Liquid Chromatography Fundamentals Hardware

November 16, 2016

Apenas para finalidades de ensino

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November 16, 2016

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Fundamentosde cromatografia líquidade alto desempenho osAvanços e Inovações.

DESENVOLVENDOUMA CIÊNCIA MELHOR

AGILENT E VOCÊClaudio Bortalieiro

Especialista de Produto Agilent

COSIMP - CASCAVEL – NOV/2016

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Agenda:• Princípios gerais das análises em HPLC;

• Introdução á Cromatografia;

• Principais Parâmetros;

• Configurações e função dos módulos;

• Principais Técnicas;

• Principais Aplicações (colunas, mecanismo de separação);

• Modos de Separação;

• Principais técnicas de detecção;

• Evolução da técnica

• Diferenças entre HPLC e UHPLC;

• Desafios da Cromatografia Ultra-rapida;

• Beneficios do UHPLC;

• Inovações Tecnológicas e sistemas especiais;

• SFC visão geral;

• 2D-LC visã geral e principio de funcionamento;

• Agilent no Mundo

• Portifólio Agilent – Principais Sistemas e Visão Geral

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Introdução

Compostos não-voláteis/biológicos típicos

Pesticidas, Vitaminas em alimentos; Conservantes em bebidas; Agentes adulterantes, Produtos naturais;

Proteínas; Produtos farmacêuticos; Substâncias químicas orgânicas, como polímeros; Compostos

termicamente instáveis;

NOTA: Se um composto for volátil (um gás, fragrância, hidrocarboneto na gasolina),

a cromatografia gasosa é uma técnica de separação indicada.

O que é Cromatografia Líquida e para que serve?

Cromatografia é uma técnica de separação de compostos não-voláteis e biológicos, com finalidade de identificação, quantificação e purificação de seus componentes.

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IntroduçãoQual melhor técnica para cada composto HPLC vs CG?

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IntroduçãoQual é a aparência de um cromatograma?

Tempo após a injeção

min0 2 4 6 8 10 12 14

Ponto de injeçãoda amostra na coluna

Eles são chamados de picoscromatográficos e cada um representa um composto separado

Composto A

Composto B

Composto C

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IntroduçãoO que acontece dentro da coluna?

Tempo t

Separação tr2-tr1

largura de pico Wb1,2

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Principais parâmetrosTempo de retenção e largura de pico

tr1

tr2

Wb1 Wb2

W1/2

h

t

tri Tempo de retenção do composto i

W1/2 largura de pico na meia altura

Wbi largura de pico na linha de base

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tr2-tr1

Separação superior Separação inferior

Separação superior Separação inferior

Wb1 Wb2Wb1Wb2

vs

vs

tr2-tr1

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Tempo t

Separação tr2-tr1

largura de pico Wb1,2


A resolução descreve a habilidade

de uma coluna de separar os picos

de interesse.

A resolução descreve se você atingiu

ou não a separação na linha de base.

)(2/1 12

12

bb

rrs

WW

ttR

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Principais parâmetros Resolução – Separação na linha de base

A resolução leva em consideração

a eficiência (N), seletividade (a)

e retenção (k).

• Um valor de 1 é o mínimo para que uma

separação mensurável ocorra e para

permitir uma quantificação adequada.

• Um valor de 0,6 é necessário para diferenciar um

vale entre dois picos de mesma altura.

• Valores de 1,7 ou maiores geralmente

são desejáveis para métodos robustos.

• Um valor de 1,6 é considerado a separação

na linha de base e garante o resultado

quantitativo mais preciso.

h

t

Rs = 1,5

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Rs 14

N

a 1

a

k

1k

Principais parâmetrosResolução – A equação fundamental de (U)HPLC

SeletividadeEficiência Retenção

A resolução pode ser melhorada aperfeiçoando qualquer um destes parâmetros:

• A eficiência descreve o poder de separação da coluna.

• A seletividade tem a influência mais alta na resolução. Pequenas mudanças na seletividade geram grandes alterações nas resoluções.

• A retenção apenas tem uma influência significativa em valores k pequenos.

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Principais parâmetrosResolução – A equação fundamental de (U)HPLC

A figura explica a resolução como uma função de seletividade, eficácia de coluna ou retenção.

A seletividade afeta mais a resolução

• Altere a fase estacionária

• Altere a fase móvel

Os pratos são mais fáceis de aumentar

Rs 14

N

a 1

a

k

1k


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Principais parâmetrosEficiência ou número de pratos teóricos (N)

A eficácia da coluna é utilizada para comparar o desempenho de colunasdiferentes. Ela é expressa como o número de prato teórico, N.

As colunas com números altos de pratos são mais eficientes. Uma colunacom um valor N alto terá um pico mais estreito em um determinado tempo de retenção do que uma coluna com um número N mais baixo.

Parâmetros que influenciam a eficiência da coluna:

• Comprimento da coluna (aumentar o comprimento da coluna aumenta a eficiência)

• Tamanho da partícula (diminuir o tamanho da partícula aumenta a eficiência)

2

2/1

54.5

W

tN r

2

16

b

r

W

tN

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Principais parâmetrosFator de retenção (k)

k =tr - t0

t0

æ

è ç

ö

ø ÷

O fator de retenção mede o período de tempo que o componenteda amostra reside na fase estacionária relativo ao tempo que residena fase móvel. Ele é calculado a partir do tempo de retenção divididopelo tempo de um pico não retido (t0).

Parâmetros que influenciam o fator de retenção:

• Fase estacionária

• Fase móvel

• Inclinação de gradiente*

• Volume morto do sistema*

*apenas eluição do gradiente

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Principais parâmetrosFator de seletividade ou separação (α)

Seletividade é uma medida de tempo ou distância entre os valoresmáximos de dois picos.

Se α = 1, os dois picos têm o mesmo tempo de retençãoe coeluição. Ela é definida como a proporção nos fatores de capacidade.

Parâmetros que influenciam o fator de retenção:

• Fase estacionária

• Fase móvel

• Temperatura

a Seletividade

k1 Fator de retenção do 1o pico

k2i Fator de retenção do 2o pico1

2

k

ka

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Principais parâmetrosInfluência de N, α e k na resolução


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Como influenciar a separação?

Mesma amostra, analisada com fases estacionárias diferentes massempre com a mesma temperatura, fase móvel e gradiente.

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Mesma amostra, analisada com a mesma fase estacionária e temperatura, mas com fases móveis diferentes (mesmo gradiente).

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Mesma amostra, analisada com a mesma fase estacionária e fase móvel, mesmo gradiente, mas diferentes temperaturas.


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A capacidade de pico é o número de picos (n) que podem ser separados em um determinado tempo com uma determinada resolução.

A capacidade de pico depende de diferentes fatores, como ocomprimento da coluna e o tamanho de partícula.

Capacidade de picoDefinição

Capacidade de pico: 32 picos em 2,5 min

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Capacidade de picoExemplo

min20 40 60 80 100

mAU

0

10

20

30

40

50

min10 20 30 40 50

mAU

0

20

40

60

Coluna: 2,1 x 150 mm, 1,8 µm

Pressão: 402 bar

Capacidade de pico: 313

Coluna: 2,1 x 300 mm*, 1,8 µm

Pressão: 598 bar

Capacidade de pico: 406

*Coluna de 300 mm acoplando duas colunas de 150 mm

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Um sistema de HPLC consiste em

várias partes conhecidas como

Módulos.

Estes módulos assumem funções

variadas no processo de separação das

substâncias.

Configuração de um HPLC e suas funções…

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A Bomba garante que a fase móvel é

movida sob alta pressão através da

fase estacionária.

Tem a capacidade de mistura

automaticamente diferentes solventes

para compor uma fase móvel, por

exemplo, água, metanol etc.

Fluxo/Pressão


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Bomba

Módulo da Bomba– tipos:

• Bomba Isocrática – Trabalha com composição de fase móvel constante;

• solventes devem ser misturados previamente;

• baixo custo

• Bomba Gradiente – Trabalha com composição de fase móvel variável;

• Pode ser mistura e utilizada como uma fase móvel isocrática ou fase móvel gradiente

– Gradiente Binário – utiliza dois solventes

– Gradiente Quaternário – utiliza 4 solventes

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Condições Gradiente vs. Isocratica

Modo Isocráticocomposição da fase móvel permanece

constante com o tempo

• Ótimo para separações simples

• Comumente utilizado em Controle de

Qualidade

Modo Gradientecomposição da fase móvel, solvente “B”

aumenta com o tempo

• Ótimo para análise de amostras complexas

• Comumente utilizado em desenvolvimento

de métodos para misturas desconhecidas

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25

Time, minutes%

of

So

lven

t B

in

Mo

bil

e

Ph

ase

Isocratic Gradient

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Porque utilizar modo Gradiente em HPLC?

Time (min)

2

0 25 50 75 0 5 10 15 20 25 30

Time (min)

1,2

3

4

5

6

7

8

1

3

45

6

7

8

Separação de Herbicides em ZORBAX StableBond-C18

Coluna ZORBAX SB-C18

4.6 x 150 mm, 5 µm

Fase Móvel: A: H2O with 0.1% TFA, pH

2

B: Acetonitrila

Fluxo: 1.0mL/min

Temperatura:35°C

Amostras: 1. Tebuthiuron

2. Prometon

3. Prometryne

4. Atrazine

5. Bentazon

6. Propazine

7. Propanil

8. Metolachlor

Modo Isocrático70% água/30% Acetonitrila

Modo Gradiente20 – 60% Acetonitrila em água

em 30 min.

Nota:

Último pico eluído

em ~70 minutos

Nota:

último pico

eluido em

~ 28 minutos e

alteração no seu

formato

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O Injetor automático transfere as

amostras do vial para a coluna.

Várias amostras podem ser colocadas

no injetor automático e processados

automaticamente.


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Principais caracteristicas de um injetor

Lavagem interna

Através consagrada tecnologia

„FlowThroughNeddle“

Lavagem externa da agulha

Escolha até 3 diferentes

solventes para lavagem.

Lavagem do acento da agulha

“backflush”

Escolha até 3 solventes externos

para o “backflush”.

• Capacidade de Amostras: 432 amostras (vial 2mL)

• Menor “Carryover”: menor que 9ppm

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O Compartimento termostatizado de

coluna contém a coluna.

Dependendo da aplicação, pode

conseguir grandes vantagens operando a

coluna em temperaturas diferentes.

As temperaturas podem ser ajustadas

entre 4 – 110°C no compartimento da

coluna.

Considerado o “Coração do Cromatógrafo”


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O Detector apresenta uma lâmpada

UV, uma célula de fluxo através do qual

a amostra passa e um detector de luz.

O detector mede a quantidade de

entrada de luz e envia os dados para

um computador para análise da luz

absorvida e luz transmitida.


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COMPUTADOR (PC)

• Chamado comumente de Sistemas de Dados, tem a função de não só controlar os

sistema, mas de adquirir os dados gerados pelo HPLC.

• Realiza as medidas das concentrações que podem ser qualificadas ou

quantificadas.

• Realiza a conexão entre o PC, gerando os dados como cromatogramas e os

gráficos que são utilizados para Identificar e quantificar as amostras.


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Cromatografia de Adsorção (Sólido/Líquido): Atração Eletrostática

Cromatografia de Partição (Líquido/Líquido): Solubilidade

• A) Cromatografia de Planar (TLC);

• B) Cromatografia de Papel (CCD);

• C) Cromatografia em Coluna;

Cromatografia (CCD);

Cromatografia Coluna;

Principais Técnicas

//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/58/Tlc_sequence.svg

//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/58/Tlc_sequence.svg

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Chromatography_column.PNG

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Chromatography_column.PNG

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min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15

Injeção

(tempo zero)

Tempo de Retenção

do Composto A

Tempo de Retenção

do Composto B

Tempo após Injeção

Aplicação em HPLC

Análise Qualitativa

Identificação (ID) compostos individuais em amostras, significa O que tem lá?;

• O Parâmetro mais utilizado para a Identificação de um composto é o seu Tempo de Retenção;

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Aplicação em HPLC

min0 2 4 6 8 10 12 14

AB

C

D

Area do Pico Composto A

Area do Pico Composto B

Area do Pico Composto C

Area do Pico Composto D

Altura do Pico

do

Composto A

Análise Quantitativa

Quantificação do composto na amostra (concentração); significa, Quanto tem lá?;

• Determinação da altura do pico do cromatograma, que é medido a partir da linha de base;

• Determinação da área;

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Isolamento e concentração

da susbstância de interesse

por evaporaçãoInicio Fim

Produção de

Padrões de Referência

Separação e coleta do pico de

interesse através de um Sistema

HPLC de Purificação

Testes “in vitro”

Aplicação em HPLC

Análise de purificação ou isolamento de ativos

http://thumbs.dreamstime.com/z/solução-transparente-colorida-em-uns-tubos-de-ensaio-39781814.jpg

http://thumbs.dreamstime.com/z/solução-transparente-colorida-em-uns-tubos-de-ensaio-39781814.jpg

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Colunas Cromatográficas

Tipos de colunas em HPLC:

• Analíticas [diâmetro interno (i.d.) 1,0 – 4,6mm; tamanhos 10 – 250mm]

• Preparativas (i.d. > 4,6 mm; tamanhos 50 – 250mm)

• Capilares (i.d. 0,1 – 1,0 mm; vários tamanhos)

• Nano (i.d. < 0,1mm, ou algumas < 100µm)

Materiais:• Aço Inox (a mais popular; fornece alta capacidade de pressão)

• Vidro (para Biomoléculas)

• PEEK polímeros (biocompativeis e quimicamente inertes para a maioria dos solventes)

Onde a separação ocorre!

A escolha adequada da coluna é o Ponto Crítico para o sucesso da Cromatografia.

LC Columns - analytical

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Materiais de Enchimento das colunas de HPLC

• As colunas são empacotadas com particulas porosas de diâmetro pequenos.

– As mais populares são: 5μm, 3,5μm e 1,8μm

• São empacotadas a altas pressões para garantir a estabilidade durante o uso

– a maioria dos usuários compram colunas prontas

• Estas particulas porosas tem normalmente fase ligada (bonded phase) quimicamente na

sua superficie, que irá interagir com os componentes da amostra para promover a

separação.

– Exemplo, C18 é fase mais popular

LC Columns

Material de

enchimento das

colunas de LCl

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Colunas InfinityLab Poroshell 120Alta eficiência em qualquer tamanho de particula

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2.5um

0.75um

0.75um

1.7um

0.5um

0.5um

Poroshell 120 - 2,7µm Poroshell 120 - 4µm

2 vezes mais eficiente que 5um

Presão normalmente abaixo de 200 bar

2 um inlet frit

www.agilent.com/chem/discoverporoshell

600Bar

90% da Eficiência da S2M

50% menor Pressão da S2M

2um inlet frit

http://www.agilent.com/chem/discoverporoshell

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Mecanismo Tipico de Separação em HPLC

Silica

Base

Fase Ligada QuimicamenteAs moléculas do Analito são atraídas

Quimicamente para a fase ligada

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Modos de Separação em HPLC

Existem quatro principais modos de separação utilizado:

1. Cromatografia em Fase Reversa;

2. Cromatografia em Fase Normal;

3. Cromatografia por Troca Iônica;

4. Cromatografia por GPC/SEC;

….Vamos dar uma breve explorada em cada modo

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Cromatografia em Fase Reversa (RPC)

• Empacotamento da coluna é apolar (e.g. C18, C8, C3, phenyl, etc.)

• Fase móvel é polar: água (tampão) + solvente orgânico miscivel em água (e.g. MeOH, ACN)

• Utilização: Mais de 90%

• Adequada para:

• Moléculas apolares;

• Polares;

• Ionizáveis;

• Moleculas iônicas

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Fase Reversa (RPC)Degradantes da Clorofila

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Cromatografia em Fase Normal (NPC)

• Empacotamento da coluna é polar (e.g. silica gel, cianopropil, amina, etc.)

• Fase móvel é apolar (e.g. hexane, iso-octane, cloreto de metileno, acetato de etila)

• Utilização: Menos que 10%

• Adequada para:

• Compostos sensíveis à agua;

• Isômeros geométricos;

• Isômeros cis-trans;

• Compostos chirais;

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Fase Normal (NPC)Surfactante

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Cromatografia de Troca Iônica (IEX)

• Empacotamento da coluna contém grupos iônicos (e.g. sulfonico, tetraalkil amonio)

• Fase móvel é um tampão (e.g. fosfato, formiato, etc.);

• Utilização: Cerca de 20%

• Adequada para:

• Separação de cátions e ánions orgânicos e inorgânicos em solução aquosa.

• Aminoacidos e proteínas.

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Troca Iônica (IEX)Proteínas

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Cromatografia por Exclusão de Tamanho (GPC/SEC)

• Sem interação entre os compostos da amostra e a fase estacionária.

• As moleculas irão difundir pelos poros das particulas do enchimento.

• Separadas pela diferença de tamanho entre a molécula e o poro da fase estacionária.

• Esta técnica é utilizada cerca de 10-15% das cromatografias,

• Adequado para

• Caracterização de polimeros, proteínas (Biopharmacos).

• Existem dois modos:

Não-aquoso [Gel Permeation Chromatography (GPC)]

Aquoso [Gel Filtration Chromatography (GFC)].

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Mecanismo

Molécula (C) será excluída do poro

Moléculas (A,B)

B

C

A

Tempo

Sin

al C

BA

Moléculas deve entrar e sair livremente

poros para serem separadas. Moléculas

maiores eluem primeiro, seguidas pelas

moléculas de tamanho intermediário e,

finalmente, as moléculas menores elui

por último..

Packing Pore

Partial entry

Full entry

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GPC/SEC(NPC)Amido por viscometria

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Detecção espectroscópica: Absorção ultravioleta (UV)

Tipos de Detecção

• A técnica mais utilizada

• Utiliza a luz ultravioleta e a capacidade dos grupos cromóforos

• O espectro ultravioleta é utilizado para auxiliar na identificação de um composto ou série de compostos

Esquema do detector de comprimento de onda variável (VWD)

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Tipos de DetecçãoDetecção espectroscópica: Absorção ultravioleta (UV)

Esquema do detector de arranjo de diodos (DAD)

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Tipos de DetecçãoDetecção por Índice de Refração (RID)

• Utiliza acapacidade de um composto ou solvente de desviar a luz .

• Considerado um detector universal, mas não é muito sensível.

• Utilizados para análise isocrática.

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Tipos de DetecçãoDetecção por Índice de Refração (RID)

Esquema de um tipo de deflexão de detector de RID

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Tipos de DetecçãoDetecção por Fluorescência (FLD)

• Oferecem sensibilidade e seletividade mais altas.

• Quantificação e identificação de compostos e impurezas em matrizes complexas em concentrações extremamente baixas (análise em nível de traços).

• Substâncias que apresentam fluorescência.

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Tipos de DetecçãoDetecção por Fluorescência (FLD)

Esquema de um detector de fluorescência

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Tipos de DetecçãoDetecção por Espalhamento da Luz: ELSD

• Detector Universal para compostos menos voláteis que a FM

• Ideal para compostos com detecção abaixo do UV

• Compatível com gradiente

• Técnica complemetar ao LC-MS

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Tipos de DetecçãoDetecção por Espalhamento da Luz: ELSD

Eluent inlet

Gas

Liquid waste

Light Source

Esquema de um detector de ELSD

O princípio de operação emprega três fases distintas:

• Nebulização

• Evaporação

• Detecção

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Tipos de DetecçãoEspectrômetro de massas (MS)

• Na espectrometria de massas, o detector percebe um composto eluindo da coluna de HPLC, primeiro a ionizando, depois medindo sua massa ou fragmentando a moléculaem pedaços menores que são exclusivos do composto, ou fazendo ambos.

• O detector de MS pode, às vezes, identificar o composto diretamente, pois seuespectro de massa é como uma impressão digital única daquele composto.

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Tipos de DetecçãoEspectrômetro de massas (MS)

Espectro de massa de atorvastatina degradada oxidativaincluindo algumas impurezas. Fonte: App no.: 5991-4404EN

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5991-4404EN.pdf

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5991-4404EN.pdf

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60

Cromatografia e sua Evolução

O que significa „UHPLC“?

UHPLC significa:

• Ultra High Pressure Liquid Chromatography (> 600 bar).

• LC de alta performance com colunas de particula sub-2-

micron (ou poros superficiais).

UHPLC não significa:

• Ultra-altas pressões não é uma vantagem, é apenas um

efeito colateral indesejável! Pressão não separa nada!

• LC em colunas de 2.1mm de i.d. Qualquer diâmetro de

coluna (4.6, 4, 3 mm i.d.) podem ser preenchidas com

particulas sub-2-micron.

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61

Qual a diferença entre HPLC e UHPLC?

Quem surgiu primeiro, a Coluna ou o Equipamento?

LC Convencional

400Bar

LC Rápido

600Bar

LC Ultra-Rápido

1300Bar

Tempo de Análise Maior que 5 min 1 – 5 min Menos que1 min

Tamanho tipico

da Coluna/

Tamanho de

particula

100 – 250 mm/

5µm

50 - 75 mm/

2,7µm

50 mm ou menor

S2M – 1,8µm

Cromatografia e sua Evolução

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62

Características de um UHPLC: Curva de Van Deemter

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0035

0.0040

0.0045

0.0 0.5 1.0 1.5

Fluxo

5.0 m

3.5 m

1.8 m

Re

du

çã

oda

altu

rad

os p

rato

ste

órico

s

Para 600Bar

H= A + B/µ + C * µ - Equação de Van Deemter

A = Difusão de Eddy

B = Difusão Longitudinal

C = Transferência de Massas

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63

Características de um UHPLC: Curva de Van Deemter

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0Fluxo (mL/min)

5.0m

3.5m

1.8m

Para 1300Bar

Re

du

çã

oda

altu

rad

os p

rato

ste

órico

s

O Tamanho da Particula!

Particulas pequenas alcançam menores reduções na altura

dos pratos teóricos, portanto maior eficiência na separação.

Particulas menores interfere menos na eficiência de separação

com o aumento do fluxo.

Qual o segredo da Cromatografia Ultra-Rápida?

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UHPLC Desafios

Podempos realizar corridas ultra-rápidas em

Qualquer Sistema LC ?

Sim…até certo ponto

Contudo sistemas UHPLC oferecem um maior potencial

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O que precisamos considerar?

Pressão Máxima

Para colunas UHPLC curtas - 400 bar

Dwell volume

Para colunas de 4.6 mm x volumes dos LC convencionais

Dispersão de VolumePara colunas de 4.6 mm o sistema LC pode ser otimizado

Velocidade de Detecção

Altas taxas de aquisição de dados são necessárias

Altas taxas de aquisição em equipamentos antigos podem aumentar o ruido

UHPLC Desafios

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66

Sistemas de UHPLC Modernos

Pressão

600 bar, 1000 bar, 1300 bar

Dwell volume

Menor que 20uL

Dispersão

Utilização de capilares otimizados, cuidados com conexões, celas com volumes baixos

Velocidade de detecção

Ruídos eletrônicos baixos

Aquisição até 240Hz

UHPLC Desafios

November 16, 2016


67

Sistema UHPLC Otimizado

Máxima capacidade e flexibilidade

November 16, 2016


68

UHPLC Efeito do Volume

Dwell volume ou volume morto = volume de efetivação do gradiente na coluna

Dwell volume ou volume morto

Para sitema de mistura por baixa

pressão

Bomba Quaternária

Dwell volume ou volume morto

Para Sistema de mistura por alta

pressão

Bomba Binária

November 16, 2016


69

Dispersão do Volume

Qualidade da conexão

Célula de fluxo

Onde está o volume em um HPLC?

November 16, 2016


70

Baixa dispersão para altas resoluções

As novas conexões de UHPLC para colunas Agilent: A-Line Quick

garantem volume morto zero!

A-Line Quick InfinityLab - Volume morto zero!

A-Line Quick Turn Fitting

A-Line Quick Fitting

November 16, 2016


71

Dispersão do Volume: Efeitos do caminho óptico

Dispersão do pico

60mm comprimento do caminho

grande geometria – volume da celula (78µL)

Baixa transmissão da luz

Perda de resolução

Perda de altura


geometria pequena - volume da celula (13µL)

Alta transmissão da Luz

Célula de fluxo convencional:


4µL (σV dispersão de volume)

Max-Light: Célula com Alta Sensibilidade:

Condução ondas:Opticfluidos

(Reflecção interna total)

November 16, 2016


72

min0.1 0.2 0.3 0.4 0.50

80Hz

PW=0.30sec

40Hz

PW = 0.33 sec

20 Hz

PW=0.42sec

10Hz

PW=0.67sec

5HzPW=1.24sec

80Hz versus 20Hz

– 30% Peak Width

+ 30% Resolution

+ 40% Peak Capacity

+ 70% Apparent Column Efficiency

Detector UHPLC – Aquisição de dados

80Hz versus 10Hz

– 55% Peak Width

+ 90% Resolution

+ 120% Peak Capacity

+ 260% Apparent Column Efficiency

November 16, 2016


73

Benefícios do UHPLC

Particulas pequenas alcançam

menores reduções na altura dos

pratos teóricos portanto maior

eficiência na separação

Para particulas menores a

eficiência de separação sofre

menos com o aumento do fluxo

Particulas menores produzem

picos mais altos e mais

estreitos.

Maior Resolução!

Sem aumentar o tempo de

análise!

Menor tempo de

análise!

Menos solvente sem

dimunuição de resolução!

Melhor sensibilidade!

November 16, 2016


74

CROMATOGRAFIA VERDE

November 16, 2016


75

UHPLC 1290 II com alteração de dimensão da coluna Colunas menores com tamanho de particulas menores

Column: ZORBAX SB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 µm

Mobile phase

Buffer pH 7.0: 0.08 M phosphoric acid

Buffer A: Water:buffer:acetonitrile (52:30:18)

Buffer B: Water:buffer:acetonitrile (10:30:60)

Gradient: at 0 min 0 % B

at 3 min 0 % B

at 26.5 min 100 % B

at 26.6 min 0 % B

at 30 min 0 % B

Flow: 1.0 mL/min

Post t.: 3.0 min

Col.: 25 °C

Inj. Vol: 10 µL

DAD: 238 nm BW 4, Ref 300, 20

Column: ZORBAX SB-C18, 4.6 x 30 mm, 1.8 µm

Mobile phase

Buffer pH 7.0: 0.08 M phosphoric acid

Buffer A: Water:buffer:acetonitrile (52:30:18)

Buffer B: Water:buffer:acetonitrile (10:30:60)

Gradient: at 0 min 0 % B

at 0.8 min 0 % B

at 7.07 min 100 % B

at 7.09 min 0 % B

at 8 min 0 % B

Flow: 1.5 mL/min

Post t.: 0.8 min

Col.: 35 °C

Inj. Vol: 4 µL

DAD: 238 nm BW 4, Ref 300, 20

Economia do Solvente: 40%!!!

27min

7min

November 16, 2016


76

UHPLC 1290 II com alteração da dimensão da coluna

PoroshellColunas menores com tamanho de particulas menores

USP method for Naproxen

Economia do Solvente : 67%!!!

10min

3min

November 16, 2016


77

UHPLC 1290 com alteração da dimensão da coluna Colunas menores com tamanho de particulas menores

Resolução otimizada

3x100mm, 1,8µm

Resolução do pico 5 = 7,16

Tempo de Corrida: 7 min

Velocidade e resolução otimizada

3x50mm, 1,8µm


Tempo de Corrida: 1,1min

Convencional

4,6x150, 5µm


Tempo de corrida: 11 min

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

Economia do Solvente : > 70%!!!

11min

1,1min

November 16, 2016


78

Análises de Impurezas Pharma: HPLC para UHPLC- Alta velocidade com alta precisão e Sensibilidade

14 min

3 min

150 x 3.0 mm, 3.5 µm

100 x 2.1 mm, 1.7 µm

Pmax = 880 bar

Metoclopramide, PN 5990-3981EN,

G. Vanhoenacker, F. David, P. Sandra

November 16, 2016


79

CROMATOGRAFIA SFC

November 16, 2016


80

O que é um SFC?

• Um solvente é o CO2!

SFC é uma forma de

cromatografia de fase normal.

Os princípios são semelhantes

aos de HPLC no entanto SFC

tipicamente utiliza CO2

supercrítico como a fase móvel.

Vantagem:

Baixa viscosidade vs alta

performance

November 16, 2016


81

Aplicações em SFC: Triglicerídes em óleo de amendoim, soja e girassol

Condições cromatográficas

Nota de Aplicação Agilent: 5991-0987EN

November 16, 2016


82

Aplicações em SFC: Comparação análise chiral por SFC vs. HPLC

min0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Norm.

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

DAD1 B, Sig=210,16 Ref=360,100 (CHIRAL\COMP000020.D)

DAD1 B, Sig=220,16 Ref=360,100 (CHIRALSFC\COMP000029.D)

HPLC: 6.5 MinutesSFC: 3 Minutes

Separação de Naragenina – Flavonóide

November 16, 2016


83

Aplicações em SFC: Diversas moléculas

November 16, 2016


84

CROMATOGRAFIA 2D-LC

November 16, 2016


85

O que é um LC Bi-Dimensional?

É a transferência seletiva de uma fração (ou frações) de uma

coluna cromatográfica para uma coluna cromatográfica

secundária com finalidade de uma separação adicional.

Coluna 1

Coluna 2

November 16, 2016


86

Por quê um LC Bidimensional?

Melhoria de resolução de uma mistura complexa, que não

pode ser separado numa única coluna

Limpeza de amostras pela remoção da matrix ou compostos

interferentes

Aumento da produtividade de amostras (duas separações

acontecendo ao mesmo tempo)

Potencialização de traços de compostos de interesse (coluna

especifica)

Fase móvel da segunda dimensão mais agradáveis para

a espectrometria de massa

Aumento da capacidade de pico

November 16, 2016


87

Capacidade de Pico vs Resolução

“O Poder de Resolução é o que tem

de mais importante na ciência da

separação analítica.”

November 16, 2016


88

ResoluçãoUma Função da Seletividade, Eficiencia da Coluna, ou

Retenção

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Re

so

luti

on

Increase N Increase Alpha

Increase k'

Pratos Teóricos: 5000 10000 15000 20000

25000Alpha: 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1

k: 2.0 4.5 7.0 9.5 12.0

A Seletividade é o parâmetro que mais

afeta a Resolução

• Mudanças na fase estacionária

• Mudanças na Fase Móvel

Rs = N½/4 (a-1)/a k/(k+1)

α

Nk

88

November 16, 2016


89

Princípios do LC Bi-Dimensional

A eficiência da primeira coluna longa em reter os

componentes das amostras na primeira dimensão

O eluente flui através do “loop” de injeção (este primeiro

passo pode incluir detecção de pico para a ténica de “heart-

cutting” da amostra)

O conteúdo do “loop” é automaticamente injectado em uma

segunda coluna rápida dando origem a uma separação

ortogonal

89

November 16, 2016


90

Modos de Combinações de Colunas90

Mode Combination* Application Advantage Disadvantage Column Examples

IEC & RP PROTEOMICS Orthogonality Low Peak Capacity AGILENT BIO-IEX;

ZORBAX STABLEBOND,

ECLIPSE, EXTEND,

BONUS RP, POROSHELL

SEC & RP POLYMERS Orthogonality Low Peak Capacity AGILENT PL-GEL

(VARIOUS

BEDS);ZORBAX

STABLEBOND, ECLIPSE,

EXTEND, BONUS RP,

POROSHELL

NP & RP PHARMACEUTICALS

METABOLOMICS

Orthogonality Solvent compatibility, limited

application

ZORBAX CYANO,

AMINO, SIL;ZORBAX

STABLEBOND, ECLIPSE,

EXTEND, BONUS RP,

POROSHELL

RP & RP PHARMACEUTICALS

METABOLOMICS

Miscible Solvents, broadest

applications,fast speed, gradient

on both dimensions, highest peak

capacity

Strongly depends on column

choice of mobile phase choice ZORBAX STABLEBOND,

ECLIPSE, EXTEND,

BONUS RP, POROSHELL

AFFINITY & RP PROTEOMICS Orthogonality Low Peak Capacity, Off-line AGILENT MULTIPLE

AFFINITY REMOVAL

COLUMNS

SEC & NP POLYMERS Orthogonality Low Peak Capacity AGILENT PL-GEL

(VARIOUS

BEDS);ZORBAX CYANO,

AMINO, SIL

SEC & IEC PROTEOMICS Orthogonality Low Peak Capacity AGILENT BIO-

SEC;AGILENT BIO-IEX

* Stoll et al, Jchrom A, 1168 (2007)

3-43

November 16, 2016


91

Os Obstáculos da Cromatografia Bi-Dimensional

Normalmente o gradiente da primeira dimensão é longo, lento, seguido de gradientes repetidos e rápidos na segunda dimensão, para isto é necesário uma bomba muito eficiente e com baixo volume volume, capaz de realizar “gradientes balisticos”

Dificuldades para coordenar o tempo entre o gradiente da primeirae da segunda dimensão

Dificuldades para coordenar o tempo de válvula entre a primeira e a segunda dimensão

Dificuldades de coordenar o “heart cutting” do detector da primeiradimensão com a mudança de posição da válvula

Quaisquer alterações em uma tabela de tempo exige mudanças para todas as outras tabelas – Isto não é uma tarefa fácil!!!!

November 16, 2016


92

Sem o Software Bi-Dimensional: MISSÃO IMPOSSÍVEL!

Gradientes e mudanças de posições de válvulas complexas

Capillary pump 1:gradient across

analytical column

Time % B

0 0

6 0

135 10

200 20

230 30

280 50

295 100

320 100

320.1 0

350 0

Time % B Time % B

0 3 175 3

5 3 201.1 65

26.1 65 201.2 3

26.2 3 210 3

35 3 236.1 65

61.1 65 236.2 3

61.2 3 245 3

70 3 271.1 65

96.1 65 271.2 3

96.2 3 280 3

105 3 306.1 65

131.1 65 306.2 3

131.2 3 315 3

140 3 340 65

166.1 65 340.1 90

166.2 3 345 90

Capillary pump 2:gradient across SCX

column

Time Position

0 column 2

26.1 column 1

35 column 2

61.1 column 1

70 column 2

96.1 column 1

105 column 2

131.1 column 1

140 column 2

166.1 column 1

175 column 2

201.1 column 1

210 column 2

236.1 column 1

245 column 2

271.1 column 1

280 column 2

306.1 column 1

315 column 2

345 column 1

Time Position

0 Pos 1

5 Pos 2

30 Pos 1

65 Pos 2

100 Pos 1

135 Pos 2

170 Pos 1

205 Pos 2

240 Pos 1

275 Pos 2

310 Pos 1

6-port valve:timetable

10-port valve:timetable

November 16, 2016


93

LC bidimensional

Configuração do sistema

Bomba 1D Autosampler Coluna 1D

Bomba 2D

Coluna 2D

Injetor

Detector 2D

Detector 1D

(opcional)

November 16, 2016


94

Diagrama de Fluxo das novas válvulas

2D - 2pos/4port

Novas Válvulas exclusivas Agilent especiais para 2D-LC.

Válvula individual com percursos de escoamento e preenchimento

totalmente simétricos, com comportamento de preenchimento e de lavagem.

Unica válvula que permite a lavagem dos “loops” em contra-corrente.

November 16, 2016


95

O Dispositivo de Amostragem 2D / Interface95

1D

column

2D

column

1. Peak sampling from 1D.

Fluxo de trabalho do „Loop Duplo“ com a Agilent 2 pos / 4 port

(Duo Valve*)

*Duo Valve: especialmente desenhado para aplicações em

2D-LC.

• Dois Caminhos de fluxos precisamente iguais.

November 16, 2016


96


1D

column

2D

column


Fluxo de trabalho do „Loop Duplo“

November 16, 2016


97


1D

column

2D

column



November 16, 2016


98

O Dispositivo de Amostragem 2D / Interface

1D

column

2D

column



November 16, 2016


99


1D

column

2D

column


2. Valve switch.


November 16, 2016


100




2. Valve switch.

3. 2D-LC.

4. Repeat 1.- 3.

2D

column

1D

column

November 16, 2016


101



2. Valve switch.

3. 2D-LC.

4. Repeat 1.- 3.

2D

column

1D

column


November 16, 2016


102



2. Valve switch.

3. 2D-LC.

4. Repeat 1.- 3.

2D

column

1D

column


November 16, 2016


103



2. Valve switch.

3. 2D-LC.

4. Repeat 1.- 3.

2D

column

1D

column


November 16, 2016


104



2. Valve switch.

3. 2D-LC.

4. Repeat 1.- 3.

2D

column

1D

column


November 16, 2016


105



2. Valve switch.

3. 2D-LC.

4. Repeat 1.- 3.

2D

column

1D

column


November 16, 2016


106

As duas abordagens para o LC Bi-Dimensional

Comprehensive: Toda a amostra a partir da primeira coluna

é “armazenada e liberada” para a segunda coluna

Heart-cutting: O detector na primeira dimensão permite e

determina quais componentes serão “armazenados e

liberados” para a segunda coluna

November 16, 2016


107

Cromatografia 2D-LC – Heart-cutting vs Comprehensive

Heart-cutting 2D-LC (LC-LC): Principio de Operação

LC1

LC2

November 16, 2016


108

2D-LC Heart-Cutting108

Princípio da Operação

• Frações de componentes „1D-peaks” são selecionados e

submetidos para a “2D peaks”.

• Desacopla a escala de tempo 1D / 2D.

• Permite longos gradientes 2D e longas colunas 2D com maior

eficiência de separação.

• Melhor qualidade de dados para os picos de interesse.

• Uso: Análise específica de amostras conhecidas /

aumentar a confiança

November 16, 2016


109

Cromatografia 2D-LC – Heart-cutting vs Comprehensive

Comprehensive 2D-LC (LCxLC): Principio de Operação

LC1

LC2

1st peak from

1st dimension

2nd peak from

1st dimension

3rd peak from

1st dimension

LC1

LC2

min

sec

November 16, 2016


110

2D-LC Comprehensive

11

• Todo o eluente da separação na 1D e todos os picos passam

para a separação na 2D.

• Frequencia : ≥ 2 recortes por pico para evitar a deseparação.

• Requer gradientes ultra-rápidos em 2D (sec), colunas curtas (≤

5 cm) e altas taxas de fluxos (≥ 2 mL/min).

• Uso: Amostras Desconhecidas/Complexas.

Princípio da Operação

November 16, 2016


111

Fluxo de Trabalho para „Heart-Cutting‘

Limitações da

técnica

November 16, 2016


112


Limitações da técnica

November 16, 2016


113


Limitações da técnica

November 16, 2016


114


Limitações da

técnica

November 16, 2016


115

Limite do Heart-Cutting (Simples)

November 16, 2016


116

Limitação do Heart-Cutting (Simples)

November 16, 2016


117

Nova Solução „Multiple Heart-Cutting (MHC)“

(A)

Deck com 6

„loops“

Loop-

1

Loop-

2

(A) Um dos „loops“ é trocado por uma válvulas

seletora com 6 diferentes posições, ou seja, 6

„loops“ diferentes: „Parking deck cluster“

oferecendo agora 7 posições de amostragem.

November 16, 2016


118


(A)

Deck

with 6

loops

Loop-

1

Loop-

2

(A) Um dos „loops“ é trocado por uma válvulas seletora com 6 diferentes posições,

ou seja, 6 „loops“ diferentes: „Parking deck cluster“ oferecendo agora 7

posições de amostragem.

(B) Parking deck cluster com 12 posições de amostragem.

• „Parking deck clusters“ permitir estacionamento pico múltiplos em paralelo

com a análise 2D

(B)

Deck-

B

Deck-

A

November 16, 2016


119

Outra visão para melhor ilustrar

=

Deck-

B

Deck-

A


Loop-1

Loop-6

Loop-1

Loop-6

November 16, 2016


120

Painel de Controle da ChemStation:

Todos os módulos

em somente um

painel de controle Pode ser remarcado

individualmente

ex: „BinPump-1st-Dim“

2D-LC - SOFTWARE

120

November 16, 2016


121

121

Configuração do Sistema 2D-LC“Somente uma tela para todo sistema - Hardware”

Definição da Bomba1D / 2D

Definição do Detector

da segunda

Dimenensão

Definição do Detector

da primeira

Dimenensão

(opcional)

Definiçõ da válvula (s) que

serão utilizadas para a

Injeção em 2D-LC

Definição da

configuração

possivel de

válvula/loop

November 16, 2016


122

122

Selecione o modo

2D-LC:

comprehensive /

heart-cutting

Defina o gradiente da

2ª dimensão

Defina a repetição do

gradiente da 2ª

dimensão

(Tempo de modulação)

Defina a janela de

tempo onde o modo

2D-LC foi selecionado

está ativo

Configuração do MétodoParâmetros especificos 2D-LC para a Bomba 2D

Representação

gráfica dos

gradientes em 1ª e 2ª

DimensõesAcesso ao método

padrão da bomba

Avisos de operação

das válvulas

Visão ampliada do

gradiente 2D

Ajuste de solventes

e Fluxo

November 16, 2016


123

1290 Infinity II 2D-LC

Heart-cutting 2D-LC

Co

mp

lexid

ad

e d

a a

mo

str

a

Multiple heart-cutting 2D-LC

Comprehensive 2D-LC

Comprehensive 2D-LC/MS

Impureza em

APIs

Formulações

complexas

Bio-fármacos

Produtos

naturais,

Amostras

biológicas....

November 16, 2016


124

Substâncias Farmacêuticas Achiral-chiral por 2D-LCIbuprofeno (racêmico) – Heart-Cutting

2nd Dim:

Chiral column

1st Dim:

C18

Application Note 5991-4664EN

November 16, 2016


125

Determinação de Taxanos em Taxus sp.Detecção de padrão com DAD e MS - Comprehensive

C18 with Methanol

Ph

en

yl-

He

xyl

wit

h A

CN

Detection:

DAD and MS

November 16, 2016


126

Aplicações em 2D-LC: Análise de Polifenois em Vinho Tinto

Condições cromatográficas Nota de Aplicação Agilent: 5991-1455EN

November 16, 2016


127

Aplicações em 2D-LC: Alimentos

Alergenicos em Alimentos• Matrix altamente carregada• Espectros analítico complexo de proteínas

alergênicas

Biotoxinas Marinhas• Espectros analítico altamente

complexo

• Muitos isomeros com mesma

m/z em Mass Spec

Ovatoxines a-e

November 16, 2016


128

Agilent Technologies no Mundo

A Garagem

da Hewlett-

Packard

1938

Um dos maiores

provedores de

soluções analíticas

em mais de 100

países

2016

Mais de 75 Anos no Mercado

Mais de 50 Anos na área Analítica

Servindo mais de 250.000 labs no mundo

November 16, 2016


129

Portifólio principal Agilent

Nova Familia LC Agilent InfinityLab!

LC 1290

Infinity II

Modular

1300 bar

240Hz

Sistema Universal com ISET

Alta Performance em UHPLC

LC 1260

Infinity II

Modular

400/600 bar

120Hz

2x ou 10x UV Sensitivity

100% HPLC Compativel

HPLC e UHPLC

LC 1220

Infinity II

Integrado

400/600 bar

120Hz

Mais acessível

HPLC e UHPLC

Tecnologia 1260 II/1290 II

November 16, 2016


130

1260

Binary

1220

Gradient

1220

Isocr.

SFC1260 SFC, SFC/MS, SFC/FID

1260 Hybrid SFC/UHPLC-MS

Bio-inert LC1260 Bio-inert LC + FC

1260 Multi-Detector Bio-SEC

1290 Infinity II LC

1260

Quat.

1260

Isocr.

Dissolution708, 400-DS, BIO-DIS,

850-DS, UV-Dissolution, MQ

App 1, 2, 3, 5, 6, 7

High-end UHPLC

Core UHPLC

Lowflow LC1260 Cap/2D-LC

1260 Nano

GPC-SEC1260 GPC, 1260 MDS,

GPC 50, GPC 220

Electrophoresis7100 CE, 2100 Bioanalyzer,

4200TapeStation,3100Offgel

Preparative LC1260 uS, 1260 AS, 1260 PS

218, SD1, A2Prep

HPLC-Chip/MSUHC-NCE,PhosphoPeptide

mAB-Glyco, HiP Protein ID

HDR-DAD

High-Speed Flexible

Portifolio Geral em LC Workflow Automation Solutions

I2I Method Transfer / ISET, 2D-LC, Method Dev., Multi-method/Walk-up, HT LC/MS, ACR,

Online-SPE, Online Sample Prep, Online Sampling, Impurity Analyzer, A2Prep, Mobile LC…

November 16, 2016


131

e-mail: [email protected] Tel: (011) 95470-0233

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