LAMA WAKTU LISIS DARI SEL PRIMER Spodoptera litura …
5
Berk. Penel. Hayati Edisi Khusus: 3D (73–77), 2009 LAMA WAKTU LISIS DARI SEL PRIMER Spodoptera litura YANG TERINFEKSI Spodoptera litura MULTIPLE NUCLEOPOLYHEDROSIS VIRUS (SpLtMNPV) DILIHAT DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI Mahanani Tri Asri* dan Nur Ducha Jurusan Biologi Fakultas FMIPA UNESA *Alamat koresponsdensi E-mail: [email protected] ABSTRACT Primary cell of Spodoptera litura larvae is one of cell resulted by in vitro multiplication. It was developed successfully and it can be used to multiply Spodoptera litura Nucleopolyhedrosis Virus (SpLtMNPV). So far, virus multiplication commonly is throughed in vivo using true host. �ut in vivo multiplication has some obstacles which host readiness in large quantity is very difficult to get. �esides that, virus multiplication through in vitro take a long time to lyses cell. It needs 3 days and for virus harvest through infected larvae need around 10 – 12 days. Therefore, it is developed insect cell culture in vitro to multiply virus at the present time. In this experiment it will be known how long lyses time duration in epithelia intestine primary cell of SpLtMNPV infection is. Infected virus in primary cell was taken pictures using transmission electron microscope in incubation time 2�, �8, and 72 hours. The result of photograph are Epithelia intestine primary cell of Spodoptera litura larvae lyses and release new virus for 2� hours. It shows that during 2� hours, the primary cell can produce 2,5 PIBs/cell. Key words: lyses time duration, primary cell, lyses time duration, primary cell, , primary cell, primary cell, Spodoptera litura Multiple Nucleopolyhedrosis virus (SpLtMNPV) PENGANTAR Salah satu insekta yang sering dianggap sebagai hama yang sangat merugikan adalah Spodoptera litura. Pada stadium larva/ulat dapat menyerang berbagai tanaman seperti kapas, tembakau, jarak, jagung, kedelai, dan kobis (Sudarmo, 1987) dengan tingkat kerusakan mencapai 50% (Naito, 1983). Hama ini dapat dikendalikan dengan agen biologis berupa virus. Virus yang sedang dikembangkan sebagai bioinsektisida adalah Spodoptera litura multipel nucleopolyhedrosis virus (SpltMNPV) in vivo, yang berdasar penelitian Asri (2005) efektif mengendalikan Spodoptera litura dengan mortalitas 80–90% pada konsentrasi 10 7 PIBs/ml di greenhouse dan di Laboratorium efektif pada konsentrasi 10 6 PIBs (Polyhedra inclution bodies)/ml /ml (Asri,2004). Perbanyakan agensia hayati virus tersebut secara konvensional dilakukan secara in vivo yaitu menggunakan inang hidup berupa ulat grayak/Spodoptera litura. Cara pembiakan virus seperti ini kurang efektif karena tergantung pada kelimpahan ulat di lapangan, atau tergantung pada musim terutama musim penghujan. Selain itu untuk memperbanyak inang di laboratorium membutuhkan persyaratan yang cukup rumit dengan tingkat kegagalan mencapai 70% dan membutuhkan waktu yang relatif lama yaitu 12 hari (Asri, 2004). Sesampai metode ini tidak efektif untuk skala besar seperti untuk perusahaan karena kontinuitas inang dari virus tidak terpenuhi. Untuk itu sekarang telah dikembangkan metode baru yaitu dengan mengkultur sel insekta terutama Spodoptera litura sebagai inang untuk virus. Kultur ini dapat digunakan untuk menghasilkan berbagai macam bioproduk seperti produksi bioinsektisida virus (baculovirus) dalam skala besar untuk pertanian dalam waktu yang relatif singkat. Oleh karena pembiakan SpLtMNPV secara in vivo mengalami banyak kendala maka dalam penelitian ini dikembangkan kultur sel insekta secara in vitro yang nantinya diharapkan dapat untuk memperbanyak virus dalam waktu yang relatif singkat. Kultur sel insekta telah berhasil dilakukan pada sel epitel usus larva Spodoptera litura instar 3,4, dan 5. Kultur tersebut diperoleh dari sel primer yang ditumbuhkan pada medium Grace's dengan penambahan fetal bovine serum. Sel primer ini juga dapat digunakan untuk memperbanyak SpLtMNPV (Asri, 2007), sesampai penelitian ini bertujuan mencari lama waktu lisis dari sel epitel usus larva yang diinfeksi dengan SpLtMNPV dilihat dengan menggunakan mikroskop elektron tranmisi. Penelitian ini dilakukan karena dengan pembiakan secara in vivo membutuhkan waktu yang lama untuk lisis. Sel yang terinfeksi membutuhkan waktu 72 jam (3 hari untuk dapat melisiskan sel-selnya yang terinfeksi), Falcon dalam Mangoendiharjo dan Pollet (1991). Sedangkan untuk
Transcript of LAMA WAKTU LISIS DARI SEL PRIMER Spodoptera litura …
Berk. Penel. Hayati Edisi Khusus: 3D (73–77), 2009
LAMA WAKTU LISIS DARI SEL PRIMER Spodoptera litura YANG TERINFEKSI Spodoptera litura MULTIPLE
NUCLEOPOLYHEDROSIS VIRUS (SpLtMNPV) DILIHAT DENGAN MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI
Mahanani Tri Asri* dan Nur DuchaJurusan Biologi Fakultas FMIPA UNESA
*Alamat koresponsdensi E-mail: [email protected]
ABSTRACT
Primary cell of Spodoptera litura larvae is one of cell resulted by in vitro multiplication. It was developed successfully and it can be used to multiply Spodoptera litura Nucleopolyhedrosis Virus (SpLtMNPV). So far, virus multiplication commonly is throughed in vivo using true host. �ut in vivo multiplication has some obstacles which host readiness in large quantity is very difficult to get. �esides that, virus multiplication through in vitro take a long time to lyses cell. It needs 3 days and for virus harvest through infected larvae need around 10 – 12 days. Therefore, it is developed insect cell culture in vitro to multiply virus at the present time. In this experiment it will be known how long lyses time duration in epithelia intestine primary cell of SpLtMNPV infection is. Infected virus in primary cell was taken pictures using transmission electron microscope in incubation time 2�, �8, and 72 hours. The result of photograph are Epithelia intestine primary cell of Spodoptera litura larvae lyses and release new virus for 2� hours. It shows that during 2� hours, the primary cell can produce 2,5 PIBs/cell.
Key words: lyses time duration, primary cell,lyses time duration, primary cell,, primary cell,primary cell,, Spodoptera litura Multiple Nucleopolyhedrosis virus (SpLtMNPV)
PENGANTAR
SalahsatuinsektayangseringdianggapsebagaihamayangsangatmerugikanadalahSpodoptera litura.Padastadiumlarva/ulatdapatmenyerangberbagaitanamansepertikapas,tembakau,jarak,jagung,kedelai,dankobis(Sudarmo,1987)dengantingkatkerusakanmencapai50%(Naito,1983).Hamainidapatdikendalikandenganagenbiologisberupavirus.VirusyangsedangdikembangkansebagaibioinsektisidaadalahSpodoptera litura multipel nucleopolyhedrosis virus(SpltMNPV)in vivo,yangberdasarpenelitianAsri(2005)efektifmengendalikanSpodoptera lituradenganmortalitas80–90%padakonsentrasi107PIBs/mldigreenhousedandiLaboratoriumefektifpadakonsentrasi106PIBs((Polyhedra inclution bodies)/ml/ml(Asri,2004).
Perbanyakanagensiahayativirus tersebutsecarakonvensionaldilakukansecarain vivoyaitumenggunakaninanghidupberupaulatgrayak/Spodoptera litura.Carapembiakanvirussepertiinikurangefektifkarenatergantungpadakelimpahanulatdilapangan,atautergantungpadamusim terutamamusimpenghujan.Selain ituuntukmemperbanyak inangdi laboratoriummembutuhkanpersyaratanyangcukuprumitdengantingkatkegagalanmencapai70%danmembutuhkanwaktuyangrelatiflamayaitu12hari(Asri,2004).Sesampaimetodeini tidak
efektifuntukskalabesarsepertiuntukperusahaankarenakontinuitasinangdarivirustidakterpenuhi.
UntukitusekarangtelahdikembangkanmetodebaruyaitudenganmengkulturselinsektaterutamaSpodoptera liturasebagaiinanguntukvirus.Kulturinidapatdigunakanuntukmenghasilkanberbagaimacambioproduksepertiproduksibioinsektisidavirus(baculovirus)dalamskalabesaruntukpertaniandalamwaktuyangrelatifsingkat.
OlehkarenapembiakanSpLtMNPVsecarain vivomengalamibanyakkendalamakadalampenelitianinidikembangkankultursel insektasecara in vitroyangnantinyadiharapkandapatuntukmemperbanyakvirusdalamwaktuyangrelatifsingkat.KulturselinsektatelahberhasildilakukanpadaselepitelususlarvaSpodoptera liturainstar3,4,dan5.KulturtersebutdiperolehdariselprimeryangditumbuhkanpadamediumGrace'sdenganpenambahanfetal bovineserum.SelprimerinijugadapatdigunakanuntukmemperbanyakSpLtMNPV(Asri,2007),sesampaipenelitianinibertujuanmencarilamawaktulisisdariselepitelususlarvayangdiinfeksidenganSpLtMNPVdilihatdenganmenggunakanmikroskopelektrontranmisi.Penelitianinidilakukankarenadenganpembiakansecarain vivo membutuhkanwaktuyanglamauntuklisis.Selyangterinfeksimembutuhkanwaktu72jam(3hariuntukdapatmelisiskansel-selnyayangterinfeksi),FalcondalamMangoendiharjodanPollet (1991).Sedangkanuntuk
LamaWaktuLisisdariSelPrimerSpodoptera litura7�
sampaipanenyangditunjukkandenganmatinyalarvaSpodoptera lituramembutuhkanwaktusekitar12hari.
BAHAN DAN CARA KERJA
Bahan
Bahan-bahanyangdiperlukanpadapenelitian iniadalahmediumGrace's,Fetal Bovineserum,Posphat Buffer saline, enzim tripsin, SpLtMNPV, larva Spodoptera litura,pakanbuatanuntuklarvaSpodoptera litura,Bayclin,Na2CO3Alkohol70%sebagaiagenpensteril,antibiotikpenisilin-treptomisin,gentamycinsulfatdanantifungiberupaAmfoterisin-B,akuades.
Alat
Alat–alatyangdigunakandalampenelitianinimeliputiperalatanutamayangterdiridari:inkubator,mikroskopinverted,mikroskopstereo,Laminar Air Flow(LAF),inkubator,sterilisatorkering(oven),sentrifuse,magnetikstirer,membran milliporedanperalatanpendukungterdiridari:cawanpetri,cawankultur,jarumpentul,stereofom,tabungsentrifuse,botolvial,alatbedahmikro,spuit,Aluminiumfoil,penyaringbakteriologis,penyaringnilon(net plankton)ukuranT100dan150,mikroskopelektrontransmisi
Preparasi Sel Primer Epitel Usus Larva Spodoptera litura
LarvaSpodoptera liturainstar5awalhasilpemeliharaandi laboratoriumdenganpakanbuatan, terlebihdahuludibersihkandenganmenggunakanbayclin,antibiotikdanPosphatBufferSaline(PBS).Selanjutnyadilakukanpembedahanuntukmengambilorganususlarvadenganmenggunakanalatbedahmikrodandiamatidibawahmikroskopstereo.JaringanepitelususlarvayangterambildicucidenganPBSdandipotong-potongsampaihalusdidalamnya.PotonganUsuslarvaditripsinasidenganperbandingan1:1antaralarutantripsin(0,25%)dengancairan PBS dan usus, sambil distirer selama 1 jamdalamsuhuhangat.Hasil tripsinasi disentrifus denganHasiltripsinasidisentrifusdengankecepatan2500rpmselama10menit,dengantujuanuntukmengendapkanselyangtelahterdispersi.Selanjutnyadilakukanpengamatandibawahmikroskopinverteduntukmengetahuiapakahsel-selepitelusussudahterdispersi,apabilabelumterdispersimakatripsinasidiulangilagi.selanjutnyasupernatanhasilsentrifusdibuangsebagian.Padaendapansisaditambahkanmediumdanserum(FBS)kemudian difilter dengan menggunakan penyaring nilon denganukuranT100danT150untukmemisahkanselepiteldenganjaringanyangtidakterdispersi.Sel-selepitelusus
dalammediumpertumbuhanditanampadacawankulturberukuran2,5ml.Selanjutnyadiinkubasidalaminkubatordengansuhu27ºC.Setelah10hariselsudahmembentukmonolayer dansiapdiinfeksidenganSpLtMNPV.
Persiapan SpLtMNPV yang Akan dinfeksi
SpLtMNPVmurnihasilpembiakanin vivo(Gambar1) dihitung konsentrasinya terlebih dahulu denganmenggunakanHaemocytometer.Konsentrasiyangdapatdigunakanuntukpenginfeksianadalah1,1×106PIBs/ml.OlehkarenaSpLtMNPVdalambentukpolyhedrayangukurannyarelatifbesar(dapatdilihatdenganmenggunakanmikroskopbiasadenganperbesaran400×)sesampaitidakmemungkinkanmasukkedalamselprimerususlarvaSpodoptera litura.maka PIBs ini harus dipecahmakaPIBsiniharusdipecahterlebihdahuludenganmenggunakanlarutanalkalisyaituNa2CO30,5Mdandiputardiatasmagnetikstirerselama1jam(virusnya berukuran lebih kurang 1 mikrometer(virusnyaberukuranlebihkurang1mikrometerlebih kecil dari sel primer berukuran lebih kurang2,5mikrometer). Selanjutnya diamati di bawah mikroskop.Selanjutnyadiamatidibawahmikroskopcahayadenganperbesaran400kaliapabilavirusnyasudahtidakterlihatberartiPIBsnyatelahpecahdanvirusdalambentukmultiplenucleocapsid.
Gambar 1. SpLtMNPV stater in vivo
Penginfeksian SpLtMNPV dalam Sel Primer Epitel Usus Larva Spodoptera litura
Untukmenjagasterilitaslarutanvirussebelumvirusdituang/diinfeksikandalammediumyangditumbuhiselprimerepitelususSpodoptera litura.LarutanSpLtMNPV-Na2CO3difiltrasidenganmembranfilterbakteriologis(pori-pori0,22mikron)danditeteskanpadamediumkulturselprimer.Selanjutnyamediumkulturyangtelahdiinfeksi
AsridanDucha 7�
diinkubasiselama24jam,48jam,dan72jam.Setiap24jam,sel terinfeksi di fiksasi/didormankan untuk memprosesan pembuatanpreparatberikutnyasupayadapatdilihatdenganmenggunakanmikroskopelektrontransmisi.
Persiapan Sel untuk Pengamatan dengan Mikroskop Elektron Transmisi (TEM)
PengamatanselterinfeksivirusdenganTEMdilakukandi Lembaga Eigment Jakarta. Sedangkan persiapanpengirimansampeldilakukandilaboratoriummikrobiologidankulturjaringanUnesadenganprosessebagaiberikut: a. Kulturselyangberadadalamdisk/flask/cawanpetri
dirontokkanb. Selyangtelahrontokdimasukkandalamfalcon tube
15ml/10mlc. Disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama
10menitd. Supernatandibuangdanditambahkancacodylate buffer
(1,5ml)kocokpelansampaisel-seltercampur.e. DipindahkankedalamtabungEpendrofdandisentrifuse
dengankecepatan3000rpmselama10menitf. Supernatandibuang,peletnyadicuci lagidengan
cacodylate buffer(1ml)g. Disentrifuselagipadakecepatan3000rpmselama
5menith. Supernatan dibuang dan ditambahkan fiksatif 2,5%
glutaraldehyde(1ml)dalamcacodylate bufferi. Dikocokpelansampaisel-sel tercampur.Sampel
disimpanpadasuhu4°CdansiapdikirimkeLembagaEigmentJakartauntukpreparasiberikutnya.
PadasampelyangterkirimakandilakukanpengeblokandenganmenggunakanmetodeSPURRyangterdiridari:Tahap Dehidrasi, Tahap infiltrasi/peresapan, dan Tahap Embedding/Penanaman.Selanjutnyadibuatsayatandarisampelbloktersebutdengantujuanmemotongsayatansetipismungkinagarmudahdiamatidibawahmikroskop.Sebelumpreparatdilapisidenganmonomerresinmelaluiprosespemanasandandilanjutkandenganpemotonganmenggunakanmikrotom.Umumnyamatapisaumikrotomterbuatdariberliankarenaberliantersusundariatomkarbonyangpadatsesampaisayatanlebihrapi.Sayatanyangtelahterbentukdiletakkandiatascincinberpetakuntukdiamati.Pelapisan/pewarnaanbiasanyajugadilakukanuntukmemperbesarkontrasantarapreparatyangakandiamatidenganlingkungansekitarnya.
HASIL
HasilpenelitianmenunjukkanbahwaselepitelususlarvaSpodoptera liturayangdiinfeksidenganSpLtMNPV
dandiinkubasipadawaktu24,48,dan72jammenunjukkanselterinfeksimulaimengalamilisisdiwaktuinkubasi24jam.Sedangkanpadawaktu48dan72jamhampirsemuaselnyasudahlisissehinggapadagambaryangtertangkaptinggalPIBsvirussertasisa-sisadariselyanglisistersebut.GambardarisuspensivirusPIBsdanselyanglisispadawaktuinkubasi24jamdapatdilihatpadagambar2,3,dan4.
Gambar 2. PIBs dari SpLtMNPV dengan mikroskop inverted (400×)
D
A
C
B
Gambar 3. Sel kultur yang normal dan terinfeksi SpLtMNPV
A. Giant Cell B. Sel normalC. Sel budding berisi virus D. Sel yang sudah terbuka/lisis Pada waktu inkubasi 24 jam (Perbesaran 5000 kali dengan TEM) (Perbesaran 5000 kali dengan TEM)(Perbesaran 5000 kali dengan TEM)
LamaWaktuLisisdariSelPrimerSpodoptera litura76
Gambar 4. Sel yang sudah terbuka dan mengeluarkan PIBs dilihat dengan TEM pada waktu inkubasi 24 jam (Perbesaran 20.000×)
PEMBAHASAN
BerdasarkangambaryangdiperolehbaikmenggunakanmikroskopinfertedmaupunmikroskopelektrontransmisiterlihatbahwaPIBsdariSpLtMNPVberbentukbulat(Gambar2).Padawaktuinkubasi24jamternyatavirussudahpadatahapreproduksiyangterakhiryaitupelepasanvirus(Gambar3dan4).Tahapreproduksiviruspadaumumnyaterdiridaridari5tahapyaitu:pelekatan padapadamembranselinangyangcocokdanabsorpsipadamembranselinang,penetrasidanpelepasanselubungdisitoplasma,reproduksi/replikasidanbiosintesiskomponenvirusdiintisel,perakitankomponenvirus,danpelepasanvirusdariselinang.SedangkanberdasarkanpenelitiandariFalcondalamMangoendiharjodanPollet(1991)keseluruhandaritahapanreproduksiNPVadalahpartikelvirustermakaninang(0jam),melepaskanpartikel-partikelpertamanyakedalamsitoplasma (4–8 jam), mengalami modifikasi pertama dalam intiselyangterinfeksi(16jam),pembentukanviroplasma(24 jam), replikasinucleocapsid (36 jam), replikasipolyhedra (48 jam),danpembentukanPIBs lengkap(72jam).ProsespelepasanNPVyangmembutuhkanwaktu72jamtersebutdilakukansecarain vivo,sedangkanpada
penelitianinidilakukansecarain vitrosehinggawaktulisis/lepasnyaPIBdarisellebihsingkatyaitu24jam.
Berdasarkandatatersebutdapatdijelaskanbahwalamawaktulisisnyaselepitelyangterinfeksisecarain vitrolebihsingkat(24jam)karenavirusyangdimasukkandalamcawankultursudahdipecahterlebihdahulupolyhedranyadenganmenggunakanlarutanNaNa2CO30,5Msehinggayangdiinfeksikanadalahmultiplenucleocapsidyangberukuranlebihkecil.Halinidapatmempersingkatwaktuuntukmemulaitahappertamadariinfeksivirusyaitupenetrasidanabsorpsi.Padainfeksiin vivo polyhedravirusharusdipecahterlebihdahuluolehlarutanalkalisdarisaluranpencernaanlarvaSpodoptera liturayangmenurutFalconFalcondalamMangoendiharjodanPollet(1991)membutuhkanwaktu0–4jam,selainitusebelummencapaiseltargetvirus jugaharusmenghadapisistemkekebalan inangyangtersebardiseluruhtubuhinang.Tahapberikutnyasetelahpenetrasidanabsorpsitidaktergambarkarenapadapenelitianinipemotretandilakukansetelahselterinfeksiselama24jam.Padawaktuiniterlihatselsudahmembesar/Giant cell (Gambar3)danhampirsemuaorganelseltelahdihancurkan,sertadidalamnyasudahdipenuhidenganrakitanvirus(multiplenucleocapsid).Selainitujugaditemuiselyangsedanglisis,membranselnyaterbuka,danterlihatPIByangakankeluar(Gambar4).
Padaselkulturyangterinfeksi48dan72jam(dilihatdenganmenggunakanmikroskopelektontransmisi)tidakterlihatlagiselyangterinfeksi,yangterlihathanyaPIBsSpLtMNPVyangsudahlengkapdansiapmenginfeksisellain.Sedangkandenganmikroskopinfertedperbesaran400kali,tidaktampakadanyaPIBsmaupunselkultur,yangtampakhanyamediayangkeruhdanpenuhdengandebrissel.HalinidisebabkankarenaseluruhselsudahlisissesampaitinggalPIBsyanglepasdariselkulturtersebut.
Selainwaktulisis,daripemotretanjugadapatdiketahuikemampuantiapselkulturuntukmenghasilkanvirus.Berdasarkanjumlahselkulturyangdinfeksidanjumlahvirusyangdiinfeksikanmakadapatditentukankemampuantiapseldalammemperbanyakvirusyaitukuranglebih2,545PIBs/ml(angkainidiperolehdari23,67×106PIBs/ml;9,3×106sel/ml=2,545PIBs/ml)
Dengandemikiandapatdisimpulkanbahwa lama waktulamawaktulisisdariselprimerepitelususlarvaSpodoptera liturayangdiinfeksidenganSpLtMNPV denganlamainkubasi24,48,dan72 jammenunjukkanbahwaselkulturtersebutmulaimengalamilisis dalamwaktu24jam.DantiapselkulturmampumemproduksiPIBssebanyak2,545.
AsridanDucha 77
KEPUSTAKAAN
AsriMT,2004.PerbanyakanSlNPVsecarain VivopadaLarvaSpodoptera litura.Unesa,Surabaya.
Asri MT 1 dan Isnawati, 2005. Effektifitas dan Karakterisasi SpLtMNPVyangTelahTerpotongMaterialGenetiknya.Unesa,Surabaya.
AsriMT2,FidaR,Yuliani,EvieR,danHerlinaF,2005.PengaruhBeauveria bassiana danSpLtMNPVterhadapLarvaSpodoptera liturapadaTanamanJarak.Unesa,Surabaya.
AsriMTdanNurDucha,2007.UpayaPerbanyakanSpLtMNPVsebagaiBioinsektisidasecaraIn vitrodenganTeknikKulturSelInsekta.Unesa,Surabaya.
Mangoendiharjo,SdanPollet,1991.InsectvirusesandthePossibleAplicationandNPVfortheControlofArmyWormSpodoptera litura.RisalahLokakaryaPengendalianHamaTerpaduTanamanKedelai.DepartemenPertanian.BalaiPenelitianTanamanPangan,Malang.
Naito,Harnoto,danIqbal,1983.PengendalianHamaKedelai.BalaiPenelitianTanaman,Bogor
SudarmoS,1987.Tembakau,PengendalianHamadanPenyakit.Kanisius,Yogyakarta,41–43.
