Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

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Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho LOPAP ( LOPAP ( LOPAP ( LOPAP (Lonomia obliqua Lonomia obliqua Lonomia obliqua Lonomia obliqua prothrombin activator prothrombin activator prothrombin activator prothrombin activator protease protease protease protease): clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura Pichia Pichia Pichia Pichia pastoris, pastoris, pastoris, pastoris, obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. São Paulo São Paulo São Paulo São Paulo 200 200 200 2009

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LOPAP (LOPAP (LOPAP (LOPAP (Lonomia obliquaLonomia obliquaLonomia obliquaLonomia obliqua prothrombin activator prothrombin activator prothrombin activator prothrombin activator

proteaseproteaseproteaseprotease)))):::: clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura clonagem e expressão em levedura Pichia Pichia Pichia Pichia

pastoris,pastoris,pastoris,pastoris, obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise obtenção de um peptídeo sintético, análise

estrutural e avaliação de suas potenciais aplicaçõesestrutural e avaliação de suas potenciais aplicaçõesestrutural e avaliação de suas potenciais aplicaçõesestrutural e avaliação de suas potenciais aplicações

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.

São PauloSão PauloSão PauloSão Paulo

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Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Bioquímica e Biologia Molecular Orientadora: Dra. Ana Marisa ChudzinskiDra. Ana Marisa ChudzinskiDra. Ana Marisa ChudzinskiDra. Ana Marisa Chudzinski----Tavassi Tavassi Tavassi Tavassi

São PauloSão PauloSão PauloSão Paulo

2009200920092009

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DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

reprodução não autorizada pelo autor

Carrijo Carvalho, Linda Christian.

LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): clonagem e expressão em levedura Pichia pastoris, obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações / Linda Christian Carrijo Carvalho. -- São Paulo, 2009.

Orientador: Ana Marisa Chudzinski Tavassi. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/IPT/Instituto Butantan. Área de concentração: Biotecnologia. Linha de pesquisa: Bioquímica e biologia molecular. Versão do título para o inglês: LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): cloning and expression in Pichia pastoris yeast, design of a synthetic peptide, structural analysis and evaluation of its potential applications. Descritores: 1. Bioquímica 2. Proteínas recombinantes 3. Peptídeos 4. Hemostasia 5. Biologia celular 6. Matriz extracelular I. Chudzinski-Tavassi, Ana Marisa II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia III. Título.

ICB/SBIB0200/2009

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A Deus,

pelo amor e por todas as dádivas,

por me permitir errar e aprender,

pelo dom da vida!

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Ao meu pai, Jose e minha mãe, Lucila, com

muito amor, pela sua dedicação imensurável,

que são meu exemplo de força e

perseverança. A minha irmã Lanna e meus

irmãos Paulo e Cleber, pela compreensão nos

momentos de ausência, pelo constante apoio

e carinho.

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Ao Fábio, meu marido, pelo amor,

cumplicidade, compreensão e cuidado. Por

estar ao meu lado em todos os momentos,

compartilhando as dificuldades e as

conquistas.

Page 9: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

A meus avôs, tios, primos e todos os meus

amigos, que sempre torceram por mim e me

ajudaram.

A todos os professores e mestres que

enriqueceram a minha vida com suas lições

profissionais e pessoais, pela amizade, apoio e

incentivo.

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AGRADECIMENTOS

À Dra. Ana Marisa Chudzinski-Tavassi, pela orientação e confiança que

depositou em mim. A amizade construída ao longo deste tempo foi muito

positiva, me permitindo conhecer além do lado profissional, a beleza do seu

lado humano. Obrigada pela acolhida, pelo constante estímulo, pelo

aprendizado e por todas as oportunidades que me fizeram crescer pessoal e

profissionalmente. Seu entusiasmo contagiante foi um fator diferencial para o

sucesso deste trabalho, que me levou a vivenciar uma nova face da pesquisa

científica, dedicada ao desenvolvimento de novas moléculas e inovação.

A todos os pesquisadores, técnicos e pós-graduandos do Laboratório de

Bioquímica e Biofísica do Instituto Butantan, que estiveram sempre dispostos

a ajudar, apoiar, ensinar e dar suporte. Especialmente à Durvanei A. Maria,

Adriana R. Lopes, Rafael Porto, Isabel Batista, Fernanda Faria, Miryam Paola

A. Flores, Simone Simons, Janaina Ventura, Luana Wlian, Paulo Sá, Sandra

Barreto, Daniella Oliveira, Karla Roedel, Daniel Furlin, Nicole Mambelli, Jáfia

Lacerda e Erica Akagi. Aos colegas que não estão mais no Laboratório pelos

ensinamentos, pela troca de experiências e pelo exemplo que deixaram:

Márcio Fritzen, Agostinho Pereira, Oscar Ramos, Jeanne Claine Modesto,

Maria Esther R. Silva, Carla Seibert, e em especial ao Cleyson V. Reis, que

me ajudou na fase inicial deste trabalho.

À Profa. Dra. Suely Gomes de Figueiredo, do Centro de Ciências

Biomédicas - UFES, por me apresentar ao “mundo das proteínas”, me

ensinando as bases da Bioquímica, da Pesquisa Científica e, principalmente,

da ética profissional. Seus ensinamentos, conselhos e sua amizade, foram

muito importantes para que eu pudesse ir adiante.

À Profa. Dra. Sandra Farsky e a Kaline Waismam, da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas - USP, pela colaboração proveitosa que mantivemos

neste período.

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Aos que colaboraram nas várias etapas deste trabalho: Dr. Cleyson V.

Reis, Dra. Carla Seibert, Dra. Paola Flores, Dra. Janaina Ventura, Luana

Wlian, Dr. Oscar Ramos, Dra. Isabel Batista e Dr. Durvanei Maria, do

Laboratório de Bioquímica e Biofísica - Instituto Butantan; Dra. Mickie Takagi

e Dra. Viviane Maimoni Gonçalves, do Laboratório de Bioprocessos, Centro de

Biotecnologia - Instituto Butantan; Dr. Robson L. Melo, do CAT - Instituto

Butantan; Profa. Dra. Aparecida Sadae Tanaka, do Depto. de Bioquímica -

UNIFESP; Profa. Dra. Maria Filomena Rodrigues e Dra. Rosana Picoli, do

Laboratório de Biotecnologia Industrial - IPT; Prof. Dr. Francisco Maffei, Dra.

Sônia Andrade Chudzinski e Dra. Lilian Peceguini, do Instituto de Ensino e

Pesquisa - Hospital Sírio Libanês; Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues,

da Faculdade de Medicina - USP.

Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - USP, em especial

aos funcionários da Secretaria Marcos, Eliane e Fábia, e à presidente do

programa Profa. Dra. Ana Clara Schenberg pelo apoio.

À Biblioteca do Instituto de Ciências Biomédicas, em especial a

bibliotecária Maria José de Jesus Carvalho, pela ajuda na revisão e

normalização da tese.

Ao suporte oferecido pelos Funcionários do Instituto Butantan e da

Universidade de São Paulo.

Enfim, a todos que contribuíram para a realização deste trabalho,

muitos que porventura não foram citados, mas que certamente foram

indispensáveis em alguma etapa deste trabalho, doando um pouco de sua

atenção, talento, conhecimento e amizade.

Agradeço a vocês imensamente!

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Este trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica e

Biofísica do Instituto Butantan, com suporte financeiro das

agências:

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

Bolsa de Doutorado Direto – PROCESSO 05/59739-9

Financiadora de Estudos e Projetos, Governo Federal

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“Senhor, tu me sondas e me conheces. Sabes

quando me assento e quando me levanto; de

longe penetras os meus pensamentos.

Esquadrinhas o meu andar e o meu deitar e

conheces todos os meus caminhos. Tu me

cercas por trás e por diante e sobre mim pões

a mão.”

Salmo 139

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“A coisa mais indispensável a um homem é

reconhecer o uso que deve fazer do seu

próprio conhecimento.”

Platão

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RESUMO

Carrijo Carvalho LC. LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): clonagem e expressão em levedura Pichia pastoris, obtenção de um peptídeo sintético, análise estrutural e avaliação de suas potenciais aplicações [Tese]. São Paulo: Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia da Universidade de São Paulo/Instituto Butantan/ Instituto de Pesquisas Tecnológicas; 2009.

O contato acidental com lagartas da mariposa Lonomia obliqua causa

envenenamento caracterizado como síndrome hemorrágica devido a uma

coagulopatia de consumo. O Lopap é uma das toxinas mais abundantes

nas cerdas desta lagarta, caracterizado como uma serino protease que

apresenta atividade ativadora de protrombina e atividade antiapoptótica.

Esta proteína é o único membro descrito da família das lipocalinas com

atividade proteolítica. Membros desta família são conhecidos como

carreadores de moléculas lipofílicas, reguladores de processos metabólicos

e homeostáticos, além do envolvimento na modulação de respostas

celulares, tendo em comum a presença de três domínios conservados na

estrutura primária. Tendo em vista potenciais aplicações terapêuticas e

biotecnológicas do Lopap, este trabalho teve como objetivo a obtenção do

Lopap recombinante (rLopap) por metodologia escalonável e a avaliação

de sua atividade in vivo e in vitro. O Lopap foi clonado a partir do

transcriptoma das cerdas de L. obliqua e expresso na levedura Pichia

pastoris, sendo recuperado na forma enzimaticamente ativa e com

capacidade procoagulante sobre plasma humano. Em modelo animal de

controle sistêmico da hemostasia, o rLopap foi capaz de diminuir o tempo

de sangramento em animais anticoagulados com enoxaparina. A partir de

domínios conservados de lipocalinas encontrados na seqüência primária

do Lopap, peptídeos sintéticos foram obtidos e testados em cultura de

células endoteliais. Um peptídeo relacionado ao segundo domínio (motif

2), designado antiapoptotic peptide (AP), foi capaz de reproduzir os

efeitos do Lopap na modulação da sobrevivência celular. Em cultura de

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fibroblastos, AP foi capaz de induzir a síntese de proteínas de matriz

extracelular como colágeno, fibronectina e tenascina. O aumento de

colágeno foi observado também na derme de animais tratados localmente

com AP, cujo efeito persistiu por mais de três meses. A ocorrência, em

outras proteínas, de seqüências relacionadas a AP foi investigada através

da busca em bancos de dados públicos por seqüência de proteínas

(blastp) e por domínios conservados (motif search library, blast conserved

domain). Os resultados obtidos mostraram a presença de seqüências

similares em lipocalinas de origem humana e animal como purpurina,

prostaglandina D sintase e apolipoproteína D e também em proteínas de

vírus, bactérias, parasitas e insetos, muitas das quais não tem função

descrita. O alinhamento do modelo tridimensional do Lopap com outras

lipocalinas descritas com atividade antiapoptótica (purpurina e

prostaglandina D sintase) mostrou que a localização e conformação

tridimensional da região correspondente a AP têm padrão semelhante às

seqüências da purpurina e prostaglandina D sintase. Os valores relativos

de polaridade, hidropaticidade e exposição ao solvente dos aminoácidos

desta região também foram semelhantes nestas proteínas. Através destes

resultados, pode-se sugerir que a seqüência identificada confere uma

propriedade comum e conservada em muitas lipocalinas. A desvinculação

da ação procoagulante do Lopap através da obtenção de um peptídeo

sintético abre perspectivas para seu uso em várias aplicações que se

baseiam em sua ação na modulação celular, como um componente

cosmético, no reparo e remodelamento tecidual e em várias disfunções

que envolvem morte celular e perda de colágeno.

Palavras-chave: Bioquímica. Proteínas recombinantes. Peptídeos.

Hemostasia. Biologia celular. Matriz extracelular.

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ABSTRACT

Carrijo Carvalho LC. LOPAP (Lonomia obliqua prothrombin activator protease): cloning and expression in Pichia pastoris yeast, design of a synthetic peptide, structural analysis and evaluation of its potential applications [Doctoral thesis]. São Paulo: Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia da Universidade de São Paulo/Instituto Butantan/Instituto de Pesquisas Tecnológicas; 2009.

Accidental contact with the Lonomia obliqua moth caterpillar causes

envenoming outcomes characterized as hemorrhagic syndrome due to a

consumption coagulopathy. Lopap is one of the most abundant toxins in

the caterpillar’s bristles. This protein was characterized as a serine

protease which displays prothrombin activation and antiapoptotic

activities. Lopap is the only member of the lipocalin family with proteolytic

activity. Members of lipocalins family are recognized as carriers of small

lipophilic molecules, regulators of methabolic and homeostatic process, by

their involvement in the modulation of cells responses, and share three

characteristic conserved domains in their primary structure. In view of the

potential therapeutic of biotechnological applications of Lopap, this work

aimed to obtain recombinant Lopap (rLopap) by a scaled-up methodology

and the evaluation of the rLopap’s activity in vivo and in vitro. Lopap was

cloned from the transcriptome of the L. obliqua bristles and expressed in

the Pichia pastoris yeast. The recombinant protein was recovered in its

enzymatic active form and displayed procoagulante effect on human

plasma. rLopap was able to reduce the bleeding time in animals that was

anticoagulated with enoxaparin in an experimental model to evaluate

systemic hemostasis. Based on lipocalin conserved domains found in

Lopap primary sequence, synthetic peptides were obtained and assayed

on endothelial cell culture. A peptide related to the second domain (motif

2), called antiapoptotic peptide (AP), was able to reproduce the effects of

Lopap in the modulation of cell survival. In fibroblast culture, AP was able

to induce the synthesis of extracellular matrix proteins, such as collagen,

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fibronectin and tenascin. The increase of collagen content was also

observed in the dermis of animals locally treated with AP. This effect was

observed up to three months after treatment. The presence of AP-related

sequences in other proteins was investigated by search at public data

banks considering complete protein sequences (blastp) and conserved

domains (motif search library, blast conserved domain). Results showed

the occurrence of similar sequences among human and animal lipocalins,

such as purpurin, prostaglandin D synthase and apolipoprotein D, and also

in proteins from virus, bacteria, parasites and insects, many of these have

no functions described. Alignment of the Lopap tridimensional model with

other antiapoptotic lipocalins (purpurin and prostaglandin D synthase)

revealed that the region corresponding to AP sequence have similar

tridimensional structures among these proteins. The relative polarity,

hydropathicity and solvent accessibility values observed for each amino

acid residue of AP and related sequences in the tertiary structure of their

proteins also had a similar pattern. These results suggest that AP-related

sequence signatures confer a common property in many lipocalins. The

trim of the Lopap procoagulant activity by means of obtaining a synthetic

peptide open perspectives for its use in several applications that are based

merely on its action via cell modulation, for example, as a cosmetic

component, aiding tissue repair and remodeling, and in many dysfunctions

involving cell death and loss of collagen.

Keywords: Biochemistry. Recombinant proteins. Peptides. Hemostasis.

Cell biology. Extracellular matrix.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Ciclo biológico de Lonomia obliqua (fases).................38

Figura 2 - Lagarta Lonomia obliqua............................................39

Figura 3 - Representação esquemática do sistema

hemostático..............................................................

43

Figura 4 - Esquema representativo da hidrólise da

protrombina.............................................................

44

Figura 5 - Seqüência nucleotídica e de aminoácidos do Lopap....49

Figura 6 - Alinhamento da seqüência primária do Lopap com

outros membros da família das lipocalinas,

mostrando as regiões conservadas (motifs)...............

50

Figura 7 - Estrutura tridimensional do Lopap obtida por

modelagem molecular................................................

51

Figura 8 - Estrutura em β-barril da apolipoproteína D

humana.....................................................................

53

Figura 9 - Estrutura da prostaglandina D sintase murina

destacando as características estruturais de

lipocalinas.................................................................

55

Figura 10 - Mapa do pAE............................................................60

Figura 11 - Oligonucleotídeo P1.................................................62

Figura 12 - Oligonucleotídeo PRIPIC9F.......................................66

Figura 13 - Perfil eletroforético do inserto codificante do

Lopap.......................................................................

100

Figura 14 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do rLopap

expresso com cauda de 6xHis em E. coli Origami....

102

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Figura 15 - Atividade ativadora de protrombina de diferentes

clones (C1 a C5) de Pichia pastoris transformada

para expressão do rLopap.......................................

104

Figura 16 - Cromatografia em coluna de afinidade

Benzamidina-Sepharose...........................................

107

Figura 17 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do material

obtido após expressão do rLopap em Pichia

pastoris em meio complexo BMMY e após

purificação em Benzamidina-Sepharose...................

108

Figura 18 - Curva de crescimento de Pichia pastoris

expressando rLopap em meio mínimo BMM com

diferentes pHs........................................................

112

Figura 19 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do sobrenadante

do meio de cultivo durante a expressão do rLopap

em Pichia pastoris em meio mínimo BMM.................

114

Figura 20 - Imunodetecção do rLopap expresso em

pH 5,0 purificado por cromatografia

em Benzamidina-Sepharose.....................................

115

Figura 21 - Atividade ativadora de protrombina do rLopap

expresso em pH 5,0 purificado por cromatografia

em Benzamidina-Sepharose....................................

116

Figura 22 - Curva de crescimento de Pichia pastoris em

biorreator para expressão do rLopap......................

119

Figura 23 - Efeito da temperatura na estabilidade da atividade

ativadora de protrombina de amostras contendo

rLopap expresso em Pichia pastoris........................

122

Figura 24 - Efeito do pH na estabilidade da atividade

ativadora de protrombina de amostras contendo

rLopap expresso em Pichia pastoris.........................

123

Page 21: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

Figura 25 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) de amostras

contendo rLopap expresso em Pichia pastoris

incubadas em diferentes pHs para teste de

estabilidade.............................................................

125

Figura 26 - Perfil cromatográfico em coluna HiPrep QFF do

material obtido no processo de cultivo de Pichia

pastoris em biorreator para expressão do rLopap.....

128

Figura 27 - Perfil cromatográfico em coluna Superose 12 da

fração ativa obtida na primeira etapa de

purificação (P1 QFF).................................................

129

Figura 28 - Viabilidade de células endoteliais (tEND) com

apoptose induzida por TNF-αααα e tratadas com

rLopap.....................................................................

131

Figura 29 - Tempo de sangramento em coelhos heparinizados

tratados com rLopap...............................................

133

Figura 30 - Tempo de coagulação (TTPa) em coelhos

heparinizados tratados com rLopap........................

134

Figura 31 - Seqüência de aminoácidos dos peptídeos

sintéticos desenhados a partir da seqüência

primária do Lopap....................................................

136

Figura 32 - Efeito de peptídeos sintéticos derivados da

seqüência do Lopap sobre a viabilidade de células

endoteliais...............................................................

138

Figura 33 - Efeito de diferentes concentrações dos peptídeos

P2 e P4 na viabilidade de células endoteliais..........

139

Figura 34 - Efeito de inibidores de serino protease sobre a

atividade antiapoptótica de P2.................................

141

Figura 35 - Localização da seqüência dos peptídeos P2 e P4 na

estrutura tridimensional do Lopap...........................

143

Page 22: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

Figura 36 - Comparação de propriedades físicas e estruturais

da região do Lopap envolvida na modulação

celular e a região correspondente em lipocalinas

antiapoptóticas.......................................................

151

Figura 37 - Imunofluorescência para fibronectina, tenascina e

procolágeno em cultura fibroblastos tratados com

P4............................................................................

153

Figura 38 - Aumento de colágeno na derme de camundongos

tratados com P4......................................................

155

Figura 39 - Ganho de colágeno na derme de camundongos

tratados com diferentes doses de P4......................

156

Figura 40 - Ganho de colágeno na derme de camundongos

tratados com doses cumulativas de P4....................

158

Page 23: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Classificação de ativadores de protrombina de venenos de serpentes..............................................

45

Tabela 2 - Meio definido (Fermentation Basal Salts)................ 75

Tabela 3 - Solução de traço de metais (PTM1)......................... 76

Tabela 4 - Concentração de proteínas no meio de cultivo durante a expressão do rLopap em P. pastoris em meio complexo BMMY.............................................

106

Tabela 5 - Atividade ativadora de protrombina das frações da cromatografia em Benzamindina-Sepharose................................................................

109

Tabela 6 - Atividade procoagulante do rLopap sobre plasma humano normal citratado.........................................

109

Tabela 7 - Efeito citoprotetor do rLopap em HUVECs................110

Tabela 8 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina ao final da expressão do rLopap em P. pastoris em meio mínimo BMM.......................

111

Tabela 9 - Parâmetros do processo de cultivo de P. pastoris em biorreator para expressão do rLopap..................

118

Tabela 10 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina durante a fase de indução da expressão do rLopap em biorreator........................

118

Tabela 11 - Recuperação de proteínas solúveis após clarificação do material obtido em biorreator.........

120

Tabela 12 - Eficiência de colunas de troca iônica e interação hidrofóbica para purificação do rLopap expresso em P. pastoris.......................................................

127

Tabela 13 - Purificação parcial do rLopap expresso em P. pastoris.................................................................

130

Tabela 14 - Propriedades dos peptídeos sintéticos derivados da seqüência do Lopap..........................................

135

Tabela 15 - Domínios de proteínas com seqüências similares a P2 e P4 identificados pela busca no Motif Search Library.......................................................

144

Page 24: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

Tabela 16 - Alinhamento dos resultados de busca por domínios conservados (CDART) relacionados com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.........................................................................

145

Tabela 17 - Alinhamento dos resultados de busca pelo blastp com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.........................................................................

148

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A – absorbância

α-trombina – trombina enzimaticamente ativa

AE – atividade específica

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AOX1 – álcool oxidase 1

AP – antiapoptotic peptide, peptídeo antiapoptótico

Arg – arginina

ARS – acessibilidade relativa ao solvente

AT III – antitrombina III

BMG – buffered minimal glycerol, meio mínimo de glicerol

BMGY – buffered glycerol-complex medium, meio complexo de glicerol

BMM – buffered minimal methanol, meio mínimo de metanol

BMMY – buffered methanol-complex medium, meio complexo de metanol

CDART – Conserved Domain Architecture Retrieval Tool

cDNA – ácido desoxirribonucléico complementar

CID – coagulação intravascular disseminada

VC – volume de coluna

DMSO – dimetilsulfóxido

DNA – ácido desoxirribonucléico

DO – densidade óptica

E. coli – Escherichia coli

EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético

F – fator de coagulação

F1.2 – fragmento 1.2 resultante da clivagem da protrombina

FBS – fermentation basal salts, meio definido

FDA – Food and Drug Administration

FF – Fast Flow

FII – fator II ou protrombina

FIIa – fator II ativado ou trombina

Page 26: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

FV – fator V ou pró-acelerina

FVIII – fator VIII ou fator anti-hemofílico

FX – fator X ou fator de Stuart-Prower

FXa – fator X ativado

FXII – fator XII ou fator de Hageman

FXIII – fator XIII ou fator estabilizante de fibrina

HPLC – high pressure liquid chromatography, cromatografia líquida de alta

pressão

HUVECs – human umbilical vein endothelial cells, células endoteliais de

veia de cordão umbilical humano

IL - interleucina

Ile – isoleucina

INPI – Instituto Nacional da Propriedade Industrial

IPTG – isopropil-β-D-tiogalactosídeo

L. obliqua – Lonomia obliqua

LB – Luria-Bertani

mAU – miliunidade de absorbância

MD – meio mínimo de dextrose

MMDB – Molecular Modeling Database

mRNA – ácido ribonucléico mensageiro

MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina

NCBI – National Center for Biotechnology Information

NMWC – corte nominal de massa molecular

NO – óxido nítrico

OD – oxigênio dissolvido

P. pastoris – Pichia pastoris

PBS – tampão fosfato-salina

PCR – polymerase chain reaction, reação em cadeia da polimerase

PMSF – fluoreto de fenil-metil-sulfonil

PPG – polipropilenoglicol

PTM1 – Pichia trace metal, solução de traço de metais

QFF – Q-Sepharose Fast Flow

Page 27: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

rLopap – Lopap recombinante

SCR – structurally conserved regions

SEM – erro padrão

SFB – soro fetal bovino

SDS – dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida em condições

desnaturantes

Thr – treonina

TNF-α – fator de necrose tumoral alfa

TP – tempo de protrombina

TTPa – tempo de tromboplastina parcial ativada

U – unidade de atividade enzimática

YNB – yeast nitrogen base

Page 28: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...........................................................................31

2 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................35

2.1 As lagartas do gênero Lonomia............................................35

2.2 Síndrome hemorrágica causada pela lagarta L. obliqua........40

2.3 Lopap – o ativador de protrombina da lagarta L. obliqua.... 42

2.4 Lipocalinas......................................................................... 52

3 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................59

3.1 Obtenção do rLopap na forma solúvel em sistema

bacteriano (E. coli Origami).......................................................

59

3.1.1 Clonagem em vetor de expressão pAE e obtenção de solução-

estoque do plasmídeo...................................................................

59

3.1.2 Expressão e purificação do rLopap..........................................63

3.2 Clonagem e expressão do rLopap na levedura Pichia

pastoris.....................................................................................

65

3.2.1 Linhagens e plasmídeos....................................................... 65

3.2.2 Síntese de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação do

DNA............................................................................................

65

3.2.3 Reação de PCR e ligação do DNA ao “pGEM-T easy”...................67

3.2.4 Transformação em bactéria......................................................68

3.2.5 Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição e

ligação ao pPIC9K..........................................................................

68

3.2.5.1 Digestão com Sna BI.........................................................68

3.2.5.2 Digestão com Eco RI...........................................................69

Page 29: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

3.2.5.3 Ligação do DNA ao pPIC9K.................................................69

3.2.6 Sequenciamento do DNA........................................................70

3.2.7 Transformação na levedura P. pastoris.....................................70

3.2.8 Cultivo celular e avaliação da expressão do rLopap....................71

3.3 Escalonamento do processo de produção do rLopap..............72

3.3.1 Expressão da proteína recombinante utilizando meio de

cultivo complexo...........................................................................

72

3.3.2 Otimização da expressão da proteína recombinante utilizando

meio de cultivo mínimo..................................................................

73

3.3.3 Expressão da proteína recombinante em biorreator....................74

3.3.3.1 Preparo do inóculo.............................................................74

3.3.3.2 Inoculação no reator..........................................................75

3.3.3.3 Controle das variáveis........................................................76

3.3.3.4 1ª Etapa: fase de crescimento............................................77

3.3.3.5 2ª Etapa: fase de indução com metanol...............................78

3.3.3.6 Separação do sobrenadante................................................78

3.4 Processamento do material após expressão em

biorreator...................................................................................

79

3.4.1 Clarificação e concentração em membranas de fibra oca.............79

3.4.2 Diálise.................................................................................80

3.5 Avaliação da estabilidade do rLopap expresso em

Pichia pastoris............................................................................

81

3.5.1 Estabilidade em diferentes temperaturas..................................81

3.5.2 Estabilidade em diferentes soluções.........................................81

3.5.3 Estabilidade em diferentes valores de pH.................................82

Page 30: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

3.6 Estabelecimento do processo de purificação do rLopap

expresso em Pichia pastoris......................................................

83

3.6.1 Cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose............83

3.6.2 Screening em colunas de troca iônica e interação hidrofóbica.....84

3.6.3 Cromatografia de troca aniônica em Q-Sepharose.................... 84

3.6.4 Cromatografia de gel filtração............................................... 85

3.7 Ensaios bioquímicos............................................................85

3.7.1 Dosagem de proteínas..........................................................85

3.7.2 Precipitação de proteínas..................................................... 85

3.7.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)....................86

3.7.4 Imunobloting.......................................................................86

3.8 Avaliação da atividade procoagulante do rLopap in vitro.....87

3.8.1 Atividade ativadora de protrombina........................................87

3.8.2 Atividade procoagulante sobre plasma humano........................87

3.9 Avaliação da atividade antiapoptótica do rLopap.................88

3.9.1 Cultivo de células endoteliais de cordão umbilical humano.........88

3.9.2 Cultivo de células endoteliais de timo murino...........................88

3.9.3 Teste de viabilidade celular pelo método do MTT..................... 89

3.10 Avaliação da ação do rLopap in vivo como agente

hemostático sistêmico..............................................................

90

3.11 Mapeamento peptídico do Lopap.......................................91

3.11.1 Ensaios de atividade procoagulante e antiapoptótica de

peptídeos derivados do Lopap........................................................

91

Page 31: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

3.11.2 Avaliação do efeito de inibidores de serino proteases sobre a

atividade de peptídeo citoprotetor derivado do Lopap.........................

92

3.11.3 Análises estruturais.............................................................92

3.12 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do

Lopap sobre a expressão de proteínas de matriz extracelular

em cultura de fibroblastos.........................................................

94

3.12.1 Cultivo de fibroblastos e tratamento com o peptídeo.............. 94

3.12.2 Imunofluorescência indireta.................................................95

3.13 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do

Lopap sobre a síntese de colágeno na derme.............................

96

3.13.1 Tratamento experimental....................................................96

3.13.2 Avaliação dos animais.........................................................97

4 RESULTADOS......................................................................... 99

4.1 Obtenção do rLopap em E. coli Origami................................99

4.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris................................103

4.2.1 Clonagem e expressão do rLopap em P. pastoris......................103

4.2.2 Expressão do rLopap em meio complexo (BMGY/BMMY)............105

4.2.3 Expressão do rLopap em meio mínimo (BMG/BMM)..................110

4.2.4 Expressão do rLopap em biorreator....................................... 117

4.2.5 Testes de estabilidade..........................................................120

4.2.6 Purificação do rLopap...........................................................126

4.3 Efeitos do rLopap em animais previamente tratados com

heparina (enoxaparina)............................................................

132

4.4 Identificação e caracterização da seqüência do Lopap

envolvida na modulação da sobrevivência celular......................

135

Page 32: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

4.4.1 Obtenção e avaliação de peptídeos sintéticos derivados do

Lopap.........................................................................................

135

4.4.2 Efeito de inibidores de serino proteases sobre a atividade

antiapoptótica de peptídeo derivado do Lopap...................................

140

4.4.3 Análise estrutural e caracterização da seqüência do Lopap

envolvida na modulação celular......................................................

142

4.5 Efeito de peptídeo sintético derivado do Lopap sobre

a síntese de proteínas de matriz extracelular in vitro e

in vivo.....................................................................................

152

4.5.1 Aumento da síntese de proteínas de matriz extracelular em

cultura de fibroblastos...................................................................

152

4.5.2 Aumento da síntese de colágeno na derme de camundongos.....154

5 DISCUSSÃO............................................................................159

5.1 Proposta do trabalho............................................................159

5.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris.................................162

5.3 Efeito do rLopap in vivo........................................................165

5.4 Mapeamento peptídico do Lopap...........................................166

5.5 Considerações finais.............................................................170

6 CONCLUSÕES..........................................................................172

REFERÊNCIAS............................................................................173

APÊNDICE - Súmula Curricular.................................................

195

Page 33: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

_________ INTRODUÇÃO 32

1 INTRODUÇÃO

Lonomia obliqua é uma espécie de mariposa comumente encontrada

na região Sul do Brasil. Em sua fase larval são conhecidas como lagartas

ou taturanas e apresentam o corpo coberto por cerdas, que ao contato

com a pele secretam veneno com propriedades procoagulantes. O

envenenamento causa uma síndrome hemorrágica devido à coagulação

intravascular disseminada levando a coagulopatia de consumo (Zannin et

al., 2003). O Lopap é uma das toxinas mais abundantes presente nas

cerdas destas lagartas (Veiga et al., 2005; Ricci-Silva et al., 2008).

Estudos com a proteína nativa demonstraram experimentalmente que o

Lopap induz efeitos semelhantes aos observados com o extrato bruto das

cerdas da lagarta em animais de laboratório e aos observados no

envenenamento humano, causando depleção de fibrinogênio e

incoagulabilidade sanguínea (Reis et al., 1999, 2001a). Neste sentido, o

Lopap tem sido apontado como uma das principais toxinas presentes no

veneno de L. obliqua (Carrijo-Carvalho e Chudzinski-Tavassi, 2007).

O Lopap foi inicialmente caracterizado como um ativador de

protrombina com atividade do tipo serino protease (Reis et al., 2001b).

Contudo, esta proteína não apresenta similaridade com nenhum ativador

de protrombina ou serino proteases conhecidos, mas tem domínios

conservados na seqüência primária característicos de lipocalinas e sua

estrutura secundária e terciária segue padrão semelhante a membros

desta família, com a predominância de folhas β-pregueadas formando

uma estrutura molecular em forma de cálice ou barril (Reis et al., 2006).

O envolvimento de algumas lipocalinas em mecanismos de reparo,

remodelamento tecidual (Olsson, 1997; Rassart et al., 2000; Descalzi

Cancedda et al., 2000; Sousa et al., 2005; Hemdahl et al., 2006) e

sobrevivência celular (Schubert et al., 1986; Taniike et al., 2002; Tong et

al., 2005) tem sido proposto. Em estudos prévios com o Lopap nativo em

cultura de células endoteliais que inicialmente foram realizados para

avaliar possíveis efeitos sobre a modulação da hemostasia independente

Page 34: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

_________ INTRODUÇÃO 33

de fatores da coagulação, foi observado que o Lopap apresentava também

uma atividade citoprotetora (Fritzen et al., 2005). Particularmente, a

indução da sobrevivência celular não é uma propriedade esperada para

uma toxina. Desta forma, todas estas características indicam que o Lopap

representa uma molécula com características únicas, que despertam

interesse tanto científico - relativo às particularidades bioquímicas e

estruturais desta proteína, quanto terapêutico e biotecnológico,

relacionado à caracterização das propriedades desta molécula e potenciais

aplicações. No início deste trabalho, haviam três patentes depositadas no

Instituto Nacional da Propriedade Industrial (INPI) com fase internacional

(PCT) em co-titularidade com a FAPESP, com base nas diferenças

estruturais que permitem enquadrar o Lopap como um novo ativador de

protrombina, sua atividade procoagulante, em seu potencial

desfibrinogenante, e em sua atividade citoprotetora (Chudzinski-Tavassi e

Reis, 2002; Chudzinski-Tavassi et al., 2004, 2005).

Um dos fatores limitantes ao estudo do Lopap é sua obtenção. A

obtenção do Lopap nativo é limitada a pequenas quantidades purificadas a

partir do extrato das cerdas das lagartas de L. obliqua; à disponibilidade

sazonal destas lagartas, restrita aos meses mais quentes do ano; e à

coleta e transporte das mesmas, a partir de cidades da região Sul do

Brasil. A obtenção do Lopap na forma recombinante é limitada pela

possibilidade de manutenção das atividades enzimática e celular na

proteína recuperada ao final dos processos de expressão e purificação, e

pela necessidade de uma metodologia escalonável.

A partir de uma biblioteca de genes transcritos nas cerdas de L.

obliqua (Reis, 2002), o Lopap foi clonado e obtido na forma recombinante

(rLopap) monomérica pela expressão em cepa de Escherichia coli com

cauda de poli-histidina, na forma de corpúsculos de inclusão (Reis et al.,

2006). As limitações para obtenção do rLopap pelo sistema bacteriano

descrito são: a obtenção da proteína com um enovelamento correto, pois

a produção em corpúsculos de inclusão implica em uma fase de

desnaturação seguida de renaturação in vitro; a baixa atividade catalítica

Page 35: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

_________ INTRODUÇÃO 34

da proteína obtida; a ausência de processamentos pós-traducionais; a

presença de uma cauda de poli-histidina na proteína recombinante

recuperada. Todos estes aspectos mostram a importância do

desenvolvimento e aprimoramento de metodologias de obtenção do

rLopap com especial atenção quanto à estabilidade da molécula.

Este trabalho teve como objetivo geral o desenvolvimento do Lopap

e o estudo de suas potenciais aplicações. Desta forma, nossos estudos

foram dedicados à obtenção do Lopap recombinante em sistema de

expressão na levedura Pichia pastoris, através de processo escalonável,

em avaliar os efeitos desta proteína in vitro e in vivo e, por outro lado,

através do mapeamento peptídico do Lopap, em identificar a região da

molécula envolvida nos efeitos do Lopap ao nível celular, e caracterizá-la

com relação à atividade catalítica do Lopap e com relação aos domínios

conservados em outros membros da família das lipocalinas. Os objetivos

específicos foram os seguintes:

1) expressar o Lopap na forma solúvel em E. coli Origami;

2) clonar e expressar o Lopap na levedura Pichia pastoris;

3) estabelecer um protocolo padrão de produção do rLopap na levedura

P. pastoris, por um processo escalonável, com produção em alta

densidade celular em biorreator;

4) estudar a estabilidade do rLopap;

5) avaliar a atividade procoagulante e antiapoptótica do rLopap;

6) avaliar experimentalmente a ação do rLopap como agente

hemostático em animais;

Page 36: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

_________ INTRODUÇÃO 35

7) entender como os domínios moleculares do Lopap estão envolvidos

na sua ação celular - através da avaliação da atividade de peptídeos

sintéticos derivados de domínios conservados da proteína;

8) avaliar a ação de peptídeos sintéticos derivados do Lopap sobre a

síntese de moléculas de matriz extracelular em cultura de células e

na derme de animais.

Page 37: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 36

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 As lagartas do gênero Lonomia

As lagartas do gênero Lonomia são encontradas na América do Sul e

América Central (Lemaire, 1972a, b; Arocha-Piñango et al., 2000) e são

conhecidas por causarem envenenamento acidental associado à uma

síndrome hemorrágica (Arocha-Piñango et al., 1992; Kelen et al., 1995).

Duas espécies têm sido descritas com interesse clínico, por causar

envenenamento em humanos. L. obliqua é encontrada nas regiões Sul e

Sudeste do Brasil, Uruguai, Paraguai e Argentina, e L. achelous na

Venezuela, Guiana Francesa e Norte do Brasil (Carrijo-Carvalho e

Chudzinski-Tavassi, 2007). A espécie Lonomia obliqua Walker, 1855

(Lemaire, 1972b) está inserida na seguinte classificação taxonômica:

Reino: Animalia

Filo: Arthropoda

Subfilo: Mandibulata

Classe: Insecta

Subclasse: Pterygota

Infraclasse: Neoptera

Superordem: Endopterygota

Ordem: Lepidoptera

Superfamília: Bombycoidea

Família: Saturniidae

Gênero: Lonomia

Espécie: Lonomia obliqua

Page 38: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 37

Lepidoptera é a ordem dentre os insetos que agrupa mariposas e

borboletas, com mais de 180.000 espécies classificadas em 128 famílias,

sendo que a maioria não apresenta perigo ao contato humano. Apenas 12

famílias contêm membros considerados perigosos, podendo causar

injúrias ao homem que variam, dependendo da espécie envolvida, de

dermatites urticantes e asma a casos que evoluem para osteocondrite,

coagulopatia de consumo, falência renal e hemorragia intracerebral (Diaz,

2005). Estas espécies, em sua maioria são potencialmente venenosas na

fase larval, especialmente de mariposas, sendo que apenas uma família

de borboletas é descrita por ter espécies venenosas (Diaz, 2005). O

acidente com lagartas é denominado genericamente de erucismo (erucae

= larva). Na fase larval, esses insetos podem ser denominados lagartas ou

também taturanas (do tupi, tata = fogo e rana = semelhante) que, com

algumas exceções, são fitófagas e por isso também são consideradas

pragas para a agricultura (Kelen et al., 1995).

O ciclo biológico de L. obliqua é composto por quatro fases distintas

(Lorini e Corseul, 2001): ovo, larva (lagarta), pupa e adulto (mariposa)

(Figura 1). Após o acasalamento, a fêmea faz a postura dos ovos nas

folhas da planta que servirá de alimento para as futuras lagartas. O

período embrionário é de aproximadamente 17 dias. A fase de larva tem

duração de aproximadamente 90 dias, nos quais permanecem nas árvores

ou arbustos, alimentando-se de folhas. As lagartas de L. obliqua têm

coloração castanho-escura, com uma listra longitudinal contínua marrom-

escura contornada de preto na região dorsal do corpo, e outras duas

listras laterais longitudinais intercaladas por manchas claras levemente

amareladas (Figura 2A). A cabeça tem coloração castanho-escura com a

fronte amarelo-palha. Apresentam cerdas na forma de espinhos,

simetricamente dispostas ao longo do dorso, as quais são ramificadas e

pontiagudas, de aspecto arbóreo, com tonalidade esverdeada. As cerdas

são as estruturas que contêm o veneno e fazem sua inoculação ao contato

da pele das vítimas com as lagartas (Lorini e Corseul, 2001; Veiga et al.,

2001). Estas lagartas têm hábitos gregários, e podem ser encontradas em

Page 39: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 38

colônias de dezenas a centenas de indivíduos, camuflando-se sobre galhos

ou troncos de árvores (Figura 2B). A fase de larva é dividida em seis

estágios de desenvolvimento denominados ínstares. No sul do Brasil,

estas lagartas podem ser encontradas principalmente no período mais

quente do ano (primavera/verão), entre os meses de novembro a

fevereiro.

No final da fase larval, as lagartas se posicionam no tronco da

árvore, próximo ao solo, onde se transformarão em pupas. As pupas

permanecem no solo por um período que pode variar de 30 a 100 dias,

nos meses de inverno, dependendo das condições climáticas. Após este

período, as pupas se transformam em mariposas, que vivem apenas em

torno de oito dias, nos quais se acasalam e fazem a dispersão, reiniciando

o ciclo na natureza. Os adultos apresentam dimorfismo sexual. O macho

tem cerca de 6 cm de envergadura e a face dorsal das asas tem cor

amarelo-alaranjada com listras pretas transversais na porção anterior e

posterior. As fêmeas tendem a ser maiores e possuem tonalidade

castanho-acinzentada com listras transversais escuras nas asas.

Os inimigos naturais da L. obliqua são as larvas de moscas e vespas

que perfuram o tegumento das lagartas e se alimentam de estruturas

internas, impedindo o prosseguimento do ciclo biológico da lagarta na

passagem para pupa. Outro parasita, o Hexamermis sp (Nematoda), foi

isolado do tubo digestivo das lagartas. Mais recentemente, foi isolado e

identificado um poliedrovírus, o LoobMNPV (Lonomia obliqua múltiplo

nucleopolyhedrovírus), que é um agente exterminador de colônias de L.

obliqua (Moraes, 2002).

Page 40: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 39

Figura 1 - Ciclo biológico de Lonomia obliqua (fases). A) ovo; B) larva; C) pupa; D) adulto (macho e fêmea), a foto ao lado direito mostra o acasalamento. Fotos: Roberto H.P. Moraes – Instituto Butantan, com permissão.

A

C

D

macho

fêmea

Page 41: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 40

Figura 2 - Lagarta Lonomia obliqua.

A) Padrão de coloração; B) hábito gregário em tronco de árvore. Foto em B: Roberto H.P. Moraes – Instituto Butantan, com permissão.

A

B

Page 42: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 41

2.2 Síndrome hemorrágica causada pela lagarta L. obliqua

A inoculação do veneno de Lonomia ocorre após contato da pele da

vítima com as cerdas de uma, ou comumente muitas lagartas. Observa-se

um quadro de envenenamento sistêmico, com manifestações

hemorrágicas de intensidade variável, que é dependente, entre outros

fatores, da área do corpo da vítima e do número de lagartas envolvidas no

acidente (Vulinec, 1990).

Desde 1967, Arocha-Piñango e colaboradores têm reportado casos

de acidentes na Venezuela com a lagarta da espécie Lonomia achelous. Os

acidentes são caracterizados por uma síndrome hemorrágica que estes

autores atribuem à atividade fibrinolítica do veneno (Arocha-Piñango e

Layrisse, 1969). Observações posteriores demonstraram baixos níveis

plasmáticos de fibrinogênio, fator V (FV), fator XIII (FXIII) e

plasminogênio, aumento de produtos de degradação de fibrinogênio e em

casos severos queda nos níveis de protrombina (FII) e aceleração na

geração de trombina (FIIa) em pacientes após contato com a lagarta

(Arocha-Piñango e Pepper, 1981; Arocha-Piñango et al., 1992; Guerrero

et al., 1997). Desta forma os autores sugeriram que o envenenamento

por L. achelous desencadeia síndrome fibrinolítica severa associada a uma

coagulação intravascular disseminada (CID) (Arocha-Piñango et al.,

2000).

No Brasil, acidentes isolados foram identificados, em 1982, no

estado do Amapá e na Ilha de Marajó (Kelen et al., 1995) causados

também por L. achelous. A partir de 1989, um número crescente de

acidentes com L. obliqua tem sido reportado no Sul do Brasil em Santa

Catarina, Rio Grande do Sul e Paraná, atingindo também Estados da

Região Sudeste. Atualmente este é considerado um problema de saúde

pública (Diaz, 2005), e pode estar relacionado a diversos fatores, como

desmatamento e expansão urbana para regiões de floresta, utilização de

defensivos agrícolas, alteração das condições climáticas, diminuição de

Page 43: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 42

predadores e adaptação da espécie a espécies vegetais exóticas

introduzidas pelo homem (Lorini e Corseul, 2001).

Os sintomas clínicos incluem dermatite urticante, cefaléia, náuseas,

vômitos e dores musculares, com equimoses, hematomas espontâneos ou

decorrentes de traumas, hemorragias de cavidades mucosas (gengival,

nasal) e em feridas recentes, hematúria, hemorragias abdominais,

pulmonares e glandulares (Duarte et al., 1990; Kelen et al., 1995). Em

casos mais graves pode ocorrer hemorragia intracerebral e insuficiência

renal.

Dados laboratoriais mostram diminuição dos níveis plasmáticos de

fibrinogênio, FV, fator VIII (FVIII), e discreta redução de FXIII. Os níveis

de FII, fator X (FX), fator XII (FXII), fator de von Willebrand e

antitrombina III (AT III) não são alterados. A presença de fragmentos 1.2

da protrombina (F1.2) e do complexo trombina-antitrombina indicam que

ocorre geração de trombina. Quanto a fatores do sistema fibrinolítico,

ocorre diminuição moderada dos níveis de plasminogênio e α2-

antiplasmina com elevados níveis dos produtos de degradação de

fibrinogênio/fibrina e de fibrina cross-linked (D-dímeros) e do inibidor do

ativador de plasminogênio (PAI-1) (Zannin et al., 2003). Esses dados

foram obtidos em um estudo realizado por Zannin e colaboradores (2003),

no qual 105 pacientes foram avaliados. O conjunto dos dados obtidos a

partir da análise dos plasmas dos pacientes demonstra que ocorre

ativação do sistema de coagulação com uma forma de coagulação

intravascular disseminada, resultando em uma coagulopatia de consumo e

ativação secundária da fibrinólise.

Atualmente, pacientes envenenados por L. obliqua são tratados com

o soro antilonômico (Dias-da-Silva et al., 1996), que é produzido no

Instituto Butantan, e têm mostrado ser efetivo na reversão da

coagulopatia de consumo causada pelo veneno desta lagarta (Rocha-

Campos et al., 2001; Caovilla e Barros, 2004).

A atividade de toxinas procoagulantes no extrato das cerdas de L.

obliqua, que atuam na ativação de FX e de protrombina, foi demonstrada

Page 44: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 43

por Donato et al. (1998). Posteriormente, duas proteínas foram isoladas e

caracterizadas, sendo denominadas Losac (Lonomia obliqua Stuart factor

activator) (Alvarez Flores et al., 2006) e Lopap (Lonomia obliqua

prothrombin activator protease) (Reis et al., 1999; 2001b). A ação destas

proteínas na cascata de coagulação está mostrada na Figura 3, que

apresenta o sistema hemostático, com as vias e fatores de coagulação e

fibrinólise.

2.3 Lopap – o ativador de protrombina da lagarta L. obliqua

A forma nativa do Lopap foi isolada a partir do extrato das cerdas de

L. obliqua como um tetrâmero de aproximadamente 69 kDa, capaz de

ativar a protrombina de forma dose dependente. Esta proteína apresenta

atividade do tipo serino protease, é inibida por fluoreto de fenil-metil-

sulfonil (PMSF) e tem sua atividade aumentada em presença de íons cálcio

(Reis et al., 1999; 2001b).

O Lopap hidrolisa a protrombina em duas posições, na ligação

peptídica Arg284-Thr285, que também é o sítio de clivagem reconhecido

pela trombina, e com menor especificidade entre os aminoácidos Arg320-

Ile321, que é o sítio de clivagem do fator X ativado (FXa). Desta forma, o

Lopap ativa o FII gerando produtos de hidrólise similares àqueles

originados pelo FXa na ausência dos componentes do complexo

protrombinase, que são os fragmentos pretrombina, F1.2 e α-trombina

(Figura 4). A trombina formada a partir da hidrólise da protrombina pelo

Lopap é capaz de coagular fibrinogênio purificado, plasma humano e

hidrolisar substrato cromogênico (S-2238) (Reis et al., 2001b, Fritzen,

2002). Verificou-se também que a trombina produzida pelo Lopap é

inibida por AT III e é capaz de agregar plaquetas e coagular plasma e

fibrinogênio, sugerindo ser semelhante à α-trombina (Chudzinski-Tavassi

et al., 2001).

Page 45: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 44

Figura 3 - Representação esquemática do sistema hemostático. As vias clássicas de ativação dos sistemas de coagulação e fibrinólise estão mostradas, bem como os principais fatores envolvidos. F: fator de coagulação, a: ativado, HMWK: cininogênio de alto peso molecular, TF: fator tissular, tPA: ativador de plasminogênio tecidual, uPA: ativador de plasminogênio do tipo uroquinase, D-D: D-dímero.

Page 46: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 45

Figura 4 - Esquema representativo da hidrólise da protrombina. A separação em retângulos de cores diferentes representa os pontos de hidrólise na seqüência da protrombina. A via de hidrólise da protrombina pelo FXa representada à esquerda ocorre na ausência do complexo protrombinase, e à direita ocorre com a formação do complexo protrombinase em uma superfície fosfolipídica na presença do FVa como cofator. A ativação da protrombina pelo Lopap ocorre conforme a via representada à esquerda, sem formação de meizotrombina. S-S representa as pontes dissulfeto.

Page 47: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 46

A maioria dos ativadores de protrombina exógenos caracterizados é

originada do veneno de serpentes (Kini, 2005). De acordo com a

classificação atual (Kini et al., 2001), estas enzimas pertencem a quatro

grupos distintos (Tabela 1). De acordo com esta classificação, os dois

grupos de ativadores de protrombina com atividade do tipo serino

protease necessitam de cofatores para sua atividade catalítica, ao

contrário do Lopap. Desta forma o Lopap não se encaixa nesta

classificação, e os dados sugerem que esta proteína representa uma nova

classe de ativadores de protrombina, com mecanismo de catálise

enzimática diferente de outras serino proteases e ativadores de

protrombina purificados de venenos de serpentes.

Tabela 1 - Classificação de ativadores de protrombina de venenos de serpentes.

Grupo Cofator necessário Classe* Produto gerado

A - metaloprotease meizotrombina

B Ca2+ metaloprotease meizotrombina

C Ca2+, fosfolipídeos serino protease trombina

D Ca2+, fosfolipídeos, FVa serino protease trombina

Fonte: Kini et al., 2001.

A administração do Lopap nativo em ratos e camundongos induziu

incoagulabilidade sanguínea de forma semelhante ao extrato bruto de L.

obliqua nos pacientes (Zannin et al., 2003) e em animais experimentais

(Reis et al., 2001a), indicando que esta proteína é um componente

importante do veneno de L. obliqua, e possivelmente, um dos principais

fatores causadores da coagulopatia de consumo (Reis et al., 1999; Reis et

al., 2001a). Devido à sua ação procoagulante, o Lopap é capaz de

depletar o fibrinogênio do sangue de animais e induzir a incoagulabilidade

Page 48: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 47

sangüínea, porém com alteração de apenas 30% no número de plaquetas

(Reis et al., 2001a).

Experimentos em cultura de células endoteliais demonstraram que o

Lopap apresenta atividade moduladora sobre o endotélio vascular,

induzindo a expressão de moléculas de adesão, como a molécula de

adesão intercelular-1 (ICAM-1) e E-selectina, moléculas envolvidas na

inflamação, como interleucina-8 (IL-8) e na regulação do tônus vascular e

agregação plaquetária como o óxido nítrico (NO) e a prostaciclina (PGI2).

Além disso, Lopap apresentou atividade citoprotetora, inibindo o processo

de apoptose (Chudzinski-Tavassi et al., 2001; Fritzen et al., 2005), o que

desperta o interesse nesta proteína como ferramenta para pesquisa, bem

como para processos terapêuticos e biotecnológicos que envolvam a

modulação da sobrevivência celular.

O Lopap foi previamente obtido na forma recombinante em nosso

laboratório através de um sistema de expressão bacteriano. A seqüência

de ácido desoxirribonucléico (DNA) codificante do Lopap foi obtida a partir

do transcriptoma das cerdas da lagarta L. obliqua, que corresponde a uma

biblioteca de DNA complementar (cDNA) a partir dos transcritos de ácido

ribonucléico mensageiro (mRNA). O fragmento de cDNA do Lopap foi sub-

clonado em vetor de expressão pAE, e a proteína foi expressa em E. coli

com a fusão de 6 resíduos de histidina na porção N-terminal. Desta forma,

o rLopap foi obtido na forma ativa monomérica (Reis, 2002; Reis et al.,

2006).

Embora se tenha estabelecido um processo de obtenção do rLopap

em sistema bacteriano, esta metodologia apresenta algumas limitações. A

proteína recombinante expressa na forma solúvel e não é secretada no

meio, mas é expressa na forma de corpúsculos de inclusão, os quais são

extraídos por lise celular e solubilizados em uréia. A proteína necessita ser

renaturada in vitro através de técnicas de refolding, que são limitadas e

muitas vezes não permitem a obtenção da conformação terciária original

da proteína com perfeição. Além disso, a proteína recombinante obtida ao

final do processo de purificação por cromatografia de afinidade com níquel

Page 49: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 48

pode apresentar resíduos de uréia e imidazol, reagentes tóxicos e

irritantes, que podem interferir em testes in vivo e em cultura de células.

A proteína produzida por este sistema não tem processamentos pós-

traducionais que são realizados em sistemas eucariontes como

enovelamento, glicosilação e clivagem do peptídeo sinal. Outro fator

limitante é a presença de uma cauda de poli-histidina, que não é

compatível com as exigências de órgãos reguladores para a produção de

produtos com finalidade terapêutica, como a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA) e o órgão americano Food and Drug

Administration (FDA).

O rLopap expresso em E. coli não apresentou a mesma eficiência

catalítica que o Lopap nativo, observando-se alto índice de polimorfia

(variedade de formas estruturais), indicando problemas de enovelamento.

Quando o rLopap foi cromatografado em coluna de afinidade Benzamidina

Sepharose, observou-se a ligação de menos de 1% da proteína na resina.

Outro aspecto importante relativo à limitação do processo de obtenção do

Lopap em E. coli é a tendência à agregação/precipitação desta proteína e

sua capacidade de se ligar a outras moléculas por se tratar de uma

lipocalina.

A seqüência completa do Lopap (Figura 5) foi deduzida a partir do

cDNA (Reis, 2002). Esta seqüência não apresenta homologia com

seqüências de outros ativadores de protrombina, tampouco com serino

proteases conhecidas disponíveis em bancos de dados públicos, mas tem

alinhamento com seqüências de proteínas da família das lipocalinas de

origem humana e animal incluindo outros lepidópteros (Figura 6). A

presença de domínios conservados característicos de lipocalina na

seqüência primária do Lopap pode ser observada na Figura 6. A análise

por dicroísmo circular aliada a estudos de modelagem computacional

confirmaram que o Lopap apresenta uma estrutura característica da

família das lipocalinas (Reis et al., 2006), que é descrita como um β-barril

consistindo de oito folhas-β antiparalelas com α-hélices nas extremidades

(Figura 7). O Lopap é o primeiro membro conhecido da família das

Page 50: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 49

lipocalinas que apresenta atividade proteolítica e um dos poucos descritos

com atividade enzimática, como a prostaglandina D sintase (Nagata et al.,

1991) e epoxidases de plantas (Bugos et al., 1998).

Os dados de caracterização bioquímica e estrutural obtidos até o

momento indicam que o Lopap é uma molécula que reúne propriedades

únicas, diferentes de outras proteínas já descritas, o que faz desta

proteína um importante objeto de estudo. As ações do Lopap

demonstradas sobre o sistema de coagulação e sobre a viabilidade celular

abrem perspectivas para o estudo desta proteína como ferramenta

terapêutica e biotecnológica.

Page 51: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 50

Figura 5 - Seqüência nucleotídica e de aminoácidos do Lopap. A seqüência de aminoácidos do Lopap (em azul) foi deduzida a partir da seqüência nucleotídica do cDNA (em preto) obtida a partir do transcriptoma das cerdas de L. obliqua.

gacgtagttatagatggtgcgtgtcctgacatgaaggcggtatcgaaa 54

D V V I D G A C P D M K A V S K 18

tttgacatgaatgcttatcaaggaacgtggtacgagatcaagaaattccccgtg 108

F D M N A Y Q G T W Y E I K K F P V 36

gctaatgaagcgaacggtgattgtggaagtgttgagtatacccccgacaatgga 162

A N E A N G D C G S V E Y T P D N G 54

ctactgaaggtgagagcgggacacgttgaagatgatatcgagaagtttgttgtc 216

L L K V R A G H V E D D I E K F V V 72

ggagtcctcaccaagaatgcagacaccagcgatgctgagctcactctcagcgtt 270

G V L T K N A D T S D A E L T L S V 90

gtagtcggcgactacgtccgcgttgcaccgctgtggattctttctactgattac 324

V V G D Y V R V A P L W I L S T D Y 108

gacaactatgctatcggctactcctgcaaagactacaagaagagcaaccaacac 378

D N Y A I G Y S C K D Y K K S N Q H 126

agggtaaacatctggattctctcgaggaccaagactctcaacgaaagttccaag 432

R V N I W I L S R T K T L N E S S K 144

tccactgtcaacaagttccttaaggagcactcaaaggagttcgatcaatcgaaa 486

S T V N K F L K E H S K E F D Q S K 162

tttgtcgagacagatttctccgaaaaagcatgcttcttcaagaaatcacacgtg 540

F V E T D F S E K A C F F K K S H V 180

tacactgtaccattcggagcttaaattcgatttgtttggtctagtgctaataaa 594

Y T V P F G A Stop 187

aggtttttgggtttttaaatttaattaaccttataagtggaattaataataaat 648

Polyadenilation site

aagtgaaacaaaaaaaaaaaaaaaaaa 675

Page 52: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 51

Figura 6 - Alinhamento da seqüência primária do Lopap com outros membros da família das lipocalinas, mostrando as regiões conservadas (motifs). As seqüências de proteínas alinhadas e seus respectivos números de acesso no National Center for Biotechnology Information (NCBI) foram: PH2IP (prostaglandina D sintase, Q8WNM1), Lopap (AAW88441), BBP (bilin-binding protein, P09464), APOD (apolipoproteína D, NP_001638), INS (insecticianina A, P00305) e bombirina (BAB47155) (Reis et al., 2006).

Page 53: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 52

Figura 7 - Estrutura tridimensional do Lopap obtida por modelagem

molecular. A) Monômero, destacando a tríade catalítica predita e sítios de ligação de íons cálcio; B) tetrâmero (Reis et al., 2006).

A

B

N-terminal

biliverdina

sítio ativo

sítio ativo

entrada do

barril

Page 54: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 53

2.4 Lipocalinas

A família das lipocalinas reúne proteínas extracelulares com funções

diversas, presentes em vários sistemas fisiológicos. Estas proteínas

podem ser encontradas em microorganismos, plantas e animais - desde

invertebrados até ao homem. Membros desta família são conhecidos

principalmente como proteínas carreadoras de pequenas moléculas, mas

também estão envolvidos em processos metabólicos e de regulação

homeostática. Estas proteínas podem ser encontradas na forma

monomérica (aproximadamente 20 a 40 kDa) ou multimérica (Flower,

1996). As principais propriedades das lipocalinas são: 1) se ligam a

moléculas hidrofóbicas de baixo peso molecular; 2) se ligam a receptores

de membrana celular e a outras proteínas, podendo formar complexos

macromoleculares; 3) apresentam estrutura terciária na forma de um β-

barril, formado por oito folhas β antiparalelas mantidas por pontes de

hidrogênio e um sítio de ligação na cavidade central, onde se ligam as

moléculas a serem transportadas (Flower, 1996; Grzyb et al., 2006). Na

Figura 8 está representada a estrutura em β-barril típica de lipocalinas e a

ligação de moléculas para transporte no interior do barril.

Page 55: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 54

Figura 8 - Estrutura em β-barril da apolipoproteína D humana.

A) Vista frontal do β-barril, B) vista interna do β-barril, com a presença de uma molécula ligante (proteína em complexo com a progesterona). A estrutura terciária cristalográfica (Eichinger et al., 2007) foi visualizada pelo programa Cn3D (Wang et al., 2000a). Fonte: banco de dados 3D domains - Molecular Modeling Database (MMDB) do NCBI (Wang et al., 2000b), acesso: 2HZR (A) e 2HZQ (B).

A

B

Page 56: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 55

Apesar de apresentarem estrutura secundária e terciária altamente

conservada, em geral, as lipocalinas apresentam baixa similaridade na

seqüência de aminoácidos (10 a 20%). Contudo, observa-se a presença

de três domínios conservados na seqüência primária destas proteínas,

denominados structurally conserved regions (SCRs). Flower et al. (1993)

classificaram estes domínios como SCR1, SCR2 e SCR3. As proteínas que

apresentam estes três domínios característicos de lipocalinas são

classificadas no grupo kernel, que inclui a maioria das lipocalinas. Em um

segundo grupo, denominado outlier, são incluídas as lipocalinas com

maior divergência. Lipocalinas do grupo outlier apresentam apenas um ou

dois desses domínios, com mais freqüência o SCR1, enquanto o SCR2 é

encontrado exclusivamente em lipocalinas do grupo kernel (Flower, 1996).

Na Figura 9 estão ilustrados os componentes da estrutura de lipocalinas

do grupo kernel, destacando os três SCRs (motifs) presentes nestas

proteínas e a disposição das oito folhas principais que formam o barril,

conforme Flower et al. (1993). A extremidade onde se localiza o loop L1, e

os demais loops de número ímpar, corresponde à entrada do barril.

Membros da família das lipocalinas podem desempenhar diversas

funções como, por exemplo, no transporte de ácidos graxos (β-

lactoglobulina), transporte de retinol (retinol-binding protein), transporte

de feromônios (major urinary protein, apolipoproteína D), coloração em

invertebrados (bilin-binding protein, crustacianina), percepções olfativas e

gustativas (odorant binding protein, von Ebner's-gland protein), síntese de

prostaglandina (prostaglandina D sintase) e regulação do sistema imune

(C8γ, neutrophil gelatinase-associated lipocalin, α1-microglobulina)

(Flower, 1996; Grzyb et al., 2006). Lipocalinas também desempenham

papéis na regulação da diferenciação, proliferação, sobrevivência e adesão

celular. A apolipoproteína D, quiescience specific protein, purpurina, α1-

microglobulina e a neutrophil gelatinase-associated lipocalin são algumas

lipocalinas cujo envolvimento na regulação da homeostasia celular tem

sido descrito (Flower, 1994, 1996).

Page 57: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 56

Figura 9 - Estrutura da prostaglandina D sintase murina destacando as

características estruturais de lipocalinas. A) Vista frontal do β-barril; B) visualização da estrutura disposta de forma linear (adaptado) com as porções N e C-terminal, a localização dos três domínios conservados de lipocalinas (motifs), hélice do tipo 310 e α-hélice (A1), as folhas β que formam o barril (A-H), e os loops que as conectam (L1-L7). A estrutura terciária cristalográfica (Irikura et al., 2003) foi visualizada pelo programa Cn3D (Wang et al., 2000a). Fonte: banco de dados 3D domains - MMDB do NCBI (Wang et al., 2000b), acesso: 2CZT.

A B C D E F

G H

A1 310

I

motif 1 L4

L1

L2

L3 L5

L6

L7

motif 2 motif 3

A

B

Page 58: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 57

Além destas funções, o envolvimento de algumas lipocalinas como

fatores de proteção em resposta a estímulos ambientais e condições de

estresse tem sido demonstrado, como é o caso das proteínas de choque

térmico TaTIL e AtTIL (Charron et al., 2002) e as enzimas fotoprotetoras

de plantas zeaxantina epoxidase e violaxantina de-epoxidase (Bugos et

al., 1998). Lipocalinas de bactérias também estão envolvidas em

respostas a condições de estresse e possivelmente no rearranjo de

membrana (Bishop et al., 1995; Bishop, 2000). Nos animais, durante

condições adversas como em infecções e patologias, é observada

freqüentemente a elevação nos níveis de algumas lipocalinas, muitas

destas com funções reconhecidas na modulação do sistema imune e

inflamatório. Estas proteínas são conhecidas como imunocalinas

(Lögdberg e Wester, 2000). O aumento da expressão de lipocalinas está

associado a muitas doenças de ordem tumoral, inflamatória,

neurodegenerativa, bem como disfunções cardiovasculares, renais e

hepáticas (Rassart et al., 2000; Xu e Venge, 2000; Henze et al., 2008; Al-

Daghri et al., 2009; Yndestad et al., 2009; Tuladhar et al., 2009), embora

em alguns casos ainda não esteja definido se a proteína tem relação com

a etiologia da patologia ou se sua expressão é aumentada em resposta ao

estado patológico.

A participação de lipocalinas em processos de desenvolvimento

também tem sido demonstrada. O envolvimento da chondrogenesis-

associated lipocalin em processos de desenvolvimento durante a

embriogênese, formação óssea, remodelamento tecidual e na citoproteção

tem sido demonstrado (Pagano et al., 2002, 2003). A quiescence-specific

protein ou extracellular fatty acid-binding protein parece ser responsável

pela estabilização e manutenção da sobrevivência celular em populações

de células maduras (Bedard et al., 1989; Descalzi Cancedda et al., 1988;

Cancedda et al., 1990; Dozin et al., 1992; Mao et al., 1993; Descalzi

Cancedda et al., 2000, 2002; Giannoni et al., 2004). A uterocalina é

altamente expressa no útero e glândulas mamárias durante o processo de

involução destes tecidos após reprodução, e, possivelmente, tem papel na

Page 59: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 58

proteção de células residentes destes tecidos que devem sobreviver ao

processo de involução, frente a estímulos de indução de apoptose, à ação

de enzimas degradativas, presença de radicais livres, invasão de

neutrófilos e outras respostas de fase aguda (Ryon et al., 2002). A

purpurina é encontrada em associação com células neuronais da retina

conferindo proteção a estas células. A apolipoproteína D tem envolvimento

na citoproteção e regeneração de tecidos nervosos, células neuronais e

fibroblastos (Rassart et al., 2000; Do Carmo et al., 2008; Navarro et al.,

2008).

Apesar de haver um número crescente de trabalhos dedicados à

caracterização bioquímica e funcional de muitas lipocalinas, o exato papel

destas proteínas na regulação celular e em processos de desenvolvimento

e manutenção nos diversos sistemas fisiológicos ainda não está claro. O

possível envolvimento dos SCRs nas propriedades das lipocalinas tem sido

discutido. Flower (1996) e outros autores (North, 1989; Flower et al.,

1993) propuseram que estes domínios poderiam conferir propriedades

comuns ao diversos membros desta família através de seu envolvimento

na interação das lipocalinas com receptores celulares, e da manutenção de

um padrão conservado de sua estrutura terciária. Contudo, não há na

literatura bases experimentais que contribuam para o esclarecimento

desta questão. A maioria dos trabalhos tem sido dedicada à caracterização

das propriedades específicas de membros da família das lipocalinas,

especialmente aquelas de caráter individual, que diferenciam estas

proteínas umas das outras, por exemplo, na interação com diferentes

moléculas ligantes (Sivaprasadarao e Findlay, 1994; Melhus et al., 1995;

Glasgow et al., 1999; Wojnar et al., 2001; Gudderra et al., 2005). Outra

questão importante discutida na literatura é o papel de modificações pós-

traducionais como, por exemplo, padrões diferenciados de glicosilação,

nas atividades de lipocalinas, que muitas vezes conferem atividades

antagônicas a uma mesma molécula (Lögdberg e Wester, 2000).

Nos lepidópteros as lipocalinas têm sido associadas principalmente a

funções na coloração destes insetos, as quais se complexam a biliverdina

Page 60: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

REVISÃO DE LITERATURA 59

IX e outros cromóforos que conferem pigmentação azul (Goodman et al.,

1985; Saito e Shimoda, 1997; Saito, 1998a, b; Saito et al., 1998;

Yamanaka et al., 2000; Choi et al., 2006). Estas lipocalinas são, em geral,

denominadas como biliverdin-binding protein, dentre as quais a

insecticianina é a melhor caracterizada (Riley et al., 1984; Goodman et

al., 1985; Holden et al., 1986; 1987; Riddiford et al., 1990; Li e Riddiford,

1992; 1994; Kang et al., 1995). O receptor de membrana desta proteína

foi identificado em ovócitos da mariposa Manduca sexta (Kang et al.,

1997). Estas proteínas são expressas diferencialmente nos vários estágios

de desenvolvimento do inseto (Riddiford et al., 1990), o que indica seu

envolvimento na fisiologia do animal. Também formam identificadas

lipocalinas de lepidópteros que se ligam a moléculas fluorescentes

(Mauchamp et al., 2006) hormônio (Sok et al., 2005; Zalewska et al.,

2009) e feromônio (Du e Prestwich, 1995).

Estudos incluindo análise proteômica e transcriptômica, têm

mostrado que lipocalinas correspondem às proteínas mais abundantes

encontradas nas cerdas e na hemolinfa das lagartas de L. obliqua, e

muitas destas lipocalinas foram identificadas como isoformas do Lopap

(Veiga et al., 2005; Chudzinski-Tavassi e Alvarez Flores, 2005; Ricci-Silva

et al., 2008). Neste caso, ainda não se sabe se o Lopap e as lipocalinas

em geral desempenham algum papel biológico para a própria lagarta além

de sua ação como toxina procoagulante no envenenamento.

Page 61: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 60

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Obtenção do rLopap na forma solúvel em sistema bacteriano

(E. coli Origami)

3.1.1 Clonagem em vetor de expressão pAE e obtenção de solução-

estoque do plasmídeo

O inserto do Lopap foi previamente subclonado a partir de uma

biblioteca de cDNA das cerdas da lagarta L. obliqua pelo Dr. Cleyson

Valença Reis (Reis, 2002). Para expressão do rLopap, foi utilizado vetor de

expressão pAE (Figura 10) contendo a seqüência codificante do Lopap com

a fusão de seis resíduos de histidina (6xHis) à porção N-terminal da

proteína para possibilitar sua posterior purificação por cromatografia de

afinidade em coluna de Ni-Sepharose.

Para obtenção da solução-estoque de plasmídeos recombinantes

pAE-Lopap foi utilizada cepa da bactéria E. coli cálcio competente DH5α:

ø80 dlacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-, mk+) SupE44,

relA1, deoR ∆(lac ZYA – arg I) u169, preparada de acordo com o método

de Inoue et al. (1990). Foram adicionados 3 µl do plasmídeo a uma

alíquota de 100 µl da bactéria competente, previamente descongelada em

banho de gelo por 15 min. A bactéria foi então submetida a choque

térmico, sendo incubada por no mínimo 30 min em banho de gelo, em

seguida 2 min em banho seco a 42 °C, e novamente em banho de gelo

por mais 5 min.

Page 62: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 61

Figura 10 - Mapa do pAE. Vetor de expressão derivado do pRSETA (Invitrogen) e do pET3-His (Chen, 1994), construído no Laboratório de Biotecnologia do Instituto Butantan (Ramos et al., 2004).

Page 63: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 62

Após a transformação, foram adicionados 350 µl de meio 2xYT

(triptona 1,6%, extrato de levedura 1,0%, NaCl 0,5%) e realizada

incubação por 90 min a 37 °C, 230 rpm. Posteriormente, alíquotas de 50,

100 e 200 µl foram semeadas em placas com meio 2xYT-ágar (1,5%)

contendo ampicilina (100 µg/ml), as quais foram incubadas por 18 h a 37

°C. Colônias isoladas foram inoculadas em 2,5 - 5,0 ml de meio 2xYT

contendo ampicilina (100 µg/ml) e incubadas a 37 °C, 250 rpm. Após 18 h

de incubação no meio líquido, a cultura foi centrifugada a 10.000 g por 5

min para recuperação das células.

O pellet de células foi submetido à extração plasmidial, utilizando kit

“Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” (Promega). O produto

obtido (solução de plasmídeos recombinantes purificados, em água) foi

analisado por eletroforese em gel de agarose 1% (corrida a 100 V por 1

h), e submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR, polymerase

chain reaction).

A reação de PCR foi realizada com o “kit 2X PCR Master Mix”

(Fermentas), em volume final de 25 µl, utilizando como oligonucleotídeos

iniciadores o oligonucleotídeo sense P1 (Figura 11) e o oligonucleotídeo

anti-sense SP6, o qual é baseado na seqüência do plasmídeo (Life

Technologies). Foi utilizado 1 µl de DNA plasmidial como molde, 2 µl de P1

e 1 µl de SP6, ambos na concentração de 10 pM/µl (100 µM) diluídos em

tampão TE (Tris-HCl 10 mM, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 1

mM). Para controle negativo de amplificação foi adicionada água ultrapura

em lugar do DNA plasmidial. As condições da PCR foram: desnaturação

inicial a 94 °C por 3 min, 30 ciclos de desnaturação (94 °C, 45 seg),

anelamento (50 °C, 25 seg), extensão (72 °C, 4 min) e uma extensão

final a 72 °C por 15 min seguida de resfriamento a 4 °C. Em seguida, as

amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1,5% em

tampão TAE 1x (tris-acetato 0,04 M, EDTA 1 mM). Após a corrida

eletroforética (100 V por 2 h), o gel foi corado com solução de brometo de

etídio 0,1 µg/ml, sob a luz ultravioleta (Sambrook, 1989).

Page 64: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 63

Figura 11 - Oligonucleotídeo P1. Oligonucleotídeo (primer) degenerado desenhado a partir da seqüência N-terminal do Lopap, com sítio de restrição BamH I, que corresponde ao sítio de inserção da seqüência codificante do Lopap no vetor pAE.

Sense Primer 1 (P1)

AT GGA TCC GAC GTA GTT ATM GAY GGN GC

BamH I D V V I D G A

M = C ou A

Y = T ou C

R = A ou G

N = A, T, C ou G

Page 65: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 64

3.1.2 Expressão e purificação do rLopap

O vetor pAE contendo o inserto do Lopap foi transformado em cepa

de E. coli competente Origami (DE3) pLys (Novagen), que é uma cepa

derivada de K-12 com mutações nos genes que codificam para as enzimas

tioredoxina redutase (trxB) e glutationa redutase (gor), o que torna o

ambiente citoplasmático destas bactérias menos redutor e, portanto

favorável à formação de pontes dissulfeto (Novagen Catalog, 2002-2003).

Desta forma, bactérias Origami são utilizadas para favorecer a obtenção

de proteínas recombinantes na forma solúvel e ativa (Xiong et al., 2005).

Para transformação, 3 µl da solução-estoque de plasmídeo pAE-

Lopap foram adicionados a 100 µl da bactéria competente, previamente

descongelada em banho de gelo por 15 min. A bactéria foi incubada por

mais 30 min em banho de gelo, e em seguida em banho seco a 42 °C por

2 min, e novamente em banho de gelo por 5 min. Após a transformação,

foram adicionados 350 µl de meio SOC (triptona 2%, extrato de levedura

0,5% NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgSO4 10 mM, glicose 20 mM) e

realizada incubação por 90 min a 37 °C, 190 rpm. Posteriormente,

alíquotas de 100 e 200 µl foram semeadas em placas com meio Luria-

Bertani (LB) sólido (triptona 1%, extrato de levedura 1%, NaCl 1%, ágar

1,5%) contendo ampicilina (100 µg/ml), as quais foram incubadas por 18

h a 37 °C. Colônias isoladas foram inoculadas em 5,0 ml de meio LB

(triptona 1%, extrato de levedura 1%, NaCl 1%) contendo ampicilina (100

µg/ml) e incubadas a 37 °C, 190 rpm por 18 h para obtenção do pré-

inóculo. O pré-inóculo foi adicionado a 500 ml de meio LB para formar o

inóculo, que foi incubado a 37 °C, 200 rpm até obtenção de uma leitura

de densidade óptica a 600 nm (DO600nm) de 0,6-0,8. Para iniciar a indução

da expressão da proteína recombinante, a temperatura foi reajustada para

16 °C e foi adicionado isopropil-β-D-tiogalactosídeo (IPTG) para a

concentração final de 1 mM. A fase de expressão durou aproximadamente

20 h. Após este período, a cultura foi centrifugada (5000 g, 10 min, 4 °C),

o sobrenadante foi descartado e o pellet celular congelado.

Page 66: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 65

O pellet celular foi ressuspendido em tampão de lise Tris-HCl 50 mM

pH 7,5 contendo imidazol 10 mM, NaCl 0.5 M e triton X-100 0,5%. A lise

celular para extração de proteína intracelular foi realizada em sonicador,

com 5 ciclos de 1 min (pulsos de 10 seg, 70 mA, ∼16 W) e intervalos de 4

min entre cada ciclo, em banho de gelo. Alternativamente, a extração de

proteína intracelular foi realização por processo de lise enzimática

utilizando “BugBuster Master Mix” (Novagen), que contém nuclease e

lisozima em solução tampão. As células foram ressuspendidas nesta

solução, utilizando 10 ml do reagente para cada 100 ml de meio cultivado

e a mistura foi incubada por 15 min à temperatura ambiente com

agitação. Em ambos os processos utilizando lise mecânica ou enzimática,

a fração solúvel foi recuperada após centrifugação a 10.000 g, 4 °C, 20

min.

Para recuperação da proteína recombinante, a fração solúvel foi

aplicada em coluna Ni-Sepharose pré-equilibrada com o tampão de lise.

Após lavagem com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 contendo imidazol 20

mM e NaCl 0,5 M para eluição de contaminantes retidos inespecificamente

na coluna, a fração contendo a proteína recombinante foi eluída no

mesmo tampão contendo 0,3 M de imidazol. Em seguida, a fração

purificada foi dialisada em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,5 contendo NaCl

0,145 M por 48 h e em seguida aplicada em coluna Sephadex G-25 (5 ml)

HiTrap Desalting (GE Healthcare), para remoção completa do imidazol,

que atua como inibidor de serino proteases. A fração eluída da

cromatografia em Ni-Sepharose foi submetida à cromatografia líquida de

alta pressão (HPLC) em coluna de fase reversa C8 (Zorbax), eluição com

gradiente de metanol, fluxo de 1ml/min, em cromatógrafo Shimatzu. As

frações obtidas em cada etapa do processo de recuperação do rLopap

expresso em Origami foram analisadas por eletroforese em gel de

poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE), conforme item

3.7.3.

Page 67: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 66

3.2 Clonagem e expressão do rLopap na levedura Pichia pastoris

3.2.1 Linhagens e plasmídeos

Os experimentos iniciais de clonagem e expressão de Lopap em

levedura Pichia pastoris foram realizados em colaboração com a Profa.

Dra. Aparecida Sadae Tanaka do Depto. de Bioquímica da UNIFESP e com

o Dr. Cleyson Valença Reis, durante seu Pós-Doutorado em nosso

Laboratório. Como molde foi utilizado o vetor pAE contendo o inserto com

a seqüência codificante da proteína (Reis, 2002).

As linhagens de microorganismos e os plasmídios utilizados

foram: E. coli DH5α: ø80 dlacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1,

hsdR17(rk-, mk+) SupE44, relA1, deoR ∆(lac ZYA – arg I) u169; P. pastoris

GS115: his4, Mut+ (Invitrogen).

Os plasmídeos utilizados foram: “pGEM-T Easy Vector Systems”

(Promega), que contém os promotores T7 e SP6 flanqueando a região de

sítios de múltipla clonagem (multiple cloning site - MCS), para a

subclonagem de produtos de PCR (de acordo com o Manual técnico

PROMEGA, 1999); pPIC9K – “Pichia Vector for Multicopy Integration and

Secreted Expression” (Invitrogen), para expressão da proteína

recombinante em levedura na forma solúvel, secretada para o meio

extracelular (de acordo com Manual técnico da Invitrogen n° V175-20).

3.2.2 Síntese de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação do DNA

Os oligonucleotídeos iniciadores foram construídos pela IDT

(Integrated DNA Technnologies). O oligonucleotídeo sense (PRIPIC9F) foi

desenhado a partir da seqüência N-terminal da proteína (Figura 12). A

este oligonucleotídeo foi acrescentado um sítio de restrição Sna BI para

subseqüente clonagem unidirecional. O oligonucletídeo anti-sense utilizado

foi o PRset rev. Estes oligonucleotídeos foram diluídos em tampão TE para

uma concentração final de 10 pmol/µl (100 µM).

Page 68: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 67

Figura 12 - Oligonucleotídeo PRIPIC9F. Oligonucleotídeo (primer) desenhado a partir da seqüência N-terminal do Lopap, com sítio de restrição Sna BI para permitir posterior clonagem no vetor pPIC 9K.

Sense Primer (PRIPIC9F)

TAC GTA GAC GTA GTT ATA GAT GGT GCG TGT CCT GAC Sna BI D V V I D G A C P D

Page 69: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 68

3.2.3 Reação de PCR e ligação do DNA ao “pGEM-T easy”

O inserto do cDNA que codifica para o Lopap, contido no pAE, foi

amplificado por PCR para ligação no plasmídeo “pGEM-T easy”. As reações

de PCR foram preparadas para um volume final de 50 µl, contendo 1 µl de

dNTPs 10 mM, 5 µl do tampão para Taq DNA Polimerase 10x (Pharmacia),

1,5 µl de MgCL2 50 mM, 0,5 µl de Taq DNA polimerase 2,5 U, 2 µl do

oligonucleotídio PRIPIC9F, 6 µl do oligonucleotídio PRset rev e 1 µl do DNA

plasmidial (pAE) como molde. As condições da PCR foram: desnaturação

inicial a 94 °C por 3 min, 30 ciclos de desnaturação (94 °C, 45 seg),

anelamento (50 °C, 25 seg), extensão (72 °C, 4 min) e uma extensão

final a 72 °C por 15 min, seguida de resfriamento a 4 °C.

Em seguida, a amostra foi analisada por eletroforese em gel de

agarose 1% (corrida a 100 V por 2 h). Após migração eletroforética, a

banda correspondente ao produto de amplificação esperado (≈ 600 pb) foi

recortada do gel e o DNA foi extraído com o kit “Concert Gel Extraction”

(Life Technologies) e eluído em 50 µl de H2O.

A ligação do fragmento de DNA amplificado ao “pGEM-T easy” foi

realizada em um volume final de 20 µl, contendo 12 µl do produto de PCR,

2 µl do plasmídeo, 4 µl do tampão “T4 DNA ligase 5x” e 2 µl da “T4 DNA

Ligase” 1 U/µl (Life Technologies) a 16 °C por 18 h. A relação

vetor:inserto foi calculada segundo a fórmula descrita no manual da

Promega (“Promega Protocols and Applications Guide”, 1999):

ng de vetor x Kb do inserto x relação molar inserto/vetor = ng de inserto

Kb do vetor

Page 70: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 69

3.2.4 Transformação em bactéria

Após a reação de ligação descrita no item anterior o vetor “pGEM-T

easy” foi utilizado para o processo de transformação em bactéria

competente DH5α, preparada de acordo com o método de Inoue et al.

(1990). Para transformação, foram adicionados 5 µl da solução de ligação

vetor-inserto a uma alíquota de 100 µl da bactéria competente,

previamente descongelada em banho de gelo por 15 min. A bactéria foi

então incubada por no mínimo 30 min em banho de gelo, em seguida 2

min em banho seco a 42 °C, e novamente em banho de gelo por mais 5

min. Após a transformação, foram adicionados 300 µl de meio

LB/ampicilina (100 µg/ml) e realizada incubação por 1 h a 37 °C, 220

rpm. Posteriormente, alíquotas de 50, 100 e 200 µl foram semeadas em

placas com meio LB-Kan, as quais foram incubadas por 18 h a 37 °C. Uma

colônia isolada foi inoculada em 5 ml de meio LB/ampicilina (100 µg/ml),

e incubada por 18 h a 37 °C. Os plasmídios foram purificados utilizando

kit “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” (Promega).

3.2.5 Digestão do DNA plasmidial com enzimas de restrição e ligação ao

pPIC9K

3.2.5.1 Digestão com Sna BI

Para a primeira reação de digestão, foi utilizada uma alíquota de 20

µl do DNA plasmidial extraído na etapa anterior. A esta solução, foram

adicionados 5 µl de tampão B 10x (Promega), 0,5 µl de albumina de soro

bovino e 20 µl da enzima Sna BI. A reação ocorreu em um volume de 50

µl, com incubação por 18 h a 37 °C.

Page 71: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 70

3.2.5.2 Digestão com Eco RI

O material obtido após a primeira digestão (50 µl) foi incubado com

7,5 µl de tampão H 10x (Promega), 0,75 µl de albumina de soro bovino e

15 µl da enzima Eco RI. A mistura de reação, com volume final de 75 µl,

foi incubada por 1 h a 37 °C. Em seguida, o material foi submetido a

eletroforese em gel de agarose 1% (corrida a 80 V por 2 h). Após

migração eletroforética, a banda correspondente ao fragmento de DNA

com tamanho esperado foi recortada e o DNA foi extraído do gel com o kit

“Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega).

3.2.5.3 Ligação do DNA ao pPIC9K

A reação de ligação foi realizada em um volume final de 20 µl,

contendo 5 µl do inserto, 5 µl do vetor pPIC9K (Invitrogen), 4 µl do

tampão T4 DNA ligase 5x e 1 µl de T4 DNA Ligase 1U/µl (Life

Technologies), com incubação por 18 h a 16 °C. O produto resultante da

ligação do inserto do Lopap no vetor (pPIC9k-Lopap) foi utilizado para

transformação da bactéria DH5α. Este processo foi realizado por choque

térmico, conforme item 3.2.4. Após a transformação, foram adicionados

300 µl de meio LB/ampicilina (100 µg/ml) e realizada incubação por 1 h a

37 °C, 220 rpm. Alíquotas de 50, 100 e 200 µl foram semeadas em meio

LB-ágar/ampiclina, e incubadas por 18 h a 37 °C.

Das colônias formadas, 15 foram selecionadas, sendo coletadas e

inoculadas individualmente em 5 ml de meio LB/ampicilina (100 µg/ml) e

incubadas por 18 h a 37 °C, sob agitação de 220 rpm/min. Os plasmídios

foram purificados de cada clone utilizando “kit mini-prep Wizard plus SV

(Promega)”, eluídos com 50 µl de água e, em seguida, congelados a -20

°C. Os plasmídios obtidos foram selecionados através da análise por

eletroforese em gel de agarose 1% (corrida a 80 V por 2 h). Os clones que

apresentaram bandas de tamanhos diferentes do esperado foram

descartados.

Page 72: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 71

3.2.6 Seqüenciamento do DNA

Os clones obtidos foram seqüenciados para verificar se o inserto se

ligou na forma e posição adequadas. O seqüenciamento do DNA foi

realizado pelo método de terminação de cadeia por dideoxinucleotídeo,

adaptado para o seqüenciador automático ABI 377 (Perkin-Elmer). Foram

preparados 400 ng do DNA plasmidial preparado com o Kit “In Concert

Plasmid DNA Mini-prep System” (Life Technologies) que foram usados

como molde na reação de seqüenciamento. A Taq DNA polimerase, dNTPs,

ddNTPs ABI Prism Big Dye Terminator foram do “Ready Reaction Kit”

(Perkin-Elmer). Foram usados nas reações os oligonucleotídeos 5’ AOX1

promoter fragment: bases 1-948 e 3’ AOX1 fragment: bases 6122-6879

(Invitrogen).

Os produtos de amplificação foram separados em gel de

seqüenciamento de DNA de 36 cm de comprimento (acrilamida:bis-

acrilamida 4,25% na proporção de 19:1, em 1xTBE e uréia 7 M), montado

segundo as especificações do fabricante do sistema ABI PRISM (Perkin

Elmer). O sistema de detecção desse aparelho consiste em uma fonte de

laser e um detector de fluorescência, localizados na parte inferior do gel

de seqüenciamento. Cada dNTP emite uma fluorescência específica que é

captada pelo detector, e este por sua vez envia a informação a um

computador que automaticamente registra a posição do nucleotídeo no

eletroferograma. A corrida foi realizada por 7 h.

3.2.7 Transformação da levedura P. pastoris

Antes da transformação, o plasmídeo pPIC9K-Lopap foi submetido à

linearização para permitir sua inserção no genoma de P. pastoris. Para

reação de linearização foi utilizado 42 µl (5 µg) de DNA plasmidial, 3 µl da

enzima Sal I (Invitrogen) e 5 µl de tampão REact 10. A mistura de reação

foi incubada por 4 h a 37 °C, sendo em seguida submetida a processo de

Page 73: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 72

purificação fenol:clorofórmio de acordo com o método descrito por Beuken

et al. (1998).

A levedura P. pastoris foi transformada com o plasmídio linearizado

por processo de eletroporação. Foi utilizada uma alíquota 80 µl de células

competentes e 10 µl do DNA linearizado, transferindo-se a mistura para

uma cubeta de 0,2 cm gelada. Em seguida, o material foi mantido em

banho de gelo por 5 min e submetido à eletroporação (25 µF, 400 Ω e 1,5

KV). Imediatamente após a eletroporação, foi adicionado sorbitol 1 M

gelado na cubeta e o conteúdo foi transferido para tubo estéril. Alíquotas

de 200 e 400 µl desse material foram semeadas em placas com meio

mínimo de dextrose (MD) (yeast nitrogen base - YNB 1,34%, biotina 4 x

10-5%, dextrose 1%, ágar 1,5%) e as placas foram incubadas a 30 °C por

48 h.

3.2.8 Cultivo celular e avaliação da expressão do rLopap

Dentre colônias formadas em placa, que corresponderam aos clones

transformados, 5 colônias isoladas foram escolhidas e inoculadas

individualmente em 2,5 ml de meio complexo de glicerol (BMGY - buffered

glycerol-complex medium: extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato

de potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina 4 x 10-5%, glicerol 1%) e

incubadas a 30 °C por 18 h, sob agitação a 250 rpm, para crescimento do

pré-inóculo até obtenção de uma DO600nm entre 2 e 6.

O pré-inóculo foi centrifugado por 5 min a 1500 g, 25 °C. Para

preparo do inóculo, o sobrenadante foi descartado e o pellet celular foi

ressuspendido em meio complexo de metanol (BMMY - buffered methanol-

complex medium: extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato de

potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina 4 x 10-5%, metanol 0,5%)

para uma DO600nm final de 1,0. O inóculo foi incubado a 30 °C, sob

agitação a 250 rpm, realizando-se a indução de expressão protéica pela

manutenção de 0,5% de metanol no meio. Para manter a concentração

necessária de metanol foram adicionados, após um período de 24 h de

Page 74: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 73

incubação, 30 µl de metanol, e após 48 e 72 h, 50 µl de metanol. Após 96

h de incubação, o material foi resfriado em banho de gelo, e

posteriormente centrifugado por 5 min, a 1500 g, 4 °C. O sobrenadante

foi coletado e analisado quanto à expressão da proteína de interesse.

Para avaliar a expressão do rLopap, amostras de 20 µl de cada uma

das 5 culturas foram submetidas à análise por SDS-PAGE (item 3.7.3),

após concentrar 40 vezes o volume em membrana com corte de 5k,

utilizando dispositivo centricon (Millipore). A atividade pro coagulante da

proteína obtida foi avaliada em cada uma das 5 culturas através de

ensaios de ativação da protrombina utilizando substrato cromogênico S-

2238 (item 3.8.1). Nos testes de atividade foram utilizados 60 µl de

amostra de cada cultura, 60 µl do meio de cultura sem inóculo para o

branco, e, como controle, 60 µl de cultura transformada com vetor

contendo o inserto de uma proteína recombinante distinta, sem atividade

sobre a coagulação.

3.3 Escalonamento do processo de produção do rLopap

3.3.1 Expressão da proteína recombinante utilizando meio de cultivo

complexo

O clone da levedura para o qual foi observada maior atividade

ativadora de protrombina foi selecionado para a continuidade dos ensaios

de expressão do rLopap em maior escala. A partir da placa mestre, o

clone foi inoculado em 100 ml de meio BMGY e incubado por

aproximadamente 24 h a 30 °C, 250 rpm, para crescimento do pré-

inóculo até uma DO600nm de 2-6. Uma alíquota da cultura em meio BMGY

foi retirada e diluída 1:2 em sorbitol 1 M. A suspensão do clone foi dividida

em frações de 50 µL e armazenada em freezer a -80 °C para servir de

inóculo nos cultivos posteriores. A concentração de glicerol no meio foi

monitorada através de kit enzimático para a detecção de triglicérides,

utilizando glicerol como padrão. A etapa de indução da expressão com

Page 75: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 74

metanol foi iniciada no momento em que todo o glicerol do meio foi

consumido.

O inóculo foi preparado conforme descrito no item 3.2.8, em um

volume de 500 ml de meio BMMY. Para indução contínua da expressão da

proteína recombinante a cada 24 h foi acrescido de 1 ml de metanol

100%. O crescimento celular foi monitorado pela leitura da DO600nm

realizando-se diluições com salina, quando necessário. Após um período

de 72 h de indução, o material foi centrifugado a 5000 g por 10 min a 4

°C. Em seguida, o sobrenadante foi filtrado em membrana de nitrato de

celulose com poro de 0,45 µm de diâmetro e foi congelado em alíquotas a

–80 °C para análise posterior.

3.3.2 Otimização da expressão da proteína recombinante utilizando meio

de cultivo mínimo

Uma alíquota-estoque (50 µl) do clone de P. pastoris foi inoculada

em 100 ml meio mínimo de glicerol (BMG - buffered minimal glycerol:

fosfato de potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina 4 x 10-5%,

glicerol 1%), e incubada por 48 h a 30 °C, com agitação de 250 rpm, para

crescimento do pré-inóculo até atingir uma DO600nm entre 20 e 30. Esta

cultura foi utilizada para inocular o meio mínimo de metanol (BMM -

buffered minimal methanol: fosfato de potássio 100 mM pH 6,0, YNB

1,34%, biotina 4 x 10-5%, metanol 0,5%), para a indução da expressão

da proteína recombinante. O inoculo foi preparado por diluição da cultura

em BMG no meio BMM para uma DO600nm final de 1,0. A expressão foi

realizada durante 107 h, a 25 °C, 250 rpm, adicionando-se diariamente

0,5-1,0% de metanol. Após o período de indução da expressão da

proteína recombinante, o material obtido foi centrifugado a 5000 g por 10

min, a 4 °C. O sobrenadante foi filtrado seqüencialmente nas membranas

de 1,2 µm RAW P04700 e 0,22 µm GPWP com pré-filtro AP20 (Millipore),

sendo em seguida aliquotado e congelado em freezer –80 °C para análise

posterior. A expressão foi realizada em diferentes valores de pH: 5,0, 6,0

Page 76: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 75

e 7,0. Para ajustar o pH do meio para 5,0, utilizou-se ácido fosfórico, os

demais pHs foram ajustados no preparo do tampão fosfato de potássio.

3.3.3 Expressão da proteína recombinante em biorreator

A produção do rLopap em biorreator foi realizada de acordo com

protocolo de processo da Invitrogen (“Pichia Fermentation Process

Guidelines - Version B”), com algumas modificações. Foi realizado cultivo

de alta densidade celular em biorreator de 14 L (Biostat MD, B.Braun

Biotech). O ensaio consistiu de duas fases: 1) fase de crescimento celular,

com duas etapas distintas de processo (batelada – batch phase e batelada

alimentada – fed-batch phase) e uma fase de indução da expressão da

proteína recombinante, utilizando-se a técnica de fermentação de

batelada alimentada. Os ensaios foram realizados no Laboratório de

Biotecnologia Industrial – IPT, juntamente com a Profa. Dra. Maria

Filomena Rodrigues e Dra. Rosana Picoli, sendo de nossa responsabilidade

a elaboração do protocolo (com colaboração da Dra. Mickie Takagi do

Laboratório de Fermentações/ Divisão de Produção, Instituto Butantan), o

acompanhamento de todo o processo de fermentação, assim como o

preparo do inóculo e dos meios de cultura e soluções utilizados.

3.3.3.1 Preparo do inóculo

O inóculo foi preparado utilizando três frascos de 1 L do tipo

erlenmeyer, contendo 100 ml de meio BMG. Uma alíquota-estoque de 50

µL da suspensão do clone de P. pastoris foi utilizada para o preparo de

cada inóculo. Os frascos foram incubados em shaker (New Brunswick G-

25) com agitação de 300 rpm, a 30 °C durante 48 h, para atingir uma

concentração celular com DO600nm entre 15 e 30. Alíquotas do meio de

cultivo diluídas em salina na proporção de 1:10 e 1:100, após 24 h e 48 h

de incubação, respectivamente, foram utilizadas para as leituras de DO.

Page 77: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 76

3.3.3.2 Inoculação no reator

O biorreator foi preparado para o recebimento do inóculo da

seguinte forma: foi esterilizado juntamente com o meio definido (FBS -

fermentation basal salts, Tabela 2) e em seguida resfriado até a

temperatura de 30 °C. O pH do meio foi ajustado para 5,0 através da

adição de hidróxido de amônio 14%. Após este procedimento, para

suplementação de sais, foi adicionada a solução de traço de metais (PTM1

- Pichia trace metal, Tabela 3), utilizando-se um volume de 4,35 ml por

litro de meio definido. O sensor de oxigênio foi calibrado antes da

inoculação (eletrodo de oxigênio Mettler-Toledo). O inóculo foi adicionado

no fermentador em volume suficiente para se obter uma DO600nm igual a

1, que correspondeu a um volume inicial do meio de fermentação de

aproximadamente 5 L.

Tabela 2 - Meio definido (Fermentation Basal Salts).

Componentes g/L

sulfato de cálcio 0,93

sulfato de potássio 18,2

sulfato de magnésio 7.H2O 14,9

hidróxido de potássio 4,13

ácido fosfórico 85% 26,7*

glicerol 40,0*

*Esta medida corresponde ao volume (ml/L).

Page 78: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 77

Tabela 3 – Solução de traço de metais (PTM1).

Componentes g/L

sulfato cúprico pentahidratado 6

iodeto de sódio 0,08

sulfato de magnésio monohidratado 3

cloreto de cobalto 0,5

cloreto de zinco 20

ácido bórico 0,02

molibidato de sódio dihidratado 0,2

sulfato ferroso heptahidratado 65

ácido sulfúrico 5*

biotina1 0,2

PTM1 foi esterilizado por filtração e estocado à temperatura ambiente. *Esta medida corresponde ao volume (ml/L). 1A solução de biotina 500x (0,2 g/L) foi preparada separadamente em água e esterilizada por filtração, sendo adicionada no biorreator à parte da solução PTM1.

3.3.3.3 Controle das variáveis

No reator foram mantidas as condições de agitação e aeração

suficientes para manter a porcentagem de oxigênio dissolvido (OD)

sempre superior a 20%. O pH no meio foi mantido sempre numa leitura

igual a 5 (eletrodo de pH Mettler-Toledo), pela adição automática de

hidróxido de amônio 14%, e a temperatura foi mantida a 30ºC durante a

fase de crescimento, e 25 °C durante a fase de indução da expressão da

proteína recombinante.

Durante todo o processo de fermentação, o monitoramento da

concentração de glicerol, quando cabível, foi realizado por HPLC e pelo

controle das variáveis de oxigênio dissolvido. A concentração celular foi

monitorada pela medida da DO600nm de alíquotas retiradas do fermentador,

após centrifugação, descarte do sobrenadante e ressuspensão do pellet

celular em salina ácida (NaCl 150 mM, HCl 100 mM). Amostras (alíquotas

Page 79: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 78

de 30 ml) foram obtidas no final de cada etapa da fermentação e pelo

menos duas vezes por dia. Para dosagem da concentração protéica e da

atividade específica da proteína recombinante, as alíquotas retiradas do

fermentador foram centrifugadas a 5000 g à temperatura ambiente por 10

min (Centrífuga da Sorvall RC 5B) e o sobrenadante congelado a –80 °C

para análise posterior.

3.3.3.4 1ª Etapa: fase de crescimento

• Fase de batelada:

A fase de crescimento em batelada foi realizada para adaptação da

levedura ao meio de cultura de fermentação e crescimento inicial de

biomassa. Esta fase foi mantida até esgotamento do glicerol do meio de

cultura, que correspondeu a um período entre 18 a 24 h. O completo

consumo do glicerol do meio na etapa de batelada foi sinalizado quando o

OD no meio aumentou para próximo de 100%.

• Fase de batelada alimentada:

Após a fase de fermentação em batelada, quando o glicerol foi

esgotado do meio, iniciou-se a fase de fermentação em batelada

alimentada. O objetivo dessa etapa é a obtenção de alta densidade celular

pelo acúmulo de biomassa. Para tanto, foi introduzido no fermentador

uma solução de alimentação contendo glicerol e PTM1 (glicerol 50%

contendo 12 ml de PTM1 e 12 ml de biotina 0,02% por litro) numa vazão

de alimentação de 18,15 ml/h/L de volume inicial de fermentação. Esta

etapa teve duração de aproximadamente 4 h. Durante este período,

observou-se consumo do glicerol que é indicado pelo nível de OD e foi

utilizado um total de aproximadamente 75 ml da solução de alimentação

para cada litro de volume inicial de fermentação. No final dessa etapa a

concentração de biomassa deve estar na faixa de 180 a 200 g/L (massa

úmida), com produção mínima de proteína recombinante.

Page 80: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 79

3.3.3.5 2ª Etapa: fase de indução com metanol

A fase de indução com metanol foi iniciada apenas quando todo o

glicerol do meio foi consumido para que, ao iniciar a alimentação por

metanol, seja promova a indução completa do promotor para a expressão

da proteína recombinante. A ausência do glicerol foi indicada pelo

aumento na porcentagem de OD. Nesta fase, a temperatura foi reduzida e

mantida em 25 °C até o final da expressão, pois o crescimento em

metanol gera muito calor e o controle da temperatura neste estágio é

importante para a preservação da proteína recombinante secretada no

meio. A alimentação com metanol foi introduzida lentamente, para

permitir a adaptação da cultura à presença de metanol no meio.

Posteriormente, a vazão de alimentação foi aumentada progressivamente.

A solução de alimentação consistiu de 100% de metanol contendo 12 ml

de PTM1 e 12 ml de biotina 0,02% por litro, numa vazão inicial de

alimentação de 3,6 ml/h/L de volume inicial de fermentação durante as

primeiras 2-3 h, até a leitura de OD estabilizar e permanecer constante, e

por aproximadamente mais 2 h, quando começou a haver variação de OD

devido ao consumo do metanol. Em seguida, a vazão de alimentação foi

aumentada para 7,3 nas próximas 2 h, e depois para 10,9 ml/h/L de

volume inicial de fermentação, sendo mantida neste fluxo até o final da

fermentação. A duração da fase de indução com metanol foi de

aproximadamente 72 h, sendo utilizado um total de aproximadamente

740 ml da solução de alimentação por litro de volume inicial de

fermentação. A concentração de biomassa no final dessa fase deve estar

entre 350 a 450 g/L de massa úmida, com produção total da proteína

recombinante.

3.3.3.6 Separação do sobrenadante

O cultivo final (aproximadamente 8 litros) foi processado de duas

formas distintas: 2 L foram destinados para processamento através

Page 81: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 80

filtração em membrana de fibra oca; e o restante do material foi

centrifugado (10.000 rpm, 30 min) e o sobrenadante filtrado em

membrana de éster de celulose 0,22 µm (GSWP14250, Millipore) com pré-

filtro em microfibra de vidro (AP1512450, Millipore) e armazenado em

freezer –80 °C, para purificação posterior.

3.4 Processamento do material após expressão em biorreator

3.4.1 Clarificação e concentração em membranas de fibra oca

O processamento de uma fração de 2 L do cultivo de P. pastoris,

obtido após processo de fermentação para produção do rLopap, foi

realizado através de uma etapa de clarificação e uma etapa de

concentração em equipamento Quix Stand, Bomba Watson Marlow modelo

323 e membranas de fibra oca (S6-4106-22, modelo CFP-1-E-4X2MA,

poro de 0,1 µm e área de superfície de 850 cm2, para clarificação; UFP-5-

C-4X2MA, corte nominal de massa molecular (NMWC) de 5 kDa e área de

superfície de 1.400 cm2, para concentração).

Para a clarificação do material, a membrana foi hidratada em água

Milli-Q e lavada com NaOH 100 mM, lavando-se em seguida com água

Milli-Q até a solução filtrada atingir pH igual a 7,0. A clarificação do

material foi realizada em duas etapas (1 L cada). O fluxo utilizado foi de

1,2 L/min. A pressão foi mantida em aproximadamente 10 psig e a força

de arrasto em aproximadamente 4.000 shear, para evitar o rompimento

das células. Durante todo o processo o compartimento de alimentação foi

mantido com agitação moderada para evitar sedimentação. A diluição do

material clarificado foi de no máximo 2 vezes o volume inicial, pela

lavagem da parte retida em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3. O material

que ficou retido na membrana, o qual correspondeu à massa celular do

cultivo foi descartado.

O material clarificado foi posteriormente concentrado em até 20

vezes seu volume inicial, utilizando fluxo de 0,6 L/min. Durante todo o

Page 82: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 81

processo o compartimento de alimentação foi mantido com agitação

moderada para evitar sedimentação. O material não-retido (ultrafiltrado),

o qual correspondeu à fração menor que 5 kDa foi descartado.

3.4.2 Diálise

Alíquotas do material obtido foram dialisadas, para os diferentes

ensaios, utilizando dispositivos de nanofiltração amicon ultra-15 (Millipore)

com NMWC de 5 kDa, em centrífuga refrigerada, considerando-se um

fator de diluição de 50-100 vezes. Estes dispositivos também foram

utilizados para concentração de amostras e frações cromatográficas,

quando necessário. Alternativamente, foi realizada diálise em membrana

de celulose regenerada com NMWC de 3,5 kDa (Fisher), à temperatura de

15 °C em um volume no mínimo 80 vezes maior que o volume da amostra

a ser dialisada, com duas trocas diárias, durante no mínimo 2 dias. Para

garantir diálise completa da amostra, a presença residual de sais do meio

de fermentação foi monitorada por teste de precipitação com cloreto de

cálcio em microplaca:

• Controle positivo:

10 µl de amostra não dialisada ou tampão fosfato de sódio + 10

µl de cloreto de cálcio 50 mM → precipitação visível

• Controle negativo:

10 µl de tampão Tris-HCl ou água + 10 µl de cloreto de cálcio 50

mM → ausência de precipitação

• Teste:

10 µl de amostra dialisada + 10 µl de cloreto de cálcio 50 mM

Page 83: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 82

3.5 Avaliação da estabilidade do rLopap expresso em Pichia

pastoris

3.5.1 Estabilidade em diferentes temperaturas

A estabilidade da proteína recombinante obtida foi avaliada em

diferentes temperaturas. Foram utilizadas alíquotas do material expresso

em fermentador, após o processamento (clarificação e concentração) em

sistema de fibras ocas e diálise em solução salina (NaCl 0,9%), na

concentração de 373 µg de proteínas/ml. As alíquotas foram mantidas em

diferentes temperaturas (-80, -20, 4, 8, 25 e 37 °C) por 2, 24 e 120 h.

Após esses períodos as alíquotas foram testadas quanto à atividade

ativadora de protrombina (item 3.8.1), utilizando-se para comparação 20

µg de proteínas em cada teste. Também foram testadas amostras

liofilizadas.

3.5.2 Estabilidade em diferentes soluções

Com o objetivo de testar a solubilidade e estabilidade da amostra

em diferentes soluções a serem utilizadas em processos cromatográficos,

e outros ensaios, amostras do material clarificado foram dialisadas contra

diferentes tampões e diferentes concentrações salinas, à temperatura de

15 °C ou ambiente:

- Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, com 0, 50, ou 150 mM de NaCl

- Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, com 0, 50, ou 150 mM de NaCl

- Acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, com 50 e 75 mM de NaCl

- Citrato de sódio 20 mM, pH 5,0, com 50 e 75 mM de NaCl

- Fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, com 150 mM de NaCl

- Fosfato de potássio 50 mM, pH 7,2, com 150 mM de NaCl

- Solução salina (NaCl 0,85%, pH 5,5)

- Solução salina/bicarbonato (pH 7,0)

Page 84: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 83

3.5.3 Estabilidade em diferentes valores de pH

A solubilidade e estabilidade da atividade da proteína recombinante

obtida foram avaliadas em diferentes valores de pH, com exceção do pH

6,0, próximo ao ponto isoelétrico do Lopap. Alíquotas do material

clarificado foram dialisadas nos tampões:

- Acetato de sódio 50 mM pH 5,0, com 50 mM de NaCl

- Tris-HCl 20 mM pH 7,0, com 50 mM de NaCl

- Tris-HCl 20 mM pH 8,0, com 50 mM de NaCl

- Tris-HCl 20 mM pH 9,0, com 50 mM de NaCl

As amostras dialisadas, na concentração de 450 µg de proteínas/ml,

foram incubadas por 24 h à temperatura ambiente. Em seguida, uma

alíquota de cada amostra foi centrifugada por 15 min, 20.000 g, a 20 °C e

depois filtrada em filtro de seringa 0,22 µm, para separação do

precipitado das proteínas solúveis. Medidas de absorbância (A) a 280 e

214 (quantificação de proteínas) e 600 nm (turbidez devido à

precipitação) foram obtidas após a diálise, após o período de incubação e

nas alíquotas após a remoção do precipitado. A fração solúvel das

alíquotas das amostras foi testada quanto à atividade ativadora de

protrombina (conforme item 3.8.1), utilizando-se 12 µg de proteínas para

comparação em cada teste. A fração solúvel e o precipitado de cada

amostra foram analisados por SDS-PAGE, conforme item 3.7.3.

Para testar se a redução de atividade apresentada em determinados

valores de pH foi resultante de uma alteração de conformação molecular

transitória ou permanente, todas as amostras foram re-dialisadas na

solução onde foi observado valor ótimo de pH para a atividade ativadora

de protrombina. As amostras foram novamente incubadas, centrifugadas,

filtradas e testadas quanto à atividade ativadora de protrombina, nas

mesmas condições descritas anteriormente. A fração solúvel das alíquotas

Page 85: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 84

das amostras obtida após a primeira diálise foi testada novamente, para

comparação com as amostras re-dialisadas.

A presença de polipropilenoglicol (PPG), adicionado como

antiespumante no meio de fermentação, causa turbidez na amostra à

temperatura ambiente, que pode se confundir com a real precipitação de

proteínas. Portanto, a precipitação de proteínas foi confirmada através de

dois testes:

1) Reação colorimétrica (reagente de Bradford):

Gotas do reagente foram adicionadas ao pellet (material

precipitado, sedimentado ou obtido por centrifugação). A

visualização de coloração azul foi indicativa da presença de

proteínas.

2) Solubilização dependente de temperatura:

A solução com turbidez foi imersa em banho de gelo, para

solubilização do antiespumante com o resfriamento. A

visualização de solução translúcida foi indicativa da ausência de

precipitação protéica. Para as leituras de absorbância, 200 µl de

amostra foram pipetados em microplaca, e esta foi previamente

incubada por 5 min em refrigerador (≈ 8 °C) e 1 min à

temperatura ambiente.

3.6 Estabelecimento do processo de purificação do rLopap

expresso em Pichia pastoris

3.6.1 Cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose

A proteína recombinante obtida após processo de cultivo e

expressão em shaker foi purificada em coluna de afinidade Benzamidina-

Sepharose 4 Fast Flow, conforme instruções do fabricante (Amersham

Biosciences). A cromatografia de afinidade foi testada como primeira

Page 86: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 85

etapa de purificação do rLopap, utilizando-se uma seringa de 5 ml

contendo 4 ml da resina, conectada a uma bomba peristáltica (Pharmacia)

com fluxo de 1 ml/min. O pH e a condutividade da amostra (sobrenadante

microfiltrado proveniente do cultivo) foram ajustados para pH 7,5 e 88

mS/cm de condutividade antes de ser aplicada à coluna. Como tampão de

equilíbrio foi utilizado Tris-HCl 50 mM, 0,5 M de NaCl, pH 7,5. A eluição foi

realizada com 50 mM de glicina pH 3,0, sendo coletadas frações de 1,0 ml

em 100 µl de Tris-HCl 1M pH 9,0. As frações obtidas (fração 1- não-retido

na coluna e fração 2- retido na coluna de afinidade) foram analisadas

quanto à atividade enzimática (atividade ativadora de protrombina,

conforme item 3.8.1), perfil eletroforético pela análise em SDS-PAGE

(conforme item 3.7.3) e imunodetecção, utilizando-se anticorpo anti-

rLopap, conforme descrito no item 3.7.4.

3.6.2 Screening em colunas de troca iônica e interação hidrofóbica

Para padronização e otimização do processo de purificação, foram

testadas colunas de troca catiônica e aniônica do kit “HiTrap IEX Selection

Kit” e de interação hidrofóbica do kit “HiTrap HIC Selection Kit” de 1 ml

cada, conforme manual do fabricante (GE Healthcare). Estas, assim como

as demais corridas cromatográficas descritas posteriormente, foram

realizadas em sistema FPLC, utilizando cromatógrafo automático Äcta

Purifier (GE Healthcare).

3.6.3 Cromatografia de troca aniônica em Q-Sepharose

O material obtido no processo de fermentação, após clarificação e

diálise, foi submetido à cromatografia em coluna HiPrep 16/10 (20 ml) Q-

Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare) como primeira etapa de

purificação. Como tampão de equilíbrio foi utilizado Tris-HCl 20 mM pH

7,3, com 150 mM NaCl. O volume de amostra aplicado correspondeu a 1

volume de coluna (VC), coletando-se frações de 10 ml, com fluxo de 5

Page 87: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 86

ml/min, no tampão de equilíbrio (5 VC). A eluição foi realizada com

gradiente não-linear de 1 M de NaCl no tampão de equilíbrio (5 VC).

3.6.4 Cromatografia de gel filtração

A fração ativa obtida da cromatografia em QFF foi aplicada à

cromatografia de gel filtração em coluna Superose 12 10/300 (24 ml) GL

(GE Healthcare), como segunda etapa de purificação. Foram aplicados 0,5

ml (0,20 mg) de amostra, coletando-se frações de 0,5 ml com gradiente

isocrático em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3, com 150 mM NaCl (tampão

de equilíbrio), com fluxo de 0,5 ml/min.

3.7 Ensaios bioquímicos

3.7.1 Dosagem de proteínas

O conteúdo protéico das amostras obtidas ou utilizadas nos

diferentes ensaios foi estimado pelo método de Bradford (Bradford, 1976),

utilizando reagente de cor da Bio-Rad. Os ensaios foram realizados de

acordo com instruções do fabricante, utilizando albumina de soro bovino -

BSA (Sigma) como padrão.

3.7.2 Precipitação de proteínas

Devido à baixa resolução obtida na análise eletroforética de

proteínas de amostras provenientes de cultura de Pichia pastoris,

provavelmente devido a um alto conteúdo lipídico, estas amostras foram

previamente submetidas a precipitação metanol/clorofórmio.

Foram adicionados à amostra, nesta ordem: 4 volumes de metanol,

1 volume de clorofórmio e 3 volumes de água, homogeneizando-se em

vortex após a adição de cada solvente. Em seguida a mistura foi

centrifugada por 5 min a 4000 g, formando 3 fases distintas. A fase

Page 88: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 87

superior do sobrenadante foi descartada. Foram adicionados 4 volumes de

metanol, homogeneizando-se em vórtex e a amostra foi centrifugada

novamente por 5 min a 4000 g. O sobrenadante foi descartado e a

amostra sedimentada foi secada com jato de nitrogênio gasoso.

3.7.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

As amostras obtidas nas várias etapas de produção do rLopap foram

analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato

de sódio (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). Foram utilizados géis de

espessura de 1,0 mm com 5% de acrilamida para empilhamento e 12,5 ou

15% para separação. As amostras foram diluídas 1:2 no tampão de

aplicação (Tris-HCl 125 mM pH 6,8, SDS 140 mM, glicerol 20%, azul de

bromofenol 0,03 mM, contendo β-mercaptoetanol 0,1 M para redução) e

aquecidas a 100 °C por 5 min. As corridas eletroforéticas foram realizadas

sob corrente elétrica de 17-20 mA. Os géis foram corados por Coomassie

Brilliant Blue R-250 (azul de Coomassie) a 0,25% em metanol 50% por 18

h e descorado com ácido acético 7,5% por 3 h à temperatura ambiente.

Como marcadores de massa molecular foi utilizado kit da GE Healthcare

que contém padrões de baixo peso (LMWM): fosforilase B (94 kDa);

albumina bovina (67 kDa); ovoalbumina (43 kDa); anidrase carbônica (30

kDa); inibidor de tripsina de soja (SBTI – 20 kDa); e lactoalbumina (14

kDa).

3.7.4 Imunobloting

Os ensaios de imunobloting (western blot) foram realizados a partir

de géis de SDS-PAGE, conforme Towbin et al. (1979) Foram utilizados

como anticorpo primário soro anti-Lopap (1:250) obtido em coelhos,

anticorpo secundário anti-IgG de coelho, conjugado à fosfatase alcalina

(1:7500) e solução reveladora “Western Blue Stabilized Substrate for

Alkaline Phosphatase” (Promega).

Page 89: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 88

3.8 Avaliação da atividade procoagulante do rLopap in vitro

3.8.1 Atividade ativadora de protrombina

A capacidade do rLopap em ativar a protrombina foi avaliada

indiretamente através do ensaio de formação de trombina a partir da

protrombina usando o substrato cromogênico S-2238 (Chromogenix), de

acordo com Reis et al. (2001b). A atividade foi avaliada após pré-

incubação durante 20 min a 37 °C com protrombina (90 pM, Calbiochem),

na presença de 5 mM de CaCl2 para volume final de 200 µl em tampão

Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5. A hidrólise de S-2238 40 µM

(geração de p-nitroanilina) pela trombina formada a partir do Lopap foi

acompanhada espectrofotometricamente a 405 nm durante 20 min a 37

°C. Para controles negativos, foram aplicadas as mesmas quantidades dos

reagentes, omitindo-se a amostra, e as mesmas quantidades dos

reagentes e amostras, omitindo-se a protrombina. Uma unidade de

atividade enzimática (U) foi definida arbitrariamente como a variação em

miliunidades de absorbância a 405 nm por min (mAU/min), nas

condições do teste descritas acima.

3.8.2 Atividade procoagulante sobre plasma humano

A atividade procoagulante da proteína recombinante obtida após

purificação por cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose foi

avaliada sobre o plasma humano normal através de ensaio do tempo de

recalcificação de plasma citratado (citrato de sódio 3,8%, 1:10). A

amostra foi diluída em 0,2 ml de solução salina com 0,1 ml de CaCl2 25

mM. Após pré-incubação (1 min, 37 °C) foi adicionado 0,1 ml de plasma e

o tempo decorrido até a coagulação foi medido. O tempo de coagulação

do plasma na ausência de amostras do rLopap foi utilizado como controle.

Page 90: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 89

3.9 Avaliação da atividade antiapoptótica do rLopap

3.9.1 Cultivo de células endoteliais de cordão umbilical humano

Este ensaio foi realizado com a colaboração da Dra. Carla Simone

Seibert, Pós-Doutoranda em nosso laboratório, para avaliar o efeito

citoprotetor do rLopap obtido através do sistema de expressão em Pichia

pastoris. Células endoteliais de veia de cordão umbilical humano (HUVECs

- human umbilical vein endothelial cells) obtidas de acordo com Jaffe et al.

(1973) foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Cultilab) suplementado com

soro fetal bovino (SFB) 10%, antibiótico 1%, L-glutamina 2 mM, heparina

45 µg/ml, mercaptoetanol 50 µM, piruvato de sódio 1 mM, fator de

crescimento 25 µg/ml (Sigma). As células foram mantidas a 37 °C em

estufa com 5% de CO2 até ficarem confluentes na garrafa, foram

desprendidas utilizando solução de tripsina 0,4%/ EDTA 0,2% (Cultilab) e

adicionadas em placas de 96 poços (previamente gelatinizada) na

concentração de 15x103 células/poço para a realização do ensaio.

As células foram mantidas por 24 h a 37ºC em estufa com 5% de

CO2 para a adesão na placa e após este período foram incubadas por 48 h

com rLopap (produzido em shaker, purificado por cromatografia de

afinidade em Benzamidina-Sepharose) na concentração de 10 µg/ml

diluído em meio RPMI suplementado com SFB 1%, que é uma condição

proapoptótica. Como controle positivo, as células foram cultivadas em

meio RPMI suplementado com SFB 10%. Como controle negativo as

células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com SBF 1% na

ausência do rLopap.

3.9.2 Cultivo de células endoteliais de timo murino

Este ensaio foi realizado em colaboração com a Dra. Miryam Paola

Alvarez Flores, Pós-Doutoranda em nosso laboratório, para avaliar a

atividade antiapoptótica das amostras de rLopap obtidas através do

Page 91: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 90

sistema de expressão em P. pastoris. Foram utilizadas células endoteliais

de timo murino, linhagem tEND, na concentração de 7x103 células/poço

em placa de 96 poços com 100 µl de meio RPMI 1640, suplementado com

SFB 1%, antibiótico (penicilina 100 IU / estreptomicina 100 µg/ml) e L-

glutamina 2 mM. As células foram mantidas em estufa a 37 °C em

atmosfera 5% de CO2. Após incubação overnight, as células foram pré-

estimuladas com fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) durante 1 h, para

indução de apoptose. Foram utilizados 5 µl de TNF-α (1 µg/ml) para 95 µl

de meio RPMI contendo 0% ou 1% de SFB. Como controle, células não

estimuladas com TNF foram incubadas paralelamente com 0%, 1% ou

10% de SFB em meio RPMI. Após o tempo de incubação, o meio foi

retirado, e os poços lavados com tampão fosfato-salina (PBS) sem cálcio,

e as células foram tratadas por 48 h com frações do rLopap purificado

após primeira etapa cromatográfica de troca iônica em QFF (rLopap 1: 1

µg/ml) e após segunda etapa cromatográfica de troca iônica em Superose

12 (rLopap 2: 0,3 µg/ml), na presença de 0% ou 1% de SFB.

3.9.3 Teste de viabilidade celular pelo método do MTT

O teste de viabilidade celular foi realizado através do método

colorimétrico do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de

tetrazolina), sal de monotetrazolium que é reduzido a formazan por

mitocôndrias ativas em células vivas. O MTT se incorpora nas células

viáveis, formando cristais de formazan, os quais, por sua vez, são

dissolvidos pela adição de dimetilsulfóxido (DMSO) e colorimetricamente

detectados pela leitura A 550 nm (Mosmann, 1983).

Após o tratamento das células, o sobrenadante foi removido e as

células aderidas na placa foram lavadas com PBS. Em seguida, foram

adicionados 100 µl de solução de MTT 0,5 mg/ml (Sigma) em cada poço.

A placa foi incubada em estufa a 37 °C com 5% de CO2 por 3 h. Em

seguida, o sobrenadante foi removido e foram adicionados 100 µl de

DMSO. Para o cálculo da viabilidade celular foi considerado como 100% de

Page 92: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 91

viabilidade a leitura de células incubadas com SFB 10%, na ausência de

agentes estimulantes (TNF ou rLopap). Os resultados foram analisados

estatisticamente pela análise de variância (ANOVA), com intervalos de

confiança de 95%, seguido pelo teste de Bonferroni.

3.10 Avaliação da ação do rLopap in vivo como agente hemostático

sistêmico

Este experimento foi realizado em colaboração com a farmacêutica

Luana Wlian, mestranda em nosso Laboratório, e com o Prof. Dr.

Francisco Humberto Maffei e a Dra. Sonia de Andrade Chudzinski, do

Grupo de Pesquisa em Trombose e Hemostasia, Instituto de Ensino e

Pesquisa – Hospital Sírio Libanês (IEP-HSL). Através destes ensaios foi

avaliada a capacidade procoagulante do rLopap in vivo e sua efetividade

como antídoto para sangramento induzido com heparina de baixo peso

molecular (enoxaparina). Foram utilizados coelhos Nova Zelândia, machos

de 3,8–4,2 kg, randomizados em três grupos experimentais contendo 5

animais em cada (controle negativo = tratado apenas com salina; controle

positivo = tratado com protamina; teste = tratado com rLopap). Após

anestesia com ketamina 115 mg/kg e xilazina 11,5 mg/kg, os animais

foram depilados na região pélvica e toráxica, e tiveram expostas a artéria

femoral esquerda para monitoramento da pressão arterial, a veia femoral

direita para administração das drogas e controle da volemia, e a veia

jugular externa direita para coleta de sangue, conectada a um cateter. Os

coelhos foram anticoagulados com enoxaparina (Aventis, 20 mg/kg), e

após 10 min foram tratados o rLopap (fração ativa recuperada da

cromatografia em Superose 12, 1 µg/kg), com protamina (dosagem de

1:1 em relação à enoxaparina) ou apenas com o veículo (salina) no grupo

controle. Foram realizadas coletas de amostras de sangue (2 ml) 10 min

antes da adiminstração de heparina e nos tempos 0, 5, 10, 15, 17, 20, 30,

40, 60 e 90 min após administração de heparina, para dosagem do tempo

de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e dos níveis de fibrinogênio. O

Page 93: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 92

plasma foi obtido após centrifugação das amostras de sangue a 2500 g,

10 min, 25 °C. O TTPa e os níveis de fibrinogênio foram medidos nos

plasmas obtidos com kit comercial (Dade Bearing) em coagulômetro. O

tempo de sangramento foi medido alternadamente nas orelhas esquerda e

direita de cada animal, após incisão de 5 mm, nos seguintes tempos: 0, 5,

10, 15, 20, 30, 40, 60 e 90 min.

3.11 Mapeamento peptídico do Lopap

Tendo como base os domínios conservados (motifs) característicos

de lipocalinas presentes na seqüência primária do Lopap (Reis et al.,

2006), foram desenhados quatro peptídeos: P1 e P3, com 20 resíduos de

aminoácidos; P2, com 19 resíduos e P4, com 11 resíduos. P1 e P3 estão

relacionados com os motifs 1 e 3, respectivamente, enquanto P2 e P4

estão relacionados ao motif 2. Os peptídeos foram sintetizados pela

ORPEGEN Pharma (Alemanha), e analisados quanto à massa molecular

por espectrometria de massa MALDI-MS e quanto ao grau de pureza por

HPLC. Os testes in vivo e in vitro com estes peptídeos foram realizados em

colaboração com a Janaina de Souza Ventura, Doutoranda em nosso

laboratório, e com a Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues, do

Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina - Universidade de São

Paulo.

3.11.1 Ensaios de atividade procoagulante e antiapoptótica de peptídeos

derivados do Lopap

A capacidade dos peptídeos sintéticos derivados do Lopap (P1, P2,

P3 e P4) de ativar a protrombina foi avaliada através do ensaio de geração

de trombina, utilizando o substrato cromogênico S-2238, conforme item

3.8.1. A atividade procoagulante destes peptídeos em plasma humano foi

avaliada de acordo com o item 3.8.2.

Page 94: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 93

A atividade antiapoptótica dos peptídeos foi avaliada em cultura de

HUVECs conforme descrito no item 3.9.1. As células foram tratadas com

cada peptídeo na concentração de 5 µg/ml e a viabilidade celular foi

avaliada após 72 h, pelo teste do MTT (item 3.9.3). Os peptídeos que

apresentaram atividade antiapoptótica foram testados após 120 h de

incubação com diferentes concentrações, para obtenção de uma curva

dose-resposta.

3.11.2 Avaliação do efeito de inibidores de serino protease sobre a

atividade de peptídeo citoprotetor derivado do Lopap

Dentre os peptídeos derivados do Lopap, o peptídeo citoprotetor

identificado de maior tamanho, foi utilizado neste ensaio. O peptídeo na

concentração de 0,1 mg/ml em solução salina foi incubado por 15 min a

37 °C com 5 mM de PMSF, que é um inibidor de serino proteases que

reage especificamente com o resíduo ativo de serina da molécula. Para

controle positivo da atividade antiapoptótica, o peptídeo foi incubado na

ausência do inibidor. Para controle negativo, apenas o PMSF foi incubado

na ausência do peptídeo. Após incubação, a solução do peptídeo tratado

com o inibidor, assim como os controles, foram aplicados em coluna

“desalting MicroSpin” G-25 (GE Healthcare) para remoção do PMSF e as

amostras recuperadas foram liofilizadas para concentração do volume.

A atividade antiapoptótica do peptídeo (0,3 µg/ml) foi avaliada em

culturas de HUVECs (conforme item 3.9) após 120 h. O efeito da

aprotinina, que também é um inibidor de serino protease, foi avaliado

através da adição de concentração não tóxica (3 µg/ml) diretamente no

meio de cultura, juntamente com o peptídeo.

3.11.3 Análises estruturais

O modelo da estrutura tridimensional do Lopap com a predição de

seu sítio catalítico foi previamente obtido por Reis et al. (2006). Este

Page 95: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 94

modelo foi utilizado para analisar a co-localização das seqüências

peptídicas identificadas com envolvimento na ação celular do Lopap,

através do programa RasMol, versão 2.5 (Sayle e Milner-White, 1995).

Partindo da seqüência compreendida pelos peptídeos citoprotetores

derivados do Lopap, foi realizada uma busca por domínios conservados

similares em bancos de dados de proteínas através do “Motif Search” –

“Search Motif Library” (Kyoto University Bioinformatics Center, 2009).

Foram utilizados como parâmetros de busca os índices de corte padrão e a

inclusão de todos os bancos de dados disponíveis. Dos resultados obtidos,

foram excluídas todas as seqüências que não apresentavam correlação de

seqüência com a região comum (seqüência coincidente) dos peptídeos

citoprotetores.

Outra estatégia utilizada para busca de regiões conservadas em

outras proteínas que apresentam similaridade com a região de seqüência

do Lopap relativa aos peptídeos citoprotetores foi a busca por domínios

conservados utilizando o “Conserved Domain Architecture Retrieval Tool”

(CDART – Geer et al., 2002) como ferramenta de busca no NCBI e a

seqüência completa do Lopap (AAW88441). Apenas as seqüências que

apresentaram alinhamento na região correspondente aos peptídeos

citoprotetores do Lopap foram consideradas. A seqüência comum aos

peptídeos ativos derivados do Lopap também foi submetida à busca direta

no NCBI utilizando blastp (Altschul et al., 1990).

A similaridade estrutural entre o Lopap e outras lipocalinas que

também apresentam atividade antiapoptótica foi analisada através de

ferramentas de bioinformática, com a colaboração do Dr. Oscar H.P.

Ramos. A localização e alinhamento da seqüência dos peptídeos ativos no

modelo de estrutura terciária do Lopap, com seqüências relacionadas

presentes na purpurina e na prostaglandina D sintase foram realizados

com o programa Pymol (DeLano, 2002). Os modelos da purpurina

(P08938) e da prostaglandina D sintase (P41222) foram obtidos pelo

ModBase (Pieper et al., 2009). A acessibilidade relativa ao solvente (ARS)

dos átomos das cadeias principais e laterais de cada resíduo de

Page 96: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 95

aminoácido da seqüência correspondente à região dos peptídeos ativos do

Lopap e seu equivalente em um tripeptídeo composto por Gly-Xaa-Gly,

onde Xaa representa o resíduo de aminoácido, foram calculados utilizando

a ferramenta VADAR (Willard et al., 2003), e comparados com as

respectivas seqüências na purpurina e na prostaglandina D sintase. O

cálculo da ARS de cada resíduo como um todo foi realizado pelo ASA-

VIEW (Ahmad et al., 2004). A polaridade e hidropaticidade de cada um

dos resíduos de aminoácido do Lopap e correspondentes das outras

proteínas analisadas, foram avaliadas, respectivamente, de acordo com o

método de Grantham (1974) e Kyte e Doolittle (1982).

3.12 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do

Lopap sobre a expressão de proteínas de matriz extracelular em

cultura de fibroblastos

Dentre os peptídeos que apresentaram atividade citoprotetora, o

peptídeo de menor tamanho foi escolhido para utilização nos ensaios

seguintes para avaliar o efeito deste peptídeo sobre a síntese de

moléculas de matriz extracelular in vitro. Este ensaio foi realizado com a

colaboração da Profa. Dra. Consuelo Junqueira Rodrigues, da Faculdade de

Medicina – USP. Foram utilizadas culturas primárias de fibroblastos

humanos e a produção de colágeno, fibronectina e tenascina foi analisada

utilizando técnicas de imunocitoquímica.

3.12.1 Cultivo de fibroblastos e tratamento com o peptídeo

Culturas primárias de fibroblastos humanos foram obtidas conforme

previamente descrito por Aldo Filho (2006). Para preparo de subculturas,

a placa com fibroblastos, crescidos em meio Ham–F-12 (Gibco) com 15%

SFB (Cultilab), antibióticos (ampicilina 20 mg/ml, estreptomicina 20

mg/ml, gentamicina 40 mg/ml), foi lavada por 3 vezes com o PBS, e

adicionou-se tripsina-EDTA 1:250 (Cultilab) para descolamento das células

Page 97: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 96

aderidas ao fundo da placa. Em seguida, foi adicionado meio de cultura +

SFB para inativação da tripsina. A suspensão celular foi retirada e

centrifugada por 5 min a 1.800 rpm. Após desprezar o sobrenadante e

ressuspender o sedimento com 1 ml de meio de cultura + SFB, foi

realizada a contagem de células viáveis. A determinação de viabilidade

celular foi realizada pelo teste de exclusão celular pelo corante azul de

tripan (Sigma), solução de 0,5% diluída em PBS 9:1, e somente as

amostras de fibroblastos que continham acima de 90% de células viáveis

foram subcultivadas. Células do 2° subcultivo foram acondicionadas em

placas de 24 poços contendo lâminas circulares de 13 mm de diâmetro, na

concentração de 1,15 x105 células/poço em 1 ml de meio de cultura + SBF

+ antibióticos. Após período de incubação de 48 h (37 °C/CO2 5%) para

aderência das células, o meio foi trocado, adicionando-se os tratamentos

com o peptídeo nas concentrações de 0,35 µg/ml e 5 µg/ml em 0,5 ml de

meio de cultura. Após a adição dos tratamentos, as células foram

incubadas por 96 h a 37 °C com 5% de CO2. O grupo controle consistiu de

cultivos de fibroblastos nas mesmas condições, onde solução salina

(solvente do peptídeo) foi adicionada em lugar do peptídeo.

3.12.2 Imunofluorescência indireta

Após fixação, as lâminas foram removidas e a produção de

moléculas de matriz foi observada por imunofluorescência indireta, com

anticorpos primários (Sigma): monoclonal anti-fibronectina celular, anti-

tenascina humana e HSP47 (procolágeno), e com anticorpo secundário

Alexa Fluor 488 (Molecular Probes), o qual é excitado a um comprimento

de onda de 495 nm, emitindo fluorescência verde com leitura a 519 nm. A

percentagem de produção de cada molécula em relação à área total (µm2)

foi analisada em microscópio de fluorescência e quantificada com o auxílio

de sistema de análise de imagens (Kontron Electronic 300, ZEISS), a

partir de imagens obtidas de 10 campos microscópicos (40x10) por

lâmina.

Page 98: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 97

Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística descritiva e

a comparação entre grupos foi realizada pelo teste de Kruskal-Wallis (não-

paramétrico) ou ANOVA (paramétrico). As análises foram realizadas com o

auxílio do progama SigmaStat 2.0 (Jandel Scientific). Foi adotado nível de

significância de p<0.05.

3.13 Avaliação do efeito de um peptídeo sintético derivado do

Lopap sobre a síntese de colágeno na derme

3.13.1 Tratamento experimental

Camundongos Balb/C fêmeas, previamente depilados no dorso,

foram tratados por via intradérmica com o peptídeo sintético derivado do

Lopap, o qual foi previamente avaliado em ensaios in vitro em cultura de

fibroblastos. Este ensaio foi realizado com a colaboração da Janaina

Ventura, doutoranda em nosso laboratório. Foram utilizados diferentes

esquemas de tratamento (dose única ou múltiplas doses, diferentes

concentrações) e os animais foram avaliados em diferentes intervalos de

tempo quanto à produção de colágeno na derme, hemostasia global e

alterações hematológicas. Este experimento foi realizado como um ensaio

piloto para entendimento da ação do peptídeo derivado do Lopap em

modelo animal e para delinear o esquema de tratamento deste peptídeo

em animais.

Um total de 68 camundongos de 20-25 g, foram divididos

aleatoriamente em 6 grupos: grupos (G) 1-4 com 5 subgrupos (n=2) e

grupos 5–6 com 6 subgrupos (n=2):

- G1 e G2) único tratamento com salina (G1) ou 0,3 µg de P4 (G2),

avaliados em diferentes intervalos de tempo após o tratamento (1, 2,

3, 4 e 12 semanas);

Page 99: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 98

- G3 e G4) único tratamento com doses variadas de P4 (0,04, 0,2, 1,0,

5,0 e 25 µg), avaliados 1 semana (G3) ou 4 semanas (G4) após o

tratamento;

- G5 e G6) tratamentos cumulativos (de 2 a 4 vezes, 1 vez por

semana,) com salina (G5) ou 0,3 µg de P4 (G6), avaliados 1 semana

após o último tratamento, ou seja, após 2, 3 e 4 semanas após o

início do tratamento, e também após 12 semanas do término de cada

tratamento.

Para tratamento, os animais foram injetados com 0,5 ml do peptídeo

em solução salina na região lombar esquerda e, como controle, foi

injetado 0,5 ml de solução salina na região direita, que foi utilizada como

controle para medição do nível basal de colágeno no mesmo animal. Os

grupos controle foram administrados apenas com salina e foram utilizados

para gerar valores de referência para avaliação de alterações

hematológicas e avaliação de toxicidade.

3.13.2 Avaliação dos animais

Nos respectivos intervalos de tempo, os animais foram anestesiados

com ketamina 10% (100 mg/kg) e xilasina (16 mg/kg) em PBS por via

intraperitoneal. Em seguida, foi coletado 1 ml de sangue por punção

cardíaca, em 3,8% de citrato de sódio na proporção de 1:10 (citrato de

sódio:sangue). Também foi coletado sangue em um capilar heparinizado

pela via retro-orbital, para avaliação do hemograma. Posteriormente, os

animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. Para análises

histológicas da derme, foram retirados por dissecção fragmentos de pele

de 1 x 1 cm da área dorsal tratada ou controle nos lados esquerdo e

direito dos animais. Os fragmentos de pele foram armazenados a 4 °C em

formalina tamponada 10%, pH 7,4 até a análise histológica. O sangue

coletado dos animais foi processado imediatamente por centrifugação a

1500 g, 25 °C, 15 min, para obtenção do plasma, que foi utilizado para

Page 100: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

MATERIAIS E MÉTODOS 99

ensaios de coagulação com a medida do tempo de protrombina (TP), do

TTPA, e dos níveis plasmáticos de fibrinogênio, utilizando kits comerciais

(Diamed) em Coagulômetro Quick Timer (Drake). A contagem do

hemograma foi realizada em analisador hematológico automático (Advia,

Bayer). Para avaliação de sinais de toxicidade, os animais foram

observados quanto a alterações no peso corporal, alterações

macroscópicas na superfície tratada e estereótipos comportamentais.

Lâminas histológicas foram preparadas a partir dos fragmentos de

pele dos animais e submetidas à coloração de Picrosirius, para avaliação

quantitativa do colágeno. A coloração de Picrosirius cora as fibras

colágenas em vermelho e não cora outras estruturas da derme. A

quantificação da porcentagem de colágeno em relação à área total (µm2)

foi realizada com auxílio de Sistema Analisador de Imagens Kontron 300

(Zeiss). A média da fração de área das fibras colágenas na derme foi

obtida a partir da análise microscópica de 05 campos dos cortes

histológicos de cada animal.

A análise estatística foi realizada pelo método de Variância ANOVA

seguido de teste comparativo múltiplo de TUKEY-KRAMER. Os valores

foram expressos em média ± desvio padrão, considerando-se valores

significantes p<0,05.

Page 101: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 100

4 RESULTADOS

4.1 Obtenção do rLopap em E. coli Origami

Para confirmar a presença do inserto codificante do Lopap nos

plasmídeos pAE-Lopap purificados, obtidos de 6 colônias isoladas da

bactéria E. coli DH5α, estes foram submetidos à reação de PCR, utilizando

oligonucleotídeos iniciadores específicos para a seqüência do Lopap

(sense) e para a seqüência do vetor (anti-sense). Como pode ser

observado na Figura 13, em todas as reações foi obtido produto

amplificado correspondente à seqüência de DNA codificante do Lopap

(>600 bp), confirmando a presença do inserto nos plasmídeos utilizados

para expressão do Lopap em E. coli.

Page 102: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 101

Figura 13 - Perfil eletroforético do inserto codificante do Lopap.

Da esquerda para direita, produto amplificado por PCR a partir dos plasmídeos extraídos dos clones 1 a 6 de E. coli DH5α, utilizando primer específico para o Lopap. Gel de agarose 1%, DNA visualizado com brometo de etídeo em luz ultravioleta. À direita do gel: padrão O’GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas).

bp 3000 2500

2000

1500

1000 750

500

250

Page 103: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 102

O rLopap foi expresso em E. coli Origami e recuperado na forma

solúvel após extração por lise celular. A fração purificada por

cromatografia de afinidade em coluna de Ni-Sepharose apresentou

rendimento de aproximadamente 5 mg/L de meio de cultura. A Figura 14

mostra o perfil eletroforético do rLopap obtido por este sistema de

expressão, com massa molecular de 21 kDa. A proteína recombinante

obtida não apresentou atividade enzimática sobre a protrombina no teste

de atividade ativadora de protrombina com substrato cromogênico S-

2238, mas apresentou atividade antiapoptótica em cultura de HUVECs

(dados não mostrados). Este dado indica que o ambiente redutor em

bactérias Origami não é suficiente para garantir uma conformação

terciária favorável para manter a atividade catalítica do rLopap, apesar de

se observar o acúmulo da proteína recombinante expressa na fração

solúvel intracelular e não em corpúsculos de inclusão.

Page 104: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 103

Figura 14 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do rLopap expresso com cauda de 6xHis em E. coli Origami. P: padrão de massa molecular (“low molecular weight marker” – GE Healthcare), FS: fração solúvel obtida após lise celular e centrifugação, Ni-S: fração purificada em coluna Ni-Sepharose, eluída em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,5 com 145 mM NaCl e 0,3 M de imidazol, C8: fração purificada eluída em coluna C8 com 100% de metanol (HPLC). Gel: 15% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.

kDa P FS Ni-S C8

97,0 66,0 45,0

30,0

20,1

14,4

Page 105: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 104

4.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris

4.2.1 Clonagem e expressão do rLopap em P. pastoris

A seqüência de DNA que codifica o Lopap foi corretamente

subclonada no vetor pPIC9K. Das colônias de bactéria DH5α

transformadas, 15 foram utilizadas para purificação dos plasmídeos. A

análise em gel de agarose 1% indicou que os plasmídeos de todos os

clones apresentaram insertos de tamanho compatível, uma vez que as

bandas apresentavam cerca de 10 kb conforme o esperado. O

seqüenciamento dos clones demonstrou a inserção correta no vetor, na

posição adjacente ao promotor AOX1 (álcool oxidase 1), e em fase de

leitura. O seqüenciamento de cerca de 400 pb confirmou a seqüência

previamente conhecida para o Lopap.

A partir da levedura P. pastoris transformada com o plasmídeo

linearizado pPIC9k e semeada em placas, cresceram várias colônias. Das

colônias formadas, 5 foram selecionadas e induzidas à expressão do

rLopap com 0,5% de metanol. O promotor AOX1 é um promotor

altamente eficiente e um dos mais importantes da levedura P. pastoris,

cuja indução ocorre em presença de metanol, mas não de outras fontes de

carbono. A expressão foi feita durante um período de 96 h a 30 °C.

A atividade procoagulante da proteína recombinante obtida em cada

uma das 5 culturas foi avaliada através do ensaio de hidrólise da

protrombina em presença do substrato cromogênico S-2238 (Figura 15).

Das 5 culturas avaliadas, em apenas 1 não foi observada a atividade

enzimática do rLopap. Na cultura-controle, que não continha inserto do

rLopap, também não foi observada atividade ativadora de protrombina,

como esperado. O clone que apresentou maior atividade (C2) foi

selecionado para expressão em escala maior.

Page 106: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 105

Figura 15 - Atividade ativadora de protrombina de diferentes clones (C1 a C5) de Pichia pastoris transformada para expressão do rLopap. Como controle (Co) foi utilizada uma cultura expressando proteína distinta do rLopap. Este teste foi realizado com 70 µL do meio de cultivo concentrado 20x e dialisado contra solução salina. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 (40 µM) pela trombina gerada a partir da hidrólise da protrombina (90 pM) pelo rLopap. As amostras foram pré-incubadas com a protrombina a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

C1 C2 C3 C4 C5 Co

Culturas

A 4

05

nm

Page 107: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 106

4.2.2 Expressão do rLopap em meio complexo (BMGY/BMMY)

No período de 24 h após o início da incubação em meio de

crescimento BMGY, o cultivo apresentou uma DO600nm entre 1,0 e 2,0. A

Tabela 4 mostra os valores da concentração de proteínas totais no meio

de cultivo durante a fase de indução da expressão da proteína

recombinante em meio BMMY. Os dados correspondem à média de 4

cultivos independentes. Este meio apresenta em sua formulação proteínas

e hidrolisado protéico provenientes do extrato de levedura e peptona.

Observou-se uma diferença de aproximadamente 16% entre a

concentração de proteínas totais solúveis no meio obtida ao final do

processo de expressão e a concentração no início da indução da expressão

da proteína recombinante. Descontando-se as proteínas do meio de

cultura e considerando apenas a quantidade de proteínas que foram

expressas antes e após a indução, observa-se um aumento de 62% na

concentração de proteínas após 72 h de indução. Neste período de

indução foi obtido um total de aproximadamente 15 mg/L de proteínas

totais expressas no meio.

O material obtido após o período de indução da expressão foi

concentrado e dialisado contra salina. Após centrifugação, filtração, diálise

e liofilização foi recuperado 57% (22,23 mg/L) do total de proteínas

obtido (39 mg/L). Este material foi submetido à cromatografia de

afinidade em resina Benzamidina-Sepharose, sendo a fração 1 (não-retida

na coluna) eluída no tampão de equilíbrio Tris-HCl 50 mM, 500 mM NaCl,

pH 7,5, e a fração 2 (retida por afinidade) eluída em 50 mM de glicina pH

3,0. A benzamidina é um inibidor competitivo e reversível de serino

proteases. Portanto, formas enzimaticamente ativas do rLopap ao

passarem pela coluna, ligam-se pelo sítio ativo à benzamidina,

mimetizando uma ligação enzima-substrato. Com a mudança brusca de

pH, essa ligação se desfaz, eluindo a serino protease (rLopap).

Page 108: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 107

Tabela 4 - Concentração de proteínas no meio de cultivo durante a expressão do rLopap em P. pastoris em meio complexo BMMY.

Tempo de

indução (h)

Concentração de

proteínas (mg/ml)*

Concentração de proteínas

descontando-se o valor do

meio de cultura (mg/ml)*

0 0,091 0,024

24 0,090 0,023

48 0,099 0,032

72 0,106 0,039

*Estimado pela dosagem de Bradford, média calculada utilizando os dados de 4 cultivos independentes. Durante as 72 h de indução o total de proteínas produzido foi de 15 mg/L.

Após purificação em coluna de afinidade Benzamidina-Sepharose

(Figura 16), a atividade ativadora de protrombina foi observada na fração

2, e foi ausente na fração 1 (Tabela 5). Na fração 2 (ativa) foi recuperado

um total de 1,76 mg/L de proteínas, que correspondeu a

aproximadamente 8% do total de proteínas aplicado na coluna. Observou-

se que após o processo de purificação a resina da coluna de purificação

apresentou mudança de cor provavelmente por oxidação, perdendo parte

de sua funcionalidade. Isto indicou que a amostra utilizada danifica a

resina.

A Figura 17 mostra o perfil eletroforético do material proveniente da

expressão do rLopap em P. pastoris utilizando meio complexo BMMY e

após a purificação por cromatografia de afinidade em coluna de

Benzaminida-Sepharose. Observa-se que a fração 2 apresentou uma

banda predominante de aproximadamente 20 kDa que corresponde à

forma monomérica do rLopap.

Page 109: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 108

Figura 16 - Cromatografia em coluna de afinidade Benzamidina-Sepharose. Tampão de equilíbrio: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, tampão de eluição: glicina 50 mM pH 3,0, fluxo: 1 ml/min. Amostra: meio de cultivo de P. pastoris em meio BMMY após expressão do rLopap.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 20 25

Volume (ml)

A2

80

nm

Glicina 50 mM, pH 3,0

PI

PII

Fração 1

Fração 2

Page 110: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 109

Figura 17 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do material obtido após expressão do rLopap em Pichia pastoris em meio complexo BMMY e após purificação em Benzamidina-Sepharose. LMWM: marcadores de massa molecular (“low molecular weight marker” – GE Healthcare). Foram aplicados 6 µg de cada amostra. Gel: 12,5% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.

Page 111: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 110

Tabela 5 - Atividade ativadora de protrombina das frações da cromatografia em Benzamindina-Sepharose.

Amostra (4 µg) A 405 nm*

Fração 1 0,003

Fração 2 0,222

*Correspondente à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap.

A fração ativa (P2) (rLopap purificado por cromatografia em

Benzamidina-Sepharose) também apresentou atividade procoagulante no

teste de recalcificação com plasma humano normal citratado (Tabela 6). O

tempo médio de coagulação do plasma humano normal após recalcificação

na ausência da proteína foi de 330 seg, enquanto que em presença do

rLopap (4 µg), o tempo médio de coagulação foi de 120 seg. Portanto,

observou-se uma redução de 64% do tempo de coagulação em relação ao

controle. Com a fração 1, o tempo de coagulação foi próximo ao do

controle (300 seg).

Tabela 6 - Atividade procoagulante do rLopap sobre plasma humano normal citratado.

rLopap (P2)1 redução do tempo de coagulação*

0 µg 0%

2 µg 23%

4 µg 64%

*Tempo de coagulação após recalcificação do plasma. A redução foi calculada a partir da média dos tempos de coagulação para cada dose (duplicata) considerando como 100% o tempo de coagulação na ausência do rLopap (controle). 1Obtido após cromatografia em Benzamidina-Sepharose.

Page 112: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 111

A proteína recombinante obtida também apresentou atividade

antiapoptótica em cultura de HUVECs. A Tabela 7 mostra o resultado do

ensaio de viabilidade celular após tratamento da cultura de células

endoteliais com o rLopap (10 µg/ml) por 48 h. O controle positivo (10%

SFB) foi cultivado em uma condição ideal de crescimento e o controle

negativo (1% SFB) foi submetido a uma condição proapoptótica por

deprivação de soro. Nesta condição, o rLopap foi capaz de aumentar a

viabilidade celular, protegendo as células de morte por apoptose.

Tabela 7 – Efeito citoprotetor do rLopap em HUVECs.

Teste A 550 nm* Viabilidade celular

(%)

Controle positivo (SFB 10%) 0,079 ± 0,003 100

Controle negativo (SFB 1%) 0,035 ± 0,008 44,3

10 µg/ml rLopap (SFB 1%) 0,098 ± 0,020 125,3

*Leitura da reação colorimétrica do ensaio de viabilidade pelo método do MTT, média ± erro padrão de medidas em triplicata.

4.2.3 Expressão do rLopap em meio mínimo (BMG/BMM)

Durante a fase de crescimento em meio BMG, a DO600nm observada

foi de aproximadamente 9,0 após 24 h do início do cultivo e de

aproximadamente 30,0 após 48 h do início do cultivo. A Figura 18 mostra

a curva de crescimento de P. pastoris recombinante durante a fase de

expressão do rLopap em meio BMM nas três condições de pH testadas, à

temperatura de 25 °C. Observou-se pouca diferença de crescimento da

levedura em pH 6,0 e 7,0 e um crescimento mais lento em pH 5,0.

A Tabela 8 mostra a concentração de proteínas totais solúveis no

meio de cultivo ao final da expressão e a atividade ativadora de

Page 113: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 112

protrombina. Estes resultados indicam que a expressão em pH 5,0 é a

mais adequada para a obtenção do rLopap ativo.

Tabela 8 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina ao final da expressão do rLopap em P. pastoris em meio mínimo BMM.

pH do meio Concentração de

proteínas

(mg/ml)*

A 405 nm1 na

presença de Ca2+

A 405 nm1 na

ausência de Ca2+

pH 5,0 0,046 0,037 0,021

pH 6,0 0,045 0,024 0,010

pH 7,0 0,043 0,011 0,010

*Estimado pela dosagem de Bradford. 1Correspondente à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. O ensaio foi realizado com amostras de 70 µL do sobrenadante do cultivo.

A Figura 19 mostra o perfil eletroforético do material obtido após

expressão do rLopap em meio BMM nos diferentes pHs. Estas amostras

foram precipitadas com metanol/clorofórmio antes de serem submetidas à

eletroforese. No perfil eletroforético das amostras obtidas durante a

expressão em pH 5,0, observa-se um aumento na intensidade de

proteínas com massa molecular entre 30 e 50 kDa, que podem

corresponder a formas diméricas e glicosiladas do rLopap. Nas amostras

obtidas durante a expressão em pH 7,0 observa-se pouca alteração do

perfil eletroforético durante a indução.

Page 114: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 113

Figura 18 - Curva de crescimento de Pichia pastoris expressando

rLopap em meio mínimo BMM com diferentes pHs. Uma unidade de absorbância (DO600nm=1) equivale a 5 x 107 células/ml. A fase de indução da expressão foi realizada durante 107 h, a 25 °C, 250 rpm, adicionando-se diariamente 0,5-1,0% de metanol.

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

tempo (h)

DO

60

0 n

m

pH 5,0

pH 6,0

pH 7,0

Page 115: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 114

O material obtido após expressão em meio mínimo pH 5,0 foi

submetido à cromatografia em coluna de afinidade Benzamidina-

Sepharose. Foram aplicados na coluna aproximadamente 50 ml do

sobrenadante do meio de cultivo em pH 5,0, correspondendo a um total

de 1,9 mg de proteínas. Na fração 2 foram eluídos aproximadamente 0,3

mg de proteínas (15% do total). Figura 20 o perfil do imunobloting com o

anticorpo anti-Lopap das amostras obtidas antes e após a purificação do

rLopap, utilizando como controle o extrato das cerdas de L. obliqua, que

contém o Lopap nativo. Obserou-se uma banda mais intensa de

aproximadamente 40 kDa na fração ativa eluída da cromatografia. As

bandas de alto peso molecular devem corresponder a aglomerados da

proteína. A Figura 21 mostra a atividade ativadora de protrombina do

rLopap expresso em pH 5,0 e purificado em coluna de Benzamidina-

Sepharose.

Page 116: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 115

Figura 19 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) do sobrenadante do meio

de cultivo durante a expressão do rLopap em Pichia pastoris em meio mínimo BMM. Marcadores de massa molecular (kDa) “low molecular weight marker” (GE Healthcare). Foi aplicada a quantidade de proteínas correspondente a 1 ml de cada amostra obtida durante a fase de indução da expressão, nos intervalos de tempo indicados, precipitado com metanol/clorofórmio. Gel: 15% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.

Page 117: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 116

Figura 20 - Imunodetecção do rLopap expresso em pH 5,0 purificado por cromatografia em Benzamidina-Sepharose. Foi utilizado anticorpo primário anti-Lopap e anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina. Imunobloting revelado com substrato para fosfatase alcalina. Linha 1: 7,5 µL do marcador de massa molecular pré-corado (Kaleidoscopic, BioRad); linhas 2 e 3: extrato bruto das cerdas de L. obliqua (600 e 200 ng); linhas 4-6 (600 ng cada): expressão do rLopap em meio BMM, fração 1 não-ativa não-retida na coluna Benzamidina-Sepharose (linha 4), material antes da purificação (linha 5), fração 2 ativa eluída da coluna (linha 6).

1 2 3 4 5 6

Page 118: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 117

Figura 21 - Atividade ativadora de protrombina do rLopap expresso em pH 5,0 purificado por cromatografia em Benzamidina-Sepharose. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 (40 µM) pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina (90 pM) pelo rLopap (4 µg). A amostra foi pré-incubada com a protrombina (rLopap+FII) a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238. Para os controles negativos, foram aplicadas as mesmas quantidades dos reagentes, adicionando-se apenas a protrombina (FII) na ausência do rLopap, e as mesmas quantidades dos reagentes e amostra (rLopap), omitindo-se a protrombina. O branco do ensaio foi obtido na ausência tanto do rLopap quanto de FII.

Page 119: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 118

4.2.4 Expressão do rLopap em biorreator

Ao final de 48 h de incubação, os cultivos preparados para inocular o

fermentador apresentaram uma DO600nm média de 16,0. A fase de

crescimento em processo de batelada no biorreator teve duração de

aproximadamente 19 h e a fase de crescimento em processo de batelada

alimentada (fed-batch) teve duração de aproximadamente 4 h. Isto

demonstrou um bom desempenho e adaptação do clone de P. pastoris

recombinante no crescimento em biorreator com alta densidade celular. A

Tabela 9 mostra os principais parâmetros obtidos durante o processo de

fermentação, em intervalos de 24 h. A Figura 22 mostra a curva de

crescimento da levedura.

Na Tabela 10, pode-se observar o aumento da concentração de

proteínas solúveis no meio de cultivo durante a fase de indução da

expressão da proteína recombinante em fermentador, sob condições de

alta densidade celular. Ao final do processo, a concentração de proteínas

solúveis totais no sobrenadante do meio de cultivo (após centrifugação e

microfiltração) estimada pelo método de Bradford foi de 553 µg/ml.

Comparando-se estes resultados com os obtidos em cultivo sem o uso de

biorreator, observa-se que ao final do processo de expressão em

fermentador foi obtida uma quantidade de proteínas 14 vezes maior que a

obtida em meio complexo e 12 vezes maior que a obtida em meio mínimo.

A atividade específica do rLopap aumentou no decorrer do período de

indução, indicando que a proteína recombinante foi produzida com

atividade nesta fase.

Page 120: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 119

Tabela 9 - Parâmetros do processo de cultivo de P. pastoris em biorreator para expressão do rLopap.

Tempo (h) Aeração

(L/min)

Agitação

(rpm)

OD

(%)

DO

600 nm

Massa celular

(g/L)

0 5,0 300 88,7 1,1 -

24 5,0 1000 20,4 166,0 41,95

48 14,6 1200 22,3 334,0 72,75

72 10,0 1200 22,4 469,0 106,7

96 10,0 1200 23,2 572,5 114,2

Tabela 10 - Concentração de proteínas e atividade ativadora de protrombina durante a fase de indução da expressão do rLopap em biorreator.

Tempo (h) Concentração de

proteínas (mg/ml)*

A 405 nm1

0 0,101 0

3 0,128 0

24 0,177 0

48 0,265 0

56 0,319 0,013

70 0,495 0,041

*Estimado pela dosagem de Bradford. 1Correspondente à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. O ensaio foi realizado com amostras de 70 µL do sobrenadante do cultivo.

Page 121: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 120

0

20

40

60

80

100

120

140

0 20 40 60 80 100 120

Tempo (h)

Bio

mas

sa (

g/L)

0

100

200

300

400

500

600

700

D.O

. (60

0nm

)

X(g/L) D.O. (600nm)início fed-batch glicerol

início fed-batchmetanol

Figura 22 - Curva de crescimento de Pichia pastoris em biorreator para

expressão do rLopap. O crescimento foi medido pela DO600nm e através da biomassa que correspondeu à massa seca (X) em g/L. Processo realizado em 3 fases: 1) batelada, 2) batelada alimentada (fed-batch) com glicerol, 3) batelada alimentada com metanol. A terceira fase correspondeu à fase de expressão da proteína recombinante. Ensaio realizado em biorreator de 14 L, com volume inicial ≈ 5 L e volume final ≈ 8 L.

Page 122: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 121

Uma fração do material obtido no processo de fermentação (2 L) foi

clarificado através do sistema de filtração em fibras ocas. O restante do

material obtido ao final do processo de fermentação (aproximadamente 6

L dos 8 L obtidos) foi centrifugado e microfiltrado para remoção dos

resíduos celulares, obtendo-se aproximadamente 3,5 litros de

sobrenadante. A Tabela 11 mostra a recuperação de proteínas nestes dois

processos. Observou-se menor perda de proteína no processo de

centrifugação.

Tabela 11 - Recuperação de proteínas solúveis após clarificação do material obtido em biorreator.

Antes da clarificação Após clarificação

Método de

clarificação

Volume

inicial

(L)

Volume

final

(L)

Concentração

de proteínas

(mg/L)

Total de

proteínas

(mg)

Recuperação

(mg/L)*

centrifugação 6,00 3,50 553 1935 322

filtração em

membrana de

1,00 1,98 78 154

189

fibra oca 1,00 1,68 133 224

*Em relação ao volume inicial (total de proteínas dividido pelo volume inicial).

4.2.5 Testes de estabilidade

Amostras do rLopap expresso em biorreator foram testadas em

diferentes condições para avaliação da estabilidade da proteína e das

condições de processamento do material após expressão, observando-se

como parâmetros a solubilidade da proteína e sua atividade enzimática

específica sobre a protrombina. A proteína mostrou-se estável em água e

nos tampões Tris-HCl, fosfato e acetato, com concentração mínima de 0,1

Page 123: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 122

M de NaCl. Em concentrações menores de NaCl ocorreu precipitação de

proteínas. A concentração máxima de proteínas solúveis atingida foi de

600 µg/ml em tampão Tris-HCl com NaCl 150 mM, 400 µg/ml em fosfato

de potássio com NaCl 150 mM, e 200 µg/ml em tampão fosfato de sódio

com NaCl 150 mM.

A Figura 23 mostra a atividade ativadora de protrombina do rLopap

medida em ensaio com substrato cromogênico após incubação em

diferentes temperaturas. Após 2 h de incubação, observou-se apenas uma

sutil diferença de atividade nas amostras, indicando que a atividade do

rLopap é estável, por curtos períodos de tempo, em uma faixa de

temperatura de até 37 °C. Após 24 h de incubação, observou-se perda

substancial na atividade da amostra incubada a 37 °C e uma sutil redução

na atividade da amostra incubada à temperatura ambiente (25 °C). Após

120 h de incubação, houve também perda significativa na atividade da

amostra incubada à temperatura ambiente e uma sutil redução na

atividade da amostra incubada à -20 °C. Os resultados também

demonstraram que o processo de liofilização não implica em perda de

atividade do rLopap.

A Figura 24 mostra a atividade ativadora de protrombina do rLopap

medida em ensaio com substrato cromogênico após diálise e incubação

em diferentes pHs. As amostras em pH 7,0 apresentaram atividade em

todos os períodos de incubação testados, enquanto em pH 5,0 foi

observada atividade apenas após 48 h de incubação, indicando a

necessidade de um longo período para conformação adequada da

molécula neste pH. Quando re-dialisada em pH 7,0, esta amostra

apresentou maior atividade. Nos pHs 8,0 e 9,0, a atividade enzimática foi

reduzida substancialmente, efeito que não foi revertido quando estas

amostras foram re-dialisadas para pH 7,0. Estes resultados indicam que o

rLopap é estável em pH neutro e ligeiramente ácido, e instável em pH

alcalino, causando provavelmente alterações irreversíveis na conformação

da molécula.

Page 124: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 123

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

-80 -20 4 8 25 37 L/25 L/-80 C/4

Condição de incubação (temperatura oC)

A 4

05

nm

2h

24h

120h

Figura 23 - Efeito da temperatura na estabilidade da atividade ativadora de protrombina de amostras contendo rLopap expresso em Pichia pastoris.

As amostras em solução salina ou liofilizadas (L) foram incubadas por 2, 24 e 120 h em diferentes temperaturas, conforme indicado, e em seguida testadas no ensaio de ativação da protrombina. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. As amostras (20 µg) foram pré-incubadas com a protrombina (90 pM) a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238 (40 µM). Para os controles negativos (C/4), foram aplicadas as mesmas quantidades de amostra (pré-incubadas 4 °C nos diferentes intervalos de tempo) e dos reagentes, omitindo-se a protrombina.

°

Page 125: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 124

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

5 7 8 9

pH de incubação

A 4

05n

m

24 h pH teste

48 h pH teste

24h pH teste + 24h pH7,0

Figura 24 - Efeito do pH na estabilidade da atividade ativadora de protrombina de amostras contendo rLopap expresso em Pichia pastoris.

As amostras foram dialisadas em tampões com diferentes pHs, conforme indicado, e incubadas por 24 e 48 h a temperatura ambiente. Após as primeiras 24 h de incubação uma alíquota de cada amostra nos diferentes pHs foi dialisada novamente em pH 7,0. A 405 nm corresponde à hidrólise do substrato cromogênico S-2238 pela trombina gerada a partir da ativação da protrombina pelo rLopap. As amostras (12 µg) foram pré-incubadas com a protrombina (90 pM) a 37° C por 20 min e as leituras foram obtidas 20 min após adição do S-2238 (40 µM).

Page 126: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 125

A Figura 25 mostra o perfil eletroforético das amostras incubadas

por 24 h nos diferentes pHs. Observou-se que a intensidade da banda de

aproximadamente 30 kDa é proporcional à atividade ativadora de

protrombina medida nestas amostras, sendo ambas acentuadas em pH

7,0. O aumento na intensidade desta banda, deve corresponder ao

monômero do rLopap, e coincide com a diminuição na intensidade da

banda de aproximadamente 60 kDa, que pode corresponder a multímeros

ou agregados desta molécula. Estes resultados sugerem que a

conformação ativa do rLopap corresponde à sua forma monomérica.

Page 127: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 126

Figura 25 - Perfil eletroforético (SDS-PAGE) de amostras contendo rLopap expresso em Pichia pastoris incubadas em diferentes pHs para teste de estabilidade. MW: marcadores de massa molecular “low molecular weight marker” (GE Healthcare). A fração solúvel (20 µl = 5 µg) e o precipitado (pellet 5 µl) das amostras foram analisados 24 h após a diálise nos diferentes tampões (tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0 com 50 mM de NaCl, tampão Tris-HCl 20 mM com 50 mM de NaCl pH 7,0, 8,0 ou 9,0), e aplicados nesta ordem, respectivamente, conforme indicado na figura. AD (antes da diálise): amostra não-dialisada. Gel: 15% de acrilamida, corado com azul de Coomassie.

MW (kDa)

97

66

45 30

20

5,0 7,0 8,0 9,0 AD

pH

Page 128: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 127

4.2.6 Purificação do rLopap

A Tabela 12 mostra de forma sucinta os resultados do screening de

colunas de troca iônica e interação hidrofóbica, para purificação do

rLopap. De forma geral, obteve-se desempenho semelhante com as

colunas de troca aniônica, nas quais a fração ativa foi eluída antes do

início do gradiente de NaCl. Nas colunas de troca catiônica, a fração ativa

foi recuperada após o início do gradiente de NaCl, mas não foi obtida uma

boa eficiência de separação e recuperação. Nas colunas de interação

hidrofóbica não houve recuperação de fração ativa, o que se deve,

provavelmente, a uma interação muito forte da proteína recombinante

com a coluna, mesmo quando utilizadas as menores concentrações de

NaCl (0,5-3,0 M) ou sulfato de amônio (0,3-2,0 M) no tampão de

equilíbio.

A Figura 26 mostra o perfil cromatográfico obtido na primeira etapa

de purificação em coluna Hiprep QFF, utilizando método otimizado com

gradiente não linear (step wise). Foram aplicados 20 ml de amostra por

corrida, e as frações foram eluídas em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3,

com gradiente de 0,15 e 1 M de NaCl. A fração ativa (P1 QFF) foi

recuperada no primeiro pico (P1 QFF) no tampão de equilíbrio (150 mM de

NaCl). Esta fração (50 ml) foi concentrada por ultrafiltração e alíquotas

desta fração foram aplicadas em coluna de gel filtração Superose 12. A

Figura 27 mostra o perfil cromatográfico obtido na cromatografia de gel

filtração. A fração ativa recuperada correspondeu ao último pico (P1 QFF/

P4 Sup). O perfil eletroforético destas amostras está mostrado nas Figuras

26 e 27. A Tabela 13 mostra o rendimento e a atividade do rLopap nas

durante as etapas de purificação.

Page 129: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 128

Tabela 12 - Eficiência de colunas de troca iônica e interação hidrofóbica para purificação do rLopap expresso em P. pastoris.

Troca iônica Eficiência3

Colunas/tipo de troca Aniônica1 Catiônica1

Q Sepharose FF* S +++

Q Sepharose XL S +++

DEAE Sepharose FF W +++

ANX Sepharose 4 FF (high sub) W ++

SP Sepharose Fast Flow S ++

SP Sepharose XL S +

CM Sepharose Fast Flow W +

Interação hidrofóbica Eficiência2

Colunas Hidrofobicidade2

Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) H 0

Phenyl Sepharose 6 FF (low sub) H 0

Phenyl Sepharose HP# H −

Octyl Sepharose 4 FF M-H 0

Butyl Sepharose 4 FF M 0

Butyl Sepharose HP M −

Butyl-S Sepharose 6 FF L 0

*Fast Flow; #High Performance 1S: trocador forte, W: trocador fraco; 2L: baixa, M: média, H: alta; 3boa (+++), regular (++), ruim (+), nula (0) não houve recuperação, não foi testada (−).

Page 130: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 129

QFF Hiprep Step linda001:10_UV1_280nm QFF Hiprep Step linda001:10_Conc QFF Hiprep Step linda001:10_Fractions

0

200

400

600

800

mAU

0 50 100 150 200 250 300 ml

F2 A2 A3 A4 A5 A6F2 A9 A10 A11 A12 B12 B10 B9 B8 B7 B6 B5 B4 B3 B2 B1 C1 Waste

Figura 26 - Perfil cromatográfico em coluna HiPrep QFF do material

obtido no processo de cultivo de Pichia pastoris em biorreator para expressão do rLopap. Cromatografia de troca aniônica, utilizada como primeira etapa de purificação. Foram aplicados 20 ml de amostra e coletadas frações de 10 ml com gradiente não linear de 0,15 e 1 M de NaCl em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3. Coluna: HiPrep 16/10 Q-Sepharose Fast Flow (20 ml), fluxo: 5 ml/min. No quadro ao lado direito, perfil eletroforético da fração ativa P1QFF, eluída no primeiro pico.

P1QFF

kDa MW P1QFF

97 66

45

30 20

14

Page 131: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 130

Superose 12 linda v2006:10_UV1_280nm Superose 12 linda v2006:10_Fractions

0.0

5.0

10.0

15.0

mAU

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 ml

F2 A2 A4 A6 A8 A10A12B11 B9 B7 B5 B3 B1 C2 C4 C6 C8 C10C12D11 D9 D7 D5 D3 D1 E2 E4 E6 E8 E10E12F11 F9 F7 F5 F3

Figura 27 - Perfil cromatográfico em coluna Superose 12 da fração ativa obtida na primeira etapa de purificação (P1 QFF). Cromatografia de gel filtração, utilizada como segunda etapa de purificação. Foram aplicados 0,5 ml de amostra em coluna Superose 12 10/300 GL (24 ml) e as frações (0,5 ml) foram eluídas em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,3 com 150 mM de NaCl, fluxo de 0,5 ml/min. No quadro ao lado direito, perfil eletroforético da fração ativa P1QFF/P4 Sup, eluída no último pico.

P1 QFF/ P4 Sup kDa MW P4 Sup

66

45

30

20

14

Page 132: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 131

Tabela 13 - Purificação parcial do rLopap expresso em P. pastoris.

Fração Vol

(ml)

Total

ptn

(mg)

A

(U/ml)

AT

(U x ml)

AE

(U/mg)

FP Recuperação1

(%)

Clarif 20 5,960 160,9 3218,4 540 1 100

P1-QFF* 5 1,270 480,1 2400,3 1890 3,5 74,58

P4-Sup# 3 0,084 554,4 1663,2 19800 36,7 51,68

Vol: volume, ptn: proteína, A: atividade, AT: atividade total, AE: atividade específica, FP: fator de purificação; clarif: sobrenadante do cultivo em biorreator. 1Com base na atividade total. *concentrado 10x em amicon NMWC 5k, #concentrado 5x em amicon NMWC 5k.

A atividade citoprotetora do rLopap obtido após a primeira (P1 QFF)

e a segunda etapa de purificação (P1 QFF/P4 Sup) foi avaliada em células

endoteliais tEND, que tiveram apoptose induzida por TNF-α. Conforme

mostrado na Figura 28, a porcentagem de células viáveis nas culturas

tratadas com rLopap foi mantida próxima ao das células sem estímulo

apoptótico (sem TNF-α), cultivadas com 0% e 1% de SFB.

Page 133: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 132

Figura 28 - Viabilidade de células endoteliais (tEND) com apoptose

induzida por TNF-αααα e tratadas com rLopap. Células cultivadas com 0% e 1% de SFB em meio RPMI, na presença de TNF-α (0,05 µg/ml) e tratadas com as frações cromatográficas obtidas no processo de purificação do rLopap (1 µg/ml de P1QFF – 1ª etapa purificação, 0,3 µg/ml de P4Sup – 2ª etapa de purificação). O controle corresponde a culturas sem tratamento. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB. Cada coluna representa a média ± erro padrão (SEM). ###p<0,001 em relação ao controle sem TNF-α, ***p<0,001 em relação ao controle com TNF-α.

Page 134: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 133

4.3 Efeitos do rLopap em animais previamente tratados com

heparina (enoxaparina)

As Figuras 29 e 30 mostram, respectivamente, as medidas do tempo

de sangramento e do tempo de coagulação (TTPa) em coelhos

anticoagulados com heparina de baixo peso molecular (enoxaparina) e

tratados com protamina (inibidor ou antídoto de heparina), rLopap ou

salina em relação a um grupo controle, que não foi anticoagulado com

enoxaparina. O administração do rLopap em coelhos heparinizados, na

dose de 1 µg/kg reverteu parcialmente a incoagulabilidade destes

animais. O tempo de sangramento, mas não o TTPa destes animais

atingiu os valores basais em aproximadamente 20 min de forma

semelhante à protamina. Também foi observada redução no volume de

sangramento dos animais tratados com rLopap, após a incisão para

medida do tempo de sangramento (dados não mostrados). Não foi

observada alteração na concentração de fibrinogênio no plasma dos

animais tratados com rLopap na dose utilizada.

Page 135: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 134

Figura 29 - Tempo de sangramento em coelhos heparinizados tratados com rLopap. Grupos: controle não heparinizado (GC), anticoagulados com enoxaparina 20 mg/kg e tratados após 10 min com salina (GSP), protamina (GP) ou rLopap 1 µg/kg (LG). O tempo de sangramento foi medido alternadamente nas orelhas esquerda e direita dos animais de cada grupo (n=5), após incisão de 5 mm, nos tempos indicados no gráfico.

Page 136: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 135

Figura 30 - Tempo de coagulação (TTPa) em coelhos heparinizados tratados com rLopap. Grupos: controle não heparinizado (GC), anticoagulados com enoxaparina 20 mg/kg e tratados após 10 min com salina (GSP), protamina (GP), ou rLopap 1 µg/kg (LG). O TTPa foi medido no plasma de amostras de sangue coletadas dos animais de cada grupo (n=5), nos tempos indicados no gráfico.

Page 137: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 136

4.4 Identificação e caracterização da seqüência do Lopap

envolvida na modulação da sobrevivência celular

4.4.1 Obtenção e avaliação de peptídeos sintéticos derivados do Lopap

Quatro peptídeos derivados da seqüência primária do Lopap (P1, P2,

P3 e P4) foram obtidos na forma sintética. O desenho destes peptídeos foi

baseado nos domínios conservados característicos de lipocalinas (motifs)

encontrados na seqüência primária do Lopap (Figura 31). As propriedades

dos peptídeos obtidos como massa molecular, número de resíduos de

aminoácidos e sua posição na seqüência da molécula original estão

mostradas na Tabela 14.

Tabela 14 - Propriedades dos peptídeos sintéticos derivados da seqüência do Lopap.

Peptídeo Massa

molecular

N° resíduos de

aminoácidos

Posição na seqüência

primária do Lopap

Pureza

(HPLC)

P1 2452,8 20 5-24 >90%

P2 2165,4 19 97-115 >90%

P3 2305,7 20 128-147 >90%

P4 1310,5 11 109-119 >95%

Page 138: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 137

Figura 31 - Seqüência de aminoácidos dos peptídeos sintéticos

desenhados a partir da seqüência primária do Lopap. A) Posição dos peptídeos em relação aos motifs 1-3 na seqüência primária do Lopap. Os motifs estão indicados abaixo da seqüência de aminoácidos sublinhada; os números à esquerda e à direita indicam a posição na seqüência; os três aminoácidos dentro dos quadros pretos correspondem a tríade catalítica de serino protease predita; as seqüências demarcadas com cinza ou delimitadas no quadro preto correspondem às sequências dos peptídeos obtidos, conforme indicado. B) Seqüência de cada peptídeo P1-P4.

A

B

Page 139: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 138

Os peptídeos obtidos foram testados quanto à atividade

procoagulante em teste de recalcificação com plasma humano normal e

em ensaio de ativação da protrombina. Nenhum dos peptídeos apresentou

efeito sobre o tempo de coagulação e tampouco foi capaz de ativar a

protrombina (dados não mostrados). Por outro lado, dois peptídeos (P2 e

P4), que estão relacionados ao motif 2 do Lopap, apresentaram efeito

citoprotetor em células endoteliais induzidas à apoptose por deprivação de

soro (Figura 32). A Figura 33 mostra os resultados obtidos em culturas de

células endoteliais estimuladas com diferentes concentrações dos

peptídeos P2 e P4. Estes resultados mostraram que P2 e P4 atuam

igualmente aumentando a viabilidade celular por inibição de apoptose. A

maior porcentagem de células viáveis foi observada com a menor

concentração utilizada de ambos os peptídeos.

Page 140: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 139

Figura 32 - Efeito de peptídeos sintéticos derivados da seqüência do Lopap sobre a viabilidade de células endoteliais. As células endoteliais (HUVECs) foram cultivadas em meio RPMI com 1% de SFB (condição proapoptótica) e tratadas com os peptídeos P1 a P4 na concentração de 5 µg/ml durante 72 h O controle corresponde a culturas sem tratamento. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB. Cada coluna representa a média ± SEM. ***p<0,001 em relação ao controle.

Page 141: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 140

Figura 33 - Efeito de diferentes concentrações dos peptídeos P2 e P4 na viabilidade de células endoteliais. Células endoteliais (HUVECs) foram incubadas com diferentes concentrações de P2 e P4 (0,35-5 µg/ml) em meio RPMI com 1% de SFB (condição proapoptótica) durante 120 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB.

Page 142: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 141

4.4.2 Efeito de inibidores de serino proteases sobre a atividade

antiapoptótica de peptídeo derivado do Lopap

Este ensaio foi realizado para avaliar o envolvimento do resíduo de

serina na atividade antiapoptótica do Lopap. Visto que ambos os peptídeos

P2 e P4 foram igualmente ativos na citoproteção de células endoteliais,

sendo capazes de reverter o estímulo apoptótico nestas células cultivadas

em condição de deprivação de soro, o P2 foi utilizado neste teste por

apresentar na seqüência dois resíduos de serina, e dentre estes o resíduo

de serina reativa da tríade catalítica predita do Lopap. Além disso, o P2

tem maior massa molecular em relação a P4, o que torna mais eficiente a

etapa de recuperação do peptídeo após tratamento com o inibidor por

técnicas que se baseiam no diferencial de massa molecular. Conforme

mostrado na Figura 34, nenhum dos inibidores, aprotinina ou PMSF,

interferiu na atividade antiapoptótica do P2, demonstrando que sua ação

não é dependente do resíduo de serina. Não foi observada diferença

estatística significante entre as culturas de HUVECs tratadas com o P2,

pré-incubado ou não com PMSF e na presença ou ausência de aprotinina

no meio de cultura. Por outro lado, em todas estas condições as células

tratadas por P2 apresentaram viabilidade significativamente maior em

relação ao controle.

Page 143: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 142

Figura 34 - Efeito de inibidores de serino protease sobre a atividade antiapoptótica de P2. Células endoteliais (HUVECs) cultivadas em meio RPMI com 1% de SFB (condição proapoptótica), tratadas com o peptídeo P2 (0,3 µg/ml) durante 120 h na presença ou ausência de aprotinina (3 µg/ml), na presença ou ausência de P2 (0,3 µg/ml), e com P2 (0,3 µg/ml) pré-incubado ou não com PMSF (5 mM). O controle corresponde a culturas sem tratamento. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A porcentagem de células viáveis foi calculada em relação a células cultivadas com 10% de SFB. Cada coluna representa a média ± SEM. ***p<0,001 em relação ao controle.

Page 144: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 143

4.4.3 Análise estrutural e caracterização da seqüência do Lopap envolvida

na modulação celular

Os peptídeos ativos, P2 e P4 apresentam seqüência parcialmente

coincidente, que corresponde a uma região conservada em lipocalinas

(motif 2), previamente descrita (Reis et al., 2006, Figura 6). A Figura 35

mostra a região na estrutura terciária do Lopap onde se localiza a

seqüência destes peptídeos, indicando também sua posição em relação ao

provável sítio ativo da molécula, constituído pelos aminoácidos Ser119,

His168 e Glu171, os quais formam uma tríade catalítica do tipo serino

protease. A seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4 localiza-se na

folha β-7 ou β-H.

A busca por domínios de outras proteínas com seqüências similares

aos peptídeos citoprotetores derivados do Lopap, mostrou que esta

seqüência faz parte de um motif altamente conservado em vários grupos

de lipocalinas, caracterizado como seqüência-assinatura. A Tabela 15

mostra os resultados obtidos utilizando a ferramenta “Motif Search”. A

busca e alinhamento da seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4 com

domínios conservados de seqüências de proteínas no banco de dados do

NCBI utilizando a ferramenta CDART mostrou que a seqüência analisada

apresenta identidade com diversas lipocalinas, de diferentes origens

animais, dentre estas a apolipoproteína D, retinol-binding protein,

prostaglandina D sintase e a purpurina (Tabela 16). Muitas destas

lipocalinas são descritas pelo envolvimento na modulação da

sobrevivência celular e em processos de desenvolvimento e regeneração.

Por outro lado, a busca e alinhamento da seqüência comum entre os

peptídeos P2 e P4 com seqüências no banco de dados do NCBI utilizando a

ferramenta blastp (Tabela 17) mostrou a presença desta seqüência em

organismos de ampla gama de variação filogenética, deste vírus,

archeobactérias, bactérias, parasitas, fungos, insetos (incluindo

lepidópteros) e outros animais, incluindo muitas proteínas hipotéticas,

cuja função ainda não é conhecida.

Page 145: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 144

Figura 35 - Localização da seqüência dos peptídeos P2 e P4 na

estrutura tridimensional do Lopap. Seqüência dos peptídeos em vermelho, tríade catalítica predita em azul ou verde. A) P4, B) P2, C-F) região comum entre P2 e P4. Visualização pelo programa RasMol, a partir do modelo da estrutura terciária do Lopap (Reis et al., 2006).

Page 146: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 145

Tabela 15 - Domínios de proteínas com seqüências similares a P2 e P4 identificados pela busca no Motif Search Library.

Proteína Seqüência Banco de dados: número de acesso

Lopap

(P2-P4)*

YAIGYSC -

ICP YAIGYSC Blocks: IPB003057D, Prints: INVTBRTCOLOR4

RBP YAI-YSC Blocks: IPB002449F, Prints: RETINOLBNDNG6

ApoD YAI-YSC Blocks: IPB002969E, Prints: APOLIPOPROTD5

Lip YAIGY-- Blocks: IPB002345B, Prints: LIPOCALIN2

DUF52 Y--GYSC Blocks: IPB002737G

Triab YA--Y-C Pfam_fs: Triabin

*Seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4. ICP: invertebrate colouration protein signature, RBP: retinol binding protein signature, ApoD: apolipoprotein D signature, Lip: Lipocalin signature, DUF52: protein of unknown function DUF52, Triab: Triabin 7.1 0.12 1.

A localização e o padrão estrutural observado para o motif 2 do

Lopap (relacionado com os peptídeos P2 e P4) e para seqüências

similares na purpurina e na prostaglandina D sintase, que são lipocalinas

antiapoptóticas, foram semelhantes. A figura 36A mostra o alinhamento

da estrutura em folha β deste motif nestas lipocalinas, considerando-se

esta região como parte da estrutura terciária completa dos modelos do

Lopap, purpurina (P08938) e prostaglandina D sintase (P41222),

respectivamente. Os parâmetros relativos de acessibilidade ao solvente,

polaridade e hidropaticidade de cada um dos sete resíduos de aminoácidos

comuns na seqüência de P2 e P4 das seqüências correspondentes na

purpurina e prostaglandina D sintase também apresentaram um padrão

semelhante entre estas proteínas (Figura 36B).

Page 147: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 146

Tabela 16 - Alinhamento dos resultados de busca por domínios conservados (CDART) relacionados com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.

N° acesso Descrição Seqüência

59709575 Lobl|Lopap YAIGYSC

34810781 Pbra|Lipocalin_Flua YIIGYSC

74933972 Scyn|BBP-I YAVSYSC

267584 Omyk|Plasma-RBP1 YAIHYSC

82247601 Saur|RBP YAIHYSC

74894593 Msex|Insecticyanin_a YAINYNC

74894890 Gmel|Gallerin YAIAYTC

74938181 Bmor|Bombyrin YAIAYNC

74866083 Dmel|RE67583p YAVVYSC

1703341 Cpor|ApoD YALVYSC

157835127 Hsap|ApoD_1 YALVYSC

131649 Ggal|Purpurin YAITYAC

132408 Xlae|Plasma_RBP YAITYAC

114034 Hsap|ApoD_2 YALVYSC

114035 Rnor|ApoD YALVYSC

809399 Btau|RBP FAVQYSC

15988271 Hgam|Alpha-CRCN YACLYSC

74933973 Scyn|BBP-II YSIVFSC

23200069 Hgam|Beta-CRCN YSCVYSC

1346419 Same|Lazarillo YSIVWSC

74934096 Hcun|Hyphantrin YAVMWAC

82216128 Ggal|CALII YAIVYSQ

2497698 Fcat|PGDI YALLYTA

730305 Hsap|PGDI YALLYSQ

34811381 Ccot|Lipocalin YAVIYAT

82215065 Drer|PGDS YAIFHTI

2497699 Mmus|PGDI YALLFSR

116666961 Mmus|PGDS YALLFSR

20178282 Ggal|FABP YAVIFAT

3914330 Btau|PGDI YALLYTE

75067994 Ocun|PGDS FALLYSE

82217528 Xlae|Cpl-1_protein YILMYTV

3121746 Clup|Allergen-2 YLILYMI

20177989 Mmus|ESL-9 YIIFYMQ

172046756 Mmus|A1MG YAIFLTK

122801 Hsap|A1MG YAIFLTK

2506821 Btau|A1MG YAIFLTK

544480 Ppla|A1MG YAIIIMS

(continua)

Page 148: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 147

Tabela 16 - (continuação).

N° acesso Descrição Seqüência

56554584 Hsap|Tear_Lipocalin HYIFYSE

81904828 Mmus|Lipocalin FALVLSL

266472 Bmar|Lipocalin YTLMHTI

82217483 Ssal|A1MG YAIVMLS

2497700 Sscr|PGDS YALLHTE

21730727 Hsap|C8gamma_compl FAVLYLE

82214882 Ggal|PGDS YALVATQ

21465464 Sscr|Salivary_Lipocalin YVILHLV

3913984 Tvul|BLG YILGCLE

20139234 Hsap|OBP-2b HYIFYCK

5822450 Rnor|A2MG YVMFHLI

81886784 Cpor|A1MG YATVLTK

401346 Hsap|VEGP HYIFYCE

62286940 Mmus|ESL-13 HYIFYCE

82191279 Xlae|A1MG YVIMQMR

112725 Mmus|NGAL FAMVFFR

127528 Mmus|MUP-4 YIMFHLI

81884017 Rnor|OBP_1 HYIFYIK

62286893 Mmus|ESL-8 YTILKLT

137823 Rnor|VEGP-1 HYIFYYE

3123036 Mmus|VSP-2 HYIIYCE

129095 Rpip|Olfactory_prot FLMEFTK

127532 Mmus|MUP-3 YIMIHLI

1718160 Sscr|VEGP HYILYCE

3121745 Clup|Allergen-1 HYILYCE

159162204 Mmus|MUP FLMAHLI

7245434 Hsap|NGAL HAMVFFK

81908474 Mmus|ME-RABP YTVIDIT

160877764 Tvul|Trichosurin_1 YAKFIFY

125950 Meug|LLP-A YWILSCV

6226255 Tvul|Trichosurin_2 YAKFIFY

75039539 Ecab|Uterocalin FVIFCAH

20141968 Mmus|VSP-1 HYMLYCD

462472 Clup|BLG1 YLFFCEM

129658 Rnor|Probasin LLFDYFN

112880 Ocun|Orosomucoid LLVFFAG

2194089 Btau|BLG YLLFCME

6225831 Mmus|Probasin LLFHYFN

(continua)

Page 149: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 148

Tabela 16 - (continuação).

N° acesso Descrição Seqüência

125916 Mgig|BLG YFLFCLY

27923795 Meug|LLP-B HWILFCE

125905 Fcat|BLG2 YMFFCME

125904 Easi|BLG2 YMFFCVG

125913 Easi|BLG1 YLFLCMK

75058963 Fcat|BLG YLFFCLE

12084621 Sscr|OBP LIISNIN

231458 Hsap|Orosomucoid-2 MFGSYLD

82071154 Zviv|ARESP SISFFTS

75052482 Sscr|Alpha-1_acid_GP MLINSLH

3122324 Tvul|LLP HWILVCP

75058766 Pcyn|BLG-I YLFLCLE

75047049 Emax|OBP LLIHAIN

11513708 Sscr|BLG HLLLCME

81861688 Mmus|OBP-Ia LTFYSEN

130701 Hsap|Glycodelin FLFLCLQ

5107505 Btau|Allergen LVTYVEN

81916647 Maur|Female-SLP MTFHNVN

15826043 Maur|Aphrodisin IFFTNKN

37926392 Btau|OBP LVAHNIN

112881 Rnor|Orosomucoid MLAFNLT

129023 Rnor|OBP_2 IFFHNVN

81905017 Mmus|OBP-1F LFFHNVN

2497693 Mmus|Orosomucoid-3 MLFFDLK

112879 Mcar|Orosomucoid-1 MLAFDLK

(conclusão)

Page 150: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 149

Tabela 17 - Alinhamento dos resultados de busca pelo blastp com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.

N° acesso Descrição Seqüência Identidade

59709575 Lobl|Lopap YAIGY-SC -

16082396 Taci|hyp_Ta1424 YAIGY-SC 7/7

169659135 Lmaj|hyp YSIGY-SC 6/7

146097075 Linf|hyp YAIGY-TC 6/7

154343547 Pxut|BBP-1 YAIGY-TC 6/7

157874363 Lbra|hyp YAIGY-TC 6/7

118367871 Nvit|hyp_sugar_trans YAISY-SC 6/7

156550211 Robe|hyp_RUMOBE FAIGY-SC 6/7

220907990 Csp |DAG_transferase YAIAY-SC 6/7

153810865 Tthe|hyp_TTHERM_1 YAISY-SC 6/7

187936685 Aalc|OSBP YAIGY-RC 6/7

7228546 Sazo|hyp_SULAZ_1 YAIGY-S- 6/6

7228558 Sazo|hyp_SULAZ_2 YAIGY-S- 6/6

7228562 Nmen|hyp_autotransp YAIGY-S- 6/6

7228574 Sazo|hyp_SULAZ_3 YAIGY-S- 6/6

7228584 Dole|hyp_Dole YAIGY-S- 6/6

7228596 Sput|hyp_Sputcn32 YAIGY-S- 6/6

12958107 Hpar|VtaA15 YAIGY-S- 6/6

14578009 Iloi|OMP YAIGY-S- 6/6

14578013 Deth|hyp_DET1386 YAIGY-S- 6/6

14578015 Abau|hyp_ACICU YAIGY-S- 6/6

14578021 Mpal|APRT YAIGY-S- 6/6

14578023 Maer|hyp_MAE YAIGY-S- 6/6

194246023 Ssp |HMG-I_-Y_DBD YAIGY-S- 6/6

195728929 Tsp |GtrA YAIGY-S- 6/6

195728943 Arad|hyp_Arad_1 YAIGY-S- 6/6

195728950 Daci|FB-OMUP YAIGY-S- 6/6

195729051 Nmen|Surf_fibril_prot YAIGY-S- 6/6

195729077 Ccel|unknown YAIGY-S- 6/6

195729136 Dhaf|hyp_DSY3482 YAIGY-S- 6/6

195729159 Ssat|hyp_GCWU000342 YAIGY-S- 6/6

195729205 Fsp |TRP_transp_1 YAIGY-S- 6/6

195729228 Fsp |TRP_transp_2 YAIGY-S- 6/6

195729249 Obac|LacI-regulator YAIGY-S- 6/6

195729273 Ncin|hyp_NEICINOT YAIGY-S- 6/6

195729298 Osin|Na+_symporter YAIGY-S- 6/6

41023310 Aexc|MFS-1 YAIGY-S- 6/6

119668690 Fsuc|MET-A_transf YAIGY-S- 6/6

254669756 Fnuc|Na+_symporter YAIGY-S- 6/6

(continua)

Page 151: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 150

Tabela 17 - (continuação).

N° acesso Descrição Seqüência Identidade

62859005 Fsp |TRP_transp_3 -AIGY-SC 6/6

15676883 Abau|hyp_AbauAB YAIGY-S- 6/6

15920898 Amin|autotransporter YAIGY-S- 6/6

19705249 Pmer|hyp_PARMER -AIGY-SC 6/6

118347720 Fbac|hyp_FBALC1_1 -AIGY-SC 6/6

121718889 Hpar|hyp_HPS YAIGY-S- 6/6

145507488 Ssp |biogenesis_prot -AIGY-SC 6/6

149632119 Hnep|hyp_HNE YAIGY-S- 6/6

157103159 Psp |hyp__OMP YAIGY-S- 6/6

164426363 Pjoh|hyp_PRABACTJOHN YAIGY-S- 6/6

167377802 Nfla|hyp_NEIFLAOT -AIGY-SC 6/6

167536578 Nlac|hyp_NEILACOT -AIGY-SC 6/6

189208392 Hpar|adhesin YAIGY-S- 6/6

219122238 Hpar|possible_OMP YAIGYYSC 6/6

219406496 Bple|hyp_BACPLE YAIGY-S- 6/6

145595383 Hpar|VtaA16 YQIGY-SC 6/6

146294596 Hpar|VtaA9 YAIGY-S- 6/6

158522009 Nmen|OMPGNA992_1 -AIGY-SC 6/6

160901366 Dvar|microsomal_GST YAIGY-S- 6/6

161869903 Hpar|VtaA14 YAIGY-S- 6/6

166367169 Hpar|VtaA3 -AIGY-SC 6/6

167039972 Hpar|VtaA6 -AIGY-SC 6/6

184159783 Hpar|VtaA5 YAIGY-S- 6/6

188996289 Hpar|VtaA2 YAIGY-S- 6/6

219851059 Hpar|VtaA1 YAIGY-S- 6/6

220930600 Hpar|VtaA8_1 YAIGY-S- 6/6

222086264 Nmen|OMPGNA992_2 YAIGY-S- 6/6

225848234 Nmen|OMPGNA992_3 YAIGY-S- 6/6

225848596 Nmen|OMPGNA992_4 YAIGY-S- 6/6

225848891 Nmen|OMPGNA992_5 YAIGY-S- 6/6

254804880 Nmen|OMPGNA992_6 YAIGY-S- 6/6

56461371 Nmen|NhhA_OMP_1 YAIGY-S- 6/6

57233874 Nmen|NhhA_OMP_2 YAIGY-S- 6/6

89896228 Nmen|NhhA_OMP_3 YAIGY-S- 6/6

113955230 Nmen|OMP YAIGY-S- 6/6

114798255 Nmen|NhhA_OMP_4 YAIGY-S- 6/6

149278835 Fvir|hyp_ankyrin-rep YAIGY-S- 6/6

154489870 Oana|hyp_VMOL-1 YAIGY-S- 6/6

163787197 Aaeg|hyp_AaeL YAIGY-S- 6/6

(continua)

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RESULTADOS 151

Tabela 17 - Alinhamento dos resultados de busca pelo blastp com a seqüência comum entre os peptídeos P2 e P4.

N° acesso Descrição Seqüência Identidade

167854694 Ncra|hyp_NCU10458 YAIGY-S- 6/6

167856866 Tthe|hyp_TTHERM_2 YAIGY-S- 6/6

167856898 Acla|DnaJ_domain YAIGY-S- 6/6

198274525 Ptet|hyp_1 -AIGY-SC 6/6

218258313 Ptri|hyp_2 YAIGY-S- 7/8

225076833 Bflo|hyp_BRAFLDRAFT YAIGY-S- 6/6

225154717 Stro|hyp_Strop YAIGY-S- 6/7

225156041 Edis|hyp_W760. -AIGY-SC 6/6

225365175 Mbre|hyp YAIGY-S- 6/6

227874522 Ptri|hyp -AIGY-SC 6/6

229828030 Saur|hyp_SaPI1_ORF8 -AIGY-SC 6/6

237739676 Nmen|hyp -AIGY-SC 6/6

237741427 Nmen|NhhA_OMP_5 -AIGY-SC 6/6

237743706 Hpar|VtaA7 -AIGY-SC 6/6

239503892 Nmen|adhesin YAIGY-S- 6/6

240949829 Stok|CytC_oxidase-I YAIGY-S- 6/6

241771701 Fnuc|Na+_dep_W_transp -AIGY-SC 6/6

241901251 Hpar|VtaA4_precursor YAIGY-S- 6/6

254302194 Xtro|angel_homolog_1 -AIGY-SC 6/6

195729159b Fbac|hyp_FBALC1_2 -AIGY-S- 5/6

163787197b Hpar|VtaA8_2 YATGY-S- 5/5

222086264b Arad|hyp_Arad_2 YAVGY--- 4/5

(conclusão)

Page 153: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 152

Figura 36 - Comparação das propriedades físicas e estruturais da região do Lopap envolvida na modulação celular e a região correspondente em lipocalinas antiapoptóticas. A) Alinhamento estrutural da seqüência referente ao motif 2 do Lopap (verde) com seqüências correspondentes da purpurina (rosa) e prostaglandina D sintase (cinza). B) curvas dos valores relativos de hidropaticidade (H), polaridade (P) e acessibilidade ao solvente (RSA) considerando cada aminoácido da seqüência comum entre os peptídeos citoprotetores derivados do Lopap P2 e P4.

A B

Page 154: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 153

4.5 Efeito de peptídeo sintético derivado do Lopap sobre a síntese

de proteínas de matriz extracelular in vitro e in vivo

4.5.1 Aumento da síntese de proteínas de matriz extracelular em cultura

de fibroblastos

Dentre os peptídeos ativos (P2 e P4), o P4 foi escolhido para

continuidade dos ensaios por ter menor tamanho em relação ao P2 e

assim, apresentar menor custo para a obtenção por síntese química e uma

seqüência mais delimitada a ser investigada. Culturas primárias de

fibroblastos humanos foram incubadas com o P4 nas concentrações de

0,35 µg e 5 µg por 4 dias. Os resultados da imunofluorescência obtidos

mostraram que houve um aumento significativo na síntese de colágeno,

fibronectina e tenascina pelos fibroblastos tratados com o peptídeo, sendo

maior o efeito na concentração de 0,35 µg de P4 (Figura 37).

Page 155: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 154

Figura 37 - Imunofluorescência para fibronectina, tenascina e

procolágeno em cultura fibroblastos tratados com P4. A) controle (salina). B) 0,35 µg de P4. C) 5 µg de P4. Gráficos de Box Plot: quantidades de cada molécula produzida na ausência e presença de P4 (0,35 e 5,0 µg) analisadas estatisticamente. Eixo y= %, ou seja, a fração de área da molécula produzida.

0

2

4

6

8

10

12

0

5

10

15

20

25

30

0

10

20

30

40

50

60

70 70

60

50

40

30

20

10

0

30

25

20

15

10

5

0

12

10

8

6

4

2

0 controle controle controle P4 0,35µµµµg P4 0,35µµµµg P4 0,35µµµµg P4 5,0µµµµg P4 5,0µµµµg P4 5,0µµµµg

Fibronectina Tenascina Procolágeno

A A A

B B B

C C C

Page 156: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 155

4.5.2 Aumento da síntese de colágeno na derme de camundongos

Para avaliar se o aumento da síntese de proteínas de matriz

extracelular induzido pelo peptídeo sintético derivado do Lopap (P4),

observado in vitro em cultura de fibroblastos, é reprodutível em modelo

animal, a síntese de colágeno foi avaliada na derme de camundongos

tratados localmente (via intradérmica) com este peptídeo. Foi observado o

efeito do tratamento com diferentes doses e em diferentes intervados de

tempo após o tratamento. Comparando-se os valores da percentagem de

colágeno na região da derme de camundongos tratada com a dose de 0,3

µg do P4 e a região controle do mesmo animal, tratada com salina, pelo

teste T pareado, foi observada quantidade significativamente maior de

colágeno na área tratada com P4 (P=0,018), em todos os animais

avaliados de 1 a 12 semanas após o tratamento (Figura 38). Confrontando

os valores de fração de área (porcentagem) de colágeno na derme nos

diferentes tempos de observação, houve uma correlação negativa linear

significante (P=0,035) entre a porcentagem de colágeno e o tempo de

tratamento com o peptídeo.

Com o objetivo de construir curva dose-resposta, o efeito de

diferentes doses do P4 (0,04–25,00 µg/animal) sobre o ganho de

colágeno na derme tratada foi avaliado 1 e 4 semanas após o tratamento.

Comparando-se os valores da porcentagem de colágeno na derme tratada

com P4 e os valores dos seus respectivos controles, pelo teste T pareado,

foi observada quantidade significativamente maior de colágeno na região

tratada com o peptídeo, tanto após 1 semana (P=0,002), quanto após 4

semanas (P=0,001). Confrontando os valores de fração de área de

colágeno na derme destes animais com as doses aplicadas não houve

correlação significante entre a dose e a resposta, tanto após 1 semana,

como após 4 semanas. As curvas dose-resposta estão mostradas na

Figura 39.

Page 157: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 156

Figura 38 - Aumento de colágeno na derme de camundongos tratados

com P4. Cortes histológicos mostrando as fibras colágenas (coloração pelo vermelho Picrosirius), representativo de um animal. A) área da derme controle (tratada com salina), destacando: colágeno (C), folículo capilar (F) e epiderme (E); B) área tratada com P4 (0,3 µg i.d.).

E

F

C

B

A

Page 158: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 157

0,04

0,2

1 5

25

0

5

10

15

20

0,01 0,1 1 10 100

dose P4 (ug)

gan

ho

de c

olá

gen

o (

%)

0,04

0,2

1

5

25

0

5

10

15

20

0,01 0,1 1 10 100

dose P4 (ug)

gan

ho

de c

olá

gen

o (

%)

Figura 39 - Ganho de colágeno na derme de camundongos tratados com

diferentes doses de P4. A) após 1 semana do tratamento (i.d.), B) após 4 semanas. Ganho de colágeno correspondente à diferença entre a porcentagem de colágeno na área tratada em relação à área controle (tratada com salina) no mesmo animal.

A

B

Page 159: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 158

Com o objetivo de avaliar o efeito de doses cumulativas de P4 sobre

o ganho de colágeno na derme dos animais e a duração do tratamento, a

fração de área de colágeno na derme foi quantificada nos animais tratados

com até 4 doses (0,3 µg/dose) do peptídeo, 1 e 12 semanas após o último

tratamento. A Figura 40 mostra a diferença de colágeno presente na área

dos animais tratados com doses cumulativas de P4 em relação a seus

valores basais (controle). Com a dose cumulativa de 0,60 µg de P4, o

efeito do tratamento no ganho de colágeno persistiu por mais de 3 meses,

sendo observada quantidade significativamente maior (P=0,011) de

colágeno após 12 semanas do tratamento. Confrontando os valores de

fração de área de colágeno na derme destes animais com os diferentes

tempos de observação, não houve correlação significante (P=0,706) entre

a porcentagem de colágeno e o tempo de tratamento.

Os resultados demonstraram que o tratamento in vivo com P4 por

via intradérmica promove o aumento de colágeno na derme, e que este

efeito não é dose dependente. No tratamento com única dose houve

correlação negativa entre a porcentagem de colágeno dérmico e o tempo

decorrido após o tratamento. Por outro lado, quando 2 doses cumulativas

foram administradas em intervalo de 1 semana, o aumento de colágeno

se mantém por pelo menos até 3 meses do início do tratamento.

Os resultados obtidos de grupos de animais tratados com P4 quanto

à hemostasia global, hemograma, peso corporal, alterações macroscópicas

na área tratada e no comportamento dos animais foram semelhantes ao

observados nos grupos controle, onde os animais foram tratados apenas

com salina. Não foi observada alteração significativa em nenhum dos

parâmetros avaliados, indicando que o P4 não apresentou efeito sobre a

hemostasia dos animais e tampouco toxicidade.

Page 160: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

RESULTADOS 159

Figura 40 - Ganho de colágeno na derme de camundongos tratados com

doses cumulativas de P4. A fração de área de colágeno na derme dos animais foi avaliada 1 e 12 semanas após o último tratamento com 1-4 doses de 0,3 µg i.d. de P4. Ganho de colágeno correspondente à diferença entre a porcentagem de colágeno na área tratada em relação à área controle (tratada com salina) no mesmo animal. Cada coluna representa a média ± SEM.

Page 161: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 160

5 DISCUSSÃO

5.1 Proposta do trabalho

Este trabalho tem duas vertentes, uma focada na pesquisa básica e

outra focada na pesquisa aplicada. Tendo em vista os usos do Lopap como

ativador de protrombina e como proteína antiapoptótica, sob proteção

patentária (Chudzinski-Tavassi e Reis, 2002; Chudzinski-Tavassi et al.,

2004, 2005), estudos in vitro e in vivo, além de contribuírem para

esclarecimento dos mecanismos de ação envolvidos nos efeitos

observados para o Lopap, têm importância como prova de conceito para

indicações de uso desta molécula. Na vertente da pesquisa aplicada e

desenvolvimento biotecnológico, os resultados apresentados neste

trabalho são interessantes, primeiramente porque o Lopap se trata de

uma molécula nova do ponto de vista bioquímico e farmacológico, com

várias aplicações potenciais. Em segundo lugar, porque atualmente,

muitos agentes hemostáticos e reagentes de kits diagnósticos

comercializados ainda dependem de sua obtenção na forma nativa de

fontes naturais, como plasma animal e venenos de serpentes (Marsh,

2001; Schöni, 2005; Yu et al., 2007; Ofosu et al., 2008), as quais, além

das dificuldades técnicas devido à limitada disponibilidade e a

heterogeneidade das matérias primas e, muitas vezes, altos custos de

obtenção, estão sujeitas à presença de contaminantes biológicos (Ofosu et

al., 2008).

Na vertente da pesquisa básica, um dos principais objetivos deste

trabalho é contribuir para a caracterização do Lopap, visto que é cada vez

mais evidente ser uma das principais toxinas ativas do veneno de L.

obliqua, cujo mecanismo de ação diverge daqueles de ativadores de

protrombina conhecidos, consistindo numa importante ferramenta para

estudos do processo hemostático. Muitas propriedades do Lopap também

divergem das observadas em membros da família das lipocalinas e ao

mesmo tempo de serino proteases, pois até o momento, esta proteína é o

Page 162: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 161

único membro da família das lipocalinas que apresenta atividade

proteolítica. Desta forma, o Lopap poderá compor uma nova classe ou

subclasse de proteínas. Por outro lado, o Lopap apresenta muitas

características comuns a membros da família das lipocalinas, como a

estrutura típica de β-barril, a presença dos três SCRs ou motifs na

seqüência de aminoácidos, e a capacidade de modulação da sobrevivência

celular.

Partindo deste fato, nos propusemos a pesquisar a importância

destes motifs nas atividades do Lopap e na vinculação de propriedades

comuns com outras lipocalinas, lançando mão do compartilhamento

destas propriedades estruturais. Assumindo que as lipocalinas, além de

apresentar características estruturais semelhantes, podem também

apresentar efeitos biológicos comuns, avaliamos o efeito do Lopap na

modulação da síntese de moléculas de matriz extracelular, visto que

muitos trabalhos têm reportado o envolvimento de lipocalinas em

processos de desenvolvimento, remodelamento e regeneração tecidual

(Rassart et al., 2000; Pagano et al., 2002, 2003).

Tendo em vista as limitações de obtenção do Lopap pelo processo de

expressão em E. coli BL21 estabelecido, este trabalho também teve a

proposta de implementar um processo de obtenção desta proteína na

forma recombinante (rLopap) em levedura, que fosse padronizado e

escalonável, visando a obtenção da proteína recombinante sem cauda de

poli-His, com enovelamento e atividade enzimática mais próximos da

proteína nativa, e melhor estabilidade. Desta forma, investimos na

clonagem, e expressão do rLopap em biorreator, utilizando sistema de

expressão em levedura metilotrófica Pichia pastoris (Cregg et al., 1985)

com vetor de expressão pPIC9k. Este vetor insere um peptídeo sinal na

seqüência de leitura do inserto recombinante, para que a proteína

expressa seja secretada na forma solúvel para o meio extracelular

(Cereghino e Cregg, 2000). A levedura P. pastoris tem se mostrado como

um sistema de expressão conveniente na produção de proteínas

recombinantes eucarióticas, inclusive com finalidade terapêutica

Page 163: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 162

(Gellissen, 2000; Cereghino e Cregg, 2000), pois pode produzir proteínas

recombinantes muito similares à sua forma nativa (Chen et al., 2004).

Dentre as vantagens deste sistema pode-se citar a estabilidade da

transformação da levedura com o gene recombinante, pois o plasmídeo

linearizado se insere no DNA genômico da levedura, eliminando o risco de

perda plasmidial e a necessidade de novas transformações (Cereghino e

Cregg, 2000). Outras vantagens são o baixo custo relativo do processo de

produção, a facilidade de escalonamento, a composição química definida

do meio de cultura, e a realização de modificações pós-traducionais na

proteína recombinante como enovelamento, glicosilação e secreção para o

meio extracelular (Romanos, 1995; Nico-Farber et al., 1995; Cereghino e

Cregg, 2000; Macauley-Patrick et al., 2005; Jahic et al., 2006), que não

ocorrem em organismos procarióticos. Estas modificações pós-

traducionais ocorrem em sistemas celulares compartimentalizados

(Damasceno et al., 2007), e com a participação de proteínas

especializadas como chaperonas e a dissulfeto isomerase (Inan et al.,

2006; Gasser et al., 2007; Huo et al., 2007). Desta forma, um número

crescente de proteínas recombinantes tem sido obtido utilizando este

sistema, dentre estas, o fator de crescimento insulina-like (IGF),

antígenos vacinais da hepatite B e a albumina sérica humana (Gellissen,

2000; Kobayashi, 2006; Gurramkonda et al., 2009; Liu et al., 2009), além

de diversas enzimas (Cereghino e Cregg, 2000; Chen et al., 2004;

Macauley-Patrick et al., 2005; Lattard et al., 2006; Ali et al., 2007).

A expressão do rLopap em E. coli Origami foi realizada

paralelamente a obtenção do rLopap em P. pastoris, com o objetivo de

comparar propriedades como estabilidade e atividade específica de ambas

as proteínas. Com a metodologia utilizada, obtivemos a proteína

recombinante na forma solúvel, mas enzimaticamente inativa. O ambiente

citoplasmático menos redutor, que diferencia esta cepa de bactéria da E.

coli BL21 através expressão das enzimas tioredoxina redutase (trxB) e

glutationa redutase (gor) (Xiong et al., 2005), parece não ser ainda

Page 164: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 163

suficiente para favorecer a obtenção do rLopap na forma enzimaticamente

ativa.

5.2 Obtenção do rLopap em Pichia pastoris

Os ativadores de protrombina descritos na literatura são, em sua

maioria, toxinas de venenos de serpentes, com atividade do tipo

metaloprotease ou serino protease (Kini et al., 2001). Várias destas

proteínas contêm muitos resíduos de cisteína e são altamente glicosiladas

(Kornalik e Blomback, 1975; Silva et al., 2003), o que dificulta a obtenção

de recombinantes enzimaticamente ativos. Além disso, o domínio

proteinase destas proteínas tem se mostrado instável, podendo sofrer

autólise (Fox e Serrano, 2005). Há muitos trabalhos na literatura

descrevendo a identificação, a classificação, a clonagem e o isolamento

destas proteínas (Yamada et al., 1997; Zhang et al., 1998; Hasson et al.,

2003; Modesto et al., 2005; Kini, 2005), mas poucos descrevem sua

obtenção na forma recombinante, como Filippovich et al. (2005), que

reportaram a expressão e purificação parcial de uma toxina FXa-like do

veneno de serpente da família Elapidae, classificada no grupo C de

ativadores de protrombina, utilizando sistema de expressão em células de

mamífero. Desta forma, o desenvolvimento de um processo de obtenção

do Lopap tem importância, tanto para pesquisa básica, quanto para

futuras aplicações biotecnológicas desta proteína.

Da mesma forma, apesar do veneno de L. obliqua ser composto por

diversas proteínas com uma ampla gama de atividades preditas através

de estudos transcriptômicos e proteômicos (Veiga et al., 2005; Ricci-Silva

et al., 2008), poucas proteínas nativas foram purificadas até o momento,

as quais envolveram várias etapas de purificação (Reis et al., 2001b;

Seibert et al., 2006; Alvarez Flores et al., 2006). A maioria dos estudos

publicados foi realizada com o extrato bruto das cerdas de L. obliqua

(Veiga et al., 2003; Castro Bastos et al., 2004; Silva et al., 2004; Ramos

et al., 2004; Gouveia et al., 2005; Bohrer et al., 2006; Pinto et al., 2006;

Page 165: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 164

Pinto et al., 2008). Até o momento, o Lopap é a única toxina de L. obliqua

obtida na forma recombinante, para o qual foi utilizado sistema de

expressão em E. coli (rLopap E) (Reis et al., 2006). No entanto, como

discutido anteriormente, este sistema apresentou limitações quanto ao

refolding, estabilidade, reprodutibilidade do processo e atividade específica

da proteína recombinante, a qual foi obtida após purificação em coluna de

Ni-Sepharose, com rendimento variando de aproximadamente 1 a 3 mg/L

de meio de cultivo. Esta proteína (rLopap E) apresentou tendência de

precipitação em concentrações maiores que 0,2 mg/ml e em temperaturas

extremas (<20 °C e >37 °C), perdendo atividade inclusive após processo

de liofilização. O rLopap E apresentou baixa atividade específica (1800)

em relação à proteína nativa purificada a partir do extrato das cerdas de

L. obliqua (3000) (Reis, 2002), considerando-se os mesmos parâmetros e

metodologia para avaliação de atividade (AE: mAU405nm/min/mg) descritos

neste trabalho (item 3.8.1).

Conforme os resultados apresentados, neste trabalho,

desenvolvemos um processo de obtenção do rLopap, utilizando sistema de

expressão em P. pastoris (rLopap P). Este processo foi delineado,

utilizando tecnologias atuais e passíveis de escalonamento e

automatização, embora ajustes ainda necessitem ser realizados, e envolve

as etapas de: 1) fermentação com alta densidade celular, com fase de

batelada e batelada alimentada; 2) processamento (downstream) do meio

fermentado com fases de clarificação e concentração; 3) purificação do

rLopap por cromatografia líquida em duas etapas. O rLopap P obtido deve

apresentar estrutura tridimensional adequada, uma vez que foi observada

alta atividade específica sobre a protrombina (19800). Com o processo de

produção padronizado até o momento, conseguiu-se obter

aproximadamente 5 L de material fermentado livre de células, por cada

processo fermentativo com alta densidade celular de até 10 L. O

rendimento de proteína recombinante ativa recuperada ao final do

processo foi de aproximadamente 4 mg/L. Apesar de não se ter obtido

alta produtividade da proteína recombinante no processo, os resultados

Page 166: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 165

são animadores, em vista da alta atividade específica e melhor

estabilidade apresentada pelo rLopap expresso em P. pastoris, e a

reprodutibilidade do processo. De acordo com os dados reportados na

literatura, não há uma uniformidade na produtividade da proteína

recombinante no sistema de expressão em levedura P. pastoris. A

recuperação da proteína recombinante varia, em geral, de microgramas a

gramas por litro de sobrenadante da cultura, dependendo da proteína que

está sendo expressa (Cereghino e Cregg, 2000; Macauley-Patrick et al.,

2005). Vários trabalhos têm reportado a obtenção de proteínas por este

sistema, em especial de enzimas, com rendimentos próximos ou menores

que o obtido para o rLopap neste trabalho (Guo et al., 1995; Rosenfeld et

al., 1996; Liao et al., 1996; Mozley et al., 1997; Morel e Massoulié, 1997;

Sun et al., 1997; Thomas e Crawford, 1998; Vandersall-Nairn et al.,

1998; Heimo et al., 1998; Nourizad et al., 2003).

Sabe-se que proteínas recombinantes obtidas em P. pastoris podem

apresentar diferentes padrões de glicosição com cadeias oligossacarídicas

de diversos tamanhos, constituídas principalmente por resíduos de

manose (Macauley-Patrick et al., 2005). Isto pode resultar da alteração da

massa molecular da proteína, observando-se, em muitos casos, diferentes

bandas da proteína no perfil eletroforético (Porres et al., 2002; Brucato et

al., 2002; Kamei et al., 2003). O diferencial de massa molecular da

proteína observado nos perfiz eletroforéticos das amostras analisadas nas

diferentes etapas de produção podem ser resultantes da glicosilação do

rLopap, assim como da formação de complexos desta proteína com outras

moléculas, ou da ocorrência de formas multiméricas do rLopap (dímeros,

trímeros, tetrâmeros). O tratamento das amostras com enzimas

deglicosilases, como a endoglycosidase H, poderá esclarecer esta questão.

Amostras com rLopap mostraram inicialmente uma tendência de

precipitação. Contudo, as condições experimentais que induziam à

instabilidade do rLopap foram investigadas e definidas a partir dos

resultados obtidos, permitindo assim a otimização do processo e a

obtenção da proteína na forma solúvel e ativa. Além disso, os testes de

Page 167: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 166

estabilidade realizados com rLopap P, geraram uma série de informações

práticas relevantes a respeito das propriedades bioquímicas e biofísicas

desta molécula, por exemplo, a solubilidade dependente de concentração

salina, a atividade pH-dependente e a estabilidade em relação à

temperaturas. Após 2 h de incubação, foi observada apenas uma sutil

diferença de atividade entre amostras incubadas a 37 °C e nas demais

temperaturas, indicando que a atividade do rLopap é estável, por curtos

períodos de tempo, em uma faixa de temperatura compatível com a

temperatura corporal de animais, o que é um dado interessante para uma

aplicação in vivo.

Os ensaios em cultura de células endoteliais realizados

demonstraram que rLopap P também apresenta atividade citoprotetora de

forma semelhante à observada para o Lopap nativo. Estes resultados

abrem perspectivas para a realização de estudos futuros para esclarecer

aspectos quando ao mecanismo de ação do Lopap na modulação celular. A

avaliação do efeito do rLopap sobre o ciclo celular por técnicas de

citometria de fluxo, e das vias de sinalização de morte celular, utilizando

inibidores específicos, poderá contribuir para esclarecimento do

mecanismo da ação desta proteína em células.

5.3 Efeito do rLopap in vivo

Os acidentes com a lagarta Lonomia obliqua são caracterizados por

incoagulabilidade sanguínea e síndrome hemorrágica, devido à ação

procoagulante do veneno de L. obliqua (Prezoto et al., 2002; Zannin et

al., 2003; Chudzinski-Tavassi e Carrijo-Carvalho, 2006). O Lopap tem sido

proposto como a principal toxina envolvida nos efeitos do envenenamento

(Carrijo-Carvalho e Chudzinski-Tavassi, 2007), através de seu

envolvimento na coagulopatia de consumo com a geração de trombina e a

formação de microtrombos em vasos de pequeno calibre (Reis et al.,

1999; Reis et al., 2001a).

Page 168: Linda Christian Carrijo Carvalho Linda Christian Carrijo Carvalho

DISCUSSÃO 167

Neste trabalho, a atividade procoagulante do rLopap P foi avaliada

utilizando como modelo animal coelhos anticoagulados com enoxaparina.

O tratamento dos animais com o rLopap P confirmou que esta proteína

atua in vivo como um agente procoagulante, pois em baixas doses (1

µg/kg) o rLopap P foi capaz de reverter parcialmente a incoagulabilidade

sanguínea causada pela heparina de baixo peso molecular, conforme

observado através da redução do tempo de sangramento nestes animais.

A enoxaparina atua como anticoagulante potencializando o efeito da

antitrombina III, que é o inibidor endógeno da trombina e dos fatores IX e

X, e também através da ação inibitória direta sobre o fator Xa (Carter et

al., 2008). A princípio, o mecanismo pelo qual o Lopap reverte o efeito da

heparina é através da geração de trombina ativa no sistema, que

contrapõe a trombina que está sendo inibida pela ligação à antitrombina

III, e contorna a ação inibitória da enoxaparina sobre o fator Xa na

cascata de coagulação, pois age como ativador direto da protrombina em

lugar do FXa. O sulfato de protamina é o único medicamento antagonista

do efeito anticoagulante da heparina descrito na literatura até o momento

(Byun et al., 2000). Contudo, além dos efeitos colaterais indesejados, que

restringem seu uso a muitos pacientes, como hipotensão,

broncoconstrição e hipertensão pulmonar, este medicamento é pouco

efetivo para heparina de baixo peso molecular, que é mais utilizada pelas

vantagens sobre a heparina não-fracionada, pela maior facilidade de

administração e monitoramento nos pacientes (Hunt, 1998), sendo

necessário o uso de altas doses. Os dados obtidos até o momento

apontam o Lopap como um possível antagonista (indireto) a ser utilizado

no controle emergencial de sangramento decorrente da anticoagulação

com heparina de baixo peso molecular, com perspectivas de uso em

pacientes com problemas de coagulação ou que requeiram rápida

neutralização do efeito da terapia anticoagulante. Por exemplo, pode ser

útil para reverter altas doses de heparina administradas em pacientes

submetidos a cirurgias cardíacas.

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DISCUSSÃO 168

Na literatura há diversos trabalhos focados na descoberta de novos

anticoagulantes (Turpie, 2007; Gross e Weitz, 2008; Haas, 2008), mas

poucos trabalhos têm sido focados no estudo de moléculas como

candidatos a medicamentos a serem utilizados para reversão da

incoagulabilidade induzida pelos anticoagulantes em uso (Chan et al.,

2003), por exemplo, para utilização em casos de sangramento durante

processos cirúrgicos (Warkentin e Crowther, 2002). Portanto, os

resultados obtidos abrem perspectivas, tanto quanto ao mecanismo de

ação do rLopap in vivo, quanto a uma nova aplicação terapêutica para

esta proteína.

5.4 Mapeamento peptídico do Lopap

Não há dados na literatura, relacionados ao mapeamento peptídico,

mutações sítio-dirigidas ou estudo de subunidades e/ou peptídeos

derivados de proteínas da família das lipocalinas, sendo direcionados ao

estudo dos motifs conservados característicos destas proteínas e o

compartilhamento de atividades biológicas comuns. A partir dos dados

obtidos do mapeamento peptídico dos motifs de lipocalina presentes na

seqüência primária do Lopap, através da obtenção de peptídeos sintéticos,

foi demonstrado que uma seqüência de sete aminoácidos, relacionada ao

motif 2, está envolvida na modulação da resposta celular, sendo

responsável pela atividade antiapoptótica do Lopap. Esta seqüência

corresponde à região coincidente entre os peptídeos sintéticos P2 e P4,

que apresentaram atividade citoprotetora em cultura de células

endoteliais, de forma semelhante ao Lopap, mas não apresentaram

atividade catalítica sobre a protrombina.

Diversas lipocalinas têm sido descritas com atividades

antiapoptóticas (Schubert et al., 1986; Berman et al., 1987; Taniike et al.,

2002; Tong et al., 2005; Iannetti et al., 2008), e alguns estudos tem

mostrado, de forma controversa, também efeitos proapoptóticos destas

proteínas (Maesaka et al., 2001; Yousefi e Simon, 2002), que, em certos

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DISCUSSÃO 169

casos têm sido atribuídos a modificações pós-traducionais da proteína

(Ragolia et al., 2007). Os dados apresentados neste trabalho contribuem

para o esclarecimento destas questões, demonstrando que a atividade

antiapoptótica está estritamente ligada a uma seqüência de aminoácidos,

que deve corresponder, provavelmente, a uma “seqüência-assinatura”,

conferido propriedades biológicas comuns a diferentes lipocalinas. Desta

forma, é provável que lipocalinas antiapoptóticas desempenhem seus

papéis de citoproteção por um mecanismo semelhante.

Os resultados do alinhamento da seqüência dos peptídeos ativos

derivados do Lopap com seqüência de outras proteínas disponíveis em

bancos de dados dão suporte para esta hipótese. A partir destes dados,

poderão ser atribuídas funções para muitas proteínas hipotéticas de vários

organismos, que apresentaram alta similaridade com a seqüência de sete

aminoácidos envolvida na ação celular do Lopap. Além disso, o

alinhamento estrutural desta seqüência inserida do modelo da estrutura

tridimensional do Lopap com regiões correlacionadas nas lipocalinas

antiapoptóticas purpurina e prostaglandina D sintase, mostrou um padrão

semelhante assumido por estas “seqüências-assinaturas”. Da mesma

forma, a semelhança nas curvas de hidropaticidade, polaridade e

acessibilidade ao solvente de cada aminoácido da seqüência inserido na

estrutura terciária destas proteínas, reforça a proposta de que estas

proteínas promovem a citoproteção por um mecanismo semelhante. Os

baixos valores de acessibilidade ao solvente observados para a região

analisada sugerem que o mecanismo de ação não deve envolver

simplesmente a interação desta região com a superfície celular, mas

outros eventos devem ocorrer, como mudanças conformacionais

decorrentes de ligações proteína-proteína ou proteína-receptor e formação

de complexos moleculares, clivagem e/ou internalização da proteína.

A co-localização da seqüência de aminoácidos dos peptídeos ativos

derivados do Lopap com os resíduos de aminoácidos preditos na tríade

catalítica do Lopap, utilizando o modelo da estrutura terciária do Lopap

previamente descrito (Reis et al., 2006), assim a ausência de atividade

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DISCUSSÃO 170

procoagulante nos peptídeos obtidos e a avaliação do efeito de inibidores

de serino protease sobre a atividade antiapoptótica de P2, indicam que a

atividade antiapoptótica do Lopap não é dependente e não está

relacionada à sua atividade enzimática. Em estudo semelhante, Liot et al.

(2006), demonstraram que a atividade antiapoptótica do ativador de

plasminogênio humano (tPA) ocorre de forma independente da sua

atividade proteolítica.

Os resultados obtidos com o tratamento do P4 em cultura de

fibroblastos e na derme de animais demonstraram funções anteriormente

desconhecidas do Lopap na modulação da expressão de proteínas de

matriz extracelular, cujo efeito pode ter envolvimento na promoção de

remodelamento e reparo tecidual. De fato, foi demonstrado recentemente

que o tratamento com o peptídeo P4 em modelo de lesão superficial

induzida na pele de ratos proporciona melhoria no reparo tecidual com o

correto remodelamento de fibras colágenas na derme destes animais,

diminuindo o tempo de reparo tecidual e inibindo a formação de quelóides

(Wlian, 2009). Estes dados são interessantes, pois demonstram um efeito

que não é comumente descrito para moléculas pró-coagulantes e outras

enzimas do tipo serino protease, que em geral degradam moléculas de

matriz extracelular (Lucena et al., 2006, 2008).

Os ensaios in vivo com o P4 foram realizados para investigar a

melhor forma de tratamento a fim de se obter um efeito sobre a síntese

de colágeno na derme. Vários esquemas de tratamento foram testados,

onde o P4 foi administrado localmente por via intradérmica em

camundongos e o aumento do colágeno da derme foi avaliado em

diferentes intervalos de tempo após o tratamento, com doses variadas,

cumulativas ou únicas. O aumento da expressão de colágeno foi

observado após o tratamento com baixas doses de P4, indicando que a

ação não é dose-dependente. Nos dados analisados, o tratamento mais

efetivo foi observado com a aplicação de duas doses cumulativas,

totalizando 0,6 µg do P4/animal, com aumento na fração de área de

colágeno após uma semana do tratamento que persistiu por todo o

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DISCUSSÃO 171

período avaliado (aproximadamente três meses). Este efeito pode ser

devido ao aumento da síntese de colágeno por fibroblastos por indução

direta do P4. Outros mecanismos também têm sido relacionados ao

aumento de colágeno, como a inibição da degradação do colágeno por

metaloproteinases de matriz (Moon et al., 2005; Jurzak et al., 2008),

regulação gênica, ou modulação de fatores de crescimento (Bernstein e

Uitto, 1996). Os animais tratados com o peptídeo também foram

avaliados quanto a outros parâmetros indicativos de toxicidade e

alterações na hemostasia, mas não foi observada nenhuma alteração

evidente em relação aos grupos controle, tratados apenas com salina.

Estes dados sugerem que o peptídeo não apresenta toxicidade. Estes

resultados abrem perspectivas de uso para este peptídeo na área

cosmética/cosmecêutica, de modelagem e cicatrização tecidual, e em

disfunções que envolvam morte celular, de remodelamento e/ou perda de

colágeno.

5.5 Considerações finais

Um dos fatores limitantes para o estudo do Lopap era sua obtenção

na forma recombinante enzimaticamente ativa, por uma metodologia

passível de escalonamento. Os resultados obtidos neste projeto

permitiram este avanço no desenvolvimento desta molécula, sem cauda

de histidina, pela padronização do processo de obtenção em sistema

escalonável em leveduras. Por outro lado, a identificação da seqüência

peptídica envolvida na modulação da resposta celular, permitiu

desvincular esta atividade da atividade enzimática pela obtenção de um

peptídeo derivado, viabilizando também outra forma de obtenção, através

de síntese química, para aplicações exclusivamente dependentes de

resposta celular.

De forma geral, os ensaios realizados com peptídeos derivados do

Lopap forneceram dados que abrem perspectivas para o entendimento da

atividade, estrutura e mecanismos de ação celular de lipocalinas, em

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DISCUSSÃO 172

especial do Lopap. Para L. obliqua, a seqüência identificada como

responsável pela ação do Lopap na modulação celular pode ter um papel

crucial em processos biológicos vitais para este inseto, como a

sobrevivência celular diante de situações de injúria e estresse e no

processo de metamorfose. A regulação endógena de apoptose na lagarta

pode ser crucial para garantir a sobrevivência de linhagens celulares

importantes para a fase seguinte do processo. Os dados apresentados

neste trabalho sugerem que a seqüência-assinatura identificada confere

uma propriedade conservada às lipocalinas, promovendo a ações na

modulação celular. Na molécula do Lopap, esta propriedade coexiste com

a atividade procoagulante, que aparentemente, não tem um papel

biológico em processos vitais da lagarta, mas pode corresponder a uma

especialização como mecanismo de defesa.

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173

6 CONCLUSÕES

A metodologia utilizada permitiu a obtenção do rLopap na levedura

P. pastoris, com alta atividade específica, por um processo

escalonável e reprodutível;

O tratamento com o rLopap foi efetivo na diminuição do tempo de

sangramento em coelhos anticoagulados com enoxaparina;

A atividade procoagulante do Lopap foi desvinculada da atividade

antiapoptótica através da obtenção de peptídeos sintéticos

derivados da seqüência primária do Lopap;

Uma seqüência peptídica de sete aminoácidos foi identificada como

a região envolvida na ação do Lopap em células, promovendo a

sobrevivência celular e induzindo a síntese de proteínas de matriz

extracelular;

A seqüência peptídica identificada está presente em outras

lipocalinas e proteínas hipotéticas, as quais podem compartilhar

propriedades biológicas comuns.

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174

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APÊNDICE

Súmula Curricular

Patente

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Artigos

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Capítulo de Livro

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Co-autoria em 14 resumos apresentados em Reuniões Científicas Internacionais e 12 resumos em Reuniões Científicas Nacionais.