LEPTOSPIROSE BOVINA NA BACIA LEITEIRA DE PARNAÍBA,...

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ANA LYS BEZERRA BARRADAS MINEIRO LEPTOSPIROSE BOVINA NA BACIA LEITEIRA DE PARNAÍBA, PI, BRASIL TERESINA/PI 2010

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ANA LYS BEZERRA BARRADAS MINEIRO

LEPTOSPIROSE BOVINA NA BACIA LEITEIRA DE PARNAÍBA, PI, BRASIL

TERESINA/PI 2010

ANA LYS BEZERRA BARRADAS MINEIRO

LEPTOSPIROSE BOVINA NA BACIA LEITEIRA DE PARNAÍBA-PI, BRASIL

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência Animal da Universidade

Federal do Piauí, para obtenção do título de

Doutora em Ciência Animal, Área de

Concentração: Sanidade e Reprodução Animal

Orientador: Prof. Assoc. Dr. Rômulo José Vieira

Co-Orientador Prof. Assoc. Dr. Francisco Assis Lima Costa

TERESINA/PI

2010

ANA LYS BEZERRA BARRADAS MINEIRO

LEPTOSPIROSE BOVINA NA BACIA LEITEIRA DE PARNAÍBA-PI, BRASIL

TESE APROVADA EM 14/04/2010

Banca Examinadora:

_______________________________________________________

Prof. Assoc. Dr. Rômulo José Vieira – DCCV/CCA/UFPI

Orientador

_______________________________________________________

Prof. Assoc. Dr. Francisco Assis Lima Costa – DCCV/CCA/UFPI

Co-Orientador

________________________________________________________

Prof. Dr. Nicodemos Alves de Macêdo – DCCV/CCA/UFPI

Membro

_____________________________________________________

Profa. Dra. Maria Madalena Pessoa Guerra – DMV/UFRPE

Membro

_____________________________________________________

Prof. Dra. Maria Rosa Quaresma Bomfim – ICB/UFMG

Membro

A DEUS e

NOSSA SENHORA.

A razão de tudo

A vocês, Felipe, Ana Clara e Luzinaldo, que são a razão de minha insistente

luta por dias melhores: somente nós quatro sabemos e sentimos a importância

do nosso projeto de vida; por isso mesmo, depende de nós o nosso sucesso.

Aos meus pais, Barradas e Socorro por tudo de bom que fizeram e fazem por

mim.

A minhas irmãs: Ana Lourdes e Aura Lys que sempre acreditaram em mim e

em quem eu sempre posso confiar.

Às minhas tias Candida e Doninha pelo apoio irrestrito que sempre

dispensaram, principalmente por terem ficado com meus filhos quando estava

em Bom Jesus.

Dedico

v

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Gostaria de agradecer a três pessoas que me ajudaram não somente no

desenvolvimento deste trabalho, como também na minha formação profissional: Ao meu

orientador, Prof. Assoc. Dr. Rômulo José Vieira, pelos ensinamentos transmitidos, liberdade

concedida e confiança depositada, ao meu co-orientador Prof. Assoc. Dr. Francisco Assis

Lima Costa, pelos ensinamentos advindos de seu impressionante acúmulo de conhecimento

em Patologia, sua reconhecida postura educadora, ética e fraterna e ao Prof. Dr. Nicodemos

Alves de Macedo, pelos conhecimentos em epidemiologia transmitidos desde a minha

iniciação científica e pelo apoio e compreensão sempre que solicitado.

vi

AGRADECIMENTOS

Ao tempo que agradecemos, tornamos público o reconhecimento de que a

consolidação desse projeto importante de nossa vida, revitalizador em sua própria existência,

embora passível de falhas advindas de nossas limitações, somente foi possível graças à

cooperação acadêmica, técnico-operacional e, acima de tudo, fraterna de professores,

técnicos, estagiários e pós-graduandos, que, de uma forma ou de outra, direta ou

indiretamente, participaram de sua execução:

Ao Prof. Dr. Élvio Carlos Moreira do Laboratório de Zoonoses do Departamento de

Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas

Gerais (UFMG), pelo apoio laboratorial.

Ao Médico Veterinário Eduardo Esmeraldo Augusto Bezerra, pelo imprescindível

apoio nas atividades de campo.

A minha amiga Sonia Maria de Carvalho pelo apoio e incentivo.

A Prof. Dra. Silvana Maria Medeiros pela orientação na colheita de material.

Aos meus amigos, Francisco de Assis Leite Souza (Chicão), Layana Mauriz Leal,

Larissa Maria Feitosa Gonçalves, Flaviane Alves de Pinho, Lucilene dos Santos Silva, Nilton

Andrade Magalhães, Kleverton Ribeiro da Silva, Isolda Márcia Rocha Nascimento pela ajuda

na colheita e processamento das amostras.

Ao Manoel de Jesus Técnico de Laboratório de Histopatologia do Centro de Ciências

Agrárias da UFPI, pela confecção de lâminas para análise histopatológica;

Ao Antonio (Toninho) Técnico de Laboratório de Leptospirose do Departamento de

Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas

Gerais (UFMG), pelo apoio nas sorologias e culturas de leptospiras.

As pesquisadoras Maria Rosa Quaresma Bomfim e Érica Azevedo Costa, pela grande

contribuição e por me proporcionarem momentos agradáveis em Belo Horizonte.

Ao funcionário da Pós-Graduação, Luís Gomes da Silva sempre prestativo.

À Coordenação de Apoio ao Pessoal de Ensino Superior (CAPES)/MEC, pelo apoio

financeiro.

MUITO OBRIGADA!!!

vii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... ix

RESUMO ........................................................................................................................ xii

ABSTRACT .................................................................................................................... xiii

INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1

CAPÍTULO I ................................................................................................................... 7

RESUMO ........................................................................................................................ 7

ABSTRACT .................................................................................................................... 7

INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 8

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 10

RESULTADOS ............................................................................................................... 12

DISCUSSÃO ................................................................................................................... 15

CONCLUSÃO ................................................................................................................. 21

REFERENCIAS .............................................................................................................. 18

CAPÍTULO II .................................................................................................................. 21

RESUMO ........................................................................................................................ 21

ABSTRACT .................................................................................................................... 22

INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 23

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 24

RESULTADOS ............................................................................................................... 27

DISCUSSÃO ................................................................................................................... 43

CONCLUSÃO ................................................................................................................. 45

REFERENCIAS .............................................................................................................. 45

REFERENCIAS GERAIS ............................................................................................... 48

viii

LISTA DE TABELAS E QUADROS

CAPITULO I

Quadro 1 – Sorovariedades de Leptospira sp utilizadas como antígenos no teste de

Soroaglutinação Microscópica, EV/UFMG. ................................................... 11

Tabela 1 – Reagentes para sorovares de Leptospira em vacas leiteiras, município de

Buriti dos Lopes, Piauí, Brasil, soroaglutinação microscópica, primeira

colheita, 2004. .................................................................................................. 13

Tabela 2 – Reagentes para sorovares de Leptospira em vacas leiteiras, município de

Buriti dos Lopes, Piauí, Brasil, soroaglutinação microscópica, doze

colheitas, 2004-2009 ........................................................................................ 14

CAPITULO II

Tabela 1 – Distribuição de títulos de anticorpos anti-leptospira (L. interrogans) em

vacas soropositivas pela prova de SAM, segundo os sorovares infectantes ..... 28

Quadro 1. Análise histopatológica de órgãos e pesquisa de leptospiras de vacas ............ 42

ix

LISTA DE FIGURAS

CAPITULO I

Figura 1 – Positividade para diferentes sorovariedades de leptospiras em bovinos de

leite, Buriti dos Lopes, Piauí, segundo colheitas semestrais, pós vacinação,

2004-2009 ......................................................................................................... 14

CAPITULO II

Figura 1 – Rim. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Infiltrado

inflamatório intersticial de células mononucleares. (HE, Obj. 40X). ............... 30

Figura 2 – Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório (mediana

de escores e intervalo entre percentis 25 e 75) em rim de vacas leiteiras

infectadas naturalmente por L. interrogans e controle . N = número de

animais por grupo. p < 0,05 em relação ao grupo controle (Teste de Mann

Whitney). ......................................................................................................... 30

Figura 3 – Rim. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Atrofia tubular.

(PAMS, Obj. 40X). .......................................................................................... 31

Figura 4 – Rim. Bovino naturalmente infectado por L. interrogans. Presença de

leptospiras aderidas a superfície luminal do túbulo proximal, em forma de

aglomerados. Warthin Starry. 350X. ................................................................ 30

Figura 5 – Pulmão. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Infiltrado

inflamatório mononuclear. (HE, Obj. 40X). .................................................... 31

Figura 6 – Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório (mediana

de escores entre percentis 25 e 75) em pulmão de vacas leiteiras infectadas

naturalmente por L. interrogans e controle não infectado. N = número de

animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney). ................................ 32

Figura 7 – Fígado. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Infiltrado

inflamatório mononuclear. (H-E, Obj. 40X). .................................................. 33

x

Figura 8 – A Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório

(mediana de escores entre percentis 25 e 75) em fígado de vacas leiteiras

infectadas naturalmente por L. interrogans e controle não infectado. N =

número de animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney). ............... 33

Figura 9 – Útero. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Infiltrado

inflamatório. (HE, Obj. 40X). .......................................................................... 34

Figura 10 – Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório

(mediana de escores entre percentis 25 e 75) em útero de vacas leiteiras

infectadas naturalmente por L. interrogans e controle não infectado. N =

número de animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney). 35

Figura 11 – Ovário. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Infiltrado

inflamatório agudo e focal. (HE, Obj. 40X). ................................................. 36

Figura 12 – Ovário. Bovino naturalmente infectado por Leptospira sp. Fibrose.

(Tricrômico de Masson, Obj. 40X). ............................................................... 36

Figura 13 – Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório

(mediana de escores entre percentis 25 e 75) entre vacas leiteiras

infectadas naturalmente por L. interrogans e controle não infectado. N =

número de animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney). ............ 37

Figura 14 – Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório

(mediana de escores entre percentis 25 e 75) em rim, pulmão, fígado,

útero, ovário e placenta de vacas leiteiras infectadas naturalmente por L.

interrogans e controle não infectado. N = número de animais por grupo. *p

< 0,05 (Teste de Kruskal-Wallis e Student-Newman-Keuls). ........................ 38

Figura 15 – Rim. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Presença de

antígenos no glomérulo. (Imunoperoxidase, Obj. 40X). ............................... 39

Figura 16 – Análise semi-quantitativa da presença de antígeno de Leptospira (mediana

de escores entre percentis 25 e 75) em rim de vacas leiteiras infectadas

naturalmente por L. interrogans e controle não infectado. N = número de

animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney). ............................. 39

xi

Figura 17 – Gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio mostrando o produto

da PCR- específica obtido com DNA extraído de amostras de urina de

bovinos naturalmente infectados com Leptospira spp. C+ controle positivo

L. interrogans sorovar Hardjo, C- controle dos reagentes usados na reação

de PCR. .......................................................................................................... 40

Figura 18 – Gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio mostrando o produto

da PCR- específica obtido com DNA extraído de amostras de urina de

bovinos naturalmente infectados com Leptospira spp . C+ controle

positivo L. interrogans sorovar Hardjo, C- controle dos reagentes usados

na reação de PCR. ......................................................................................... 40

Figura 19 – Gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio mostrando o produto

da PCR- específica obtido com DNA extraído de amostras de rins de

bovinos naturalmente infectados com Leptospira spp. C+ controle positivo

L. interrogans sorovar Hardjo, C- controle dos reagentes usados na reação

de PCR. .......................................................................................................... 41

xii

RESUMO

A leptospirose é uma doença comum nos animais de produção. Na espécie bovina, as perdas

econômicas causadas estão ligadas às falhas reprodutivas como infertilidade, abortamento,

queda da produção. Neste estudo, foram colhidos soros de 255 vacas e dois touros no período

de 2004 a 2009 em intervalos de seis meses de uma fazenda de gado leiteiro no município de

Buriti dos Lopes, PI. Foram colhidos ainda soros de 60 vacas e os respectivos rins, pulmões,

fígado, ovário, útero, placenta e urina durante abate em matadouro municipal da bacia leiteira

de Parnaíba, PI. Pela técnica de soroaglutinação microscópica (SAM), os sorovares de

leptospiras encontrados foram Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG) e Hardjoprajitno (OMS).

A análise histopatológica dos rins revelou alteração túbulo intersticial em 100% dos animais

naturalmente infectados. A lesão localizava-se principalmente na região corticomedular. Em

glomérulos, foi observada hipercelularidade, principalmente focal, global e segmentar.

Cilindros hialinos nos túbulos estavam presentes em oito animais (34,78%), necrose da

membrana basal, atrofia e vasculite em seis animais (26,08%). A presença de leptospiras

em túbulos foi observada em cinco (21,73%) das 20 amostras positivas. Pela técnica de

imunoperoxidase, de 20 animais positivos, foi verificada a marcação de antígenos de

leptospiras em células epiteliais, no endotélio dos vasos intersticiais, no endotélio de capilares

glomerulares e na cápsula de Bowman. Nos pulmões, infiltrado inflamatório em todos os

lobos, nas regiões peribronquial e peribronquiolar, foi observado em intensidade maior nos

animais soropositivos quando comparados aos soronegativos (p = 0,0017). No fígado foi

observado infiltrado inflamatório, principalmente macrófagos e linfócitos. No útero, infiltrado

inflamatório difuso linfoplasmocitário em intensidade maior nos animais soropositivos que

nos negativos (p = 0,0017). As lesões nos ovários caracterizavam-se por infiltrado de células

inflamatórias mononucleares em todos os animais positivos e fibrose em 10 destes. Células

inflamatórias estavam presentes em maior intensidade nos rins seguido de pulmões, fígado,

útero, ovários e placenta (p = 0,0000). A PCR (Reação em cadeia da polimerase). foi positiva

para leptospiras em amostras de urina de 20 animais e de tecido renal de 10 animais positivos.

Os resultados indicam que, em bovinos leiteiros, na bacia leiteira de Parnaíba, ocorre

leptospirose com predominância do sorovar Hardjobovis. Lesões renais, pulmonares,

hepáticas e uterinas estão presentes em bovinos infectados por leptospirose sem

manifestações clínicas aparentes. A PCR detectou a presença de Leptospiras no tecido renal e

em urina dos bovinos estudados, conferindo-lhes a condição de prováveis disseminadores de

Leptospira para outros animais .

Palavras-Chave: Leptospirose, bovino de leite, vacina, PCR

xiii

ABSTRACT

Leptospirosis is a common disease in farm animals. In bovine, the economic losses are linked

to reproductive failure and infertility, miscarriage, decreased production . In This study were

collected sera from 255 sera from cows and two bulls during 2004 to 2009 at intervals of six

months in a dairy farm in the municipality of Buriti dos Lopes - PI. Serum were collected

from cows and their kidney, lung, liver, ovary, uterus, placenta and urine during abattoir

slaughter in the dairy industry Parnaíba - PI. For the microscopic agglutination test (MAT),

the present serovars of Leptospires were Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG), Hardjoprajitno

(WHO). Histopathology showed tubular interstitial alterations in 100% of naturally infected

animals. The lesion was located mainly in the corticomedullary region. In glomeruli, was

observed hypercellularity, mainly focal segmental and global. Hyaline casts in the tubules

were present in eight animals (34.78%), necrosis of the basement membrane, atrophy, and

vasculitis in six animals (26.08%). The presence of leptospires in tubules was observed in 5

(21.73%) of 20 positive samples. For immunostaining of 20 positive animals examined, there

was the marking of antigens of Leptospires in epithelial cells in the endothelium of interstitial

blood vessels, the endothelium of glomerular capillaries and Bowman's capsule. The lung

showed inflammatory infiltrates in all lobes located in the peribronchial and peribronchiolar

regions of greater intensity in positive animals when compared to seronegative (p = 0.0017).

The liver was observed infiltration of inflammatory cells, mainly macrophages and

lymphocytes. The uterus showed diffuse lymphocytic infiltrate in greater intensity in positive

animals when compared to seronegative animals (p = 0.0017). Ovarian lesions were

characterized by infiltration of mononuclear inflammatory cells in all positive animals and

fibrosis in 10 positive animals. Inflammatory cells were present in greater intensity in the

kidney followed by lung, liver, uterus, ovary and placenta (p = 0.0000). PCR(Polymerase

Chain Reaction) was positive in 20 urine of animals and positive in 10 samples of renal tissue.

The results show that in dairy cattle in the coastal Parnaiba city Leptospirosis occurs with a

prevalence of serovar Hardjobovis. Kidney damage, lung, liver and uterus are present in cattle

infected with leptospirosis without clinical manifestations of disease. The PCR of leptospires

in kidney tissue and urine give to the animals the probable status of disseminators of disease.

Keywords: Leptospirosis,dairy cattle, vaccine, PCR

1

1 INTRODUÇÃO

As leptospiroses são consideradas uma das principais enfermidades que afeta o

sistema reprodutivo das espécies domésticas causando, principalmente, abortamentos,

infertilidade, ocorrência de natimortos e retenção placentária; participando como uma das

grandes responsáveis pela baixa produtividade da pecuária nacional e mundial (GIVENS,

2006). Além da importância na área de saúde animal, a leptospirose assume papel relevante

do ponto de vista da Saúde Pública, uma vez que o contato com animais infectados constitui

uma importante via de transmissão para o homem (AMATREDJO, 1975; HIGGINS et al.,

1980).

As leptospiras são bactérias aeróbias obrigatórias, que medem 0,1µm de diâmetro e

seis a 20 µm de comprimento. Apresentam morfologia filamentosa, espiralada, com

movimentos rotacionais e de dobramento (helicoidal) de acordo com Baranton (1995) o que

possibilita motilidade ativa. Por causa de seu diâmetro reduzido, as Leptospiras são melhor

visualizadas por iluminação em microscópio de campo escuro ou microscópio de contraste de

fase (FAINE et al., 1999).

A leptospirose é causada pela bactéria pertencente, à ordem Spirochaetales, família

Leptospiracea, gênero Leptospira. Dois tipos de classificação de leptospiras coexistem: uma

baseada em determinantes genéticos e a outra baseada em determinantes antigênicos.

Antigenicamente, o gênero Leptospira é dividido em duas espécies: L. interrogans que

compreende as amostras patogênicas e L. biflexa que compreende as amostras saprófitas

(FAINE et al., 1999). As leptospiras são divididas em sorovariedades com base na reação de

soroaglutinação microscópica e reação de absorção cruzada de aglutininas. Sorovariedades de

leptospira antigenicamente relacionadas são agrupadas em sorogrupos, compondo mais de

260 sorovariedades agrupados em 24 sorogrupos. Métodos moleculares deram nova visão á

taxonomia de leptospiras. Estudos recentes mostraram a presença de heterogeneidade

genômica dentro do gênero Leptospira e, com isso, foram propostas novas espécies

genômicas de leptospiras patogênicas e saprófitas baseadas no grau de homologia do DNA

(RAMADASS et al., 1992; ADLER, MOCTEZUMA, 2009).

A cadeia epidemiológica da leptospirose envolve três elos: a fonte de infecção, as vias

de transmissão e o hospedeiro susceptível, sendo que as medidas de prevenção e controle da

enfermidade deverão ser dirigidas a todos os elos dessa cadeia (BROD; FEHLBERG, 1992).

2

Os animais são considerados hospedeiros primários, importantes para a persistência dos focos

de infecção e o homem hospedeiro acidental e terminal, sendo pouco eficiente na perpetuação

da doença (BADKE, 2001; KO, GOARANT, PICARDEAU, 2009).

A infecção por Leptospiras em bovinos tem sido descrita em todo o mundo. O

primeiro relato de leptospirose em bovinos foi efetuado na Rússia, (MIKHIN e AZHINOV,

1935), onde isolaram Leptospiras de bezerros com hemoglobinúria infecciosa aguda. A partir

de então, pesquisadores de diferentes países começaram a investigar a ocorrência da

leptospirose nesta espécie animal. No Brasil, os primeiros trabalhos sobre leptospirose bovina

foram publicados em São Paulo, onde os autores investigaram a ocorrência de abortamentos e

queda da produção de leite em bovinos. Testaram pela técnica de soroaglutinação

microscópica, 150 amostras de soros sanguineos e obtiveram 18 soros reagentes, sendo 16

para o sorovar Pomona. Os autores isolaram essa sorovariedade a partir de um feto bovino

abortado entre o quarto e quinto mês de gestação (FREITAS et al., 1957).

A leptospirose é mais incidente em países de clima tropical, provavelmente devido ao

aumento da sobrevida da Leptospira em ambientes com temperaturas que variam de 25 a

30ºC e condições climáticas úmidas, onde podem persistir por semanas a meses. Em regiões

de clima temperado, a doença é estacional, com grande incidência no verão e no período de

maior densidade pluviométrica (VINETZ, 2001; BHARTI et al., 2003).

Nos bovinos as infecções por Leptospiras frequentemente são subclínicas e associadas

a infecções fetais que provocam abortamentos, natimortalidade e o neonatos com alta taxa de

mortalidade (ELLIS et al., 1986). Nos bovinos de leite pode causar ainda epidemias de

agalactia, também chamadas de síndrome da queda de produção de leite associada à fase

aguda da infecção pela Leptospira Hardjo. (HIGGINS et al., 1980).

Nessa espécie a transmissão ocorre principalmente através do contato direto com a

urina contaminada e os animais infectados podem eliminar o agente por longos períodos

mesmo após sua cura clínica. A infecção do sistema genital também é uma forma importante

de manutenção da Hardjo nos rebanhos bovinos (ELLIS et al., 1986) que são considerados

hospedeiros de manutenção desse sorovar. A transmissão de Hardjo é endêmica entre os

animais dessa espécie, pois apresentam elevada suscetibilidade à infecção. Mas como os

bovinos geralmente apresentam a forma crônica da doença, caracterizada por transtornos

reprodutivos, a taxa de letalidade é baixa.

3

possuem elevada suscetibilidade à infecção, baixa patogenicidade, a transmissão é

endêmica entre os animais dessa espécie e, por isso, apresentam doença na forma crônica,

caracterizada por transtornos reprodutivos. Essa sorovariedade apresenta dois genótipos:

Hardjobovis e Hardjoprajitno.O genótipo Hardjobovis pertence à espécie L. borgpetersenni e

o genótipo Hardjoprajitno à espécie L. interrogans. Ambos são importantes causadores de

transtornos reprodutivos nos rebanhos bovinos do mundo e possuem diferenças nas suas

manifestações clínicas. A infecção causada por Hardjobovis é considerada uma pandemia em

bovinos e é frequentemente caracterizada pela forma subclínica com sintomas clássicos de

abortamentos, enquanto que a Hardjoprajitino, isolada em poucos países, caracteriza-se por

ser mais patogênica levando a queda na produção do leite e também problemas reprodutivos

(ELLIS, 1994).

Embora esses genótipos pertençam à mesma sorovariedade, nas vacinas eles não

induzem imunidade cruzada (BOLIN et al., 1989), isto é, uma vacina polivalente com

genótipo Hardjoprajitino não leva uma resposta imune satisfatória em um rebanho infectado

por Hardjobovis. Por isso, teoricamente, o mais indicado na elaboração dessas vacinas seria a

sua formulação com o menor número possível de sorovariedades, dando-se especial ênfase

para aquelas realmente presentes na região (MOREIRA, 2004). Entretanto na prática, nas

vacinas anti-leptospiras comercializadas no Brasil, são incluídas várias sorovariedades que

não possuem importância epidemiológica para a espécie bovina e que poderia estar levando a

falhas na imunização (RODRIGUES, 2008).

A penetração das Leptospiras nos bovinos ocorre principalmente através de solução de

continuidade da pele e mucosas. O período de incubação é de dois a cinco dias, com posterior

disseminação hematógena, com localização e proliferação nos órgãos parenquimatosos,

(ROSE, 1966). A leptospiremia dura em torno de dois a três dias, caracterizada por uma fase

febril e já no quarto dia, as Leptospiras estão presentes nos rins, onde se localizam nos túbulos

renais, principalmente no túbulo proximal, causando nefrite intersticial (CORREA;

CORREA, 1992).

As Leptospiras tendem a persistir em locais como túbulos renais, olhos e útero, onde a

ação dos anticorpos é mínima (BASTOS, 2006).

As leptospiroses em bovinos se manifestam, basicamente, nas formas aguda e crônica.

Na forma aguda, frequentemente ocorre febre e mastite focal nos animais adultos; nos

bezerros, pode ocorrer febre, anorexia, hemoglobinúria, casos de encefalite, acessos

convulsivos e alta mortalidade (FAINE, 1999). A forma crônica é mais comum nos animais

4

adultos e os sinais clínicos constam de infertilidade, abortamentos, natimortos e leptospirúria,

sendo mais evidentes nas fêmeas (BASTOS, 2006).

As lesões provocadas por Leptospira interrogans são observadas, principalmente, nos

rins, mas também são afetados, fígado, útero, coração e pulmões onde as Leptospiras chegam

por via hematógena (YANG et al., 2001; SITPRIJA, LOSUWANRAK, KANJANABUCH,

2003). As leptospiroses comprometem várias estruturas dos rins; lesões túbulo-intersticiais

são as mais encontradas e constituem a alteração patológica básica da doença (OLIVEIRA et

al., 2005). Macroscopicamente, os rins geralmente estão aumentados, amolecidos e pálidos.

São freqüentes, também, focos de hemorragia, muitas vezes sub-capsulares.

Microscopicamente o acometimento é multifocal, e o quadro varia de nefrite intersticial

inespecífica e necrose tubular aguda. Os glomérulos podem apresentar hiperplasia de células

mesangiais e tumefação endotelial em permeio a polimorfonucleares (ALVES et al., 1989).

Após a estimulação da formação de anticorpos, as leptospiras localizam-se nos túbulos

contornados proximais onde podem multiplicar-se. A fase intersticial é acompanhada por

alteração vascular, marcada por hiperemia, edema e espessamento endotelial (BARNETT et

al., 1999; LEVETT, 2001). A lesão renal pode ser severa, sendo caracterizada por nefrite

intersticial com infiltrado celular constituído de linfócitos, plasmócitos, macrófagos e,

ocasionalmente, neutrófilos (LEVETT, 2001; SAGLAM et al., 2003; ROSSETTI, 2004). O

infiltrado inflamatório tem localização peritubular, perivascular e periglomerular, de

distribuição multifocal e focal, que são evidentes macroscopicamente como manchas brancas

subcapsulares (BOQVIST et al., 2003; SILVA et al., 2005; MARTÍNEZ et al. 2006).

Ocasionalmente, são observadas atrofia glomerular com espessamento da cápsula de Bowman

(MARINHO et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2005). Nefrite intersticial granulomatosa

multifocal, atrofia tubular e fibrose intersticial, são alterações encontradas em rins de bovinos

abatidos em matadouros (MARTÍNEZ et al., 2006).

Apesar dos rins serem o órgão de predileção das leptospiras, as lesões provocadas por

essas bactérias ainda não são totalmente conhecidas, especialmente a estreita relação da lesão

com a presença “in situ” do agente, em tecido renal de bovinos. Esses aspectos dificultam o

entendimento da patogenia da ação das leptospiras sobre o parênquima renal. Estudos sobre o

mecanismo de lesão renal na leptospirose no homem e nos animais apontam para um

mecanismo imunológico (YANG et al., 2001; YANG et al., 2002). Outros estudos atribuem a

lesão glomerular e intersticial na leptospirose, à invasão direta do parênquima renal, com

5

produção de toxinas e enzimas proteolíticas, e conseqüente lesão tecidual (FAINE et

al., 1999).

Na fase de leptospiremia, o fígado é um dos primeiros locais a ser atingido, causando

necrose de hepatócitos, colestase intra hepática com conseqüente diminuição da excreção da

bilirrubina (WOHL, 1996; FAINE et al., 1999). Macroscopicamente, o órgão mantém-se

aumentado de volume e seu parênquima corado de amarelo pela bilirrubina; é mais friável do

que o normal, com hemorragias petequiais na cápsula (ENRIETI, 1954). Microscopicamente

são observadas necrose centro-lobular com proliferação de células de Kuppfer (JEZIOR,

2005).

Os pulmões, ao exame macroscópico, apresentam lesões hemorrágicas focais e

petequiais difusas envolvendo o parênquima, pleura e árvore traqueobrônquica,

principalmente nos lobos inferiores (NICODEMO, 1997; MANHÃES, 2004). A pneumonia

hemorrágica pode apresentar-se com graus variados de severidade (HUTTNER et al., 2002).

O comprometimento respiratório, presente na leptospirose, foi classificado em três

grupos: a) de suave a moderado (20 a 70%), com infiltrados pulmonares frequentemente

associados à icterícia e alteração discreta da função renal; b) com icterícia severa, nefropatias

e hemorragias, ocasionalmente morte por falência renal e miocardites ou colapso

cardiovascular com extensa hemorragia; c) hemorragias pulmonares frequentemente fatal,

sem a ocorrência de icterícia, nefropatia ou outras hemorragias (SEIJO et al., 2002).

Os achados de necropsia não determinam o diagnóstico da leptospirose, porém o

edema e enfisema pulmonar observados pode estar associados á infecção (CORREA;

CORREA, 1992). À microscopia eletrônica observa-se que a lesão primária encontra-se em

células do endotélio dos capilares pulmonares (HUTTNER et al., 2002), sendo que a injúria

pulmonar durante os processos inflamatórios tem sido associada ao excesso de células

estimuladas no pulmão, incluindo os macrófagos alveolares, polimorfonucleares e produção

de reativos intermediários do oxigênio e do nitrogênio, ou outros mediadores inflamatórios

(NALLY et al., 2004).

No homem, a pesquisa de antígeno de leptospiras, pelo método de imunoperoxidase,

revelou cinco casos positivos de oito analisados, com predominância de antígeno no

interstício, no endotélio de vasos, no epitélio dos túbulos contornados e no citoplasma de

alguns macrófagos, sem marcação nos glomérulos (ALVES et al., 1989). Em hamsters

infectados experimentalmente, foi observado que em 100% das amostras de tecido renal havia

6

marcação positiva, durante a fase aguda da infecção. As leptospiras formavam massas de

aglomerados filiformes de coloração marrom, visíveis, principalmente, no lúmen e periferia

dos túbulos, próximos a vasos sanguíneos e interstício (HAANWINCKEL et al., 2004).

O diagnóstico preciso da infecção por Leptospiras em bovinos depende do isolamento

e tipificação da sorovariedade prevalente, contudo na maioria dos trabalhos publicados no

Brasil são realizados apenas inquéritos sorológicos que não incluem o isolamento para a

identificação do agente devido à dificuldade na obtenção de resultados conclusivos. O

diagnóstico é realizado mediante aplicação da técnica de Soroaglutinação Microscópica,

porém este teste apresenta algumas limitações como não permitir a indentificação do genótipo

específico, além de gerar reações cruzadas entre espécies do gênero Leptospira com

características antigênicas similares, impossibilitando o diagnóstico preciso referente ao

agente infectante.

A visualização direta de Leptospiras em microscópio de campo escuro tem sido

utilizada principalmente em amostras de urina durante a fase de leptospirúria. Este exame

quando realizado imediatamente após a colheita da urina aumenta as chances de um resultado

positivo, uma vez que o diagnóstico é baseado na morfologia e motilidade das leptospiras

(FAINE, 1999). A bactéria pode ser detectada na urina e órgãos por provas que utilizam a

interação antígenos e anticorpos marcados como a imunoperoxidase (SCANZIANI et al.,

1989).

Entre as técnicas de diagnóstico baseadas na detecção do DNA das Leptospiras, a

reação em cadeia de polimerase (PCR) vem sendo utilizada de forma crescente para o

diagnóstico da leptospirose em fluídos orgânicos e órgãos de várias espécies animais

(HEINEMANN et al. 1999).

A caracterização e a indentificação da Leptospira sp., presente em rebanho bovino

infectado, são passos de grande importância no diagnóstico, na implementação de programas

de vacinação adequados e na eficácia das vacinas. A inclusão de sorovariedades realmente

presentes nas vacinas utilizadas poderá induzir uma imunidade mais efetiva no rebanho, que

promoverão consequentemente, o controle da doença e aumento nos índices de produtividade

animal.

Este trabalho teve como por objetivo contribuir para o desenvolvimento de métodos

eficientes de controle das leptospiroses em bovinos leiteiros, pesquisar aglutininas anti-

leptospiras (L. interrogans) em vacas e estabelecer relação entre as lesões nos rins, fígado,

7

pulmões, ovários, útero e placenta com a infecção por Leptospiras e a presença de DNA de

Leptospira sp.

Esta Tese apresenta a seguinte estrutura formal: abstract, resumo, seguido de uma

introdução englobando revisão de literatura e objetivos; dois capítulos contendo artigos

completos, um intitulado “Controle da Leptospirose Hardjo mediante vacina em bovinos da

bacia leiteira de Parnaíba-PI, Brasil”, e o outro com o título “Detecção de leptospiras por

imunoperoxidase e reação em cadeia de polimerase em vacas da bacia leiteira de Parnaíba,

PI.“, encaminhados para publicação na revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e

Zootecnia, estruturados de acordo com as normas da revista e referências da introdução geral.

2 CAPÍTULO I

Controle da Leptospirose Hardjo mediante vacina em bovinos da bacia leiteira de

Parnaíba, Piauí

Ana L. B. B. Mineiro1*; Rômulo José Vieira

1; Eduardo E. A. Bezerra

2; Nicodemos Alves de

Macedo1; Layana M. Leal

3; Élvio C. Moreira

4; Francisco A. L. Costa

1

RESUMO

As leptospiroses são doenças comuns nos animais de produção. Na espécie bovina, as perdas

econômicas estão ligadas às falhas reprodutivas como infertilidade, abortamento, queda da

produção de carne e leite. Neste estudo foram colhidos soros de 255 vacas e dois touros no

período de 2004 a 2009 em intervalos de seis meses de uma fazenda de gado leiteiro no

município de Buriti dos Lopes, PI. Pela técnica de soroaglutinação microscópica (SAM), os

sorovares de Leptospiras encontrados foram Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG),

Hardjoprajitno (OMS). Para o controle da leptospirose foi testada uma vacina monovalente

com as sorovariedades Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG), Hardjoprajitno (OMS). Os

resultados mostraram que em bovinos leiteiros na bacia leiteira de Parnaíba, PI ocorre

leptospirose, com predominância do sorovar Hardjobovis. A vacina elaborada por

determinação sorológica das sorovariedades mais prevalentes no rebanho revelou elevada

eficiência, aplicada semestralmente, por cinco anos.

Palavras-chave: Leptospirose. Bovinos de leite. Vacina.

Control of bovine leptospirosis by an vaccinne, in a dairy farm an coastal region of

Piauí, Brasil

Mineiro, A.L.B.B.; Vieira R.J.; Eduardo E. A. Bezerra; Nicodemos Alves de Macedo; Layana

M. Leal; Élvio C. Moreira; Costa, F.A.L. 2010. [Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária

e Zootecnia]. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal do

Piauí, Campus Agrícola da Socopo, s/n. Teresina, PI 64049-550 Brazil. E-mail:

[email protected]

ABSTRACT

Leptospirosis is a common disease in farm animals. In bovine, the economic losses are linked

to reproductive failure and infertility, miscarriage, decreased production . This study collected

sera from 255 cows and 2 bulls during 2004 to 2009 at intervals of six months of a dairy farm

in the municipality of Buriti dos Lopes - PI. For the microscopic agglutination test (MAT),

1 Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UFPI, Campus Agrícola da Socopo, S/N, Teresina, PI, 64049-

550, Brasil. * Autora para correspondência: [email protected] 2 Médico Veterinário, Bacia Leiteira de Parnaíba, PI.

3 Aluna de graduação do Curso de Medicina Veterinária, UFPI, Campus Agrícola da Socopo S/N, Teresina, PI,

64049-550, Brasil. 4 Departamento de Preventiva da Escola de Veterinária da UFMG, Campus da Pampulha, Belo Horizonte, MG.

9

the present serovars of leptospires were Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG), Hardjoprajitno

(WHO). To the control of leptospirosis was tested a monovalent vaccine with the serovars

Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG), Hardjoprajitno (OMS). The results show that in dairy

cattle in the coastal state of Piaui leptospirosis occurs with a prevalence of serovar

Hardjobovis. The vaccine developed by serological determination of the serovars prevalent in

the herd showed high efficiency, applied every six months for five years.

Keywords: Leptospirosis, dairy cattle, vaccine.

2.1 INTRODUÇÃO

As leptospiroses são zoonoses que acometem animais domésticos, silvestres e o

homem. Dois tipos de classificação de Leptospira sp coexistem: uma baseada em determinantes

antigênicos e a outra, mais recente, baseada em determinantes genéticos. Antigenicamente, o

gênero Leptospira é dividido em duas espécies: L. interrogans que compreende as amostras

patogênicas e L. biflexa que compreende as amostras saprófitas (Faine et al., 1999). As

Leptospiras são divididas em sorovariedades com base na reação de soroaglutinação

microscópica e reação de absorção cruzada de aglutininas. Sorovariedades de Leptospiras

antigenicamente relacionadas são agrupadas em sorogrupos, compondo mais de 200 sorovares

agrupadas em 23 sorogrupos. A classificação baseada em métodos moleculares deu nova visão

à taxonomia de Leptospiras. Estudos com essa técnica mostraram a presença de

heterogeneidade genômica dentro do gênero Leptospira e, com isso, foram propostas novas

espécies genômicas de Leptospiras patogênicas e saprófitas baseadas no grau de homologia do

DNA (Ramadass et al., 1992; Ko, Goarant, Picardeau, 2009).

Os aspectos da epidemiologia das leptospiroses em bovinos no Brasil merecem maior

atenção. A sorovariedade Hardjo, pertencente ao sorogrupo SEJROE, aparece nos inquéritos

sorológicos em bovinos como de elevada freqüência (Moreira et al., 1994), sendo os bovinos

considerados hospedeiros de manutenção desse sorovar, pois apresentam elevada

suscetibilidade à infecção; a bactéria tem baixa patogenicidade; a transmissão é endêmica na

espécie e, por isso, é comum a doença na forma crônica, caracterizada por problemas

reprodutivos. O genótipo Hardjobovis pertence à espécie L. borgpertesenii e o genótipo

Hardjoprajitno à espécie L. interrogans. Ambos são importantes causadoras de problemas

reprodutivos nos rebanhos bovinos em todo o mundo com diferenças nas suas manifestações

clínicas.

10

A infecção causada por Hardjobovis é considerada pandêmica sendo frequentemente

caracterizada pela forma subclínica com sintomas clássicos de abortamento, enquanto que

Hardjoprajitno, isolada em poucos países, caracteriza-se por ser mais patogênica, levando à

queda da produção do leite e problemas reprodutivos (Ellis, 1994). De um modo em geral as

infecções por Leptospiras freqüentemente são subclínicas e associadas a danos fetais,

natimortalidade, agalactia, (Higgins et al., 1980) bem como colonização do sistema genital,

constituindo uma forma importante de manutenção de Hardjo nos rebanhos bovinos (Ellis et al,

1986).

Embora tais genótipos pertençam à mesma sorovariedade, nas vacinas eles não

induzem imunidade cruzada (Bolin et al., 1989). Por isso, teoricamente, o mais indicado na

elaboração dessas bacterinas seria a sua formulação com o menor número possível de

sorovariedades, dando-se especial ênfase para aquelas realmente presentes na região (Moreira,

2004; Araujo et al., 2005). Nas vacinas anti-leptospira comercializadas no Brasil são incluídas

várias sorovaridades com baixa importância epidemiológica para a espécie bovina, o que

poderia estar levando a falhas na vacinação, além de elevação desnecessária dos custos e

interferência no diagnóstico.

A identificação das Leptospiras que infectam um rebanho torna possível o

desenvolvimento de uma vacina específica (Faine et al., 1999). Contudo, existe a dificuldade de

identificar com precisão a sorovariedade causadora usando técnicas sorológicas. O alto grau de

reações cruzadas entre as sorovariedades pode levar a interpretações equivocadas. Por sua vez,

essas vacinas podem gerar reações cruzadas nos animais induzindo resposta imunológica que

não apresenta títulos uniformes para as diferentes sorovariedades (Siddique e Shah, 1990; Bolin

et al.,1991; Arduino et al., 2004).

Este trabalho teve como objetivo contribuir para o desenvolvimento de métodos

eficientes de controle das leptospiroses em propriedade de produção leiteira do tipo

empresarial, utilizando-se vacinas elaboradas após determinação sorológica das

sorovariedades mais prevalentes no rebanho, acompanhando a sorologia por meio da técnica

de Soroaglutinação Microscópica após vacinação semestral, por dois anos.

11

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi realizado em uma fazenda localizada no município de Buriti dos

Lopes, região norte do estado do Piauí. O município está situado a 300 Km de Teresina e

apresenta como coordenadas geográficas 3°5´ S e 40°41’ W. O clima da região, segundo

Koppen é Aw, com estação seca bem definida (julho a dezembro). Na última década, a região

apresentou médias anuais de umidade relativa de 74,9%, precipitação de 965 mm,

concentrada no período de janeiro a junho (estação chuvosa) e temperatura média máxima do

ar de 36°C e mínima de 22°C (Lima, 2002).

A fazenda reunia, na ocasião, um rebanho constituído de 62,20% de vacas jovens da

raça Girolando (1/2; 3/4; 7/8 e 15/16 HOL+GIR), com média de período de lactação de 286,5

dias, produção de leite/vaca/dia de 14,31 Kg, produção de leite/vaca/lactação de 4.513 kg,

número de crias de 1 a 10 e peso ao primeiro parto de 480 Kg. O sistema de criação utilizado

é o de semi-confinamento, com duas ordenhas mecânicas por dia. Os currais são lavados antes

de cada ordenha com mangueira de jato forte.

Em janeiro de 2004 foi observada na fazenda a ocorrência dos seguintes eventos em

forma de surto: aumento do número de abortamentos, mamites, morte de bezerros com

icterícia, repetições de estro e vacas com urina avermelhada. O médico veterinário

responsável suspeitou de leptospirose. O rebanho apresentava resultados negativos, em testes

recentes de brucelose, diarréia bovina a vírus, rinotraqueíte infecciosa e tuberculose. Para

confirmação do diagnóstico clínico de leptospirose, procedeu-se à colheita de amostras de

soro sanguíneo das 255 vacas e dois touros.

As vacas foram submetidas a 12 colheitas de sangue para obtenção de soro e

realização de testes sorológicos em intervalos de seis meses. As leituras foram realizadas em

microscópio de campo escuro, objetiva 10x. O critério adotado para o soro ser considerado

como reagente foi de 50% de Leptospiras aglutinadas por campo microscópico em aumento

de 100 vezes. O sorovar registrado foi aquele que apresentou maior título, sendo as demais

aglutinações consideradas reações cruzadas. As amostras positivas ao título inicial foram

novamente diluídas sucessivamente na razão dois e testadas para o(s) sorovar(es) que

reagiram anteriormente. O título final foi aquele que ainda apresentou 50% ou mais de

aglutinação.

A coleção de sorovares de Leptospira sp, que foram utilizadas como antígeno está

registrada no Quadro I.

12

Quadro 1 – Sorovariedades de Leptospira sp utilizadas como antígenos no teste de

Soroaglutinação Microscópica, EV/UFMG

Sorogrupos Sorovariedades Amostra de Referência

AUSTRALIS bratislava Jez Bratislava

BALLUM ballum Mus 127

CANICOLA canicola Hond Utrecht IV

GRIPPOTHYPHOSA gripothyphosa Moskva V

ICTEROHAEMORRAGIAE icterohaemorragiae RGA

MINI szwajizak Szwajizak

MINI mini Neguita

POMONA pomona Pomona

SEJROE hardjo Hardjoprajitno (OMS)

SEJROE hardjo Hardjoprajitno (Norma)

SEJROE Hardjo (hardjobovis) Sponselee

A colheita de soro foi realizada a cada 180 dias por um período de 60 meses. Por

ocasião da sexta colheita, 30 amostras de urina foram obtidas de forma asséptica, de animais

positivos à sorologia (sorovar Hardjo) e com histórico de problemas reprodutivos. As

amostras foram submetidas à microscopia de campo escuro e a seguir inoculadas em meio de

cultura (EMJH modificado), para posterior isolamento.

Para o controle da leptospirose foi testada uma vacina experimental monovalente,

produzida pelo Laboratório de Leptospirose da Escola de Veterinária da Universidade Federal

de Minas Gerais (EV/UFMG), em Belo Horizonte,MG, contendo os sorovares Hardjoprajitno

(CTG e OMS) e bovis, cultivados em meio EMJH modificado, fração “V” de albumina

bovina (Ellinghausen , 1965) por um período de 14 dias a 28°C. Foi feita a contagem

aproximada de 2x108 bactérias/ml, inativada com formalina na concentração final de 0,3%,

dividida em três alíquotas de 1000 ml, emulsionada no adjuvante Emulsigen® a 20% e

adsorvida em um homogeneizador circular por 24 horas, 96 g e padronizada em 1x108

células

por ml (Escala Mcfarland). A dose utilizada em cada vaca foi de 5,0 ml, inoculada por via

subcutânea na região do terço proximal do pescoço. A vacina foi avaliada previamente com

relação à pureza, inocuidade e esterilidade, conforme United State of Department of

13

Agriculture (1976). As condições de manuseio do inóculo seguiram rigorosamente as normas

de biossegurança.

Todas as fêmeas acima de quatro meses de idade foram vacinadas e revacinadas aos

45 dias e a seguir semestralmente. O acompanhamento do rebanho vacinado foi realizado por

meio da colheita de sangue para realização da técnica de SAM.

A organização da base de dados e a confecção de tabelas e gráficos foram realizadas

em planilhas eletrônicas do programa Microsoft Excel, versão 2007. Na base de dados, cada

amostra de soro sangüíneo era acompanhada pelos seguintes dados: data de colheita, sorovar

utilizado na bateria de antígenos, resultado das reações à SAM e títulos. As diferenças

observadas nos índices quando da primeira leitura foram realizadas pelo teste do Qui-

quadrado (α<0,05).

Para avaliar a eficiência da vacina, considerando a inexistência de grupo controle e

admitindo-se 50% de redução da prevalência devida ao acaso, aplicou-se a prova de confronto

de taxas (OR) para = 0,05.

2.3 RESULTADOS

Na primeira colheita de material para a realização do teste de SAM, em 07/07/2004, as

freqüências de aglutininas anti-leptospira apresentaram taxas elevadas de positividade para

Hardjobovis (54,50%), Hardjo CTG (45,50 %) e Hardjo OMS (56,50%) e negatividade para

os demais sorovares (Tabela 1).

14

Tabela 1 - Reagentes para sorovares de Leptospira em vacas leiteiras, município de Buriti dos

Lopes, Piauí, Brasil, soroaglutinação microscópica, primeira colheita, 2004

Sorovariedades Amostras

Positivas Negativas % de Pos

Hardjobov 139 116 54,50

Hardjo (CTG) 116 139 45,50

Hardjo (OMS) 144 111 56,50

Mini 0 255 0,00

Gripo 0 255 0,00

Pomona 0 255 0,00

Icterohaemorragiae 0 255 0,00

Canicola 0 255 0,00

Bratislava 0 255 0,00

Canicola 0 255 0,00

Ballum 0 255 0,00

*Hardjobovis x demais sorovares χ2 = 261,83.

CTG x demais sorovares χ2 = 123,53.

OMS x demais sorovares χ2 = 290,37.

Hardjobovis x CTG χ2 = 9,83.

Hardjobovis x OMS χ2 = 1,03.

O teste de associação qui-quadrado revelou diferenças reais entre os sorovares com

reação positiva e o conjunto dos demais sorovares testados e entre estes, exceto no caso

Hardjobovis x OMS.

As 11 colheitas subseqüentes, semestrais, realizadas no período de 2004-2009,

revelaram queda gradativa na positividade (Tabela 2, Figura 1). Em todas as colheitas, até o

desaparecimento de reagentes, houve predomínio de Hardjobovis sobre as demais

sorovariedades. A tentativa de cultivo de Leptospiras em 30 amostras de urina não revelou

crescimento da bactéria. À tabela 2 e Figura 1 observa-se que as Taxas de confronto (OR)

indicam queda real da prevalência atribuível À vacina, gradativa e crescente.

15

Tabela 2 – Reagentes para sorovares de Leptospira em vacas leiteiras, município de Buriti dos Lopes,

Piauí, Brasil, soroaglutinação microscópica, doze colheitas, 2004-2009

Colheitas Hardjobovis Hardjoprajitno (CTG) Hardjoprajitno (OMS)

Positivos Negativos % Positivos Negativos % Positivos Negativos %

1 139 116 54,5 116 139 45,5 144 111 56,5

2 125 130 49 89 166 35 102 153 40

3 101 154 39,6 72 123 28,2 89 166 35

4 99 156 38,8 67 188 26 85 170 33,4

5 109 146 42,7 65 190 25,5 89 171 32,9

6 102 152 40,1 62 192 24,4 76 178 30

7 83 169 33 54 198 21,4 52 20 20,6

8 50 200 20 26 224 10,4 19 231 7,8

9 21 226 8,4 13 234 5,2 12 235 4,8

10 17 230 6,8 7 240 2,8 6 241 2,4

11 4 243 1,6 0 24 0 0 247 0

12 0 247 0 0 247 0 0 247 0

Hardjobovis (OR1=2,44 e ICOR95=2,09 – 2,79; OR2=1,79 e ICOR95=1,441 – 2,139; OR3=40,77 e ICOR95=39,76 – 41,78)

CTG (OR1 = 2,58 e ICOR95 = 2,204 – 2,956; OR2 = 11,07 e ICOR = 10,27 – 11,87)

OMS (OR1 = 3,00 e ICOR95 = 2,703 – 3,297; OR2 = 17,14 e ICOR = 16,29 – 17,99).

Figura 1 – Positividade para diferentes sorovariedades de Leptospiras em

bovinos de leite, Buriti dos Lopes, Piauí, segundo colheitas

semestrais, pós vacinação, 2004-2009.

0

20

40

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

%

Colheitas

hardjobovis hardjoprajitno (CTG) hardjoprajitno (OMS)

16

2.4 DISCUSSÃO

Os sorovares de Leptospiras mais frequentemente encontrados infectando bovinos no

Brasil, são o sorovar Pomona, Icterohaemorragiae, Grippothyphosa, Bratislava, Canicola,

Ballum, Szwajisak e Hardjo (Santa Rosa et al., 1969/1970; Moreira et al., 1994; Vasconcelos

et al., 1997). No surto de abortamento bovino, no rebanho leiteiro de Buriti dos Lopes, PI,

observou-se ocorrência do sorovar Hardjo, com as sorovariantes bovis (HB), Cantagalo

(CTG) e OMS e uma resposta positiva frente à vacina experimental, utilizada nesse rebanho.

O papel de Hardjo, como a principal sorovariedade patogênica para bovinos é aceita

universalmente (Ellis, 1986, Macedo et al., 1996, Moreira, 2004, Mineiro et al., 2007).

O percentual de 54,1% de positivos na primeira colheita, associado à apresentação de

histórico de abortamento e mastites confirmaram a existência da infecção no rebanho.

Resultados com porcentagens inferiores foram encontrados em bovinos sororreagentes em 28

fazendas no estado de Mato Grosso do Sul (38,88%) conforme (Pellegrin et al., 1999) e em

Rondônia, 52,8% (Aguiar et al., 2006), enquanto no norte do estado do Piauí, foi encontrado

52,86% sendo 38,10% para Hardjo (Mineiro et al., 2007), mas percentuais maiores (61,15 a

97%) foram registrados nos estados do Pará (Negrão et al., 1999; Homem et al., 2001), na

Paraíba (Thompson et al., 2006).

Estas diferenças sugerem provável influência de alguns fatores como a densidade

bovina, índice pluviométrico, tipo de solo, sistema de criação, proximidade de outras espécies

animais, acesso às aguadas por bovinos de propriedades diferentes (Ellis, 1994; Faine, 1999;

Salles & Lilenbaum, 2004; Tomich et al., 2007).

Os percentuais de positividade para cada sorovariedade detectados no rebanho,

sugerem que a infecção leptospírica se manteve, por meio da transmissão bovino/bovino. Em

teoria, qualquer sorovar pode infectar um animal, mas, na prática, somente um pequeno

número de sorovariedades é encontrado em determinadas regiões infectando determinadas

espécies. No caso específico de Hardjo, considera-se que a transmissão direta de bovino para

bovino seja o mecanismo mais importante para sua manutenção no plantel (Ellis, 1984).

Quanto à Hardjobovis observa-se entre a primeira e a sétima colheitas, quando a

positividade tinha caído pela metade e ainda sem a aplicação do antígeno Hardjobovis

(vacina), que aquela queda não se deveu ao acaso [OR1 = 2,44 (2,09 – 2,79)], o que parece

17

indicar alguma interferência favorável dos inóculos CTG e OMS sobre aquela infecção, visto

que os mesmos tinham sido inoculados quando da segunda visita (dois anos antes, portanto).

No primeiro mês pós-vacinação (entre 6ª e 7ª leituras) por Hardjobovis houve

acréscimo na proteção, mas, embora OR tenha sido significante [OR2 = 1,79 (1,441 – 2,139)],

é provável que parte dessa proteção seja residual à aplicação dos inóculos CTG + OMS; no

entanto, a elevação de 38,8% para 42,7% entre a 4ª e 5ª leituras permite supor que aquela

proteção cruzada se ocorreu, já não se fazia presente. Já quanto ao efeito propriamente dito de

Hardjobovis, o confronto entre o momento da aplicação (6ª leitura) e a última leitura com pelo

menos um positivo (11ª leitura), foi altamente significante [OR3 = 40,77 (39,76 – 41,78)].

Quanto à CTG, constata-se que entre a primeira colheita e o momento em que a

positividade caiu pela metade (sexta leitura, dois anos, portanto), a redução não se deveu ao

acaso [OR1 = 2,58 (2,204 – 2,956)] e entre este e a última leitura com pelo menos um

positivo (10ª leitura), o resultado foi altamente significante [OR2 = 11,07 (10,27 – 11,87)]. O

aumento das significâncias no período faz supor que a proteção realmente manteve-se ao

longo do tempo.

Quanto a OMS, a redução de positividade entre a primeira leitura (antes da vacinação)

e a sexta, quando a mesma caiu pela metade, não se deveu ao acaso [OR1 = 3,0 (2,703 –

3,297)] e entre esta e a última, em que havia pelo menos um positivo (décima), a queda foi

ainda maior [OR2 = 17,14(16,29 – 17,99)], o que sugere alto poder imunogênico do inóculo.

Considerando a inexistência de um grupo controle, uma vez que 100% do rebanho foi

vacinado, optou-se pelo teste de associação do tipo qui-quadrado paras as prevalências

iniciais, diferença entre sorovariedades, e a eficácia da vacina testada pela prova de OR

(confronto de taxas) entre as prevalências prévia, mediana e final, admitindo-se devida ao

acaso e α=0,05

No presente estudo, o esquema vacinal adotado (sorovares identificados previamente,

vacinação semestral por dois anos) foi eficiente (prevalência decrescente, chegando a zero no

final do estudo).

18

2.5 CONCLUSÕES

Em bovinos leiteiros na bacia leiteira de Parnaíba, PI, ocorre leptospirose, sorovar

Hardjo, sorovariedades Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG), Hardjoprajitno (OMS), com

predominância de Hardjobovis.

Uma vacina elaborada por determinação sorológica das sorovariedades mais

prevalentes no rebanho revelou eficiência, aplicada semestralmente, por dois anos.

19

2.6 REFERÊNCIAS

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22

3 CAPÍTULO II

Detecção de leptospiras por imunoperoxidase e reação em cadeia de polimerase em

vacas da bacia leiteira de Parnaíba, PI

Ana L. B. B. Mineiro1; Rômulo José Vieira

1; Francisco A. L. Costa

1

RESUMO

A leptospirose é uma doença comum nos animais de produção. Na espécie bovina, as perdas

econômicas estão ligadas às falhas reprodutivas como infertilidade, abortamento e queda da

produção . Neste estudo, foram colhidos 60 soros de bovinos leiteiros e 60 amostras de rins,

pulmões, fígado, ovário, útero, placenta e urina durante abate em matadouro municipal da

bacia leiteira de Parnaíba , PI. Pela técnica de soroaglutinação microscópica (SAM), as

sorovariedades de Leptospiras mais freqüentes foram Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG),

Hardjoprajitno (OMS). A análise histopatológica revelou alteração túbulo intersticial em

100% dos animais naturalmente infectados. A lesão localizava-se principalmente na região

corticomedular. Em glomérulos, foi observada hipercelularidade, principalmente focal, global

e segmentar. Cilindros hialinos nos túbulos estavam presentes em oito animais (34,78%),

necrose da membrana basal, atrofia e vasculite em seis animais (26,08%). A presença de

Leptospiras em túbulos foi observada em 5 (21,73%) das 20 amostras positivas. Pela técnica

de imunoperoxidase, de 20 animais positivos analisados, foi verificada a marcação de

antígenos de Leptospiras em células epiteliais, no endotélio dos vasos intersticiais, no

endotélio de capilares glomerulares e na cápsula de Bowman. No pulmões haviam infiltrados

inflamatórios em todos os lobos. O infiltrado inflamatório se localizava nas regiões

peribronquial e peribronquiolar em intensidade maior nos animais soropositivos quando

comparados aos soronegativos (p = 0,0017). No fígado foi observado infiltrado de células

inflamatórias, principalmente de macrófagos e linfócitos. No útero, infiltrado inflamatório

difuso linfoplasmocitário em intensidade maior nos animais soropositivos quando

comparados aos animais soronegativos (p = 0,0017). As lesões nos ovários caracterizavam-se

por infiltrado mononuclear em todos os positivos e fibrose em 10 animais positivos. Células

inflamatórias estavam presentes em maior intensidade nos rins seguido dos pulmões, fígado,

útero, ovários e placenta (p = 0,0000). A PCR foi positiva nas 20 amostras de urina dos

animais positivos e em 10 de tecido renal. Os resultados mostram que em bovinos leiteiros na

bacia leiteira de Parnaíba, PI, ocorre a leptospirose com predominância do sorovar

Hardjobovis. Lesões renais, pulmonares, hepáticas e uterinas estão presentes em bovinos

infectados por leptospiroses sem manifestações aparentes da doença. A presença de DNA de

Leptospiras em tecido renal e urina confere aos animais a condição de disseminadores da

doença.

Palavras-chave: Leptospirose, imunoistoquímica, pcr, vacas.

1 Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, UFPI, Campus Agrícola da Socopo, S/N, Teresina, PI, 64049-

550, Brasil. * Autora para correspondência: [email protected]

23

Leptospiras detection by imunoperoxidase and polimerase chain reaction in cows an the

milk farm in Parnaíba, PI.

Mineiro A.L.B.B., Vieira R.J., & Costa F.A.L. 2010. Detecção de leptospiras por

imunoperoxidase e reação em cadeia de polimerase em vacas da bacia leiteira de Parnaíba,PI .

Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. Programa de Pós-Graduação em

Ciência Animal, Universidade Federal do Piauí, Campus Agrícola da Socopo, s/n. Teresina,

PI 64049-550 Brazil. E-mail: [email protected]

ABSTRAT

Leptospirosis is a common disease in farm animals. In bovine, the economic losses are linked

to reproductive failure and infertility, miscarriage and decreased production . In this study,

sera were collected from cows and samples of kidney, lung, liver, ovary, uterus, placenta and

urine during abattoir slaughter in the dairy industry Parnaíba - PI. For the microscopic

agglutination test (MAT), the serovars of leptospires were more frequent Hardjobovis,

Hardjoprajitno (CTG), Hardjoprajitno (WHO). Histopathology showed tubular interstitial

change in 100% of naturally infected animals. The lesion was located mainly in the

corticomedullary region. In glomeruli, was observed hypercellularity, mainly focal segmental

and global. Hyaline casts in the tubules were present in eight animals (34.78%), necrosis of

the basement membrane, atrophy, and vasculitis in six animals (26.08%). The presence of

leptospires in tubules was observed in 5 (21.73%) of 20 positive samples. For

immunostaining of 20 positive animals examined, there was the marking of antigens of

leptospires in epithelial cells in the endothelium of interstitial blood vessels, the endothelium

of glomerular capillaries and Bowman's capsule. The lung showed inflammatory infiltrates in

all lobe, the inflammatory infiltrate was located in the peribronchial and peribronchiolar

regions of greater intensity in positive animals when compared to seronegative (p = 0.0017).

In the liver was observed infiltration of inflammatory cells, mainly macrophages and

lymphocytes, in the uterus diffuse lymphocytic infiltrate in major intensity in positive

animals when compared to seronegative animals (p = 0.0017). Ovarian lesions were

characterized by infiltration of mononuclear inflammatory cells in all positive animals and

fibrosis in 10 of the of the positive animals. Inflammatory cells were present in greater

intensity in the kidney followed by lung, liver, uterus, ovary and placenta (p = 0.0000). PCR

was positive in 20 urine samples of positive and in 10 samples of renal tissue. The results

show that in dairy cattle in the coastal region of state of Piaui leptospirosis occurs with

prevalence of serovar Hardjobovis. Kidney, lung, liver and uterus damages are present in

cows infected with leptospirosis without clinical manifestations of disease. The presence of

DNA of leptospires in kidney tissue and urine gives animals the status of disseminators of

disease.

Keywords: Leptospirosis, cattle, pcr, immunohistochemistry

24

3.1 INTRODUÇÃO

As leptospiroses são consideradas uma das principais enfermidades que afetam o

sistema reprodutivo, causando principalmente abortamentos, infertilidade, ocorrência de

natimortos e retenção placentária, participando como uma das grandes responsáveis pela

baixa produtividade da pecuária nacional e mundial (Givens, 2006).

Bovinos são considerados hospedeiros de manutenção do sorovar Hardjo, pois além

da elevada suscetibilidade à infecção e baixa patogenicidade, a transmissão é endêmica na

espécie e por isso a doença ocorre na forma crônica, caracterizada por transtornos

reprodutivos. Essa sorovariedade apresenta dois genótipos: Hardjobovis e Hardjoprajitno. O

genótipo Hardjobovis pertence à espécie L. borgpertesenni e o genótipo Hardjoprajitino à

espécie L. interrogans. Ambos são importantes causadores de transtornos reprodutivos nos

rebanhos bovinos em todo o mundo, com diferenças nas suas manifestações clínicas. A

infecção causada por Hardjobovis é considerada uma pandemia em bovinos e é

frequentemente caracterizada pela forma subclínica com sintomas clássicos de abortamento,

enquanto que Hardjoprajitno, isolada em poucos países, caracteriza-se por ser mais

patogênica, levando à queda na produção de leite e transtornos reprodutivos (Ellis, 1994).

As lesões provocadas por L. interrogans são observadas, principalmente, nos rins,

onde chega por via hematógena e multiplica-se, provocando lesões túbulo-intersticiais, até

ser transportada, pela urina, para o meio ambiente, em condições viáveis, para infectar outros

animais e o homem (Scanziani et al., 1989, Yang et al., 2001).

Na fase de leptospiremia,o fígado é o primeiro local a ser atingido, causando necrose

de hepatócitos, colestase intra hepática com conseqüente diminuição da excreção da

bilirrubina (Wohl, 1996; Faine et al., 1999).

Nos pulmões à microscopia eletrônica, observa-se que a lesão primária encontra-se em

células do endotélio dos capilares pulmonares (Huttner et al., 2002), sendo que a injúria

pulmonar durante o processo inflamatório tem sido associada ao excesso de células

estimuladas incluindo os macrófagos alveolares, polimorfonucleares e produção de reativos

intermediários do oxigênio e do nitrogênio, ou outros mediadores inflamatórios (Nally et al.,

2004).

O diagnóstico preciso da infecção por leptospiras em bovinos depende do isolamento e

tipificação da sorovariedade prevalente. Contudo, na maioria dos trabalhos publicados no

25

Brasil são realizados apenas inquéritos sorológicos que não incluem o isolamento para a

identificação do agente, devido à dificuldade na obtenção de resultados conclusivos.

O diagnóstico é realizado mediante aplicação da técnica de Soroaglutinação

Microscópica, porém este teste apresenta algumas limitações como não permitir a

indentificação do genótipo específico, além de gerar reações cruzadas entre espécies do

gênero Leptospira com características antigênicas similares, impossibilitando o diagnóstico

preciso referente ao agente infectante.

A visualização direta de Leptospiras em microscópio de campo escuro tem sido

utilizada principalmente em amostras de urina durante a fase de leptospirúria. Este exame

quando realizado imediatamente após a colheita da urina aumenta as chances de um resultado

positivo, uma vez que o diagnóstico é baseado na morfologia e motilidade das Leptospiras

(Faine, 1999). As Leptospiras podem ser detectadas na urina e vísceras por provas que

utilizam a interação antígeno-anticorpo marcados com imunoperoxidase (Baskervile, 1986).

Entre as técnicas de diagnóstico baseadas na detecção do DNA de leptospiras, a

reação em cadeia de polimerase (PCR) vem sendo utilizada de forma crescente para o

diagnóstico em fluídos e órgãos de várias espécies animais (Heinemann et al., 1999).

O presente estudo teve como objetivo pesquisar aglutininas anti-leptospiras (L.

interrogans) em vacas, caracterizar a natureza e extensão das lesões de rins, fígado, pulmões,

ovários, útero e placenta, detectar a presença de antígeno de Leptospira, bem como, pesquisar

a presença de DNA Leptospira sp. a partir de rins e urina.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 60 vacas, adultas, provenientes da Bacia Leiteira da região de

Parnaíba, Piauí, abatidas segundo recomendações técnicas do Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento – MAPA (Brasil, 2000), no período de julho de 2007 a julho de

2008.

No momento do abate dos animais, amostras de sangue foram colhidas durante a fase

de sangria, na linha de abate, em tubos de 10 ml, sem anticoagulante, para a realização da

Prova de Soroaglutinação Microscópica (SAM). O sangue foi centrifugado a 10.000g por 10

26

minutos para a obtenção do soro que, em seguida, foi colocado em tubos “eppendorf” de 1,5

ml e posteriormente armazenado a -20ºC até o processamento.

O diagnóstico de infecção por L. interrogans foi realizado pela técnica de SAM, no

Laboratório de Zoonoses do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de

Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, em Belo Horizonte, MG. com coleção

de antígenos vivos que incluiu 11 variantes sorológicas patogênicas: Ballum, Bratislava,

Canícola, ,Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Szwajizak, Mini, Pomona, Hardjobovis,

Hardjoprajtno CTG, Hardjoprajitno OMS com 4 a 14 dias de crescimento, diluídas na

proporção de 1:3 em solução salina tamponada, pH 7,2.

O critério adotado para o soro ser considerado como reagente foi de 50% de

Leptospiras aglutinadas por campo microscópico em aumento de 100 vezes. O sorovar

registrado foi aquele que apresentou maior título, sendo as demais aglutinações consideradas

reações cruzadas. As amostras positivas ao título inicial foram novamente diluídas

sucessivamente na razão dois e testadas para o(s) sorovar(es) que reagiram anteriormente. O

título final foi aquele que ainda apresentou 50% ou mais de aglutinação.

Após o abate dos animais, foram colhidos fragmentos de rins, fígado, pulmões,

ovários, útero e placenta, de aproximadamente 0,5 cm de espessura, fixados em formol neutro

a 10%, tamponado com fosfato 0,01M pH 7,4 (formol tamponado) e “Bouin”. Fragmentos de

rins foram colhidos, também, em solução de Duboscq-Brasil por 60 minutos e posteriormente

mantidos em formol neutro a 10% até o processamento.

Os fragmentos de rins, fígado, pulmões, ovários, útero e placenta, foram processados

seguindo técnicas de rotina e os cortes corados com hematoxilina-eosina (H-E), ácido

periódico de Schiff (PAS), tricrômico de Masson (Masson) e ácido periódico prata

metanamine (PAMS). Lâminas também foram tratadas com adesivo Silane A174 (Pharmacia,

USA) para aplicação da técnica de imunoperoxidase nos cortes dos fragmentos de rins fixados

apenas em formol tamponado. Para detecção de DNA de leptospiras, pesou-se 30mg de rim

colocando-os em criotubos com meio RPMI com glicerol a 10% em nitrogênio líquido até seu

processamento no laboratório.

A detecção de antígeno de leptospira foi realizada pela técnica de imunoperoxidase.

Os cortes de tecidos foram desparafinados em xilol e hidratados em concentrações

decrescentes de álcool etílico; foram submetidos a bloqueio de peroxidase endógena, com

peróxido de hidrogênio 0,03%, em metanol por 30 minutos no escuro e tratados em forno de

27

microondas2 potência máxima, em solução Tris-Hcl, pH 1,0, sucessivamente por 10 e 5

minutos. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), os cortes foram

incubados com anticorpo policlonal de coelho anti-leptospira (produzido no Laboratório de

Patologia Animal do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, CCA, UFPI, em

Teresina,PI na diluição de 1:200 “overnight”, em atmosfera úmida, em temperatura de 4ºC.

No dia seguinte, a incubação com anticorpo secundário e a amplificação da reação foi

realizada com o EnVision System3 em atmosfera úmida, temperatura ambiente por 30

minutos. A revelação da reação foi efetuada com 0,3mg/ml de 3,3’- diaminobenzidina4 em

PBS com 0,06% de peróxido de hidrogênio e contracoloração com hematoxilina de Harrys.

A extração de DNA das amostras de tecido renal e urina foi realizada pela otimização

do método extração de DNA com sílica. As amostras de tecido renal e urina foram

homogeineizadas com PBS em microtubos de 1,5 ml contendo 1,0μl de NAI (Iodeto de

Sódio). Em seguida foram incubadas a 55ºC por 15 minutos, adicionado sílica e

homegeineizado por 10 minutos. Centrifugou a 14000g por 30 segundos. O sobrenadante foi

descartado e adicionado o NAI. Em seguida foi centrifugado a 14000g por 30 segundos.

Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 1000μL de solução etanol wash. Retirou-se o

excesso de etanol wash. Colocou-se 1000 µL de Acetona gelada. Procedeu-se a nova

centrifugação a 14000g por 30 segundos. Transferiu-se o sobrenadante para outro microtubo e

adicionou-se 20μL de água ultra-pura. Centrifugou-se a 14000g por 30 segundos, removeu-se

todo o sobrenadante deixando apenas o “pellet”. O sobrenadante foi centrifugado novamente

para retirar possível sílica e acondicionado a -20ºc até o processamento.

Os primeiros utilizados foram G1(5’- CTG AAT CGC TGT ATA AAA GT-3’) G2

(5’- GGA AAA CAA ATG GTC GGA AG- 3’) (Bomfim et al., 2006). A mistura para a

reação de PCR (10µL) foi preparada com buffer 1,5 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTPs

(deoxynucleotideo trifosfato), 10 µM de cada primer, 0,4 µL de Taq DNA polimerase

(Invitrogen), 14,05 µL de H2O bi-destilada deionizada estéril e 5 µL de DNA. A amplificação

foi realizada em um termociclador (Eppendorf Mastercycler Gradient), com um ciclo inicial

de 94°C por 3 minutos, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 1 minuto a 51°C , 1

minuto a 72°C e 3 minutos a 72ºcom um ciclo final de 7 minutos a 72°C.

2 Jetdfrost: Brastemp, São Paulo.

3 EnVision System: Dako Comporation, Carpinteria, CA, USA, Código K4002.

4 Diaminobenzidina: Sigma Chemical, USA.

28

O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1,5% e corados em

brometo de etídeo (0,5µg/ml), e vizualizados em Transluminador UV (Bioagency).

Os resultados foram analisados de forma semi-quantitativa, mensurando-se a

distribuição e intensidade das lesões, classificando-as com base numa escala de 0 a 5, onde

0=normal, 1=mínima ou duvidosa, 2=média, 3= moderada, 4 = moderadamente severa e 5=

severa. Nas análises dos dados comparativos foi utilizado o teste estatístico não paramétrico

de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis. O nível de significância adotado foi de p < 0,05.

Na avaliação histopatológica, ao microscópio de luz, foram analisadas as alterações de

rins, fígado, pulmões, ovários, útero e placenta de forma semi-quantitativa, de acordo com a

localização, distribuição e intensidade das lesões, numa escala de 0 a 5, onde 0 = normal, 1 =

mínima; 2 = média; 3 = moderada; 4 = moderadamente severa; 5 = severa (Pirani 1994). Os

resultados quantitativos foram analisados no programa estatístico Sigma Stat, para testes não

paramétricos: a) método de Kruskal-Wallis para análise de variância. Havendo diferença

significante, aplicou-se o teste de Student-Newman-Keuls para comparação múltipla de

grupos; b) método de Mann-Whitney para comparação entre dois grupos. Adotou-se o nível

de significância de p<0,05.

3.3 RESULTADOS

Do total de 60 soros de vacas analisados pela prova de SAM, vinte e três foram

reagentes para um ou mais sorovares de L. interrogans, detectando-se aglutininas anti-

leptospira em 38,3% das vacas. Dentre os reagentes, o sorovar de maior ocorrência foi

Hardjobovis (15/23), seguido de Hardjoprajitno (CTG) (3/23), Hardjoprajitno (OMS) (2/23),

Bratislava (1/23), Icterohaemorragiae (1/23). Nove animais apresentaram títulos de anticorpos

de 1:100, três, títulos de 1:200, três título de 1:400, três, título de 1:800, um, título de 1:3200 e

quatro de 1:6400. Os animais que reagiram ao sorovar Hardjo (incluindo os sorovares

Hardjobovis, Hardjoprajitno (CTG) e Hardjoprajtno (OMS) corresponderam a 86,9% (20/23),

seguidos dos sorovares Bratislava, 4,34% (1/23), Icterohaemorragiae 4,34% (1/23) e Pomona

4,34% (Tabela 1).

29

Tabela 1 - Distribuição de títulos de anticorpos anti-Leptospira (L. interrogans) em vacas

soropositivas pela prova de SAM, segundo os sorovares infectantes

Sorovar Título

200

400

800

3200

6400

100 200 400 800 3200 6400

Hardjo bovis 9 2 1 3

Hardjo CTG 2 1

Hardjo OMS 1 1

Bratislava 1

Icterohaemorragiae 1

Pomona 1

Para análise das lesões de rins, fígado, pulmões, ovários, útero e placenta, amostras de

40 vacas foram utilizadas: 20 sorologicamente positivas e 20 negativas, grupo controle.

Dos vinte animais positivos, todos (100%) apresentaram alterações túbulo-intersticiais.

Nefrite intersticial estava presente em todos os animais (100%), com infiltrado inflamatório

predominante de linfócitos, macrófagos, plasmócitos (Figura 1) e raros neutrófilos em

intensidade maior nos animais infectados comparados aos controles, não infectados (P =

0,0001, teste de Mann Whitney) (Figura 2). A lesão localizava-se, principalmente na região

cortico-medular, mas estava presente, também, na região cortical e medular, de distribuição

focal, perivascular, periglomerular e peritubular, com intensidade variando de mínima a

severa. Em glomérulos, foi observada hipercelularidade, principalmente, focal, global e

segmentar. O tufo glomerular apresentava-se lobulado e, em casos raros, constatou-se

espessamento segmentar da membrana basal do capilar glomerular. Observou-se ainda

espessamento da cápsula de Bowman. Nos túbulos constatou-se a presença de cilindros

hialinos em oito animais (34,78%) necrose de membrana basal, atrofia (Figura 3) e vasculite

em seis animais (26,08%).

Em cinco casos (21,73%), leptospiras foram detectadas, por meio da técnica de

Warthin-Starry, no lume de túbulos proximais; apresentavam-se agrupadas em massas de cor

negra livres no lume e aderidas à superfície, do epitélio tubular (Figura 4).

30

Figura 1 - Rim. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Infiltrado inflamatório

intersticial de células mononucleares (→). (HE, Obj. 40X).

Figura 2 - Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório

(mediana de escores e intervalo entre percentis 25 e 75) em rim de

vacas leiteiras infectadas naturalmente por L. interrogans e controle .

N = número de animais por grupo. p < 0,05 em relação ao grupo

controle (Teste de Mann Whitney).

31

Figura 3 - Rim. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Atrofia

tubular (→). (PAMS, Obj. 40X).

Figura 4 – Rim. Bovino naturalmente infectado por L. interrogans. Presença de

leptospiras aderidas a superfície luminal do túbulo proximal, em

forma de aglomerados (→). Warthin Starry. 350X.

32

Ao exame histopatológico dos pulmões, os animais positivos, apresentaram, em todos

os lobos, infiltrado inflamatório, principalmente macrófagos e linfócitos (Figura 5), sendo que

neutrófilos e eosinófilos também se faziam presentes em alguns casos. O infiltrado

inflamatório se localizava nas regiões peribronquial e peribronquiolar, em intensidade maior

nos animais soropositivos quando comparados aos negativos (Teste de Mann Whitney,

p=0,0017) (Figura 6). Outras alterações teciduais observadas nos pulmões foram:

espessamento do septo interalveolar, de distribuição focal e, em raros casos, difusa,

congestão, hemorragia, edema pulmonar, presença de exsudato no lúmen de brônquios e

bronquíolos.

Figura 5 - Pulmão. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp.

Infiltrado inflamatório mononuclear (→). (HE, Obj. 40X).

33

Figura 6 - Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório (mediana de

escores entre percentis 25 e 75) em pulmão de vacas leiteiras infectadas

naturalmente por L. interrogans e controle não infectado. N = número de animais

por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney).

As lesões histopatológicas no fígado, encontradas em todos os animais positivos, foi a

presença de infiltrado de células inflamatórias (Figura 7), principalmente de macrófagos e

linfócitos que se localizava na região periportal, de intensidade variando de mínima a

moderada. Houve diferença significativa entre os animais soropositivos e soro-negativos

(Teste de Man Whitney, p>0,5246) (Figura 8). Hiperplasia de células de Kupffer, foi

encontrada em oito animais positivos e em dois negativos.

34

Figura 7 - Fígado. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp.

Infiltrado inflamatório mononuclear. (H-E, Obj. 40X).

Figura 8 - Análise semi-quantitativa da intensidade do processo

inflamatório (mediana de escores entre percentis 25 e 75)

em fígado de vacas leiteiras infectadas naturalmente por

L. interrogans e controle não infectado. N = número de

animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney).

35

Ao exame histopatológico do útero encontrou-se infiltrado inflamatório difuso

linfoplasmocitário (Figura 9) em intensidade maior nos animais soropositivos quando

comparados aos animis soronegativos (p= 0,0017 Teste de Mann Whitney) (Figura 10);

artérias com parede espessa e células vacuolizadas; glândulas endometriais com epitélio

tumefeito e vacuolizado. O infiltrado se localizava nas regiões periglandular e perivascular.

Em menor ocorrência, presenciaram-se plasmócitos, neutrófilos e eosinófilos A reação

normalmente associava-se à congestão e edema e em outros casos, estava acompanhada de

fibrose periglandular com variável grau de dilatação glandular.

Figura 9 - Útero. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp. Infiltrado

inflamatório. (HE, Obj. 40X).

36

Figura 10 - Análise semi-quantitativa da intensidade do processo

inflamatório (mediana de escores entre percentis 25 e 75) em

útero de vacas leiteiras infectadas naturalmente por L.

interrogans e controle não infectado. N = número de animais

por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney).

As lesões histopatológicas dos ovários, encontradas em todos os animais positivos,

caracterizaram-se por infiltrado de células inflamatórias mononucleares (Figura 11) e em

todos os casos o processo era focal, contudo não havia diferença entre os animais positivos e

negativos (p=0,5246, Teste de Mann Whitney) (Figura 12). Lesões como fibrose foram

encontradas em dez animais positivos. (Figura 13).

37

Figura 11 - Ovário. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp.

Infiltrado inflamatório agudo e focal (→). (HE, Obj. 40X).

Figura 12 - Ovário. Bovino naturalmente infectado por Leptospira sp.

Fibrose. (Tricrômico de Masson, Obj. 40X).

38

Figura 13 - Análise semi-quantitativa da intensidade do processo

inflamatório (mediana de escores entre percentis 25 e 75)

entre vacas leiteiras infectadas naturalmente por L.

interrogans e controle não infectado. N = número de

animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney).

Na placenta, foi observado infiltrado inflamatório de células mononucleares entre as

vilosidades, neutrófilos e eosinófilos, necrose das vilosidades coriônicas, material amorfo no

corion, contudo não havia diferença significativa entre positivos e negativos (p=0,5246, Teste

de Mann Whitney).

De um modo em geral, a análise da resposta inflamatória nos vários órgãos

examinados em conjunto, revelou um infiltrado inflamatório linfohistioplasmocitário maior

nos infectados, comparado aos não infectados (p= 0,0001, teste de Mann-Whitney).

Células inflamatórias estavam presentes em maior intensidade no rim seguido do

pulmão, fígado, útero, ovário e placenta (p = 0,0000, Kruskal-Wallis e Student-Newman-

Keuls) (Figura 14).

39

Figura 14 - Análise semi-quantitativa da intensidade do processo inflamatório

(mediana de escores entre percentis 25 e 75) em rim, pulmão, fígado,

útero, ovário e placenta de vacas leiteiras infectadas naturalmente por L.

interrogans e controle não infectado. N = número de animais por grupo.

*p < 0,05 (Teste de Kruskal-Wallis e Student-Newman-Keuls).

A imunoistoquímica, realizada em 40 animais, sendo 20 positivos e 20 negativos,

revelou marcação de antígenos em células epiteliais, no endotélio dos vasos intersticiais,

endotélio de capilares glomerulares e cápsula de Bowman (Figura 15), apenas nos animais

infectados, com diferença significante quando comparado aos animais não infectados (p =

0,00, Teste de Mann-Whitney) (Figura 16).

40

Figura 15 - Rim. Bovino naturalmente infectado por Leptospira spp.

Presença de antígenos no glomérulo (→).

(Imunoperoxidase, Obj. 40X).

Figura 16 - Análise semi-quantitativa da presença de antígeno de

Leptospira (mediana de escores entre percentis 25 e 75)

em rim de vacas leiteiras infectadas naturalmente por L.

interrogans e controle não infectado. N = número de

animais por grupo. *p < 0,05 (Teste de Mann Whitney).

41

A PCR realizada em amostras de urina de 40 animais, sendo 20 sorologicamente

positivos e 20 negativos, foi positiva em todos os animais infectados e negativa em todos os

animais não infectados (Figura 17 e 18). A PCR realizada em amostras de tecido renal desses

mesmos animais, foi positiva em apenas dez dos animais infectados e negativa em todos os

não infectados (Figura 19).

Figura 17 - Gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio mostrando o produto da PCR-

específica obtido com DNA extraído de amostras de urina de bovinos naturalmente

infectados com Leptospira spp. C+ controle positivo L. interrogans sorovar hardjo,

C- controle dos reagentes usados na reação de PCR.

Figura 18 - Gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio mostrando o produto da PCR-

específica obtido com DNA extraído de amostras de urina de bovinos naturalmente

infectados com Leptospira spp . C+ controle positivo L. interrogans sorovar hardjo,

C- controle dos reagentes usados na reação de PCR.

42

Figura 19 - Gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio mostrando o produto da

PCR- específica obtido com DNA extraído de amostras de rim de bovinos

naturalmente infectados com Leptospira spp. C+ controle positivo L.

interrogans sorovar hardjo, C- controle dos reagentes usados na reação de

PCR.

O quadro 1 sumariza os resultados gerais deste trabalho, incluindo as análises

histopatológicas, imunoistoquímica e reação em cadeia de polimerase.

43

Quadro 1. Análise histopatológica de órgãos e pesquisa de leptospiras de vacas

Grupos Animais

Análise Histopatológica PCR

Infiltrado Inflamatório* (HE) IMH W-S

Rins Pulmões Fígado Ovários Útero Placenta Urina Rins

Po

siti

vo

s

1 5 3 4 4 3 3 2 P P P

2 1 1 1 1 0 0 1 N N P

8 3 1 2 0 2 0 1 P P P

11 3 1 2 0 0 0 1 N N P

15 3 2 2 0 2 0 1 N N P

20 1 2 1 0 3 0 3 N N P

21 5 4 3 0 3 0 1 P P P

23 1 3 1 0 0 0 0 N P P

24 2 2 2 0 3 0 2 N P P

25 1 1 2 0 0 0 0 N N P

28 5 1 3 3 0 3 3 P P P

29 2 0 1 0 0 0 0 N N P

30 5 3 3 3 0 3 3 P P P

32 3 3 2 0 0 0 2 N N P

35 3 3 0 0 0 0 0 N N P

36 2 2 0 0 0 0 2 N N P

37 3 1 0 0 0 0 0 N N P

38 2 3 3 0 0 0 2 N P P

39 3 2 0 0 1 0 2 N P P

40 3 1 0 0 1 0 2 N P P

Neg

ativ

os

3 0 1 1 0 0 0 0 N N N

4 0 1 0 0 0 0 0 N N N

5 0 1 0 0 0 0 0 N N N

6 0 0 1 0 0 0 0 N N N

7 0 0 1 0 0 0 0 N N N

9 0 0 1 0 0 0 0 N N N

10 0 1 0 0 0 0 0 N N N

12 0 0 0 0 0 0 0 N N N

13 0 0 0 0 0 0 0 N N N

14 0 0 0 0 0 0 0 N N N

16 0 1 0 0 0 0 0 N N N

17 0 1 0 0 0 0 0 N N N

18 0 1 1 0 0 0 0 N N N

19 0 0 0 0 0 0 0 N N N

22 0 1 0 0 0 0 0 N N N

26 0 1 1 0 0 0 0 N N N

27 0 1 0 0 0 0 0 N N N

31 0 1 0 0 0 0 0 N N N

33 0 0 0 0 0 0 0 N N N

34 0 0 0 0 0 0 0 N N N

*Escores: 0 = normal; 1 = mínimo; 2 = médio; 3 = moderado; 4 = moderadamente severo; 5 = severo.

44

3.4 DISCUSSÃO

Apesar da pesquisa de aglutininas anti-Leptospiras em animais de abatedouro não

constituir parâmetro dos mais adequados para determinar a prevalência da doença em uma

área ou região, em função, geralmente, do limitado número de animais, a mesma permite o

registro seguro da infecção, bem como dos sorovares de Leptospiras de maior ocorrência na

região de origem dos animais. Neste contexto pode-se assegurar que 38,3% de um total de 60

vacas oriundas da bacia leitera de Parnaíba-PI estão infectadas por L. interrogans. Esta

infecção, provavelmente, reflita exposição natural, pois a vacinação de bovinos não é

praticada na região.

As evidências sorológicas apontam maior importância para o sorovar Hardjo (Hardjo

bovis, Hardjo CTG e Hardjo OMS com ocorrência de 86,9% (20/23), seguidos dos sorovares

Bratislava, 4,34% (1/23), Icterohaemorragiae 4,34% (1/23) e Pomona 4,34%. A

predominância do sorovar Hardjo também foi observado em rebanho leiteiros no Estado de

Minas Gerais (Moreira et al., 1993), das regiões Sul (Fávero et al., 2000) e Sudeste do Brasil

(Vasconcelos et al., 1997), dos estados de São Paulo (Favero et al., 2001), Minas Gerais

(Araújo et al., 2005), Pernambuco (Oliveira et al.,2001), na Amazônia (Homem et al., 2001),

Rio de Janeiro (Lilembaum e Souza.,2003) e no Piauí (Mineiro et al., 2007) mas no norte da

Espanha o principal sorovar encontrado é Bratislava (25,4%), seguido de Hardjo (8,2%)

(Atxaerandio et al., 2005). Esta diferença, provavelmente, decorra das condições de ambiente

e clima que são bem diferentes na Europa em comparação com o Brasil.

Dos 40 animais incluídos na casuística das alterações histopatológicas, 20 (50%)

apresentaram alterações renais. As lesões localizavam-se tanto na região cortical, quanto

cortico-medular e medular. Sabe-se que o local preferencial de lesão renal na leptospirose é

no espaço túbulo-intersticial, com maior evidência de comprometimento nos túbulos

proximais (Sitprija et al., 1980, Barnett et al., 1999) onde as Leptospiras aderem e liberam

toxinas, que danificam o epitélio tubular (Ferreira Alves et al., 1987). Muito embora não

tenha sido feito controle e nem a sorologia para outras doenças, é de se admitir que as lesões

inflamatórias renais fossem devidas à leptospirose, pois esta era significantemente maior nos

animais infectados quando comparados aos não infectados. Além disso, nos túbulos renais de

cinco animais (12,5%), constatou-se, pela coloração de Warthin Starry, a presença de

Leptospiras com a característica conformação filamentosa contorcida, em aglomerados ou em

45

formas únicas, de coloração enegrecida, tanto aderida ao epitélio quanto presente no lume

tubular. O percentual encontrado neste trabalho é inferior ao observado por Yener & Keles

(2001) em bovinos e superior ao observado por Saglam et al. (2003), também, em bovinos .

Verificou-se que lesões renais túbulo-intersticiais, como nefrite intersticial e atrofia

tubular, estavam presentes em todos os animais com sorologia positiva (100%), mas não

foram encontradas nos animais sorologicamente negativos. Observou-se, também lesões

glomerulares de intensidade mínima, conforme a literatura registra (Alves et al., 1989, Stiprija

et al., 1980), mas chamou a atenção a lobulação do tufo glomerular, espessamento da

membrana basal do capilar glomerular e a presença de material protéico na cápsula de

Bowman.

Na coloração de H-E as lesões hepáticas encontradas foram congestão vascular e

sinusoidal, perda da arquitetura hepática, tumefação celular e presença de células

polimorfonucleares e nos pulmões foram observadas congestão de vasos, hemorragia,

vasculite, pigmentação e presença de células polimorfonucleares. As lesões observadas no

parênquima hepático e pulmonar provavelmente foram resultantes da multiplicação do

microrganismo na fase de leptospiremia, mas com o aparecimento de anticorpos, confirmados

pela SAM, as Leptospiras foram eliminadas do fígado e da maioria dos órgãos acometidos,

permanecendo então nos rins (Oliveira, 2005).

A técnica de imunoistoquímica é uma das mais sensíveis para detecção de Leptospira

sp. ou do antígeno de leptospira em tecido renal. Antígeno foi observado em maior

intensidade nas células epiteliais e intersticiais quando comparado a outras estruturas renais, o

que sugere que estes sejam locais preferenciais de ação das Leptospiras sobre os rins,

corroborando outras pesquisas realizadas em humanos, hamster e bovinos (Alves et al., 1989,

Haanwinckel et al., 2004, Silva et al., 2005). Além disso, antígeno de Leptospiras era

numericamente mais evidente em células glomerulares dos animais infectados quando

comparados aos não infectados, demonstrando que os glomérulos, também são

comprometidos no curso da infecção em bovino.

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) revelou a presença de DNA de Leptospira

sp. na urina das 20 vacas soropositivas (100%) e em tecido renal de 10 animais (50%). Nos

animais soronegativos não foi observado DNA de leptospiras, nem na urina e nem em tecido

renal. A sorologia associada à histopatologia, imunohistoquímica e PCR, são métodos de

diagnóstico eficazes na confirmação da infecção em bovinos. Os resultados deste estudo estão

de acordo com autores que sugerem que a PCR pode ser uma alternativa na detecção de

46

Leptospiras em amostras de tecido e urina (Gerritsen et al., 1994; Magajevski et al., Bomfim,

2006). Em bovinos foi detectado um percentual de 52,5% de animais positivos na urina, na

PCR (Bomfim, 2006).

3.5 CONCLUSÕES

1. Infecção por Leptospiras em bovinos estão presentes na Bacia Leiteira de Parnaíba-PI;

2. O sorovar de maior ocorrência na Bacia Leiteira de Parnaíba-PI é o Hardjo;

3. Lesões renais, pulmonares, hepáticas e uterinas estão presente em bovinos infectados por

Leptospiras sem manifestações clínicas da doença;

4. A presença de antígeno e de Leptospiras em células epiteliais tubulares, do interstício

renal e glomerulares, indica que o bovino pode ser portador assintomático;

5. A presença de DNA de Leptospiras em tecido renal e urina confere aos animais a

condição de disseminadores da doença.

3.6 REFERÊNCIAS

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