UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMÉDICO

BIOMEDICINA

Leonardo Alves e Silva

USO DE TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA AVALIAÇÃO DO

SISTEMA HEMÓSTATICO E DETECÇÃO DE NOVOS

ANTIPLAQUETÁRIOS E ANTICOAGULANTES PARA O

TRATAMENTO DE QUADROS TROMBÓTICOS

NITERÓI

2011

Leonardo Alves e Silva

USO DE TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA AVALIAÇÃO DO

SISTEMA HEMÓSTATICO E DETECÇÃO DE NOVOS

ANTIPLAQUETÁRIOS E ANTICOAGULANTES PARA O

TRATAMENTO DE QUADROS TROMBÓTICOS

Orientadora: Profª. Drª. HELENA CARLA CASTRO

Co-orientador: Msc. PLÍNIO CUNHA SATHLER

Niterói

2011

Monografia apresentada ao curso de graduação

em Biomedicina da Universidade Federal

Fluminense como requisito parcial para

obtenção do grau de Bacharelado em

Biomedicina

Leonardo Alves e Silva

USO DE TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA AVALIAÇÃO DO

SISTEMA HEMÓSTATICO E DETECÇÃO DE NOVOS

ANTIPLAQUETÁRIOS E ANTICOAGULANTES PARA O

TRATAMENTO DE QUADROS TROMBÓTICOS

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________

Profª. Drª Helena Carla Castro (Presidente)

Universidade Federal Fluminense (UFF)

__________________________________________________________________

Profª. Drª Evelize Folly das Chagas (Membro 1)

Universidade Federal Fluminense (UFF)

________________________________________________________

Profª. Drª Hye Chung Kang (Membro 2)

Universidade Federal Fluminense (UFF)

___________________________________________________________________

Msc. Plínio Cunha Sathler (Suplente)

Universidade Federal Fluminense (UFF)

Niterói

2011

Monografia apresentada ao curso de graduação

em Biomedicina da Universidade Federal

Fluminense como requisito parcial para

obtenção do grau de Bacharelado em

Biomedicina

“No começo, toda ciência encontra forçosamente fatos que, a princípio, parecem

contraditórios e só um estudo minucioso e completo pode demonstra-lhes a conexão.”

Allan Kardec

Agradecimentos

Inicialmente a Deus, por tudo que fez e tem feito em minha vida.

Aos meus pais, por serem tão importantes em minha vida, meu exemplo de amor, bondade e

respeito. Obrigado por sempre me apoiarem nas minhas decisões, se hoje eu sou vitorioso é por

causa de vocês, então essa vitória é nossa, eu amo vocês! A minha irmãzinha, que desde que chegou

nessa vida me fez entender o amor fraterno, a importância de compartilhar, por fim a amizade.

Amo-te muito minha “pimentinha”. A minha bisavó, e avós que fizeram parte da minha infância e

moram comigo no coração, obrigado por tudo que fizeram por mim. Aos outros familiares que

sempre torcem por mim, o meu muito obrigado.

Aos meus amigos de infância, em especial José Roberto, Evandro, Emanuel e Denison, que

me proporcionaram vários momentos felizes, divertidos e muita, muita história pra contar.

Aos meus amigos, espalhados por todo o Brasil, que compartilhavam do mesmo sonho que o

meu de estar em uma Universidade, pra mim essa etapa acaba agora, portanto muita força a vocês e

obrigado pelo incentivo para nunca desistir.

Aos meus mais novos amigos de Níteroi, que apesar do pouco tempo se tornaram muito

importantes em minha vida, em especial ao Vinícius, meu grande amigo, que já me agüenta há

quatro anos, muito obrigado meu irmão por essa amizade sincera.

Aos meus queridos companheiros da turma de biomedicina Amanda, Angélica, Anna, Ayslan,

Felipe, Gentil, Havana, João Vitor, Jonathas, Juliana, Marcelle, Melise, Raiane, Raquel, Raul e

Thiago, sem todos vocês não teria sido a mesma coisa, guardarei grandes lembranças.

Aos meus amigos do LABIEMOL, cada um de vocês é responsável pela minha vitória

também, portanto meu muito obrigado, em especial ao Mestre “Jedi” Plínio “Skywalker” e seu

discípulo “Padawan” André, se hoje sei alguma coisa de hemostasia e me tornei um exímio

“flebotomista” é por causa de vocês, muito obrigado amigos. A Professora Doutora Helena Carla

Castro por ter aceitado me orientar, muito obrigado.

Aos integrantes da banca examinadora, meus sinceros agradecimentos.

Aos demais que por ventura não foram citados, mas que foram essências em minha

caminhada.

vi

RESUMO

As doenças cardiovasculares representam a causa mais freqüente de morbidade e de

mortalidade em todo o mundo segundo a organização mundial de sáude. Entre as doenças mais

importantes, destacam-se a aterotrombose e o tromboembolismo venoso (TEV), ambos relacionados

ao processo de formação do trombo vascular (trombose). Em geral, a formação do trombo provém

de três fatores principais que caracterizam alterações da hemostasia normal, apontadas em 1856 por

Virchow, que incluem a lesão da parede vascular, a estase venosa e a hipercoagulabilidade

conhecidos como a tríade de Virchow. O tratamento deste distúrbio baseia-se no uso de fármacos

antitrombóticos incluindo antiplaquetários (ex.: ácido acetil salicílico) e anticoagulantes (ex.:

heparinas, dicumarínicos), os quais apresentam efeitos adversos como a trombocitopenia induzida,

neutropenia, hemorragias, osteoporose, resistência, hipersensibilidade e necrose de pele. O objetivo

deste trabalho é estabelecer um protocolo envolvendo técnicas laboratoriais de avaliação do sistema

hemostático empregados na rotina de análises clínicas para monitorar a atividade de fármacos

convencionais e potenciais protótipos antitrombóticos (derivados N-acilhidrazônicos), gerando

assim um perfil comparativo com o padrão observado em pacientes sob terapia antitrombótica

monitorados na rotina hospitalar. Esse estudo demonstra que é possível rastrear os fármacos

convencionais e os novos derivados através das técnicas laboratoriais utilizadas na rotina de

analises clínicas e assim predizer o perfil antitrombótico desses compostos que se encontram em

fase pré-clínica.

vii

ABSTRACT

Cardiovascular diseases are the most frequent cause of morbidity and mortality worldwide.

Among the most important diseases, stand atherothrombosis and venous thromboembolism (VTE),

both related to the process of vascular thrombus formation (thrombosis). Overall, thrombus

formation comes from three main factors that characterize changes in normal haemostasis, pointed

in 1856 by Virchow, which include endothelial injury, venous stasis and hypercoagulability known

as the Virchow's triad. The treatment of these disorders is based on the usage of antithrombotics

including antiplatelet drugs (ie aspirin) and anticoagulants (ie heparin, coumarins), which may

present several adverse effects such as induced thrombocytopenia, neutropenia, bleeding,

osteoporosis, aspirin resistance, hypersensitivity and skin necrosis. The objective of this work is to

establish a protocol involving laboratory techniques toward the evaluation of haemostatic system in

a routine clinical testing to monitor the activity of conventional drugs and potential antithrombotic

prototypes (N-acylhydrazone derived), thus generating a comparative profile with the pattern

observed in antithrombotic therapy in patients monitored into a hospitalar routine. This study

demonstrates that it is possible to detect the interference of conventional drugs and new derivatives

through the laboratory techniques used in routine clinical analysis and also, predict the

antithrombotic profile of these compounds into a preclinical phase.

viii

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Avaliação da atividade antitrombótica da Heparina 0,25, 0,5, 1 UI/mL utilizando o

ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada. (* p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test). ...... 36

Gráfico 2: Avaliação da atividade antitrombótica da Heparina 0,25, 0,5, 1 UI/mL utilizando o

ensaio de tempo de protrombina. (* p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test). ................................. 36

Gráfico 3: Avaliação da atividade antitrombótica do Argatroban 2, 5 e 10 µg/mL utilizando o ensaio

de tempo de tromboplastina parcial ativada. (* p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test). ................. 37

Gráfico 4: Avaliação da atividade antitrombótica do Argatroban 2, 5 e 10 µg/mL utilizando o ensaio

de tempo de protrombina. (* p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test). ............................................ 37

Gráfico 5: Avaliação da atividade antiplaquetária da aspirina (AAS: Ácido Acetil Salicílico

100µg/mL) através da análise da inibição da amplitude de agregação e da taxa de agregação(%)

frente aos agonistas, Acido araquidônico (AA), Adenosina Difosfato (ADP), Epinefrina (EP) e

Colágeno (COL). (* p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test). ........................................................ 38

Gráfico 6: Avaliação da atividade anticoagulante dos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e

2h) através dos ensaios de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA). (* p<0,05 ANOVA

oneway; Tukey Test). .................................................................................................................... 39

Gráfico 7: Avaliação da atividade anticoagulante dos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e

2h) através dos ensaios de tempo de protrombina (TP). (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test). . 40

Gráfico 8: Avaliação da atividade antiplaquetária dos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e

2h) através da análise da inibição da amplitude de agregação e da taxa de agregação(%) frente aos

agonistas, Acido araquidônico (AA), Adenosina Difosfato (ADP), Epinefrina (EP) e Colageno

(COL). (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test). ......................................................................... 41

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: O processo de Hemostático. A) Injuria (lesão) com exposição de agonistas plaquetários,

B) Adesão das plaquetas ao subendotélio, C) Mudança de forma da plaqueta com secreção dos

grânulos, D) Ligação plaqueta-plaqueta, E) Depósito da fibrina sobre o tampão plaquetário

(CASTRO et al., 2006). ................................................................................................................ 13

Figura 2: Eventos plaquetários envolvidos na hemostasia (YIP et al., 2005). ................................. 14

Figura 3: A cascata de coagulação sanguínea evidenciando os fatores da via extrínseca (brancos) e

os da via intrínseca (pretos) e seus inibidores (círculos ovais) (CIPRANDI et al., 2003). ............... 16

Figura 4: A aspirina e seu mecanismo. (A) Via metabólica alvo da aspirina – produção do ácido

araquidônico e Tromboxano A2 e (B) Estrutura tridimensional do complexo cicloxigenase com o

substrato, ácido araquidônico (rosa) e com o inibidor, aspirina (cinza) (CASTRO, et al., 2006). ... 22

Figura 5: N-acilhidrazonas e seus substituintes. ............................................................................. 24

Figura 6: Fluxograma dos testes realizados com fármacos de mercado com perfil anticoagulante

(heparina e argatroban), antiplaquetário (Aspirina) e os novos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c,

2e, 2g e 2h). TTPA: Tempo de tromboplastina parcial ativada; TP: Tempo de protrombina: AA:

Ácido Araquidônico; ADP: Adenosina Difosfato; EPI: Epinefrina; COL: Colágeno. ..................... 31

x

LISTA DE ABREVIATURAS

AA – Ácido Araquidônico

AAS – Ácido acetil salicílico

ADP – Adenosina difosfato

AFP - analisador da função plaquetária

AOAP - avaliação ótica da agregação plaquetária

COL - Colágeno

COX-1 – Cicloxigenase 1

DMSO - Dimetilsulfóxido

EP - Epinefrina

EV - Endovenosa

FA – Fibrilação atrial

FT – Fator Tecidual

GP IIb/IIIa – Glicoproteína IIb/IIIa (Receptor plaquetário)

GP VI – Glicoproteina VI (Receptor plaquetário)

HBPM – Heparina de baixo peso molecular

HNF – Heparina não fracionada

INR - Razão Normatizada Internacional

ISI – Índice de sensibilidade internacional

PAI-1 - Inibidores do ativador do plasminogênio

PAI-2 - Inibidores do ativador do plasminogênio

PPP – Plasma pobre em plaquetas

PRP – Plasma rico em plaquetas

SC – Subcutânea

TEV – Trombo embolismo venoso

TFPI – Inibidor da via do fator tecidual

TP – Tempo de protrombina

t-PA - Ativador do plasminogênio do tipo tecidual

TTPA – Tempo de tromboplastina parcial ativada

TXA2 – Tromboxano A2

TXB2 – Tromboxano B2

u-PA - Ativador do plasminogênio do tipo uroquinase

VRAA - Verificação rápida da ação da aspirina

vWF – Fator de Von Willebrand

α2-AP – α2 antiplasmina

xi

SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................................... vi

ABSTRACT ................................................................................................................................. vii LISTA DE GRÁFICOS ............................................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................... ix LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................................ x

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 13 1.1. HEMOSTASIA ................................................................................................................. 13

1.2. DISTÚRBIOS TROMBOEMBÓLICOS E TRATAMENTOS ............................................ 17 1.2.1. TROMBOSE VENOSA ............................................................................................... 17

1.2.2 TROMBOSE ARTERIAL ............................................................................................ 18 1.3. AGENTES ANTITROMBÓTICOS (ANTICOAGULANTES E ANTIPLAQUETÁRIOS) 19

1.3.1. ANTICOAGULANTES .............................................................................................. 19 1.3.2. INIBIDORES PLAQUETÁRIOS ................................................................................ 21

1.3.3. COMPOSTOS E MOLÉCULAS COM POTENCIAL TERAPÊUTICO ...................... 23 1.4. DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO .......................................................................... 24

1.4.1. COAGULOGRAMA ................................................................................................... 25 1.4.1.1. Ensaios de Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada e Tempo de Protrombina ....... 25

1.4.2. ENSAIOS DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA ......................................................... 27 2. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 29

2.1. OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 29 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 29

3. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 30 3.1. CASUÍSTICA .................................................................................................................... 30

3.1.1. PLANEJAMENTO ...................................................................................................... 30 3.1.2. AMOSTRA DO ESTUDO ........................................................................................... 30

3.1.2.1. Critérios de inclusão ................................................................................................. 32 3.1.2.2. Critérios de exclusão ................................................................................................. 32

3.1.3. LOCAL DOS TESTES ................................................................................................ 32 3.1.4. CUIDADOS ÉTICOS .................................................................................................. 32

3.2. METODOLOGIA .............................................................................................................. 33 3.2.1 ENSAIOS DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA .......................................................... 33

3.2.2. ENSAIOS ANTICOAGULANTES ............................................................................. 33 3.2.2.1. Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) ..................................................... 34

3.2.2.2. Tempo de protrombina (TP) ...................................................................................... 34 3.2.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 34

4. RESULTADOS......................................................................................................................... 35 4.1. DETERMINAÇÃO DOS ENSAIOS ANTITROMBÓTICOS IN VITRO UTILIZANDO

FÁRMACOS CONVENCIONAIS (CONTROLES) .................................................................. 35 4.1.1. COAGULAÇÃO ......................................................................................................... 35

4.1.1.1 Heparina – potencializador de antitrombina ............................................................... 35 4.1.1.2. Argatroban – inibidor direto de trombina .................................................................. 35

4.1.2. AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA ................................................................................ 38 4.1.2.1. Aspirina – inibidor de COX ...................................................................................... 38

xii

4.2. ENSAIOS ANTITROMBÓTICOS IN VITRO COM NOVOS DERIVADOS N-

ACILHIDRAZÔNICOS ............................................................................................................ 39 4.2.1 COAGULAÇÃO .......................................................................................................... 39

4.2.2 AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA ................................................................................. 40 5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................ 42

6. CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 46 7. ANEXOS........................................................................................................................................47

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 49

13

1. INTRODUÇÃO

1.1. HEMOSTASIA

A hemostasia é um processo fisiológico de manutenção do estado líquido e circulante do

sangue, com a indução de um tampão hemostático em caso de lesão vascular (MITCHELL et al.,

2006; BAKER E BRASSARD, 2011). Este processo pode ser dividido em hemostasia primária,

hemostasia secundária e a fibrinólise (Figura 1) (CANOBBIO et al., 2004; TING E

KHASAWNEH, 2010).

Figura 1: O processo de Hemostático. A) Injuria (lesão) com exposição de agonistas plaquetários, B) Adesão das

plaquetas ao subendotélio, C) Mudança de forma da plaqueta com secreção dos grânulos, D) Ligação plaqueta-plaqueta,

E) Depósito da fibrina sobre o tampão plaquetário (CASTRO et al., 2006).

14

Na hemostasia primária, a partir do estabelecimento do quadro lesivo vascular, verifica-se

uma resposta vasoconstritora imediata, mediada por mecanismos neurogênicos reflexos, os quais

geram o aumento da secreção local de substâncias vasoativas como a endotelina. Essa

vasoconstrição local diminui o fluxo sanguíneo, permitindo o maior contato das plaquetas ao

colágeno exposto, proporcionando assim, a sua adesão a esta superfície e em seguida o processo de

ativação.

A adesão plaquetária ocorre na matriz extracelular presente no subendotélio, que contêm ainda

fibronectina, fator de von Willebrand (vWF) e laminina e vitronectina. Com a ativação, as plaquetas

liberam uma série de moléculas pró-agregantes (Adenosina Difosfato, TXA2) promovendo a

agregação plaquetária, amplificando a resposta hemostática e formação do trombo branco (Figura 2)

(CASTRO et al., 2006; CAPLAN E FISHER, 2007; EYRE E GAMLIN, 2010).

Figura 2: Eventos plaquetários envolvidos na hemostasia (YIP et al., 2005).

A hemostasia secundária consiste no processo de coagulação em que se observa a ativação

seqüencial de proteínas plasmáticas inativas, os zimogênios, também chamados de fatores de

coagulação, em enzimas capazes de originar, como produto final, a rede de fibrina a partir do

fibrinogênio. Neste processo uma das enzimas produzidas, a trombina, é também um agonista

plaquetário que aumentará o processo de agregação das plaquetas.

Segundo a literatura tradicional, existem duas vias de coagulação: a via extrínseca e a via

intrínseca. A via extrínseca é ativada após a lesão vascular, promovendo a exposição do fator

tecidual (FT) que em contato com o fator VII, na presença de íons Ca2+

, proporciona a ativação

desse fator em VIIa e formação de um complexo (Complexo FT-FVIIa). Este complexo irá ativar os

15

fatores IX e X, levando a conversão de protrombina em trombina. Na ativação da via intrínseca (via

de contato) verifica-se a participação dos fatores VIII, IX, X, XI e XII da coagulação, além das

proteínas pré-calicreína, cininogênio de alto peso molecular e íons Ca2+

. Quando a pré-calicreína, o

cininogênio, o fator XI e XII são expostos à cargas negativas do vaso lesado, a pré-calicreína é

convertida em calicreína, sendo esta capaz de ativar o fator XII. O fator XIIa acaba convertendo

mais pré-calicreína em calicreína e ativando o fator XI.

Na presença de íons Ca2+

, o fator XIa proporciona a ativação do fator IX. Por sua vez o fator

IXa junto ao fator VIIIa, levam à ativação do fator X. Deste modo, o complexo enzimático

constituído pelo fator Xa, juntamente com o fator Va e íons Ca2+

irão formar o complexo

protrombinase na membrana fosfolipídica das plaquetas, que será responsável pela formação da

trombina (GOODMAN E GILMAN, 2006; FRANCO, 2001). É importante ressaltar que existem

interconexões entre essas duas vias e que para alguns autores, esta ordenação (intrínseca e

extrínseca) é uma visão ainda a ser discutida (HOFFMAN E DOUGALD, 2001; VINE, 2009).

A cascata de coagulação é controlada continuamente por inibidores, evitando assim, a

ativação exacerbada ou inespecífica deste processo (RANG, 2003). Dentre os inibidores mais

importantes estão: a) as antitrombinas (ex. antitrombina III), que agem inibindo a atividade da

trombina e de outras serino-proteases presentes na cascata de coagulação (fatores IXa, Xa, XIa e

XIIa) (MOSESSON, 2007); b) as proteínas C e S, que são dependentes da vitamina K e

caracterizam-se por inativar os fatores Va e VIIIa, e c) o inibidor da via do fator tecidual (TFPI),

uma proteína secretada pelo endotélio subjacente à lesão que inativa os fatores Xa e o complexo

FT-VIIa (Figura 3) (INNERHOFER E KIENAST, 2010).

Em etapa posterior, observa-se desenvolvimento de eventos antitrombóticos os quais ocorrem

a partir da ação de enzimas que dissolvem o coágulo para controle de sua extensão, após a cobertura

da área lesada. Desta forma, o sistema fibrinolítico tem como função, o controle da formação do

coágulo no vaso, garantindo a não-oclusão do mesmo e a restauração adequada da circulação no

local em que ocorreu a lesão vascular (WOHNER, 2008; WOLBERG E CAMPBELL, 2008). Este

sistema controla o tamanho do coágulo de fibrina principalmente pela ação da plasmina, uma

enzima que degrada à fibrina.

A plasmina é uma serino protease ativa após a clivagem da ligação do plasminogênio sendo

dois ativadores fisiológicos do plasminogênio descritos na literatura: o ativador do plasminogênio

do tipo tecidual (t-PA) e o ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (u-PA). Os dois ativadores

têm alta especificidade de ligação com seu substrato (plasminogênio) e promovem hidrólise de uma

16

Figura 3: A cascata de coagulação sanguínea evidenciando os fatores da via extrínseca (brancos) e os da

via intrínseca (pretos) e seus inibidores (círculos ovais) (CIPRANDI et al., 2003).

única ligação peptídica (Arg560-Val561) que resulta na formação de uma serino-protease ativa, a

plasmina.

Embora a plasmina degrade não somente a fibrina, mas também o fibrinogênio, fator V e

fator VIII, em condições fisiológicas o processo de fibrinólise se processa de maneira especifica

sobre a fibrina, gerando uma ativação localizada e restrita, não sistêmica, cumprindo desta forma,

sua função de remover o excesso de fibrina intravascular. Esta especificidade é resultado de

interações moleculares específicas entre o plasminogênio e seus ativadores, a fibrina e os inibidores

da fibrinólise. Essas enzimas também são reguladas por inibidores que incluem os inibidores do

ativador do plasminogênio 1 e 2 (PAI-1 e PAI-2) que inativam o t-PA; enquanto a α2 anti-plasmina

(α2-AP) inativa a plasmina (GOODMAN E GILMAN, 2006; THELWELL, 2010).

Embora tais eventos sejam responsáveis pelo controle da hemostasia normal, oclusões ou

mesmo embolias podem ser ocasionadas caso haja uma resposta exacerbada do processo

hemostático que são induzidas por distúrbios fisiológicos. O produto desta indução, com freqüência

resulta no estabelecimento do quadro clínico que recebe o nome de trombose (KUMAR et al.,

2010).

17

1.2. DISTÚRBIOS TROMBOEMBÓLICOS

Diversos fatores, adquiridos ou genéticos, exercem influência contrária ao equilíbrio da

hemostasia o que resulta em estados de hipo ou hipercoagulabilidade. Como define Kummar et al.

(2010) o oposto patológico a hemostasia é a trombose, que pode ser oriunda de uma ativação

inapropriada dos processos hemostáticos normais, tal como a formação de um coágulo sanguíneo

(trombo) na vasculatura não lesionada ou oclusão trombótica de um vaso após uma lesão relativamente

pequena (KUMAR et al., 2010).

Entre as doenças trombóticas mais recorrentes destacam-se a aterotrombose e o

tromboembolismo venoso (TEV) que são doenças causadas por quadros de trombose arterial e

trombose venosa respectivamente. Esses quadros patológicos fazem parte das doenças

cardiovasculares, que segundo a Organização Mundial de Saúde, representam uma das maiores

causas de morbidade e de mortalidade em todo o mundo (WHO, 2009; COTRAN et al., 1996;

MAVRAKANAS E BOUNAMEAUX, 2010)

1.2.1. TROMBOSE VENOSA

O tromboembolismo venoso é uma complicação muito comum que representa um risco de

vida para pacientes hospitalizados ou aqueles que deixam o hospital após um período de

permanência em estado pós-operatório (SANFORD E PLOSKER, 2008). Sua faixa de ocorrência

média, descrita na literatura é superior a 20% em pacientes que passaram por cirurgias gerais e 40%

em pacientes que foram submetidos a cirurgias ortopédicas. As chances de ocorrência de

tromboembolias pulmonares fatais após cirurgias de alto risco têm um valor estimado de 5%.

Segundo Cotran et al., o trombo venoso se forma sob condições de baixa força de

cisalhamento do sangue na parede vascular, apresentando predominantemente fibrina e eritrócitos

(COTRAN et al., 1996). Em sua formação, atuam três fatores principais, apontados desde 1856 por

Virchow, que inclui a lesão da parede vascular, a estase venosa e a hipercoagulabilidade (LENSING

et al., 1999; TURPIE E ESMON, 2011). Estes trombos, uma vez formados, podem se desprender e

migrar para o pulmão, dando origem às embolias pulmonares (BATES E WEITZ, 2003).

Os altos índices de mortalidade provenientes do tromboembolismo venoso após cirurgias de

alto-risco se deve ao fato de tais procedimentos, produzirem distúrbios hemodinâmicos capazes de

18

induzir a ativação da cascata de coagulação além de promover a inibição dos processos

fibrinolíticos. Esses eventos culminam numa formação prolongada do trombo vascular e num

aumento proporcional do risco do paciente desenvolver um quadro clínico de trombose

(ERIKSSON BI et al., 2007; SANFORD E PLOSKER, 2008)

Como visto, os trombos causam obstrução das artérias e veias, podendo ocasionar embolia,

sendo o grau de gravidade determinado pelo local de ocorrência do mesmo. Assim, embora o

trombo venoso possa causar congestão e edema nos leitos vasculares distais, seu desprendimento e

migração podem ser fatais. Inversamente, os trombos arteriais possuem importância direta no local

de ocorrência propriamente dito, podendo causar infarto miocárdico ou cerebral se localizado no

coração ou cérebro (COTRAN et al., 2006).

1.2.2 TROMBOSE ARTERIAL

O trombo arterial se forma sob condições de alta força de cisalhamento, sendo formado

basicamente por plaquetas agregadas, envolvidas em rede de fibrina (COTRAN et al., 1996;

HAGEDORN et al., 2010). Geralmente, os trombos arteriais são formados sobre placas de ateroma

instáveis e rotas (YOSHIDA, 2004). Em situações de hipercoagulabilidade, os trombos podem se

desenvolver até mesmo em superfícies endoteliais aparentemente normais.

Em meio a condições fisiopatológicas, o processo de adesão, ativação e agregação das

plaquetas se mostram como processos-chave para formação do trombo arterial, após o dano

endotelial. Tanto a ruptura das placas ateroscleróticas quanto as intervenções cirúrgicas podem

causar a exposição subendotelial e a subseqüente formação do tampão hemostático, resultando

eventualmente na oclusão de artérias, levando a isquemia, infartos do miocárdio e derrame

(ULRICHTS et al., 2011).

De fato, as respostas normais das plaquetas podem ser alteradas por disfunções

cardiovasculares mediadas pelo estabelecimento de quadros patológicos graves (angina pectoral

estável) e agudos (Infarto do miocárdio). A formação da tromboxano A2 (TXA2), um metabólito da

via do ácido araquidônico e potente ativador plaquetário, foi encontrado em altas concentrações em

pacientes que sofreram infarto agudo do miocárdio, enquanto pacientes com síndromes

coronarianas agudas, apresentaram um aumento significativo da expressão de glicoproteína VI (GP

VI), um dos receptores presentes nas plaquetas que possuem um caráter pró-agregante (XIANG et

al., 2008). Esses trabalhos demonstram que as plaquetas têm um papel importante na formação dos

trombos arteriais.

19

1.3. AGENTES ANTITROMBÓTICOS (ANTICOAGULANTES E

ANTIPLAQUETÁRIOS)

Como alternativa terapêutica para os quadros tromboembólicos é indicada a prescrição de

fármacos antitrombóticos como, os antiplaquetários e anticoagulantes. Estes são administrados de

acordo com o tipo de distúrbio e/ou risco que possam causar ao paciente (FLATO et al., 2010). O

avanço destas terapias tem proporcionado uma nítida melhora na evolução do quadro de pacientes

com síndromes miocárdicas, eventos isquêmicos e no controle do risco de complicações

hemorrágicas (NICOLAU E BARACIOLI, 2010).

1.3.1. ANTICOAGULANTES

Os agentes anticoagulantes são moléculas que alteram direta ou indiretamente a cinética da

coagulação sangüínea (HAMERSCHLAK E ROSENFELD, 1996). De uma maneira geral, os

anticoagulantes são representados pelas heparinas e compostos dicumarínicos.

Em pacientes nos quais anticoagulação imediata é desejada (ex. TEV agudo), recomenda-se

o início da varfarina em ambiente hospitalar concomitantemente com heparina não-fracionada

(HNF) ou heparina de baixo peso molecular (HBPM), em doses terapêuticas, por pelo menos 4-5

dias e até que a Razão Normatizada Internacional (INR) esteja na faixa terapêutica em duas

dosagens separadas por 24 horas, quando então, a heparina pode ser suspensa. Em pacientes com

baixo risco trombótico (ex. fibrilação atrial) a varfarina pode ser iniciada em regime ambulatorial,

sem a necessidade de heparina concomitante (CLÉ et al., 2010).

A heparina tem sido usada na prevenção da trombose venosa profunda, em pós - cirurgias e

pós - partos, em pacientes com estado de hipercoagulopatia, ou sujeitos a trombose causada por

diferentes etiologias (FABRIS et al., 2000). Este anticoagulante é administrado aos pacientes,

geralmente em baixas doses, porém para tratar pacientes com tromboembolismo agudo ou

síndromes coronárias agudas e durante cirurgias cardíacas são usadas doses mais elevadas

(TIMOTEO E PAIS, 1998).

Algumas reações adversas graves, como hemorragias e trombocitopenia, são observadas em

alguns pacientes com o uso de heparina, podendo ainda ocorrer um quadro de hemorragia residual,

20

causados até mesmo por fragmentos de heparina que não possuem atividade anticoagulante

(BARROSO, 2008; WARKENTIN, 2010).

A heparina não é absorvida por via oral e, então, deve ser usada via parenteral: endovenosa

(EV) ou subcutânea (SC). Quando a via endovenosa é a escolhida, a dose preconizada para o uso da

heparina não-fracionada (HNF) no tratamento do TEV é um bolus (administração de um fármaco

para aumentar sua concentração no sangue para um nível eficaz) de 80 U/Kg (máximo 5.000 U)

seguido de infusão contínua de 18 U/Kg/h20.

A dose recomendada pelo Colégio Americano de Cardiologia para o tratamento da Síndrome

Coronariana Aguda (BRAUNWALD et al., 2000) é bolus de 60-70 U/Kg (máximo 5.000 U)

seguido de infusão contínua de 12-15 U/Kg/h (máximo de 1.000 U/h).

Pode-se também, realizar anticoagulação plena para o tratamento do TEV com HNF

utilizando-se a via de administração subcutânea, iniciando com bolus EV de 5.000 U seguido de

250 U/Kg SC de 12 em 12 horas; ou iniciando com uma dose SC de 333 U/Kg seguido de 250

U/Kg SC de 12 em 12 horas (HIRSH et al., 2008).

Utilizando um mecanismo diferente, os anticoagulantes dicumarínicos inibem a conversão da

vitamina K, através da inibição das enzimas 2,3 epoxi-redutase e da quinona redutase de vitamina

K, impedindo a ativação dos fatores de coagulação, que é dependente desta vitamina (KREISNER

et al., 2004; MAZZA E YALE, 2009). Incluem-se nesta categoria de anticoagulantes, os derivados

da cumarina e da indadiona que são comumente utilizados por via oral.

O mecanismo de ação dessas moléculas se deve especificamente a similaridade estrutural com

a vitamina K, com a qual compete na fase final da síntese dos fatores II, VII, IX e X e das proteínas

C e S, impedindo a adequada carboxilação dessas moléculas (BLANCO e MESCHENGIESER,

1990; HAMERSCHLAK E ROSENFELD, 1996). Devido ao seu mecanismo de ação, o efeito

desses anticoagulantes orais não é imediato e depende de vários fatores.

O fármaco mais utilizado pertencente a essa classe é a varfarina. A dose inicial de varfarina

deve ser 5-10mg/dia em adultos e ≤ 5mg/dia em pacientes idosos, desnutridos, com insuficiência

cardíaca, doença hepática, em pós-operatório de cirurgia de grande porte ou que estejam usando

medicação que conhecidamente aumenta a sensibilidade a varfarina (ex. amiodarona) (ANSELL et

al., 2008).

Outra classe que vem sendo muito utilizada na clínica é a dos inibidores diretos de trombina.

Estes fármacos bloqueiam a atividade da trombina impedindo a conversão do fibrinogênio em

fibrina e bloqueando a amplificação da cascata da coagulação via trombina uma enzima da

21

coagulação que participa da última etapa de formação do coágulo de fibrina. Uma vantagem deste

fármaco é que diferentemente da heparina não-fracionada (HNF), que se liga às lipoproteínas de

baixa densidade, globulinas e fibrinogênio, os inibidores de trombina devido a sua estrutura e

especificidade não se ligam às proteínas plasmáticas, permitindo estabilidade plasmática constante.

Esta classe de anticoagulante pode ser dividida em dois grupos, os que se ligam de forma bivalente

à trombina (hirudina e bivalirudina) e os que se ligam de forma univalente à trombina

(ximelagatran, argatroban e dabigatram). A hirudina, bivalirudina e argatroban são fármacos de uso

parenteral e são aprovados para utilização em outras situações que não seja fibrilação atrial (FA),

como por exemplo: trombocitopenia induzida por heparina, síndromes coronarianas agudas,

prevenção e tratamento de trombose venosa profunda entre outras. Ximelagatran e dabigatram são

compostos de uso oral com evidências de sua utilização em pacientes com FA (FLATO, et al.,

2010).

1.3.2. INIBIDORES PLAQUETÁRIOS

A inibição plaquetária se baseia principalmente em dois conceitos incluindo a inibição dos

agentes pró-trombóticos (agonistas, receptores e enzimas) e a modulação dos fatores antiagregantes

endógenos. Essas inibições atuam via mecanismos diferentes seja sobre os fatores e/ou vias de

síntese plaquetária em que essas moléculas estão envolvidas. Dentre os inibidores plaquetários mais

utilizados estão a aspirina, o clopidogrel e os inibidores da glicoproteína IIb/IIIa.

O ácido acetil salicílico, conhecido comercialmente pelo nome de aspirina, vem sendo

utilizado atualmente na prevenção primária e secundária de eventos trombóticos como derrame e

infarto do miocárdio (WEBER et al., 2009). Seu mecanismo de ação antiplaquetária é a acetilação

irreversível da hidroxila da porção de serina-529, no centro ativo da Cicloxigenase 1 (COX-1). Essa

modificação química inibe a ligação do ácido araquidônico no interior do centro ativo

inviabilizando a síntese de Tromboxano A2 (TXA2).

A redução na síntese de 90% do TXA2 é necessária para obter a inibição eficaz da agregação

plaquetária, mas essa inibição pode chegar a 100% em plaquetas expostas à aspirina e inativá-las

permanentemente, para o resto do período de vida dessas células, que normalmente atinge 7-10

dias, uma vez que as plaquetas como células diferenciadas perderam os seus núcleos e são

incapazes de sintetizar novas moléculas da enzima (TSELEPIS et al., 2011).

22

As análises realizadas entre a dosagem de aspirina e seus efeitos na prevenção de derrames

recorrentes tem demonstrado que pequenas doses (30 mg/dia) ou maiores (300–1500 mg/dia) de

aspirina apresentam a mesma eficácia, sendo suas menores doses associadas com baixos efeitos

colaterais (SHULGA E BORNSTEIN, 2011).

Figura 4: A aspirina e seu mecanismo. (A) Via metabólica alvo da aspirina – produção do ácido araquidônico e

Tromboxano A2 e (B) Estrutura tridimensional do complexo cicloxigenase com o substrato, ácido araquidônico (rosa) e

com o inibidor, aspirina (cinza) (CASTRO, et al., 2006).

O Clopidogrel é um antiplaquetário pertencente ao grupo das tienopiridinas. Ele é um pró-

fármaco absorvido pelo intestino e metabolizado no fígado por isoformas da enzima P450. Seu

mecanismo de ação é a inibição irreversível dos receptores P2Y12 de adenosina difosfato (ADP),

presentes nas plaquetas, exercendo sua ação através da formação de ligações disulfícas com dois

resíduos de serina (serina-17, serina-270) da molécula receptora (TSELEPIS et al., 2011).

Em testes ex vivo o clopidogrel apresenta uma eficácia máxima na inibição plaquetária em 3-

7 dias, sendo que após cinco horas da administração de uma dose de 300 mg, na maioria dos

pacientes, 80% da atividade plaquetária é inibida. Na clínica o clopidogrel vem sendo utilizado

juntamente com uma baixa dose de aspirina, principalmente em casos de síndromes coronárias

agudas, e tem demonstrado uma maior eficácia do que apenas a administração de aspirina.

Entretanto essa dupla administração tem levado a relatos de grandes hemorragias em cirurgias

levando os pacientes a necessidade de receberem transfusões de sangue e prolongando sua

recuperação (STEWART E LANGTRY, 2010).

23

Os três principais compostos que representam a classe de inibidores GP IIb/IIIa são o

abciximab, a eptifibatida e o tirofibano. Suas características farmacocinéticas e farmacodinâmicas

foram selecionadas para fornecer em pouco tempo uma alta inibição dos receptores GPIIb/IIIa das

plaquetas para combater a trombose que pode ocorrer em resposta ao rompimento mecânico de

placas de ateroma durante e imediatamente após angioplastia coronária (PATRONO E ROCCA,

2010).

Abciximab, é um fragmento Fab quimérico (humano-murino) de um anticorpo monoclonal

contra o receptor GP IIb/IIIa, sendo o primeiro agente desta classe a demonstrar uma eficácia

clínica. O peso molecular de abciximab é de 4,7 KDa.

Eptifibatida é um heptapéptido cíclico sintético, com um peso molecular de 800 Da, enquanto

tirofibano é um não peptídico com um peso molecular de 495 Da. Após término da infusão de

eptifibatida ou tirofibano são necessárias cerca de 4 horas para a restauração da agregação

plaquetária normal, por outro lado, o abciximab liga-se com mais afinidade ao receptor GP IIb/IIIa

que os outros dois agentes e tem uma atividade antiplaquetária que dura vários dias (72 horas).

Um aumento da incidência de trombocitopenia também foi observada como resultado do

tratamento com abciximab, incluindo um aumento na trombocitopenia grave (em 0,7% dos

pacientes que receberam tratamento primário, e em 2,2% com segundo tratamento), o que sugere

que alguma cautela deve permanecer com qualquer readministração de abciximab. Vários estudos

avaliando o uso de eptifibatide em combinação com uma dose completa ou meia dose de

fibrinolíticos têm mostrado melhora significativa na realização de trombólise no infarto do

miocárdio (SHAH et al., 2009).

1.3.3. COMPOSTOS E MOLÉCULAS COM POTENCIAL TERAPÊUTICO

Embora o tratamento com agentes inibidores de agregação plaquetária, como a aspirina, e

agentes anticoagulantes como a heparina e o varfarin constituam um progresso no tratamento de

doenças tromboembólicas, essas substâncias possuem limitações consideráveis no que se refere a

efeitos colaterais e forma de administração (WEITZ E HIRSH, 2001; GRESELE E AGNELLI,

2002; MACKMAN, 2008). Essas características indicam a necessidade da busca de novas opções

terapêuticas seja de origem natural ou sintética.

Estudos do grupo da Drª. Anna Cláudia Cunha, professora do departamento de Química

Orgânica da UFF, em colaboração com o nosso laboratório descreveram a síntese de compostos

24

acilhidrazônicos com atividade antiplaquetária (CUNHA et al., 2003). Estes compostos

apresentaram um perfil similar à aspirina, porém sem sintomas indesejáveis de ulceração gástrica.

Recentemente este mesmo grupo descreveu a síntese de 10 novos compostos derivados N-

fenilamino-5-metil-1H-1,2,3-triazol-4-carbohidrazida.

Estes foram caracterizados e selecionados por meio de seus perfis antiplaquetários in vitro,

analisados usando ácido araquidônico, adrenalina e ADP como agonistas (JORDÃO et al., 2009).

Baseado nos resultados biológicos e teóricos foi visto que alguns dos derivados N-acilhidrazônicos

sintetizados (2a, 2c, 2e, 2g e 2h), são potencialmente capazes de inibir as vias do ácido

araquidônico, da adrenalina e do ADP (IC50 < 20 μg ml-1), apresentando potencial antiplaquetário

suficiente para serem investigados em sistemas in vivo (JORDÃO et al., 2009). Esses protótipos

estão em fase pré-clínica e apresentam ótimos resultados o que reforça seu potencial como fármaco

antitrombótico no tratamento da trombose arterial, sendo que através do monitoramento por testes

laboratoriais é possível verificar a influência desses derivados na hemostasia. Esse fato nos permite

pressupor como será o perfil de atividade do protótipo, quando for administrado ao paciente com

necessidade de terapia antitrombótica.

Figura 5: N-acilhidrazonas e seus substituintes.

1.4. DIAGNÓSTICO E MONITORAMENTO

Os testes laboratoriais empregados na rotina em análises clínicas desempenham um

importante papel na busca por um diagnóstico correto e fidedigno de diversas doenças

tromboembólicas, assim como o seu uso para o monitoramento de pacientes sobre terapia

antitrombótica. Os métodos laboratoriais para avaliação global, bem como de componentes

específicos do sistema hemostático evoluíram de maneira rápida ao longo das últimas décadas,

permitindo a realização de diagnósticos precisos e caracterização detalhada de distúrbios

hemorrágicos e trombóticos com precisão (RISZATTI E FRANCO, 2003). A comparação de testes

25

de sangramento descritos por Duke em 1912 e Ivy em 1941, comumente utilizados em alguns casos

como uma primeira avaliação dos pacientes, e o teste de tromboelastografia, originalmente descrito

por Hellmut Hartert em 1948, porém automatizado e registrado pela Haemoscope Corporation em

1996, permite a verificação de enorme avanço (RISZATTI E FRANCO, 2003).

É valido salientar que em decorrência do emprego de técnicas moleculares, algumas

mutações em genes de componentes da coagulação, anticoagulação e fibrinólise foram descobertas

e associadas a doenças trombóticas e hemorrágicas. No que tange especificamente à trombose

venosa, uma verdadeira revolução conceitual ocorreu sendo essa doença hoje compreendida como

multigênica, estando envolvidas diferentes alterações genéticas que determinam o risco de sua

ocorrência (FRANCO E REITSMA, 2001).

Mencionar o benefício desses avanços na melhoria do tratamento de pacientes, que passaram

a receber intervenções cada vez mais bem adaptadas às suas reais necessidades, se torna importante,

pois tais avanços terapêuticos ocorreram ainda em virtude do desenvolvimento de novas drogas

anti-hemorrágicas e antitrombóticas, cuja utilização clínica resultou em impacto considerável sobre

a qualidade de vida dos pacientes e diminuição de mortalidade associada a distúrbios hemorrágicos

e trombóticos, hereditários ou adquiridos (FRANCO, 2001).

O impacto da evolução dos conhecimentos na área de hemostasia sobre outras disciplinas e

ramos da medicina foi também surpreendente, criando uma interface que não se limitou ao cenário

clínico, mas que se expandiu para a condução de atividades de investigação com característica

multidisciplinar (RISZATTI E FRANCO, 2003).

Dentre os diversos testes que podem ser empregados no diagnóstico e monitoramento de

pacientes com quadros trombóticos ou sob terapias antitrombóticas os mais comuns na rotina são a

contagem de plaquetas (através do hemograma) e os testes de coagulação Tempo de

Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA) e Tempo de Protrombina (TP). Quando se busca uma

análise mais focada para a hemostasia primária, testes complementares como os ensaios de

agregação plaquetária podem ser realizados para uma melhor caracterização do quadro trombótico

(RIZZATTI; FRANCO, 2001).

1.4.1. COAGULOGRAMA

1.4.1.1. Ensaios de Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada e Tempo de Protrombina

26

O ensaio mais comumente empregado para verificação do mecanismo intrínseco de

coagulação é o tempo tromboplastina parcial ativada (TTPA) (SWENSON, 1996). Após adição de

cálcio, fosfolipídios de carga negativa e uma substância particulada, como caulim (silicato de

alumínio), observa-se a ativação dos fatores XII e XI por essas substâncias, sendo possível

determinar o TTPA (MAJERUS E TOLLEFSEN, 2003).

Devido a resposta anticoagulante da heparina ser variável entre os pacientes, recomenda-se o

monitoramento freqüente e ajuste das doses com base nos resultados dos testes de coagulação. A

monitorização da HNF é realizada pelo TTPA. Já as heparinas de baixo peso molecular (HBPM)

são monitoradas pelo nível da atividade anti-Xa.

O TTPA, quando se utiliza a HNF EV, deve ser realizado 6 horas após a primeira dose e

repetido de 6 em 6 horas, até que se atinja o nível terapêutico adequado,calculado pela divisão do

TTPA do paciente pelo TTPA de uma amostra controle (razão entre 1,5-2,5) (CLÉ et al., 2010).

Quanto à monitorização da HNF usada para anticoagulação plena por via subcutânea, é

estabelecido, nos trabalhos iniciais que propuseram este esquema, realizar o TTPA 6 horas após a

dose de HNF e ajustar a próxima dose aumentando ou reduzindo 20%, com o objetivo de manter a

razão do TTPA entre 1,5-2,5 (RASCHKE et al., 1996).

No caso do argatroban, a análise do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) é

geralmente recomendada. O TTPA deve ser determinado antes do tratamento e pelo menos uma vez

por dia durante o tratamento. O TTPA do paciente em estado de equilíbrio deve ser alcançado após

algumas horas de tratamento e seu valor deve ser de 1,5 a 3,0 vezes o valor do TTPA basal, mas não

deve exceder 100 segundos (IVANDIC; ZORN, 2011)

Outro ensaio de grande importância é o tempo de protrombina (TP), que quantifica o tempo

necessário para que ocorra a coagulação (GUYTON E HALL, 2002). Este teste é usado para

identificar as anormalidades dos fatores envolvidos no sistema extrínseco, a saber, fibrinogênio,

protrombina e fatores V, VII e X. Este mede o tempo necessário para um coágulo de fibrina se

formar em uma amostra de plasma citratado após a adição de íons de cálcio e tromboplastina

tecidual (fator III) (CARLOS E FREITAS, 2007). Dentre esses fatores três são dependentes de

vitamina K (protrombina e fatores VII e X) e se tornam diminuídos com o uso de anticoagulantes

cumarínicos, motivo pelo qual, esse exame é o mais utilizado para o controle e monitoramento de

pacientes sob uso de anticoagulantes orais e/ou procedimentos pré ou pós-operatórios (RIZZATTI E

FRANCO, 2001).

27

O resultado do TP é comumente expresso através da Razão Normatizada Internacional

(INR) que foi instituída pela Organização Mundial de Saúde para padronizar as diferenças de

resultados observadas neste teste entre os vários laboratórios. Essas diferenças ocorrem devido à

diferença de métodos, aparelhos e tromboplastinas.

Todos os fabricantes de tromboplastina devem determinar o Índice de Sensibilidade

Internacional (ISI) mediante a padronização de sua tromboplastina frente a uma tromboplastina de

referência internacional proveniente de cérebro humano, que define a sensibilidade do reagente.

Quanto mais próximo de 1,0 for o ISI, mais sensível é a tromboplastina. Os resultados do TP podem

ser reportados em tempo de protrombina, atividade enzimática (%) e INR (HURSTING et al.,

1999). O cálculo do INR é feito de acordo com a seguinte fórmula: INR = [TP do paciente/TP

normal (média do valor de referência)] ISI

Em pacientes internados, deve-se monitorizar a anticoagulação por meio do TP/INR

diariamente, principalmente em pacientes sob uso de anticoagulantes orais como a varfarina,

iniciando-se após a segunda ou terceira dose, até que o valor terapêutico seja atingido por dois dias

consecutivos. Passa-se, então, a monitorizar o TP/INR 2-3 vezes por semana, durante 1-2 semanas

e, após, menos freqüentemente, não ultrapassando uma vez a cada quatro semanas. O valor do INR

terapêutico, para a maioria das situações, deve ser entre 2,0-3,0. Exceções podem ser feitas nos

seguintes casos, quando se recomenda INR entre 2,5-3,5 (CLÉ et al., 2010).

1.4.2. ENSAIOS DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA

A agregação plaquetária ocorre devido à formação de complexos de fibrinogênio e fator de von

Willebrand, liberados pelas plaquetas ativadas, com o receptor GP IIb/IIIa na membrana plaquetária

na presença do Ca2+

que forma um complexo estável na superfície das plaquetas ativadas

(ANDREWS E BERNDT, 2004). Essa também ocorre devido ao metabolismo do ácido

araquidônico, sendo o mesmo liberado a partir da membrana fosfolipídica das plaquetas pela

ativação da enzima fosfolipase A2 e, subseqüentemente, a enzima cicloxigenase (COX-1) converte

o ácido araquidônico em endoperóxidos cíclicos. Esses são então convertidos pela tromboxano

sintetase à tromboxano A2 (TXA2), funcionando como um potente agonista que induz a agregação

(BERNARDI E MOREIRA, 2004)

A agregação plaquetária é um teste que avalia a função das plaquetas pela exploração de

diferentes vias de ativação plaquetária in vitro, quando um plasma citratado rico em plaquetas

28

(PRP) é continuamente agitado, por uma pequena barra de metal (stir) ou imã, em um aparelho

denominado agregômetro. Esse aparelho mede uma combinação de absorção e dispersão de luz,

tendo-se hoje aparelhos que permitem tanto medições nefelométricas, que se baseia na diminuição

da intensidade pela difusão da luz, quanto turbidimétricas, método de medida da redução da

transmissão de luz em um meio causado pela formação de partículas (MATTHEW et al., 2007).

O ensaio de agregação plaquetária medido no agregômetro constitui um processo no qual se

registra alterações na transmissão da luz, pois, ao adicionar agentes agonistas, tem-se um

decréscimo da mesma devido à mudança na forma das plaquetas, que passam de discóides a

esféricas. Isto é seguido de um aumento gradual na transmissão de luz, devido à agregação das

plaquetas, o que torna o meio mais translúcido. Este teste é válido para mostrar problemas na

hemostasia primária, quando se suspeita da história clínica do paciente e na presença de um

prolongamento do tempo de sangramento (ZUCKER, 1989; BITHELL, 1998; BERNARDI E

MOREIRA, 2004).

Não existe um teste laboratorial padrão, que possa ser utilizado como teste ideal para

avaliação da antiagregação plaquetária determinada pela aspirina ou outros agentes antiplaquetários.

Os testes laboratoriais utilizados para avaliação da ação da aspirina nas plaquetas avaliam a função

(in vivo) e a agregação plaquetária (ex vivo). Os principais testes de avaliação da ação da aspirina in

vivo são: nível urinário do TXB2, quantificação da expressão da P selectina e da P selectina solúvel.

Os principais testes que avaliam a ação da aspirina na agregação plaquetária (ex vivo) são: teste de

avaliação ótica da agregação plaquetária (AOAP), analisador da função plaquetária (AFP), teste de

verificação rápida da ação da aspirina (VRAA) e tromboelastograma (OLIVEIRA et al., 2010).

A agregometria por transmissão de luz, empregando o método turbidimétrico, representa o

método mais bem estudado e permite diversas variações no protocolo experimental, tais como o uso

de diferentes agonistas em diferentes concentrações. Contudo, é um método que possui limitações

quanto à rapidez da realização do teste e requer análise adequada dos resultados obtidos na clínica

(SILVA SOARES, DA et al., 2010).

29

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho é determinar um protocolo para monitorar a atividade de fármacos

convencionais e identificar potenciais protótipos antitrombóticos (derivados N-acilhidrazônicos)

através de técnicas laboratoriais de avaliação do sistema hemostático (coagulação e atividade

plaquetária) empregados na rotina de análises clínicas, gerando assim um perfil comparativo com o

padrão observado em pacientes sob terapia antitrombótica monitorados na rotina hospitalar.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a adequabilidade das técnicas laboratoriais de tempo de tromboplastina parcial

ativada (TTPA) e tempo de protrombina (TP) para estabelecer o perfil anticoagulante in

vitro dos controles heparina e argatroban.

Determinar a adequabilidade da técnica laboratorial de agregação plaquetária in vitro para

estabelecer o perfil antiplaquetário do controle aspirina.

Determinar a adequabilidade das técnicas laboratoriais para estabelecer o perfil anticoagulante

e antiplaquetário de novos compostos N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e 2h).

Avaliar a eficiência do protocolo a partir de uma análise comparativa entre os fármacos

convencionais e novos compostos.

30

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. CASUÍSTICA

3.1.1. PLANEJAMENTO

Para a padronização do monitoramento do perfil antitrombótico de um composto,

inicialmente, determinamos critérios com base nos fármacos de mercado no sentido de traçar um

panorama em relação ao rastreamento destes através dos testes laboratoriais. Desta forma, para o

monitoramento comparativo de um determinado derivado por estas metodologias, o mesmo deve

funcionar como inibidor direto das proteínas envolvidas no mecanismo de agregação plaquetária

(ex.: ácido acetil salicílico) ou como inibidor direto das proteínas e fatores envolvidos na cascata de

coagulação (ex.: argatroban), bem como, potencializador de inibidores naturais da coagulação (ex.:

heparina). Os testes ocorreram seguindo o fluxograma representado pela figura 5.

O fator de exclusão para utilização desse protocolo é se os derivados tiverem ação inibitória

sob a síntese de proteínas e/ou componentes ligados a coagulação ou agregação plaquetária que

dependam de uma etapa metabólica (ex.: varfarina), que não poderão ter sua atividade detectada

nessa proposta metodológica.

3.1.2. AMOSTRA DO ESTUDO

Para a realização dos testes de tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada foram

utilizados pools de plasma citratado pobre em plaqueta contendo seis (6) amostras de pacientes do

Hospital Universitário Antônio Pedro e doadores saudáveis que não apresentavam distúrbios no

sistema hemostático e cujo INR expresso no coagulograma, fosse igual ou inferiores a 1,3.

31

Figura 6: Fluxograma dos testes realizados com fármacos de mercado com perfil anticoagulante (heparina e

argatroban), antiplaquetário (Aspirina) e os novos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e 2h). TTPA: Tempo de tromboplastina parcial ativada; TP: Tempo de protrombina: AA: Ácido Araquidônico; ADP: Adenosina

Difosfato; EPI: Epinefrina; COL: Colágeno.

32

No caso dos experimentos de agregação plaquetária, foram utilizadas amostras de plasma rico

em plaqueta de doadores voluntários da comunidade da Universidade Federal Fluminense após

esclarecimentos acerca do projeto e assinatura do termo livre esclarecido como determinado pelo

projeto submetido ao comitê de ética.

3.1.2.1. Critérios de inclusão de voluntários

Serem maiores de 18 anos;

Apresentarem coagulograma dentro dos valores de referência com INR ≤ 1,3.

3.1.2.2. Critérios de exclusão de voluntários

Pacientes/Doadores em uso de anticoagulantes e antiplaquetários

Pacientes/Doadores com qualquer distúrbio do sistema hemostático;

Apresentarem coagulograma com INR > 1,3.

3.1.3. LOCAL DOS TESTES

A seleção dos pacientes e a realização de alguns testes aconteceram no Laboratório de

Hematologia do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP) e Laboratório de Antibióticos,

Bioquímica, Ensino e Modelagem Molecular (LABIEMOL) da Universidade Federal Fluminense

localizado no campus do Valonguinho. Os testes definitivos foram realizados no LABIEMOL.

3.1.4. CUIDADOS ÉTICOS

O estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina e do

Hospital Universitário Antônio Pedro/HUAP da Universidade Federal Fluminense, de acordo com a

resolução 196/96 do Ministério da Saúde. Aprovado em dezembro de 2007 sob o número 153/07.

Em 04/07/2008, foi aprovado um adendo para utilização de pool de plasma de descarte do

Laboratório de Hematologia do HUAP, bem como um novo projeto que engloba o atual trabalho e

fornece suporte as atividades desenvolvidas.

33

3.2. METODOLOGIA

3.2.1 ENSAIOS DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA

As amostras de sangue humano foram obtidas de voluntários adultos, saudáveis, de ambos os

sexos, na faixa etária de 21 a 35 anos, sem uso de medicamentos ou outras substâncias que possam

interferir no experimento pelo período mínimo de 15 dias.

O sangue foi coletado por punção venosa da veia braquial média, com auxílio de scalp 21 e

seringa de 20 ml, em citrato 3,8%, na proporção de 9 volumes de sangue para 1 volume de citrato.

O plasma rico em plaquetas (PRP) foi preparado por centrifugação do sangue total em 1000 rpm

por 12 minutos enquanto o plasma pobre em plaquetas (PPP) foi obtido por centrifugação do PRP a

4000 rpm por 10 minutos.

A aspirina (100 µg/mL), os derivados N-acilhidrazônicos (100 µg/mL) (JORDÃO, 2009), o

controle negativo (NaCl 0,15 M) e o veículo empregado (DMSO) foram pré-incubados por 2

minutos com o PRP antes da adição do agente agregante (ácido araquidônico 10 µM, ADP 10 µM,

epinefrina 0,3 µM e colágeno 3 µg/mL) . A concentração de DMSO na amostra não ultrapassou o

limite de 1%. Os testes de agregação plaquetária foram realizados pelo menos três vezes em

duplicata e os dados foram analisados estatísticamente.

3.2.2. ENSAIOS ANTICOAGULANTES

Os laboratórios clínicos avaliam a função dos dois componentes da via de coagulação através

de dois ensaios-padrão: tempo de protrombina (TP) e o tempo de tromboplastina parcial ativada

(TTPA).

As amostras de sangue foram coletadas do Hospital Universitário Antônio Pedro utilizando

como anticoagulante o citrato de sódio tamponado 3,8% ou 3,2% na proporção 1:10 (ex: 5mL de

sangue utilizar 500μL de citrato), e centrifugadas a 4000 rpm por 10 minutos.

O plasma foi isolado e transferido para um tubo plástico dentro de no máximo 60 minutos e

direcionado para realização dos experimentos no tempo máximo de 2 horas. Caso fosse impossível

a realização dos testes o plasma era armazenado e congelado em tubos falcon para uso posterior.

34

3.2.2.1. Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)

Os ensaios serão realizados no analisador de coagulação Coab Lab IV – Labor Lab®

seguindo o seguinte protocolo (MARTINICHEN-HERRERO et al. 2005).

Inicialmente o reagente aPTT-EA (Cefalina 1,2 mg/mL e Sílica 1mg/mL) foi agitado e

aquecido a 37ºC. Em seguida 97 µL de PPP mais 3 µL de heparina (0,25, 0,5, 1 UI/mL), argatroban

(2 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL), derivados N-acilhidrazônicos (10 µg/mL, 50 µg/mL e 100

µg/mL), NaCL (0,15 M) ou veículo empregado (DMSO 1%) foram incubados e aquecidos a 37ºC

por 2 minutos. Foi então adicionado 100 µL aPTT-EA pré-aquecido e essa amostra tornou a ser

incubada por 2-3 minutos a 37ºC. Após o período de incubação foi adicionado 100 µL de cloreto de

cálcio 0,025M pré-aquecido a 37ºC e iniciou-se a contagem do tempo. Após a formação do coagulo

o tempo foi anotado. Os testes foram realizados em duplicata.

3.2.2.2. Tempo de protrombina (TP)

Os ensaios serão realizados no analisador de coagulação Coab Lab IV – Labor Lab®

seguindo o seguinte protocolo (MARTINICHEN-HERRERO et al. 2005)

Inicialmente o reagente TeClot PT (Tromboplastina 2,5mg/mL e CaCl2 0,025M) foi agitado e

aquecido a 37ºC. Em seguida 97 µL de PPP mais 3 µL de heparina (0,25, 0,5, 1 UI/mL), argatroban

(2 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL), derivados N-acilhidrazônicos (10 µg/mL, 50 µg/mL e 100

µg/mL), NaCL (0,15 M) ou veículo empregado (DMSO 1%) foram incubados e aquecidos a 37ºC

por 2 minutos. Foi então adicionado 100 µL de PBS pré-aquecido e essa amostra tornou a ser

incubada por 2-3 minutos a 37ºC. Após o período de incubação foi adicionado 100 µL TeClot PT

pré-aquecido ao plasma e iniciou-se a contagem do tempo. Após a formação do coagulo o tempo foi

anotado. Os testes foram realizados em duplicata.

3.2.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para a análise estatísticas foi realizada utilizando o software SPSS 14.0 para Windows

aplicando-se o teste ANOVA, e na seqüência o teste de Tukey. Sendo um valor de p<0,05

considerado significante. Todos os resultados foram expressos como a média ± desvio padrão.

35

4. RESULTADOS

4.1. DETERMINAÇÃO DOS ENSAIOS ANTITROMBÓTICOS IN VITRO UTILIZANDO

FÁRMACOS CONVENCIONAIS (CONTROLES) – ETAPA 1

4.1.1. COAGULAÇÃO

4.1.1.1 Heparina – potencializador de antitrombina

O teste de tempo de tromboplastina parcial ativada foi capaz de detectar a atividade

anticoagulante da heparina (0,25 UI/mL = 137 segundos; 0,5 UI/mL > 300 segundos; 1 UI/mL >

300 segundos) sendo esses resultados estatisticamente significativos (p<0,05) em relação aos

controles negativos cloreto de sódio 0,15 M (NaCl 0,15 M) e dimetilsulfóxido 1% (DMSO 1%) (24

e 28 segundos respectivamente) (Gráfico 1).

Na avaliação do perfil antitrombótico da heparina, através do teste de tempo de protrombina,

(Gráfico 2) (0,25 UI/mL = 17 segundos; 0,5 UI/mL = 17 segundos; 1 UI/mL = 18 segundos), não

se verificou atividade anticoagulante estatisticamente significativa em nenhuma das concentrações

quando comparado com os controles negativos NaCl 0,15 M e DMSO 1% (16 segundos).

4.1.1.2. Argatroban – inibidor direto de trombina

Em relação ao argatroban pode-se observar que, por meio do teste de tempo de tromboplastina

parcial ativada, é possível detectar a sua atividade anticoagulante (2 µg/mL = 66 segundos; 5 µg/mL

= 98 segundos; 10 µg/mL = 146 segundos) tendo esses resultados significância estatistica (p<0,05)

36

em relação aos controles negativos NaCl 0,15 M e DMSO 1% (24 segundos e 28 segundos

respectivamente) (Gráfico 3).

0

50

100

150

200

250

300

350

NaCl 0,15 M DMSO 1% 0,25 UI/mL 0,5 UI/mL 1 UI/ mL

Tem

po

de

co

agu

laçã

o

(s)

TTPA HEPARINA

Gráfico 1: Avaliação da atividade antitrombótica da Heparina 0,25 UI/mL, 0,5 UI/mL e 1 UI/mL utilizando o ensaio de

tempo de tromboplastina parcial ativada. (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

0

5

10

15

20

NaCl 0,15 M DMSO 1% 0,25 UI/mL 0,5 UI/mL 1 UI/ mL

Tem

po

de

co

agu

laçã

o

(s)

TP HEPARINA

Gráfico 2: Avaliação da atividade antitrombótica da Heparina 0,25 UI/mL, 0,5 UI/mL e 1 UI/mL utilizando o ensaio de

tempo de protrombina. (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

*

* *

37

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

NaCl 0,15 M DMSO 1% 2 µg/mL 5 µg/mL 10 µg/mL

Te

mp

o d

e c

oa

gu

laçã

o

(s)

TTPA ARGATROBAN

Gráfico 3: Avaliação da atividade antitrombótica do Argatroban 2 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL utilizando o ensaio de

tempo de tromboplastina parcial ativada. (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

O teste de tempo de protrombina (Gráfico 4) foi também capaz do detectar a atividade do

argatroban (2 µg/mL = 41 segundos; 5 µg/mL = 72 segundos; 10 µg/mL = 119 segundos). Na

Análise estatística todas as concentrações apresentaram significância quando comparado com os

controles negativos NaCl 0,15 M e DMSO 1% (16 segundos).

0

20

40

60

80

100

120

140

NaCl 0,15 M

DMSO 1% 2 µg/mL 5 µg/mL 10 µg/mL

Tem

po d

e co

agul

ação

(s)

TP ARGATROBAN

Gráfico 4: Avaliação da atividade antitrombótica do Argatroban 2 µg/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL utilizando o ensaio de

tempo de protrombina. (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

*

*

*

*

*

*

38

4.1.2. AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA

4.1.2.1. Aspirina – inibidor de COX

Em relação aos ensaios de agregação plaquetária, foi possível verificar que essas técnicas

são capazes de detectar a atividade antiplaquetária da aspirina frente aos agonistas ácido

araquidônico 10µM (AA), adenosina difosfato (ADP) 10µM, epinefrina 0,3µM (EP) (inibição da

agregação 93%, 20% e 93% respectivamente) e colágeno 3 µg/mL (COL) (inibição da taxa de

agregação 86%) (Gráfico 5).

Os agonistas ácido araquidônico, ADP e epinefrina foram avaliados determinando-se a

percentagem de inibição da agregação causada pelos antiplaquetários testados enquanto que para o

colágeno foi avaliada a taxa de agregação calculada pelo “slope”, uma função que correlaciona %

de agregação pelo tempo.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

AAS 100 µg/mL

% d

e In

ibiç

ão d

a A

greg

ação

a /Ta

xa d

e ag

rega

ção

b

Agregação plaquetária AAS

AA

ADP

EP

COL

Gráfico 5: Avaliação da atividade antiplaquetária da aspirina (AAS: Ácido Acetil Salicílico 100µg/mL) através da

análise da inibição de agregação do Acido araquidônico (AA), ADP, Epinefrina (EP) e da taxa de agregação (%) do

Colageno (COL). (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

*

*

* *

39

4.2. ENSAIOS ANTITROMBÓTICOS IN VITRO COM NOVOS DERIVADOS N-

ACILHIDRAZÔNICOS – ETAPA II

4.2.1 COAGULAÇÃO

Os ensaios antitrombóticos através do teste de tempo de trombloplastina parcial ativada para

os derivados N-acilhidrazônicos nas concentrações de 10 µg/mL, 50 µg/mL e 100 µg/mL não

apresentaram um perfil de atividade anticoagulante estatisticamente significativo (p<0,05), sendo

seus valores equiparáveis com os controles utilizados negativos (NaCl 0,15 M = 30s e DMSO 1% =

35s respectivamente) (Gráfico 6).

Gráfico 6: Avaliação da atividade anticoagulante dos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e 2h) através dos

ensaios de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA). (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

Os derivados N-acilhidrazônicos não apresentaram perfil anticoagulante estatisticamente

significativo (p<0,05) para os testes de tempo de protrombina, semelhantemente ao TTPA, sendo

seus valores equiparáveis ao dos controles negativos NaCl 0,15 M (15 segundos) e DMSO 1% (15

segundos) (Gráfico 7).

40

0

5

10

15

20

Tem

po

de

co

agu

laçã

o

(s)

TP NAH

10µg/mL

50µg/mL

100µg/mL

Gráfico 7: Avaliação da atividade anticoagulante dos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e 2h) através dos

ensaios de tempo de protrombina (TP). (* p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

4.2.2 AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA

Os ensaios de agregação plaquetária foram capazes de detectar a atividade antiplaquetária dos

derivados N-acilhidrazônicos frente aos agonistas ácido araquidônico, ADP, epinefrina e colágeno.

Cada um dos derivados apresentou um diferente perfil inibitório frente aos agonistas, sendo seu

valores representados no gráfico 8. De acordo com nossos resultados o derivado 2a proporcionou a

maior inibição da agregação plaquetária pelo ADP (94 %), diferente dos derivados 2c, 2e e 2h que

inibiram de maneira mais evidente a agregação induzida pelo acido araquidônico (100%). Os

derivados 2a, 2e, 2g e 2h inibiram a agregação pela epinefrina em 81%, 81%, 82% e 95%

respectivamente, tendo o derivado 2c proporcionado a menor inibição (12%). Para o colágeno

tivemos inibição da taxa de agregação diferente entre os derivados, sendo o 2a de 55%, 2c de 32%,

2e de 68%, 2g de 7% e 2h de 29%.

41

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

2a 2c 2e 2g 2h

% d

e In

ibiç

ão d

a A

gre

gaçã

o/T

axa

de

agre

gaçã

oAgregação plaquetária NAH

AA

ADP

EP

COL

Gráfico 8: Avaliação da atividade antiplaquetária dos derivados N-acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e 2h) através da

análise da inibição de agregação do Ácido araquidônico (AA), ADP, Epinefrina (EP) e da taxa de agregação (%) do

Colageno (COL). (*p<0,05 ANOVA oneway; Tukey Test).

*

*

*

*

*

* *

*

*

*

*

*

*

* *

*

*

42

5. DISCUSSÃO

A literatura descreve diversos casos de aumento no risco de sangramento gastrointestinal em

pacientes que fazem uso de aspirina. A utilização da heparina por longos períodos também leva ao

sangramento, seguido de plaquetopenia e outros efeitos adversos como osteoporose, no uso por

longo prazo, hipersensibilidade e necrose de pele (ALMEIDA CHAVES, DE et al., 2010). Assim,

os testes laboratoriais em análises clínicas, utilizados para o monitoramento de pacientes sob terapia

antitrombótica, se fazem necessários, uma vez que, os tratamentos podem necessitar de ajustes na

dosagem para que os pacientes usufruam dos benefícios advindos dessas terapias, sem correr os

riscos causados pelas reações adversas desses fármacos.

Dentre os testes de monitoramento da coagulação, os mais empregados nas rotinas

hospitalares são o tempo de protrombina (TP) e o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA),

tendo um papel fundamental no rastreamento de fármacos convencionais usados para terapia

antitrombótica como a heparina e o argatroban. Esses testes são capazes não só de detectar as

anormalidades relacionadas aos fatores da coagulação nas vias extrínseca e intrínseca como também

a atividade dos anticoagulantes sob essas vias (RIZZATTI; FRANCO, 2001).

No caso da heparina, um dos anticoagulantes mais utilizados para o tratamento e prevenção de

quadros de trombose venosa, o teste mais indicado para o monitoramento de pacientes é o TTPA

(CLÉ et al., 2010). Segundo o protocolo de heparinização do Hospital Israelita Albert Einstein a

anticoagulação através da heparina é realizada mantendo os níveis plasmáticos deste fármaco dentro

de uma faixa terapêutica de 0,35 UI/mL à 0,75 UI/mL, gerando um aumento nos valores de TTPA

(61 a 85 segundos) (PROTOCOLO HEPARINA, 2011).

Nos testes de TTPA e TP realizados no presente estudo utilizamos heparina em três diferentes

concentrações (0,25 UI/mL, 0,5 UI/mL e 1 UI/mL) a fim de rastrearmos essa faixa terapêutica e

testarmos a sensibilidade desses testes para fins comparativos. O resultado de TTPA da heparina

mostrou que o teste selecionado em nosso protocolo é capaz de rastrear este fármaco nas

43

concentrações propostas. A análise da razão entre o tempo de coagulação da heparina 0,25 UI/mL e

o tempo basal no TTPA, representado pelo controle NaCl 0,15 M, indica uma razão de 5,7

demonstrando uma alta concentração de heparina no plasma, uma vez que a faixa de controle são

razões entre 1,5 e 2,5 (CLÉ et al., 2010; RASCHKE et al., 1996).

De forma importante, os valores de tempo de coagulação observados (heparina 0,25 UI/mL –

137 segundos) no TTPA indicam na clínica altos níveis plasmáticos de heparina, sendo necessária a

suspensão da infusão e a realização de um novo monitoramento, horas depois, para o

acompanhamento e estabilização da faixa terapêutica (PROTOCOLO HEPARINA; VOLSCHAN,

2001).

No teste de TP as concentrações de heparina rastreadas não causaram grandes variações no

tempo de coagulação quando comparadas aos controles, demonstrando que a heparina expressa um

perfil diferente no TP, apresentando uma dose resposta diferente e uma menor atividade

anticoagulante sob o teste que avalia a via extrínseca da coagulação. Isto se deve ao mecanismo

fisiológico da coagulação, onde a antitrombina III, quando potencializada pela heparina, exerce uma

maior ação catalítica sob a trombina e em uma menor escala também sob outras proteases da via

intrínseca da coagulação, os fatores XIIa, XIa, Xa, IXa e calicreína, com esses fatores também

sendo afetados temos o prolongado do tempo no teste de TTPA.

Na via extrínseca, somente na presença de heparina, a antitrombina III expressa uma ação

inibitória sob o fator VIIa, porém a sua taxa de inibição é muito lenta o que torna a antitrombina III

pouco eficaz para o controle fisiológico dessa via, na presença ou ausência da heparina, fazendo

com que o tempo no teste de TP não seja prolongado como foi visto no TTPA (WUN, 1992).

Devido a esse fato o TTPA é um dos testes mais indicados para o monitoramento da terapia com

heparina.

Já o argatroban, um inibidor direto da trombina usado como anticoagulante na profilaxia e

tratamento de complicações tromboembólicas, atinge concentrações plasmáticas de até 2 µg/mL,

com doses de infusão de até 10 µg/kg por minuto. Estudos recentes mostram que o monitoramento

através dos testes de TTPA e TP são usados na clínica, porém não são capazes de detectar

corretamente uma relação dose resposta proporcional quando em baixas doses (0 à 4 µg/mL). Seu

monitoramento na clínica é realizado através do TTPA e seu valor deve ser de 1,5 a 3,0 vezes o

valor do TTPA basal, mas não deve exceder 100 segundos (IVANDIC; ZORN, 2011).

Em nosso estudo, para este fármaco, o resultado de TTPA (Gráfico 3) demonstra que a

concentração de 2 µg/mL está dentro da faixa terapêutica aceitável (razão entre 1,5 a 3,0 ou tempo

44

inferior a 100 segundos), tanto no tempo (66 segundos), quanto na razão (razão = 2,75). A

concentração de 5 µg/mL apesar de não exceder o tempo (98 segundos) apresentou uma razão a

cima da faixa terapêutica (razão = 4,0), assim como a concentração de 10 µg/mL (razão = 6,0). O

TP (Gráfico 4) apresentou razões de 2,6 (2 µg/mL), 4,5 (5 µg/mL) e 7,4 (10 µg/mL) e esses

resultados juntamente com o TTPA comprovam que a dose resposta não segue um padrão de

proporcionalidade, sendo esse fato, como supracitado, condizente com a literatura. Desta forma os

testes propostos utilizando nosso protocolo tem responsividade semelhante ao monitoramento para

anticoagulação visto na clinica.

Os derivados N-acilhidrazônicos não apresentaram um perfil de atividade anticoagulante

detectável através dos testes de TTPA e TP, portanto é possível inferir que estes não interferem de

maneira direta e significativa sob os fatores da coagulação. No entanto, alguns trabalhos

demonstram que novos derivados acilhidrazonicos, planejados por modificação de inibidores

diretos de trombina, são capazes de inibir a trombina nos ensaios de agregação plaquetária, porém

não mostram resultados em relação a coagulação (LIMA, L. M. et al., 2008). Por outro lado,

existem trabalhos que mostram os derivados acilhidrazônicos sendo capazes de prolongar o tempo

nos testes de TP e TTPA, demonstrando portanto ser possível o rastreamento de novos derivados

por esses testes (FRATTANI, F., 2009).

Atualmente não há consenso quanto ao método laboratorial aceito para avaliação ex vivo da

função plaquetária ou para a determinação do grau de ativação plaquetária após o tratamento com

os medicamentos antiplaquetários. Um grande problema é a falta de um método simples, seguro, de

baixo custo e de fácil reprodutibilidade que permita a avaliação da atividade plaquetária e que possa

ser utilizada na prática diária, da mesma forma que testes para controle das doses administradas de

anticoagulantes (SILVA SOARES, DA et al., 2010).

Estudos recentes mostram que existe muita discordância entre autores em relação as análises

realizadas pelo métodos turbidimétricos na clínica, principalmente, devido a falta de padronização

para emprego dessa técnica no monitoramento de pacientes sob uso da terapia antiplaquetária, a

ampla faixa terapêutica empregada em estudos clínicos e os diferentes perfis de inibição quando

comparados com outras técnicas (impedância elétrica) utilizando a mesma concentração do

antiplaquetário, porém uma vez estabelecidos certos padrões os ensaios se tornam muito confiáveis

(SILVA, L. L. DA; D’AMICO, 2010; VICENTE et al., 2009). Porém um estudo realizado com

pacientes que ingeriam 100 mg/dia de aspirina em diversos intervalos de tempo demonstrou que os

testes in vitro de agregação plaquetária, realizados com o agonista ácido araquidônico, tiveram sua

45

agregação máxima reduzida, apresentando uma inibição de 90% da agregação, sendo valor

compatível com o encontrado em nossos testes (PULCINELLI et al., 2004).

Neste estudo, o monitoramento através dos ensaios de agregação plaquetária por turbidimetria

utilizando nosso protocolo foram capazes de detectar a influência inibitória do ácido acetil salicílico

no mecanismo de ativação plaquetária. A aspirina na concentração de 100 µg/mL apresentou um

perfil inibitório significativo nas vias ativadas pelos agonistas AA (93%), EP (91%) e COL (86%)

tendo um menor efeito sob a via do ADP (20%). De acordo com a literatura, essa menor atividade

inibitória na via do ADP ocorre, pois a aspirina inibe a agregação na via do ADP dependendo da

sua concentração em relação ao agonista, ou seja, concentrações altas de ADP (10 µM) impedem a

atividade plena desse fármaco (DOBACZEWSKI et al., 2008).

De acordo com Jordão e colaboradores (2009), as análises realizadas sob os derivados N-

acilhidrazônicos sintetizados (2a, 2c, 2e, 2g e 2h) mostraram que os compostos são potencialmente

capazes de inibir as vias do ácido araquidônico, da adrenalina e do ADP, apresentando então um

perfil antiplaquetário (JORDÃO et al., 2009).

Os testes de agregação plaquetária realizados para os novos derivados N-acilhidrazônicos

utilizando nosso protocolo demonstram que esses compostos são capazes de inibir as vias de

ativação da agregação plaquetária, sendo passíveis de rastreamento por essa técnica. Os derivados

apresentam um perfil inibitório diferente para cada um dos agonistas plaquetários. Alguns

compostos (2c, 2e e 2h) apresentam um perfil inibitório para o ácido araquidônico semelhante ao da

aspirina na mesma concentração (100 µg/mL), permitindo inferir possíveis mecanismos de ação

envolvendo a via do ácido araquidônico.

Outros derivados apresentaram um perfil inibitório diferente do AAS, como o derivado 2g,

que foi capaz de inibir de maneira mais expressiva a via da epinefrina, ou o derivado 2a, que apesar

da não especificidade por uma das vias, inibiu de maneira mais expressiva a via de ativação pelo

ADP.

46

6. CONCLUSÃO

O monitoramento realizado através da metodologia proposta que abrange as técnicas

laboratoriais de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e tempo de protrombina

(TP) são capazes de rastrear a ação anticoagulante de fármacos convencionais como

heparina e argatroban em suas diferentes concentrações, permitindo assim, traçar um perfil

de atividade in vitro dos mesmos, o qual é equivalente ao visto na prática clinica, podendo

ser aplicada para determinar o perfil de outros compostos como os N-acilhidrazônicos (2a,

2c, 2e, 2g e 2h) que aparentemente não interferem na coagulação.

A metodologia empregada para o monitoramento da atividade antiplaquetária realizada pela

técnica laboratorial de agregação plaquetária permitiu rastrear fármacos convencionais como

o ácido acetil salicílico, assim como novos antiplaquetários como os derivados N-

acilhidrazônicos (2a, 2c, 2e, 2g e 2h) que apresentaram um perfil antiplaquetário semelhante

ao da aspirina.

Esse estudo demonstra que é possível determinar o perfil antitrombótico de novos derivados

que se encontram em fase pré-clínica através de técnicas laboratoriais utilizadas na rotina de

analises clínicas, indicando o protocolo utilizado como um guia em potencial para a

descoberta de novos antrombóticos .

47

7. ANEXO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Títulos do Projeto: Caracterização do perfil Antitrombótico e Toxicológico In Vitro de Novos Derivados

Sintéticos Pesquisadores Responsáveis: MSc. Plínio Cunha Sathler e Dr. Helena Carla Castro

Instituição a que pertence o pesquisador responsável: Laboratório de Antibióticos, Bioquímica, Ensino e

Modelagem Molecular (LABiEMol-UFF)

Telefone para contato: Nome do Voluntário: Idade: R.G.:

O Sr(ª) está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa “Caracterização do perfil

Antitrombótico e Toxicológico In Vitro de Novos Derivados Sintéticos”, conduzida Laboratório de

Antibióticos, Bioquímica, Ensino e Modelagem Molecular (LABiEMol-UFF) Este estudo tem como objetivo testar e entender a atividade de compostos sintéticos no processo

hemostático, afim de analisar o perfil antitrombótico e toxicológico in vitro dos mesmos.

O seu sangue será colhido em tubos de coleta contendo um anticoagulante para armazenamento sem

que haja formação de um coágulo. Este procedimento de coleta de sangue pode causar um ligeiro desconforto. O tubo contendo o seu sangue será destinado exclusivamente para ensaios realizados pelo nosso

laboratório onde testaremos compostos sintéticos para verificar como eles atuam na hemostasia.

O estudo pode gerar informações importantes no futuro quanto a possíveis medicamentos para o tratamento das doenças relacionadas à formação trombos indevidos que podem quadros de aterotrombose

e o tromboembolismo venoso.

Após essas informações o(a) senhor(a) concorda voluntariamente em participar do projeto, ciente que poderá retirar a sua autorização a qualquer momento, sem prejuízo algum para minha, ou sua relação

com o LaBiEMol-UFF ou mesmo para a pesquisa em si. Será mantido caráter confidencial dos seus dados

pessoais e que, se os resultados dos testes gerarem informações importantes para todos que atuem com estes

estudos, estas informações estarão autorizadas a ser apresentadas em congressos nacionais e internacionais e a publicações especializadas.

Eu,____________________________________________, RG nº________________declaro ter sido informado sobre os detalhes desta pesquisa, seus riscos e benefícios e concordo em participar

voluntariamente do projeto de pesquisa acima descrito, doando ao LaBiEoMol, minha amostra de sangue.

Niterói,____de___________de_____

48

____________________________ ____________________________ Nome e assinatura do doador Nome e assinatura do pesquisador responsável

____________________________ ___________________________ Testemunha Testemunha

49

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALMEIDA CHAVES, D. S. DE; COSTA, S. S.; ALMEIDA, A. P. DE; et al. Metabólitos secundários de

origem vegetal: uma fonte potencial de fármacos antitrombóticos. Quim. Nova, v. 33, n. 1, p. 172–180, 2010.

ANDREWS, R. K. E BERNDT, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thrombosis Research, v. 114, n.

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