Lara Elis Alberici Delsin - teses.usp.br · AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por nunca desistir de...

Universidade De São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Departamento De Genética

“Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em

Osteossarcoma e seu papel no processo de invasão celular”

Lara Elis Alberici Delsin

Ribeirão Preto – SP 2015

Universidade De São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Departamento De Genética




Dissertação apresentada ao Departamento de Genética da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a

obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas - Genética.

Orientador: Profº. Dr. Luiz Gonzaga Tone

Ribeirão Preto – SP 2015

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo ou pesquisa, desde que citada a fonte.

Delsin, Lara Elis Alberici Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em Osteossarcoma e seu papel no processo de invasão celular. Ribeirão Preto, 2015. 87f.

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/USP. Área de concentração: Genética Orientador: Tone, Luiz Gonzaga

1. Osteossarcoma. 2. ROCK. 3. miR-708-5p.

FOLHA DE APROVAÇÃO




Dissertação apresentada ao Departamento de Genética da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a

obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas - Genética.

Área de Concentração: Genética

Data da defesa:

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

Prof.Dr.________________________________________________________________

Instituição:__________________________Assinatura:__________________________

Prof. Dr. _______________________________________________________________


Prof. Dr. _______________________________________________________________


Apoio e Suporte Financeiro Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes entidades e instituições:

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo n° 2014/07117-3 e processo nº 2014/03877-3);

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq;

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP;

Dedico este trabalho ao meu avô Delfino

Alberici, que me ensina a cada dia lições de

Superação, Força e Fé, e que Desistir simplesmente

não é uma opção.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por nunca desistir de mim nos momentos em que me faltou fé. A meu orientador Prof. Dr. Luiz Gonzaga Tone, que colaborou para meu crescimento profissional, dando toda a estrutura e apoio necessários para o desenvolvimento do trabalho. A Profª Drª María Sol Brassesco Annichini, que me acompanha desde meus primeiros passos no mundo científico, me conduzindo, auxiliando, apoiando e me ensinando lições não apenas científicas, mas que vou levar comigo pela vida toda. Obrigada! À Fundação de Apoio do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pela concessão da bolsa de Mestrado e apoio financeiro. Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, especialmente a secretária Susie Adriana Penha Nalon, pela atenção e apoio prestados durante o mestrado. Ao Departamento de Puericultura e Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, pelo apoio prestado aos Laboratórios de Citogenética, Biologia Molecular e Biologia Celular e Oncogenética, onde realizei meus experimentos. Aos Prof. Dr. Carlos Alberto Scridelli, Prof. Dr. Edgarg Engel, Prof. Dr. Rodrigo Tocantins Calado, Prof. Dr. Rodrigo Panepucci e ao Estatístico Davi Aragon por todo o apoio científico e discussões. Ao serviço de Ortopedia Oncológica HC-FMRP do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da FMRP-USP, por auxiliar na coleta das amostras tumorais aqui analisadas; Aos meus Pais, que sempre estiveram ao meu lado, obrigada por acreditarem em mim, me apoiarem e me incentivarem em todas as minhas decisões, ainda que seja o caminho mais difícil. Espero poder sempre orgulhar vocês, retribuindo tudo o que vocês fazem por mim. Gustavo Borges, pelo carinho, dedicação, paciência, apoio e amor. Por me ajudar desde a prova de seleção até o desenvolvimento desta dissertação. Por me escutar e me ajudar em todos os problemas que enfrentei, sejam eles científicos ou emocionais. Por me apoiar em todas as decisões e, mais que isso, me acompanhar. Obrigada! Aos meus amigos Gabriela Molinari Roberto, Lenisa Geron, Karina Bezerra Salomão, Marcela Oliveira da Silva, Gabriela Maciel Vieira, Rodrigo Hakime, Guilherme Vargas, por serem minha família dentro do laboratório. Ser amigo é interpretar olhares, entender silêncios, perdoar os erros, guardar segredos, secar lágrimas e claro, comemorar as vitórias. Obrigada por serem essas pessoas maravilhosas na minha vida.

A minha Família por ser minha segurança, minha motivação e minha inspiração. Amo cada um de vocês, perto ou longe. A todos os amigos do laboratório Augusto, Caio, Camilla, Carol, Daniel, Giovanna, Jaqueline, Julia, Kleiton, Gustavo, Mariana, Maurício, Mirella, Pâmela, Paola, Régia, Rosane, Vanessa e Veridiana, pela verdadeira amizade e por sempre me ajudarem e apoiarem quando precisei, contribuindo extremamente para o meu aprendizado e crescimento. Às técnicas do laboratório de Citogenética do Departamento de Puericultura e Pediatria Aide Barbosa, Sônia Scandussi, Lucimar Fernandes Laureano, Paola, Sara e às secretárias do Laboratório de Puericultura e Pediatria Evelice Visconte, assim como aos funcionários do departamento de Pediatria pelo apoio, conversas no almoço e convivência pelos corredores. A todos que de algum modo me apoiaram e contribuíram para que este trabalho fosse realizado.

“I am among those who think that science has great

beauty. A scientist in his laboratory is not only a

technician: he is also a child placed before natural

phenomena which impress him like a fairy tale.”

Marie Curie

https://www.goodreads.com/author/show/126903.Marie_Curie

RESUMO

“Avaliação de microRNAs associados às quinases ROCK em osteossarcoma e seu

papel no processo de invasão celular”

Osteossarcoma (OS) é uma neoplasia que acomete principalmente as metáfises de ossos

longos, sendo o tumor ósseo pediátrico mais comum. O tratamento consiste em ressecção cirúrgica,

tratamento quimioterápico multimodal neo-adjuvante e adjuvante. No entanto, apesar dos

tratamentos, cerca de 80% dos pacientes que apresentam metástase tem uma sobrevida curta.

Deste modo, torna-se necessário um melhor entendimento do processo metastático, assim como da

busca por novos alvos terapêuticos. Uma das principais vias relacionada à invasão e migração das

células neoplásicas é a das GTPases Rho, cujas principais moléculas efetoras são as quinases ROCK1 e

2, responsáveis por mediar a migração através do controle do citoesqueleto. Tais quinases têm sido

relatadas hiperexpressas em diversas neoplasias e associadas ao pior prognóstico. Recentemente,

pesquisas também têm apontado a desregulação de miRNAs na tumorigênese, sendo que a

hipoexpressão de alguns microRNAs estão relacionados à hiperexpressão das ROCKs e, portanto,

envolvidos no processo metastático. No presente trabalho, estudou-se a expressão tanto das ROCKs

quanto de miRNAs associados a elas em amostras tumorais de OS por meio de PCR em tempo real.

Encontramos uma hipoexpressão de ROCK1 nas amostras OS quando comparadas ao osso não

neoplásico controle, enquanto que ROCK2 não apresentou diferença. O miR-138 foi encontrado

hiperexpresso e obteve correlação com ROCK2, além de associação com a sobrevida. Os miR-139 e

miR-708 demonstraram-se hipoexpressos nas amostras tumorais. Já os miR-196b e miR-584 não

apresentaram diferenças. Após as análises de expressão, optou-se pelo estudo do miR-708 em

linhagens de OS, desta forma, sua expressão foi induzida em três linhagens celulares, através de um

vetor lentiviral, e foram realizados ensaios funcionais com o objetivo de estabelecer o papel deste

miRNA. Não foi observada diferença nas taxas de proliferação ou capacidade clonogênica quando a

expressão do miR-708 foi indizida. No ensaio de migração wound healing o miR-708 reduziu a

migração da linhagem SAOS-2, enquanto que no ensaio de invasão induziu a invasão da linhagem

MG-63 em matrigel, mas reduziu esse potencial nas linhagens HOS e SAOS-2 na matriz de gelatina.

Uma análise in silico dos alvos deste miRNA apontou sua associação às vias WNT, MAPK e de Junções

Aderentes. Desta forma, sugere-se que o miR-708 pode estar envolvido no controle processos que

levam ao desenvolvimento de metástase, principalmente na interação com a matriz extracelular.

Palavras-chave: Osteossarcoma, ROCK, miR-708-5p

ABSTRACT “Evaluation of the expression of microRNAs associated with ROCK kinases and their

role in the invasion process in osteosarcoma”

Osteosarcoma (OS) is a neoplasia that mainly occurs at the metaphyses of long bones, being

the most common pediatric bone tumor. The treatment is based on surgical resection and the

multimodal chemoterapy adjuvant and neoadjuvant. However, despite the treatment, around 80% of

patients who evolve to metastais present a poor survival. Therefore, understanding the metastatic

process is essencial, as well as the search for new therapy targets. The mainly pathway related to

invasion and migration in neoplasic cells is regulated by the Rho GTPases, and their main effectors

are the kinases ROCK1 and ROCK2, which are responsible for cytoskeleton control. The

hyperexpression of these kinases has been described in different cancers and it has been associated

to poor prognostic. In parallel, several studies have extensively demonstrated miRNA deregulation in

tumorigenesis, and the hipoexpression of some miRNA are related to ROCK upregulation,

consequently, involved with metastasis. Herein, we studied the expression profiles of ROCK1 and 2

and associated miRNAs in OS tumor samples by means of qRT-PCR. We found downregulation of

ROCK1 in OS samples when compared to normal bone (control), while ROCK2 did not show

differences. MiR-138 showed hiperexpression and was correlated with ROCK2, and an association

with survival rates. MiR-139 and miR-708 were found downregulated in tumor samples, though miR-

196b and miR-584 did not show differences in expression. Afterwards, miR-708 expression was

induced in three OS cell lines, aiming establish miR-708 role. Proliferation and clonogenic essays did

not present any effects when miR-708 was induced. In the wound healing essay, miR-708 reduced

the migration of SAOS-2 cells, and in invasion essay, miR-708 induced invasion of MG-63 cells in a

matrigel matrix, while reduced the invasive potential of HOS and SAOS-2 cell lines in a gelatin matrix.

An in silico analysis of miR-708 targets highlighted its association with WNT, MAPK and Adherent

Junction pathways. Therefore, we suggest that miR-708 can be involved in process that leads to

metastasis, mainly related to extracellular matrix interation.

Keywords: Osteosarcoma,ROCK, miR-708-5p.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: GTPases da família Rho e seus efetores....................................................................19 Figura 2: (A) Modelo de auto-inibição de ROCK onde o extremo C-terminal bloqueia a atividade quinase; (B) Modelo de liberação do sítio catalítico e ativação de ROCK após ligação de Rho-GTP..................................................................................................................21

Figura 3: Vetor de expressão da proteína de empacotamento lentiviral psPAX2...................31 Figura 4: Vetor de expressão da proteína de envelope lentiviral pCMV-VSV-G......................31

Figura 5: Vetor de expressão controle (pLV-miRNA-Expression).............................................32

Figura 6: Expressão relativa de ROCK1 e 2 em amostras de osso não neoplásico, amostras tumorais pré-QT e linhagens celulares de OS .........................................................................39

Figura 7: Expressão relativa de ROCK1 e 2 em amostras neoplásicas pré-quimioterapia (pré-QT) e pós-quimioterapia (pós-QT)...........................................................................................39 Figura 8: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras de osso não neoplásico comparados a amostras tumorais e linhagens celulares...................................................................................................................................40 Figura 9: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras pré-quimioterapia (pré-QT) comparadas a amostras pós-quimiterapia (pós-QT)...........................................................................................................................................41 Figura 10: Curvas de sobrevida global relativas a expressões dos genes ROCK1 (A), ROCK2 (B), miR-138 (C), miR-139 (D), miR-196b (E), miR-584 (F) e miR-708 (G)............................................................................................................................................43 Figura 11: Expressão Relativa do miR-708-5p nas linhagens HOS, MG-633 e SAOS-2 não transduzida (N.T.), transduzida com vetor vazio (V.V.) e com vetor de indução do miR-708...........................................................................................................................................47 Figura 12: Expressão relativa dos genes ROCK1 (A) e ROCK2 (B) nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 N.T., V.V. e miR-708....................................................................................................48 Figura 13: Taxa de proliferação das linhagens HOS, MG63 e SAOS-2 com hiperexpressão do miR-708-5p nos tempos de 24h a 144h...................................................................................49 Figura 14: Porcentagem de colônias apresentadas pelas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 miR-708 em relação às linhagens vetor vazio (V.V.) correspondente.....................................50

Figura 15: Fotos e gráficos correspondentes ao ensaio de migração wound healing realizado nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 V.V. e miR708................................................................51 Figura 16: Gráfico e figuras da taxa de invasão relativa nas linhagens HOS (A), MG-63(B) e SAOS-2(C) transduzidas com vetor vazio (V.V.) ou miR-708. O traço representa p<0,05......................................................................................................................................53

Figura 17: Figura e gráfico representando o número de colônias relativo obtidas através de crescimento independente de ancoragem na linhagem SAOS-2 vetor vazio (V.V.) e miR-708...........................................................................................................................................54

LISTA DE TABELAS

Tabela I: Valores do índice de correlação de Spearman, nível de significância das correlações (valor p) e n amostral entre miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584, miR-708-5p, ROCK1 e ROCK2......................................................................................................................................42

Tabela II: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos genes ROCK1 e ROCK2, apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de significância (valor p) para cada grupo.......................................................................44 Tabela III: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584 e miR-708, apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de significância (valor p) para cada grupo........................................................................................................................................45 Tabela IV: Fold change entre as linhagens transduzidas (V.V. e miR-708) de não transduzidas (N.T.), demonstrando a eficiência da transdução....................................................................47

Tabela V: Vias e processos biológicos nos quais o miR-708-5p pode estar envolvido.................................................................................................................................55

LISTA DE SIGLAS

CO2 Dióxido de carbono

DMEN Solução Nutritiva para o Cultivo Celular

DNA ácido desoxirribonucleico

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

FMRP Faculdade de Medicina de Riberião Preto

GTP Guanosina Trifosfato

HAM F-10 Solução Nutritiva para o Cultivo Celular

HC Hospital das Clínicas

HEK293T/17 Linhagem Celular competente para produção lentiviral

HOS Linhagem Celular de Osteossarcoma

INCA Instituto Nacional do Câncer

McCoy´s Solução Nutritiva para o Cultivo Celular

MEC Matriz Extracelular

MG-63 Linhagem Celular de Osteossarcoma

mRNA Ácido ribonucléico mensageiro

MRC-5 Linahgem Celular de Fibroblasto

N.T. Não Transduzido

OMS Organização Mundial de Saúde

OS Osteossarcona

PBS Tampão salina fosfato

PCR Reação em cadeia da polimerase

QT quimioterapia

RNA Ácido ribonucleico

ROCK1 Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1

ROCK2 Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 2

RT-qPCR Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real

SAOS-2 Linhagem Celular de Osteossarcoma

SBF Soro Bovino Fetal

SPSS Statistical Package for the Social Sciences

USP Universidade de São Paulo

V.V. Vetor Vazio

LISTA DE SÍMBOLOS

°C Graus Celsius

cm3 Centímetros cúbicos

h horas

L Litro

mg Miligrama

min Minuto

mL Mililitro

mM Milimolar

nm Nanometro

rpm Rotações por minuto

µg Micrograma

µL Microlitro

µM Micromolar

µm Micrômetro

SUMÁRIO

1 Introdução......................................................................................................................................16

2 Objetivos.........................................................................................................................................25 2.1. Objetivos Específicos................................................................................................................26

3 Materiais e Métodos......................................................................................................................27

3.1 Linhagens Celulares e Condições de Cultura............................................................................28

3.2 Amostras de Pacientes (Casuística)..........................................................................................28

3.3 Extração de mRNA e Síntese de cDNA......................................................................................28

3.4 RT-qPCR....................................................................................................................................29

3.5 Transfecção e Transdução de linhagens celulares com microRNA de

interesse...................................................................................................................................29

3.5.1 Amplificação dos plasmídeos lentivirais, vetor de expressão e do miR-708-

5p.................................................................................................................................29

3.5.2 Purificação dos plasmídeos.........................................................................................30

3.5.3 Plasmídeos e produção lentiviral.................................................................................30

3.5.4 Infecção Lentiviral........................................................................................................32

3.5.5 Confirmação da Transdução........................................................................................32

3.5.6 Confirmação da autenticidade das linhagens celulares após processo de

transdução...................................................................................................................32

3.6 Ensaios Funcionais – Crescimento Celular................................................................................33

3.6.1 Proliferação Celular.....................................................................................................33

3.6.2 Ensaio Clonogênico......................................................................................................33

3.7 Ensaios Funcionais – Migração, Invasão e Ancoragem.............................................................34

3.7.1 Ensaio de migração por Wound Healing......................................................................34

3.7.2 Ensaio de Invasão em Matrigel e Gelatina..................................................................34

3.7.3 Ensaio de Crescimento Independente de Ancoragem.................................................34

3.8 Forma de Análise Estatística.....................................................................................................35

3.9 Análise in silico..........................................................................................................................35

4 Resultados......................................................................................................................................36

4.1 Resultados Clínicos e Patológicos.............................................................................................37

4.2 Dados de Expressão.................................................................................................................38

4.2.1 Expressão dos genes ROCK1 e ROCK2.........................................................................38

4.2.2 Expressão dos miRNAs miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584 e miR-708-

5p.................................................................................................................................39

4.2.3 Correlação entre as expressões...................................................................................41

4.3 Associação com Diagnóstico e Evolução Clínica dos Pacientes................................................43

4.3.1 Associação com Sobrevida Global...............................................................................43

4.3.2 Associação dos dados de expressão e características clínicas e biológicas dos

pacientes.....................................................................................................................44

4.4 Transdução das linhagens de OS..............................................................................................46

4.4.1 Escolha do miRNA de interesse...................................................................................46

4.4.2 Confirmação da eficiência de transdução....................................................................46

4.4.3 Expressão das quinases ROCKs nas linhagens transduzidas........................................48

4.5 Ensaios Funcionais....................................................................................................................49

4.5.1 Ensaio de Proliferação.................................................................................................49

4.5.2 Ensaio Clonogênico......................................................................................................50

4.5.3 Ensaio de migração por Wound Healing......................................................................51

4.5.4 Ensaio de Invasão em Matrigel e Gelatina..................................................................52

4.5.5 Ensaio de Crescimento Independente de Ancoragem (Soft Agar)..............................54

4.6 Análise In Silico.........................................................................................................................55

5 Discussão........................................................................................................................................56

6 Conclusão........................................................................................................................................65

7 Referências Bibliográficas..............................................................................................................67

8 Apêndice.........................................................................................................................................81

9 Anexo..............................................................................................................................................86

Introdução

________________________ INTRODUÇÃO

17

O Osteossarcoma (OS) corresponde ao subgrupo de tumores ósseos malignos de maior

ocorrência na criança e no adolescente, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), (Steliarova-

Foucher et al., 2005; Rivera-Valentin et al., 2015), e representa a oitava malignidade mais comum

da infância (Ottaviani & Jaffe, 2009). Pode acometer qualquer região do esqueleto, entretanto, os

ossos com maiores índices de incidência são o fêmur na região distal, a tíbia proximal e o úmero

proximal, respectivamente (Bielack et al., 2002). O OS se caracteriza por apresentar um crescimento

radial, apresentando grande volume tumoral com mais de cinco centímetros. Frequentemente

ultrapassa o córtex e associa-se a tecidos moles (Fletcher et al., 2002; Wittig et al., 2002).

Esta neoplasia se desenvolve principalmente no espaço intramedular das metáfises de ossos

longos, geralmente provocada pelo rápido crescimento de tais regiões durante o período da

puberdade. Durante o processo de transformação maligna, ocorre uma proliferação indiscriminada

de células mesenquimais malígnas, capazes de produzir uma substância osteóide neoplásica,

característica dessa doença (Federman et al., 2009; Gill et al., 2013). O principal sintoma do OS é dor

localizada na região tumoral (Federman et al., 2009).

Histologicamente, os OSs convencionais podem ser divididos em três subtipos principais

dependendo da ausência ou presença de matriz e da composição desta, sendo eles osteoblástico,

condroblástico e fibroblástico (Fletcher et al., 2002). Cerca de 85% dos casos ocorrem de novo e 70%

deles apresentam anormalidades cromossômicas (Fletcher et al., 2002), sendo divididos em OS com

cariótipos balanceados e não balanceados, contendo tanto alterações numéricas quanto estruturais

(Gorlick et al., 2003; Hayden & Hoang, 2006).

Ainda não foi identificada nenhuma anomalia genética distinta e específica como causa

primária dos OSs, mas estudos têm demonstrado que a desregulação de diversos genes, também

comuns a outras neoplasias, estão presentes em casos de OS. Têm-se indicado como alterações

principais àquelas relacionadas a dois processos basais: controle de crescimento e proliferação

celular, como alterações nas vias do Wingless (WNT) ou Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF),

e controle do ciclo celular e reparo do DNA, como alterações nas vias do TP53, Rb, superexpressão de

FOS e amplificação de CDK4 (Gorlick & Khanna, 2010). Recentemente, diversos trabalhos têm focado

em terapias que têm como alvo receptores tirosino-kinase, como IGF-1R, ERBB, PDGFR, críticos para

oncogênese de diferentes tipos tumorais; além de vias intracelulares de sinalização, tendo como

alvos ezrin, associada aos casos metastáticos da doença, além de vias como mTOR, Notch, Hedgehog

e Ras, cujo potencial terapêutico tem sido demonstrado em diferentes tipos tumorais (Rivera-

Valentin et al., 2015).

O procedimento terapêutico consiste na realização de quimioterapia neoadjuvante,

ressecção cirúrgica e quimioterapia adjuvante, isto é, os quimioterápicos são ministrados nos

________________________ INTRODUÇÃO

18

processos pré- e pós-operatórios (Bielack et al., 2002; Hayden & Hoang, 2006). O tratamento

neoadjuvante se iniciou na década de 1970 com o objetivo de prevenir a amputação dos membros

acometidos pelo OS, e assim pode-se também mensurar a resposta tumoral ao quimioterápico

através da análise do grau de necrose da neoplasia. Os primeiros e principais quimioterápicos

utilizados são metotrexato, doxorubicina e cisplatina. Mais recentemente introduziram-se também a

ifosfamida e o etoposide para os casos de maus respondedores, entretanto o uso destes

medicamentos ainda é questionável, uma vez que nem sempre é obtida uma melhora na sobrevida

destes pacientes (Bielack et al., 2002; Gill et al., 2013; Rivera-Valentin et al., 2015).

Apesar do tratamento multimodal, as terapias pouco evoluíram para o tratamento de

pacientes diagnosticados com OS nos últimos 30 anos (Isakoff et al., 2015). Além do que, as maiores

taxas de mortalidade ocorrem nos casos em que há eventos metastáticos, sendo que apenas cerca

de 20% dos pacientes com metástases apresentam uma sobrevida média de cinco anos (Gorlick &

Khanna, 2010; Brennecke et al., 2013). Cerca de 80% das metástases ocorrem nos pulmões, seguido

de 15% dos casos em ossos (Kempf-Bielack et al., 2005; Hayden & Hoang, 2006; Isakoff et al., 2015).

Um dado interessante levantado por Gorlick & Khanna (2010) foi que mesmo sem o uso de

quimioterápicos, quando o tratamento se baseava exclusivamente na ressecção cirúrgica e, portanto,

eram frequentes eventos de amputação, 85% dos casos apresentavam metástases, indicando a

presença inclusive de micrometástases durante o desenvolvimento tumoral. Sendo assim, visando

diminuir os índices de mortalidade neste tipo tumoral, ainda é necessária a busca por novos alvos

terapêuticos.

Neste contexto, estudos mais aprofundados sobre os aspectos moleculares que regem o

processo metastático se tornam primordiais, visto que esta é a principal causa da redução da

expectativa de vida dos pacientes com OS.

Sob uma perspectiva mais ampla podemos definir o processo metastático, como um

processo que envolve o desprendimento das células de seu tecido primário, invasão da matriz

extracelular, circulação pelo sistema vascular ou linfático e finalmente o estabelecimento e

colonização de um tecido secundário (Croft & Olson, 2008; Kumar, 2012). Em condições não

neoplásicas, existe uma homeostase entre as forças de adesão célula-célula e célula-matriz

extracelular. Entretanto, em condições tumorigênicas a matriz extracelular sofre alterações e este

equilíbrio é perdido, fazendo com que a célula neoplásica adquira capacidade de se desprender e

invadir a matriz (Lu et al., 2012). Tal processo pode se iniciar através da sinalização molecular ou

mecânica de receptores de membrana, como as integrinas, que respondem às mudanças na matriz

extracelular e ativam vias de sinalização intracelulares capazes de interagir com o citoesqueleto e

promover forças propulsoras do processo invasivo (Kumar, 2012).

________________________ INTRODUÇÃO

19

Dessa forma, a migração no meio intracelular, envolve a polarização na direção do

movimento, reorganização do citoesqueleto, remodelamento na adesão celular e alteração na

dinâmica da membrana celular (Amano et al., 2010). Dentre as vias intracelulares de sinalização

desse processo, está a família das GTPases Rho, que inclui as moléculas Rho, Rac e Cdc42. Estas

proteínas, quando ativadas por uma molécula de GTP, são capazes de ativar uma variedade de

substratos relacionados ao controle do citoesqueleto (Kumar, 2012; Sahai & Marshall, 2003) (Figura

1).

A GTPase Rho é necessária para a geração da força contrátil através da ativação das

proteínas ROCK (Rho-associated coiled-coil containing kinase), que induzem a formação de estruturas

contráteis associadas aos filamentos de actina (F-actina) do citoesqueleto. A proteína Rac se

relaciona à formação de lamelipódios, e a GTPase Cdc42 à formação de protrusões do tipo filopódios,

além de controlar a formação de estruturas ricas em actina responsáveis pela sensibilidade à

gradientes quimiostáticos (Kumar, 2012; Sahai & Marshall, 2003).

Existem dois principais mecanismos de invasão controlados pelas GTPases da família Rho. No

primeiro deles ocorre polimerização dos F-actina concedendo à célula uma morfologia alongada ou

mesenquimal, e através da liberação de proteases e do alongamento dos F-actina a célula torna-se

capaz de invadir a matriz extracelular. Já no segundo mecanismo de invasão a célula adota uma

morfologia arredondada e não necessita da liberação de proteases, pois se comprime através dos

poros da matriz utilizando movimentos ameboides gerados pela força contrátil dos filamentos de

actomiosina (Wolf et al., 2003; Sahai & Marshall et al., 2003). Sabe-se que esses processos são

Figura 1: GTPases da família Rho e seus efetores. Adaptado de Sadok & Marshall, 2014.

________________________ INTRODUÇÃO

20

mutuamente excludentes, ou seja, a ativação da via mesenquimal implica na inibição da via

ameboide, e a célula pode variar entre estes mecanismos invasivos conforme as condições

ambientais ou intrínsecas da célula (Kumar, 2012; Wyckoff et al., 2006). A invasão do tipo

mesenquimal é dependente da ativação da GTPase Rac, enquanto que o mecanismo tipo ameboide é

controlado pela GTPase Rho, especificamente RhoA e seus efetores, as quinases ROCK 1 e ROCK 2

(Croft & Olson, 2008; Sahai & Marshall, 2003).

ROCK 1 e 2 são proteínas codificadas por genes diferentes, entretanto possuem cerca de 64%

de homologia em seus aminoácidos, sendo que no domínio quinase este valor chega a 83%,

indicando a similaridade no substrato específico (Amano et al., 2010; Nakagawa et al, 1996). São

quinases do tipo serina-treonina compostas por um domínio catalítico N-terminal, um domínio

central na forma coiled-coil constituído de duas α-hélices enroladas, nas quais a proteína Rho pode

se ligar para ativação das mesmas, e um domínio C-terminal com homologia a plecstrina (PH)

interrompido por uma região rica em cisteína e contendo um domínio RB (Amano et al., 2010).

Ambas as quinases possuem capacidade de autoinativação. Nesta conformação os

segmentos N-terminais se posicionam de forma que permita aos domínios quinases das moléculas

ROCK formarem homodímeros, nos quais os domínios RB e PH C-terminais se ligam, inativando as

quinases (Yamagushi et al.,2006; Amano et al., 1999). A ativação das proteínas ROCK ocorre quando

há alteração desta conformação de autoinativação. Para isso, deve haver a ligação de uma Rho-GTP

no domínio RB da quinase ROCK induzindo a liberação dos homodímeros e ativando a molécula

(Morgan-Fisher et al., 2013; Amano et al., 1999) (Figura 2).

Após serem ativadas, as proteínas ROCK são capazes de modular a ação de diversos

substratos. Um deles é a MLC (myosin light chain – cadeia leve da miosina), que pode tanto ser

modulada diretamente quanto indiretamente pela fosforilação de MLCP; esta proteína é capaz de

promover a formação de fibras de estresse responsáveis por aumentar a contratilidade da célula

Figura 2: (A) Modelo de auto-inibição de ROCK onde o extremo C-terminal bloqueia a atividade quinase; (B) Modelo de liberação do sítio catalítico e ativação de ROCK após ligação de Rho-GTP (adaptado de Morgan-

Fisher et al., 2013)

________________________ INTRODUÇÃO

21

(Morgan-Fisher et al., 2013; Amano et al., 1996). As quinases ROCK também são capazes de fosforilar

as moléculas da família ECM (ezrin/radixin/moesin), responsáveis pelo ancoramento das fibras de

estresse às proteínas integrais da membrana plasmática (Morgan-Fisher et al.,2013; Matsui et

al.,1998). Outro substrato relevante das ROCKs são as LIMK (Lin11 Isl-1 & Mec-3 domain-kinases),

que após fosforiladas estabilizam o citoesqueleto de actina através da fosforilação da cofilina e do

fator de despolimerização da actina (Morgan-Ficher et al., 2013; Scott & Olson, 2007;). Amano e

colaboradores (2003) encontraram que ROCK modula não apenas moléculas relacionadas à actina,

mas também as proteínas TAU e MAP2 que são responsáveis por regular a polimerização dos

microtúbulos.

Apesar da grande homologia estrutural, existem diferenças funcionais entre ROCK 1 e 2. A

primeira quinase parece estar essencialmente relacionada à formação das fibras de estresse,

enquanto que ROCK2 se associa aos processos de fagocitose dependente de miosina-II e contração

celular. Além disso, ocorre uma diferença espacial na localização intracelular destas moléculas, pois

diferentemente de ROCK1, ROCK2 encontra-se principalmente na periferia celular (Yoneda et al.,

2005).

As quinases ROCK não estão envolvidas apenas no processo de migração. Na apoptose as

ROCKs podem ser ativadas por caspases, se relacionando neste processo à formação de protrusões

na membrana plasmática, desintegração nuclear e relocação dos fragmentos de DNA para os corpos

apoptóticos via regulação dos filamentos de actomiosina e fibras de estresse de actina (Street &

Bryan, 2011; Coleman et al., 2001). As ROCKs também têm papel importante durante a mitose,

controlando de modo direto ou indireto a dinâmica dos microtúbulos e a integridade do

centrossomo (Oku et al., 2014). Durante a citocinese controlam a formação do anel contrátil e do

sulco de clivagem (Matsumura, 2005; Kosako et al., 2000). Além disso, se destacam no controle do

ciclo celular durante a progressão para a fase S pela regulação de alvos como ciclinas A/D1/D3 ou

CDKs (Street & Bryan, 2011; Croft & Olson, 2006). Recentemente, tem sido descrita sua atuação

inclusive na regulação da expressão global de microRNAs (miRNAs), sendo que sua inibição está

relacionada a um aumento na função de deadenilação dos miRNAs (Stiller et al., 2013; Yoshikawa et

al., 2015).

Estando, portanto, envolvidas em vias essenciais para a homeostase celular, as quinases

ROCK se tornam influentes no desenvolvimento de diversas doenças, incluindo o câncer. A

hiperexpressão destas quinases foi descrita em condições neoplásicas (Sahai & Marshall, 2003),

sendo que as maiores taxas de expressão são relacionadas com o pior prognóstico e menor sobrevida

dos pacientes em diferentes tipos tumorais, e recentemente tem sido explorado o potencial

________________________ INTRODUÇÃO

22

terapêutico da sua inibição (Kamai et al., 2003; Lane et al., 2008; Liu et al., 2011; Wu et al., 2013;

Feng et al., 2015).

Experimentos de knockdown ou inibição por drogas específicas de ROCK1 e ROCK2

provocaram uma diminuição da proliferação celular em carcinoma hepatocelular (Takeba et al.,

2012) e câncer de pulmão (Yang et al., 2012), redução da viabilidade em linhagens de osteossarcoma

e sarcoma de Ewing (Liu et al., 2011) e alterações morfológicas nas células de glioblastoma (Mertsch

& Thanos, 2013). Adicionalmente, alterações na expressão e/ou ativação de ROCK estão sendo

principalmente relacionadas a processos invasivos e metastáticos, como em câncer de mama (Lane

et al., 2008), gástrico (Wu et al., 2013) ou pancreático (Fujimura et al., 2015).

Outras moléculas que têm se destacado na participação dos processos invasivos e

metastáticos das células tumorais são os microRNAs (miRNA), inclusive no controle das ROCKs De

fato, a desregulação destes têm sido relacionada ao processo de tumorigênese como um todo (Calin

et al., 2004; Calin et al., 2006) e é crescente seu destaque como biomarcadores em diferentes

neoplasias (Lan et al., 2015).

Os miRNAs são pequenos RNAs não codificantes de aproximadamente 18 a 24 nucleotídeos

originados a partir das regiões intrônicas de RNAs codificantes ou não (Bartel, 2004). São

considerados reguladores negativos pós-transcricionais, uma vez que direcionam o complexo

proteico RISC (RNA-induced silencing complex) aos RNA mensageiros (mRNA) através da ligação

completa ou parcial dos miRNAs a estes, fazendo com que os mRNA sejam, respectivamente,

clivados ou silenciados pelo RISC (Bartel, 2004). Recentemente, demonstrou-se que mesmo em casos

de complementaridade incompleta entre o miRNA e o mRNA há uma diminuição na concentração

deste último na célula, através de uma regulação pós-transcricional (Lim et al., 2005; Bagga et al.,

2005). Um dos processos indicados pelo qual o miRNA leva a degradação do mRNA alvo é sua

atuação na desestabilização através da deadelinação destes, uma vez que a retirada da cauda poli-A

levaria então a degradação do mRNA devido a exposição da extramidade 5´ desta molécula (Wu et

al., 2006).

Existem mais de dois mil miRNAs descritos no genoma humano e cada um deles pode ter

como alvo centenas de mRNA, sendo assim, os miRNAs se tornam essenciais na regulação de

inúmeros processos celulares, dentre eles diferenciação, proliferação, apoptose, entre outros (Kong

et al., 2012 ; Hwang & Mendell, 2006; Bartel, 2004). De forma interessante, Calin e colaboradores

(2004) demonstraram que os genes de miRNAs encontram-se frequentemente localizados em sítios

frágeis do cromossomo e em regiões genômicas associadas ao câncer, destacando a associação dos

miRNAs e o desenvolvimento e progressão tumoral.

________________________ INTRODUÇÃO

23

Em casos de neoplasias os miRNAs podem atuar tanto como oncogenes quanto no papel de

supressores tumorais. No primeiro caso, também chamados “oncomirs”, determinados miRNAs se

encontram hiperexpressos e tem como alvos genes supressores tumorais. Quando hipoexpressos, os

miRNAs são considerados supressores tumorais, controlando negativamente oncogenes. Em ambos

os casos os miRNAs também podem estar agindo como reguladores pós-transcricionais de genes

relacionados à diferenciação celular e apoptose (Manikandan et al., 2008; Zhang et al., 2007). Além

disso, o perfil de expressão dos miRNAs tem sido usado em diferentes malignidades para auxiliar na

classificação tumoral, além de servirem como fator prognóstico (Lu et al., 2005; Hernando, 2007;

Schooneveld et al. , 2012).

Em 2009, Hurst e colaboradores estabeleceram o termo metastamiR, agrupando os miRNAs

associados a regulação de genes envolvidos nas múltiplas vias do processo metastático, tanto

miRNAs pró- como antimetastáticos. Grande atenção tem sido depositada especificamente nos

processos de invasão e migração celular. Diversos artigos têm demonstrado que a hipoexpressão de

determinados miRNAs está associada a estes processos específicos em diferentes neoplasias, como

câncer de cólon (Li et al., 2013), carcinoma hepatocelular (Zheng et al., 2012; Wong et al. ,2011,

Wang et al., 2015), glioma (An et al., 2013), câncer de próstata (Lin et al., 2008; Kroiss et al., 2014),

entre outros (Yamasaki et al., 2012; Ueno et al., 2011; Song et al., 2013; Lopez-Camarillo et al., 2012).

Diferentes miRNAs têm sido descritos como associados ao desenvolvimento e progressão do

OS, destacando o papel desta classe de moléculas nesta neoplasia (Zhang et al., 2015). Mais

especificamente, muitos miRNAs estão sendo relacionados aos processos de invasão e migração em

OS, apresentando diferentes genes envolvidos no processo metastático como alvos, como por

exemplo, os miR-646 (Sun et al., 2014), miR-33b (Xu et al., 2014), miR-195 (Han et al., 2015), miR-140

(Gu et al., 2015), miR-34a (Liu et al., 2013; Yan et al., 2012).

Uma das vias citadas nos artigos acima pela qual os miRNAs atuam para garantir a diminuição

dos processos metastáticos e invasivos é a Rho/ROCK quinase, isto é, os miRNAs são responsáveis

por inibir a expressão das proteínas Rho e suas quinases ROCK, impedindo que ocorra migração das

células neoplásicas. Sendo assim, conclui-se que a hipoexpressão de tais miRNAs leva à uma

expressão desregulada de Rho e ROCK quinases, potencializando os processos de invasão e

aumentando a ocorrência de metástases.

Já foram descritos alguns miRNAs em OS envolvidos na regulação da via Rho/ROCK, como os

miR-144, miR-145, miR-335 e miR-340. Estes miRNAs foram descritos como supressores tumorais, e

que seu reestabelecimento na célula leva a menores taxas de proliferação, migração e invasão (Lei et

al., 2014.; Wang et al., 2015; Zhou et al., 2013; Wang et al., 2013). A principal quinase descrita como

________________________ INTRODUÇÃO

24

alvo destes miRNAs é ROCK1, sendo que seu perfil de expressão juntamente com o do miR-340 foi

associado ao pior prognostico de pacientes com OS (Cai et al., 2014).

Neste contexto, com o objetivo de selecionar alguns miRNAs que tenham as quinases ROCK

como alvos, nosso grupo realizou uma predição através da ferramenta miRWalk (Dweep et al., 2011),

na qual foram utilizadas oito bases de dados para análise, e foram selecionados miRNAs que estavam

presentes em ao menos três bases de dados. Dessa forma, foram escolhidos os miR-196b-5p e miR-

708-5p, como preditos para ROCK1 e ROCK2, respectivamente, visto que ambos já foram associados

aos processos invasivos e migratórios em outras neoplasias (Li et al., 2015; Jang et al., 2012; Saini et

al., 2011; Ryu et al., 2013; Li et al., 2010, Lu et al., 2014). E como miRNAs já validados para ROCK1

foram selecionados os miR-138 e miR-139, e para ROCK2 o miR-584. Esses miRNAs já foram descritos

em diferentes tipos tumorais (Jiang et al., 2010; Ueno et al., 2011; Wong et al., 2011; Shen et al.,

2014), mas ainda não verificados em OS.

Através da análise destes miRNAs associados às quinases ROCK em OS poderemos ampliar

nosso conhecimento sobres as vias responsáveis pela migração, invasão e metástase das células

neoplásicas e assim identificar novas abordagens sobre estes processos com o intuito de minimizá-

los, e assim possibilitar a diminuição dos índices de mórbido-mortalidade causados principalmente

pelos casos de OS com metástase.

Objetivos

________________________ OBJETIVOS

26

O objetivo principal do trabalho aqui apresentado foi estudar os processos de invasão e

migração celular de Osteossarcoma, através do papel das quinases ROCK1 e ROCK2 e dos miRNAs

associados.

2.1. Objetivos específicos:

Analisar o perfil de expressão gênica utilizando a técnica de RT-qPCR de ROCK1 e 2 em

amostras tumorais e linhagens celulares de OS;

Analisar o perfil de expressão dos miRNAs preditos e validados (miR-708, miR-196b, miR-138,

miR-139, miR-584) por RT-qPCR em amostras tumorais e linhagens celulares de OS;

Analisar a associação entre os níveis de expressão encontrados nas amostras tumorais ao

diagnóstico e evolução clínica dos pacientes;

Verificar os efeitos da modulação do miRNA de maior interesse em linhagens de OS em

relação a proliferação celular e capacidade clonogênica;

Realizar ensaios funcionais com as células transfectadas com o miRNA de interesse

relacionados aos processos invasivos e migratórios (wound healing, invasão em matrigel e

em gelatina, crescimento independente de ancoragem).

Materiais e

Métodos

_______________________ MATERIAIS E MÉTODOS

28

3.1 Linhagens Celulares e Condições de Cultura

Para o presente estudo foram utilizadas as linhagens celulares de osteossarcoma HOS, MG-

63 (gentilmente cedidas por Jeremy Squire – University of Toronto – Canada) e SAOS-2 (gentilmente

cedida pelo Prof. Dr. Keith Oswaldo Okamoto, do IB-USP). Além das linhagens de OS, foi utilizada a

linhagem de fibroblasto MRC-5 como amostra calibradora para as reações de RT-qPCR e a linhagem

HEK293T/17 para produção lentiviral.

Todas as linhagens foram cultivadas em garrafas de 75cm2, incubadas em atmosfera úmida

contendo 5% de CO2 e temperatura de 37°C. Foi utilizado meio de cultivo apropriado a cada

linhagem (HAM F10 ou McCoy´s) complementados com 60mg/L de penicilina, 100mg/mL de

estreptomicina e 10% a 15% de soro bovino fetal (pH de 7,2-7,4).

As células em cultura, quando confluentes, foram desprendidas através do uso de 0,05 %

da enzima tripsina (Gibco BRL, Life Technologies, Carlsbad, California, USA), e expandidas para novas

garrafas ou congeladas com SBF e 10%DMSO a -80ºC. Os experimentos foram realizados com células

com menos de 10 passagens a partir de seu descongelamento.

3.2 Amostras de Pacientes (Casuística)

As amostras de OS (n=35) e amostras de osso não neoplásico (n=8) foram coletadas durante

o procedimento cirúrgico pelo serviço de Ortopedia Oncológica HC-FMRP do Departamento de

Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da FMRP-USP. Imediatamente após a

cirurgia, as amostras de tumor foram congeladas a -80°C e estocadas no Banco de Tumores do

Laboratório de Oncologia Pediátrica do Hospital das Clínicas (aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa Proc. 9373/2003) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

(FMRP-USP). O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Filosofia

Ciências e Letras de Riberão Preto, USP, processo nº 43619215.9.0000.5407.

3.3 Extração de mRNA e Síntese de cDNA

O mRNA foi extraído das culturas celulares e das amostras tumorais por meio do Trizol

Reagent (Invitrogen Inc, Carsdab, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA foi

quantificado e armazenado em freezer – 80°C até a sua utilização. Foi sintetizado o cDNA a partir do

mRNA extraído através da utilização de sondas RT específicas para os miRNAs de interesse por meio

do kit High capacity (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).


29

3.4 RT-qPCR

A RT-qPCR (PCR quantitativa tempo real) foi realizada utilizando aparelho ABI Prism 7500

Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os primers e as sondas TaqMan®

foram adquiridas pelo sistema by-demand da Applied Biosystems. O volume final para cada PCR foi

de 10μL, sendo utilizados 5,0 μL do Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, part

number 4304437), 0,5 μL de sonda e 4,5 μL de cDNA (diluído 1/20).

O controle endógeno utilizado na análise da expressão de ROCK1 e ROCK2 foi o gene GUSB

(glucuronidase beta) (4326320E), enquanto que o RNU6B (001093) e RNU48 (001006) foram

utilizados como controles endógenos na expressão de microRNAs. A amostra calibradora foi

proveniente da linhagem de fibroblasto MRC-5. A quantificação relativa da expressão gênica foi

determinada utilizando o método 2-ΔΔCT (Livak & Schmittgen, 2001).

Foi mensurada a expressão dos genes ROCK1 (Hs01127699-m1) e ROCK2 (Hs00178154-m1),

assim como dos miR-138-5p (002284), miR-139-5p (002289), miR-196b-5p (002215), miR-584-5p

(001624) e miR-708-5p (002341).

3.5 Transfecção e Transdução de linhagens celulares com microRNA de interesse

3.5.1 Amplificação dos plasmídeos lentivirais, vetor de expressão e do miR-708-5p

Foram adicionados 1μL do plasmídeo pCMV-VSV-G (Addgene, Cambridge, MA, #Cat. 8454) ou

1μL do plasmídeo psPAX2 (Addgene, Cambridge MA, #Cat. 12260) em 50μL de células competentes

Subcloning Efficiency™ DH5-alfa™ Competent Cells (Invitrogen Inc, Carlsbad, California, #Cat. 18265-

017) e mantidas em gelo por 30 minutos. Em seguida as células foram submetidas a um choque

térmico a 42°C por 1 minuto e novamente transferidas para o gelo por mais 3 minutos. Foi

adicionado 250uL de meio S.O.C. (Invitrogen Inc, Carlsbad, California, #Cat. 15544-034) e a solução

foi incubada por 1 hora a 37°C . Então, 20uL de cada solução foi plaqueada por espalhamento em

placas de petri com LB-Ágar com ampicilina e incubadas por aproximadamente 18 horas a 37°C,

obtendo-se colônias isoladas. Para os plasmídeos pLV-miR-708-Expression ou seu controle pLV-miR-

Expression foram utilizadas as bactérias competentes empregando-se a técnica de semeadura por

esgotamento nas mesmas condições descritas acima. Após o tempo de incubação as placas foram

colocadas na geladeira para a diminuição do crescimento das colônias. Colônias isoladas foram

selecionadas para crescimento em 5 mL de meio LB líquido com ampicilina e incubadas por

aproximadamente 18 horas. A solução total foi transferida para um tubo Falcon de 15mL e

centrifugadas a 2000 rpm, 4°C por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e as bactérias

transformadas foram congeladas a -20C até a extração do plasmídeo.


30

3.5.2 Purificação dos Plasmídeos

Os plasmídeos foram purificados através de soluções de ressuspensão, lise, neutralizante,

preparadora da coluna, além da coluna e solução de aluição, utilizando o protocolo QIAprep Spin

Miniprep Kit (Qiagen Company, Hilden, Alemanha, #Cat. 27104), segundo especificações do

fabricante. A partir deste procedimento, e solução eluída foi estocada a -20oC. O rendimento e a

pureza dos plasmídeos foram avaliados através do NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Scientific,

DE, EUA).

3.5.3 Plasmídeos e Produção Lentiviral

Resumidamente, 1μg pCMV-VSV-G (Addgene, Cambridge MA) e 1μg psPAX2 (Addgene,

Cambridge MA) foram combinados com 1,5μg de vetor de expressão lentiviral pLV-miR-708-5p-

Expression ou seu controle pLV-miR-Expression. A mistura foi feita em um tubo contendo 500uL de

meio de cultivo sem soro e 6 μL de TurboFect Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Waltham, MA, EUA, #Cat. R0531). A solução foi incubada a temperatura ambiente por 20 min, sendo

agitada por inversão algumas vezes. O volume então foi adicionado sobre cultura de HEK293T/17

com 50% confluência em placa de 6 poços, para o empacotamento viral, contendo 3 mL de meio

DMEM com 10% SBF e sem antibiótico. Na manhã do dia seguinte, o meio de cultura foi substituído

por novos 3mL de DMEM com 10% SBF com antibióticos previamente definidos nas condições de

cultura. O sobrenadante contendo partículas virais foi coletado 72 horas após transfecção. O

conteúdo foi filtrado com poro de 0,45μm e criopreservado a -80°C até momento da infecção.

A sequência utilizada para expressão do miR-708-5p (pLV-[hsa-miR-708-5p] expression

plasmid) foi:

AACUGCCCUCAAGGAGCUUACAAUCUAGCUGGGGGUAAAUGACUUGCACAUGAACACAACUAGA

CUGUGAGCUUCUAGAGGGCAGGGA

O desenho dos plasmídeos utilizados estão representados nas figuras 1, 2 e 3 abaixo.


31

Figura 3: Vetor de expressão da proteína de empacotamento lentiviral psPAX2. Addgene,

Cambridge MA, #Cat.12260

Figura 4: Vetor de expressão da proteína de envelope lentiviral pCMV-VSV-G. Addgene, Cambridge, MA, #Cat. 8454


32

Figura 5: Vetor de expressão controle (pLV-miRNA-Expression) e a sequência do Mirna-708-5p (pVL-[hsa-mir-708] plasmid). BioSettia, San Diego California, EUA, #Cat. mir-p495 e mir-expression-ctrl.

3.5.4 Infecção lentiviral

Células das linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 foram plaqueadas (variando entre 4x105 a 8x105

células dependendo da linhagem) em placas de seis poços contendo 2mL de meio de cultivo e após

período de aderência, foram expostas a 0,5mL de suspensão viral e centrifugadas por 30min a

2200rpm, sendo posteriormente incubadas à 37°C com 5% de CO2 em estufa umidificada por 24

horas. Decorrido o tempo, o sobrenadante foi apropriadamente descartado e foi adicionado 3mL de

meio suplementado. Após 48/96 horas este procedimento foi repetido. Ao atingir a confluência as

células foram transferidas para garrafas de 25cm3 e posteriormente, de 75cm3. Após

aproximadamente um mês de cultivo de expansão foi realizada a seleção positiva por puromicina

(1ug/uL).

3.5.5 Confirmação da transdução

A confirmação da transdução pelo miR-708-5p foi realizada por RT-qPCR, sob as mesmas

condições técnicas da RT-qPCR realizada para as amostras tumorais. Para isso, foi extraído RNA

(Trizol Reagent - Invitrogen Inc, Carsdab, CA) das linhagens transduzidas em três tempos diferentes,

garantindo uma triplicata biológica. Foi sintetizado cDNA (kit High capacity- Applied Biosystems,

Foster City, CA, EUA). Os endógenos utilizados foram RNU6B e RNU48 e como amostra calibradora

utilizou-se a linhagem de fibroblasto MRC-5.


33

3.5.6. Confirmação da autenticidade das linhagens celulares após processo de transdução

A confirmação da autenticidade das linhagens após transdução foi realizada através da

análise de marcadores STR (Short Tandem Repeats) característicos de cada linhagem celular. Estas

análises foram gentilmente reaizadas pelo Laboratório de Investigação de Paternidade do

Departamento de Genética da FMRP-USP, sob a responsabilidade do Prof Dr Aguinaldo Simões.

Foram utilizados oito marcadores para cada linhagem e os resultados obtidos foram comparados

com os marcadores disponibilizados na base de dados online da ATCC. Todas as linhagens foram

confirmadas, obtendo 100% de correspondência. Estes dados podem ser encontrados no anexo A.

3.6 Ensaios Funcionais – Crescimento Celular

3.6.1 Proliferação Celular

Neste ensaio, as células transfectadas miR-708 e V.V. foram semeadas em concentração

inicial de 2x103cel/poço em placas de 96 poços e mantidas em condições de cultura. As análises da

proliferação foram realizadas nos tempos de 24, 48 e 72, 96, 120 e 144 horas. A cada intervalo de

tempo, foi realizada a remoção do meio de cultura dos poços e foram adicionados 100μL de meio de

cultura com 5μL/poço de Resazurina (Sigma, ST. Louis, MO, USA) (0,25 mg/mL em PBS esterilizado) e

as placas incubadas por mais 4h em estufa. A leitura da absorbância de 570nm foi realizada

utilizando o aparelho iMark Microplate Absorbance reader (BioRad Laboratories, Inc, CA, EUA). Após

a leitura, as células foram fixadas com metanol 100% e coradas com Giensa (1%), foi realizada nova

leitura a 655nm para confirmação dos resultados. Os experimentos foram repetidos três vezes, em

triplicata e os resultados expressos como média ± desvio padrão.

3.6.2 Ensaio Clonogênico

Para este ensaio, foram semeadas 300 (para a linhagem SAOS-2) ou 500 (para as linhagens

HOS e MG-63) células hiperexpressando miR-708-5p ou vetor vazio por poço em placas de seis poços.

As células foram incubadas em estufa por sete dias a nove dias, tempo suficiente para a formação de

colônias.

Para visualização das colônias o meio de cultura foi descartado e as células foram fixadas

com metanol absoluto e coradas com Giemsa (1%). A contagem foi realizada com auxílio de

estereomicroscópio (40x) e foram consideradas apenas colônias com número de células maior ou

igual a 50. Os experimentos foram repetidos três vezes, em triplicata e os resultados expressos como

média ± desvio padrão.


34

3.7. Ensaios Funcionais – Migração, Invasão, Ancoragem

3.7.1 Ensaio de migração por wound healing

Os ensaios de migração in vitro foram realizados de acordo com Liang et al. (2007) com

pequenas alterações. As células transfectadas e controle foram mantidas em condições de cultivo até

confluência de 100% em placa de 12 poços e então foi realizado um risco central em cada poço

através da retirada mecânica das células nesta região com o auxílio de uma ponteira de 200μl. Assim

que realizado este procedimento, isto é, no tempo zero, o risco central foi fotografado. Após 16h ou

24h a partir do processo de lesão mecânica (de modo linhagem-dependente), as células foram

fotografadas e o software Motic Images Plus v2.0 (Motic China Group Co., Ltd) foi utilizado para

calcular a área livre de células. A taxa de migração foi calculada então como a distância em

nanômetros migrada ao longo do tempo. Os experimentos foram repetidos três vezes, em triplicata e

os resultados expressos como média ± desvio padrão.

3.7.2 Ensaio de Invasão em Matrigel ou Gelatina

Para o ensaio de invasão em matrigel ou gelatina, foi adicionado 100uL de matriz de matrigel

do kit BD BiocoatTM MatrigelTM Matrix–24 well plate (Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA) ou

gelatina (Teleostean Gelatin – Sigma Aldrich), nas concentrações de, respectivamente, 3% e 0,2%,

sob os insertos correspondentes a placa de 24 poços. Posteriormente, as células transduzidas foram

plaqueadas em uma concentração de 3X105 a 5X105 células por insertos no topo da matriz de

matrigel em meio apropriado para cada linhagem sem SBF. Na parte inferior do inserto foi

adicionado meio de cultivo com 10% de SBF, servindo como quimioatrativo. Após a incubação a 37°C

por 24 horas, as células que não transpassaram a camada de matrigel ou gelatina foram removidas

da parte superior do inserto com o uso de um swab. As células que invadiram foram fixadas com

metanol absoluto por 15 min e coradas com uma solução de Giemsa (1%). As membranas do inserto

foram então removidas, montadas em laminas de vidro com Entellan (Merk®) e fotografadas ao

microscópio de luz clara (magnificência de 40x) sendo contadas com o auxilio do software Image-J,

versão 1.48 (Abramoff et al., 2004) Os experimentos foram repetidos três vezes, em triplicata e os

resultados expressos como média ± desvio padrão.

3.7.3 Ensaio de Crescimento Independente de Ancoragem

A partir das linhagens celulares modificadas, foram plaqueadas de 5X102 a 2X103 células em

placas de 6 poços, em 1,5 mL de uma mistura (1:1) de meio de cultivo 2X e de agarose 0,6%,

adicionado sobre 1,5mL de uma mistura (1:1) de meio 2X e agarose 1,2% (meio solidificado). Foram


35

adicionadas, duas vezes por semana, 100ul de meio de cultura 1X para evitar o ressecamento da

agarose. Vinte dias após o plaqueamento das linhagens de interesse, o número de colônias (mais de

50 células) foram contadas para determinar a eficiência de formação de colônias. Protocolo

adaptado de Borowicz et al. (2014).

3.8 Forma de Análise Estatística

Para análise estatística dos dados de expressão gênica e da relação destas expressões

encontradas com os dados clínicos dos pacientes foi utilizado o programa estatístico SPSS 15.0 (SPSS

Inc. Chicago, USA), realizando-se o teste não paramétrico de Mann Whitney. Para analisar a

associação com sobrevida foi usado o teste de Kaplan Meier. Para análise dos ensaios funcionais

foram utilizados os testes T-Student ou one-way ANOVA, utilizando como pós-teste Holm-Sidack.

Sempre se considerando um valor significativo de p<0,05. Todos os ensaios funcionais foram

realizados em triplicata, com três experimentos independentes e os gráficos apresentados

representam a média e desvio padrão, considerando-se um desvio máximo entre as replicatas de 0,3.

Os gráficos de expressão estão no formato box-plot padrão representam a mediana, interquartis e

valores máximos e mínimos.

3.9 Análise in silico

Foi realizada uma análise através do software miRWalk v2.0, utilizando as bases de dados

DIANAmT, miRanda, miRDB, miRWalk, RNAhybrid, PICTAR4, PICTAR5, PITA, RNA22 e TargetScan,

visando detectar os alvos preditos para o miR-708-5p, considerando-se a região 3´UTR e um p-valor

de 0,05. Foram também verificados os genes já validados como alvos deste microRNA nesta

plataforma. Foram então selecionados os genes preditos em no mínimo 5 bases de dados, e a esta

lista foram acrescentados os genes validados. No total foram selecionados 1917genes alvos do miR-

708 pelo software miRWalk.

Esta lista foi então submetida a uma análise para inspecionar quais vias estes genes estão

inseridos. Para isso, foi utilizada a ferramenta de bioinformática DAVID – v6.7 (Database

for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), que utiliza a base de dados KEGG-Pathways

para a análise. Obtendo-se, deste modo, as principais vias que o miR-708 pode estar envolvido.

.

Resultados

_______________________________ RESULTADOS

37

4.1. Resultados Clínicos e Patológicos

Foi analisada a expressão dos genes e microRNAs de interesse em 35 amostras tumorais. As

amostras analisadas compreendem biópsias de tumores pré-quimioterapia (pré-QT) (n=15), de

metástases (n=1), recidivas (n=2) e também biópsias pós-quimioterapia neoadjuvante (pós-QT)

(n=17). Para análise de expressão, todas as amostras foram consideradas. Para análise de associação

com os dados clínicos dos pacientes apenas amostras de tumores pré-quimioterapia (pré-QT) foram

utilizadas.

Dentre as amostras de tumores pré-QT (n=15), nove amostras são provenientes de pacientes

do sexo feminino (60%), enquanto que seis amostras são provenientes de pacientes do sexo

masculino (40%). As amostras também foram divididas em pacientes pediátricos e adultos. A idade

de corte escolhida foi igual ou menor de 21 anos para os casos pediátricos, uma vez que este tipo

tumoral se estabelece principalmente na fase infanto-juvenil, e pacientes maiores que 21 anos foram

considerados como casos adultos. Assim, o número de amostras pediátricas é de 13 (86,7%),

enquanto foram coletadas duas amostras de casos considerados adultos (13,3%).

As amostras de tumores pós-QT (n=17) compreendem sete amostras femininas (41,1%) e 10

amostras masculinas (58,9%), sendo 14 amostras pediátricas (82,4%) e três amostras de pacientes

adultos (17,6%). Apenas dois casos são pareados, ou seja, apenas de dois pacientes haviam sido

coletadas tanto amostras pré-QT, quanto amostras pós-QT.

A amostra coletada de metástase é proveniente de um paciente pediátrico e do sexo

masculino, sendo uma metástase pulmonar. Ambas as amostras de recidiva são de pacientes

femininos, porém uma pediátrica e outra adulta.

As características clínicas dos pacientes que foram consideradas relevantes para o

desenvolvimento e progressão da doença foram:

Grau de malignidade tumoral, sendo graus 1 e 2 considerados tumores de baixo grau,

enquanto que 3 e 4 são características de tumores com alto grau de malignidade;

Metástase, na qual foi analisada presença ou ausência da mesma ao diagnóstico;

Amputação, considerando se foi ou não realizado este procedimento, uma vez que a

necessidade de amputação está relacionada à malignidade da doença;

Recidiva, sendo considerados casos de ausência ou presença da mesma;

Óbito, considerando-se os casos de pacientes que vieram a falecer devido à neoplasia;

Um resumo dos dados clínicos dos pacientes está apresentado no apêndice A.

Foram ainda incluidas oito amostras de osso normal. Os pacientes apresentavam as idades de 7, 10,

15, 17, 18, 27, 32 e 42 anos, sendo apenas uma do gênero feminino. Entretanto, as amostras de

_______________________________ RESULTADOS

38

pacientes com 32 e 42 anos foram excluídas de todas as análises, uma vez que tais idades, ou

próximas de, não apresentavam correspondente no grupo de amostras neoplásicas

4.2. Dados de Expressão

4.2.1. Expressão dos genes ROCK1 e ROCK2

Os dados gerais de expressão (n amostral, média, desvio-padrão, mínima, máxima, percentis)

dos grupos analisados (osso não neoplásico, pré-QT, pós-QT e linhagens celulares) para essas

quinases se encontram no apêndice B.

A expressão dos genes ROCK1 e ROCK2 encontradas nas amostras tumorais pré-QT foi

comparada àquela encontrada nas amostras de osso não neoplásico, também comparada às

linhagens celulares de OS (HOS, MG-63, SAOS-2) (Figura 6). Foi encontrada uma hipoexpressão

significativa de ROCK1 nas amostras tumorais analisadas em relação às amostras controle de osso

(p=0,01), entretanto, essa hipoexpressão não foi verificada nas linhagens celulares. Não foi

encontrada alteração de expressão de ROCK2 nas amostras e linhagens tumorais quando

comparadas aos ossos não neoplásicos.

Outro tipo de análise realizada foi a comparação entre as expressões das ROCKs entre o

grupo de amostras pré-QT ao grupo pós-QT (Figura 7). O grupo pré-QT e pós-QT demonstrou grande

semelhança de expressão de ambas as quinases, não apresentando diferença significativa.

Entretanto, devemos considerar que os grupos não eram amostras pareadas, o que pode influenciar

nos resultados encontrados.

Não foi realizada comparação entre grupos envolvendo as amostras de metástase ou recidiva

devido ao pequeno n amostral coletado.

_______________________________ RESULTADOS

39

Figura 6: (A) Expressão Relativa de ROCK1 em amostras de osso não neoplásico, amostras tumorais coletadas antes do tratamento quimioterápico (pré-QT) e três linhagens celulares de OS (HOS, MG-63, SAOS-2)

(B)Expressão Relativa de ROCK2 em amostras de osso não neoplásico, amostras tumorais coletadas antes do tratamento quimioterápico (pré-QT) e três linhagens celulares de OS (HOS, MG-63, SAOS-2) O traço representa

diferença significativa entre os grupos analisados (p<0,05).

Figura 7: (A) Expressão Relativa de ROCK1 em amostras neoplásicas pré-quimioterapia (pré-QT) e pós-quimioterapia (pós-QT). (B) Expressão Relativa de ROCK2 em amostras neoplásicas pré-quimioterapia (pré-QT) e pós-quimioterapia (pós-QT). Foram excluídos os dois casos pareados de pré-QT e pós-QT, para que a análise

estatística não fosse influenciada pela presença de amostras dependentes.

4.2.2. Expressão dos microRNAs miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584 e miR-708-5p

Os dados gerais de expressão (n amostral, média, desvio-padrão, mínima, máxima, percentis)

dos grupos analisados (osso não neoplásico, pré-QT, pós-QT e linhagens celulares) para os

microRNAs estudados se encontram no apêndice B.

As análises de expressão para todos os microRNAs estudados foram realizadas em

comparação entre os mesmos grupos analisados para os genes ROCK1 e ROCK2.

Ao comparar as amostras pré-QT e linhagens celulares com o grupo de osso não neoplásico

controle pudemos verificar que há uma hiperexpressão do miR-138 nas amostras neoplásicas, mas

não nas linhagens celulares devido a grande variação na expressão entre as linhagens. Também

encontramos uma hipoexpressão dos miR-139 e miR-708 tanto nas amostras tumorais quanto nas

_______________________________ RESULTADOS

40

linhagens celulares. Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos na expressão dos miR-

196b e miR-584 (Figura 8).

Entretanto, nenhuma diferença estatisticamente relevante foi observada na comparação

entre os grupos de amostras pré-QT e pós-QT (Figura 9).

Figura 8: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras de osso não neoplásico comparados a amostras tumorais e linhagens celulares. O traço representa diferença significativa entre os

grupos analisados (p<0,05). Amostras que apresentavam valor de expressão igual a zero para o miR-584 não foram incluídas no gráfico, porém, foram analisadas estatísticamente.

_______________________________ RESULTADOS

41

4.2.3. Correlação entre as expressões

Foi realizada uma análise de correlação entre as expressões dos genes de ROCKs e também

dos microRNAs estudados através do programa SPSS, utilizando-se o índice de correlação de

Spearman. Para este tipo de análise, todas as amostras neoplásicas deste trabalho foram utilizadas

(n=35). Com este tipo de análise pudemos demonstrar a correlação positiva entre ROCK1 e ROCK2

(p=0,003, R=0,493). Verificou-se também uma correlação negativa entre ROCK2 e o miR-138

(p=0,028, R= -0,377). Outro dado interessante foi a correlação entre ROCK1 e o miR-196b (p=0,045,

R=0,345), também predita neste trabalho, porém trata-se de uma correlação positiva, o que não é

esperado para microRNAs e genes. Além disso, pudemos observar uma correlação positiva entre os

miR-196b e miR-708 (p=0,037, R=0,359) (Tabela I).

Figura 9: Expressão dos miR-138 (A), miR139 (B), miR-196b (C), miR-584 (D) e miR-708 (E) em amostras pré-quimioterapia (pré-QT) comparadas a amostras pós-quimiterapia (pós-QT).

_______________________________ RESULTADOS

42

Tabela I: Valores do índice de correlação de Spearman, nível de significância das correlações (valor p) e n

amostral entre miR-138, miR-139, miR-196b, miR-584, miR-708-5p, ROCK1 e ROCK2.

ROCK1 ROCK2 miR138 miR139 miR196b miR584 miR708

Sp

ea

rma

n's

rh

o

ROCK1

Coeficiente de

Correlação 1,000 0,493

** 0,049 0,287 0,345

* 0,301 0,252

Sig. (2-tailed) 0,003 0,784 0,100 0,045 0,083 0,150

N 35 35 34 34 34 34 34

ROCK2

Coeficiente de

Correlação 0,493

** 1,000 -0,377

* -0,165 0,121 -0,070 -0,099

Sig. (2-tailed) 0,003 0,028 0,352 0,497 0,692 0,578

N 35 35 34 34 34 34 34

miR138

Coeficiente de

Correlação 0,049 -0,377

* 1,000 0,140 -0,033 0,227 0,045

Sig. (2-tailed) 0,784 0,028 0,429 0,851 0,197 0,799

N 34 34 34 34 34 34 34

miR139

Coeficiente de

Correlação 0,287 -0,165 0,140 1,000 0,254 0,199 0,288

Sig. (2-tailed) 0,100 0,352 0,429 0,148 0,260 0,099

N 34 34 34 34 34 34 34

miR196b

Coeficiente de

Correlação 0,345

* 0,121 -0,033 0,254 1,000 -0,092 0,359

*

Sig. (2-tailed) 0,045 0,497 0,851 0,148 0,605 0,037

N 34 34 34 34 34 34 34

miR584

Coeficiente de

Correlação 0,301 -0,070 0,227 0,199 -0,092 1,000 0,055

Sig. (2-tailed) 0,083 0,692 0,197 0,260 0,605 0,757

N 34 34 34 34 34 34 34

miR708

Coeficiente de

Correlação 0,252 -0,099 0,045 0,288 0,359

* 0,055 1,000

Sig. (2-tailed) 0,150 0,578 0,799 0,099 0,037 0,757

N 34 34 34 34 34 34 34

_______________________________ RESULTADOS

43

4.3. Associação com Diagnóstico e evolução clínica dos pacientes

4.3.1. Associação com Sobrevida Global

Para a construção do gráfico e análise de sobrevida global (Kaplan-Meier) foram utilizados as

expressões de ROCK1, ROCK2 e microRNAs estudados das amostras de tumores pré-QT,

considerando-se para contagem dos meses da data do diagnóstico até o último retorno do paciente

ou data do óbito. Pudemos verificar que houve uma associação significativa do miR-138, cuja maior

expressão foi encontrada relacionada aos casos de menor sobrevida (p=0,042). Não foram

observadas associações das quinases ou microRNAs estudados com a sobrevida. Entretanto, ambas

quinases e o miR-708 apresentaram uma tendência de uma menor sobrevida quando há uma baixa

expressão (Figura 10).

Figura 10: Curvas de sobrevida global relativas a expressões de ROCK1 (A), ROCK2 (B), miR-138 (C), miR-139 (D), miR-196b (E), miR-584 (F) e miR-708 (G). As linhas azuis representam uma expressão abaixo da mediana

enquanto que as linhas verdes representam uma expressão acima da mediana.

_______________________________ RESULTADOS

44

4.3.2. Associação dos dados de expressão e características clínicas e biológicas dos pacientes

A partir dos resultados obtidos através da técnica de RT-qPCR, utilizamos o software SPSS

para analisar a relação da expressão dos genes ROCKe dos microRNAs em questão nas amostras de

tumores pré-QT com os dados clínicos dos pacientes.

Para que a análise estatística fosse válida, consideramos as características cujos

agrupamentos mantinham um n mínimo de 3 amostras. Sendo assim, para ROCK1 e ROCK2 foram

consideradas as características Grau de Malignidade, Metástase, Recidiva, Amputação e Óbito,

enquanto que para análise dos microRNAs foram consideradas Grau de Malignidade, Metástase e

Óbito, pois para uma das amostras não foi a possível síntese de RNA específica para microRNA. O

resultado desta análise para ROCK1 e 2 está apresentado na tabela II, enquanto dos microRNAs se

encontram na tabela III. As tabelas resumem os valores de média, mediana, mínima e máxima da

expressão de cada variável analisada, assim como o valor p e n dos agrupamentos.

Nenhuma associação clínica foi encontrada, tanto para as quinases quanto para os

microRNAs estudados, entretanto, deve ser considerado o pequeno n amostral disponível.

Tabela II: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos genes ROCK1 e ROCK2,

apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de significância (valor

p) para cada grupo.

Grau Malignidade Metástase Recidiva Amputação Óbito

Baixo Grau

Alto Grau

Ausente Presente Ausente Presente Não

Realizada Realizada Ausente Presente

RO

CK

1

média 0,87 0,50 0,68 0,58 0,57 0,86 0,63 0,64 0,53 0,80

mediana 0,97 0,43 0,62 0,42 0,50 0,97 0,56 0,66 0,43 0,60

mínima 0,30 0,17 0,30 0,17 0,17 0,54 0,26 0,17 0,17 0,41

máxima 1,47 0,97 1,07 1,47 1,47 1,07 1,47 1,07 1,07 1,47

n 5 9 7 8 12 3 12 3 9 5

p valor 0,13 0,20 0,15 0,77 0,21

RO

CK

2

média 2,97 1,62 2,13 2,01 1,92 2,67 2,03 2,23 1,60 2,75

mediana 3,01 1,43 1,57 1,37 1,48 3,01 1,50 1,52 1,10 2,40

mínima 0,54 0,70 0,54 0,70 0,70 0,54 0,54 0,72 0,54 1,31

máxima 5,96 2,92 4,45 5,96 5,96 4,45 5,96 4,45 4,45 5,96

n 5 9 7 8 12 3 12 3 9 5

p valor 0,39 0,56 0,56 0,89 0,21

_______________________________ RESULTADOS

45

Tabela III: Análise das associações clínicas obtidas a partir da expressão dos miR-138, miR-139, miR-196b, miR-

584 e miR-708, apresentando valores de média, mediana, mínima, máxima, tamanho amostral (n) e nível de

significância (valor p) para cada grupo.

Grau Malignidade Metástase Óbito

Baixo Grau Alto Grau Ausente Presente Ausente Presente

miR

-138

média 1,18 2,98 1,60 3,08 2,25 2,75

mediana 0,53 1,58 1,49 1,50 0,89 2,73

mínima 0,29 0,27 0,27 0,46 0,27 0,52

máxima 3,35 9,06 3,35 9,06 9,06 8,63

n amostral 4 9 6 8 8 5

p valor 0,35 0,61 0,14

miR

-139

média 2,00 2,18 1,76 2,40 1,59 3,32

mediana 2,04 1,30 1,96 1,33 1,34 2,15

mínima 1,33 0,35 0,45 0,35 0,35 1,33

máxima 2,58 11,10 2,58 11,10 2,33 11,10


p valor 0,12 0,37 1,00

miR

-196

b

média 66,55 41,73 57,17 52,90 43,99 79,97

mediana 67,45 32,93 36,41 40,66 28,82 113,96

mínima 15,91 14,45 14,45 17,99 15,91 41,70

máxima 115,39 113,96 124,45 113,96 70,86 124,45


p valor 0,35 0,90 0,38

miR

-584

média 0,04 0,17 0,05 0,18 0,04 0,28

mediana 0,05 0,06 0,06 0,04 0,02 0,06

mínima 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05

máxima 0,07 1,11 0,09 1,11 0,09 1,11


p valor 0,53 0,70 0,19

miR

-708

média 0,28 0,35 0,32 0,38 0,21 0,63

mediana 0,30 0,20 0,30 0,22 0,16 0,53

mínima 0,12 0,06 0,09 0,06 0,06 0,34

máxima 0,40 1,45 0,69 1,45 0,35 1,45


p valor 0,44 0,52 0,14

_______________________________ RESULTADOS

46

4.4. Transdução das linhagens de OS

4.4.1. Escolha do microRNA de interesse

O miR-708 foi o escolhido para estudos de sua modulação. A seleção do microRNA de

interesse foi feita, primeiramente, analisando os dados de expressão das amostras tumorais quando

comparadas ao controle não neoplásico. Observamos que os miR-138, miR-139 e miR-708

apresentavam desregulação da expressão nas amostras neoplásicas quando comparadas as amostras

controle saudável. Porém, apesar da associação do miR-138 com os dados de sobrevida e sua

correlação com ROCK2, apenas os miR-139 e miR-708 apresentavam diferença também nas linhagens

celulares, característica primordial para os estudos in vitro, favorecendo a escolha dos miR-139 ou

miR-708. Uma revisão na literatura mostrou que ambos microRNAs já haviam sido relacionados com

o processo metastático em outros tipos tumorais (Krishnan et al.,2013; Shen et al.,2012; Yue et

al.,2015; Li et al.,2015; Lin et al.,2014), mas não foram encontradas informações em osteossarcoma.

Deste modo, ambos microRNAs apresentavam grande potencial de estudo, porém o miR-708

mostrou-se mais relevante.

4.4.2. Confirmação da eficiência de transdução

As linhagens celulares de osteossarcoma HOS, MG-63 e SAOS-2 foram transduzidas, através

de lentivírus, com um vetor de expressão vazio (V.V.) ou com vetor de expressão carregando a

sequência para aumentar a expressão do miR-708-5p (miR-708). Após este processo, foi extraído

RNA em três tempos diferentes e sintetizado o cDNA de cada linhagem. Foi mensurada a expressão

do miR-708-5p em cada uma das linhagens através de RT-qPCR, visando confirmar a eficiência da

transdução (Figura 11). Em todas as linhagens não houve diferença entre as linhagens N.T. e V.V.,

sendo encontrada diferença significativa ao comparar as linhagens miR-708 e V.V. com valor de

p=3X10-4 para linhagem HOS, p=0,015 para linhagem MG-63 e p=3x10-3 para linhagem SAOS-2.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Krishnan%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24158791

_______________________________ RESULTADOS

47

Como pode ser verificado nos gráficos acima, todas as linhagens obtiveram sucesso na

transfecção. O fold change entre as linhagens não transduzidas, linhagens com vetor vazio e

linhagens com vetor para miR-708 podem ser observados na tabela IV abaixo:

Tabela IV: Fold change entre as linhagens transduzidas (V.V. e miR-708) de não transduzidas (N.T.),

demonstrando a eficiência da transdução.

Figura 11: Expressão Relativa do miR-708-5p nas linhagens HOS (A), MG-63 (B) e SAOS-2 (C)

transduzidas com vetor vazio (V.V.), não transduzidas (N.T.), e transduzidas com vetor para

miR-708 (miR-708). O traço representa p<0,05.

Fold Change V.V./N.T. miR-708/V.V. miR-708/N.T.

HOS 0,68 113,38 77,44

MG-63 0,33 5,65 1,85

SAOS-2 0,42 43,59 18,18

_______________________________ RESULTADOS

48

A linhagem MG-63 foi a que obteve menor sucesso de transdução, uma vez que seu fold

change foi de 5,65 em relação ao V.V. Entretanto, em uma busca na literatura foram encontrados

trabalhos com o mesmo tipo de transdução lentiviral visando a hiperexpressão de determinado

miRNA em linhagens celulares que apresentaram fold change semelhante ou menor que 5,65 (Lei et

al., 2015; Li et al., 2014; Liu et al., 2014). Deste modo, a linhagem MG-63 também foi utilizada para

realização dos ensaios funcionais.

4.4.3. Expressão das quinases ROCKs nas linhagens transduzidas

Pudemos verificar que a expressão relativa das quinases ROCKs entre as linhagens N.T. (não

transduzida), V.V. (vetor vazio) e miR-708 (Figura 12) não apresentou diferença significativa (p>0,05)

em nenhuma das linhagens celulares estudadas.

Figura 12: Expressão relativa dos genes ROCK1 (A) e ROCK2 (B) nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2 N.T., V.V. e miR-

708.

_______________________________ RESULTADOS

49

4.5. Ensaios Funcionais

4.5.1. Ensaio de proliferação

Todas as linhagens celulares deste trabalho foram submetidas ao ensaio funcional de

proliferação, nos tempos de 24h, 48h, 72h, 96h, 120h e 144h. A taxa de proliferação nas linhagens

com hiperexpressão miR-708 foi mantida em todos os tempos, não obtendo diferença estatística

(p>0,05) com as linhagens vetor controle correspondentes, sugerindo que o miR-708 provavelmente

não exerce influência na capacidade de replicação destas células (Figura 13).

Figura 13: Taxa de proliferação das linhagens HOS, MG63 e SAOS-2 com hiperexpressão do miR-708 nos tempos de 24h a 144h. Não houve diferença significativa quando comparadas

as linhagens com vetor controle com os mesmos tempos.

_______________________________ RESULTADOS

50

4.5.2. Ensaio clonogênico

O ensaio clonogênico foi realizado nas três linhagens celulares estudadas, HOS, MG-63 e

SAOS-2. Não se encontrou diferença estatística entre as linhagens vetor vazio (V.V.) e miR708 em

nenhuma das linhagens (Figura 14), indicando que o miR-708-5p pode não estar envolvido na

capacidade das células neoplásicas estudadas de formação de clones.

Figura 14: Número de colônias relativas apresentadas pelas linhagens HOS (A), MG-63 (B) e SAOS-2 (C) miR-708 em relação às linhagens vetor vazio (V.V.) correspondente. Não houve

diferença estatística.

_______________________________ RESULTADOS

51

4.5.3. Ensaio migração Wound Healing

Foi realizado o ensaio de migração Wound Healing nas linhagens HOS, MG-63 e SAOS-2

transduzidas por lentivirus para avaliar o efeito da hiperexpressão do miR-708-5p na capacidade de

migração de tais células (Figura 15). Pode-se observar diferença significativa entre os grupos vetor

vazio (V.V.) e miR-708 apenas na linhagem SAOS-2 (p=0,02), onde o miR-708 induziu uma diminuição

na taxa de migração.

Figura 15: Fotos e gráficos correspondentes ao ensaio de migração wound healing realizado nas linhagens HOS V.V. e miR708 (A, B), MG-63 V.V. e miR-708 (C,D) e SAOS-2 V.V. e miR-708 (E,F).

_______________________________ RESULTADOS

52

4.5.4. Ensaio de Invasão em Matrigel e Gelatina

As três linhagens celulares controle vetor vazio e miR-708 foram utilizadas neste ensaio, em

dois tipos de matrizes: matrigel e gelatina (Figura 16). Foi possível observar um comportamento

distinto tanto entre as linhagens quanto entre os tipos de matrizes.

Na matriz composta por Gelatina, o miR-708 induziu uma diminuição nas taxas de invasão

das linhagens HOS (p=0,01) e SAOS-2 (p=0,02). Entretanto, este miRNA induziu um comportamento

diferente na matriz de Matrigel, uma vez que a linhagem MG-63 apresentou um aumento nas taxas

de invasão quando comparadas ao controle V.V. (p=0,008).

Apesar de não ter sido encontrada diferença significativa, pudemos também observar uma

tendência ao aumento da invasão nas linhagens HOS (p=0,096) e MG-63 (0,612) nas matrizes de

matrigel e gelatina, respectivamente. Deste modo, podemos observar um comportamento ambíguo

da linhagem HOS dependente da matriz.

Já a linhagem SAOS-2 miR-708 também apresentou uma tendência a redução do potencial

invasivo na matriz de matrigel (0,149), mostrando o mesmo comportamento, independente da

matriz.

_______________________________ RESULTADOS

53

Figura 16: Taxa de invasão relativa nas linhagens HOS (A), MG-63(B) e SAOS-2(C) transduzidas com vetor vazio (V.V.) ou miR-708. O traço representa p<0,05.

_______________________________ RESULTADOS

54

4.5.5. Ensaio Crescimento Independente de Ancoragem (Soft Agar)

Neste ensaio, apenas a linhagem SAOS-2 foi utilizada, uma vez que esta é a única linhagem

tumorigênica in vivo. O mir-708 não alterou o comportamento desta linhagem de modo significativo

(p=143), entretanto, pudemos observar que a hiperexpressão do miR-708 induziu uma tendência à

um aumento no número de colônias quando comparada ao vetor vazio controle (Figura 17).

Figura 17: Figura e Gráfico representando o número de colônias relativo obtidas através de crescimento independente de ancoragem na linhagem SAOS-2 vetor vazio (V.V.) e miR-708.

_______________________________ RESULTADOS

55

4.6. Análise In Silico

A partir das análises realizadas nos programas miRWalk (v2.0) e DAVID (v6.7), foram obtidos

os processos biológicos nas quais o miR-708 pode estar envolvido. Na Tabela VI foram resumidas as

vias de maior interesse, o número de genes preditos como alvos do miR-708 participantes de cada

via e o p-valor.

Tabela V: Vias e processos biológicos nos quais o miR-708-5p está envolvido, segundo base de dados

KEGG-Pathways (Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes).

Categoria Vias/Processos Biológicos Número de genes p-valor Genes

KEGG_PATHWAY hsa05200:Pathways in cancer

(Vias em Câncer) 40 0,0084

TRAF1, DCC, E2F2, WNT5B, PTGS2, PGF, STK36, WNT3A, ARNT2, FGF11, FOXO1, PTEN, SUFU, MAX, ACVR1B, CDKN2B, PAX8, WNT8B, AKT2, PRKCA, FZD8, BCR, RALBP1, CBL, SMAD4, FZD1, SMAD3, FGF23, FADD, STK4, FZD4, MAPK1, CCDC6, NRAS, CDKN1A, FZD10, GSK3B, JAK1, PTCH1, IKBKB

KEGG_PATHWAY hsa04514:Cell adhesion

molecules (CAMs) (Moléculas de Adesão Celular)

20 0,0094

PVR, GLG1, PTPRF, SELL, NFASC, CD276, NLGN2, SDC4, PDCD1LG2, PDCD1, SDC3, NRCAM, NCAM1, SIGLEC1, SDC1, CD34, CD274, CNTNAP2, HLA-DOA, JAM3, CD28

KEGG_PATHWAY hsa04310:Wnt signaling

pathway (Via de Sinalização WNT)

21 0,019

PRKCA, FZD8, WNT5B, VANGL1, BTRC, WNT3A, VANGL2, FZD1, SMAD4, PPP3R2, SMAD3, FZD4, MAP3K7, FZD10, CCND2, GSK3B, PRICKLE2, NFAT5, CAMK2D, NFATC2, WNT8B

KEGG_PATHWAY hsa04010:MAPK signaling

pathway (Via de Sinalização MAPK)

31 0,039

ZAK, GNA12, FGF11, PPP3R2, GNG12, SRF, MAP3K7, MAX, ACVR1B, PAK2, MAP3K2, RASGRP4, NFATC2, AKT2, PRKCA, CACNA1I, PTPRR, FGF23, STK4, MAPK1, DUSP4, NRAS, RPS6KA1, RAP1A, CACNA1E, RAP1B, CACNA1C, IKBKB, MAP3K13, PLA2G5, PLA2G2F

KEGG_PATHWAY hsa04520:Adherens junction

(Junção Aderente) 12 0,044

MAP3K7, PTPRB, PTPRJ, MAPK1, ACVR1B, PTPRF, WASF3, SMAD4, SMAD3, SSX2IP, YES1, IQGAP1

Discussão

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

57

Os casos com maior taxa de mortalidade em OS são aqueles que apresentam metástase,

sendo assim, é essencial ampliar o conhecimento sobre a regulação deste processo, visando também

identificar possíveis alvos terapêuticos. Além disso, a evolução no tratamento dos OSs atingiu um

platô, não havendo opção para casos que não apresentam uma boa resposta ao tratamento padrão

(Zhang et al., 2015). Deste modo, torna-se primordial a procura por novos alvos terapêuticos.

Dois possíveis alvos estudados neste trabalho foram as quinases ROCK1 e ROCK2. Tais

quinases são efetores da GTPase Rho, envolvida no controle do citoesqueleto e, consequentemente,

no processo de motilidade celular. Ambas as quinases foram encontradas desreguladas em diversos

tipos tumorais, e frequentemente associadas ao processo metastático (Sahai & Marshall, 2003).

Desta forma, o presente trabalho teve como um de seus objetivos mostrar os níveis de expressão

destes genes em amostras de pacientes diagnosticados com OS.

Estudos relatam que tanto ROCK1 quanto ROCK2 apresentaram-se hiperexpressas em

amostras de OS. Liu e colaboradores (2011) encontraram, através de técnicas de imunohistoquímica,

uma hiperexpressão de ROCK1 em 51 amostras de OS, além de confirmar esta hiperexpressão por

western-blotting em duas linhagens celulares (U-2OS e KHOS) e seis amostras de tecido neoplásico.

Esta análise utilizou como amostras controles duas linhagens celulares de osteoblasto (HOB-c e

NHOST). O trabalho de Wang e colaboradores (2015) encontrou uma hiperexpressão, através da

técnica RT-qPCR, tanto de ROCK1 quanto de ROCK2 utilizando 91 amostras de OS quando

comparadas a 24 amostras de tecido não neoplásico adjacente utilizadas como controle. Além disso,

trabalhos demonstraram que a inibição de ROCK1 e 2, seja por técnicas de siRNA, pela utilização de

drogas específicas ou pelo estudo de microRNAs que apresentem as quinases ROCKs como alvo,

diminuem taxas de proliferação e invasão celular, levando à uma regressão tumoral em OS (Wang et

al., 2015; Zucchini et al., 2013).

No presente trabalho, encontramos uma hipoexpressão de ROCK1 nas amostras tumorais

pré-QT quando comparadas ao controle não neoplásico. Além disso, a expressão de ROCK2 não

apresentou diferença estatística quando comparada as amostras controle. Ao analisar os dados de

expressões e suas possíveis associações com os dados clínicos dos pacientes, podemos perceber que

uma menor expressão tanto de ROCK1 como de ROCK2 tende a se associar a uma menor sobrevida.

Entretanto, os níveis proteicos dessas quinases devem ser investigados a fim de reforçar os dados

aqui encontrados.

A incongruência encontrada entre os resultados aqui apresentados e os dados da literatura

pode ser devida aos diferentes tipos de amostras utilizadas como controle nos trabalhos. Enquanto

que no presente trabalho foram utilizadas seis amostras de osso não neoplásico, o trabalho de Liu e

colaboradores (2011) utilizaram como referência linhagens de osteoblasto e Wang e colaboradores

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

58

(2015) fizeram uso de amostras adjacentes à neoplasia. Além das diferentes técnicas utilizadas

(imunohistoquímica, Western Blotting e RT-qPCR).

No uso de amostras de osso como controle, deve ser considerado que o tecido ósseo é um

tecido dinâmico, com capacidade de remodelagem ao longo da vida. Deste modo, a proporção de

células (osteoblastos, osteoclastos, condrócitos, células progenitoras mesenquimais, além de células

hematopoiéticas e endoteliais) e fase mineral (como fosfato de cálcio) varia consideravelmente

conforme a região óssea, além da idade do paciente (Kartsogiannis et al., 2004; Alfranca et al., 2015).

Por outro lado, o uso de linhagens celulares de osteoblastos não expõe a variabilidade celular

encontrada no tecido ósseo. No presente trabalho optou-se pela utilização de amostras de osso de

pacientes que não desenvolveram OS, com o objetivo de garantir a heterogeneidade encontrada no

tecido ósseo. Além disso, buscou-se selecionar ossos controle com idades semelhantes às amostras

de OS, visando minimizar os efeitos da idade nesta análise, além de serem preferencialmente

coletadas amostras de ossos longos, como fêmur e úmero. Porém, o tamanho amostral ainda é um

fator limitante, além do fato das amostras de osso normal e OS não serem pareadas, como acontece

nos dados encontrados na literatura.

Além das diferentes amostras controle utilizadas nos trabalhos que estudaram a expressão

das ROCKs, as amostras neoplásicas per se podem apresentar grande variabilidade, uma vez que não

foi relatada desregulação de nenhuma via especifica que leve ao desenvolvimento do OS, mas sim

diferentes alterações genéticas (Rivera-Valentin et al., 2015). Deste modo, o estudo de coortes

amostrais diferentes podem apresentar expressões gênicas distintas.

O tipo de matriz extracelular (MEC) é um fator relevante e que deve ser considerado nestas

análises. O OS é um tipo tumoral cujo desenvolvimento é dependente também da composição da

MEC (Alfranca et al., 2015). Rubio e colaboradores (2010, 2013 e 2014) demonstraram a influência da

MEC no desenvolvimento do OS, destacando a importância da composição do ambiente ósseo no

desenvolvimento deste tipo tumoral.

A MEC não é apenas importante para o desenvolvimento da neoplasia aqui estudada, mas

também especificamente para a regulação da via Rho/ROCK. Tem sido observado que o câncer de

ovário apresenta uma tendência ao desenvolvimento de metástases em tecidos moles. McGrail e

colaboradores (2014) demonstraram que a ativação ou inibição de ROCK apresenta diferentes efeitos

na migração deste tipo tumoral dependendo da rigidez encontrada na matriz extracelular,

ressaltando que estudos na densidade da matriz são essenciais para o entendimento da

mecanosensibilidade mediada pela via Rho/ROCK. Em linhagens celulares de glioblastoma

knockdown para ROCK1 foi demonstrado que há uma diminuição da migração wound healing sobre

superfícies cobertas por laminina, enquanto que ao retirar a laminina, estas taxas de migração

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

59

aumentam (Mertsch & Thanos, 2014), enfatizando a influência da composição da matriz extracelular

na regulação destas quinases.

Uma matriz extracelular mais macia favorece uma migração mesenquimal, enquanto que o

aumento da rigidez desta matriz induz uma migração do tipo ameboide. A variação entre estes tipos

de migração é mutuamente excludente e controlada pela via Rho-ROCK, no caso da migração

ameboide, ou Rac, no caso da migração mesenquimal (Sahai & Marshall, 2003; Amin et al., 2013).

Han e colaboradores (2015) demonstraram hiperexpressão de PAK7 (p21-activated kinase 7) em

amostras tumorais e na linhagem celular SAOS-2 de OS. Tal quinase é um membro da família

Rac/Cdc42, podendo indicar que a migração em OS é controlada por Rac e, consequentemente, uma

baixa ativação de ROCKs.

Foi demonstrado que em OS há uma hiperexpressão de Cyr61, e que tal molécula promove a

transição epitélio-mesenquimal e induz a migração neste tipo tumoral através da ativação de alvos

como MEK (MAP kinase kinase), ERK (extracelullar signal-regulated kinase) e Raf1 (MAP kinase kinase

kinase) (Hou et al., 2014), efetores da via das MAPK (mitogen-activated protein kinase). Uma inibição

direta das proteínas ROCKs pode ser realizada através da ativação de Raf-1 (c-Raf) (Amin et al., 2013).

Portanto, existe uma possibilidade das ROCKs estarem sendo inibidas por Raf-1 pela via das MAPKs

em nossa coorte de amostras, entretanto, as técnicas aqui utlizadas não apropriadas para validar

essa hipótese e mais análises devem ser feitas.

Deste modo, apesar das quinases ROCK se encontrarem hiperexpressas em diversos tipos

tumorais e sua inibição estar relacionada à diminuição nas taxas de migração (Sadok,et al., 2015; Oku

et al., 2014) a interação com a matriz extracelular, além da correlação inversa com a via Rac e sua

inativação direta por Raf-1 poderiam justificar a hipoexpressão de ROCK1 encontrada nas amostras

de OS aqui estudadas.

O presente trabalho também avaliou o perfil de expressão de cinco miRNAs em amostras

tumorais e linhagens celulares de OS, sendo que nenhum deles haviam sido descritos previamente

em OS. A hipoexpressão do miR-138 foi previamente demonstrada em tumores como do pâncreas

(Yu et al., 2015) e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (Islam et al., 2014), e em

câncer de pulmão sua hiper-regulação foi associada a uma diminuição na migração e maior quimio- e

radio- sensibilidade (Han et al., 2015; Yang et al., 2014). Entretanto, este miRNA foi encontrado

hiperexpresso em câncer de bexiga (Pignot et al., 2013). Chan e colaboradores (2012) encontraram

uma hiperexpressão do miR-138 em células tronco de glioblastoma, além de uma associação desta

hiperexpressão com tumores recorrentes e com menores taxas de sobrevida. No presente trabalho

foi demonstrada uma hiperexpressão deste miRNA em amostras de tumores pré-QT quando

comparadas ao controle não neoplásico. Além disso, esse miRNA demonstrou uma correlação

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

60

negativa com ROCK2, dando suporte aos trabalhos de Jiang e colaboradores (2010) e Liu e

colaboradores (2011), que demonstraram que ROCK2 é um alvo do miR-138 em carcinoma de células

escamosas de língua. Outro dado interessante apresentado neste trabalho é a associação do miR-138

com a sobrevida dos pacientes avaliados (p=0,042), sendo que as maiores expressões deste miRNA

estão associadas as menores taxas de sobrevida.

Já o miR-139 foi encontrado hipoexpresso em tumores pré-QT de OS, assim como nas

linhagens celulares, o que condiz com a literatura. Krishnan e colaboradores (2013) encontraram

baixos níveis de expressão deste miRNA em câncer de mama, além da associação desta com tumores

mais metastáticos. Tal miRNA foi predito para diversos alvos relacionados ao processo de migração,

incluindo as cascatas de sinalização Rho e MAPK/PI3K. Em carcinoma hepatocelular também foi

verificada uma diminuição do miR-139, além de sua associação com os casos metastáticos. Neste

estudo os autores ressaltam a relação deste miRNA com transição epitélio-mesenquimal (Qiu et al.,

2015). Também foi demonstrada uma hipoexpressão do miR-139 em câncer de pulmão (Xu et al.,

2015) e câncer coloretal (Zhang et al., 2014). Deste modo, apesar de não apresentar associação aos

casos metastáticos em OS, sua hipoexpressão pode estar associada a este processo também neste

tipo tumoral, sendo necessários mais estudos.

Ainda, a hiperexpressão do miR-196b foi associada à uma menor taxa de apoptose e ao pior

prognóstico em câncer coloretal (Mo et al., 2015; Ge et al., 2014), e seu perfil de expressão permitiu

uma predição da resposta a quimioterapia em pacientes com adenocarcinoma de pulmão,

ressaltando seu papel como biomarcador (Saito et al., 2014; Li et al., 2014). Zhang e colaboradores

(2014) demonstraram um aumento dos miR-196a e miR-196b em amostras de tecido e soro de

pacientes com OS. Entretanto, no presente trabaho não foram demonstradas diferenças entre as

amostras de pré-QT e osso não neoplásico, apesar da evidente alta taxa de expressão deste miRNA

em tais tecidos. Além disso, a expressão do miR-196b apresentou uma correlação positiva com

ROCK1. O trabalho aqui apresentado havia encontrado, através de uma análise na base de dados

miRWalk, que esta quinase seria um alvo predito deste miRNA. Apesar da análise de Spearman ter

mostrado uma correlação entre estas moléculas, trata-se de uma correlação positiva, que não é

comumente esperada para uma interação mRNA/miRNA.

Por outro lado, poucos estudos têm demonstrado o perfil de expressão do miR-584 em

neoplasias. A hiperexpressão deste miRNA foi encontrada em câncer retal (Gaedcke et al., 2012) e

em amostras de glioma, mas não em linhagens celulares (Wang et al., 2014). Contrariamente, foi

verificada uma hipoexpressão do miR-584 em carcinoma renal (Ueno et al., 2011). No trabalho aqui

apresentado o miR-584 mostrou uma expressão muito baixa e em algumas amostras e linhagens não

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

61

foi possível detectar sua expressão, e uma alta variação de expressão nos ossos não neoplásicos, não

apresentando diferença significativa entre os grupos neoplásicos e normal.

No presente trabalho, também foi encontrada uma diminuição nos níveis de expressão do

miR-708 em amostras de tumores pré-QT e linhagens celulares de OS. Uma busca na literatura

mostrou que a expressão do miR-708 varia conforme os tipos tumorais estudados. Por exemplo, este

miRNA se mostrou hipoexpresso em glioblastoma, sendo considerado um supressor tumoral neste

tipo de neoplasia (Guo et al., 2013), assim como foi encontrado atenuado em câncer renal (Saini et

al., 2011). Já em câncer colo retal foi encontrada hiperexpressão deste miRNA (Lei et al., 2014) e o

mesmo foi verificado em carcinoma de bexiga (Song et al., 2013).

Tais trabalhos também demonstram a atuação do miR-708 nos processos de proliferação e

apoptose, sendo que sua hipoexpressão reduziu a proliferação e induziu apoptose em câncer de

bexiga (Song et al., 2013) e câncer coloretal (Lei et al., 2014) enquanto que, em câncer renal (Saini et

al., 2011) e glioblastoma (Guo et al., 2013), a indução de sua expressão levou à diminuição na taxa de

proliferação e a um aumento na apoptose. Entretanto, ao induzir a expressão deste miRNA em

linhagens de OS, não foram encontrados efeitos anti-proliferativos ou uma diminuição na capacidade

clonogênica das células, indicando que o miR-708 pode não estar atuando de forma significativa no

controle do ciclo celular ou indução da apoptose em células de OS.

Por outro lado, trabalhos têm descrito o miR-708 como associado ao processo metastático

em alguns tipos tumorais, como câncer de ovário (Lin et al., 2015) ou câncer coloretal (Pizzini et al.,

2013). Ao realizar o ensaio de migração wound healing com linhagens hiperexpressando o miR-708,

foi observada redução da taxa de migração na linhagem SAOS-2. Porém, não foi encontrada

diferença estatística entre os grupos controle V.V. e miR-708 nas linhagens HOS e MG-63.

No ensaio de invasão, a linhagem SAOS-2 manteve o comportamento encontrado na

migração, uma vez que o miR-708 reduziu a taxa de invasão na matriz de gelatina. Resultados

semelhantes foram encontrados em carcinoma hepatocelular e câncer de ovário, onde a indução do

miR-708 levou a uma diminuição tanto da migração wound healing quanto da invasão em linhagens

celulares (Li et al., 2015; Lin et al., 2014). Ao contrário dos resultados encontrados no ensaio de

migração wound healing, o miR-708 induziu uma resposta de invasão diferenciada nas linhagens HOS

e MG-63. Na linhagem HOS, o miR-708 diminuiu a taxa invasiva em gelatina. Já na linhagem MG-63, o

miR-708 aumentou as taxas de invasão na matriz de matrigel.

Sabe-se que o matrigel é um composto de proteínas da MEC extraído do tumor Englebreth-

Holm-Swarm de camundongo, e que apresenta não apenas proteínas estruturais, como laminina,

colágeno IV e enactina, mas também foram identificadas fatores de crescimento e seus ligantes,

como FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor) e IGF-1 (insulin growth factor 1)

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

62

além de proteínas de baixo peso molecular (Hugues et al.,2010; Vukicevic et al.,1992). Já a gelatina é

um composto extraído de estruturas como tendões, ossos, ligamentos e pele, apresentando

principalmente proteínas de alto peso molecular presentes no colágeno, que favorecem a adesão das

células (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).

Já foi discutida anteriormente a importância da interação com a MEC para o

desenvolvimento do OS. Desta forma, o comportamento encontrado nas linhagens celulares aqui

estudadas é condizente com as características deste tipo tumoral. A partir disso, podemos concluir

que o papel do miR-708 no comportamento celular é também dependente da interação com este

fator externo, papel ressaltado pelos diferentes comportamentos apresentados pelas células

dependendo da MEC utilizada. Uma vez que as MEC de gelatina e matrigel apresentam compostos

diferentes, podemos inferir que o miR-708 pode estar regulando a interação da célula tumoral com

esses fatores, estimulando diferentes respostas.

Resultados semelhantes foram encontrados no ensaio de Crescimento Independente de

Ancoragem, onde as células são colocadas em um terceiro tipo de matriz, a agarose, e crescem sem

contato com um substrato de apoio, ou seja, de modo independente de ancoragem. Neste ensaio

realizado com a SAOS-2, pôde-se observar um tênue aumento do crescimento neste tipo de matriz

nas células com hiperexpressão do miR-708, o que não foi observado no ensaio clonogênico comum.

Além disso, capacidade de crescimento independente de ancoragem é fundamental para o

estabelecimento de um tumor secundário, o passo final do processo metastático.

Desta forma, os ensaios funcionais realizados no presente trabalho demonstram que, em OS,

o miR-708 pode não estar relacionado com a capacidade de proliferação celular, controle do ciclo ou

apoptose, mas se relaciona principalmente à processos ligados ao desenvolvimento de metástases,

destacando-se a interação com a MEC. São necessários estudos mais aprofundados nestas vias para

se estabelecer a função deste miRNA para o OS.

Através do software miRWalk®, foi verificado que ROCK2 seria um alvo predito do miR-708-

5p. Entretanto, a análise pelo índice de correlação de Spearman não indicou uma correlação

significante entre essas moléculas. Além disso, a análise da expressão de ROCK1 e ROCK2 nas

linhagens transduzidas não mostrou uma diminuição destas quinases quando o miR-708-5p era

induzido. Entretanto, para confirmar que não há correlação entre estas moléculas ainda seriam

necessários estudos proteicos ou com outros marcadores moleculares.

Considerando os resultados aqui obtidos, ainda que o miR-708-5p não esteja regulando tal

quinase neste tipo tumoral, sugere-se que este miRNA pode estar envolvido com os processos de

migração, invasão ou ancoragem através da regulação de outros mRNA, uma vez que levou a

alterações no comportamento celular, principalmente de forma dependente da MEC.

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

63

Com objetivo de encontrar as principais vias e processos biológicos que o miR-708 poderia

estar envolvido, foi realizada uma nova análise in silico através do software miRWalk® e a ferramenta

bioinformática DAVID®. A partir destas análises foram encontradas algumas vias que poderiam estar

relacionadas ao desenvolvimento e progressão tumoral.

Uma das vias encontradas foi a via de sinalização WNT (Wingless). Sabe-se que esta via tem

papel fundamental em diversos processos do desenvolvimento embrionário, sendo bem conservada

entre as espécies, além de sua influência na tumorigênese ser bem estabelecida (Akiyama, 2000). Cai

e colaboradores (2014), em uma revisão sobre a via WNT especificamente em OS, descrevem

diversos trabalhos que demonstraram uma superexpressão de diferentes ligantes e receptores desta

via, tanto em amostras tumorais quanto em linhagens celulares, indicando que pode haver uma

sinalização autócrina e parácrina em OS para ativação da via WNT. Além disso, trabalhos têm

demonstrado que a inibição desta leva a uma diminuição do potencial invasivo e alterações em

moléculas de ancoragem em linhagens de OS (Hoang et al., 2004a; Lin et al., 2013).

Uma vez que o miR-708 encontra-se hipoexpresso nas amostras estudadas, e analisando os

dados de predição, podemos sugerir que a hiperexpressão de diferentes componentes da via WNT

pode estar sendo regulada pelo miR-708, como os genes WNT3a, WNT5b ou receptores Frizzled 1 e

4, que já foram relatados hiperexpressos nas linhagens de OS estudadas neste trabalho (Ma et al.,

2013; Chen et al., 2008; Hoang et al., 2004b). Sendo assim, o reestabelecimento desse miRNA

poderia alterar membros dessa via e, consequentemente, os processos de invasão e ancoragem,

como visto nos ensaios funcionais.

Outra via de destaque encontrada na análise in silico é a das MAPKs (mitogen-actvated

protein kinase). Esta via é ativada através da sinalização do oncogene Ras, encontrado downstream a

fatores de crescimento como PDGF e VEGF, e que tem como principais moléculas efetoras RAF1, MEK

e ERK (Young et al., 2009). Sasaki e colaboradores (2011) encontraram que esta via está ativa em OS

através da análise dos alvos RAF1 e MEK, e demonstraram que a inibição desta leva a uma

diminuição na proliferação. Outros trabalhos relacionaram a inibição da via MAPK não apenas a uma

redução das taxas proliferativas, mas também a uma diminuição da invasão neste tipo tumoral

(Zhang et al., 2013; Miao et al., 2014).

Além do possível papel da molécula RAF1 na inibição direta de ROCK em OS discutido

anteriormente, outros membros desta via já foram estudados em OS e através das análises in silico

aqui realizadas, estão sendo relacionados ao miR-708. Um destes alvos é Rap1, cuja supressão

através da indução do miR-708 levou a uma diminuição da invasão, migração e adesão em câncer de

ovário (Lin et al., 2014). Outro alvo do miR-708 que ganha destaque é MAPK7, que foi apontado

___________________________________________________________________________DISCUSSÃO

64

como um oncogene em OS e quando silenciado, reduziu a proliferação, invasão e migração celular

(Tesser-Gamba et al., 2015).

Ao avaliar os resultados obtidos pela análise in silico juntamente aos resultados dos ensaios

funcionais realizados neste trabalho, a associação do miR-708 com os processos biológicos das

Junções Aderentes, assim como Moléculas de Adesão Celular ganham grande destaque. O

envolvimento do miR-708 nestes processos poderia corroborar com os resultados aqui apresentado,

uma vez que a regulação de moléculas de adesão é dependente da interação da célula com a MEC,

justificando as diferentes respostas encontradas nos ensaios de invasão, que variaram tanto de uma

linhagem para outra como de uma MEC para outra.

Ao explorar as moléculas apontadas na via das Junções Aderentes, o gene WASF3 (WAVE3)

teve destaque. Este gene é um membro da família de proteínas da Síndrome de Wiskott Aldrich

(Wiskott Aldrich syndrome family of proteins – WASP), composta por 5 membros, dos quais dois são

efetores de Cdc42, enquanto que os outros três membros (WAVE1, WAVE2 e WAVE3/WASF3) são

efetores de Rac1. As moléculas Cdc42 e Rac1 são GTPases da família Rho, sendo que as vias

Rho/ROCK e Rac/WAVE são vias de controle de actina e miosina mutuamente excludentes (Takenawa

& Miki, 2001; Lane et al., 2014; Sadok & Marshall, 2014). Shen e colaboradores (2014) demonstraram

a hiperexpressão de WASF3 em sete amostras de OS quando comparadas a seus tecidos não

tumorais pareados, além da regulação desta molécula pelo miR-217.

Deste modo, o miR-708 pode também estar atuando na regulação desta molécula, e

consequentemente, nos processos de invasão e migração, assim como ancoragem, através de uma

via alternativa a Rho/ROCK, podendo justificar não apenas os dados obtidos nos ensaios funcionais,

mas também os resultados de expressão encontrados.

Entretanto, é imprescindível destacar que essas hipóteses são especulações com base em

análises in silico, e que todos os dados devem ser confirmados e validados através de experimentos

biológicos.

Conclusão

________________________ CONCLUSÃO

66

A partir dos resultados obtidos neste estudo, foi possível verificar uma hipoexpressão de

ROCK1 na coorte de amostras tumorais, além de diferentes perfis de expressão de cinco microRNAs

em OS. O miR-138 apresentou uma hiperexpressão nas amostras tumorais quando comparadas ao

grupo controle, e os miR-139 e miR-708 apresentaram-se hipoexpressos nas amostras neoplásicas.

Especificamente o miR-138 obteve uma associação com a sobrevida dos pacientes, sendo que os

maiores níveis de expressão foram relacionados as menores sobrevidas. Além disso, através dos

estudos de correlações, pudemos confirmar que ROCK2 é um alvo do miR-138.

Desta forma, podemos sugerir que tanto ROCK1, quanto os miR-138, miR-139 e miR-708

apresentam um potencial de utilização como biomarcadores de OS. Especialmente o miR-138 que

demonstra inclusive um papel de biomarcador de prognóstico, devido a sua associação com a

sobrevida dos pacientes.

O miR-708, através dos ensaios funcionais, demonstrou estar envolvido no controle

processos que levam ao desenvolvimento de metástase neste tipo tumoral, ganhando grande

destaque na interação com a MEC, pois não induziu alterações na proliferação celular ou capacidade

clonogênica, mas reduziu a migração e diminuiu ou aumentou as taxas de invasão dependendo da

matriz utilizada.

Uma vez que o OS e o processo metastático apresentam uma relação intrínseca com a MEC,

o estudo deste miRNA nesta neoplasia se torna de extrema importância. No presente trabalho

foram apontadas, por estudos in silico, três principais vias nas quais o miR-708 pode estar atuando

em OS: WNT, MAPK e Junção Aderente. Desta forma, este estudo contribuiu para a descoberta de

novas funções do miR-708 em OS e ressalta a relevância deste miRNA na tumorigênese do OS e em

processos ligados a metástase, principal causa da mortalidade encontrada em OS.

.

Referências

Bibliográficas

__________________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

68

Abramoff, M.D., Magalhaes, P.J., Ram, S.J. (2004). "Image Processing with ImageJ".

Biophotonics International, volume 11, issue 7, pp. 36-42.

Akiyama, T. (2000). Wnt/b-catenin signaling. Cytokine & Growth Factor Reviews. Vol 11, pp

273-282.

Alfranca A., Martinez-Cruzado L., Tornin J. et al. (2015).

Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cell Mol Life Sci. Vol 72, n 16, PP

3097-113. doi: 10.1007/s00018-015-1918-y.

Amano, M., Chihara, K., Nakamura, N. et al. (1999). The COOH Terminus of Rho-kinase

Negatively Regulates Rho-kinase Activity. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 274, n 45,

pp. 32418–32424.

Amano, M., Ito, M., Kimura, K., et al. (1996). Phosphorylation and Activation of Myosin by

Rho-associated Kinase (Rho-kinase). The Journal Of Biological Chemistry. Vol. 271, n 34, pp. 20246–

20249.

Amano, M., Kaneko, T., Maeda, A., et al. (2003). Identification of Tau and MAP2 as novel

substrates of Rho-kinase and myosin phosphatase. Journal of Neurochemistry, 2003, vol 87,pp 780–

790, DOI:10.1046/j.1471-4159.2003.02054.x

Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. (2010). Rho-Kinase/ROCK: A Key Regulator of the

Cytoskeleton and Cell Polarity. Cytoskeleton, vol 67, pp 545–554, DOI: 10.1002/cm.20472.

Amin, E., Dubey, N., Zhang, S., et al. (2013). Rho-kinase: regulation, (dys)function, and

inhibition. Biol. Chem. Vol 394, n 11, pp 1399–1410. DOI 10.1515/hsz-2013-0181

An, L., Liu, Y., Wu, A., Guan, Y. (2013). microRNA-124 Inhibits Migration and Invasion by

Down- Regulating ROCK1 in Glioma. PLoS ONE. vol 8, n 7, DOI:10.1371/journal.pone.0069478.

Bagga S., Bracht J., Hunter S., et al.,(2005). Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs Results in

Target mRNA Degradation. Cell , vol 122 , n 4 , pp 553 – 563.

Bartel, D.P. (2004). MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function – Review.

Cell. vol 116, pp 281–297.

Bielack,S.S., Kempf-Bielack, B., Delling, G., et al. (2002). Prognostic Factors in High-Grade

Osteossarcoma of the Extremities or Trunk: An Analysis of 1,702 Patients Treated on Neoadjuvant

Cooperative Osteossarcoma Study Group Protocols. Journal of Clinical Oncology. vol 20, n 3, pp 776-

790.

Borowicz S., Van Scoyk M., Avasarala S. et al. (2014). The Soft Agar Colony Formation Assay. J

Vis Exp. Vol 92. e51998. doi: 10.3791/51998.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Alfranca%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25935149

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Martinez-Cruzado%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25935149

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tornin%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25935149

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25935149

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bracht%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16122423

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hunter%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16122423

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Borowicz%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25408172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Van%20Scoyk%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25408172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Avasarala%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25408172

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=The+Soft+Agar+Colony+Formation+Assay+Borowicz

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=The+Soft+Agar+Colony+Formation+Assay+Borowicz


69

Brennecke, P., Arlt, M.J.E., Campanile, C., et al. (2013). CXCR4 antibody treatment suppresses

metastatic spread to the lung of intratibial human osteossarcoma xenografts in mice. Clin Exp

Metastasis. DOI 10.1007/s10585-013-9632-3.

Cai Y., Cai T. & Chen Y. (2014). Wnt pathway in osteosarcoma, from oncogenic to therapeutic.

J Cell Biochem. Vol 115, n 4, pp 625-31. doi: 10.1002/jcb.24708.

Cai, H., Lin, L., Cai, H., et al.(2014). Combined MicroRNA-340 and ROCK1 mRNA Profiling

Predicts Tumor Progression and Prognosis in Pediatric Osteosarcoma. International Journal of

Molecular Sciences, vol 15, n 1,pp 560–573. http://doi.org/10.3390/ijms15010560

Calin, G.A. & Croce, C.M. (2006). MicroRNA-Cancer Connection: The Beginning of a New Tale.

Cancer Res, vol 66, pp 7390-7394.

Calin, G.A., Sevignani, S., Dumitru, C.D. et al. (2004). Human microRNA genes are frequently

located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. PNAS, vol 101, n 9, pp 2999–3004

Chan X.H., Nama S., Gopal F. et al. (2012).

Targeting glioma stem cells by functional inhibition ofa prosurvival oncomiR-

138 in malignant gliomas. Cell Rep. Vol 2, n 3, pp 591-602. doi: 10.1016/j.celrep.2012.07.012.

Chen K., Fallen S., Abaan H.O. et al. (2008).

Wnt10b induces chemotaxis of osteosarcoma and correlates with reduced survival. Pediatr Blood

Cancer. Vol 51, n 3, pp 349-55. doi: 10.1002/pbc.21595.

Coleman M.L., Sahai E.A., Yeo M., et al. (2001). Membrane blebbing during apoptosis results

from caspase-mediated activation of ROCK I. Nat Cell Biol. Vol 3, n 4, pp 339-45.

Croft, D.R. & Olson, M.F. (2006). The Rho GTPase Effector ROCK Regulates Cyclin A, Cyclin D1,

and p27Kip1 Levels by Distinct Mechanisms. Molecular And Cellular Biology, vol 26, n 12 , pp 4612–

4627.

Croft, D.R. & Olson, M.F. (2008). Regulating the Conversion between Rounded and Elongated

Modes of Cancer Cell Movement. Cancer Cell, vol 14, pp 349-351, DOI: 10.1016/j.ccr.2008.10.009.

Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. (2011). miRWalk - database: prediction of possible

miRNA binding sites by "walking" the genes of 3 genomes, Journal of Biomedical Informatics, vol 44,

pp 839-7.

Federman, N., Bernthal,N., Eilber, F.C., Tap, W.D. (2009). The Multidisciplinary Management

of Osteossarcoma. Current Treatment Options in Oncology. vol 10, pp 82–93, DOI:10.1007/s11864-

009-0087-3.

Feng Y., LoGrasso P.V., Defert O. et al. (2015). Rho Kinase (ROCK) Inhibitors and

Their Therapeutic Potential. J Med Chem. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5b00683

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cai%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24190862

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cai%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24190862

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24190862


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chan%20XH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22921398

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nama%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22921398

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gopal%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22921398

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Targeting+Glioma+Stem+Cells+by+Functional+Inhibition+of+a+Prosurvival+OncomiR-138+in+Malignant+Gliomas

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chen%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18465804

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fallen%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18465804

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Abaan%20HO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18465804

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wnt10b+Induces+Chemotaxis+of+Osteosarcoma+and+Correlates+With+Reduced+Survival

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wnt10b+Induces+Chemotaxis+of+Osteosarcoma+and+Correlates+With+Reduced+Survival

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Coleman%20ML%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11283606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sahai%20EA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11283606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yeo%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11283606

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Feng%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26486225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=LoGrasso%20PV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26486225

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Defert%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26486225



70

Fletcher, C.D., Unni, K.K., Mertens, F., et al. (2002). World Health Organization Classification

of Tumours: Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. Lyon, France, IARC Press.

Fujimura K., Choi S., Wyse M. et al. (2015). Eukaryotic Translation Initiation Factor 5A (EIF5A)

Regulates Pancreatic Cancer Metastasis by Modulating RhoA and Rho-associated Kinase (ROCK)

Protein Expression Levels. J Biol Chem. pii: jbc.M115.687418

Gaedcke J., Grade M., Camps J. et al. (2012). The rectal cancer microRNAome--microRNA

expression in rectal cancer and matched normal mucosa. Clin Cancer Res. Vol 18, n 18, pp 4919-30.

Ge,J., Chen, Z., Li,R. et al. (2014). Upregulation of microRNA-196a and microRNA-196b

cooperatively correlate with aggressive progression and unfavorable prognosis in patients with

colorectal cancer. Ge et al. Cancer Cell International, 14:128.

Gill, J., Ahluwalia, M.K., Geller, D., Gorlick, R. (2013). New targets and approaches in

osteossarcoma. Pharmacology & Therapeutics vol 137, pag 89–99.

Gorlick, R.& Khanna, C. (2010). Osteossarcoma. Journal of Bone and Mineral Research. vol.

25, n 4, pp 683–691, DOI: 10.1002/jbmr.77.

Gorlick, R., Anderson, P., Andrulis, I., et al. (2003). Biology of Childhood Osteogenic Sarcoma

and Potential Targets for Therapeutic Development: Meeting Summary. Clin Cancer Res. vol 9 pp

5442-5453.

Gu R., Sun Y.F., Wu M.F. et al.,(2015). Biological roles of microRNA-140 in tumor growth,

migration, and metastasis of osteosarcoma in vivo and in vitro. Tumor Biology. DOI

10.1007/s13277-015-3801-8

Guo, P., Lan, J., Ge, J., et al. (2013). miR-708 acts as a tumor suppressor in human

glioblastoma cells. ONCOLOGY REPORTS 30: 870-876

Han, K., Chen, X., Bian, N., et al. (2015). MicroRNA profiling identifies MiR-195 suppresses

osteosarcoma cell metastasis by targeting CCND1. Oncotarget. vol 6, n 11,pp 8875–8889.

Han, K., Zhou, Y., Gan, Z.-H., et al. (2014). p21-activated kinase 7 is an oncogene in human

osteosarcoma. Cell Biology International. Vol 38, n 12, pp 1394–1402.

http://doi.org/10.1002/cbin.10351

Han, L., Fu, T., Lin, Y. et al. (2015). MicroRNA-138 negatively regulates non-small cell lung

cancer cells through the interaction with cyclin D. Tumor Biol. DOI 10.1007/s13277-015-3757-8

Hayden, J.B. & Hoang, B.H. (2006). Osteossarcoma: Basic Science and Clinical Implications.

Orthop Clin N Am. vol 37, pp1 – 7, DOI:10.1016/j.ocl.2005.06.004.

Hernando E.(2007). microRNAs and cancer: role in tumorigenesis, patient classification and

therapy. Clin Transl Oncol. vol 9, pp 155-160. DOI 10.1007/s12094-007-0029-0

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fujimura%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26483550

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Choi%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26483550

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wyse%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26483550

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eukaryotic+Translation+Initiation+Factor+5A+(EIF5A)+Regulates+Pancreatic+Cancer+Metastasis+by+Modulating+RhoA+and+Rho-associated+Kinase+(ROCK)+Protein+Expression+Levels

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gaedcke%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22850566

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Grade%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22850566

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Camps%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22850566

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gaedcke+miR-584

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sun%20YF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26219893

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wu%20MF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26219893

http://dx.doi.org/10.1007/s13277-015-3801-8

http://dx.doi.org/10.1007/s13277-015-3801-8


71

Hoang B.H., Kubo T., Healey J.H. et al. (2004) B. Expression of LDL receptor-

related protein 5 (LRP5) as a novel marker for disease progression in high-gradeosteosarcoma. Int J

Cancer. Vol 109, n 1, pp 106-11.

Hoang B.H., Kubo T., Healey J.H. et al. (2004)A.

Dickkopf 3 inhibits invasion and motility of Saos-2 osteosarcoma cells by modulating the Wnt-beta-

catenin pathway. Cancer Res. Vol 64, n 8, pp 2734-9.

Hou, C., Lin, F., Hou, S. et al. (2014). Cyr61 promotes epithelial-mesenchymal transition and

tumor metastasis of osteossarcoma by Raf-1/MEK/ERK/Elk-1/TWIST-1 signaling pathway. Molecular

Cancer. Vol 13, n 236.

Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. (2009). Bioinformatics enrichment tools: paths toward

the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. Vol 37, n 1, pp 1-13.

Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. (2009). Systematic and integrative analysis of large

gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. Vol 4, n 1, pp 44-57

Hughes C.S., Postovit L.M. & Lajoie G.A. (2010). Matrigel: A complex protein mixture required

for optimal growth of cell culture. Proteomics. Vol10, n 9, pp1886-90. doi: 10.1002/pmic.200900758.

Hurst D.R., Edmonds M.D. & Welch D.R. (2009). Metastamir - the field of metastasis-

regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. vol 69, n 19, pp 7495–7498. doi:10.1158/0008-

5472.CAN-09-2111

Hwang, H.W. & Mendell, J.T. (2006). MicroRNAs in cell proliferation, cell death, and

tumorigenesis. British Journal of Cancer. vol 94, pp 776 – 780.

Isakoff M.S., Bielack S.S., Meltzer P. et al.(2015). Osteosarcoma: Current Treatment and

a Collaborative Pathway to Success. J Clin Oncol. Vol 33, n 27, pp 3029-35. doi: 10.1200/

JCO.2014.59.4895

Islam, M., Datta, J., Lang, J. et al. (2014).Down regulation of RhoC by microRNA-138 results in

de-activation of FAK, Src and Erk1/2 signaling pathway in head and neck squamous cell carcinoma.

Oral Oncol. Vol 50, n 5, pp 448–456. doi:10.1016

Jang, J.S., Jeon, H., Sun, Z., et al. (2012). Increased miR-708 Expression in NSCLC and Its

Association with Poor Survival in Lung Adenocarcinoma from Never Smokers. Clin Cancer Res. vol 18,

n 13, pp 3658–3667, DOI:10.1158/1078-0432.CCR-11-2857.

Jiang, L., Liu, X., Kolokythas, A. et al. (2010). Down-regulation of the Rho GTPase signaling

pathway is involved in the microRNA-138 mediated inhibition of cell migration and invasion in tongue

squamous cell carcinoma. International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. Vol 127, n

3, pp 505–512. http://doi.org/10.1002/ijc.25320

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hoang%20BH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15087387

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kubo%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15087387

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Healey%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15087387

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=EXPRESSION+OF+LDL+RECEPTOR-RELATED+PROTEIN+5+(LRP5)+AS+A+NOVEL+MARKER+FOR+DISEASE+PROGRESSION+IN+HIGH-GRADE+OSTEOSARCOMA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=EXPRESSION+OF+LDL+RECEPTOR-RELATED+PROTEIN+5+(LRP5)+AS+A+NOVEL+MARKER+FOR+DISEASE+PROGRESSION+IN+HIGH-GRADE+OSTEOSARCOMA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hoang%20BH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15087387

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kubo%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15087387

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Healey%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15087387

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Dickkopf+3+Inhibits+Invasion+and+Motility+of+Saos-2+Osteosarcoma+Cells+by+Modulating+the+Wnt-%01-Catenin+Pathway

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hughes%20CS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20162561

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Postovit%20LM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20162561

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lajoie%20GA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20162561

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Isakoff%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26304877

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bielack%20SS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26304877

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Meltzer%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26304877

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Osteosarcoma%3A+Current+Treatment+and+a+Collaborative+Pathway+to+Success+Isakoff


72

Jiang, L., Liu, X., Kolokythas, A., et al. (2010). Down-regulation of the Rho GTPase signaling

pathway is involved in the microRNA-138 mediated inhibition of cell migration and invasion in tongue

squamous cell carcinoma. Int J Cancer. vol 127, n 3, pp 505–512, DOI:10.1002/ijc.25320.

Kamai, T., Tsujii, T., Arai,K., et al.(2003). Significant Association of Rho/ROCK Pathway with

Invasion and Metastasis of Bladder Cancer. Clin Cancer Res. vol 9, pp 2632-2641.

Kartsogiannis, V. & Wah Ng, K. (2004). Cell lines and primary cell cultures in the study of bone

cell biology. Molecular and Cellular Endocrinology. Vol 228, pp 79–102.

Kempf-Bielack,B.K., Bielack, S.S, Ju¨rgens, H., et al. (2005). Osteossarcoma Relapse After

Combined Modality Therapy: An Analysis of Unselected Patients in the Cooperative Osteossarcoma

Study Group (COSS). J Clin Oncol. vol 23, pp 559-568, DOI: 10.1200/JCO.2005.04.063.

Kong, Y.W., Ferland-McCollough,d., Jackson, T.J., Bushell, M. (2012). microRNAs in cancer

management. Lancet Oncol. vol 13, pp 249–58.

Kosako, H., Yoshida, T., Matsumura, F., et al. (2000). Rho-kinase/ROCK is involved in

cytokinesis through the phosphorylation of myosin light chain and not ezrin/radixin/moesin proteins

at the cleavage furrow. Oncogene. vol 19,pp 6059-6064.

Krishnan, K., Steptoe, A. L., Martin, H. C et al. (2013). miR-139-5p is a regulator of metastatic

pathways in breast cancer. RNA, 19(12), 1767–1780. doi:10.1261/rna.042143.113

Kroiss A., Vincent S., Decaussin-Petrucci M. et al. (2015). Androgen-regulated microRNA-

135a decreases prostate cancer cell migration and invasion through

downregulating ROCK1 and ROCK2. Oncogene. vol 34, n 22, pp 2846-55. doi: 10.1038/onc.2014.222

Kumar, S. (2012). Cell-Extracellular Matrix Mechanobiology in Cancer. Elsevier B.V. pp 143-

155.

Lan, H., Lu, H., Wang, X., & Jin, H. (2015). MicroRNAs as Potential Biomarkers in Cancer:

Opportunities and Challenges. BioMed Research International. 125094.

http://doi.org/10.1155/2015/125094

Lane J., Martin T., Weeks H.P. et al. (2014).

Structure and role of WASP and WAVE in Rho GTPase signalling in cancer. Cancer Genomics

Proteomics. Vol 11, n 3, pp 155-65.

Lane, J., Martin, T.A., Watkins, G., et al. (2008). The expression and prognostic value of ROCK

I and ROCK II and their role in human breast cancer. International Journal Of Oncology. vol 33, pp

585-593, DOI: 10.3892/ijo_00000044.

Lei, SL., Zhaou, H., Yao, H.L., et al. (2014). Regulatory roles of microRNA-708 and microRNA-

31 in proliferation, apoptosis and invasion of colorectal cancer cells. Oncology Letters. Vol 8, pp

1768-1774.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kroiss%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25065599

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vincent%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25065599

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Decaussin-Petrucci%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25065599

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lane%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24969695

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Martin%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24969695

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Weeks%20HP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24969695

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Structure+and+Role+of+WASP+and+WAVE+in+Rho+GTPase+Signalling+in+Cancer

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Structure+and+Role+of+WASP+and+WAVE+in+Rho+GTPase+Signalling+in+Cancer


73

Lei, SL., Zhaou, H., Yao, H.L., et al. (2014). Regulatory roles of microRNA-708 and microRNA-

31 in proliferation, apoptosis and invasion of colorectal cancer cells. Oncology Letters. Vol 8, pp

1768-1774.

Li G., Yang F., Xu H. et al. (2015). MicroRNA-708 is downregulated in hepatocellular

carcinoma and suppresses tumor invasion and migration. Biomed Pharmacother. Vol 73, pp 154-9.

doi: 10.1016/j.biopha.2015.05.010.

Li, N., Tang, A., Huang, S. et al. (2013). MiR-126 suppresses colon cancer cell proliferation and

invasion via inhibiting RhoA/ROCK signaling pathway. Mol Cell Biochem. vol 380, pp 107–119, DOI

10.1007/s11010-013-1664-0.

Li, X., Shi, Y., Yin, Z.et al. (2014). An eight-miRNA signature as a potential biomarker for

predicting survival in lung adenocarcinoma. Journal of Translational Medicine, 12, 159.

doi:10.1186/1479-5876-12-159

Li, Y., Zhang, M., Chen, H., et al. (2010). Ratio of miR-196s to HOXC8 mRNA Correlates with

Breast Cancer Cell Migration and Metastasis. Cancer Res. vol 70, n 20, pp 7894–7904,

DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-1675.

Liang, C., Park A. & Guan, J. (2007). In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive

method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. Vol 2, n 2, pp 329-33.

Lim L.P., Lau N.C., Garrett-Engele P. Microarray analysis shows that

some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. Vol 433, n 7027, pp769-73.

Lin, C. H., Guo, Y., Ghaffar, S., McQueen, P., Pourmorady, J., Christ, A., … Hoang, B. H. (2013).

Dkk-3, a Secreted Wnt Antagonist, Suppresses Tumorigenic Potential and Pulmonary Metastasis in

Osteosarcoma. Sarcoma,2013, 147541. http://doi.org/10.1155/2013/147541

Lin, K., Yeh, Y., Chuang, C., et al. (2015). Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708

to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B.Nat Commun.;6:5917. doi:

10.1038/ncomms6917.

Lin, K.-T., Yeh, Y.-M., Chuang, C.-M., Yang, S. Y., Chang, J.-W., Sun, S.-P., … Wang, L.-H. (2015).

Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through

targeting Rap1B. Nature Communications. Vol 6, 5917. http://doi.org/10.1038/ncomms6917

Lin, S., Chiang, A., Chang, D., Ying, S. (2008). Loss Of Mir-146a Function In Hormone-

Refractory Prostate Câncer. Rna. Vol 14, pp 417–424.

Liu, X., Choy, E., Hornicek, F.J., et al. (2011). ROCK1 as a Potential Therapeutic Target in

Osteossarcoma. Journal Of Orthopaedic Research August, pp 1259-1266.

Liu, X., Choy, E., Hornicek, F.J., et al. (2011). ROCK1 as a Potential Therapeutic Target in

Osteossarcoma. Journal Of Orthopaedic Research August, pp 1259-1266.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26211597

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yang%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26211597

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xu%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26211597

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=MicroRNA-708+is+downregulated+in+hepatocellular+carcinoma+and+4+suppresses+tumor+invasion+and+migration

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lim%20LP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15685193

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lau%20NC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15685193

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Garrett-Engele%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15685193

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs

http://doi.org/10.1155/2013/147541

http://doi.org/10.1038/ncomms6917


74

Liu, X., Wang, C., Chen, Z. et al. (2011). MicroRNA-138 suppresses epithelial–mesenchymal

transition in squamous cell carcinoma cell lines. Biochemical Journal. Vol 440, n 1, pp 23–31.

http://doi.org/10.1042/BJ20111006

Lopez-Camarillo, C., Marchat, L. A., Arechaga-Ocampo, E., et al. (2012). MetastamiRs: Non-

Coding MicroRNAs Driving Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular

Sciences.Vol 13, n 2, pp 1347–1379. http://doi.org/10.3390/ijms13021347

Lu J., Getz G., Miska E.A. et al. (2005). MicroRNA expression profiles classify human cancers.

Nature. Vol 435, n 7043, pp 834-8.

Lu, P., Weaver, V.M., Werb, Z. (2012). The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer

progression. J. Cell Biol. Vol. 196, n 4, pp 395–406, DOI:10.1083/jcb.201102147.

Lu, Y.C., Chang, J. T., Liao, C.-T., et al. (2014). OncomiR-196 promotes an invasive phenotype

in oral cancer through the NME4-JNK-TIMP1-MMP signaling pathway. Molecular Cancer. Vol 13,n

218. http://doi.org/10.1186/1476-4598-13-218

Ma, Y., Ren, Y., Han, E. Q., Li, H., Chen, D., Jacobs, J. J., … Li, T.-F. (2013). Inhibition of the

Wnt-β-catenin and Notch signaling pathways sensitizes osteosarcoma cells to

chemotherapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. Vol 431, n 2, pp 274–279.

http://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.12.118

Manikandan, J., Aarthi1, J.J., Kumar, S.D., Pushparaj, P.N. (2008). Oncomirs: The potential

role of non-coding microRNAs in understa nding cancer. Bioinformation, Vol 2, n 8, pp 330-334.

Matsumura, F. (2005). Regulation of myosin II during cytokinesis in higher eukaryotes. Trends

in Cell Biology Vol 15, n 7, pp 371-377.

McGrail, D. J., Kieu, Q. M. N., & Dawson, M. R. (2014). The malignancy of metastatic ovarian

cancer cells is increased on soft matrices through a mechanosensitive Rho–ROCK pathway. Journal of

Cell Science, vol 127, n 12, pp 2621–2626. doi:10.1242/jcs.144378

Mertsch, S. & Thanos, S. (2013). Opposing Signaling of ROCK1 and ROCK2 Determines the

Switching of Substrate Specificity and the Mode of Migration of Glioblastoma Cells. Mol Neurobiol.

DOI: 10.1007/s12035-013-8568-6.

Mertsch, S., & Thanos, S. (2014). Opposing Signaling of ROCK1 and ROCK2 Determines the

Switching of Substrate Specificity and the Mode of Migration of Glioblastoma Cells. Molecular

Neurobiology, vol 49, n 2, pp 900–915. doi:10.1007/s12035-013-8568-6

Miao J.H., Wang S.Q., Zhang M.H. et al. (2014). Knockdown of galectin-

1 suppresses the growth and invasion of osteosarcoma cells through inhibition of the

MAPK/ERK pathway. Oncol Rep. Vol 32, n 4, pp 1497-504. doi: 10.3892/or.2014.3358.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lu%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15944708

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Getz%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15944708

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Miska%20EA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15944708

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers+Lu+2005

http://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.12.118

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Miao%20JH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25069486

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20SQ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25069486

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25069486

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Knockdown+of+galectin-1+suppresses+the+growth+and+invasion+of+osteosarcoma+cells+through+inhibition+of+the+MAPK%2FERK+pathway


75

Mo, J.-S., Alam, K. J., Kang, I.-H. et al. (2015). MicroRNA 196B regulates FAS-mediated

apoptosis in colorectal cancer cells. Oncotarget, 6(5), 2843–2855

Morgan-Fisher, M., Wewer, U.M., Yoneda, A. (2013). Regulation of ROCK Activity in Cancer.

Journal of Histochemistry & Cytochemistry. vol 61, n 3, pp 185–198. DOI:

10.1369/0022155412470834.

Nakagawa, O., Fujisawa, K., Ishizaki, T., et al. (1996). ROCK-I and ROCK-II, two isoforms of

Rho-associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase in mice. Federation of European

Biochemical Societies Letters. Vol 392, pp 189-193.

Oku,Y., Tareyanagi, C., Takaya, S. et al. (2014). Multimodal Effects of Small Molecule ROCK

and LIMK Inhibitors on Mitosis, and Their Implication as Anti- Leukemia Agents. PLoS ONE. vol 9, n

3,DOI:10.1371/journal.pone.0092402Ottaviani & Jaffe, 2009

Oku,Y., Tareyanagi, C., Takaya, S. et al. (2014). Multimodal Effects of Small Molecule ROCK

and LIMK Inhibitors on Mitosis, and Their Implication as Anti- Leukemia Agents. PLoS ONE vol 9, n

3,DOI:10.1371/journal.pone.0092402

Ottaviani G. & Jaffe N. (2009). The epidemiology of osteosarcoma. Cancer Treat Res. Vol 152,

pp 3-13. doi: 10.1007/978-1-4419-0284-9_1.

Pignot G., Cizeron-Clairac G., Vacher S. et al. (2013). microRNA expression profile in

a large series of bladder tumors: identification of a 3-miRNA signature

associated with aggressiveness of muscle-invasive bladder cancer. Int J Cancer. Vol 132, n 11, pp

2479-91. doi: 10.1002/ijc.27949.

Pizzini, S., Bisognin, A., Mandruzzato, S., et al. (2013). Impact of microRNAs on regulatory

networks and pathways in human colorectal carcinogenesis and development of metastasis . BMC

Genomics, 14:589.

Qiu,G., Lin, Y., Zhang, H. et al. (2015). miR-139-5p inhibits epithelialemesenchymal transition,

migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells by targeting ZEB1 and ZEB2. Biochemical

and Biophysical Research Communications, 1-7.

Rivera-Valentin R. K., Zhu, L.,Hughes, D.P.M. (2015). Bone Sarcomas in Pediatrics: Progress in

Our Understanding of Tumor Biology and Implications for Therapy. Pediatr Drugs. vol 17, pp 257–

271. DOI 10.1007/s40272-015-0134-4

Rubio R., Abarrategi A., Garcia-Castro J. et al. (2014).

Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem

cells. Stem Cells. Vol 32, n 5, PP 1136-48. doi: 10.1002/stem.1647.

Rubio R., García-Castro J., Gutiérrez-Aranda I. et al (2010). Deficiency in p53 but not

retinoblastoma induces the transformation of mesenchymal stem cells in vitro and initiates

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ottaviani%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20213383

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jaffe%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20213383


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pignot%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23169479

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Cizeron-Clairac%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23169479

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vacher%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23169479

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=microRNA+expression+profile+in+a+large+series+of+bladder+tumors%3A+Identification+of+a+3-miRNA+signature+associated+with+aggressiveness+of+muscle-invasive+bladder+cancer

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rubio%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24446210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Abarrategi%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24446210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Garcia-Castro%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24446210

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bone+Environment+is+Essential+for+Osteosarcoma+Development+from+Transformed+Mesenchymal+Stem+Cells


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Garc%C3%ADa-Castro%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20442289

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Guti%C3%A9rrez-Aranda%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20442289


76

leiomyosarcoma in vivo. Cancer Res. Vol 70, n 10, pp 4185-94. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-

4640.

Rubio R., Gutierrez-Aranda I., Sáez-Castillo AI. El al (2013). The differentiation stage of p53-

Rb-deficient bone marrow mesenchymal stem cells imposes the phenotype of in

vivo sarcoma development. Oncogene. Vol 32, n 41, pp 4970-80. doi: 10.1038/onc.2012.507.

Ryu, S., McDonnell, K., Choi, H., et al. (2013). Suppression of miRNA-708 by Polycomb Group

Promotes Metastases by Calcium-Induced Cell Migration. Cancer Cell. vol 23, pp 63–76, DOI:

10.1016/j.ccr.2012.11.019.

Sadok, A., & Marshall, C. J. (2014). Rho GTPases: Masters of cell migration.Small GTPases.

Vol 5, e29710. http://doi.org/10.4161/sgtp.29710

Sadok, A., McCarthy, A., Caldwell, J. et al. (2015). Rho kinase inhibitors block melanoma cell

migration and inhibit metastasis. Cancer Res. Vol 75, n 11, pp 2272-84. doi: 10.1158/0008-5472

Sahai, E. & Marshall, C.J. (2003). Differing modes of tumour cell invasion have distinct

requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nature Cell Biology Vol 5, n 8, pp

711-719.

Saini, S., Yamamura, S., Majid, S., et al. (2011). MicroRNA-708 induces apoptosis and

suppresses tumorigenicity in renal cancer cells. Cancer Res. vol 71, n 19, pp 6208–6219,

DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-0073.

Saini, S., Yamamura, S., Majid, S., et al. (2011). MicroRNA-708 induces apoptosis and

suppresses tumorigenicity in renal cancer cells. Cancer Res, vol 71, No 19, pp 6208–6219,

DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-0073.

Saito M., Shiraishi K., Matsumoto K. et al. (2014). A three-microRNA signature predicts

responses to platinum-based doublet chemotherapy in patients with lung adenocarcinoma. Clin

Cancer Res. Vol 20, n 18, pp 4784-93. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-14-1096.

Sasaki K., Hitora T., Nakamura O. et al. (2011). The role of MAPK pathway in bone and soft

tissue tumors. Anticancer Res. Vol 31, n 2, pp 549-53.

Scott R.W. & Olson M.F. (2007). LIM kinases: function, regulation and association with human

disease. J Mol Med (Berl). Vol 85, n 6, pp 555-68.

Shen K., Mao R., Ma L., et al. (2014) A. Post-transcriptional regulation of

the tumor suppressor miR-139-5p and a network of miR-139-5p-mediated

mRNA interactions in colorectal cancer. FEBS J. Vol 281, n 16, pp 3609-24. doi: 10.1111/febs.12880

Shen, L., Wang, P., Yang, J., & Li, X. (2014). MicroRNA-217 Regulates WASF3 Expression and

Suppresses Tumor Growth and Metastasis in Osteosarcoma. PLoS ONE, 9(10), e109138.

http://doi.org/10.1371/journal.pone.0109138



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gutierrez-Aranda%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23222711

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=S%C3%A1ez-Castillo%20AI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23222711


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saito%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25142144

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shiraishi%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25142144

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Matsumoto%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25142144

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=saito+lung+adenocarcinoma+2014+miRNA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=saito+lung+adenocarcinoma+2014+miRNA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sasaki%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21378337

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hitora%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21378337

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nakamura%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21378337


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Scott%20RW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17294230

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Olson%20MF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17294230

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Scott+Olson+2007+Rho

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Shen%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24942287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mao%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24942287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ma%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24942287

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Post-transcriptional+regulation+of+the+tumor+suppressor+miR-139-5p+and+a+network+of+miR-139-5p-mediated+mRNA+interactions+in+colorectal+cancer


77

Slobodan Vukicevic, S., Kleinman,H.K., Luyten,F.P.,et al.(1992). Identification of multiple

active growth factors in basement membrane matrigel suggests caution in interpretation of cellular

activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. Vol 202, n 1,pp 1-8.

http://dx.doi.org/10.1016/0014-4827(92)90397-Q.

Song , T. Zhang , X., Zhang , L., et al. (2013). miR-708 promotes the development of bladder

carcinoma via direct repression of Caspase-2. J Cancer Res Clin Oncol. Vol 139, pp 1189–1198, DOI:

10.1007/s00432-013-1392-6.

Song , T. Zhang , X., Zhang , L., et al. (2013). miR-708 promotes the development of bladder

carcinoma via direct repression of Caspase-2. J Cancer Res Clin Oncol, vol 139, pp 1189–1198, DOI:

10.1007/s00432-013-1392-6.

Steliarova-Foucher, E., Stilller, C., Lacour, B., Kaatsch, P. (2005) Classificação Internacional do

Câncer na Infância, Terceira Edição. American Cancer Society. DOI 10.1002/cncr.20910.

Stiles,J.M., Kurisetty,V., Mitchell, D.C. et al.(2013). Rho Kinase Proteins Regulate Global

miRNA Expression in Endothelial Cells.CANCER GENOMICS & PROTEOMICS. Vol 10, pp 251-264

Street, C.A. & Bryan, B.A. (2011). Rho Kinase Proteins—Pleiotropic Modulators of Cell Survival

and Apoptosis. Anticancer Research. Vol 3, pp 3645-3658.

Sun X.H., Geng X.L., Zhang J. et al. (2014). miRNA-

646 suppresses osteosarcoma cell metastasis by downregulating fibroblast growth factor 2 (FGF2).

Tumor Biol. Vol 36, n 3, pp2127-34. DOI 10.1007/s13277-014-2822-z

Takeba, Y., Matsumoto, N., Watanabe, N. et al. (2012). The Rho kinase inhibitor fasudil is

involved in p53-mediated apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells. Cancer Chemother

Pharmacol. Vol 69, pp 1545–1555, DOI: 10.1007/s00280-012-1862-6.

Takenawa T. & Miki H. (2001).

WASP and WAVE family proteins: key molecules for rapid rearrangement of cortical actin filaments

and cell movement. J Cell Sci. Vol 114, n 10, pp 1801-9.

Tesser-Gamba F., Lopes L.J., Petrilli A.S. et al. (2015).

MAPK7 gene controls proliferation, migration and cell invasion in osteosarcoma. Mol Carcinog. doi:

10.1002/mc.22420.

Ueno, K., Hirata, H., Shahryari, V., et al. (2011). Tumour suppressor microRNA-584 directly

targets oncogene Rock-1 and decreases invasion ability in human clear cell renal cell carcinoma.

British Journal of Cancer. Vol 104,pp 308 – 315.



British Journal of Cancer. Vol 104,pp 308 – 315.

http://dx.doi.org/10.1016/0014-4827(92)90397-Q

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sun%20XH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25403884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Geng%20XL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25403884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhang%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25403884

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Takenawa%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11329366

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Miki%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11329366

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=WASP+and+WAVE+family+proteins%3A+key+molecules+for+rapid+rearrangement+of+cortical+actin+filaments+and+cell+movement

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tesser-Gamba%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26460937

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lopes%20LJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26460937

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petrilli%20AS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26460937

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=MAPK7+Gene+Controls+Proliferation%2C+Migration+and+Cell+Invasion+in+Osteosarcoma


78



British Journal of Cancer , vol 104,pp 308 – 315.

Van Schooneveld, E., Wouters, M. C., Van der Auwera, I., et al. (2012). Expression profiling of

cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum

from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers. Breast Cancer Research :

BCR, 14(1), R34. http://doi.org/10.1186/bcr3127

Wang Y., Zhao W. & Fu Q. (2013). miR-

335 suppresses migration and invasion by targeting ROCK1 in osteosarcoma cells. Mol Cell

Biochem. Vol 384, n 1-2, pp 105-11. doi: 10.1007/s11010-013-1786-4

Wang, W., Zhou, X., & Wei, M. (2015). MicroRNA-144 suppresses osteossarcoma growth and

metastasis by targeting ROCK1 and ROCK2.Oncotarget. Vol 6, n 12, pp 10297–10308.


metastasis by targeting ROCK1 and ROCK2.Oncotarget. Vol 6, n 12, pp 10297–10308.


metastasis by targeting ROCK1 and ROCK2.Oncotarget, vol 6,n 12, pp 10297–10308

Wang, X.-P., Deng, X.-L., & Li, L.-Y. (2014). MicroRNA-584 functions as a tumor suppressor

and targets PTTG1IP in glioma. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 7(12),

8573–8582.

Wittig, J.C., Bickels, J., Priebat, D. et al. (2002). Osteossarcoma: A Multidisciplinary Approach

to Diagnosis and Treatment. American Family Physician. Vol 65, n 6.

Wolf, K., Mazo, I., Leung, H. et al. (2003). Compensation mechanism in tumor cell migration:

mesenchymal–amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. The Journal of Cell

Biology. Vol 160, n 2, pp 267–277, DOI:10.1083/jcb.200209006.

Wong, C.C., Wong, C. Tung, E. K., Et Al. (2011). The Microrna Mir-139 Suppresses Metastasis

And Progression Of Hepatocellular Carcinoma By Down-Regulating Rho-Kinase 2. Gastroenterology,

Vol 140, pp 322–331, Doi:10.1053/J.Gastro.2010.10.006.

Wong, C.C., Wong, C. Tung, E. K., Et Al. (2011). The Microrna Mir-139 Suppresses Metastasis

And Progression Of Hepatocellular Carcinoma By Down-Regulating Rho-Kinase 2. Gastroenterology.

Vol 140, pp322–331, Doi:10.1053/J.Gastro.2010.10.006.

Wu, L., Fan, J., & Belasco, J. G. (2006). MicroRNAs direct rapid deadenylation of

mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(11),

4034–4039. http://doi.org/10.1073/pnas.0510928103

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23975506

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Zhao%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23975506

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fu%20Q%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23975506

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=miR-335+suppresses+migration+and+invasion+by+targeting+ROCK1+in+osteosarcoma+cells

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=miR-335+suppresses+migration+and+invasion+by+targeting+ROCK1+in+osteosarcoma+cells


79

Wu,Y, Tang,Y., Li, Z. et al. (2013). Expression and significance of Rac1, Pak1 and Rock1 in

gastric carcinoma. Asia_Pacific Journal of Clinical Oncology, DOI: 10.1111/ajco.12052.

Wu,Y, Tang,Y., Li, Z. et al. (2013). Expression and significance of Rac1, Pak1 and Rock1 in

gastric carcinoma. Asia_Pacific Journal of Clinical Oncology, DOI: 10.1111/ajco.12052.

Wyckoff J.B., Pinner S.E., Gschmeissner S. et al. (2006). ROCK- and myosin-

dependent matrix deformation enables protease-independent tumor-cell invasion in vivo. Curr Biol.

Vol 16, n 15, pp 1515-23.

Xu, N., Li, Z., Yu, Z., et al.. (2014). MicroRNA-33b Suppresses Migration and Invasion by

Targeting c-Myc in Osteosarcoma Cells. PLoS ONE. vol 9, n 12. e115300.


Xu, W., Hang, M., Yuan, C.-Y. et al. (2015). MicroRNA-139-5p inhibits cell proliferation and

invasion by targeting insulin-like growth factor 1 receptor in human non-small cell lung

cancer. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. Vol 8, n 4, pp 3864–3870.

Yamaguchi H., Kasa M., Amano M. et al.(2006). Molecular mechanism for

the regulation of rho-kinase by dimerization and its inhibition by fasudil. Structure. Vol 14, n 3, pp

589-600.

Yamasaki, T., Seki, N., Yamada, Y., Et Al. (2012). Tumor Suppressive Microrna-138 Contributes

To Cell Migrationand Invasion Through Its Targeting Of Vimentinin Renal Cell Carcinoma.

International Journal Of Oncology, Vol 41, Pp 805-817, Doi: 10.3892/Ijo.2012.1543

Yan, K., Gao, J., Yang, T., et al. (2012). MicroRNA-34a Inhibits the Proliferation and Metastasis

of Osteosarcoma Cells Both In Vitro and In Vivo. PLoS ONE. Vol 7, n 3, e33778.


Yang H., Tang Y., Guo W. et al (2014). Up-regulation of microRNA-138 induce

radiosensitization in lung cancer cells. Tumour Biol. Vol 35, n 7, pp 6557-65. doi: 10.1007/s13277-

014-1879-z.

Yang, X., Di, J., Zhang, Y. et al. (2012). The Rho-kinase inhibitor inhibits proliferation and

metastasis of small cell lung cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. Vol 66, pp 221–227,

DOI:10.1016/j.biopha.2011.11.011.

Yoneda,A., Multhaupt,H.A.B., Couchman, J.R. (2005). The Rho kinases I and II regulate

different aspects of myosin II activity. The Journal of Cell Biology. Vol. 170, n 3, pp 443–453,

DOI:10.1083/jcb.200412043.

Yoshikawa, T., Wu, J., Otsuka, M., et al. (2015). ROCK inhibition enhances microRNA function

by promoting deadenylation of targeted mRNAs via increasing PAIP2 expression. Nucleic Acids

Research. Vol 43, n 15, 7577–7589. http://doi.org/10.1093/nar/gkv728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wyckoff%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16890527

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pinner%20SE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16890527

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gschmeissner%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16890527

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=ROCK-+and+Myosin-Dependent+Matrix+Deformation+Enables+Protease-Independent+Tumor-Cell+Invasion+In+Vivo

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yamaguchi%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16531242

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kasa%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16531242

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Amano%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16531242

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Molecular+Mechanism+for+the+Regulation+of+Rho-Kinase+by+Dimerization+and+Its+Inhibition+by+Fasudil

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Yang%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24691972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24691972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Guo%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24691972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=yang+miR-138+lung+cancer+2014


80

Young A., Lyons J., Miller A.L. et al. (2009). Ras signaling and therapies. Adv Cancer Res. Vol

102, pp 1-17. doi: 10.1016/S0065-230X(09)02001-6.

Yu, C., Wang, M., Li, Z. et al. (2015). MicroRNA-138-5p regulates pancreatic cancer cell

growth through targeting FOXC1. Cellular Oncology (Dordrecht). Vol 38, n 3, pp 173–181.

doi:10.1007/s13402-014-0200-x

Zhang, B., Pan, X., Cobb, G.P., Anderson, T.A. (2007). microRNAs as oncogenes and tumor

suppressors. Developmental Biology. Vol 302, pp 1–12, DOI:10.1016/j.ydbio.2006.08.028.

Zhang, C., Yao, C., Li, H., et al. (2014) B. Combined Elevation ofmicroRNA-196a and

microRNA-196b in Sera Predicts Unfavorable Prognosis in Patients with Osteossarcomas.

International Journal of Molecular Sciences,15(4), 6544–6555. doi:10.3390/ijms15046544

Zhang, J., Yan, Y, Wang, C. et al. (2015). MicroRNAs in osteossarcoma. Clinica Chimica Acta

vol 444, pp 9–17

Zhang, L., Dong, Y., Zhu, N., et al. (2014) A. microRNA-139-5p exerts tumor suppressor

function by targeting NOTCH1 in colorectal cancer. Molecular Cancer, 13, 124. doi:10.1186/1476-

4598-13-124

Zhang, Y., Tang, Y. J., Li, Z. H., Pan, F., Huang, K., & Xu, G. H. (2013). KiSS1 Inhibits Growth and

Invasion of Osteosarcoma Cells through Inhibition of the MAPK Pathway. European Journal of

Histochemistry : EJH. Vol 57, n 4, e30. http://doi.org/10.4081/ejh.2013.e30

Zhao H., Ma B., Wang Y., et al. (2013). miR-34a inhibits the metastasis of osteosarcoma

cells by repressing the expression of CD44. Oncology Reports. Vol 29, pp 1027-1036.

Zheng, F., Liao, Y., Cai, M. et al.(2012). The putative tumour suppressor microRNA-124

modulates hepatocellular carcinoma cell aggressiveness by repressing ROCK2 and EZH2. Gut. Vol 61,

pp278-289, DOI:10.1136/gut.2011.239145.

Zhou, x., Wei, M., Wang, W. (2013). MicroRNA-340 suppresses osteossarcoma tumor growth

and metastasis by directly targeting ROCK1. Biochemical and Biophysical Research Communications.

Vol 437, pp 653–658, DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.07.033.

Zucchini, C., Manara, M., Pinca, R.S., et al.(2013). CD99 suppresses osteossarcoma cell

migrateon through inhibition of ROCK2 activity. Oncogene. pp 1–10.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Young%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19595305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lyons%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19595305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Miller%20AL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19595305


http://doi.org/10.4081/ejh.2013.e30

Apêndices

_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE

82

Apêndice A

Tabela com resumo dos dados dos pacientes cuja amostra tumoral foi coletada para análise no

presente trabalho. ID,indentidade; F, feminino; M, masculino; R, realizada; N.R., não realizada.

ID Idade Gênero Etnia Diagnóstico Malignidade

pré-QT

1 21 F Branca OS Parosteal Justa-cortical não informado

2 12 F Branca OS Convencional Grau 4

3 18 M Branco OS Convencional Central Grau 3

4 24 M Branco OS Condroblástico Grau 2

5 15 M Branco OS Convencional Condroblástico Intramedular Alto Grau

6 10 F Branca OS Paraosteal Grau 1

7 12 F Branca OS Central Convencional Alto Grau

8 13 M Negro OS Osteoblástico Central Convencional Grau 3

9 13 M Mulato OS Osteoblástico Convencional Grau 3

10 12 F Branca OS Osteoblástico Grau 3

11 15 F Mulato OS Osteoblástico Convencional Grau 2

12 18 F Negra OS Baixo Grau

13 11 M Branco OS Convencional Grau 3

14 21 F Branca OS Paraosteal Grau 1

15 26 F Mulata OS Condroblástico Central Alto Grau

pós-QT

16 16 F Branca OS Clássico Central Grau 3

17 13 F Branca OS Condroblástico Grau 3

18 66 M Branco OS Central Convencional não informado

19 17 F Branca OS Osteoblástico Grau 3

20 12 M Branco OS Clássico Osteoblástico Grau 3

21 57 F Branca OS Central Clássico Osteoblástico Grau 2

22 21 M Branco OS Clássico Intramedular Grau 2

3

23 9 F Branca OS Convencional Condroblástico Grau 3

24 15 F Branca OS Convencional Central Grau 2

25 16 M Branco OS Central Condroblástico Grau 3

26 20 M Branco OS Condroblástico Central Convencional Grau 3

8

27 21 M Mulato OS Central Osteoblástico não informado

28 18 F Branca OS Osteoblástico Medular Grau 3

29 28 M Branco OS Osteoblástico Central Grau 3

30 15 M Branco OS Convencional Grau 3

Metástase 30 Metástase de OS Condroblástico

Recidiva 31 36 F Branca OS Parosteal Extracompartimental não informado

12 OS Paraosteal Recidivado

_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE

83

Apêndice A - Continuação

ID Volume ao diagnóstico

Localização Amputação HUVOS

pré-QT

1 401,76 Fêmur Direito N.R. não recebeu quimioterapia

2 1393,92 Fêmur Esquerdo N.R. não informado

3 865,92 Fêmur Esquerdo R. Grau 2

4 82,5 Tíbia Direita R. amputação ao diagnóstico

5 255,474 Tornozelo R. amputação ao diagnóstico

6 não informado Tíbia Esquerda N.R. retirada cirurgica ao diagnóstico

7 221,858 Fíbula Direita N.R. Grau 2

8 432 Fêmur Direito N.R. Grau 1

9 486 Fêmur Esquerdo N.R. Grau 4

10 651,776 Fêmur Direito N.R. Grau 1

11 455 Joelho Esquerdo N.R. Grau 3

12 465,108 Fêmur Esquerdo N.R. Grau 1


14 não informado Fêmur Direito N.R. não informado

15 não informado Asa Ilíaca Esquerda N.R. não informado

pós-QT

16 não informado Tíbia Direita N.R. Grau 2

17 não informado Tíbia e Fibula Esquerda N.R. Grau 2

18 90,651 Fêmur Esquerdo N.R. não informado

19 não informado Fêmur Esquerdo e Joelho N.R. Grau 2

20 não informado Fêmur Direito N.R. Grau 2

21 não informado Clavícula Direita N.R. não recebeu quimioterapia

22 1391,94 Fêmur Direito N.R. Grau 2

3

23 não informado Tíbia e Fibula Esquerda N.R. Grau 2


25 não informado Tíbia Esquerda R. amputação ao diagnóstico

26 não informado Fêmur Esquerdo R. amputação ao diagnóstico

8

27 764,4 Fíbula Esquerda N.R. Grau 3



30 não informado Fêmur Esquerdo N.R. Grau 3

Metástase 30 Parênquima Pulmonar Lobo Inferior Esquerdo

Recidiva 31 não informado Tíbia Direita N.R. não informado

12 Fossa Poplítea Esquerda

_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE

84

Apêndice A - Continuação

ID Metástase Recidiva Status

Sobrevida Global (meses)

pré-QT

1 Ausente Ausente Sem Informações Atuais

2 Pulmonar, Esternal, Hepática Ausente Óbito 6

3 Pulmonar Ausente Óbito 28

4 Ausente Presente Sem Doença 57

5 Ausente Ausente Sem Doença 67

6 Pulmonar Ausente Sem Doença 65


8 Pulmonar e Coluna Ausente Óbito 39


10 Linfonodos das Cadeias

Inguinais e Poplíteas Ausente Óbito 12





15 Ausente Ausente Perda de Seguimento (Paliativo)

pós-QT

16 Tecido Muscular Esquelético e

Pulmonar Presente Óbito

34


18 Ausente Ausente Óbito 12

19 Epífise Tibial e Pulmonar Ausente Óbito 12




3

23 Pulmonar Ausente Viva Sem Informação 27

24 Pulmonar e Encefálica não informado Sem Informações Atuais

25 Ausente Ausente Vivo Sem Informação 1


8

27 Ausente Ausente Sem Informações Atuais



30 Pulmonar Ausente Com Doença 28

Metástase 30

Recidiva 31 Ausente Presente Sem Doença 67

12

_______________________ ____________________________________________________APÊNDICE

85

Apêndice B

Tabela com resumos das expressões dos genes ROCK1 e ROCK2 e miRNAs associados: miR-138, miR-

139, miR-196b, miR-584 e miR-708 em amostras de ossos não neoplásicos, amostras de OS pré-QT,

pós-QT e linhagens celulares de OS.

Grupos Genes n Média Desvio Padrão Mínima Máxima

Percentis

25% 50%

(mediana) 75%

Osso N

ão

Neop

lásic

o

ROCK1 6 1,10 0,28 0,81 1,50 0,81 1,08 1,38

ROCK2 6 1,26 0,92 0,54 3,01 0,69 0,88 1,89

miR138 6 0,38 0,33 0,09 0,84 0,14 0,23 0,79

miR139 6 10,45 6,62 2,47 21,90 4,87 10,61 14,03

miR196b 6 79,92 70,51 14,27 210,86 32,48 56,62 129,67

miR584 6 1,06 1,47 0,03 3,64 0,03 0,32 2,45

miR708 6 0,82 0,38 0,39 1,42 0,55 0,69 1,21

pré

-QT

ROCK1 15 0,63 0,35 0,17 1,47 0,39 0,57 0,97

ROCK2 15 2,07 1,53 0,54 5,96 0,90 1,52 2,92

miR138 14 2,44 2,87 0,27 9,06 0,50 1,50 2,88

miR139 14 2,13 2,67 0,35 11,10 0,99 1,36 2,20

miR196b 14 54,73 40,81 14,45 124,45 19,03 39,75 99,74

miR584 14 0,13 0,29 0,00 1,11 0,01 0,06 0,08

miR708 14 0,35 0,37 0,06 1,45 0,11 0,24 0,43

pós-Q

T

ROCK1 17 ,58 ,21 ,29 ,96 ,42 ,55 ,76

ROCK2 17 2,41 1,88 ,42 6,92 1,15 1,72 2,73

miR138 17 2,81 3,25 ,11 10,24 ,48 1,78 3,88

miR139 17 2,88 2,79 ,54 10,42 ,98 1,49 4,32

miR196b 17 42,90 19,19 18,44 72,67 26,90 37,99 62,36

miR584 17 ,24 ,54 ,00 1,96 ,00 ,02 ,15

miR708 17 ,24 ,16 ,07 ,52 ,10 ,14 ,36

Lin

hag

ens C

elu

lare

s

ROCK1 3 2,29 2,12 0,99 4,74 0,99 1,15 4,74

ROCK2 3 0,90 0,66 0,36 1,63 0,36 0,71 1,63

miR138 3 15,38 21,99 0,36 40,61 0,36 5,16 40,61

miR139 3 0,16 0,10 0,04 0,22 0,04 0,21 0,22

miR196b 3 75,73 23,48 48,81 91,97 48,81 86,40 91,97

miR584 3 1,11 1,23 0,00 2,43 0,00 0,90 2,43

miR708 3 0,03 0,03 0,01 0,07 0,01 0,02 0,07

____________________________________________________________________________ANEXO

87

Anexo A

Tabela com perfis de STR apresentados pela ATCC e encontrados na análise das linhagens utilizadas

no presente trabalho, sendo elas HOS, MG-63 e SAOS-2 não transduzidas (N.T.), Vetor vazio (V.V.) e

miR-708.

Linhagens Perfil STR

CSF1PO D13S317 D16S539 D5S818 D7S820 THO1 TPOX vWA

HOS

Ref ATCC 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18

HOS N.T. 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18

HOS V.V. 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18

HOS miR-708 12 12 10;13 13 11;12 6 8;11 18

MG-63

Ref ATCC 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19

MG-63 N.T. 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19

MG-63 V.V. 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19

MG-63 miR-708 10;12 11 11 11;12 10 9.3 8;11 16;19

SAOS-2

Ref ATCC 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18

SAOS-2 N.T. 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18

SAOS-2 V.V. 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18

SAOS-2 miR-708 10 12;13 12;13 12 8;10 6;9 8 18

Lara Elis Alberici Delsin - teses.usp.br · AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por nunca desistir de...

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