém uma boa aproximação com medidas relacionadas ao tamanho
do ligante: área, volume e comprimento da cadeia carbônica. Em estudos realizados previamente, o
valor de α = 0,18 tem reproduzido energias livres de ligação de vários sistemas, e tem-se demonstrado
que esse coeficiente não é dependente do sistema nem do campo de força, para os casos estudados até
hoje por Åqvist et al. (2004) com 9 ligantes diferentes complexados em P450cam utilizando os campos
de força Amber95, Gromos87 e OPLS-AA. A constante γ reflete a hidrofobicidade do sítio de ligação
que pode ser necessária para reprodução da energia livre absoluta, mas não é necessária para o cálculo
da energia livre relativa (Åqvist et al., 2006). Apesar de não se ter encontrado uma parametrização
"universal" para esses coeficientes no cálculo da energia livre, há algumas qualidades dessa abordagem
que devem ser enfatizadas: pode-se estudar em nível atômico o efeito de uma mutação pontual em uma
proteína associada à resistência a um fármaco devido à possibilidade de inferir a tendência de ligação
41
do fármaco no sítio da proteína pelo valor positivo da energia livre relativa (mutada em relação à
selvagem).
3.1.2 Adequação do método LIE para aplicação neste trabalho
As simulações de DM focaram-se na região de interesse: o sítio de ligação do fármaco à
proteína. Utilizou condições de contorno esféricas com raio de corte de 20 Å: na presença do solvente
explícito (Modelo SPC) e posteriormente em complexo com o sítio quinase da proteína BCR-ABL
(selvagem e 12 mutantes) e o solvente envolvido. Como centro da esfera, foi considerado o átomo
central do ligante (C15 – Figura 4.2).
Desde a publicação original do método (Åqvist, et al. 1994) tem-se demonstrado que não há
como encontrar uma parametrização universal dos coeficientes de LIE (Shunzhou W. et al, 2005).
Originalmente, esses coeficientes α, β e γ (Equação 3.1) eram intimamente relacionados ao modelo em
estudo e foram calculados utilizando uma família de ligantes empregando apenas uma proteína. No
nosso caso particular, os coeficientes foram calculados a partir de um processo de calibração usando 12
proteínas mutantes e 1 selvagem complexadas a apenas um ligante (Imatinib). É por isso que no nosso
caso, esses coeficientes representam a contribuição média de um conjunto de receptores e se denotam
como: α , β e γ . Os parâmetros médios de calibração α , β e γ foram obtidos após minimização do
erro da predição da energia livre a partir de estudos experimentais prévios da proteína BCR-ABL
(selvagem e com mutações sítio-dirigidas) complexada com o Imatinib (Azam et al., 2003).
2
exp
exp
( , , ) calc
i
G GE
Gα β γ
∆ −∆=
∆ ∑ (3.2)
Utilizamos o cálculo por mínimos quadrados pela Equação 3.2 para minimização do erro e
obtenção dos coeficientes de LIE.
Levando em consideração a aproximação para o cálculo da energia livre experimental:
exp( )selG∆ ou exp( ) 50 50ln( ) ln( 0,50 ) ln( )mut diss enzG RT k RT IC C RT IC∆ = = + ≈ (3.3)
onde R é a constante universal dos gases, T é a temperatura absoluta (K), Cenz é a concentração da
enzima que é um número insignificante quando comparado após a equilibração e pode ser omitido
42
nesse caso.
Calculamos o ( / )calc mut selG∆∆para 12 mutantes, para ligação com o Imatinib e também o outro
fármaco Nilotinib, clinicamente reconhecido como mais potente, utilizando os mesmos parâmetros
médios.
3.2 Escolha das estruturas e inibidores
A estrutura do motivo tirosina quinase da oncoproteína BCR-ABL foi obtida no banco de dados
PDB (Berman et al., 2000; Westbrook et al., 2002), tomando-se como critério a estrutura cristalográfica
com melhor resolução e que tivesse os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio. Como a estrutura obtida
por difração de raio-X do domínio quinase ligado ao Nilotinib (PDB 3CS9, Weisberg et al., 2005) não
possui cinco resíduos importantes na sua estrutura, um modelo por homologia foi construído usando o
programa SPDB-viewer (Guex e Peitsch, 1997) utilizando como molde a cadeia A da estrutura PDB
1OPJ ligada ao Imatinib com 1,75 Å de resolução. (Nagar et al., 2003). A identidade entre as
seqüências do domínio quinase da 1OPJ e 3CS9 (100 %) associada à alta resolução da estrutura
cristalográfica, permitiu a construção do modelo estrutural da quinase com o Nilotinib. A molécula de
água Cw (Figura 1.8) da estrutura PDB 1OPJ que está envolvida em uma rede de ligações de
hidrogênio com os resíduos Lys290 e Glu305, assim como a cadeia principal do Asp400 e o grupo
amida (com um átomo de hidrogênio disponível) do Imatinib foi mantida. Essas interações são
conservadas em ambos modelos com ambos ligantes.
3.2.1 Escolha dos mutantes
As 12 mutações estudadas foram realizadas nas estruturas tridimensionais utilizando o
programa SPDB-viewer (Guex e Peitsch, 1997) e partindo da estrutura inicial (PDB 1OPJ com 1,75 Å
de resolução). As diferenças no cálculo das energias livres foram investigadas como consequência do
efeito das mutações Thr334Ile, Leu267Arg, Gln271His, Tyr272His, Glu274Lys estudadas por Lee et al.
(2008), e mais sete mutações adicionais (Met263Val, Met263Ile, Thr334Ser, Met370Thr, Met370Ile,
Leu403Met e Gly417Arg) encontradas em outras regiões da proteína c-ABL e ainda não estudadas pela
técnica de Dinâmica Molecular (DM).
43
3.3 Escolha dos parâmetros utilizados nas simulações de dinâmica molecular
Realizamos as simulações de DM utilizando o programa Q (versão 5.0 Janeiro/2004) (Marelius
et al., 1998) e campo de força GROMOS96, baseado no Gromos87 (Van Gunsteren e Berendsen,
1987). Consideramos a mediação de uma molécula de água conservada na interação da onco-proteína
BCR-ABL com o fármaco Imatinib e optamos por realizar as simulações e calcular a energia livre
relativa (da proteína mutada em relação à selvagem) de duas maneiras: restringindo ou não a posição
inicial dessa molécula de água através da aplicação de um potencial harmônico de constante de força de
5 kcal/(molÅ2).
O arquivo necessário para a construção da topologia da proteína (Qgrm96.lib) que define os
átomos e as conectividades de resíduos de qualquer proteína está disponível no pacote do programa. As
cargas parciais atômicas do Imatinib e do Nilotinib foram calculadas utilizando o campo de força
MMFF94 do programa Sybyl 7.3 (Tripos International, 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri,
63144, USA) e incorporadas ao arquivo de biblioteca do respectivo ligante (STI.lib e NIL.lib). Os
parâmetros dos ligantes foram agregados no arquivo de parâmetros correspondentes ao campo de força
escolhido (Qgrm96.prm), as coordenadas das estruturas iniciais foram solvatadas com o modelo de
água SPC (Simple Point Charge) (Berendsen et al., 1987) em uma esfera de raio = 20 Å. As topologias
dos sistemas foram geradas pelo programa Qprep, obtendo assim toda informação molecular necessária
para a simulação (complexo.top e STI.top/NIL.top). Deste modo, o sistema (proteína quinase +
solvente + ligante) é composto por aproximadamente 2280 átomos imersos em um sistema esférico
finito. Restringimos as moléculas de água localizadas além da esfera de 18,5 Å para evitar evaporação
das mesmas pela aplicação de uma força derivada de um potencial harmônico de constante k = 200
kcal/(molÅ2) nos seus átomos.
O sistema foi aquecido de 1 a 300 K utilizando uma equilibração controlada para estabilização
das interações do ligante com o meio antes da fase de coleta. Durante a fase de equilibração de 1 a 4
(Apêndice C), os átomos pesados do Imatinib, Nilotinib e Cw foram mantidos nas suas posições iniciais
utilizando um potencial harmônico de constante de força de 5 kcal/(molÅ2). Ao todo, o processo de
equilibração (1 a 6) teve um período de 39,7 ps, a temperatura (300 K) e a pressão (1 atm) do sistema
foram mantidas constantes durante os 1000 ps de simulação de DM. Os detalhes referentes à
equilibração estão no Apêndice C.
O algoritmo de SHAKE (Ryckaert et al., 1977) foi utilizado para os vínculos das ligações e
ângulos do solvente. As interações entre átomos não ligados foram calculadas sem restrições de raio de
44
corte e o potencial eletrostático de longo alcance na fronteira foi tratado por uma expansão multipolar
(Lee e Warshel, 1992). A frequência dos eventos regulares da simulação foi definida da seguinte forma:
lista de pares de átomos não ligados foram gerados a cada 25 passos, a energia e as coordenadas foram
escritas a cada 250 passos. O tempo de integração utilizado na fase de produção foi de 1 fs em 50000
passos, de modo a obter um total de 20 arquivos de trajetória com 50 ps de simulação cada (totalizando
1000 ps). O valor médio das energias de interação eletrostática e Lennard-Jones, respectivamente elU e
LJU , entre o fármaco (Imatinib ou Nilotinib) e o meio, nos estados ligado e livre, calculado nos
últimos 250 ps dessas trajetórias, foi utilizado na Equação 3.4 para estimar a energia livre de ligação.
Maiores detalhes sobre o protocolo utilizado nas simulações podem ser vistos no Apêndice C, baseado
no tutorial do programa Q disponível na
Internet:http://xray.bmc.uu.se/~aqwww/q/samples/default.html.
3.4 Análise do comportamento de Cw e mobilidade dos resíduos do sistema ABL/Imatinib
Utilizamos um programa em linguagem Fortran capaz de encontrar as possíveis ligações de
hidrogênio entre o Imatinib, os resíduos Asp400 e Glu305 durante os 1000 ps de simulação nas
proteínas c-ABL selvagem e 12 mutantes. Os valores da raiz dos desvios quadráticos médios (RMSD)
dos átomos pesados dos resíduos localizados a 4 Å de distância do Imatinib (incluindo todos resíduos
do P-loop e motivo DFG), tendo como referência a estrutura cristalográfica, foram obtidos pelo
programa Q conforme Equação 3.7.
2 1/ 21 2 1 2
1
( , ) [1/ || ( ) ( ) || ]N
i i i
i
RMSD t t M m r t r t=
= −∑ (3.4)
onde 1
N
i
i
M m=
=∑ e ( )ir t é a posição do átomo i no tempo t.
O programa MOLMOL (MOLecular Analysis and MOLecule display) (Koradi et al., 1996) foi
utilizado para avaliar o efeito alostérico causado pelas 12 mutações pontuais.
45
Capítulo 4
Resultados
Neste capítulo serão apresentados os resultados obtidos utilizando a técnica computacional de
Dinâmica Molecular (DM) para calcular as energias livres absolutas das proteínas mutantes ( ( )calc mutG∆ )
e a energia livre absoluta da proteína selvagem ( ( )calc selG∆ ) utilizando a metodologia LIE.
Consequentemente foram obtidas as energias livres relativas (mutante versus selvagem -
( / )calc mut selG∆∆ ), da proteína c-ABL selvagem em relação a 12 proteínas mutantes (Met263Val,
Met263Ile, Leu267Arg, Gln271His, Tyr272His, Glu274Lys, Thr334Ile, Thr334Ser, Met370Thr,
Met370Ile, Leu403Met e Gly417Arg) complexadas com Imatinib ou Nilotinib. As diferenças nas
energias (Eletrostática e Lennard-Jones) dos fármacos livres na água e ligados ao domínio quinase da
proteína c-ABL foram analisadas para melhor compreensão das interações intermoleculares e possíveis
explicações para a resistência aos fármacos (Imatinib e Nilotinib) associada às mutações pontuais
foram dadas.
4.1 Diferenças nas energias (Eletrostática e Lennard-Jones) dos fármacos (Imatinib e Nilotinib)
livres na água
Os valores de energia eletrostática ( elU< > ) e Lennard-Jones ( LJU< > ) foram obtidos a partir
de 1000 ps de simulação por DM do Imatinib e Nilotinib em solução, e estão apresentados na Tabela
4.1 em médias realizadas a cada 50 ps.
46
Tabela 4.1: Média das energias eletrostáticas ( eleU< ∆ > e Lennard-Jones ( LJU< ∆ > ), realizadas a
cada 50 ps, dos 1000 ps de simulação por DM do Imatinib e Nilotinib em solução.
IMATINIB NILOTINIB
Amostras eleU< ∆ > LJU< ∆ >
eleU< ∆ > LJU< ∆ >
1 -85,47 -39,09 -81,02 -43,55
2 -88,19 -38,08 -81,15 -42,96
3 -84,16 -39,06 -82,34 -42,77
4 -86,44 -38,21 -83,55 -43,13
5 -83,40 -39,19 -82,31 -42,55
6 -84,46 -38,66 -83,23 -43,12
7 -90,02 -37,91 -84,26 -43,27
8 -83,79 -38,70 -82,56 -43,42
9 -84,07 -39,34 -82,58 -43,98
10 -83,19 -39,43 -82,87 -42,98
11 -86,62 -39,20 -80,52 -42,89
12 -85,29 -39,81 -83,24 -43,09
13 -82,92 -38,51 -80,75 -43,90
14 -82,70 -39,09 -83,22 -43,92
15 -83,83 -39,52 -82,87 -42,37
16 -84,99 -39,06 -82,38 -43,86
17 -84,87 -38,68 -81,26 -43,38
18 -86,10 -39,24 -83,04 -43,87
19 -84,54 -39,77 -81,66 -44,19
20 -86,83 -38,69 -81,14 -42,99
47
A média de todas 20 amostras das energias (ele
livreU< > e LJ
livreU< > ) foram obtidas do
programa Q durante os 1000 ps de DM com cada ligante no seu estado livre. A partir desses resultados,
calculamos o desvio padrão (σ ) que é a raiz quadrada da variância (média das diferenças ao quadrado
entre as observações): ele
livreU< > = -85,09 kcal/mol com σ = 1,85 kcal/mol e LJ
livreU< > = -38,96
kcal/mol com σ = 0,53 kcal/mol; e nos 1000 ps de simulação com o Nilotinib no estado livre foi:
ele
livreU< > = -82,30 kcal/mol com σ = 1,04 kcal/mol e LJ
livreU< > = -43,31 kcal/mol com σ = 0,51
kcal/mol.
4.2 Escolha das amostras de energia para calibração dos coeficientes de LIE
Na simulação com o Imatinib livre em solução (qw) (STI_AGUA, Figura 4.1 a), obtivemos 20
amostras das energias eletrostática (Ele_qw) e de Lennard-Jones (Evdw_qw), sendo que a média de
todas elas resultou em desvios padrão, respectivamente iguais a, 1,85 kcal/mol e 0,53 kcal/mol. Visto
que os desvios padrão não foram elevados quando comparados com todas as 20 amostras, utilizamos os
valores da média de todas elas, ou seja, Eel_TOT = - 85,09 kcal/mol e Evdw_TOT = - 38,96 kcal/mol.
48
a) Resultado da simulação com Cw livre obtido pelo programa Q das amostras (50 ps de DM cada) de
energias, Eletrostática e Van der Waals, do Imatinib (STI) livre em solução (STI_AGUA) e ligado na
proteína ABL selvagem (CPLX_ABL_STI).
STI_AGUA
N Eel_qp Ele_qw Eel_TOT SD Evdw_qp Evdw_qw Evdw_TOT SD
200 (1) -85.47 -85.47 -39.09 -39.09
200 (2) -88.19 -88.19 -38.08 -38.08
200 (3) -84.16 -84.16 -39.06 -39.06
200 (4) -86.44 -86.44 -38.21 -38.21
200 (5) -83.40 -83.40 -39.19 -39.19
200 (6) -84.46 -84.46 -38.66 -38.66
200 (7) -90.02 -90.02 -37.91 -37.91
200 (8) -83.79 -83.79 -38.70 -38.70
200 (9) -84.07 -84.07 -39.34 -39.34
200 (10) -83.18 -83.18 -39.43 -39.43
200 (11) -86.62 -86.62 -39.20 -39.20
200 (12) -85.29 -85.29 -39.81 -39.81
200 (13) -82.92 -82.92 -38.51 -38.51
200 (14) -82.70 -82.70 -39.09 -39.09
200 (15) -83.83 -83.83 -39.52 -39.52
200 (16) -84.99 -84.99 -39.06 -39.06
200 (17) -84.87 -84.87 -38.68 -38.68
200 (18) -86.10 -86.10 -39.24 -39.24
200 (19) -84.54 -84.54 -39.77 -39.77
200 (20) -86.83 -86.83 -38.69 -38.69
FINAL -85.09 1.85 -38.96 0.53
CPLX_ABL_STI
N Eel_qp Ele_qw Eel_TOT SD Evdw_qp Evdw_qw Evdw_TOT SD
200 (1) -23.61 -27.70 -51.31 -60.72 -5.99 -66.71
200 (2) -25.10 -27.51 -52.61 -60.28 -7.30 -67.58 0.62
200 (3) -25.29 -27.42 -52.71 -61.85 -6.86 -68.71 1.00
200 (4) -24.68 -30.81 -55.49 -62.73 -6.88 -69.61 1.27
200 (5) -24.51 -29.98 -54.49 1.66 -62.45 -7.10 -69.55 1.27
200 (6) -24.47 -30.27 -54.74 1.28 -60.02 -7.92 -67.94 0.92
200 (7) -25.44 -29.31 -54.75 1.03 -61.56 -7.77 -69.33 0.70
200 (8) -25.38 -32.08 -57.46 1.22 -61.99 -7.71 -69.70 0.73
200 (9) -25.19 -32.75 -57.94 1.68 -62.39 -7.11 -69.50 0.72
200 (10) -26.39 -30.83 -57.22 1.55 -63.07 -7.01 -70.08 0.82
200 (11) -25.76 -32.47 -58.23 1.38 -61.67 -7.21 -68.88 0.44
200 (12) -33.10 -26.51 -59.61 0.94 -61.77 -7.48 -69.25 0.45
200 (13) -33.67 -24.20 -57.87 0.88 -64.17 -7.75 -71.92 1.20
200 (14) -33.72 -24.58 -58.30 0.87 -62.84 -7.65 -70.49 1.19
200 (15) -35.59 -28.13 -63.72 2.42 -62.03 -7.69 -69.72 1.21
200 (16) -36.26 -26.64 -62.90 2.68 -61.55 -7.74 -69.29 1.12
200 (17) -36.85 -24.72 -61.57 2.66 -62.63 -7.64 -70.27 1.00
200 (18) -35.70 -27.75 -63.45 2.22 -63.50 -6.67 -70.17 0.48
200 (19) -48.62 -20.85 -69.47 3.05 -63.86 -5.30 -69.16 0.50
200 (20) -51.77 -20.04 -71.81 4.51 -64.32 -6.14 -70.46 0.60
FINAL -65.84 4.51 -69.87 0.60
deltaUel 19.25
deltaUvdw -30.91
Delta_G(2) -3.12 0.05
49
b) Resultado da simulação com Cw livre obtido pelo programa Q das amostras (50 ps de DM cada) de
energias, Eletrostática e van der Waals, do Imatinib ligado na proteína ABL mutante Met263Val
(CPLX_ABL_STI).
Figura 4.1: a) Média FINAL das 20 amostras de energia do Imatinib livre na água (qw) Ele_TOT = -
85,09 kcal/mol (1,85) e Evdw_TOT = -38,96 kcal/mol (0,53); Média FINAL das últimas 5 amostras de
energia do Imatinib ligado (qp) na proteína ABL (em rosa) Ele_TOT = -65,84 kcal/mol (4,51) e
Evdw_TOT = -69,87 kcal/mol (0,60). b) Média FINAL das últimas 5 amostras de energia do Imatinib
ligado na proteína ABL mutante Met263Val (em rosa) Ele_TOT = -69,88 kcal/mol (1,84) e Evdw_TOT
= -64,86 kcal/mol (0,36). Os desvios (entre parêntesis) foram calculados da seguinte maneira utilizando
a Equação 4.1 descrita abaixo:
( ) ( ) ( ) ( )
2 22 2 2 2( ) ( )ligado livre ligado ligadovdw vdw el elσ α σ σ β σ σ= + + + (4.1)
CPLX_ABL_STI
N Eel_qp Ele_qw Eel_TOT SD Evdw_qp Evdw_qw Evdw_TOT SD
200 (1) -23.70 -37.08 -60.78 -60.08 -6.95 -67.03
200 (2) -25.62 -34.76 -60.38 0.28 -59.10 -7.17 -66.27 0.54
200 (3) -21.96 -35.24 -57.20 1.96 -61.13 -6.81 -67.94 0.84
200 (4) -25.27 -31.18 -56.45 2.20 -60.60 -7.12 -67.72 0.75
200 (5) -19.10 -33.31 -52.41 3.40 -62.64 -6.33 -68.97 1.01
200 (6) -25.41 -28.08 -53.49 3.16 -58.98 -8.68 -67.66 0.96
200 (7) -44.87 -23.85 -68.72 6.50 -56.79 -9.34 -66.13 1.02
200 (8) -43.57 -22.44 -66.01 7.47 -58.79 -8.18 -66.97 1.05
200 (9) -42.97 -25.17 -68.14 8.11 -57.26 -9.09 -66.35 1.15
200 (10) -44.40 -20.54 -64.94 6.21 -57.97 -8.70 -66.67 0.60
200 (11) -44.57 -21.93 -66.50 1.55 -59.02 -7.88 -66.90 0.36
200 (12) -43.87 -22.01 -65.88 1.18 -57.39 -8.01 -65.40 0.64
200 (13) -44.89 -21.33 -66.22 1.17 -56.65 -9.21 -65.86 0.61
200 (14) -45.06 -25.90 -70.96 2.34 -55.83 -8.62 -64.45 0.99
200 (15) -47.42 -25.26 -72.68 3.15 -56.16 -8.69 -64.85 0.95
200 (16) -45.82 -22.19 -68.01 2.98 -55.76 -9.43 -65.19 0.54
200 (17) -43.20 -25.43 -68.63 2.54 -54.61 -9.74 -64.35 0.61
200 (18) -44.59 -24.74 -69.33 1.89 -55.25 -9.36 -64.61 0.34
200 (19) -45.68 -26.89 -72.57 2.22 -55.62 -9.42 -65.04 0.34
200 (20) -44.30 -26.58 -70.88 1.84 -57.19 -7.90 -65.09 0.36
FINAL -69.88 1.84 -64.86 0.36
deltaUel 15.21
deltaUvdw -25.89
Delta_G(2) -2.95 0.03
50
Na escolha das amostras de energia do Imatinib ligado à proteína c-ABL, selvagem (Figura 4.1
a) e 12 mutantes (Met263Val, Figura 4.1 b) (CPLX_ABL_STI), calculamos os desvios padrão da média
de Eel_TOT e Evdw_TOT (a cada 250 ps). Calibramos os coeficientes de LIE utilizando a Equação 3.2
e consequentemente realizamos o cálculo da energia livre pela Equação 3.1, testando 3 possibilidades:
1) utilizando apenas a média das 5 amostras de energia com desvios padrão pequenos quando
comparados com os desvios dos “blocos” de outras 5 amostras;
2) utilizando os últimos 250 ps de DM, porém eliminando os valores que desviavam da média e
aumentavam o desvio padrão (abordagem aleatória);
3) utilizando os últimos 250 ps de DM, incluindo todos os valores (abordagem mais padronizada).
A opção 3 resultou em melhores resultados de convergência ao equilíbrio para todos os
complexos (ABL/Imatinib selvagem e 12 mutantes), ou seja, utilizando os últimos 250 ps de DM
conseguimos chegar a erros na predição da energia livre absoluta menores que 1,3 kcal/mol. Esse
mesmo procedimento de calcular a energia livre de ligação utilizando diferentes amostras foi utilizado
por Almlof et al. 2006.
4.2.1 Estimativas das energias (Eletrostática e Lennard-Jones) de proteína c-ABL selvagem e dos
12 mutantes complexados aos fármacos Imatinib ou Nilotinib
A simulação computacional pode ser considerada uma ciência experimental e, portanto os
resultados devem ser submetidos a análises sistemáticas. Uma possível fonte de erro sistemático está na
realização de um processo de equilibração insuficiente. Em DM é necessário gerar uma estrutura
representativa a uma dada temperatura para calcular propriedades macroscópicas no equilíbrio
termodinâmico como a energia livre. Para isso, há a necessidade de convergência ao equilíbrio durante
a simulação. Os valores numéricos das energias e de convergência foram estimados pelo desvio padrão
amostral a cada 250 ps de acordo com o método baseado no conceito de ineficiência estatística
(Tildesley e Allen, 1986).
Os valores de energia e de convergência obtidos durante os últimos 250 ps da simulação por
DM com Cw livre e fixa, estão ilustrados na Tabela 4.2.
51
Tabela 4.2: Média dos valores das energias eletrostáticas e van der Waals (Lennard-Jones) dos últimos
250 ps de simulação por DM do Imatinib e Nilotinib ligados ao domínio quinase da proteína c-ABL
(selvagem e dos 12 mutantes), com (Cw fixo) e sem (Cw livre) restrição na posição inicial de Cw.
Desvio padrão amostral (N=5) entre parêntesis. Unidades em kcal/mol.
† Mutações Leu267Arg, Gln271His, Tyr272His, Glu274Lys estão na região P-loop da c-ABL
Proteína c-ABL complexada com IMATINIB
Proteína c-ABL complexada com NILOTINIB
Cw fixo Cw livre Cw fixo Cw livre
<Uele> <ULJ> <Uele> <ULJ> <Uele> <ULJ> <Uele> <ULJ>
Selvagem -77,29 (2,69)
-62,01 (1,75)
-65,84 (4,51)
-69,87 (0,60)
-62,69 (1,49)
-74,24 (0,35)
-58,77 (1,76)
-77,88 (0,52)
Met263Val -51,22 (1,93)
-69,40 (0,28)
-69,88 (1,84)
-64,86 (0,36)
-57,02 (1,07)
-76,19 (0,27)
-60,93 (1,34)
-73,52 (1,07)
Met263Ile -49,91 (1,27)
-69,78 (0,47)
-38,90 (1,69)
-72,61 (0,61)
-52,06 (1,18)
-78,83 (0,33)
-59,66 (1,36)
-77,65 (0,34)
Leu267Arg † -51,49 (2,34)
-67,46 (0,90)
-48,76 (3,06)
-69,00 (1,12)
-57,09 (0,99)
-73,38 (0,69)
-58,15 (0,93)
-74,45 (1,11)
Gln271His † -66,19 (2,78)
-68,82 (0,41)
-57,79 (5,29)
-65,32 (2,15)
-54,92 (1,74)
-79,03 (1,01)
-58,40 (0,83)
-77,90 (0,84)
Tyr272His † -62,26 (4,80)
-67,25 (0,25)
-60,08 (7,23)
-70,53 (0,63)
-58,08 (1,19)
-73,98 (0,55)
-60,55 (1,02)
-75,93 (0,86)
Glu274Lys † -55,62 (2,20)
-67,89 (0,87)
-69,00 (2,22)
-65,72 (0,59)
-57,33 (0,75)
-74,78 (0,54)
-61,91 (0,50)
-76,84 (0,49)
Thr334Ile -47,93 (2,89)
-68,73 (0,60)
-56,74 (2,03)
-68,08 (1,90)
-50,48 (0,63)
-79,93 (0,63)
-56,81 (1,02)
-78,48 (0,36)
Thr334Ser -70,28 (3,11)
-62,99 (0,68)
-71,92 (1,91)
-69,80 (0,66)
-57,47 (0,83)
-75,89 (0,40)
-58,02 (2,11)
-75,11 (1,44)
Met370Thr -47,01 (2,95)
-71,48 (0,91)
-48,39 (1,28)
-71,05 (0,21)
-57,15 (1,49)
-73,40 (0,59)
-58,58 (2,21)
-80,89 (1,10)
Met370Ile -54,04 (1,09)
-72,03 (0,75)
-57,31 (1,70)
-68,32 (0,37)
-56,88 (2,08)
-83,12 (0,41)
-58,48 (2,46)
-77,35 (1,25)
Leu403Met -44,12 (1,65)
-72,15 (1,09)
-58,58 (2,86)
-66,56 (1,18)
-58,11 (0,72)
-75,22 (0,93)
-59,33 (1,44)
-75,42 (0,78)
Gly417Arg -45,26 (5,10)
-72,27 (1,17)
-51,20 (2,25)
-70,99 (0,77)
-54,83 (1,38)
-75,01 (1,21)
-57,68 (1,42)
-76,39 (0,76)
52
Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa α = 0,2169; β = 0,0654; γ =
1,4159; e Cw livre α = 0,0394; β = 0,0077; γ = -2,0503. Os valores numéricos dos três coeficientes
foram menores na simulação do sistema com Cw livre, sendo que a maior diminuição ocorreu no
coeficiente representado pelo termo γ . O coeficiente representado pelas interações de van der Waals
(α ) passou de 0,2169, em Cw fixa, para 0,0394, em Cw livre, sugerindo que a imposição dessa
restrição (Cw Fixa) nas simulações dos mutantes são desfavoráveis influenciando negativamente na
predição da energia livre relativa. O fator β passou de 0,0654 (Cw fixa) para 0,0077 (Cw livre) e
indica que a diminuição do seu valor também está fortemente relacionada à modifição no entorno do
sítio de ligação induzida pela presença constante da molécula Cw .
As médias el
ligadoU< > , LJ
ligadoU< > , el
livreU< > e LJ
livreU< > , assim como os coeficientes de
LIE para Cw fixa e Cw livre, foram utilizadas na Equação 3.3 para estimar a energia livre relativa
(mutante em relação à selvagem) dos sistemas proteína/Imatinib com Cw livre e Cw fixa. Utilizando os
valores das médias de energia nas simulações com Cw livre foram encontrados valores mais
compatíveis com a predição da energia livre relativa a partir de dados experimentais ( exp( / )mut selG∆∆ > 0)
para todos 12 mutantes, exceto Thr334Ser na simulação com Imatinib (Tabela 4.3).
Os valores de energia livre relativa das simulações ( ( / )calc mut selG∆∆ ), obtidos a partir de
comparações entre as estimativas de energia de interação do Imatinib complexado à proteína selvagem
e a cada um dos 12 mutantes são apresentados na Tabela 4.3, para Cw livre ou fixa. Estes valores nos
dão evidências importantes para o cálculo da predição da energia livre, pois há maior concordância
com os valores experimentais ( exp( / )mut selG∆∆ ) quando não se impõe restrição na posição inicial de Cw.
As proteínas quinase são estudadas há mais de 15 anos, porém apesar do número de estruturas
disponíveis, pouco estudo tem sido direcionado a outros elementos do domínio quinase, como por
exemplo o recente trabalho realizado por Knighton et al. (2009) onde foi feito um alinhamento
estrutural seguido de dinâmica molecular de 13 proteínas quinase e assim descoberto a presença de seis
moléculas de água que ocorrem em localizações conservadas. Partindo do trabalho de Schindler et al.,
(2000), escolhemos uma molécula de água conservada Cw que interage com dois resíduos importantes
da proteína c-ABL. Os desvios no cálculo da energia livre relativa na predição pelo método de LIE com
Cw livre foram menores quando comparado com Cw fixa (Tabela 4.3).
53
Tabela 4.3: Comparação dos valores de energia livre de Gibbs relativa (em kcal/mol). Experimentais
( exp( / )mut selG∆∆ ) e calculadas computacionalmente ( ( / )calc mut selG∆∆ ).
Proteína
( / )calc mut selG∆∆
Proteína/Imatinib
Cw fixa
exp( / )mut selG∆∆ †
Proteína/Imatinib
( / )calc mut selG∆∆
Proteína/Imatinib
Cw livre
Met263Val 0,10 ± 0,67 0,98 0,17 ± 0,07
Met263Ile 0,11 ± 0,66 0,50 0,02 ± 0,09
Leu267Arg 0,51 ± 0,75 2,09 †† 0,17 ± 0,11
Gln271His -0,75 ± 0,71 0,94 0,24 ± 0,15
Tyr272His -0,15 ± 0,81 2,02 0,02 ± 0,12
Glu274Lys 0,14 ± 0,74 1,79 0,14 ± 0,09
Thr334Ile 0,46 ± 0,73 2,09 †† 0,14 ± 0,13
Thr334Ser 0,25 ± 0,75 1,10 -0,04 ± 0,09
Met370Thr -0,07 ± 0,77 1,25 0,09 ± 0,08
Met370Ile -0,65 ± 0,69 0,58 0,13 ± 0,08
Leu403Met -0,03 ± 0,76 0,92 0,19 ± 0,11
Gly417Arg -0,13 ± 0,90 0,36 0,07 ± 0,09
† Dados de IC50 retirados da mesma fonte (Azam et al. 2003) para a proteína c-ABL selvagem e todos
os 12 mutantes.
†† Limites inferiores, isto é, os valores de exp( / )mut selG∆∆ para os mutantes Leu267Arg e Thr334Ile
podem ser maiores devido ao fato de seus IC50 serem > 20,0 µM.
Calculado: ( / ) ( ) ( )LJ LJ el el
calc mut sel ligado livre ligado livreG U U U Uα β∆∆ = < > − < > + < > − < >
Experimental: exp( / ) 50 50ln( ) ln( 0,5 ) ln( †)mut sel diss enzG RT k RT IC C RT IC∆∆ = = + ∼ , sendo T= 300K, R =
8,3145 JK-1mol-1 e 1 cal = 4,189 J. Na simulação com Cw fixa: α = 0,2169; β = 0,0654; γ = 1,4159
e para Cw livre: α = 0,0394; β = 0,0077; γ = -2,0503.
Cálculo do desvio padrão de ( / )calc mut selG∆∆ está indicado ao lado dos valores de energia livre relativa e
54
foram calculados da seguinte maneira: 2 2
T selvagem mutadoσ σ σ= + . Os menores desvios de
( / )calc mut selG∆∆ foram obtidos na simulação com Cw livre.
Percebe-se que não foi obtida uma predição adequada para o mutante Thr334Ser (- 0,04 ± 0,09
kcal/mol) quando se compara com dados experimentais de Azam et al. 2003. Comparando os 12
valores de energia livre de Gibbs relativa nas simulações com o Imatinib verificamos que para Cw fixa
obtivemos ( / )calc mut selG∆∆ positivos para seis proteínas mutantes e com Cw livre obtivemos
( / )calc mut selG∆∆ positivos para onze das 12 proteínas mutantes.
4.2.2 Comparação dos valores de energia livre relativa e absoluta da proteína c-ABL selvagem e
dos mutantes ligados ao Imatinib ou Nilotinib
Os valores de energia livre relativa ( ( / )calc mut selG∆∆ ) obtidos para os dois fármacos (Imatinib e
Nilotinib) através das simulações com Cw fixa e livre está ilustrado na Figura 4.2 a e b,
respectivamente. Nas simulações com Cw fixa (Figura 4.2 a) encontramos valores de ( / )calc mut selG∆∆ > 0
para seis mutantes nas simulações com Imatinib (Met263Val, Met263Ile, Leu267Arg, Glu274Lys,
Thr334Ile, Thr334Ser) e ( / )calc mut selG∆∆ > 0 para cinco mutantes nas simulações com Nilotinib
(Leu267Arg, Tyr272His, Glu274Lys, Met370Thr, Leu403Met e Gly417Arg).
Nas simulações com Cw livre (Figura 4.2 b) encontramos valores de ( / )calc mut selG∆∆ > 0 para a
maioria dos 12 mutantes, exceto para o mutante Thr334Ser na simulação com Imatinib e para os
mutantes Gln271His, Thr334Ile e Met370Thr na simulação com Nilotinib. Na Figura 4.2 c estão
ilustrados os valores de energia livre absoluta para todas as proteínas: selvagem ( ( )calc selG∆ ) e 12
mutantes ( ( )calc mutG∆ ). Nesse caso obtivemos valores de energia livre absoluta < 0 para todas as
predições.
Os desvios padrão mostrados na Figura 4.2 foram calculados segundo a descrição apresentada
na legenda da Tabela 4.3. Os mesmos coeficientes de LIE, obtidos na calibração do sistema
proteína/Imatinib com Cw livre (α = 0,0394; β = 0,0077; γ = -2,0503), foram utilizados para calcular
os valores de calcG∆ do domínio quinase da proteína c-ABL complexada com Nilotinib.
55
a) Predições de ( / )calc mut selG∆∆ entre a proteína selvagem e cada proteína mutante ligadas ao Imatinib ou
ao Nilotinib com restrição na posição inicial de Cw.
b) Predições de ( / )calc mut selG∆∆ para Imatinib ou ao Nilotinib ligados à proteína c-ABL selvagem e 12
mutantes sem restrição na posição inicial de Cw.
56
c) Predições de ( ( )calc selG∆ e ( )calc mutG∆ ) para Imatinib e Nilotinib ligados à proteína c-ABL selvagem e
12 mutantes sem restrição na posição inicial de Cw.
Figura 4.2: Predições da energia livre relativa ( ( / )calc mut selG∆∆ ) e absoluta ( ( )ca lc selG∆ ou ( )calc mutG∆ )
para Imatinib e Nilotinib ligados à proteína c-ABL selvagem e 12 mutantes.
4.2.3 Comparação dos modelos com e sem restrição na posição de Cw
Calculamos a raiz do desvio quadrático médio (RMSD) para comparar os valores de energia
livre relativa obtidos pelo método de LIE ( ( / )calc mut selG∆∆ ) e os observados experimentalmente
( exp( / )mut selG∆∆ ). Foram utilizadas as duas abordagens: (1) com e sem restrição na posição inicial de Cw;
(2) considerando o cálculo de todas as 12 mutações ou excluindo as mutações na região do P-loop e a
Thr334Ile (devido valor de exp( / )mut selG∆∆ ≥ 2,09 kcal/mol). Desvios maiores foram obtidos quando Cw
foi mantida fixa, tanto quando consideramos os 12 mutantes como quando foram excluídos do cálculo
os mutantes presentes no P-loop e Thr334Ile (Tabela 4.4). Isso sugere que particularmente a mutação
Thr334Ile e a região P-loop assim como a restrição da posição inicial de Cw, estão fortemente
associadas aos valores negativos obtidos nas predições da energia livre relativa.
57
Tabela 4.4: Comparação do RMSD dos modelos com e sem restrição na posição inicial de Cw, nas
simulações da proteína c-ABL com Imatinib. Sendo N = 12. ( )2exp
1
N
calcG G
N
∆∆ −∆∆∑
Modelos
(Cw fixa)
(Cw livre)
Todas mutações
1,790 kcal/mol 1,589 kcal/mol
Sem P-loop e
Thr334Ile
0,867 kcal/mol 0,537 kcal/mol
4.3 Comparação das energias livres relativas calculadas ( calc(mut/sel)∆∆G ) versus experimentais
( exp(mut/sel)∆∆G ) com Cw livre
A escolha entre os coeficientes de LIE com e sem restrição da posição inicial de Cw foi baseada
no valor da energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( exp( )selG∆ ) ser sempre um número mais
negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada
( exp( )mutG∆ ), resultando em um valor positivo da energia livre relativa:
exp( / ) exp( ) exp( )mut sel mut selG G G∆∆ = ∆ −∆ (Tabela 4.3).
Os erros absolutos na predição, definidos como o módulo da diferença entre a energia livre
relativa experimental e calculada ( ( / ) exp( / )D calc mut sel mut selG G G∆∆ = ∆∆ −∆∆ ) são apresentados na Figura
4.3 para cada um dos 12 mutantes. Mutações na região do P-loop (Tyr272His e Leu267Arg) e
Thr334Ile apresentam os maiores valores de DG∆∆ , e os valores obtidos foram independentes da
distância do resíduo mutante ao centro da esfera utilizada para a simulação, coincidente com o átomo
central do ligante.
58
Figura 4.3: Distância do átomo C15 (centro da esfera utilizada nas simulações) até as mutações
localizadas em várias regiões da proteína c-ABL. Módulo dos valores da diferença entre a energia livre
relativa experimental e calculada ( ( / ) exp( / )D calc mut sel mut selG G G∆∆ = ∆∆ −∆∆ ) dos 12 mutantes da proteína
c-ABL em relação à selvagem.
9,54 2,00 Tyr272His
12,96 0,70 Qln271His
11,78 1,92 Leu267Arg
11,09 1,65 Glu274Lys
15,97 0,81 Met263Val
15,97 0,48 Met263Ile
19,90 0,29 Gly417Arg
11,50 0,74 Leu403Met
15,48 0,46 Met370Ile
15,48 1,1 Met370Thr
6,08 1,1 Thr334Ser
6,08 1,95 Thr334Ile
Distância ( Å ) |∆∆GD|
kcal mol
Muta ç ões
9,54 2,00 Tyr272His
12,96 0,70 Qln271His
11,78 1,92 Leu267Arg
11,09 1,65 Glu274Lys
15,97 0,81 Met263Val
15,97 0,48 Met263Ile
19,90 0,29 Gly417Arg
11,50 0,74 Leu403Met
15,48 0,46 Met370Ile
15,48 1,16 Met370Thr
6,08 1,14 Thr334Ser
6,08 1,95 Thr334Ile
Distância ( Å )
kcal/mol
Muta ç ões
59
4.4 Diferenças nos valores das energias (Eletrostática e Lennard Jones) nas simulações com e sem
restrição da posição inicial de Cw
Na Tabela 4.5 observam-se valores detalhados da diferença entre as simulações com e sem
restrição na posição de Cw, das energias (Eletrostática e Lennard-Jones) absoluta ( U< ∆ > ) e relativa
( U< ∆∆ > ) para os 13 sistemas (domínio quinase selvagem e 12 mutantes - Met263Val, Met263Ile,
Leu267Arg, Gln271His, Tyr272His, Glu274Lys, Thr334Ile, Thr334Ser, Met370Thr, Met370Ile,
Leu403Met e Gly417Arg) complexados ao Imatinib ou Nilotinib.
60
Tabela 4.5: Média das energias eletrostáticas ( eleU< > ) e Lennard-Jones ( LJU< > ) para a proteína c-
ABL selvagem e 12 mutantes em diferentes regiões do domínio quinase ( β 1, P-loop, β 5, contato-
SH2, A-loop e hélice-J) obtidos a partir das simulações com Cw livre e Cw fixa para os fármacos
Imatinib e Nilotinib. Sendo U< ∆ > a diferença das energias nos estados ligado e livre e U< ∆∆ > a
diferença de U< ∆ > nas simulações com a proteína selvagem e mutantes.
ß1 P-loop ß5 contato-SH2 A-loop Hélice-J
wt Met263Val Met263Ile Leu267Arg Gln271His Tyr272His Glu274Lys Thr334Ile Thr334Ser Met370Thr Met370Ile Leu403Met Gly417Arg
IMATINIB
<∆UeleCw FIXA> 7.80 33.88 35.19 33.60 18.90 22.84 29.42 37.16 14.82 38.08 31.05 40.98 39.84
<∆UeleCw LIVRE > 19.25 15.21 46.19 36.33 27.30 25.02 16.09 28.35 13.18 36.71 27.78 26.52 33.89
<∆∆UeleCw FIXA> - 26.07 27.38 25.80 11.10 15.03 21.61 29.36 7.01 30.28 23.25 33.17 32.03
<∆∆UeleCw LIVRE> - -4.04 26.94 17.08 8.05 5.760 -3.16 9.10 -6.08 17.45 8.53 7.26 14.61
<∆ULJCw FIXA> -23.05 -30.44 -30.82 -28.50 -29.86 -28.29 -28.92 -29.77 -24.03 -32.52 -33.07 -33.19 -33.31
<∆ULJCw LIVRE> -
30.91
-25.90 -35.65 -30.04 -26.35 -31.57 -26.76 -29.12 -30.84 -32.09 -29.36 -27.59 -32.03
<∆∆ULJCw FIXA> - -7.39 -7.77 -5.45 -6.81 -5.24 -5.88 -6.72 -0.98 -9.47 -10.02 -10.14 -10.26
<∆∆ULJCw LIVRE> - 5.01 -4.74 0.87 4.55 -0.66 4.15 1.79 0.07 -1.18 1.55 3.31 0.58
NILOTINIB
<∆UeleCw FIXA> 19.61 25.28 30.24 25.21 27.37 24.21 24.97 31.82 24.83 25.14 25.42 24.19 27.47
<∆UeleCw LIVRE> 23.53 21.37 22.64 24.14 23.90 21.75 20.39 25.49 24.27 23.72 23.81 22.96 24.62
<∆∆UeleCw FIXA> - 5.67 10.63 5.6 2.10 4.61 5.36 12.21 5.22 5.54 5.81 4.58 7.86
<∆∆UeleCw LIVRE> - -2.16 -0.89 0.62 0.37 -1.78 -3.14 1.96 0.75 0.19 0.29 -0.56 1.09
<∆ULJCw FIXA> -30.93 -32.88 -35.52 -30.07 -35.72 -30.67 -31.47 -36.82 -32.58 -30.09 -39.81 -31.91 -31.70
<∆ULJCw LIVRE> -34.57 -30.21 -34.34 -31.14 -34.59 -32.62 -33.53 -35.17 -31.80 -37.58 -34.04 -32.11 -33.08
<∆∆ULJCw FIXA> - -1.95 -4.59 0.86 -4.79 0.26 -0.54 -5.69 -1.65 0.84 -8.88 -0.98 -0.77
<∆∆ULJCw LIVRE> - 4.36 0.23 3.43 -4.38 1.95 1.04 -0.60 2.77 -3.01 0.53 2.46 1.49
Os valores de U< ∆ > mostram ser desfavoráreis para as interações eletrostáticas eleU< ∆ >
quando comparados com as de Lennard-Jones LJU< ∆ > , contudo observa-se um padrão na média das
energias relativas eleU< ∆∆ > e LJU< ∆∆ > sendo desfavoráveis para as interações eletrostáticas e
favoráveis para as de Lennard-Jones, na simulação com restrição da posição inicial de Cw. Isso sugere
que durante a simulação com Cw livre ocorrem mudanças estruturais no domínio quinase, em
consequência das mutações pontuais, levando à perda desse padrão.
Deve-se ressaltar que há exceções no padrão de valores negativos para LJU< ∆∆ > nas
61
simulações com Nilotinib e Cw fixa (Leu267Arg = 0,86 kcal/mol; Tyr272His = 0,26 kcal/mol;
Met370Thr = 0,84 kcal/mol). Percebe-se na Tabela 4.5 que não existem valores de eleU< ∆∆ > e
LJU< ∆∆ > favoráveis simultaneamente, mas há ambos desfavoráveis na simulação com os dois
fármacos (Imatinib e Nilotinib) e Cw fixa.
As mutações que possuem ambos, eleU< ∆∆ > e LJU< ∆∆ > , positivos nas simulações com
Imatinib e Cw livre são:
- Na região do P-loop: Leu267Arg ( eleU< ∆∆ > = 17,08 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 0,87
kcal/mol),
- Na região do P-loop: Gln271His ( eleU< ∆∆ > = 8,05 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 4,55 kcal/mol),
- Na β -5: Thr334Ile ( eleU< ∆∆ > = 9,10 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 1,79 kcal/mol),
- No contato-SH2: Met370Ile ( eleU< ∆∆ > = 8,53 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 1,55 kcal/mol),
- Na região do A-loop: Leu403Met ( eleU< ∆∆ > = 7,26 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 3,31
kcal/mol)),
– Na hélice-J: Gly417Arg ( eleU< ∆∆ > = 14,61 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 0,58 kcal/mol).
As mutações que possuem ambos, eleU< ∆∆ > e LJU< ∆∆ > , desfavoráveis nas simulações com
Nilotinib e Cw livre são:
- Na região do P-loop: Leu267Arg ( eleU< ∆∆ > = 0,62 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 3,43 kcal/mol),
- Na β -5: Thr334Ser ( eleU< ∆∆ > = 0,75 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 2,77 kcal/mol),
- No contato-SH2: Met370Ile ( eleU< ∆∆ > = 0,29 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 0,53 kcal/mol),
- Na hélice-J: Gly417Arg ( eleU< ∆∆ > = 1,09 kcal/mol e LJU< ∆∆ > = 1,49 kcal/mol).
62
4.5 Comportamento de Cw na proteína c-ABL selvagem e nos 12 mutantes complexados ao
Imatinib ou Nilotinib em simulações com Cw livre.
Para avaliar a relevância da molécula de água Cw na interação dos ligantes Imatinib (Figura 4.4
a) e Nilotinib (Figura 4.4 b) com a proteína c-ABL calculamos os valores da distância entre Cw e o
átomo de oxigênio do Asp400 e o átomo de nitrogênio da Lys290, tomando simultaneamente como
referência o átomo de carbono do Glu305. Consideramos a permanência de Cw mantendo a rede de
ligações de hidrogênio no sítio ativo da proteína c-ABL para distâncias até 3,5 Å de Cw ao oxigênio de
Asp400 e ao nitrogênio de Lys290. Para cada um dos 4000 frames (1000 ps), identificamos, através do
seu número de ordem, a molécula de água que substitui a molécula cristalográfica Cw.
a) b)
Figura 4.4: Interações entre Cw e os resíduos Lys290, Glu305 e motivo DFG (Asp400). a) Proteína c-
ABL complexada com Imatinib obtida do PDB 1OPJ. b) Proteína c-ABL e Cw foram obtidos por
homologia da estrutura PDB 1OPJ. O Nilotinib foi obtido da estrutura PDB 3CS9.
63
Em simulações com o Imatinib e a proteína selvagem, Cw permaneceu na sua posição inicial ao
longo dos 1000 ps (Figura 4.5 a). Este fato não foi observado em simulações com as proteínas mutantes
(vide Apêndice F), nas que houve substituição por outra molécula de água (por exemplo, Thr334Ile,
Figura 4.5 b), exceto para o mutante Tyr272Hix (não houve permanência de uma ligação de hidrogênio
com outra molécula de água) e o mutante Leu267Arg (em que envidenciamos a formação de uma
ligação de hidrogênio com apenas uma molécula de água, porém por um período muito curto de
permanência no sítio (Figura 4.5 c). Pela visualização da trajetória dos átomos pelo programa VMD
(Visual Molecular Dynamics), durante os 1000 ps das simulações com o Nilotinib, foi possível observar
que Cw permaneceu na sua posição inicial tanto com a proteína selvagem como com as mutantes,
exceto para Met263Val, Tyr272Hip, Tyr272Hix, Met370Thr e Gly417Arg.
Figura 4.5: Troca de Cw (Molécula de HOH 278) por outra molécula de água para as proteínas
Selvagem, Thr334Ile e Leu267Arg, complexadas com Imatinib.
64
Para verificarmos as características físico-químicas do resíduo mutado no cálculo da energia
livre de ligação, apresentamos na Tabela 4.6 o índice de hidropatia dos aminoácidos na proteína
selvagem e os respectivos mutantes. Pode-se observar que a maior diferença entre os índices de
hidropatia é observada no mutante Leu267Arg.
Tabela 4.6: Comparação da distância (Å) entre o centro da esfera e o C do respectivo mutante com o
índice de hidropatia.
Mutante Hidropatia*
selvagem/mutante
Diferença
Hidropatia antes e depois
(em módulo)
Met263Val + 1,9 / + 4,2 2,3
Met263Ile + 1,9 / + 4,5 2,6
Leu267Arg † + 3,8 / - 4,5 † 8,3
Gln271His - 3,5 / - 3,2 0,3
Tyr272His - 1,3 / - 3,2 1,9
Glu274Lys - 3,5 / - 3,9 0,4
Thr334Ile † - 0,7 / + 4,5 † 5,2
Thr334Ser - 0,7 / - 0,8 0,1
Met370Thr † + 1,9 / - 0,7 † 2,6
Met370Ile + 1,9 / + 4,5 2,6
Leu403Met + 3,8 / +1,9 1,9
Gly417Arg - 0,4 / - 4,5 4,1
* Hidropatia = escala que combina hidrofobicidade e hidrofilicidade dos resíduos. Pode ser usada para
medir a tendência de um aminoácido ser solvatado pela água. Valores positivos (aminoácidos
hidrofóbicos), valores negativos (aminoácidos hidrofílicos). Fonte: Kyte e Doolittle (1982).
† Troca do sinal da hidropatia
65
4.5.1 Raiz do desvio quadrático médio dos resíduos das proteínas c-ABL selvagem e mutantes
Foram obtidos os valores de RMSD dos resíduos de aminoácidos localizados a 4 Å do Imatinib
para analisar a flutuação dos mesmos ao longo da simulação nas proteínas selvagem e mutantes.
Também foram obtidos os valores de RMSD dos resíduos do motivo DFG (Asp400, Phe401 e Gly402)
e P-loop, devido à proximidade destas regiões com o fármaco e o seu efeito na resistência observado
em diversas mutações no P-loop. Foi utilizada a estrutura cristalográfica inicial para comparação das
mudanças conformacionais.
No Apêndice D se apresentam os resultados de RMSD obtidos pelo programa Q durante os
1000 ps de simulação por DM. Definimos o Imatinib como subconjunto 1 e os átomos da proteína que
estão ao redor de 4 Å do Imatinib como subconjunto 2. Uma vez definidas as relações átomo-a-átomo
entre todas as estruturas, fez-se o alinhamento estrutural que é baseado na comparação das
conformações tridimensionais.
A qualidade de uma conformação tridimensional é determinada pelas ligações entre os átomos,
ângulos formados, ligações peptídicas, planaridade dos anéis e ângulos de torção nas cadeias principal
e lateral (Ramachandran et al, 2001). Por ser baseado em uma estrutura tridimensional resolvida, o
valor de RMSD obtido pela sobreposição da estrutura molde inicial e das conformações obtidas pela
simulação de dinâmica molecular deve estar entre 1 Å e 2 Å, para ser considerado de boa qualidade.
O valor de RMSD está relacionado à divergência de uma estrutura em relação à outra e sendo
assim, tomamos como critério uma mudança conformacional significativa a partir da conformação
inicial quando o RMSD for maior que 2,5 Å. Analisamos as modificações conformacionais por sete
grupos de proteínas mutantes com características em comum:
- Thr334Ser e Thr334Ile
- Met263Ile e Met263Val
- Met370Thr e Met370Ile
- Tyr272His, Tyr272Hix e Tyr272Hip (P-loop)
- Glu274Lys, Gln271His e Leu267Arg (P-loop)
- Leu403Met
- Gly417Arg
O P-loop e o A-loop foram as regiões a 4 Å do Imatinib que possuíram as maiores modificações
nas proteínas mutantes em comparação com a selvagem. Os resíduos Gly268, Gly269, Gly270 (P-loop)
66
resultaram em valores de RMSD maiores que 2,5 Å para todas as 12 mutações analisadas tanto para a
proteína selvagem quanto para as mutantes. Ao contrário, o resíduo Gly402 presente no A-loop, não
apresentou RMSD maior que 2,5 Å tanto para a proteína selvagem como para as proteínas mutantes
Thr334Ile, Thr334Ser, Met263Ile, Leu267Arg, Tyr272His, Tyr272Hix, Met370Ile, Met370Thr e
Gly417Arg.
Nos resíduos Gln271 e Tyr272 (P-loop) obtivemos valores de RMSD maiores que 2,5 Å para a
proteína selvagem em comparação a todas as mutações, exceto para os três estados de protonação da
histidina no aminoácido Tyr272. Para os resíduos do P-loop, Gly273 e Glu274, obtivemos valores
maiores que 2,5 Å para as proteínas mutantes Thr334Ile, Tyr272Hix, Glu274Lys, Leu403Met e
Met370Thr.
Na região do A-loop obtivemos valores de RMSD maiores que 2,5 Å para o resíduo Phe401
para as proteínas mutantes Met263Val, Tyr272Hip, Gln271His, Leu403Met e Met370Ile em
comparação com a selvagem. Para o resíduo Gly402, valores de RMSD maiores que 2,5 Å foram
encontrados nas proteínas mutantes Met263Val, Tyr272Hip, Gln271His, Leu403Met.
No resíduo Asp400 houve mudança significativa apenas para a proteína que contém a mutação
Tyr272Hip.
4.6 Efeito alostérico das mutações pontuais
As modificações conformacionais das proteínas devido a modificações não covalentes são
chamadas de alostéricas. As mutações na proteína c-ABL funcionam como moduladores alostéricos que
podem atuar como inibidores da reação enzimática, diminuindo a afinidade do fármaco (Imatinib ou
Nilotinib) no sítio ativo. Verificamos o efeito das 12 mutações pontuais, assim como os outros dois
estados de protonação da mutação no aminoácido Tyr272, na afinidade de ligação do Imatinib ao sítio
ativo da proteína.
Com o objetivo de se ter uma melhor visualização de quais regiões contribuem com as
mudanças no RMSD, analisamos na Figura 4.6 e no Apêndice E, o RMSD-3D em RGB (red, green,
blue) para cada sistema utilizando o programa MOLMOL (Koradi, et al., 1996) com um macro para o
fator de temperatura B (Cruickshank, 1999). Os resultados da flutuação de todos os resíduos da
proteína c-ABL foram obtidos dos últimos 250 ps de simulação por DM. O local das mutações está
indicado pelas setas sendo que a maior espessura indica a maior movimentação dos resíduos. Um fator
de temperatura baixo (cor azul) indica pouco movimento.
Destacamos a proteína Selvagem (Figura 4.6 a), e as mutações Leu247Arg (Figura 4.6 b) e
67
Tyr272Hix (Figura 4.6 c) complexadas com Imatinib para serem analisadas na discussão. Na primeira,
a molécula Cw foi substituída logo no início da simulação por outra molécula que não permaneceu até
o fim da mesma (Figura 4.5 b). Na segunda não foi observada a permanência de Cw no início da
simulação ou a substituição desta por qualquer outra molecula de água (Figura 4.5 c).
a)
c)
b) c)
Figura 4.6: Flutuação dos últimos 250 ps da proteína (a) Selvagem, (b) Leu247Arg e (c) Tyr272Hix
complexada com Imatinib.
Tyr272HixTyr272Hix
Leu247ArgLeu247Arg
68
4.7 Interações específicas entre os ligantes Imatinib e Nilotinib e a proteína c-ABL.
Neste trabalho foi monitorada a permanência das interações entre os átomos da proteína c-ABL
e dos fármacos Imatinib e Nilotinib. Observamos a partir da estrutura cristalográfica da proteína
selvagem (Figura 1.8 e 1.9), as interações específicas por ligações de hidrogênio. Ao longo da
dinâmica, foram calculadas as distâncias entre aminoácidos específicos e átomos dos fármacos que
intervêm nessas ligações: Asp400 e O29 (do Imatinib e Nilotinib; Figura G.6), Met337 e N3 (do
Imatinib e Nilotinib; Figura G.7), Thr334 e N13 (do Imatinib e Nilotinib; Figura G.8) e Glu305 e N21
(do Imatinib e Nilotinib; Figura G.9). As interações por ligação de hidrogênio perdidas, com distâncias
maiores que 3,5 Å, estão listadas abaixo:
• Asp400 --- O29: Tyr272His (distância ≈ 4,5 Å para ambos os fármacos).
• Thr334 --- N13: Tyr272His (distância ≈ 4,5 Å para Nilotinib e ≈ 3,5 Å para Imatinib),
Tyr272Hix (distância ≈ 4,0 Å para ambos os fármacos), Gln271His (distância ≈ 3,5 Å
para Nilotinib e ≈ 5,0 Å para Imatinib), e Met370Thr (distância ≈ 4,0 Å para ambos os
fármacos).
• Glu305 --- N21: diferença no padrão entre os fármacos Imatinib e Nilotinib – distância ≈
5,0 Å para ambos os fármacos nas simulações com a proteína selvagem; Met263Val e
Thr334Ile (distância ≈ 5,5 Å para Nilotinib e ≈ 3,5 Å para Imatinib); Met263Ile e
Gly417Arg (distância ≈ 5,5 Å para ambos os fármacos); Leu267Arg e Thr334Ser
(distância ≈ 3,5 Å para ambos os fármacos); Gln271His, Glu274Lys, Met370Ile,
Leu403Met e Tyr72His (distância ≈ 5,5 Å para Nilotinib e ≈ 3,0 Å para Imatinib);
Tyr272Hix, Tyr272Hip e Met370Thr (distância ≈ 5,0 Å para ambos os fármacos);
69
Capítulo 5
Discussão
As proteínas experienciam movimentos devido à energia do sistema em uma dada temperatura
(Pickover, 1984). O domínio quinase também possui tais movimentos que levam a mudanças nos
estados da proteína: ativo ou inativo. Nossos resultados sugerem que os mutantes da proteína c-ABL
quando ligados ao Imatinib e Nilotinib precisam de mobilidade na sua estrutura para acomodação dos
resíduos mutantes, além disso, percebemos que a mutação dificulta a permanência do fármaco no sítio
ativo e que a imposição de restrição na posição inicial de Cw tem grande influência para a
incompatibilidade no cálculo das energias livres relativas (Figura 4.2 a). Portanto, o modelo sem
restrição da posição inicial de Cw é o mais adequado para predição dos valores de energia livre.
Outra questão que merece ser ressaltada é a transferabilidade dos parâmetros do método de LIE
calculados. Foram obtidos resultados satisfatórios para simular o comportamento de ambos os ligantes
(Imatinib e Nilotinib) no sítio ativo da proteína com os mesmos coeficientes de LIE obtidos na
simulação com Imatinib e Cw livre. A parametrização também pode ser validada pelo fato de que todos
os valores de energia livre absoluta ( )calc selvG∆ ou ( )calc mutG∆ foram negativos, além de prever
computacionalmente a maior eficácia do Nilotinib quando comparado ao Imatinib (Figura 4.2 c).
Para facilitar a comparação dos resultados aqui apresentados com estudos de dinâmica
molecular da proteína c-ABL realizados por Pricl et al. (2005) e Lee et al. (2008) assim como delimitar
a abrangência dos resultados obtidos, são apresentados na Tabela 5.1 os detalhes sobre as semelhanças
e diferenças metodológicas em cada estudo.
70
Tabela 5.1: Comparação da metodologia dos trabalhos de Pricl et al. 2005 e Lee et al. 2008 com o
trabalho desenvolvido nessa dissertação
Pricl et al. 2005 Lee et al. 2008 Trabalho desenvolvido
nessa dissertação
Cristal e
resolução
1IEP e 2,10 Å
1IEP e 2,10 Å
1OPJ e 1,75 Å
Águas
cristalográfic
as
178 águas foram
mantidas
todas as moléculas de água do
cristal foram removidas e em
seguida foi adicionado o solvente
ao sistema
Cw (Figura 4.4 a) foi
mantida fixa em uma
simulação e livre em outra.
Diferenças entre as duas
simulações foram observadas
Adição dos
hidrogênios
ao cristal de
c-ABL
módulo parse do
AMBER 7 e refinado
por 200 passos do
algoritmo steepest
descent no vácuo
Não cita o método, apenas
comenta que os hidrogênios
foram adicionados.
Pacote Q (versão 5.0
Janeiro/2004)
Campo de
força
parm94, módulo
sander do AMBER 7
campo de força CHARMM27 do
pacote NAMD (v. 2.6)
GROMOS96
Parâmetros
de campo de
força
faltantes
transferidos dos
parâmetros de campo
de força parm99 e de
outros parâmetros
gerais do AMBER 7
transferidos de tipos de átomos
similares
Os parâmetros dos ligantes
foram agregados
manualmente no arquivo de
parâmetros correpondentes
ao campo de força escolhido
(Qgrm96.prm).
Obtenção
das cargas
dos
inibidores
parm94, módulo
sander do AMBER 7 e
de cálculos ab initio:
RHF (Restricted
cálculos ab initio: RESP
(Restrained Eletrostatic Charge-
Fitting Procedure) e otimizado
por RHF (Restricted Hartree-
MMFF94 do programa
Sybyl 7.3 (Tripos
International, 1699 South
Hanley Rd., St. Louis,
71
Hartree-Fock)/6-31++
single-point, seguido de
RESP (Restrained
Eletrostatic Charge-
Fitting Procedure).
Fock)/6-31++ pelo pacote
Gaussian03.
Missouri, 63144, USA) e
incorporadas ao arquivo de
biblioteca do respectivo
ligante (STI.lib e NIL.lib)
Tratamento
das cargas
dos resíduos
ionizáveis
em pH=7,0
(ASP, GLU,
LYS, ARG)
ASP = (-1)
GLU = (-1)
LYS = (+1)
ARG = (+1)
ASP = (-1)
GLU = (-1)
LYS = (+1)
ARG = (+1)
ASP = (-1)
GLU = (-1)
LYS = (+1)
ARG = (+1)
Tratamento
das cargas
dos resíduos
de HIS
Neutra para todas
histidinas.
Neutra para todas histidinas.
Porém, para as histidinas
mutantes:
Hp = HIS protonada em ND1 e
NE2, (+1)
H = HIS protonada em ND1, (0)
Neutra para todas histidinas.
Porém, para as histidinas
mutantes:
His = protonado em ND1 ( 0
)
Hix = protonado em NE2 ( 0
)
Hip = protonado em ND1 e
NE2 (+1)
Mutantes c-
ABL
estudados e
suas
respectivas
regiões
1) Thr334Ile ( β 5) 1) Met263Val ( β 1)
2) Leu267Val (P-loop)
3) Gly269Glu (P-loop)
4) Gln271His/Hip (P-loop)
5) Tyr272Phe (P-loop)
6) Tyr272His/Hip (P-loop)
7) Glu274Lys (P-loop)
8) Glu274Val (P-loop)
9) Thr334Ile ( β 5)
1) Met263Val ( β 1)
2) Met263Ile ( β 1)
3) Leu267Arg (P-loop)
4) Gln271His (P-loop)
5) Tyr272His/Hix/Hip (P-
loop)
6) Glu274Lys (P-loop)
7) Thr334Ile ( β 5)
8)Thr334Ser ( β 5)
9) Met370Thr (contato SH2)
72
10) Met370Ile (contato SH2)
11) Leu403Met (A-loop)
12) Gly417Arg (Hélice-J)
Como foi
realizada a
mutação
Módulo Biopolymer do
Insight II (v. 2001,
Accerlys, Inc., San
Diego, CA)
1 - os rotâmeros foram
submetidos à
minimização pelo
algoritmo steepest
descent em 100 passos
utilizando o módulo
sander do AMBER 7 e
em seguida realizou-se
a minimização por
conjugate gradient.
2 - o resíduo mutante
foi minimizado por no
máximo 500 passos,
onde o resto do sistema
foi mantido fixo.
3 - somente os átomos
de hidrogênio foram
minimizados por no
máximo 500 passos
4 - todos átomos foram
minimizados por 1000
passos.
5 - obteve-se 6
rotâmeros com
diferentes energias na
As mutações foram realizadas
utilizando o pacote VMD baseado
no sistema água/íons em
equilíbrio. Um ou dois
cátions/ânions foram removidos
para permitir que os mutantes
com carga fossem neutralizados,
seguido de 1 ns de equilibração
para água/íons. Então, a força foi
reduzida a 3 kcal/(molÅ2) durante
um período de 500 ps seguido por
2000 passos de minimização de
energia para todos os átomos.
Depois foi realizado um período
(300 ps) de aquecimento de 0 K a
300 K (1 K por ps).
SPDB-viewer
73
faixa de 0,28 a 0,82
kcal/mol.
7 - o rotâmero com a
menor energia final foi
selecionado para
realização da DM.
Metodologia
para cálculo
da energia
livre
PBSA
(Poisson-Boltzmann
Surface Area)
bind MM solvG E G T S∆∆ = ∆ + ∆ − ∆
onde
solv PB NPG G G∆ = ∆ + ∆
e
MM EL vdwE E E∆ = ∆ + ∆
ELE∆ é a contribuição
eletrostática, vdwE∆ é a
contribuição de vdW,
PBG∆ é a contribuição
polar da solvatação,
NPG∆ é a contribuição
não polar da
solvatação.
Os termos foram
calculados pelos
módulos carnal e anal
PBSA
(Poisson-Boltzmann Surface
Area)
binding eletrostatic vdw PB NonPolarG E E G G∆∆ = ∆ + ∆ + ∆∆ + ∆∆
eletrostaticE∆ é a contribuição
eletrostática, vdwE∆ é a contribuição
de vdW, PBG∆∆ é a contribuição
polar da solvatação, NonPolarG∆∆ é a
contribuição não polar da
solvatação.
Os termos foram calculados pelo
módulo PBEQ do pacote
CHARMM (v. 32b1)
LIE
(Linear Interaction Energy)
l s l sLJ el
calcG U Uα β γ− −∆ = ∆ < > + ∆ < > +
74
do AMBER 7.
Modelo de
água
TIP3P em esfera
de raio = 75 Å
TIP3P em caixa cúbica
60 X 80 X 60 Å3
SPC (Simple Point Charge)
em esfera
de raio = 20 Å
Moléculas de água
localizadas além da esfera de
18,5 Å com potencial
harmônico de constante k =
200 kcal/(molÅ2) nos seus
átomos.
Quantidade
de átomos
Não cita.
c-ABL = 4441
Imatinib = 63
água = 31,673
Na+ = 18
Cl- = 9
Total = 36,204 átomos
c-ABL + água + ligante
(Imatinib ou Nilotinib)
composto por
aproximadamente 2280
átomos no total
Ensemble NVT (isotérmica-
isocórica)
NPT (isotérmica-isobárica) NVT (isotérmica-isocórica)
Temperatura 300K (algoritmo de
Berendsen)
298 K
1 atm
300 K
Raio de corte
para
interações
entre átomos
não ligados
raio de corte duplo (12
e 30Å), atualizadas a
cada 20 time steps
rtotal = 12 Å
rvdw = 10 Å
Aproximação eletrostática:
PME (Particle Mesh Ewald)
sem raio de corte
Tempo de
integração
(time step)
2 fs não comenta 1 fs
Algoritmo SHAKE SHAKE SHAKE
75
aplicado no
enlace
químico
Equilibração 1- proteína foi relaxada
em ambiente aquoso
(esfera de 75 Å )
2- o sistema foi
minimizado pelo
gradual decrescimento
da restrição na posição
dos átomos
3- no final do processo
de relaxamento, todas
moléculas de água
depois da primeira
camada de hidratação
(distâncias > 3,5 Å)
foram removidas
4- para atingir a
neutralidade, contra-
íons foram adicionados
conforme determinação
do módulo cion do
AMBER 7
5- todos resíduos da
proteína com átomos
próximos a 30 Å do
centro de massa do
mutante, foram
mantidos flexíveis
durante a DM.
6- uma camada esférica
1- todos átomos da proteína
foram mantidos por uma força
constante de 50 kcal/(molÅ2)
2- as moléculas de água e os íons
foram energeticamente
otimizados e submetidos ao
esquema seguinte (simulated
annealing):
- a temperatura aumentou de 0 K
a 600 K (1 K por ps)
- mantida a 600 K por 500 ps
- a temperatura diminuiu de 600
K a 300 K a -1 K por ps
- mantida a 300 K por 500 ps
- mantido a 300 K por 4000 ps
O mesmo procedimento foi
repetido novamente e resultando
numa simulação de equilibração
de 10 ns para as moléculas de
água e íons.
De 1 a 300 K utilizando uma
equilibração controlada
(Apêndice C).
Não houve adição de íons.
76
de raio igual a 30 Å foi
centralizada no
Imatinib, incluindo as
águas da primeira
camada de hidratação
da etapa anterior e
submetida a 1500
passos de minimização
(mantendo rígidas a
proteína, o inibidor e as
águas pré-existentes)
7- Equilibração de 20
ps da esfera de água
(com soluto fixo)
8- Interações
desfavoráveis foram
progressivamente
diminuídas de 25 a 0
kcal/(molÅ2) por 4000
passos.
9- O sistema foi
gradualmente aquecido
a 27°C em 2 intervalos:
I) 5 ps a 100°C, II) 50
ps a 27°C
Coleta de
dados
No total 400 snapshots
foram salvos,
freqüência de 1
snapshot por ps de DM
(400 ps de coleta de
O sistema de água/íons
equilibrado foi utilizado como
ponto de partida para os 20 ns de
simulação, sem restrição alguma
na posição de todos os átomos.
1 fs em 50000 passos, de
modo a obter um total de 20
arquivos de trajetória com 50
ps de simulação cada
(totalizando 1000 ps)
77
dados) Os últimos 15 ns foram coletados
para análise.
O trabalho de Pricl et al. (2005) utilizando DM no sistema c-ABL/Imatinb indicou, pela
primeira vez, que a suposta ausência da ligação de hidrogênio do resíduo mutado Thr334Ile e o
Imatinib, não é a única explicação para a falha da inibição da proteína c-ABL pelo fármaco, sendo
também causada por mudanças desfavoravelmente drásticas na estrutura da proteína c-ABL mutante
(Thr334Ile), o que foi evidenciado pela análise das trajetórias das simulações de DM. Os valores de
energia livre absoluta calculados por Pricl et al. (2005) para Thr334Ile, foram próximos aos valores
experimentais obtidos por Corbin et al. (2001), entre parênteses: ( )calc selG∆ = - 10,39 kcal/mol (-10,37
kcal/mol) e ( 334 )calc Thr IleG∆ = -6,55 kcal/mol (< -7,23 kcal/mol).
Mais recentemente, Lee et al. (2008), realizaram a primeira simulação por DM em larga escala
do sistema c-ABL/Imatinib, não só para a proteínas selvagem e a proteína mutante Thr334Ile, como
haviam feito Pricl et al. (2005), mas também para outras 10 proteínas mutantes na região P-loop
(Glu274Lys, Glu274Val, Gly269Glu, Leu267Val, Met263Val, Gln271His, Gln271Hip, Tyr272Phe,
Tyr272His/Hip). Para Lee et al. (2008) e Azam et al. (2003) a localização da mutação Met263Val é no
P-loop, porém essa informação não é observada em fonte cristalográfica (Cowan-Jacob et al., 2007)
onde a localização dessa mutação se encontra na região β 1.
Esses autores mostraram que o efeito de diminuição da afinidade do Imatinib pela mutação
Thr334Ile ocorre principalmente devido à mudança conformacional da hélice α -C da proteína c-ABL.
Os valores de ( / )calc mut selG∆∆ obtidos por Lee et al. (2008) concordam qualitativamente com os dados
experimentais de seis fontes diferentes (Shah et al., 2002; Bradeen, et al. 2006; Azam et al., 2003;
Corbin et al., 2003; Corbin et al., 2002; e Roumiantsev et al., 2002). Lee et al. (2008) obtiveram
valores de energia livre relativa com valores de desvio padrão muito elevados tanto para mutações
associadas à maior (Thr334Ile) ou menor (Gln271His) resistência ao Imatinib: ( 334 )calc Thr IleG∆∆ = 6,84
kcal/mol (σ = 22 kcal/mol), Gln271His: ( ln 271 )calc G HisG∆∆ = 1,47 kcal/mol (σ = 18 kcal/mol).
Os autores justificam os valores elevados do desvio padrão a diversos fatores como, por
exemplo, não ter considerado o equilíbrio entre as conformações ativa e inativa de cada mutante. As
simulações realizadas apenas na conformação inativa (realizada pelos autores e nessa dissertação)
podem não estar de acordo com a real mudança de afinidade, e as simulações iniciadas com outras
78
conformações possíveis (ativa em vez da inativa) podem levar à melhor compreensão do sistema.
Em Pricl et al. (2005) e Lee et al. (2008), os valores de energia livre absoluta e relativa foram
obtidos pelo método MM/PBSA (Molecular Mechanism Poisson-Boltzmann Surface Area). O
procedimento envolve o uso do modelo de solvente contínuo, também chamado de solvente implícito
(representação do solvente como um meio contínuo). O potencial da força média para um sistema
macromolecular é designado como a soma dos termos das energias intermoleculares ( MME∆ ) e o termo
da energia livre de solvatação é subdividido em uma parte polar ( PBG∆ ) e apolar ( NPG∆ ), onde:
- PBG∆ (termo eletrostático), corresponde ao trabalho realizado para polarização do solvente e equivale
à transferência da proteína de um meio com constante dielétrica igual ao interior da proteína para outro
meio com constante dielétrica igual ao exterior da proteína.
- NPG∆ (termo hidrofóbico) representa a transferência de uma macromolécula apolar do tamanho da
proteína de um meio homogêneo (idealmente o vácuo) para outro meio constituído por solvente iônico.
Já o método empregado nessa dissertação (método LIE, Åqvist et al., 1994) possui
características como menor tempo de simulação, utilização do solvente explícito e a aproximação da
energia livre de Gibbs por uma combinação linear das diferenças entre os termos de energia de
interação eletrostática e de Lennard-Jones, nos estados ligado e livre. Os resultados de energia livre
absoluta e relativa relatados aqui apresentaram valores de desvio padrão menores que os relatados por
Lee et al. (2008). Nessa dissertação foram obtidos resultados com boa precisão (pouca variação em
torno de um valor médio), porém com pouca acurácia. Como, por exemplo, os obtidos nas simulações
com Cw livre: ( 334 )calc Thr IleG∆∆ = 0,14 kcal/mol (σ = 0,13 kcal/mol) e ( ln 271 )calc G HisG∆∆ = 0,24 kcal/mol
(σ = 0,15 kcal/mol).
Os dados obtidos a partir das simulações discordam mais frequentemente dos dados
experimentais quando Cw é mantida fixa. Portanto, o modelo sem restrição da posição inicial de Cw é
o mais adequado para predição dos valores de energia livre. Os resultados utilizando os mesmos
coeficientes de LIE parametrizados para calcular a afinidade do Imatinib ao dominio da proteína c-
ABL, e utilizados nas simulações com o Nilotinib, estão de acordo com a menor afinidade do Imatinib
em relação ao Nilotinib, nas proteínas mutantes, devido aos menores valores de exp( / )mut selG∆∆ obtidos
para o último fármaco (Figura 4.2 b).
Foram observados valores de ( / )calc mut selG∆∆ negativos para determinadas proteínas mutantes
(Figura 4.2 b e Tabela 4.3) em simulações com Cw livre, indicando um erro na predição computacional
(valores de ( / )calc mut selG∆∆ negativos ) o que pode ser explicado pela utilização de apenas 12 mutantes.
79
Entretanto a parametrização pôde ser validada já que os valores de energia livre absoluta ( ( )calc selG∆ ou
( )calc mutG∆ ) foram negativos. (Figura 4.2c)
O tempo de permanência de Cw no sítio ativo não mostrou relação com a maior
( exp( 334 )Thr IleG∆∆ ≥ 2,09 kcal/mol) ou menor ( exp( l 417 )G y ArgG∆∆ = 0,36 kcal/mol) resistência ao Imatinib.
Porém, evidenciamos a sua permanência no sítio ativo do sistema c-ABL/Imatinib apenas para o
sistema c-ABL selvagem e não para os mutantes. Já para o sistema c-ABL/Nilotinib, evidenciamos a
presença de Cw no sítio tanto para a proteína selvagem como para a maioria dos mutantes. A
permanência de Cw nas simulações com o Nilotinib, tanto na proteína selvagem como nas mutantes
mostra uma forte evidência de que Cw medeia interações importantes entre a proteína c-ABL e os
fármacos.
5.1 Valores das energias (Eletrostática e Lennard Jones) nas simulações sem restrição de Cw pelo
método de LIE
As interações intermoleculares durante as simulações com Cw livre resultaram em valores de
energia eletrostática eleU< > e Lennard-Jones LJU< > , onde a diferença nos estados ligado e livre é
dada por U< ∆ > e a diferença nas simulações da proteína selvagem em relação à mutante é dada por
U< ∆∆ > .
A mutação Leu267Arg, desfavorável com relação a eleU< ∆∆ > e LJU< ∆∆ > tanto na
simulação com Imatinib quanto com Nilotinib e Cw livre, possui o terceiro maior valor em modulo de
DG∆∆ ( ( / ) exp( / )D calc mut sel mut selG G G∆∆ = ∆∆ −∆∆ ) da diferença entre energia livre relativa calculada e
energia livre relativa experimental (Figura 4.3). A diferença entre as energias livres relativas da
proteína mutante Leu267Arg calculada comparada à experimental é 1,92 kcal/mol. A segunda maior
diferença foi observada para a mutação Thr334Ile (1,95 kcal/mol) e a primeira para Tyr272His (2,0
kcal/mol).
Vale ressaltar que para Leu267Arg e Thr334Ile, segundo Azam et al. (2003), o valor de IC50
para essas mutações pode ser > 20 µM, ou seja, o valor de energia livre relativa pode estar
superestimado com relação à afinidade, pois exp( / ) exp( ) exp( )mut selv mut selvG G G∆∆ = ∆ −∆ . A contribuição da
mutação Thr334Ile para resistência in vivo ainda é mantida em um nível de especulação na literatura.
Corbin et al, 2001 demonstraram que a mutação Thr334Ile não exibe inibição significativa a
concentrações 200 vezes (200-fold) maiores que o valor de IC50 da quinase selvagem e que a afinidade
80
pelo ATP aumentou 2 vezes (2-fold). Também se deve lembrar que diferentes estados de protonação do
mutante Tyr272His poderão levar a diferenças nos valores de energia livre.
5.2 Análise do mecanismo molecular de resistência
Sendo ambos os métodos LIE e MM-PBMA aproximados para a predição de energia livre de
outros mutantes além do Thr334Ile (realizado com acurácia por Pricl et al. 2005), os dados estruturais
tornam-se, portanto, o foco dessa discussão, com o propósito de obter informações sobre qual pode ser
o efeito das mutações pontuais. Entre essas, está a importância do solvente na interação entre a proteína
c-ABL e os inibidores (Imatinib e Nilotinib). Pela visualização das trajetórias das moléculas ao longo
das simulações, observamos a permanência constante das ligações de hidrogênio entre Cw e o oxigênio
da carbonila do resíduo Asp400 e o nitrogênio da Lys290 durante os 1000 ps de simulação com
Nilotinib em 9 mutantes (Met263Ile/Leu267Arg/Gln271His/Tyr272His/Glu274Lys/Thr334Ile/
Thr334Ser/Met370Ile/Leu403Met) em um total de 12, ao contrário do observado para o Imatinib e os
mesmos 12 mutantes (Apêndice G). Esse resultado evidencia que Cw é um marcador para o impacto
que as mutações causam na flexibilidade da quinase, sugerindo que elas ocasionam um rearranjo dos
átomos para acomodação dos resíduos mutantes.
Deve-se ressaltar que até o momento não há dados na literatura sobre o papel de Cw na rede de
ligações de hidrogênio encontrada para a afinidade entre a proteína c-ABL e Nilotinib, e aqui foi feita
uma análise da sua importância. Evidentemente (Figura 4.4 a) a Cw é trocada por outra molécula de
água qualquer do solvente durante as simulações de dinâmica com Imatinib. Percebe-se que a
modificação que levou ao desenvolvimento do Nilotinib (a partir da alteração do grupo exposto ao
solvente do Imatinib) foi suficiente para que a Cw permanecesse na sua posição inicial nas simulações
com este fármaco para a maioria dos mutantes. Como as simulações com os dois fármacos foram
realizadas na mesma escala de tempo (1000 ps) a comparação realizada é admissível.
A saída de Cw (não sendo trocada por outra molécula de água do solvente) apenas para o
mutante Leu267Arg (P-loop) poderia ser explicada pela grande mudança da característica físico-
química (diferença entre os índices de hidropatia de 8,3). A saída de Cw não foi observada para os
outros mutantes, o que estaria relacionado ao impacto do efeito alostérico que essas mutações
específicas (Leu267Arg e Tyr272Hix) provocam, aumentando a entropia da proteína a ponto de
expulsar Cw do sítio ativo. A Figura E.7 do Apêndice E mostra que a mutação Leu403Met provocou
aumento da mobilidade na extremidade N-terminal da quinase e a mutação Leu247Arg (Figura 4.6 b)
sofreu impacto na região do A-loop.
81
A partir da análise da Figura 4.6 a, observa-se que o efeito causado pelos mutantes Leu247Arg
(Figura 4.6 b) e Tyr272Hix (Figura 4.6 c) teve grande influência na região próxima ao Imatinib.
Especificamente para esses mutantes, verificamos a ausência de troca de Cw por outra molécula de
água. No Apêndice E se apresentam os resultados que as mutações pontuais provocaram em diversas
regiões da proteína, sendo que mesmo mutações distantes do ligante (Met263Ile, Met370Thr,
Met370Ile, Gly417Arg) provocaram aumento da flexibilidade no P-loop e A-loop, estruturas próximas
ao ligante. Com relação às mutações mais próximas ao Imatinib (Thr334Ile e Thr334Ser), verifica-se
que o efeito foi evidenciado no N-terminal, sendo que para o mutante Thr334Ser houve aumento na
mobilidade da hélice α -C.
Percebe-se (Figura 4.3) que não há relação entre o maior/menor valor para DG∆∆ e à
proximidade ou afastamento do resíduo mutante com respeito ao centro da esfera de simulação. A
molécula de água Cw é mantida na sua rede de ligações de hidrogênio durante a simulação com a
proteína c-ABL selvagem (Figura 4.5 a), porém é trocada por outra molécula de água tanto nas
simulações com os resíduos mutantes mais próximos do fármaco (exemplo: Thr334Ile/Ser) quanto com
os mais distantes (exemplo: Gly417Arg). Os cálculos dos valores de RMSD dos resíduos a 4 Å de
distância do Imatinib em relação às suas posições cristalográficas (Apêndice D) mostram que não há
relação entre a maior flexibilidade desses resíduos nas simulações com a proteína c-ABL mutante
quando compara-se com esses mesmos resíduos na proteína selvagem. Porém, observa-se que existe
um padrão de maior mobilidade para a região do P-loop e A-loop, tendo sempre a primeira maior
mobilidade que a segunda. Podemos sugerir que todas as mutações são caracterizadas por um
mecanismo indireto de resistência, ou seja, a proximidade da posição do resíduo mutado não está
relacionada à intensidade da resistência.
Os mutantes que tiveram o sinal da hidropatia invertido após a mutação são: Leu267Arg (+ 3,8 /
- 4,5), juntamente com os mutantes Thr334Ile (- 0,7 / + 4,5) e Met370Thr (+ 1,9 / - 0,7). Curiosamente,
o menor tempo de permanência de Cw na sua posição inicial foi durante a simulação
(proteína/Imatinib) do mutante Met370Thr, estando relacionada ao aumento da flexibilidade da hélice
α -C (Figura E.5 do Apêndice E). Para a mutação Thr334Ser, quando comparamos o índice de
hidropatia (Tabela 4.6) do resíduo selvagem Thr (- 0,7) com o mutado Ser (- 0,8) obtivemos o menor
valor da subtração em módulo (0,1). Essa pequena diferença na hidropatia pode ser uma explicação
baseada na estrutura química do resíduo mutado para a discrepância na predição (ou seja:
( / ) 0calc mut selG∆∆ < ), visto que os cálculos de energia livre relativa são realizados levando-se em conta a
82
subtração da média de todas as interações (Eletrostáticas e Lennard-Jones) do mutante em relação à
proteína selvagem.
Curiosamente o estado de protonação com carga positiva Tyr272Hip (Figura E.3 do Apêndice
E) teve menor impacto na flexibilidade da proteína quando comparado aos mutantes com carga neutra
Tyr272Hix e Tyr272His. Esse resultado sugere diferenças na desestabilização da afinidade de ligação
com relação aos diferentes estados de protonação do aminoácido Histidina 272. O mutante Tyr272His é
caracterizado pela alta frequência nos pacientes com resistência ao Imatinib (Tabela 1.2). Lee et al.
(2008) sugerem que a forma correta que leva à resistência ao Imatinib seria a Tyr272Hip (protonado em
ND1 e NE2, com carga positiva) e que o pka estimado da Histidina 272 seja 5,32 (de acordo com a
interface PROPKA 2.0 presente no site http://propka.ki.ku.dk e baseado nas conformações estruturais
de 20 ns de DM). Portanto, os resultados dessa dissertação não descartam a possibilidade de um
diferente estado de protonação para essa Histidina (Tyr272Hix), ao contrário do sugerido por Lee et
al.(2008).
5.3 Análise da permanência das ligações de hidrogênio dos fármacos (Imatinib e Nilotinib) com a
proteína c-ABL
As interações entre o átomo N21 do Imatinib e o oxigênio (OE2) do resíduo Glu305 da hélice
α -C (tracejado preto da Figura G.9) tanto para a proteína selvagem quanto para os mutantes, mostram
que são mais instáveis quando comparado com as interações do átomo N21 do Nilotinib (tracejado
vermelho da Figura G.9), como evidenciam a maior frequência de afastamento durante a simulação. A
perda específica dessa interação em todos os sistemas (selvagem e mutantes) pode favorecer a saída de
Cw e entrada de outras moléculas de água nessa região, fazendo com que a superfície acessível ao
solvente esteja relacionada ao impacto da mutação sobre a afinidade de ligação com ambos os
fármacos.
83
Capítulo 6
Conclusões e Perspectivas
- Verificamos que o método LIE (Linear Interaction Energy) foi eficiente para analisar o efeito
das mutações em várias regiões da proteína c-ABL utilizando um ligante (Imatinib ou Nilotinib) contra
vários mutantes, diferentemente do método original onde é utilizado apenas um receptor para vários
ligantes.
- Realizamos, pela primeira vez, um estudo sobre a importância de uma molécula de água
conservada (Cw) no sítio ativo da proteína c-ABL complexada ao Imatinib e Nilotinib através da
imposição (Cw fixa) ou não (Cw livre) de uma restrição na posição inicial de Cw. Os melhores
resultados ( ( / )calc mut selG∆∆ > 0) foram observados pelos valores de energia livre relativa ( ( / )calc mut selG∆∆ )
e absoluta ( ( )calc selG∆ e ( )calc mutG∆ ) utilizando as simulações com Cw livre. Os mesmos parâmetros
utilizados para calibração dos coeficientes de LIE nas simulações com o Imatinib foram utilizados com
o Nilotinib.
- Verificamos que mesmo nas mutações distantes do sítio de ligação, há um efeito alostérico que
aumenta a flexibilidade do P-loop e A-loop, interferindo na afinidade de ligação e, consequentemente,
no cálculo da energia livre de ligação.
- O comportamento de Cw ao longo do mesmo tempo de simulação em dinâmica molecular
com os fármacos Imatinib e Nilotinib demonstrou que interações importantes entre Cw, o fármaco e a
proteína c-ABL são mantidas durante as simulações com c-ABL/Nilotinib e perdidas com c-
ABL/Imatinib, sendo que a razão de troca de Cw por outra molécula do solvente, nas simulações com
as proteínas mutantes, não apresenta relação com a drasticidade da mutação. Porém, especificamente
para as mutações Leu267Arg, Leu403Met e Tyr272Hix verificamos a ausência de troca de Cw por
outra molécula de água qualquer. A protonação da Histidina no átomo NE2 (Hix) conferiu maior
mobilidade na região de ligação ao Imatinib quando se compara com a protonação em ND1 (His) ou
em ambos ND1 e NE2 (Hip).
- O resultado da perda, em uma região próxima à Cw, da interação do aminoácido Glu305 e os
fármacos (Imatinib ou Nilotinib) e a solvatação de outras moléculas de água nessa região (obtido pelo
monitoramento das ligações de hidrogênio entre os fármacos e a proteína c-ABL) demonstraram que
maiores oscilações da distância fármaco/proteína foram encontradas durante as simulações com o
84
Imatinib. Esse fato nos leva à hipótese de que diferenças na superfície acessível ao solvente no sítio
ativo da proteína c-ABL pode estar relacionada à maior afinidade do Nilotinib em relação ao Imatinib.
Perspectivas:
- Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros
domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3. Como perspectiva poderemos verificar a manutenção das
interações entre esses domínios e o domínio quinase, que mantêm o complexo inativo (situação
necessária para a ligação do Imatinib e Nilotinib). Também poderemos estudar o efeito das mutações na
proteína ativa (complexada com ATP e/ou Dasatinib) e comparar com os resultados desta dissertação,
feita com a proteína na conformação inativa. Atualmente, o que determina o sucesso de uma simulação
não é apenas o tempo de simulação (20ns, 30ns, etc.), visto que o poder computacional de
armazenamento de informações e velocidade dos cálculos é muito grande.
- A melhor compreensão possível do sistema biológico está relacionada ao tempo investido na
tentativa de elucidar o fenômeno (descrever, compreender e interpretar) com o auxílio da maior
quantidade de ferramentas possíveis, sejam elas computacionais ou experimentais. Tendo em vista o
tempo investido na compreensão do sistema biológico para chegar à abordagem realizada nessa
dissertação, como perspectiva há o intuito de estender o tempo de simulação nas futuras investigações
do mecanismo de resistência da proteína c-ABL.
85
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Apêndice A – Alinhamento entre as sequências das isoformas a e b da proteína c-ABL.
105
Apêndice B: Código das estruturas do domínio quinase da proteína c-ABL depositadas no PDB
(Protein Data Bank), nome dado pelo banco de dados, data do depósito, resolução (em Å) e a
respectiva referência. A proteína c-ABL complexada com os fármacos Imatinib, Nilotinib e Dasatinib
está presente, respectivamente, nas estruturas: 1IEP, 1OPJ, e 2HYY; 3CS9; e 2GQG. As outras
estruturas possuem outras moléculas complexadas, como o ATP e outros fármacos.
PDB Nome Data de depósito Resolução (Å) Referência
2GQG
X-ray Crystal Structure of
Dasatinib (BMS-354825)
Bound to Activated ABL
Kinase Domain
21-Nov-2006 2,40 Tokarski et al., 2006
2F4J Structure of the Kinase
Domain of an Imatinib-
Resistant Abl Mutant in
Complex with the Aurora
Kinase Inhibitor VX-680
24-Jan-2006 1,91 Young et al., 2006
1IEP Crystal structure of the C-
ABL kinase domain in
complex with STI-571.
18-Abr-2001 2,10 Nagar et al., 2002
1OPJ Structural basis for the
auto-inhibition of c-Abl
tyrosine kinase
08-Abr-2003 1,75 Nagar et al., 2003
1FPU Crystal structure of ABL
kinase domain in
complex with a small
molecule inhibitor
20-Set-2000 2,40 Schindler et al., 2000
1M52 Crystal Structure of the c-
Abl Kinase domain in
complex with PD173955
18-Set-2002 2,60 Nagar et al., 2002
106
2E2B Crystal structure of the c-
Abl kinase domain in
complex with INNO-406
22-Mai-2007 2,20 Horio et al., 2007
1OPK Structural basis for the
auto-inhibition of c-Abl
tyrosine kinase
08-Abr-2003 1,80 Nagar et al., 2003
2HIW Crystal Structure of
Inactive Conformation
Abl Kinase Catalytic
Domain Complexed with
Type II Inhibitor
22-Ago-2006 2,20 Okram et al., 2006
2HZN Abl kinase domain in
complex with NVP-
AFG210
16-Jan-2007 2,70 Cowan-Jacob et al., 2007
2Z60 Crystal Structure of the
Thr334Ile Mutant of Abl
kinase bound with PPY-A
18-Set-2007 1,95 Zhou et al., 2007
2HZ0 Abl kinase domain in
complex with NVP-
AEG082
16-Jan-2007 2,10 Cowan-Jacob et al., 2007
2HZ4 Abl kinase domain
unligated and in complex
with
tetrahydrostaurosporine
16-Jan-2007 2,80 Cowan-Jacob et al., 2007
2HZI Abl kinase domain in
complex with PD180970
16-Jan-2007 1,70 Cowan-Jacob et al., 2007
3CS9 Human ABL kinase in
complex with nilotinib
22-Abr-2008 2,21 Weisberg et al., 2005
2QOH Crystal Structure of Abl 18-Set-2007 1,95 Zhou et al., 2007
107
kinase bound with PPY-A
3DK3
3DK6
Crystal structure of
mutant ABL kinase
domain in complex with
small molecule fragment
29-Jul-2008 2,02 Bounaud (em publicação)
3DK7 Crystal structure of
mutant ABL kinase
domain in complex with
small molecule fragment
29-Jul-2008 2,01 Bounaud (em publicação)
2HYY Human Abl kinase
domain in complex with
imatinib (STI571, Glivec)
16-Jan-2007 2,40 Cowan-Jacob et al., 2007
108
Apêndice C - Parâmetros utilizados na simulação com Cw fixo. Imposição de força constante de 5
kcal/(molÅ2 ) no átomo pesado de Cw (oxigênio, átomo 2913 nesse caso).
Equilibração 1
[MD]
steps 1000
stepsize 0.2
temperature 1.0
bath_coupling 0.2
random_seed 8427
initial_temperature 1.0
lrf on
[intervals]
non_bond 25
output 10
[files]
topology complexo.top
final eq01.re
fep STI.fep
[sequence_restraints]
2860 2914 5.0 0
Equilibração 2
[MD]
steps 6000
stepsize 1.00
temperature 50.0
bath_coupling 1.0
random_seed 852
109
initial_temperature 50.0
lrf on
[intervals]
non_bond 25
output 10
[files]
topology complexo.top
final eq02.re
restart eq01.re
fep STI.fep
[sequence_restraints]
2860 2914 5.0 0
Equilibração 3
[MD]
steps 2000
stepsize 1.00
temperature 150.0
bath_coupling 5.0
random_seed 3556
initial_temperature 150.0
lrf on
[intervals]
non_bond 25
output 10
[files]
topology complexo.top
final eq03.re
restart eq02.re
fep STI.fep
[sequence_restraints]
2860 2914 5.0 0
110
Equilibração 4
[MD]
steps 7000
stepsize 1.50
temperature 300.0
bath_coupling 10
random_seed 835
initial_temperature 300.0
lrf on
[intervals]
non_bond 25
output 10
[files]
topology complexo.top
final eq04.re
restart eq03.re
fep STI.fep
[sequence_restraints]
2860 2914 5.0 0
Equilibração 5
[MD]
steps 7000
stepsize 1.50
temperature 300.0
bath_coupling 10
initial_temperature 300.0
lrf on
[intervals]
111
non_bond 25
output 10
[files]
topology complexo.top
final eq05.re
restart eq04.re
fep STI.fep
[sequence_restraints]
2912 2914 5.0 0
Equilibração 6
[MD]
steps 7000
stepsize 1.50
temperature 300.0
bath_coupling 10
initial_temperature 300.0
lrf on
[intervals]
non_bond 25
output 10
[files]
topology complexo.top
final eq06.re
restart eq05.re
fep STI.fep
[sequence_restraints]
2912 2914 5.0 0
112
Protocolo Dinâmica
[MD]
steps 50000
stepsize 1.00
temperature 300.0
bath_coupling 10
lrf on
[intervals]
non_bond 25
output 10
energy 250
trajectory 250
[trajectory_atoms]
not restrained
[files]
topology complexo.top
final md01.re
energy md01.en
restart eq06.re
fep STI.fep
trajectory md01.dcd
[sequence_restraints]
2912 2914 5.0 0
113
Apêndice D – Média do desvio quadrático médio (RMSD), das estruturas dos 4000 frames em relação
à estrutura cristalográfica inicial, dos resíduos a 4 Å de distância do Imatinib. As barras de erros (para
mais e para menos) são referentes ao desvio padrão dos 4000 valores de RMSD.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Lys266 (P-loop)
Leu267 (P-loop)
Gly268 (P-loop)
Gly269 (P-loop)
Gly270 (P-loop)
Gln271 (P-loop)
Tyr272 (P-loop)
Gly273 (P-loop)
Glu274 (P-loop)
Val275
Ala288
Lys290
Glu305
Val308
Met309
Ile312
Leu317
Val318
Ile332
Thr334
Glu335
Phe336
Met337
Ile379
His380
Leu389
Ala399 (A-loop)
Asp400 (A-loop)
Phe401 (A-loop)
Gly402 (A-loop)
Média do RMSD (Å)
Thr334Ser
Thr334Ile
Selvagem
114
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Lys266 (P-loop)
Leu267 (P-loop)
Gly268 (P-loop)
Gly269 (P-loop)
Gly270 (P-loop)
Gln271 (P-loop)
Tyr272 (P-loop)
Gly273 (P-loop)
Glu274 (P-loop)
Val275
Ala288
Lys290
Glu305
Val308
Met 309
Ile312
Leu317
Val318
Ile332
Thr334
Glu335
Phe336
Met 337
Ile379
His380
Leu389
Ala399 (A-loop)
Asp400 (A-loop)
Phe401 (A-loop)
Gly402 (A-loop)
Média do RMSD (Å)
Met263Ile
Met263Val
Selvagem
115
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Lys266 (P-loop)
Leu267 (P-loop)
Gly268 (P-loop)
Gly269 (P-loop)
Gly270 (P-loop)
Gln271 (P-loop)
Tyr272 (P-loop)
Gly273 (P-loop)
Glu274 (P-loop)
Val275
Ala288
Lys290
Glu305
Val308
Met309
Ile312
Leu317
Val318
Ile332
Thr334
Glu335
Phe336
Met337
Ile379
His380
Leu389
Ala399 (A-loop)
Asp400 (A-loop)
Phe401 (A-loop)
Gly402 (A-loop)
M éd ia do RM SD ( Å )
Glu274Lys
Gln271His
Leu267Arg
Selvagem
116
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Lys266 (P-loop)
Leu267 (P-loop)
Gly268 (P-loop)
Gly269 (P-loop)
Gly270 (P-loop)
Gln271 (P-loop)
Tyr272 (P-loop)
Gly273 (P-loop)
Glu274 (P-loop)
Val275
Ala288
Lys290
Glu305
Val308
Met309
Ile312
Leu317
Val318
Ile332
Thr334
Glu335
Phe336
Met337
Ile379
His380
Leu389
Ala399 (A-loop)
Asp400 (A-loop)
Phe401 (A-loop)
Gly402 (A-loop)
Média do RMSD (Å)
Tyr272Hip
Tyr272Hix
Tyr272His
Selvagem
117
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Lys266 (P-loop)
Leu267 (P-loop)
Gly268 (P-loop)
Gly269 (P-loop)
Gly270 (P-loop)
Gln271 (P-loop)
Tyr272 (P-loop)
Gly273 (P-loop)
Glu274 (P-loop)
Val275
Ala288
Lys290
Glu305
Val308
Met309
Ile312
Leu317
Val318
Ile332
Thr334
Glu335
Phe336
Met337
Ile379
His380
Leu389
Ala399 (A-loop)
Asp400 (A-loop)
Phe401 (A-loop)
Gly402 (A-loop)
M éd ia do RM SD ( Å )
Met370Ile
Met370Thr
Selvagem
118
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
Lys266 (P-loop)
Leu267 (P-loop)
Gly268 (P-loop)
Gly269 (P-loop)
Gly270 (P-loop)
Gln271 (P-loop)
Tyr272 (P-loop)
Gly273 (P-loop)
Glu274 (P-loop)
Val275
Ala288
Lys290
Glu305
Val308
Met309
Ile312
Leu317
Val318
Ile332
Thr334
Glu335
Phe336
Met337
Ile379
His380
Leu389
Ala399 (A-loop)
Asp400 (A-loop)
Phe401 (A-loop)
Gly402 (A-loop)
Média do RMSD (Å)
Leu403Met
Selvagem
119
Apêndice E – Flutuação dos últimos 250 ps de simulação em DM dos resíduos da proteína c-ABL (selvagem e mutantes) complexada com Imatinib. As setas indicam o local da mutação.
Figura E.1 Flutuação dos últimos 250 ps das proteínas Met263Val e Met263Ile complexadas com
Imatinib.
Met263ValMet263Val
Met263IleMet263Ile
120
Figura E.2 Flutuação dos últimos 250 ps das proteínas Gln271His e Glu274Lys (P-loop) complexadas
com Imatinib.
Gln271HisGln271His
Glu274LysGlu274Lys
121
Figura E.3 Flutuação dos últimos 250 ps das proteínas Tyr272His/Hip (P-loop) complexadas com
Imatinib.
Tyr272HisTyr272His
Tyr272HipTyr272Hip
122
Figura E.4 Flutuação dos últimos 250 ps da proteína Thr334Ser complexada com Imatinib.
Thr334SerThr334Ser
Th r334 IleT h r334 Ile
123
Figura E.5 Flutuação dos últimos 250 ps das proteínas Met370Thr e Met370Ile complexadas com
Imatinib.
Met370ThrMet370Thr
Met370IleMet370Ile
124
Figura E.6 Flutuação dos últimos 250 ps das proteína Gly417Arg complexada com Imatinib.
Gly417ArgGly417Arg
125
Figura E.7 Flutuação dos últimos 250 ps da proteína Leu403Met complexada com Imatinib.
Leu403MetLeu403Met
126
Apêndice F - Troca de Cw por outra molécula de água do solvente em função do tempo de simulação (1000 ps) com o Imatinib complexado nas proteínas Selvagem e 10 mutantes: Met263Val, Met263Ile, Gln271His, (Tyr272 nas protonações Tyr272His e Tyr272Hip), Glu274Lys, Thr334Ile, Thr334Ser,.Met370Thr, Met370Ile e Gly417Arg).
127
128
Apêndice G - Permanência das ligações de hidrogênio entre os fármacos Imatinib (linha preta) e
Nilotinib (linha vermelha) e a proteína c-ABL (selvagem e mutantes) durante os 1000 ps de DM.
Figura G.1: Interação entre Asp400 e O29 do Imatinib e Nilotinib.
129
130
131
Figura G.2: Interação entre Met337 e N3 do Imatinib e Nilotinib.
132
133
134
Figura G.3: Interação entre Thr334 e N13 do Imatinib e Nilotinib.
135
136
Figura G.4: Interação entre Glu305 e N21 do Imatinib e Nilotinib.
137
138
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