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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Odontologia Dissertação CITOTOXICIDADE, GENOTOXICIDADE E PROPRIEDADES FÍSICO-MECÂNICAS DE UM CIMENTO EXPERIMENTAL DUAL FOTOATIVÁVEL À BASE DE MTA Laura Siqueira Pintado Pelotas, 2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Odontologia
Dissertação
CITOTOXICIDADE, GENOTOXICIDADE E PROPRIEDADES
FÍSICO-MECÂNICAS DE UM CIMENTO EXPERIMENTAL DUAL
FOTOATIVÁVEL À BASE DE MTA
Laura Siqueira Pintado
Pelotas, 2011
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LAURA SIQUEIRA PINTADO
Citotoxicidade, genotoxicidade e propriedades físico-
mecânicas de um cimento experimental dual
fotoativável à base de MTA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia da Universidade
Federal de Pelotas como requisito parcial à
obtenção do título de mestre em Odontologia,
Área de concentração em Dentística.
Orientadora: Dra. Adriana Etges
Co – Orientador: Dr. Fábio Renato Manzolli Leite
Co – Orientador: Dr. Rodrigo Varella de Carvalho
Pelotas, 2011
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Dados de Catalogação da Publicação
P659c Pintado, Laura Siqueira
Citotoxicidade, genotoxicidade e propriedades físico-mecânicas
de um cimento experimental dual fotoativável a base de MTA / Laura Siqueira Pintado ; orientador: Adriana Etges ; co-orientador: Fábio Renato Manzolli Leite, Rodrigo Varella de Carvalho. – Pelotas: UFPel, 2011.
79 f. ; fig. ; tab. Dissertação (Mestrado) Dentística. Faculdade de Odontologia. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas.
1. MTA. 2. Citotoxicidade. 3. Genotoxicidade. 4. Cultivo celular. 5. Fibroblastos pulpares. I. Etges, Adriana (orient.) II. Leite, Fábio Renato Manzolli (co-orient.) III. Carvalho, Rodrigo Varella de (co- orient.) IV.Título.
D2
Bibliotecário: Fabiano Domingues Malheiro CRB -10/1955
19
Banca examinadora:
Profa. Dra. Adriana Etges
CD. Dra. Beatriz Farias Vogt
Prof. Dr. Rogério de Castilho Jacinto
Profa. Dra. Fernanda Geraldes Pappen (Suplente)
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Dedicatória
À Deus,
Aos meus pais Eliana e Ricardo
Ao meu noivo Vitor,
Com amor e carinho
21
Agradecimentos
À Universidade Federal de Pelotas por meio do seu Magnífico Reitor, Prof.
Dr. Antônio César Gonçalves Borges.
À Faculdade de Odontologia através de sua Diretora, Profª. Drª. Márcia
Bueno Pinto.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, em especial ao seu
coordenador Prof. Dr. Flávio Demarco.
A minha orientadora, Adriana Etges, por proporcionar a realização desta
dissertação, por ter me acolhido e aceitado receber uma nova orientanda, por
mostrar-me os caminhos a serem seguidos para a finalização desta jornada.
Obrigada pela confiança, ensinamentos e amizade.
Ao meu co-orientador Fábio Renato Manzolli Leite, pela sua presença em
todos os momentos de desenvolvimento deste trabalho, sempre disponível a ajudar,
independente do horário ou do dia da semana. Obrigada por fazer parte deste
trabalho e juntamente com a Adriana ter aceitado assumir a minha orientação e a
realização deste projeto. Obrigada pela confiança, ensinamentos e amizade.
À minha colega Eliana do Nascimento Torre, agradeço pelo
companheirismo, pela amizade, pelos conselhos, pelo ombro amigo, pelos
ensinamentos e pela ajuda. Obrigada por estar sempre comigo, participando e
colaborando no desenvolvimento desta pesquisa, pela paciência e pela amizade.
À todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Odontologia
pela convivência e pelo aprendizado.
Ao laboratório de Cultivo Celular, a todos os professores e funcionários
que nele trabalham. Obrigada pelos ensinamentos e ajuda.
22
A colega Sônia, pela colaboração, ajuda, ensinamentos em diversas etapas
deste trabalho. Sempre com palavras acolhedoras , obrigada pela amizade
A Fernanda Nedel., obrigada pelos ensinamentos na área de cultivo celular,
pela paciência, dedicação, amizade e compreensão de mesmo em horários
“alternativos” se mostrar sempre disponível para me ajudar.
Ao professor César Zanchi, pela contribuição com o material testado neste
experimento.
À Josiane Silva, secretária do Programa de Pós-Graduação em Odontologia
(PPGO), por sua dedicação ao PPGO e aos alunos do programa.
A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da
Universidade Federal de Pelotas, pela agradável convivência e amizade.
À toda minha família, em especial aos meus pais Eliana e Ricardo, obrigada
pelo apoio, compreensão, carinho, conforto e amor. Vocês são os grandes
responsáveis por eu estar hoje concluindo este curso de mestrado.
Aos meus avós, Estela, Marli e Selmar, e a minha mana Letícia obrigada
pelo apoio, amor e carinho e por sempre acreditarem em mim.
Ao meu companheiro, Vitor, por estar sempre ao meu lado em todos os
momentos da minha vida, sempre me apoiando e confortando. Obrigada pelos
momentos de paciência, pelos conselhos, pelo amor, pelo companheirismo e por
acreditar e mim.
A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
23
“... Não me abraçaste só no peito
Puseste a mão na minha mão
Eu pequenino- tu, eleito
Poeta, pai! Áspero irmão. ”
Vinicius de Moraes
24
Notas Preliminares
A presente dissertação foi redigida segundo o Manual de Normas para
Dissertações, Teses e Trabalhos Científicos da Universidade Federal de Pelotas de
2006, adotando o Nível de descrição 1. Estrutura tradicional, que consta no
Apêndice A do referido manual. Disponível no endereço eletrônico:
(http://www.ufpel.edu.br/prg/sisbi/documentos/Manual_normas_UFPel_2006.pdf)
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Resumo
PINTADO, Laura Siqueira. Citotoxicidade, genotoxicidade e propriedades físico-mecânicas de um cimento experimental dual fotoativável à base de MTA. 79f. 2011. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Visando o sucesso do tratamento conservador da polpa, o MTA (agregado trióxido mineral) tem sido considerado o produto de primeira escolha para a realização de capeamento pulpar direto. Apresenta características como biocompatibilidade, capacidade de estimular a formação de dentina e proliferação celular, entre outros. No entanto, os inconvenientes como a dificuldade de manuseio após a manipulação e longo tempo de presa tem estimulado novas pesquisas na tentativa de melhorar essas características. Assim, um novo cimento fotopolimerizável baseado em MTA (MTA F) foi desenvolvido na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas. Sugere-se que a presença de monômeros resinosos pode ter um efeito deletério sobre a polpa dentária. Baseado neste fato, o estudo avaliou a citotoxicidade e genotoxicidade do MTA F em comparação ao convencional disponível no mercado bem como suas propriedades físico-mecânicas. Foram utilizadas culturas primárias de fibroblastos de polpa humana (FPH) e uma linhagem de fibroblastos de camundongo 3T3/NIH. Polpa extraída de terceiros molares humanos íntegros foi utilizada para a cultura de fibroblastos pulpares. Os corpos de prova de ambos os materiais foram embebidos em 1 mL de DMEM para a obtenção do eludato teste. Para citotoxicidade, as células foram incubadas por 24 ou 48 horas com o eludato e avaliado pelo ensaio de MTT [3 - (4,5-dimetil-2-il) -2,5-brometo difeniltertrazolim]. Para avaliar a genotoxicidade dos produtos através da técnica de micronúcleos, foi utilizada a técnica de coloração de Feulgen após a incubação de células por 24 horas com o eludato. Para a avaliação das características físico-mecânicas do MTA experimental foram realizados os testes de resistência a tração diametral e sorção e solubilidade. Os resultados foram analisados pelos testes ANOVA e Kruskal Wallis considerando p<0,05. O MTA fotopolimerizável apresentou efeitos citotóxicos semelhantes ao MTA convencional nas duas linhagens celulares. O percentual de micronúcleos foi diferente entre os materiais, porém ambos foram semelhantes ao controle. A resistência a tração diametral do MTA experimental foi inferior ao MTA comercial. O MTA convencional foi mais solúvel e ambos tiveram o mesmo comportamento em relação à sorção de água. Os resultados sugerem que o MTA experimental fotopolimerizável teve comportamento e biocompatibilidade semelhante ao MTA disponível comercialmente, sendo um material promissor para o capeamento pulpar.
Palavras-chave: MTA, citotoxicidade, genotoxicidade, cultivo celular, fibroblastos pulpares.
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Abstract
PINTADO, Laura Siqueira. Cytotocity, genotoxicity, physical and mechanical properties of an experimental MTA based light-cure cement. 79f. 2011. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Aiming at the success of conservative pulp treatment, the MTA (mineral trioxide aggregate) has been considered the first choice product for performing direct pulp capping. It has features such as biocompatibility, ability to stimulate the formation of dentin and cellular proliferation, among others. However, drawbacks such as difficulty of handling after the manipulation and extended setting times stimulated new researches in an attempt to improve such characteristics. Thus, a light-cured cement-based MTA was developed at the CDC-BIO in the Faculty of Dentistry of the Federal University of Pelotas. It is suggested that the presence of resin monomers may have a deleterious effects on the dental pulp. Based on this fact, the study evaluated the cytotoxicity and genotoxicity of the experimental MTA compared with the conventional commercially available as well as their physical and mechanical properties. Primary cultures of human pulp fibroblasts (HPF) and one strain of mouse fibroblasts 3T3/NIH were employed. Pulp of extracted sound human third molars was used for the pulpal fibroblast cell culture. Specimens were made from the two materials and embedded in 1 mL of DMEM for obtaining the test eluate. For cytotoxicity, cells were incubated for 24 or 48 hours with the eluate and evaluated by the MTT assay [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide]. To assess the genotoxicity of the products through micronucleus development the Feulgen staining technique was employed after cell incubation for 24 hours with the eluate. For the evaluation of physical and mechanical properties of the experimental MTA diametral tensile strength and sorption and solubility tests were performed. The results were analyzed by ANOVA and Kruskal Wallis tests considering p <0.05. The light-curing MTA showed cytotoxic effects similar to conventional MTA in the two cell lineages. The percentage of micronuclei was different between the materials, but both were similar to control. The diametral tensile strength was lower for the experimental MTA. The conventional MTA was more soluble and both had the same behavior in relation to water sorption. The results suggest that the experimental light-cured MTA had similar behavior and biocompatibility comparable to the commercially available MTA and is a promising material for pulp capping
Keywords: MTA, cytotoxicity, genotoxicity, cell culture, pulp fibroblasts.
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Lista de Figuras
Figura 1 Ensaio de compressão diametral (DTS). Força compressiva aplicada na lateral do disco que produz uma fratura por tração..................................................................................................
. .
. 28
Figura 2 Estruturas moleculares do Bis-EMA com 4, 10 e 30 óxidos etilenos e a estrutura molecular do Bis-GMA... ..........................................................................
. .
32
Figura 3 Explants (setas brancas) e início da migração dos fibroblastos pulpares (a e b); FPHs em baixa confluência (c) e em 70% de confluência (aumento de 40 X) (d)..................... ...........................................................
. .
. 37
Figura 4 a) Células 3T3 no inicio do cultivo (aumento 40X); b) 3T3 com 100% de confluência (20X); c, d) células com 70% de confluência(40X), observa-se a morfologia celular............................
. .
. 39
Figura 5 Matriz metálica utilizada para a confecção dos corpos de prova...................................................................................... .......................................
. . 42
Figura 6 Corpo de prova imerso em 1 ml de DMEM para obtenção do eludato teste...................................................................... ............................................
. . 42
Figura 7 Núcleo e micronúcleo corados pela técnica de Feulgen ............................................... 46
Figura 8 Matriz metálica individual utilizada para a confecção dos corpos-de-prova. Na foto se observa a confecção de um corpo-de-prova com o MTA convencional...................................................................
. . .
47
28
Figura 9 Viabilidade celular dos materiais testados com os FPHs, letras iguais resultados sem diferença estatistica, letras diferentes resultados estatisticamente diferentes……………………………............
51
Figura 10 Viabilidade celular dos materiais testados com as 3T3, letras iguais resultados sem diferença estatistica, letras diferentes resultados estatisticamente diferentes…………………………….........................
51
Figura 11 Média de MN encontrados por grupo em 1.000 células e comparação entre os grupos. Letras diferentes, grupos estatisticamente diferentes.................................................................
52
Figura 12 Resistência a tração diametral comparada entre os grupos............... 53
Figura 13 Padrão de fratura apresentado. Foi semelhante nos dois grupos, apresentando fratura em apenas duas partes. MTA experimental e MTA convencional, respectivamente..................................................
53
29
Lista de Tabelas
Tabela 1 Composição química do MTA experimental fotoativável dual testado...........................................................................................
. . . . .
41
Tabela 2 Média e desvio padrão de sorção e solubilidade para o MTA convencional e para o MTA experimental. Análise realizada por coluna. Diferentes letras subscritas indicam diferença estatística entre os grupos (p< 0,05)..............................................................
. . . . 54
30
Lista de Abreviaturas e Siglas
% Percentual
µm Micrômetro
µl Microlitro
< Menor
> Maior
et al. e outros
°C Graus Celsius
ANOVA Análise de Variância
Bis-EMA Bisfenol A polietileno glicol dimetacrilato
Bis-GMA Bisfenol glicidil metacrilato
CaOH Hidróxido de Cálcio
CP Corpo–de-prova
CQ Canforoquinôna
DHEPT Dihidroxi-etil-p-toluidino
DMEM Meio Essencial de Eagle Modificado por Dulbecco’s
DMSO Dimetil sulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
DTS Resistência à tração diametral
EDAB Etil 4-dimetilamino benzoato
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGDMA Etilenoglicol Dimetacrilato
FPH Fibroblastos pulpares humanos
FO Faculdade de Odontologia
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h Hora
HEMA 2-hidróxietil metacrilato
ISO Organização Internacional para Padronização
mg Miligrama
min Minuto
ml Mililitro
mm Milímetro
MMP Metaloproteinase da matriz extracelular
MN Micronúcleos
MPa Mega Pascal
MTA Mineral Trióxido Agregado
MTA F MTA dual fotoativável
MTT Sal tetrazolium [3-(4,5-dimetltiazol-2-yl)-2,5 difeniltetrazolium brometo]
PBS Tampão fosfato salino
pH Potencial hidrogeniônico
ROS Espécies reativas de oxigênio
s Segundo
SFB Soro fetal bovino
TEGDMA Trietilenoglicol dimetacrilato
UDMA Dimetacrilato uretano
UFPel Universidade Federal de Pelotas
V Volume
32
Sumário
1 Introdução ........................................................................................................... 17
2 Objetivo ............................................................................................................... 20
2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 20
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................ 20
3 Revisão de literatura ........................................................................................... 21
3.1 Fisiologia pulpar ................................................................................................ 21
3.2 Materiais capeadores ........................................................................................ 23
3.2.1 MTA ................................................................................................................ 23
3.2.2 Limitações do MTA ......................................................................................... 28
3.3 Monômeros resinosos ....................................................................................... 30
4 Materiais e métodos ............................................................................................ 35
4.1 Ensaios Biológicos ............................................................................................ 35
4.1.1 Técnica de cultivo primário de fibroblastos pulpares humanos ........................ 35
4.1.2 Cultivo da linhagem celular 3T3 ...................................................................... 38
4.1.3 Contagem celular ............................................................................................ 39
4.1.4 Preparo dos corpos de prova a partir do MTA convencional e fotoativado ..... 40
4.1.5 Teste de citotoxicidade .................................................................................... 42
4.1.5.1 Teste de viabilidade celular (MTT) .............................................................. 42
4.1.6 Teste de genotoxicidade ................................................................................. 43
4.1.6.1 Contagem de micronúcleos ......................................................................... 43
4.2 Ensaios Físico- mecânicos ............................................................................... 46
4.2.1 Resistência à tração diametral ........................................................................ 46
4.2.2 Sorção e solubilidade ...................................................................................... 48
4.3 Análise estatística ............................................................................................. 49
33
5 Resultados .......................................................................................................... 50
5.1 Citotoxicidade ................................................................................................... 50
5.1.1 Fibroblastos pulpares ..................................................................................... 50
5.1.2 3T3 ................................................................................................................. 50
5.2 Genotoxicidade ................................................................................................. 52
5.3 Resistência à tração diametral ......................................................................... 53
5.4 Sorção e solubilidade ....................................................................................... 54
6 Discussão ........................................................................................................... 55
7 Conclusões ......................................................................................................... 64
Referências ............................................................................................................... 65
Anexos ...................................................................................................................... 75
17
1 INTRODUÇÃO
O tratamento pulpar conservador tem por objetivo tratar injúrias reversíveis e
manter a vitalidade e a função da polpa dentária. Dependendo do tipo de injúria dois
tipos principais de tratamentos podem ser realizados, o capeamento pulpar direto e
o indireto. O capeamento pulpar indireto é realizado em cavidades profundas, sem
exposição pulpar, enquanto o capeamento pulpar direto e a pulpotomia são
realizados em casos de exposição pulpar. O sucesso do tratamento depende do tipo
e da localização da injúria, qualidade do tecido pulpar, idade dentária, tipo de
material capeador utilizado e da integridade da cavidade restauradora (TZIAFAS,
2004).
Por muitos anos, o hidróxido de cálcio ocupou o posto de material de
primeira escolha para a proteção e indução da polpa dentária em casos de
exposição pulpar e cavidades profundas. Atualmente, no entanto, em casos de
capeamento pulpar direto o material de primeira escolha tem sido o cimento mineral
trióxido agregado (MTA) (PARIROKH e TORABINEJAD, 2010b), visto que, é um
material biocompatível (CAMILLERI e PITT FORD, 2006; ROBERTS et al., 2008;
PARIROKH e TORABINEJAD, 2010a), que apresenta resultados clínicos
satisfatórios e até mesmo superiores ao hidróxido de cálcio (AEINEHCHI et al.,
2003).
O MTA é um material efetivo para a realização de capeamento pulpar, pois
estimula a formação de dentina reparativa formando tecido mineralizado osteóide no
local do capeamento (TZIAFAS et al., 2002; CHACKO e KURIKOSE, 2006).
Apesar das favoráveis qualidades comprovadas em diversos estudos,
defendendo a aplicação clínica do MTA, algumas de suas características têm sido
citadas como limitantes por dificultarem sua aplicação. As limitações do MTA estão
relacionadas à dificuldade de manipulação do material (ALANEZI et al., 2010;
PORTER et al., 2010), tempo de trabalho reduzido (MATT et al., 2004; CHNG et al.,
2005) e o tempo de presa considerado prolongado (CHNG et al., 2005; CHIANG e
18
DING, 2010; PARIROKH e TORABINEJAD, 2010b), variando em 50 minutos
(KOGAN et al., 2006) até três horas (TORABINEJAD et al., 1995; PORTER et al.,
2010). Neste sentido diversos autores sugeriram alterações na formulação do MTA
convencional para diminuir o tempo de trabalho (BORTOLUZZI et al., 2006; KOGAN
et al., 2006; BER et al., 2007; WATTS et al., 2007; BORTOLUZZI et al., 2009).
Alguns trabalhos podem ser encontrados na literatura objetivando melhorar
as propriedades do MTA citadas anteriormente através da formulação de um MTA
fotopolimerizável, os quais apresentam diferenças na composição como a adição de
monômeros resinosos (GOMES-FILHO et al., 2008; GOMES-FILHO et al., 2010;
GANDOLFI et al., 2011; GOMES-FILHO et al., 2011).
Com propriedades semelhantes ao MTA e buscando melhorar as
propriedades clínicas de trabalho, como manipulação e tempo de presa, um cimento
experimental à base de MTA foi desenvolvido na Faculdade de Odontologia da
UFPel com a proposta de ser fotoativável e manter a sua reação de presa
tradicional, sendo assim um cimento dual. O MTA dual fotoativado (MTA F) é
composto por duas pastas, uma catalisadora e a outra ativadora, que ao serem
misturadas iniciam o processo de presa química que pode ser concluída com a
utilização do fotopolimerizador. Esse material foi desenvolvido para a realização de
capeamento pulpar direto.
Porém, esse novo material apresenta em sua composição monômeros
resinosos como o Bis-EMA 10 e o Bis-EMA 30, que entrarão em íntimo contato com
a polpa dentária no momento do capeamento, podendo desencadear alguma reação
de potencial citotóxico ou genotóxico sobre as células deste tecido, visto que esta é
uma característica dos metacrilatos (GEURTSEN et al., 1998; SIDERIDOU e
ACHILIAS, 2005; CHANG et al., 2010; NOCCA et al., 2010; KRIFKA et al., 2011).
Ensaios como resistência a tração diametral e sorção e solubilidade são
testes freqüentemente empregados para a avaliação mecânica e física de materiais
odontológicos (MORAES et al., 2010; GANDOLFI et al., 2011). A sorção de água e a
solubilidade podem levar a uma variedade de processos físicos e químicos na
estrutura dos monômeros que podem levar a efeitos deletérios na função e na
estrutura dos polímeros dentais, incluindo sua capacidade retentiva na adesão
dentária (MALACARNE et al., 2006).
19
Nesse sentido, o presente estudo pretende avaliar em cultivo primário de
fibroblastos pulpares de dentes humanos e em uma linhagem celular imortalizada de
fibroblastos de camundongo 3T3/NIH, as propriedades biológicas através do ensaio
de citotoxicidade e genotoxicidade deste cimento experimental fotoativado à base de
MTA comparando-o com o MTA comercialmente disponível, bem como avaliar as
propriedades físico - mecânicas através do teste de resistência à tração diametral e
sorção e solubilidade.
20
2 OBJETIVO
2.1 Objetivo geral
O objetivo do presente estudo é avaliar a biocompatibilidade de um cimento
experimental à base de MTA dual fotoativável através de cultivo primário de
fibroblastos pulpares humanos e de fibroblastos de camundongo 3T3/NIH e suas
propriedades físico-mecânicas, comparando as com o MTA comercial.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar se, tanto o MTA comercialmente disponível quanto o MTA dual
fotoativável experimental apresenta potencial citotóxico sobre os fibroblastos
pulpares cultivados e em uma linhagem celular imortalizada de fibroblastos de
camundongo 3T3/NIH.
Avaliar se, tanto o MTA comercialmente disponível quanto o MTA dual
fotoativável experimental apresenta potencial genotóxico sobre os fibroblastos de
camundongo 3T3/NIH.
Avaliar o valor de resistência à tração diametral do MTA dual fotoativável
experimental comparado ao MTA comercial.
Avaliar o comportamento de sorção e solubilidade do MTA dual fotoativável
experimental comparado ao MTA comercial.
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3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Fisiologia pulpar
A polpa é um tecido conjuntivo não mineralizado e especializado originário
da papila dentária e cercado por dentina. Durante a formação do órgão dental,
células ectomesenquimais da periferia da papila dentária diferenciam-se em
odontoblastos, as quais são as células responsáveis pela formação da dentina. A
secreção de dentina ocorre ao longo de toda vida, sendo a dentina primária aquela
secretada até a formação do ápice radicular; a dentina secundária, a camada
formada após o fechamento do ápice radicular e, a dentina terciária, que pode ser de
dois tipos: reacional e reparativa (TEN CATE, 2001; KATCHBURIAN e ARANA,
2004)
A secreção de dentina terciária reacional é estimulada frente a fatores como
atrição e cárie, constituindo uma tentativa dos odontoblastos de formar uma barreira,
restabelecendo a espessura de dentina e afastando a polpa do estímulo agressor. A
dentina terciária do tipo reparativa é formada por células indiferenciadas da polpa,
originando um tecido tipo osteóide (TEN CATE, 2001; KATCHBURIAN e ARANA,
2004). A dentina terciária do tipo reacional apresenta características anatômicas,
químicas e funcionais semelhantes às dentinas primárias e secundárias (SMITH,
2002).
A polpa dentária é constituída pelos odontoblastos e uma região
subodontoblástica que se divide na Zona Pobre em Células, Zona Rica em Células,
além da Região Central da polpa. A Zona Pobre em Células é construída por
prolongamentos das células subjacentes, vasos sangüíneos e fibras nervosas. A
Zona Rica em Células é formada por fibroblastos (quase todos em estado de
repouso) e células indiferenciadas (stem cells). A Região Central da polpa é
constituída por um tecido conjuntivo frouxo, com abundância de fibroblastos,
presença de células indiferenciadas, células do sistema imunológico e colágeno
(TEN CATE, 2001; KATCHBURIAN e ARANA, 2004).
22
A polpa dental apresenta também, células dendríticas que se localizam logo
abaixo dos odontoblastos estendendo seus prolongamentos na Zona Pobre em
Células. Possuem a função de capturar e apresentar o antígeno ao linfócito T. São
mais numerosas em dentes cariados e estão em maior número que os macrófagos
(TEN CATE, 2001). A identificação das células dendríticas pulpares levou a
pesquisas sobre a atividade de resposta pulpar. Essas células não são capazes de
identificar os antígenos estranhos, mas enviam sinais que ativam os linfócitos T, que
irão desencadear o processo de defesa imunológico pulpar (JONTELL et al., 1998).
Os odontoblastos são células pós-mitóticas responsáveis pela secreção da
dentina. São células sintetizadoras e secretoras de proteínas, principalmente de
colágeno tipo I. Os odontoblastos permanecem funcionais e continuam secretando
dentina ao longo da vida, porém em quantidade reduzida, mantendo sua capacidade
de responder a estímulos ambientais leves. Quando estimulados, apresentam um
aumento de sua atividade secretora levando á regeneração dentinária, podendo o
estímulo ser de natureza exógena ou endógena (SMITH et al., 1995).
Em preparos cavitários com exposição pulpar, no quais ocorre lesão
tecidual, foi comprovada a proliferação, migração e diferenciação de células
semelhantes a odontoblastos, levando a secreção de dentina reparadora (TECLES
et al., 2005). Neste caso, as células endoteliais injuriadas são responsáveis pelo
recrutamento de células semelhantes à odontoblastos para a região afetada
(MATHIEU et al., 2005), uma vez que os odontoblastos primários são destruídos. O
reparo se tornará possível quando novas células semelhantes aos odontoblastos
forem recrutadas secretando dentina terciária na presença de material de
capeamento pulpar (TZIAFAS et al., 2001).
Nesses casos, quando a polpa está livre de contaminação bacteriana e
apresenta condições de reparo as células pulpares em contato com o material
capeador proliferam e elaboram um novo colágeno em contato com a região pulpar
necrótica iniciando a formação de dentina reparativa. Uma camada de células
semelhantes à odontoblastos é formada em associação com uma calcificação
superficial, secretando uma matriz mineralizada como pré-dentina (TZIAFAS, 2004).
23
3.2 Materiais capeadores
3.2.1 MTA
O MTA, mineral trióxido agregado, foi lançado no mercado na década de 90,
desenvolvido com a função de material retro-obturador endodôntico, sendo
seqüencialmente usado para capeamento pulpar, pulpotomia, vedamento de
perfurações radiculares entre outras funções (PARIROKH e TORABINEJAD, 2010a).
O MTA é comercializado nas cores branca ou cinza, sendo o MTA branco composto
por cálcio, sílica, bismuto e oxigênio, enquanto o MTA cinza é composto por cálcio,
sílica, alumínio, ferro, bismuto e oxigênio (CAMILLERI et al., 2005). Ambos
apresentam pH básico variando de 10 – 12, apresenta pouca solubilidade
(TORABINEJAD et al., 1995) e excelente capacidade seladora na presença de
umidade (TORABINEJAD et al., 1994; DANESH et al., 2006; MAROTO et al., 2007).
O hidróxido de cálcio é um material odontológico de capeamento pulpar
amplamente utilizado na odontologia, considerado padrão ouro (HORSTED-
BINDSLEV et al., 2003) porém apresenta algumas desvantagens como presença de
canais na barreira de dentina formada, obliteração da câmara pulpar, alta
solubilidade nos fluidos orais, falta de adesão e degradação após condicionamento
ácido (COX et al., 1996; COX et al., 1998; COX et al., 2001). Além de apresentar
comportamento instável no capeamento pulpar de dentes permanentes mais velhos
(TZIAFAS et al., 2002).
A utilização do MTA para capeamento elimina algumas desvantagens do
hidróxido de cálcio como solubilidade e infiltração. Sendo portanto, o MTA
apropriado para o capeamento pulpar direto (DAMMASCHKE, WOLFF, et al., 2010).
O MTA é rico em óxidos de cálcio, que são convertidos em hidróxido de cálcio
em contacto com fluidos dos tecidos (CAMILLERI, 2008). O hidróxido de cálcio
se separa em íons de cálcio e hidróxido, resultando em aumento do pH e liberação
dos íons cálcio. Os íons de cálcio podem atravessar a membrana celular por
despolarização ou ativação dos canais de cálcio ligado à membrana, portanto, é
provável que esse íon apresente um papel no processo reparador melhor do que a
hidroxila iônica, presente no hidróxido de cálcio. Os íons cálcio são necessários para
a diferenciação e mineralização de células pulpares (TAKITA et al., 2006).
24
Quando comparado in vivo, o capeamento pulpar direto com MTA e hidróxido
de cálcio, foi observado que o MTA cicatrizou o tecido pulpar mais rapidamente,
porém em 60 dias ambos os materiais foram efetivos no tratamento capeador
(ACCORINTE MDE et al., 2008).
Recente estudo in vivo, mostrou que o capeamento pulpar direto com o MTA
apresenta biocompatibilidade, induz a formação de fibrodentina e dentina reparadora
na superfície pulpar em contato direto com o material. Observaram que houve
diferença significativa entre a resposta da polpa ao MTA após duas semanas e oito
semanas de capeamento pulpar. Após duas semanas, as polpas capeadas com
MTA mostraram a formação de matriz de dentina reparadora. Gradativamente, essa
matriz foi calcificada com padrão tubular e as células odontoblástica se organizaram
em forma paliçada, consituindo efetiva ponte de dentina. Após oito semanas havia
menos inflamação no grupo do MTA, com um padrão em paliçada das células
odontoblástica e uma espessa barreira de tecido duro com um padrão mais tubular.
Este estudo ocmparou as propriedades do MTA com um cimento endodôntico
(ZARRABI et al., 2010).
Outro estudo atual comparou histologicamente a resposta do hidróxido de
cálcio, do MTA e da própolis em capeamento pulpar de pré-molares humanos. Seus
resultados confirmaram a superioridade do MTA em relação ao CaOH, relacionada a
produção de menor inflamação pulpar e formação de ponte de dentina com melhor
qualidade. A própolis apresentou comportamento semelhante aos materiais
capeadores comparados (PAROLIA et al., 2010).
Avaliando após seis meses o tratamento capeador em macacos, as polpas
dos dentes capeados com MTA apresentavam ausência de processo inflamatório e
a formação de ponte de dentina, em contraste com os dentes capeados com
hidróxido de cálcio, nos quais as polpas apresentaram inflamação, não havendo
formação de pontes de dentina em todos os casos (FORD et al., 1996).
O uso de MTA em caninos com cavidades classe V com exposição pulpar
induziu mudanças citológicas e fisiológicas nas células pulpares, resultando na
formação de dentina reparadora na região exposta da polpa dentária. O MTA
oferece um substrato biologicamente ativo para as células pulpares, capaz de
regular os eventos da dentinogênese. O efeito inicial do MTA na superfície da polpa
25
exposta foi a formação de uma camada superficial de estruturas cristalinas em
contato com o material capeador. Células colunares com polarização nuclear e
citoplasmática organizaram ao longo das estruturas cristalinas. Esta reação de curto
prazo indica claramente a estimulação da atividade biossintética das células
pulpares pelo processo de capeamento (TZIAFAS et al., 2002).
Outro estudo em roedores comparou a proliferação celular em molares de
roedores com capeamento pulpar com MTA e hidróxido de cálcio. Em análise
imunoistoquimica (DAMMASCHKE, STRATMANN, et al., 2010) e histológica
(DAMMASCHKE, WOLFF, et al., 2010) observaram qua ambos os materiais
obtiveram resultados similares.
Estudos recentes, in vitro, demonstraram que o MTA apresenta menor
citotoxicidade quando comparado ao cimento de hidróxido de cálcio em cultivo
celular, além de estimular a formação de tecido ósseo (DE SOUZA COSTA et al.,
2008; YASUDA et al., 2008; SEPET et al., 2009), bem como, maior capacidade de
liberar íons cálcio e de induzir proliferação celular (MOGHADDAME-JAFARI et al.,
2005; TAKITA et al., 2006). Porém o cimento de silicato dicálcio com óxido de
bismuto apresentou maior viabilidade celular que o MTA branco em células humanas
semelhantes à osteoblastos imortalizadas (MG63) (CHIANG e DING, 2010).
Crescente volume de estudos in vitro com o teste de citotoxicidade tem sido
realizado por diversos autores com a finalidade de verificar a biocompatibilidade de
um produto experimental através da comparação com o MTA comercialmente
disponível. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com o MTA, o Endo-COM-Sealer
e o Sealapex em fibroblastos de rato (L929). Nenhum dos materiais inibiu a
viabilidade deste tipo celular (GOMES-FILHO et al., 2009), bem como o material
obturador biocerâmico EndoSequence (ALANEZI et al., 2010).
Um cimento poliuretano à base de óleo de mamona teve sua citotoxicidade
comparada ao MTA e ao cimento de hidróxido de cálcio. Foram utilizadas células
pulpares de uma linhagem celular estabelecida. O cimento a base de mamona
apresentou menor citotoxicidade que o MTA e o CaOH apresentou maior
citotoxicidade que o MTA. O material testado apresentou maior proliferação celular
quando comparado ao grupo controle, sem tratamento (CAMARGO et al., 2009).
26
O MTA foi capaz de permitir adesão, proliferação e migração de células
mesenquimais cultivadas (hMSCs), apresentando após 14 dias proliferação celular
maior que o grupo controle (D'ANTO et al., 2010). Em contato com células pulpares
humanas, o comportamento biológico se repetiu com presença de
biocompatibilidade e proliferação celular (TAKITA et al., 2006; PARANJPE et al.,
2010).
Em cultura primária de fibroblastos do ligamento periodontal o MTA
demonstrou diminuição da viabilidade celular em relação ao grupo controle, o que
pode estar relacionado aos íons bismuto e alumínio, presentes no material, que
podem ser tóxicos a este tipo celular (YAN et al., 2010).
Utilizando o teste de genotoxicidade, um ensaio in vitro, é possível avaliar as
concentrações subletais que podem causar danos hereditários ao DNA celular. O
dano ao DNA é o primeiro passo na carcinogênese (DA SILVA et al., 2006; RIBEIRO
et al., 2006). O teste de genotoxicidade é de grande importância de ser realizado
antes da utilização de um material, visto que, muitos materiais dentários
permanecem em contato com os tecidos orais por longos períodos. As propriedades
do material e o tempo que permanecem em exposição podem ser fatores
importantes que às atividades nocivas (RIBEIRO et al., 2004).
O MN consiste em massas de DNA com aparência de um pequeno núcleo
localizado no citoplasma celular dependente da divisão celular, da quantidade e
proliferação e da morte celular (DE ALMEIDA et al., 2004).
Materiais odontológicos resinosos têm sido identificados por apresentar algum
potencial mutagênico. Contudo, a mutagenicidade não significa carcinogenicidade
(capacidade de causar tumores) porque muitas mutações são reparadas e outras
são até irrelevantes para causar doenças (ANUSAVICE et al., 2005).
O ensaio de MN é utilizado como um marcador biológico para avaliar o grau
de comprometimento das células. Eles somente se expressam em células que
completaram pelo menos uma divisão celular, após sofrerem ação do agente
genotóxico. Freqüentemente a não incorporação destes fragmentos ocorre por não
possuírem centrômero, e por isto não conseguirem migrar em direção aos pólos do
fuso, permanecendo atrasados na anáfase. Estes fragmentos de DNA deixados para
27
trás são incorporados dentro de núcleos secundários, permanecendo no citoplasma
celular (FENECH, 2000).
O MTA e o Cimento Portland tiveram seus efeitos genotóxicos testados em
linfócitos periféricos humanos, que apresentam a vantagem de serem células
humanas com cariótipo normal, pela técnica cometa. Ambos os materiais não
aumentaram o nível de lesões ao DNA nesse tipo celular, segundo a técnica do
ensaio cometa (BRAZ et al., 2006). Outros estudos semelhantes comprovaram que
o MTA não apresenta efeito genotóxico (DA SILVA et al., 2006; RIBEIRO et al.,
2006; ZEFERINO et al., 2010).
Um cimento de resina natural à base de óleo de mamona teve sua
genotoxicidade comparada ao MTA e ao cimento de hidróxido de cálcio através do
teste de contagem de MN. Foram utilizados fibroblastos de hamister chinês V79.
Nenhum efeito genotóxico foi encontrado nos materiais testados (CAMARGO et al.,
2009).
Assim como avaliações biológicas, como a citotoxicidade e a genotoxicidade,
testes mecânicos também são amplamente realizados com os materiais.
O teste mecânico de resistência à tração diametral (DTS) avalia em mega
pascal (MPa) a resistência à tração apresentada pelo material. Denominado teste de
compressão diametral o método consiste na transferência de uma carga
compressiva por uma placa plana na lateral de um corpo-de-prova (CP) curto, e
cilíndrico (disco) no qual a força compressiva vertical ao longo da lateral do disco
produz uma tensão de tração perpendicular ao plano vertical que passa pelo centro
do disco, onde ocorre a fratura (Figura 1). O resultado confiável ocorre quando o CP
se fragmenta em apenas duas partes (ANUSAVICE, 2005).
28
Figura 1. Ensaio de compressão diametral (DTS). Força compressiva aplicada na
lateral do disco que produz uma fratura por tração (ANUSAVICE, 2005).
Chiang e Ding, em 2010 realizaram o teste DTS com o MTA branco
comparando-o com um cimento de silicato dicálcio com ou sem a adição de óxido de
bismuto. Os CP apresentavam 6mm x 4mm e foram armazenados em 100% de
umidade a 37°C por 24h. O MTA convencional apresentou maior valor de DTS 7.4
MPa; os outros materiais apresentaram valores de 2.1 MPa e 1.8 MPa
respectivamente (CHIANG e DING, 2010). Outros estudos encontraram o valor
médio de DTS para o MTA branco após 24h de 4.4 MPa (HUANG et al., 2008; KAO
et al., 2009) e imediatamente (0h) (SHIE et al., 2009). Após imersão em pH 6.4 por
sete dias o valor de DTS para o MTA foi de 11.2 MPa e 7.9 MPa quando imerso em
pH 4.0 por sete dias (SHIE et al., 2009).
3.2.2 Limitações do MTA
Algumas características do MTA têm sido citadas como limitantes por
dificultarem sua aplicação. As limitações do MTA estão relacionadas à dificuldade de
manipulação do material, tempo de trabalho reduzido e o tempo de presa
prolongado. O pó do MTA é misturado com água destilada produzindo uma pasta
com aspecto arenoso, sendo esta, difícil de ser aplicada no sitio desejado e de se
29
conseguir boa adaptação e compactação (KOGAN et al., 2006). Diversos autores
sugerem alterações na fórmula do MTA convencional visando melhorar estas
propriedades (KOGAN et al., 2006; BER et al., 2007; BORTOLUZZI et al., 2009;
GANDOLFI et al., 2011; GOMES-FILHO et al., 2011)
Para diminuir o tempo de presa e melhorar as características de manipulação
do material, um estudo adicionou ao MTA, lidocaína 2%, gel de hipoclorito de sódio
3%, gel de digluconato de clorexidina, gel K-Y e cloreto de cálcio 3% e 5%,
comparando com água estéril. O tempo de presa do MTA com água estéril foi de 50
minutos, o hipoclorito, o gel K-Y e o cloreto de cálcio 5% diminuíram o tempo de
presa para 20 minutos. A combinação MTA com gel de hipoclorito foi apresentou
melhores características de manipulação, se assemelhando ao IRM (KOGAN et al.,
2006).
Outros estudos, com os mesmos objetivos anteriores testaram a adição do
cloreto de cálcio ao MTA, em associação com metilcelulose (BER et al., 2007),
verificando que o cloreto de cálcio não interfere na sua capacidade seladora
(BORTOLUZZI et al., 2006), diminui a solubilidade e aumenta o pH do MTA
(BORTOLUZZI et al., 2009).
Gomes-Filho et. al., em 2008, publicaram um estudo com um MTA
experimental fotoativável com propriedades semelhantes ao MTA convencional,
porém com melhores propriedades de trabalho. Apresenta facilidade de aplicação e
a polimerização permite secagem imediata. Constituído por aerosil 8%, resina 42%,
MTA 44,5%, Basulfate 5%, componentes resinosos (Bis-GMA 20%, resina própria
biocompatível [FDA] 77,25%, modificador 2,4%, iniciador 0,32% e estabilizador de
iniciador 0,032%). Neste estudo, os autores avaliaram a capacidade e a habilidade
do MTA experimental, comparado com o MTA (Angelus), em simular a mineralização
em tecido subcutâneo de ratos. O MTA experimental apresentou moderada
inflamação crônica em 30 dias enquanto o MTA (Angelus) apresentou leve
inflamação crônica; em 60 dias apresentaram reação inflamatória semelhante. O
MTA convencional promoveu calcificação distrófica nos tecidos adjacentes,
formados pelos óxidos de cálcio presentes no material, enquanto o MTA
experimental não estimulou formação de tecido ósseo (GOMES-FILHO et al., 2008).
30
Em 2010, foi feita uma avaliação do comportamento do MTA fotoativável em
tubos de polietileno no alvéolo de ratos, comparando-o com o MTA (Angelus). Em 30
dias ambos os materiais, inclusive o controle apresentaram leve inflamação crônica.
O grupo controle (sem material) não apresentou formação óssea, o MTA (Angelus)
apresentou áreas de calcificação distrófica em contato íntimo com o material nos
períodos avaliados e o MTA experimental não estimulou a formação de calcificação
óssea, porém o tecido ósseo cicatricial estava em contato com o material separado
por um tecido não-mineralizado. Bis-GMA presente no MTA experimental não
interferiu na cicatrização alveolar após 90 dias (GOMES-FILHO et al., 2010). A
mineralização pode ser retardada pela presença do bisfenol-alfa-metacrilato, um dos
principais componentes do material, o qual é altamente solúvel, ou pelo
aprisionamento dos óxidos de cálcio do MTA (GOMES-FILHO et al., 2011).
Gandolfi, et. al., em 2011, apresentaram um cimento fotopolimerizável de
MTA com silicato de cálcio, voltado para utilização como material retro-obturador em
cirurgia parendodôntica e aplicação em defeitos ósseos, buscando suprir a limitação
do cimento de MTA de longo tempo de presa. O material desenvolvido é constituído
por silicato de cálcio que constitui o pó e a parte líquida que é formada pelos
monômeros HEMA e TEGDMA, mais CQ e EDAB. Neste estudo realizaram diversos
testes tais como o ensaio de citotoxicidade, sorção e solubilidade, liberação de
cálcio entre outros. No teste de citotoxicidade o MTA fotopolimerizável apresentou
aumento da viabilidade celular como os demais grupos (ProRoot e controle) após
24horas, porém após três dias a viabilidade celular do ProRoot foi maior. O MTA
fotopolimerizável apresentou baixa solubilidade e absorveu mais água que os
demais materiais. Apresentou liberação de cálcio e estimulou a formação óssea
(GANDOLFI et al., 2011).
3.3 Monômeros resinosos
O MTA experimental fotoativável é composto por duas pastas uma pasta base
e uma ativadora. Cada uma destas pastas apresenta em sua composição 40% de
Bis-EMA, sendo 20% de Bis-EMA 10 e 20% de Bis-EMA 30.
Monômero é denominado um composto químico capaz de reagir para formar
um polímero. Os polímeros consistem em grandes moléculas orgânicas e quanto
31
mais longa a cadeia do polímero, maior é a quantidade de tramas entre as cadeias,
portanto, mais difícil se torna distorcer o material polimérico, e assim, as
características como rigidez, resistência e temperatura de fusão aumentam com o
aumento da cadeia. Quanto maior a cadeia, maior o seu peso molecular
(ANUSAVICE, 2005).
Biologicamente, a polimerização dos polímeros raramente é inteiramente
completa, e desta forma, as moléculas dos monômeros residuais podem ser
lixiviadas (devido seu baixo peso molecular) e causar reações adversas, como as
reações alérgicas. Essa perda de monômeros leva a diminuição do peso molecular
do polímero (ANUSAVICE, 2005).
Os polímeros são dissolvidos lentamente e raramente são solúveis ou
insolúveis em algum líquido e quanto mais longa a cadeia mais lentamente um
polímero dissolve. Os polímeros tendem mais a absorver um solvente, inchar e
amolecer, do que a dissolver. As ligações cruzadas impedem a completa separação
da cadeia e retardam a dissolução portanto polímeros com grande quantidade de
ligações cruzadas não podem ser dissolvidos. As moléculas absorvidas afastam as
cadeias poliméricas e facilitam o escorregamento das cadeias, esse efeito
plastificante é chamado de plastificação. A ligação cruzada provê um número
suficiente de pontes entre as macromoléculas lineares, para formar uma rede
tridimensional que diminui a sorção de água e a solubilidade e aumenta a resistência
e a rigidez da resina (ANUSAVICE, 2005).
Os dimetacrilatos surfactantes, apresentam dois grupos polimerizáveis
formando polímeros com ligações cruzadas (C=C). Estes materiais têm a
característica de reduzir a tensão de superfície, tornando mais fácil a mistura entre
dois líquidos. São componentes orgânicos ambifílicos, pois contém tanto grupos
químicos hidrofílicos quanto hidrofóbicos, sendo solúveis em água e solventes
orgânicos. Este comportamento bipolar é muito importante para a melhora dos
sistemas adesivos, pois possibilita menor hidrólise devido à formação das ligações
cruzadas, sem a perda de massa, produzindo propriedades melhoradas de
penetração nas fibrilas desmineralizadas de colágeno na camada hibrida (ZANCHI
et al., 2011).
32
O monômero Bis-EMA (bisfenol A etoxilado dimetacrilato) é um análogo
dimetacrilato do Bis-GMA (2,2-bis [4 - (2-hidroxi-3-methacryloyloxypropyl) fenil] –
propano) que pode apresentar diferentes tamanhos de cadeias e peso molecular, se
caracterizam basicamente pela presença de dois radicais metacrilatos
correspondendo ao grupo hidrofóbico e longas cadeias de óxido de etileno ([-CH2-
CH2-O-]n) que são a parte hidrofílica da molécula. Estas longas cadeias estendidas
de óxido de etileno propiciam grande flexibilidade a estes materiais, melhorando a
mobilidade de todo o sistema (Figura 2).
Figura 2 - Estruturas moleculares do Bis-EMA com 4, 10 e 30 óxidos etilenos e a
estrutura molecular do Bis-GMA (OGLIARI et al., 2008).
O Bis-GMA consiste em um monômero dimetacrilato amplamente utilizado
para criar a base de resinas de materiais dentários, apresenta rígida estrutura
aromática a qual fornece adequadas propriedades mecânicas para os materiais, o
que é necessário para obtenção de bons resultados clínicos. Porém a alta
viscosidade do Bis-GMA diminui o grau de conversão dos monômeros na ausência
de outros monômeros de baixa viscosidades. No entando, quando se adiciona
monômeros de baixa viscosidade como o TEGDMA ocorre aumento na contração de
polimerização e absorção de água, o que pode prejudicar o desempenho clínico do
material (OGLIARI et al., 2008).
O Bis-EMA apresenta menor viscosidade que o Bis-GMA, uma característica
favorável para o desempenho dos materiais odontológicos. Neste estudo os autores
33
avaliaram a influência do tamanho da cadeia de monômeros do Bis-EMA sobre os
perfis de polimerização. O Bis-EMA 30 apresentou maior taxa de converção (82%)
que os monomeros Bis-EMA 10 e Bis-EMA 4 (78, 3% e 59,4% respectivamente).
Com relação a sorção de água o Bis-EMA 30 apresentou valor mais elevado (622,3)
quando comparado ao Bis-EMA 4 e 10. Em relação a solubilidade o comprimento da
cadeia foi significativo, o Bis-EMA 4 e 10 foram semelhantes (5,6 e 7,4,
respectivamente) e inferiores ao Bis-EMA 30 (16,36). Os monômeros Bis-EMA 10 e
30 apresentaram alta elasticidade (OGLIARI et al., 2008).
O monômero HEMA, amplamente utilizado na composição de adesivos
dentários, é um monômero pequeno, formado por apenas um grupo polimerizável o
que o torna mais suscetível a hidrólise, podendo diminuir a resistência mecânica dos
materiais e se difundir pelos túbulos dentinários causando inflamação pulpar
(ZANCHI et al., 2010).
Com base nisto, um estudo buscou substituir o HEMA, de adesivos
experimentais auto-condicionantes, pelo Bis-EMA 30, que por apresentar mais
óxidos etilenos pode apresentar melhor comportamento biológico. A molécula do
Bis-EMA apresenta dois extensores de cadeia longa de unidades de óxido de etileno
que produzem um comportamento bi-polar, atuando como um agente de monômero
de superfície ativa ou surfactante depende da relação de unidade polar/apolar.
Quando foi utilizado em uma concentração de 40% do Bis-EMA 30 o adesivo
experimental apresentou comportamento mecânico (micro tensão) semelhante ao
adesivo comercial controle. A citotoxicidade diminui neste caso por diminuição da
penetração do Bis-EMA nos túbulos dentinários (ZANCHI et al., 2010).
Um estudo avaliou as propriedades de diversas associações dos monômeros
Bis-GMA, TEGDMA e Bis-EMA 4, buscando substituir o TEGDMA e em seu lugar
associar o Bis-EMA 4 ao Bis-GMA. Dentre os ensaios, realizaram a tração diametral
(DTS). Os autores observaram que formulações compostas por 30% ou mais de Bis-
EMA em substituição ao TEGDMA diminuíram a resistência mecânica. O valor de
DTS quando usado 100% de Bis-EMA foi de 28.9 MPa. Outro resultado que se
mostrou bastante diferente do comportamento do TEGDMA associado com o Bis-
GMA foi o teste de sorção, onde conforme o TEGDMA foi sendo substituído pelo
Bis-EMA a sorção de água foi diminuindo (MORAES et al., 2010).
34
Geurtsen em 1998 avaliou a citotoxicidade de 35 monômeros resinosos em
fibroblastos 3T3 e em cultivo primário de fibroblastos pulpares, gengivais e do
ligamento periodontal. Os monômeros mais citotóxicos foram o UDMA, o Bis-GMA e
o TEGDMA. O Bis-EMA apresentou menor citotoxicidade que estes monômeros
acima mencionados (GEURTSEN et al., 1998).
A citotoxicidade de quatro resinas compostas (Z100, Solitaire 2, Filtek P60 e
Synergy) foi avaliada nos fibroblastos 3T3, através do contato direto com as células
por 72hs e com o eludato do extrato obtido pelo etanol destes compósitos. O teste
colorimétrico MTT foi utilizado. O material mais citotóxico no contato direto foi a
resina Solitaire 2 (Bis-GMA, TEGDMA, UDMA) e a menos citotóxica foi a Synergy
(Bis-GMA, Bis-EMA, TEGDMA). No outro teste a resina Synergy apresentou maior
citotoxicidade, não havendo diferença estatística entre os outros grupos. Esses
resultados se devem devido à composição de cada material (DARMANI et al., 2007).
Em outro estudo foi avaliada a qualidade e a quantidade dos monômeros Bis-
GMA, TEGDMA, UDMA e o Bis-EMA 4 extraídos com etanol das resinas Z100 e
Z250. O monômero Bis-EMA de presa de 60s apresentou liberação crescente do
monômero durante 30 dias. O Bis-EMA de presa de 100s apresentou liberação
somente nos três primeiros dias, sendo semelhante ao TEGDMA e UDMA. Quando
extraídos os monômeros das resinas observaram que quanto maior o tempo de
polimerização menor a liberação dos monômeros. O Bis-EMA está presente
somente na Z250, sendo liberado por 30 dias (SIDERIDOU e ACHILIAS, 2005).
Estudo com cultura primária de fibroblastos pulpares avaliou a citotoxicidade
de 4 adesivos odontológicos, CMF Bond (Adesivo), Prime&Bond, Clearfil S (adesivo)
e XP Bond. O adesivo CMF Bond foi o único que apresentou viabilidade celular
semelhante ao grupo controle após 72h de teste, permitindo proliferação celular, o
que pode ser explicado por este adesivo ser livre de TEGDMA e HEMA (TRUBIANI
et al., 2010).
35
4 MATERIAIS E MÉTODOS
O projeto de pesquisa do presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas
(Parecer Nº 162/2010).
4.1 Ensaios Biológicos
4.1.1 Técnica de cultivo primário de fibroblastos pulpares humanos
Através do cultivo primário foi estabelecida uma linhagem celular de
fibroblastos pulpares humanos (FPH), pela técnica de explants (FRESHNEY, 2000),
para a avaliação da biocompatibilidade do MTA dual fotoativável experimental (MTA
F) comparado com o MTA comercial (Angelus, Soluções Odontológicas, Londrina,
PR, Brasil). Figura 3.
A linhagem celular foi estabelecida no Laboratório de Cultivo Celular da
Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pelotas (NCT-Bio/FOUFPel).
Terceiros molares hígidos com rizogênese incompleta e com o ápice aberto,
apresentando indicação de extração por motivos terapêuticos, foram extraídos na
Unidade de Cirurgia de Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de
Pelotas e utilizados nessa pesquisa, para os quais os pacientes efetuavam doação,
assinando termo de doação dos dentes para a pesquisa. Dois dentes,
primeiramente, foram extraídos e imediatamente transportados para o laboratório,
sob refrigeração em um falcon de 15ml contendo meio de transporte composto por
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco/Invitrogen–Lote: 563487)
com 10% de soro fetal bovino (SFB, Gibco/Invitrogen- Lote:210120) e 1% de
antibiótico (estreptomicina/penicilina, Gibco/Invitrogen-Lote: 847143). Na capela de
fluxo laminar vertical (Quimis/ Série 041109) cada dente teve a sua polpa removida
através do ápice radicular com o auxílio de curetas estéreis (Dentsply, n° 17). Após,
os fragmentos pulpares foram lavados por duas vezes em PBS (Gibco/Invitrogen-
36
Lote:558182) e imersos em um meio de cultivo (DMEM + 10% de SFB + 1% de
antibiótico).
Logo, em uma placa de Petri estéril o tecido pulpar foi fragmentado com o
auxílio de duas lâminas de bisturi n° 15, em várias partes de aproximadamente 1
mm2 cada. Esses fragmentos foram colocados em uma garrafa de cultivo celular
(Techno Plastic Products) de 25 cm2, de modo que se mantivessem aderidos ao
fundo da garrafa. Nesta garrafa de cultivo com os fragmentos foi adicionado 1ml de
meio de cultivo (DMEM + 10% de SFB + 1% de antibiótico) e logo foi levada a
incubadora (estufa 5% CO2 e 95% de O2, Thermo Electron Corporation). Nas
primeiras 72 horas, os fragmentos permaneceram em repouso, no interior da garrafa
de cultivo, sem nenhum movimento nos frascos. Após este primeiro período, as
garrafas foram monitoradas a cada 48/72 hs em microscópio de luz invertida
(AAKER) para a observação da migração das células a partir dos explants. Nesse
período, 1ml de meio de cultivo era adicionado, cuidadosamente a cada garrafa de
cultivo. Os fragmentos não aderidos foram removidos. Após o início da migração das
células, os explants foram descartados, e as células mantidas até a sua confluência
na garrafa de cultivo, sempre em atmosfera de 5% CO2 a 37°C.
O meio de cultura foi trocado a cada dois ou três dias, de acordo com o
metabolismo celular observado através da alteração de coloração do meio. As
células foram subcultivadas quando atingiam uma quantidade maior que 70% da
área cultivável do frasco, o que se denomina subconfluência. Para o subcultivo, a
garrafa foi levada à capela de fluxo laminar, logo o meio de cultura do frasco foi
removido com pipeta Pasteur estéril acoplada à bomba a vácuo (AspiraMax/
Indústria de Aparelhos Médicos Ltda). A pipeta foi apoiada no fundo da garrafa na
parede oposta a área de cultivo para a sucção do meio. A monocamada celular foi
lavada uma vez com 3 ml de PBS, pH 7,2. Em seguida, o PBS foi sugado e as
células separadas entre si e do fundo do frasco com a adição de 2 ml de solução de
tripsina a 0,25% com ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (Gibco/Invitrogen –Lote:
794994) durante 5 minutos, a 37ºC. Passados os 5 minutos a tripsina foi inativada
com 4ml de meio de cultura contendo SFB reservado anteriormente e, as células em
suspensão transferidas para um falcon de 15 ml. Com uma pipeta volumétrica o
conteúdo do falcon foi ressuspenso para homogeneização. Alíquotas dessa
suspensão de células foram distribuídas em duas novas garrafas de 25 cm2
37
contendo 5 ml de meio de cultivo suplementado com SFB a 10% e na garrafa de
origem. Os frascos foram mantidos em estufa à temperatura de 37ºC e atmosfera
úmida contendo 5% de CO2. Cada procedimento de subcultura originou nova
passagem da linhagem celular. As células usadas para os testes de citotoxicidade
estavam entre a 5ª e 10ª passagem.
Figura 3. Explants (setas brancas) e início da migração dos fibroblastos pulpares (a
e b); FPHs em baixa confluência (c) e em 70% de confluência (aumento de 40 X) (d).
38
4.1.2 Cultivo da linhagem celular 3T3
Fibroblastos de camundongo de uma linhagem estabelecida 3T3/NIH, foram
descongelados, provenientes do Laboratório de Cultivo Celular da Faculdade de
Odontologia (NCT-Bio/FOUFPel). Figura 4.
Para o descongelamento um tubo de criogenia graduado de 4,5ml (Techno
Plastic, ref 89050) contendo a linhagem celular 3T3/NIH foi levado à temperatura de
37ºC através da parcial imersão em banho-maria (Biopar, Mod BM 03) por cinco
minutos e a seguir, dentro de capela de fluxo laminar vertical, o conteúdo foi
adicionado a uma garrafa de cultivo celular de área de superfície 25cm2 (Techno
Plastic Products), a qual já continha 5ml de DMEM completo à temperatura de 37ºC.
A garrafa de cultivo foi colocada em estufa de 5% CO2 à 37ºC e permaneceu
por um período de três horas para promover a adesão celular no fundo da mesma.
Após este período, o meio de cultura contendo DMSO (protetor criogênico) foi
removido da garrafa com pipeta Pasteur estéril acoplada à bomba a vácuo
(AspiraMax/Indústria de Aparelhos Médicos Ltda). Novo meio de cultura (DMEM,
completo) foi adicionado à linhagem celular e esta permaneceu em atmosfera úmida,
à 37ºC, até obter-se a confluência de aproximadamente 70% da superfície cultivável
da garrafa.
Procedimentos semelhantes aos descritos anteriormente de troca de meio de
cultura e subcultivo foram realizados até a obtenção de um número satisfatório de
células para realização dos experimentos com esta linhagem celular como explicado
no item anterior para cultivo dos FPHs.
39
Figura 4. a) Células 3T3 no inicio do cultivo (aumento 40X); b) 3T3 com 100% de confluência (10X); c, d) células com 70% de confluência (40X), observa-se a morfologia celular.
4.1.3 Contagem celular
Antes da realização dos experimentos foi determinado o número de células
existentes nos frascos de cultivo. A finalidade da contagem foi conhecer o número
de células para uma divisão igualitária de células por grupo experimental. O número
de células semeadas em cada placa de 96 poços foi de 2 x 104 , para o teste de
citotoxicidade, e na placa de 24 poços de 4x104 células por poço, para o teste de
genotoxicidade.
Para a determinação do número (contagem celular), o meio foi sugado com a
pipeta Pasteur, as células foram lavadas uma vez em PBS e ressuspensas do seu
substrato utilizando solução de tripsina a 0,25% em PBS e 1% de EDTA
(Gibco/Invitrogen –Lote: 794994) por aproximadamente 5 minutos. Para inativação
da tripsina 4 ml de meio com SFB foram adicionados às garrafas, como descrito na
técnica de subcultivo. Após, o conteúdo total da garrafa utilizada no experimento foi
removido e colocado em um falcon de 15ml. O volume de células com meio foi
ressuspenso com a pipeta volumétrica para homogeneização das células no
40
sobrenadante. Dessa suspensão celular, 20 µL foram pipetados e em um
hemocitômetro (Câmara de Neubauer Espelhada Melhorada/ Labor Optik), que logo
foi levado ao microscópio invertido de fase para realização da contagem. As células
com aspecto brilhante e formato arredondado foram consideradas viáveis, enquanto
as células escurecidas com formato distorcido foram consideradas mortas, não
sendo contabilizadas na contagem dos 4 quadrantes das extremidades. O cálculo foi
feito com base na fórmula onde o número total de células viáveis contadas foi
multiplicado por 104. Esse valor foi dividido pelo número de quadrados contados (4)
e multiplicado pelo fator de diluição (6ml). A partir da fórmula obtivemos a
quantidade aproximada de células presentes em cada frasco.
O número total de células presentes no frasco foi obtido através da equação
abaixo:
Após a determinação do número de células, uma quantidade de DMEM foi
adicionada a suspensão para obter-se a quantidade desejada de células por volume
para cada poço testado.
4.1.4 Preparo dos corpos-de-prova a partir do MTA convencional e do
fotoativado
O MTA convencional (Angelus, Soluções Odontológicas, Londrina, PR, Brasil)
e o MTA experimental fotoativado (MTA F) foram divididos em dois grupos e
manipulados de acordo com as recomendações dos fabricantes. O MTA
convencional (MTA C) foi espatulado em uma placa de vidro na proporção pó/líquido
de 3:1, com o auxilio de um medidor. A tabela 1 mostra a composição química do
MTA F. Para o MTA F, foram manipulados 4g de cada pasta do material, cada um
dos ingredientes foi pesado, em balança de precisão, nas porcentagens indicadas.
Logo após, foram confeccionados os corpos-de-prova em formato de pastilhas
apresentando 5,5 mm de diâmetro e 1 mm de espessura estabelecidos com o auxílio
de uma matriz metálica circular (figura 5), os corpos-de-prova foram polimerizados
41
por 40s de cada face com fotopolimerizador (Radii Cal SDI). Uma matriz de poliéster
foi colocada sobre os corpos de prova na matriz metálica circular antes da
fotopolimerização, de ambos os lados do corpo-de-prova. O MTA convencional ficou
estocado em um tubo plástico, a temperatura ambiente sem umidade, por 24 horas
até a presa total, enquanto o MTA F ficou em média 20 horas estocado.
Tabela 1. Composição química do MTA dual fotoativável experimental testado.
MTA dual fotoativável
Pasta A Pasta B
60% MTA 60% Itérbio
20% Bis-EMA 10 20% Bis-EMA 10
20% Bis-EMA 30 20% Bis-EMA 30
Iniciadores Iniciadores
DHEPT 1% Peróxido de benzoila 1,5%
EDAB 0,8%
CQ 0,4%
Após tal período os corpos-de-prova foram esterilizados através da exposição
à luz ultravioleta (MODARESZADEH et al., 2010; DAMAS et al., 2011) por duas
horas (CHIANG e DING, 2010) sendo 60 minutos para cada lado da pastilha. Após,
cada um dos materiais foi colocado em DMEM sem soro, em um volume de 1 ml
cada, durante 24 horas, em tubos de criogenia (2ml, Eppendorf) (MODARESZADEH
et al., 2010; YAN et al., 2010) em estufa a 37°C para o condicionamento do meio
(DAMAS et al., 2011) (Figura 6). Passado o período, no interior da capela de fluxo
laminar, os corpos-de-prova de ambos os materiais foram removidos dos tubos, com
auxílio de pinça clínica para algodão estéril (Golgran). Os eludatos obtidos foram
congelados em freezer - 80ºC (Indrel/ IULT 335D) para posterior utilização nos
testes de citotoxicidade e genotoxicidade (GOMES-FILHO et al., 2009; ALANEZI et
al., 2010).
42
Figura 5. Matriz metálica utilizada para a confecção dos corpos-de-prova.
Figura 6. Corpo de prova imerso em 1 ml de DMEM para formação do eludato teste.
4.1.5 Teste de citotoxicidade
4.1.5.1 Teste de viabilidade celular (MTT)
As condições de tratamento incluindo o cultivo e tempo de exposição foram
baseadas nas especificações de International Standards Organization (1997).
A suspensão das células foi plaqueada em uma concentração de 2 x 104
células por poço e distribuídas em placas de cultivo celular (ELISA/ Techno Plastic
Products) de 96 poços. Cada poço recebeu 200 µl de DMEM suplementado com
10% de SFB e 1% de antibiótico, onde se obteve o número de células descrito. As
placas foram então incubadas à 37ºC, em ar a 5% de CO2, por 24 h com os
fibroblastos 3T3/NIH e por 48h com os FPH, para promover a adesão celular ao
43
fundo dos poços (FRESHNEY, 2000). Passado o período, os 200µl de meio foram
removidos e logo adicionados 200µl dos meios condicionados pelos materiais
experimentais, com adição de 20µl de SFB por poço, em contato com as células nas
placas de 96 poços (GOMES-FILHO et al., 2009; ALANEZI et al., 2010). Após a
adição do eludato a placa foi colocada por cinco minutos no agitador Shaker
(Biomixer/ TS-2000A UDRL Shaker) para homogeneização dos meios
condicionados. As células do experimento ficaram em contato com o meio teste por
24 horas na incubadora de CO2. Poços com DMEM sem a adição de células foram
usados como controles brancos.
Após a remoção dos produtos teste, 20 µl de MTT (sal tetrazolium [3-(4,5-
dimetltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium brometo] (Sigma/Aldrich) diluídos em 180 µl
de DMEM foram adicionados em cada poço sendo as placas incubadas em
ambiente sem luminosidade por quatro horas à 37ºC (GOMES-FILHO et al., 2009). A
solução contendo MTT diluído em DMEM foi aspirada e 200 µL de dimetilsulfóxido
(DMSO/ Synth) foram adicionados a cada poço e as placas novamente levadas à
mesa agitadora a uma velocidade de 150 rpm por dez minutos para a solubilização
dos cristais de formazan. Tais cristais são produzidos pela redução do MTT pela
enzima desidrogenase succínica da respiração celular. Subseqüentemente, a
absorbância foi aferida usando o espectrofotômetro (Termoplate/TP-Reader) em um
comprimento de onda de 540 nm.
Foram utilizados três poços da placa para cada material teste e para o
controle, nos quais foram adicionadas células com o meio de cultura, não sendo
realizada troca pelo meio condicionado.
O experimento foi repetido três vezes com cada tipo celular em momentos
independentes para confirmação dos resultados.
4.1.6 Teste de genotoxicidade
4.1.6.1 Teste de contagem de micronúcleos (MN)
OS ensaios de genotoxicidade foram realizados somente com a linhagem
celular 3T3/NIH.
44
No interior da capela de fluxo laminar foram adicionadas 400µl de DMEM com
SFB, após a contagem celular, onde se obteve 4x104 células/poço, em seis poços de
uma placa de 24 poços (Techno Plastic Products). Antes da realização do
plaqueamento, em cada poço a ser utilizado foi adicionada uma lamínula de vidro
circular previamente esterilizada com 13 mm de diâmetro (G13C Glasscyto), onde a
célula realizou a sua adesão, e posteriormente foi feita a contagem dos MN no
microscópio. Todos os procedimentos foram realizados no interior da capela de fluxo
laminar para manter a esterilidade. Após, a placa foi levada à estufa 37°C com 5%
CO2 e 95% O2 por 24 horas com as 3T3. Passado o período de incubação o meio foi
substituído em dois poços por 400µl do eludato formado pelo MTA F com adição de
40 µl de SFB, outros dois poços por 400µl do eludato do MTA convencional, com
adição de 40µl de SFB e nos outros dois poços denominado grupo controle foram
adicionado 400 µl de novo meio de cultivo (DMEM + 10% SFB), novamente a placa
foi levada a incubadora, após ter ficado 5 minutos na mesa agitadora (Biomixer/ TS-
2000A UDRL Shaker), por mais 24horas.
Passado o período de incubação, fora da capela de fluxo, os meios foram
sugados dos poços e a cada um foi adicionado 300µl de PBS por 10s, para lavagem
das lamínulas. As células foram fixadas, dentro do próprio poço, com 300µl de
solução constituída por três partes de metanol (Vetec) para uma parte de ácido
acético (Synth) e imediatamente foram levadas ao freezer -20ºC (Consul 220) por 30
minutos. O protocolo utilizado para fixação e coloração foi adaptado de
(FERNANDEZ et al., 2010).
Passados os 30 minutos, o fixador foi sugado e adicionado ácido clorídrico 1N
(Vetec) a temperatura ambiente durante um minuto, logo após, este foi substituído
por ácido clorídrico pré-aquecido em banho-maria a 63°C (Techno Plastic, BMD01),
a placa foi levada a estufa a 60 °C (Fanen) por dez minutos. Em temperatura
ambiente aguardou-se dez minutos o resfriamento natural do conjunto para
prosseguir. Sugou-se o ácido clorídrico e novamente se adicionou acido clorídrico
1N a temperatura ambiente por cinco minutos. O ácido foi sugado e foram feitas
duas passagens de cinco minutos de água destilada. Feito isto, a água foi sugada e
as lamínulas foram mantidas em repouso até a completa secagem.
45
Iniciou-se então a coloração com a Técnica de Feulgen, que consiste na
coloração de todos os elementos celulares que contenham DNA. O DNA após
hidrólise ácida moderada, quando tratado pelo reagente de Schiff, dá lugar à
formação de um produto que cora num tom de vermelho arroxeado.
A coloração do material nuclear foi realizada com Reagente de Schiff (ácido
periódico de Schiff) por duas horas e trinta minutos à temperatura ambiente, em
ambiente escuro. Após, o reagente foi removido e as lamínulas cobertas por água
tamponada por quatro minutos sem luminosidade, a água tamponada foi removida e
realizada lavagem com água destilada e remoção das lamínulas dos poços. Foi feita
identificação das mesmas e repouso para secagem. Vinte e quatro horas depois as
lamínulas foram imersas no corante Fast Green (Sigma-Aldrich) por 10 segundos,
para obtenção da contra coloração do citoplasma, e depois lavadas em álcool (96%)
por três vezes durante três segundos cada passagem. Para a visualização da
reação em microscopia as lamínulas foram montadas em lâminas histológicas com
Entellan (Merck KGaA), após 24h de secagem.
Os micronúcleos foram visualizados em microscópio óptico comum (CX 21
Olympus), com objetiva de 40x e oculares de 10x em lâminas identificadas de forma
a cegar a leitura. A determinação da proporção de micronúcleos ocorreu mediante a
contagem manual de micronúcleos em 1000 células por campo. Os experimentos
foram repetidos por três vezes e analisados por dois avaliadores cegos.
Os critérios utilizados para caracterizar a formação dos micronúcleos foram os
seguintes: (a) deve ter contorno regular, redondo ou oval e estar dentro do
citoplasma da célula; (b) apresentar coloração semelhante ao núcleo principal; (c)
seu diâmetro deve ser menor que 1/3 do diâmetro do núcleo principal; (d) deve estar
no mesmo plano de foco do principal; (e) deve estar separado ou marginalmente
justaposto ao núcleo principal, de modo que haja identificação clara do limite nuclear
de ambos (COUNTRYMAN e HEDDLE, 1976).
46
Figura 7. Célula micronucleada, MN (seta) de forma arredondada (a); um dos
critérios de exclusão: cromatina condensada em duas células-filhas, pós –mitose (b).
Foi contado um número de 1.000 células por cultura e realizados dois cultivos
por cada grupo testado, assim como preconizado por Kirsch-Volders et al., 2003
(KIRSCH-VOLDERS et al., 2003).
4.2 Ensaios Físicos - Mecânicos
4.2.1 Resistência à tração diametral
Os corpos de prova foram preparados com o auxilio de uma matriz
metálica circular bipartida tendo dimensões de 4 mm de altura e 2 mm de espessura
(Figura 8).
47
Figura 8. Matriz metálica individual utilizada para a confecção dos corpos-de-prova.
Nota-se um CP com o MTA convencional em processo de confecção.
O MTA Angelus foi espatulado com água destilada na proporção pó/líquido
3:1. Os CP foram preparados individualmente e cada um permaneceu 15 minutos na
matriz para posterior remoção, evitando a sua fratura. O MTA F foi preparado na
quantidade de quatro gramas de cada pasta. Para a confecção de cada CP foi
pesado 0,060g (Balança de precisão, AW220D; Shimadzu) de cada pasta. Os
espécimes foram polimerizados por 40 segundos de cada lado, cobertos com uma
matriz de poliéster.
Depois de removidos da matriz, os CP, de ambos os materiais foram
individualmente armazenados em solução de água destilada a 37°C por 24 horas.
Os espécimes do MTA F foram lixados e polidos em lixa 600 (Norton S.A., São
Paulo, SP, Brasil). As dimensões dos CP foram medidas, considerando diâmetro e
espessura, com um paquímetro digital (Mitutoio, Tokio, Japão, 0.01mm precisão) e
então submetido ao teste.
Os valores de resistência à tração diametral foram realizados em uma
máquina universal (Emic DL-500, São José dos Pinhais, PR, Brasil) com uma carga
de 1000 N e velocidade de 0.5mm/minuto. Foram testados 11 espécimes de cada
grupo. Os espécimes foram posicionados verticalmente na máquina para aplicação
da carga compressiva.
48
4.2.2 Sorção e solubilidade
Para realização dos testes foram confeccionados dez CP do MTA C (Angelus)
e dez CP do MTA F, com as mesmas proporções, características de manipulação e
matriz metálica de cinco unidades cilíndricas de 5,5mm X 1mm descritas no item
4.1.4.
Depois de preparados, todos os CP tiveram seus quatro cantos e o centro
medidos com um paquímetro digital (Mitutoio, Tokio, Japão, 0.01mm precisão), na
qual uma média foi calculada para determinar o volume (V) em mm3. Cada CP foi
armazenado individualmente em tubo de criogenia (Eppendorf) aberto em um
dessecador contendo sílica a 42°C. Foram repetidamente pesados em intervalos de
24horas, em uma balança analítica digital (AW220D; Shimadzu) até a estabilização
da massa, obtendo-se o valor de m1.
Após, cada CP foi imerso em 1 ml de água destilada e armazenado a 37°C
durante sete dias. Ao final dos sete dias os espécimes foram removidos e secos com
papel absorvente e novamente pesados para obtenção da massa úmida (m2). Então
os espécimes foram recolocados no dessecador a 42°C até nova estabilização da
massa para obtenção de m3.
A sorção de água (WS) e a solubilidade (SL) foram calculadas em mg/mm3,
através das seguintes fórmulas:
WS = (m2 - m3)
V
SL = (m1 - m3)
V
49
4.3 Análise estatística
Os resultados dos testes de citotoxicidade e genotoxicidade foram submetidos
ao método estatístico baseado no modelo de distribuição normal e igualdade de
variância considerando-se o valor de p < 0,05 como estatisticamente significante.
O programa utilizado foi o Sigma Stat 3.5, e o teste utilizado ANOVA e
Kruskall Wallis.
Para os testes de resistência a tração diametral e sorção e solubilidade o
teste estatístico utilizado foi a análise de variância One-way ANOVA e Tukey para
realizar a análise comparativa entre os grupos (p< 0,05).
50
5 RESULTADOS
5.1 Citotoxicidade
Os ensaios foram realizados em triplicata e repetidos independentemente três
vezes para cada tipo celular (FPH e 3T3/NIH). Em todos os ensaios os valores foram
expressos em porcentagem nos quais o valor do controle (sem tratamento) foi
equivalente a “1”, sendo os demais grupos comparados a este através dos dados
normalizados.
Os dados são apresentados como a percentagem média das absorbâncias
para cada sistema de teste e o valor da mediana de cada triplicata foi dividido pelo
valor da absorbância do controle do respectivo teste, obtendo-se assim, as
percentagens de cada MTA testado dentro dos independentes experimentos.
5.1.1 Fibroblastos pulpares humanos
A viabilidade celular entre o MTA C e o MTA F não apresentou diferença
estatisticamente significante, porém o MTA F apresentou desempenho mais
favorável quando comparado ao grupo controle (Figura 9).
5.1.2 Fibroblastos 3T3
A viabilidade celular entre o MTA C, o MTA F e o grupo controle não
apresentaram diferença estatisticamente significante (Figura 10).
51
Figura 9. Viabilidade celular dos materiais testados com os FPHs, letras iguais
resultados sem diferença estatistica, letras diferentes resultados estatisticamente
diferentes.
Figura 10. Viabilidade celular dos materiais testados com as 3T3(NIH), letras iguais
resultados sem diferença estatistica.
52
5.2 Genotoxicidade
A contagem de micronúcleos (MN) obteve 1.000 células por lamínula,
começando da parte superior esquerda do campo e seguindo no sentido horizontal.
As lâminas foram cegadas e contadas por dois examinadores diferentes para
confirmação dos dados. Foram realizados três experimentos independentes com
duas lamínulas cada.
O MTA C e o grupo controle (sem tratamento) apresentaram média de MN
semelhantes de seis e oito por 1.000 células, respectivamente. O MTA F apresentou
maior formação de MN quando comparado ao outro grupo controle, bem como ao
MTA C, porém, estatisticamente não apresentou diferença do grupo controle. A
quantidade média de micronúcleos para o MTA F foi de onze em 1.000 células
(Figura 11).
Figura 11. Média de MN encontrados por grupo em 1.000 células e comparação
entre os grupos. Letras diferentes, grupos estatisticamente diferentes.
53
5.3 Resistência à tração diametral (DTS)
Os resultados da DTS dos dois cimentos testados foram estatisticamente
diferentes (p < 0,0001). O MTA C apresentou valor superior de 7.6 MPa e o MTA F
de 4.8 MPa (Figura 12).
Figura 12. Resistência a tração diametral comparada entre os grupos.
A imagem abaixo mostra o padrão de fratura dos corpos-de-prova (Figura 13).
Figura 13. Padrão de fratura apresentado. Foi semelhante nos dois grupos,
apresentando fratura em apenas duas partes. MTA F e MTA C, respectivamente.
54
5.4 Sorção e Solubilidade
A tabela 2 mostra os valores obtidos de sorção e solubilidade para os
materiais testados com seu desvio padrão.
O MTA C e o MTA F apresentaram comportamento estatisticamente
semelhante em relação à absorção de água (p = 0,04559) e estatisticamente
diferente em relação a solubilidade na qual, o MTA C apresentou maior valor (p=
0.0002).
Sorção de água
(WS)
Solubilidade
(SL)
MTA C 11.3 + 3.0a 5.8 + 1.8a
MTA F 12.2 + 0.5a 2.9 + 0.2b
Tabela 2. Média e desvio padrão de sorção e solubilidade para o MTA C e para o
MTA F. Análise realizada por coluna. Diferentes letras subscritas indicam diferença
estatística entre os grupos (p< 0,05).
55
6 DISCUSSÃO
O MTA é um material recomendado para capeamento pulpar direto, pois é um
material bioativo, biocompatível que conduz e induz a formação de tecido
mineralizado (PARIROKH e TORABINEJAD, 2010a).
A produção de um MTA fotoativável com presa dual (como proposto no
presente estudo) pretende reduzir os problemas relacionados à dificuldade de
manipulação do MTA convencional, que são amplamente relacionados na literatura.
As propriedades físicas do MTA podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre
os quais podemos citar a proporção pó/líquido, o método de manipulação, pressão
de condensação e o tempo de manipulação (PARIROKH e TORABINEJAD, 2010a).
Além disso, a incorporação de uma maior quantidade de água no momento da
manipulação leva ao aumento da porosidade e, conseqüentemente, ao aumento da
solubilidade do cimento, o que pode desencadear uma maior liberação de cálcio.
Entretanto, o aumento da quantidade de cálcio liberada deve ser controlado, pois a
maior disponibilidade deste elemento diminui a proliferação celular em cultivo (MIDY
et al., 2001)
O MTA F, proposto no presente estudo, é composto por duas pastas em
seringas distintas que são dispensadas e homogeneizadas em quantidades iguais,
diminuindo assim a probabilidade de erros na proporção das duas pastas, o que
poderia provocar diminuição das propriedades mecânicas, físicas e biológicas. A
proposta de um produto que seja conduzido à cavidade através de seringas,
fotoativado por 40s e com a possibilidade de realização de uma restauração
definitiva imediata resolveria grande parte dos problemas ainda existentes no MTA.
A metodologia escolhida no presente estudo buscou avaliar a resposta
biológica do cimento experimental proposto através do cultivo de fibroblastos
pulpares humanos e células de uma linhagem celular amplamente utilizadas para
esse fim. Trabalhos prévios, avaliando a citotoxicidade de materiais odontológicos
usam linhagens celulares imortalizadas, como os fibroblastos 3T3 ou L949, que são
56
células mais resistentes que as células humanas, porém apresentam um
metabolismo diferente do fibroblasto pulpar humano frente ao material testado.
Sendo assim, com o cultivo primário de fibroblastos pulpares humanos buscou-se
sensibilidade específica do teste mais próximos da realidade clínica, visto que a
célula pulpar é o objetivo do material que está sendo desenvolvido (CHANG et al.,
2010).
Um dos problemas associados com às linhagens celulares, pode ser
relacionado ao rearranjo extenso do material cromossômico, no qual alguns dos
principais genes envolvidos na viabilidade celular sofrem alterações (DA SILVA et
al., 2006; RIBEIRO et al., 2006). Para facilitar a reprodutibilidade do experimento e
comparação dos resultados optou-se pela utilização dos fibroblastos 3T3/NIH, visto
que, a utilização de uma linhagem celular também é recomendada pela ISO (SEPET
et al., 2009). Além disso as células 3T3 são amplamente utilizadas para os
experimentos de citotoxicidade e genotoxicidade (SEPET et al., 2009; FERNANDEZ
et al., 2010; NOCCA et al., 2010; ZEFERINO et al., 2010).
Muitos autores têm realizado seus experimentos com a utilização de culturas
primárias (PEREZ et al., 2003; BRAZ et al., 2006; TAKITA et al., 2006; YASUDA et
al., 2008; CHANG et al., 2010; TRUBIANI et al., 2010; YAN et al., 2010; DAMAS et
al., 2011). A vantagem desse tipo de cultivo celular é que possui características
muito similares às células dos doadores, e por isso a resposta obtida in vitro simula
de forma mais fiel o que aconteceria in vivo. Como desvantagem pode-se citar a
dificuldade de reprodutibilidade, já que as células perpetuam as características do
doador, e assim cada cultivo primário terá fenótipo e genótipo similares aos dos seus
doadores (FRESHNEY, 2000).
Pérez em 2003 comparou o comportamento de duas linhagens celulares,
uma imortalizada (MG-63) e outra de cultivo primário (osteoclastos de feto de ratos)
frente ao ProRoot e o MTA branco. A MG-63 teve crescimento e adesão celular mais
rápido que os osteoclastos no MTA, porém quanto ao ProRoot não houve diferença.
O processo de adesão celular é complexo e dinâmico, o que representa um
papel crítico de cicatrização, crescimento, proliferação e diferenciação celular. A
maioria das células de cultura primária adere-se a matriz protéica para sobreviver e
proliferar e quando essas células são cultivadas em condições que dificultam a
57
proliferação e a adesão, elas param de crescer e perdem a viabilidade. Estas
características são bem diferentes nas linhagens estabelecidas, as quais
apresentam ancoragem independente à semelhança de um tumor in vivo,
crescimento e metástase (PEREZ et al., 2003).
Pérez, 2003 demonstrou que osteoblastos de cultivo primário mostraram
formação de nódulos ósseos enquanto a linhagem celular MG-63 não formou, sendo
os osteoblastos mais sensíveis que a MG-63. Desta forma, comprovou que células
de culturas primárias apresentam um melhor comportamento para testar os materiais
endodônticos.
O ensaio com MTT é considerado o método padrão para determinar a
citotoxicidade de materiais dentários em culturas celulares (JAFARNIA et al., 2009;
ALANEZI et al., 2010), além de ser um método simples, rápido e preciso (GOMES-
FILHO et al., 2009) que apresenta reprodutibilidade, capacidade de testar materiais
frescos e fixados em diversas fases.
Uma forma de disponibilizar o material para a execução da reação é o
eludato, que se obtém de através da solubilização das substâncias tóxicas do
material que potencialmente inibem a atividade e o crescimento celular (DARMANI et
al., 2007; ALANEZI et al., 2010; GANDOLFI et al., 2011).
Em nosso estudo foi possível observar que o MTA F obteve resposta
semelhante ao MTA C, ou seja, os monômeros utilizados na composição do material
experimental não interferiram inicialmente na citotoxicidade do material quando o
experimento foi realizado nos FPH. Na análise da figura 9 pode-se observar que o
MTA F promoveu maior proliferação celular que o MTA C e apresentou
estatisticamente maior viabilidade celular que o grupo sem tratamento (controle).
Contudo, quando o mesmo teste foi realizado com os fibroblastos 3T3/NIH, todos os
grupos apresentaram comportamento estatisticamente semelhante, no qual o MTA C
apresentou viabilidade celular semelhante ao grupo controle, como verificado por
Sepet, 2009 bem como o MTA F. Gomes-Filho, 2008, 2010 e 2011, utilizou um MTA
fotoativável semelhante ao testado neste estudo, avaliado através da técnica de
biocompatibilidade subcutânea in vivo, no qual o material experimental demonstrou-
se biocompatível, semelhante ao MTA convencional.
58
O monômero resinoso utilizado no material experimental (MTA F) foi o Bis-
EMA. Sabe-se que a maioria dos metacrilatos são altamente citotóxicos
(GEURTSEN et al., 1998). Entretanto o Bis-EMA apresentou comportamento menos
citotóxico em FPH e 3T3 no estudo de Geurtsen em 2008, no qual o Bis-GMA foi um
dos monômeros mais citotóxicos. Em contra partida, o Bis- GMA foi o monômero
utilizado no experimento de Gomes-Filho, 2008, e não demonstrou citotoxicidade.
No estudo de Darmani, 2007, a resina Synergy que apresenta Bis-EMA em
sua composição apresentou melhor compatibilidade que as outras resinas testadas
quando em contato direto com os fibroblastos 3T3, além de maior efeito citotóxico
quando em eludato de etanol, justificando os resultados pela alta liberação deste
monômero no eludato. A resina P60 que também apresenta Bis-EMA em sua
fórmula teve comportamento intermediário. Esses resultados podem ser
relacionados a interação dos vários componentes de cada material liberados no
meio. Em outro estudo foi observado que o monômero mais liberado das resinas foi
o TEGDMA e o menos liberado foi o Bis-GMA (DARMANI et al., 2007).
Zanchi et. al., 2010, propôs um adesivo livre de HEMA substituindo-o pelo
monômero Bis-EMA, visto que este poderá apresentar menor efeito citotóxico do
adesivo pela diminuição da penetração do adesivo nos túbulos dentinários, uma vez
que a difusão das substâncias liberadas dos materiais dentários podem reagir com o
tecido pulpar após a difusão através da dentina, principalmente em cavidades
profundas (KRIFKA et al., 2011).
Sabe-se que o efeito citotóxico dos monômeros nas células está relacionado
ao potencial de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que
vai ao encontro da biocompatibilidade do MTA, visto que este material não produz
aumento de ROS nas células (CAMARGO et al., 2009). Em concordância, estudos
recentes tem comprovado a citotoxicidade dos monômeros amplamente utilizados
na composição de adesivos dentários e resinas compostas, como o TEGDMA, o
HEMA e o Bis-GMA, através da produção de ROS (CHANG et al., 2010; NOCCA et
al., 2010; KRIFKA et al., 2011). Devidos estes fatores o teste de citotoxicidade
realizado torna-se necessário uma vez que os monômeros utilizados na composição
do MTA F podem causar inflamação pulpar (GEURTSEN et al., 1998).
59
Poucos estudos testam o Bis-EMA isoladamente, aparecendo em trabalhos
na formulação de algum material odontológico. Krifka, 2011, avaliou a citotoxicidade
de materiais livres de TEGDMA e HEMA, no qual dois materiais testados
apresentavam Bis-EMA em sua fórmula, entretanto tais materiais apresentaram
citotoxicidade pela formação de ROS.
Portanto, torna-se difícil comparar nossos resultados de citotoxicidade do
MTA experimental com os de outros estudos, porque estes testam materiais com
Bis-EMA que apresentam outros componentes associados, podendo a citotoxicidade
de determinado material ser relacionada a associação química dos demais
componentes (SIDERIDOU e ACHILIAS, 2005; DARMANI et al., 2007; SEISS et al.,
2009).
Em nosso experimento utilizamos matriz de poliéster sobre o CP antes da
polimerização, este recurso pode diminuir o efeito citotóxico do material, uma vez
que diminui a interferência na polimerização da superfície da resina pela presença
dos radicais livres de oxigênio (KRIFKA et al., 2011), o oxigênio livre interfere na
polimerização completa das resinas, ficando monômeros livres, que podem se
difundir pela cavidade bucal ou pela dentina (SEISS et al., 2009).
O teste de genotoxicidade utilizado foi o ensaio pela detecção de
micronúcleos (MN), o qual é considerado um indicador de danos cito-genéticos em
células humanas (COUNTRYMAN e HEDDLE, 1976).
O principal mecanismo responsável pela indução de micronúcleos é a quebra
da fita dupla de DNA, durante a divisão celular, levando à formação de pequenos
núcleos, bem menores que o original com fragmentos acêntricos e falha dos
aparatos mitóticos, resultando em MN com fragmentos de cromossomos ou
cromossomos inteiros em seu interior. O MN é resultado de um fragmento ou perda
cromossômica durante a mitose ou meiose celular (EVANS, 1997; KIRSCH-
VOLDERS et al., 2003).
O experimento de genotoxicidade foi realizado somente com a linhagem de
fibroblastos 3T3/NIH. A técnica de genotoxicidade com os FPH apresentou-se
bastante crítica, com dificuldades de adesão e de crescimento celular sobre a
lamínula no interior do poço de cultivo para realização do experimento, além de
60
problemas de fixação e coloração. Estes problemas sugerimos, relacionar-se ao
cultivo primário, visto que, para o ensaio de MN existem relatos de linhagens
celulares imortalizadas ou utilização de linfócitos humanos ou ainda células
humanas pela técnica de citologia esfoliativa (KIRSCH-VOLDERS et al., 2003; BRAZ
et al., 2006; DA SILVA et al., 2006; RIBEIRO et al., 2006; FENECH et al., 2011).
Em nosso estudo o MTA C não apresentou efeito genotóxico, apresentando
baixa formação de MN em 1.000 células, sendo o número de MN obtidos inferior aos
encontrados no grupo controle, de 6MN e 8 MN, respectivamente, o que corrobora
com os relatos da literatura. Portanto o MTA não apresenta genotoxicidade (BRAZ et
al., 2006; DA SILVA et al., 2006; RIBEIRO et al., 2006; CAMARGO et al., 2009;
ZEFERINO et al., 2010). O MTA F apresentou a formação de 11 MN em 1.000
células, o que representa um aumento em relação aos outros grupos, porém não
apresentou diferença estatística do grupo controle, porém foi estatisticamente mais
genotóxico que o MTA C.
Fernandez et. al., 2010, realizaram ensaio de genotoxicidade com o mesmo
grupo controle utilizado neste estudo, em condições metodológicas semelhantes,
com a utilização de fibroblastos 3T3/NIH e obtiveram em média 7 MN a cada 1.000
células. Os demais grupos compostos por agentes clareadores, sendo o material
mais genotóxico o peróxido de hidrogênio, que é um material comercialmente
disponível amplamente utilizado na clínica odontológica, apresentando uma média
de 22,3 MN em 1.000 células.
Camargo et al., 2009, realizaram o ensaio de genotoxicidade pela técnica de
MN, encontrando valores em torno de 10MN para o MTA C e para o seu grupo
controle, somente com meio de cultura, 11,25 MN, o que os torna semelhantes, ou
seja, não genotóxico. Utilizaram a linhagem celular V79, o que pode ser a causa da
diferença no número de MN, pela diferença de metabolismo celular.
Visto que, o MTA não apresenta efeito genotóxico, a maior formação de MN
no grupo do MTA F pode ser justificada pela presença de outro componente do
material como o monômero Bis-EMA, que pode apresentar efeito genotóxico, ou
pela associação dos componentes do material.
61
Alguns estudos têm demonstrado que alguns monômeros como o TEGDMA e
o HEMA, provocam estresse oxidativo na célula-alvo, produzindo mutagenicidade e
apoptose celular, estando à quantidade de MN formada relacionada à concentração
do monômero (LEE et al., 2006; SCHWEIKL et al., 2007). Contudo, nenhum estudo
de genotoxicidade foi realizado com o Bis-EMA, portanto, mais testes de potencial
mutagênico serão necessários.
Se o dano ao DNA causado pelo produto químico carcinogênico é reparado
ou persiste é um fato importante para o destino da células-alvo. No entanto, o
desenvolvimento de tumores nestas células não é depente somente dos danos
iniciais induzidos no DNA e de sua reparação, mas também de
outros fatores, como a produção de metabólitos reativos, a sua distribuição, e seus
efeitos sobre a proliferação celular. Neste contexto, os testes de genotoxicidade nem
sempre refletem a carcinogenicidade (FENECH, 2000; SASAKI et al., 2002).
Com base nos resultados encontrados nos FPHs e nos fibroblastos 3T3,
podemos sugerir diferenças metabólicas entre as linhagens celulares, visto que os
produtos testados, as condições experimentais e laboratoriais foram as mesmas,
tendo como diferença apenas o tipo celular plaqueado, uma vez que a concentração
tóxica de determinado monômero pode variar de acordo com o tipo celular e sua
capacidade de desintoxicação (GEURTSEN et al., 1998; NOCCA et al., 2010;
DAMAS et al., 2011).
Os testes físicos-mecânicos realizados neste estudo foram necessários para
que avaliássemos o comportamento físico de solubilidade e absorção de água, visto
que o material estará em contato com a polpa dentária, na presença de umidade,
bem como sua resistência mecânica, para que seja determinada a espessura de
material que pode ser aplicada na cavidade dentária.
O ensaio de resistência a tração diametral nos indica a resistência mecânica
vertical do material, in vitro, frente à aplicação de uma carga compressiva. Consiste
em um teste mecânico de fácil reprodutibilidade e alta confiabilidade (ANUSAVICE,
2005).
Neste estudo o valor encontrado de DTS para o MTA F foi significantemente
menor que o MTA C. Porém a maioria dos autores relatam em seus trabalhos o valor
62
médio de DTS para o MTA de 4.4 MPa (HUANG et al., 2008; KAO et al., 2009; SHIE
et al., 2009), o que se assemelha com o valor encontrado no nosso grupo
experimental (MTA F:4.8 MPa). Assim, pode-se afirmar que com relação à
propriedade mecânica de resistência à tração diametral o MTA F pode ser aplicado
como agente capeador pulpar.
Chiang e Ding, 2010, também relataram valores de DTS ao redor de 7MPa
para o MTA convencional como o encontrado nesta pesquisa.
Ogliari et. al., 2008, relataram que os monômeros Bis-EMA 10 e 30
apresentam grande flexibilidade devido à extensão de sua cadeia, o que inviabilizou
a realização do teste mecânico de resistência a flexão, na sua forma isolada. No
entanto a presença da longa cadeia flexível formada por oxietilenos dos monômeros
Bis-EMA 10 e 30 permite que o grau de polimerização dessas cadeias chegue a
100%. A presença de um maior número de unidades de óxido de etileno pode agir
como um solvente aprótico e levar a diminuição da concentração de espécies
reativas de oxigênio. Estas características dos monômeros utilizados no material
experimental (MTA F) podem justificar a viabilidade celular positiva observada no
ensaio de citotoxicidade e o baixo valor de resistência a tração diametral.
O MTA apresenta baixa solubilidade (TORABINEJAD et al., 1995), porém
essa solubilidade pode aumentar com o tempo do ensaio e pode ser influenciada
pelo aumento da razão pó/liquido do material. O óxido de bismuto presente no
material é responsável pela diminuição da solubilidade, além de conferir
radiopacidade ao material (PARIROKH e TORABINEJAD, 2010a). A perda de peso
do MTA após sete dias ocorre pela liberação de cálcio e o aumento de peso visto
após 30 dias de estocagem em solução fisiológica pode ser justificado pela
deposição de cristais de apatita sobre a superfície do material (SHIE et al., 2009).
A solubilidade dos grupos foi diferente, onde o MTA F apresentou menos
solubilidade que o MTA C. Como no estudo de Gandolfi, et. al., 2011, seu MTA
fotoativável composto por HEMA e TEGDMA também apresentou menos
solubilidade que os grupos comparados.
Esse resultado pode ser atribuído a característica dos dimetacrilatos de
insolubilidade devido à formação das ligações cruzadas, que dificultam a
63
solubilidade (ANUSAVICE, 2005). No estudo de Ogliari et. al., o Bis-EMA 30,
apresentou alta solubilidade, porém o Bis-EMA 10 apresentou solubilidade
significantemente menor, o que pode ter gerado um equilíbrio no material
experimental e o tornado menos solúvel que o outro grupo formado somente por
MTA e água destilada.
A absorção de água apresentada pelos dois grupos testados foi semelhante,
portanto as características de expansão e comportamento em ambiente úmido não
alteraram as propriedades do material experimental.
Os monômeros dimetracrilatos apresentam a característica de absorver algum
líquido. O número de ligações cruzadas forma uma rede tridimensional que diminui a
sorção (ANUSAVICE, 2005). A sorção do Bis-EMA 30 é maior que o Bis-EMA 10 e
que o MTA (OGLIARI et al., 2008), porém quando se manipula o material se obtém,
no CP, ou no caso do capeamento, 20% Bis – EMA 10, 20% Bis – EMA 30,
totalizando 40% de composição resinosa, 30% de MTA, além dos outros
componentes do material, portanto a maior porcentagem do material não apresenta
a característica de alta sorção de água.
O Bis-EMA é um dimetacrilato aromático como o Bis-GMA, que apresenta
ligações éter em sua estrutura molecular, mas não apresenta grupos hidroxilas que
formam um veículo forte de ligação com a molécula de água, o que pode levar a
diminuição da sorção de água deste monômero (MORAES et al., 2010).
Além disto, o teste de sorção e solubilidade foi realizado como preconizado
pela ISO4049, de imersão em água por sete dias, que pode ser um tempo curto para
a liberação completa dos produtos do material composto pelos monômeros no
ambiente. Portanto avaliações neste tempo podem ser consideradas (MORAES et
al., 2010). Contudo, altos valores de absorção de água não são desejáveis, pois
pode afetar a estabilidades dos compostos resinosos e favorecer a degradação da
interface dente restauração (MALACARNE et al., 2006).
64
7 CONCLUSÕES
Apesar das limitações de um estudo in vitro, podemos concluir que:
MTA convencional é um material biocompatível, que não interfere na
viabilidade celular, podendo estimular a proliferação celular, portanto não é um
material citotóxico e não apresenta potencial genotóxico pela formação de
micronúcleos.
O MTA experimental fotoativável dual (MTA F) pode ser considerado
biocompatível com as células pulpares humanas, capaz de estimular a proliferação
celular neste tipo celular como o MTA convencional (MTA C).
Com a linhagem celular de fibroblastos 3T3/NIH o MTA F mostrou-se
biocompatível, mas não promoveu proliferação celular.
O MTA F apresentou maior genotoxicidade em comparação ao MTA C, menor
resistência a tração diametral e menor solubilidade. A sorção de água de ambos foi
semelhante.
Com base nos dados obtidos neste estudo, in vitro, o MTA experimental
fotoativável dual apresenta-se como uma alternativa promissora para a realização de
capeamento pulpar. Contudo, outros testes precisam ser realizados para avaliação
de outras propriedades do material experimental antes de sua utilização in vivo.
65
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