UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINRIA PS-GRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA HIGIENE VETERINRIA E PROCESSAMENTO TECNOLGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

MARIA CARMELA KASNOWSKI

Listeria spp., Escherichia coli: ISOLAMENTO, IDENTIFICAO, ESTUDO SOROLGICO E

ANTIMICROBIANO EM CORTE DE CARNE BOVINA (ALCATRA) INTEIRA E MODA

Niteri 2004

MARIA CARMELA KASNOWSKI

Listeria spp., Escherichia coli: ISOLAMENTO, IDENTIFICAO, ESTUDO SOROLGICO E ANTIMICROBIANO EM CORTE DE CARNE BOVINA (ALCATRA)

INTEIRA E MODA.

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obteno do Grau de Mestre. rea de Concentrao em Higiene Veterinria e Processamento Tecnolgico de P.O.A.

Orientador: Prof. Dr. ROBSON MAIA FRANCO

Niteri 2004

MARIA CARMELA KASNOWSKI

Listeria spp., Escherichia coli: ISOLAMENTO, IDENTIFICAO, ESTUDO SOROLGICO E ANTIMICROBIANO EM CORTE DE CARNE BOVINA (ALCATRA)

INTEIRA E MODA.

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obteno do Grau de Mestre. rea de Concentrao em Higiene Veterinria e Processamento Tecnolgico de P.O.A.

Aprovada em setembro de 2004.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Robson Maia Franco - Orientador Universidade Federal Fluminense

Prof. Dr. Luiz Antnio Trindade de Oliveira - Co- orientador Universidade Federal Fluminense

Dra. Maria da Graa Fichel do Nascimento Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria/ EMBRAPA

Niteri 2004

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A DEUS, por iluminar meu caminho e me fortalecer diante das dificuldades.

Ao meu pai, Francesco Kasnowski (in memorian), por ter me amado e pela certeza de que, mesmo to distante, estar feliz com mais uma conquista minha.

minha famlia: me, filho, marido, irmo e av; pelo exemplo de amor e por constiturem peas fundamentais na minha vida.

5

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Robson Maia Franco, pela oportunidade, confiana, amizade, dedicao e principalmente pela sua orientao imprescindvel na realizao desta pesquisa.

Ao Prof. Dr. Tefilo Jos Pimentel da Silva, por ter me iniciado na rea de tecnologia e inspeo de alimentos, pela amizade, pelo estmulo e apoio prestados durante todo o curso de mestrado.

Ao meu marido, Marcelo R. M. Holanda Duarte, por ter me proporcionado a oportunidade de voltar a estudar; pela amizade, amor e compreenso.

Ao Prof. Dr. Luiz Antnio Trindade de Oliveira, pelo estmulo, amizade e ajuda prestados.

Ao tcnico Alcinez Paes Fidelis, pela amizade e ajuda nas atividades laboratoriais.

Ao Prof. Srgio Carmona de So Clemente e ao Prof. Henrique Silva Pardi, ambos da Faculdade de Veterinria UFF, pelo apoio e recursos prestados.

Ao Dr. Ernesto Hofer e assistente Cristhiane Moura F. dos Reis (biloga) do Laboratrio de Zoonoses- Departamento de Bacteriologia da FIOCRUZ, pela realizao da caracterizao antignica das cepas de Listeria spp. isoladas.

Prof. Dra. Mnica Queiroz, da Faculdade de Veterinria UFF, pela amizade e auxlio na realizao da anlise estatstica desta pesquisa.

Prof. Dra. Eliana de Ftima Marques de Mesquita, da Faculdade de Veterinria- UFF, pela amizade e auxlio no uso da lngua estrangeira.

amiga Carolina Pombo, pelo auxlio na formatao do trabalho e na elaborao da apresentao.

6

Ao Drusio Ferreira de Paiva, secretrio da coordenao de ps-graduao, pela amizade, considerao e apoio s solicitaes.

Aos amigos do curso de mestrado, que me apoiaram e auxiliaram nesta pesquisa.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), pelo auxlio financeiro.

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SUMRIO

LISTA DE ILUSTRAES LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS RESUMO ABSTRACT 1 INTRODUO, p. 2 REVISO BIBLIOGRFICA, p. 2.1 Listeria spp. 2.1.1 TAXONOMIA E CARACTERSTICAS DO MICRORGANISMO 2.1.2 EPIDEMIOLOGIA 2.1.3 OCORRNCIA DE LISTERIA EM ALIMENTOS 2.1.4 FATORES INTERFERENTES NA SOBREVIVNCIA E NO CRESCIMENTO DE Listeria spp. 2.1.5 VIRULNCIA E PATOGENICIDADE 2.1.6 CARACTERSTICAS DA DOENA

2.2 Escherichia coli 2.2.1 TAXONOMIA E CARACTERSTICAS DO MICRORGANISMO 2.2.2 EPIDEMIOLOGIA 2.2.3 OCORRNCIA DE DIFERENTES SOROVARES DE E. coli EM ALIMENTOS 2.2.4 FATORES INTERFERENTES NA SOBREVIVNCIA E CRESCIMENTO 2.2.5 VIRULNCIA E PATOGENICIDADE 2.2.6 CARACTERSTICAS DA DOENA 2.3 MEDIDAS DE CONTROLE, p. 2.4 RESISTNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS 2.5 LEGISLAO 3 MATERIAL E MTODOS, p. 3.1 MATERIAL E AMOSTRAGEM 3.2 ANLISES BACTERIOLGICAS 3.3 METODOLOGIA 3.3.1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACTRIAS DO GNERO Listeria spp. 3.3.1.1 Provas bioqumicas 3.3.1.2 Caracterizao antignica das cepas isoladas de Listeria 3.3.2 ENUMERAO DE Escherichia coli 3.3.3 ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE Escherichia coli PATOGNICAS (EPEC

e EIEC) 3.3.3.1 Interpretao dos testes de Mili e EPM 3.3.4 ISOLAMENTO, IDENTIFICAO DE E.coli O157:H7 E DIFERENCIAO DE

CEPAS ENTEROHEMORRGICAS (EHEC) 3.3.5 SOROLOGIA 3.3.6 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS 3.4 ANLISE ESTATSTICA 4 RESULTADOS, p.

8

5 DISCUSSO, p. 6 CONCLUSES, p. 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS, p. 8 APNDICES, p. 9 ANEXOS, p.

9

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1- Isolamento de Listeria spp. pelo mtodo USDA Figura 2- NMP de Escherichia coli (MERCK, 2000) Mtodo I Figura 3- Isolamento e identificao de cepas de E.coli patognicas (EIEC, EPEC,

EHEC) (Mehlman; Lovett, 1984) Mtodo 2 Figura 4- Isolamento e identificao de E.coli O157:H7 e diferenciao de cepas

enterohemorrgicas (EHEC) (MERCK, 1996) Mtodo 3 Figura 5 - Listeria spp.; Microscopia eletrnica Figura 6 - Listeria spp. com presena de flagelos peritrquios (microscopia eletrnica) Figura 7 - Colnias de Listeria spp. em placas contendo gar MOX Figura 8 - Listeria spp.; colorao de Gram; microscopia ptica Figura 9 - CAMP- test. Placa contendo gar com sangue de carneiro. Figura 10 - Caldo Fluorocult com reagente de Kovacs para diagnstico rpido de E.

coli e Caldo Fluorocult sob luz UV Figura 11 - Teste de sensibilidade aos antimicrobianos; meio gar Meller- Hinton

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Nmero de cepas de Listeria spp. isoladas das amostras de carne (alcatra) inteira e carne (alcatra) moda TABELA 2- Nmero de cepas isoladas de acordo com o meio de enriquecimento das amostras de carne inteira e moda. TABELA 3 - Valores mdios de isolamentos de cepas de Listeria spp. em amostras

de carne bovina (alcatra) inteira e moda TABELA 4 - Valores mdios de isolamentos de cepas de Listeria spp. quanto ao

enriquecimento primrio e secundrio aos enriquecimentos primrios e secundrios utilizados na metodologia

TABELA 5 Comportamento das cepas de Listeria spp. isoladas frente aos antimicrobianos

TABELA 6 - Resultados das anlises de NMP pelo mtodo 1 de amostras de carne (alcatra) inteira (CI) e carne moda (CM)- Enumerao de Escherichia coli.

TABELA 7 - Valores mdios de NMP de coliformes a 35C e coliformes a 45C em amostras de carne bovina (alcatra) inteira e moda.

TABELA 8 - Nmero de colnias de Escherichia coli isoladas de amostras de carne bovina (alcatra) pelo mtodo 2

TABELA 9 - Nmero de colnias de Escherichia coli isoladas de amostras de carne bovina (alcatra) pelo mtodo 3

TABELA 10 - Valores mdios de isolamento de cepas de E. coli de amostras de carne bovina (alcatra) quanto ao fator tratamento (inteira e moda)

TABELA 11 - Valores mdios de cepas de E. coli oriundas de amostras de carne bovina (alcatra) inteira e moda quanto ao fator mtodo de isolamento 2 e 3.

TABELA 12 - Sorogrupos indicadores de Escherichia coli considerados patognicos isolados de meios de cultura seletivos

TABELA 13 - Comportamento das cepas de E. coli isoladas e sorotipadas como patognicas frente aos antimicrobianos

TABELA 14 Caractersticas diferenciais de Listeria spp. TABELA 15 Caractersticas bioqumicas teis na diferenciao dos gneros

Brochothrix, Erysipelothrix, Listeria, Lactobacillus e Kurthia. TABELA 16 Sorotipos das espcies de Listeria TABELA 17 Caractersticas bioqumicas identificveis da Escherichia coli

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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

Aa Atividade de gua ABNT Associao Brasileira de Normas Tcnicas A/E Attachment/ Efforcement APHA America Public Health Association AMPc Adenosina monofosfato cclica AOAC Association of Official Analytical APPCC Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle ATCC American Type Culture Collection bact./mL bactria/mililitro Bfp Bundle forming pillus BPF Boas Prticas de Fabricao BHI Brain Heart Infusion C Graus centgrados CDC Centers for Disease Control CFA. Co Factor Adesion cm centmetro DAEC Diffusely adherent Escherichia coli DIC Delineamento Inteiramente Casualizado eae Escherichia coli attaching and effacing eaf EPEC adherence factor EaggEC Enteroaggregative Escherichia coli EHEC Enterohemorrhagic Escherichia coli EIEC Enteroinvasive Escherichia coli EMB Eosin Metilen Blue EPEC Enteropathogenic Escherichia coli ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli EUA Estados Unidos da Amrica FAO Food Agriculture Organization FDA Food and Drug Administration FSIS Food Safety and Inspection Service g Grama h Hora HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point H2S Sulfeto INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em

Sade Inv Invasion IPA Invasion Plasmid Antigen Kcal Quilocalorias KDa Quilo Dalton Kg Quilograma KGy Quilogray LLO Listeriolisina O LT Labile Toxin M.A Ministrio da Agricultura MCLac MacConkey lactose MCS MacConkey sorbitol

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MDal mili Dalton Mg Miligrama MG Minas Gerais MILI Motilidade Indol Lisina mL Mililitro Mm Milmetro MOX Modified Oxford MR Metil Red M.S Ministrio da Sade MUG Metil Umbeliferil Galactopiranosdeo n Nmero NaCl Cloreto de sdio NCCLS National Committee for Clinical Laboratory

Standards Nm Nanmetro NMP Nmero Mais Provvel OMS Organizao Mundial de Sade Pb Pares de base Per Plasmid encoded regulator POA Produtos de origem animal PPHO Procedimentos Padro de Higiene Operacional PTT Prpura Trombocitopnica Trombtica RJ Rio de Janeiro SIF Servio de Inspeo Federal SIM Sulfeto Indol Motilidade SLT Shiga Like Toxin SNC Sistema nervoso central SOPs Sanitation Standard Operating Procedures SP So Paulo SS Salmonella-Shigella SSP Soluo salina peptonada ST Stabile Termic SUH Sndrome Urmica Hemoltica TAF Trplice Acar Ferro TSI Triple Sugar Iron UFC Unidades Formadoras de Colnias UFF Universidade Federal Fluminense USDA United State Departamment of Agriculture UV Ultra-Violeta UVM University of Vermont Medium VP Voges Proskauer VT Verotoxina m Micrmetro % Por cento

13

RESUMO

Os surtos de enfermidades transmissveis por alimentos (ETA) constituem

alvo de preocupao para as indstrias alimentcias e para os rgos de Sade Pblica. A Listeria monocytogenes e as cepas patognicas de Escherichia coli esto comumente presentes no trato intestinal dos animais, possibilitando a contaminao da carcaa e cortes de carne durante o abate ou o processamento inadequado. A importncia que a carne apresenta na alimentao humana associada necessidade de se oferecer sempre um alimento incuo e incapaz de veicular doenas, induziram ao desenvolvimento desta pesquisa com o objetivo de isolar e identificar Listeria spp.; enumerar, isolar e identificar sorogrupos de E. coli em 30 amostras de carne bovina (alcatra) comercializadas em supermercados e aougues do Rio de Janeiro. Dessas amostras, 15 foram inteiras e 15 modas no prprio estabelecimento. Aps identificao, os sorogrupos tambm foram testados quanto susceptibilidade antimicrobiana. Dentre as amostras examinadas, um maior nmero de isolamentos foi obtido na carne moda, porm, sem significncia estatstica. As cepas de Listeria mais identificadas pertenciam ao sorogrupo da L. innocua 6a, seguida da L. monocytogenes 4b. O mtodo utilizado foi o da USDA com enriquecimento secundrio, o que possibilitou maior percentual de isolamento. Em relao E. coli, foram isoladas cepas EPEC, EIEC e EHEC. Todos os isolamentos foram confirmados bioqumica e sorologicamente. As cepas patognicas de Listeria e E. coli apresentaram grande espectro de resistncia frente aos antimicrobianos testados. A presena de L. monocytogenes e sorogrupos de E. coli nas amostras avaliadas indicativa da necessidade de se colocar em prtica os programas de Boas Prticas de Fabricao (BPF), Procedimentos Padro de Higiene Operacional (PPHO) e Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (APPCC); preservando desta maneira a sade do consumidor.

Palavras - chave: carne bovina, Listeria, Escherichia coli, antimicrobianos.

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ABSTRACT

The outbreaks of foodborne diseases constitute a target of concern to the food industries and to the Public Health agencies. Listeria monocytogenes and pathogenic variants of Escherichia coli are usually present in the intestinal tract of animals, making possible the contamination of the carcass and meat cuts during slaughtering or by inadequate processing. The importance of meat as human food associated to the needs of having a safety food which is not capable to cause illnesses, had induced to the development of this research with the objective to isolate and to identify Listeria spp.; to enumerate, to isolate and to identify strains of E. coli in 30 samples of beef (heart of rump) sold in supermarkets and butchers of Rio de Janeiro. Of these samples, 15 were composed by whole beef and 15 were grounded in each own establishment. After identification, the strains were also tested for antimicrobial susceptibility. Amongst the examined samples, a greater number of isolations were obtained from ground meat, but it was not statistically significant. Most of the variants of Listeria identified belonged to serogroup of L. inoccua 6a, followed of L. monocytogenes 4b. The adopted method was the USDA with secondary enrichment, which made possible a great percent of isolation. Concerning E. coli, variants of EPEC, EIEC and EHEC were isolated. All the isolates had been confirmed biochemically and sorologically. The patogenic variants of Listeria and E. coli presented a great specter of resistance to antimicrobials. The presence of L. monocytogenes and serogroups of E. coli in the examined samples stands out the need of programs of Good Manufacturing Practice (GMP), Sanitation Standard Operation Procedures (SSOP), and Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP); to preserve the consumers health.

Key-words: beef, Listeria, Escherichia coli, antimicrobial.

15

1 INTRODUO

A carne bovina uma excelente fonte de protenas de alto valor biolgico, de

vitaminas do complexo B e minerais essenciais (especialmente ferro e zinco), sendo

muito utilizada na alimentao humana (FELCIO, 1998). A carne moda destaca-se,

entre os produtos crneos, pela sua boa aceitao comercial e por se caracterizar

como produto popular utilizado em refeies de maneiras prticas e variadas

(FLORENTINO et al., 1997).

A alcatra um corte de carne bovina, cuja composio mdia presente em

100g : 191,0 Kcal; 30,4g de protenas; 6,8g de gordura; 89,0 mg de colesterol; 3,4

mg de ferro e 6,5 mg de zinco (PROTESTE, 2003).

Entretanto os alimentos crneos, particularmente aqueles que passam por

aprecivel manuseio, se constituem em excelente meio de cultura devido elevada

porcentagem de umidade, pH prximo neutralidade e composio rica em

nutrientes; favorecendo a instalao, sobrevivncia e multiplicao de grande

nmero de microrganismos capazes de provocar toxinfeces no homem (FRAZIER;

WESTHOFF, 1993).

As condies sanitrias deficientes durante o abate dos animais, cozimento

inadequado, armazenamento imprprio e falta de higiene durante o preparo dos

produtos crneos so fatores que podem predispor os indivduos a ETA ou a

tornarem-se portadores assintomticos.

As enfermidades humanas e animais passam a ter maior destaque quando se

transformam em condies que contribuem para a diminuio da produo e da

oferta de bens e servios de uma populao, bem como, quando comprometem a

sade humana. Alm disso, a presena de microrganismos patognicos em

16

alimentos muitas vezes significa uma barreira para as exportaes, influenciando

significativamente na economia do pas.

Neste contexto as ETA se constituem atualmente em uma grande

preocupao para as indstrias de alimentos e rgos oficiais de regulamentao

em termos de segurana alimentar.

Inicialmente denominada Bacterium monocytogenes, Listerella hepatolytica,

Erysipellothrix monocytogenes e finalmente Listeria, em homenagem a Lord Lister,

descobridor da antissepsia; o agente causal da listeriose foi descrito pela primeira

vez no ano de 1926 por Murray, em virtude de uma infeco espontnea que

ocorreu entre cobaias de laboratrio caracterizada por uma monocitose, em

Cambridge EUA (FARBER; PETERKIN, 1991; HOBBS; ROBERTS, 1992;

PEREIRA; ROCOURT, 1993; LOGUERCIO et al, 2001; RYSER; DONNELLY, 2001).

O meio cientfico foi despertado para o perigo da listeriose durante a dcada

de 80, quando uma srie de surtos ocorreu na Amrica do Norte e Europa

(SCHLECH, 1988; FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Os estudos e procedimentos para isolamento e enumerao de Listeria spp

em alimentos tm aumentado muito nos ltimos anos, tendo em vista a comprovada

relevncia como patgeno emergente de origem alimentar, documentada pelos

inmeros surtos e casos de listeriose que surgiram nas dcadas de 80 e 90,

envolvendo alimentos como veculo (FARBER; PETERKIN, 1991; OLIVEIRA, 1993).

No Brasil e em alguns pases no existem surtos de listeriose documentados

causados por alimentos, entretanto, isto no significa que estejam livres deste

problema emergente. O que vem ocorrendo a subnotificao, uma vez que

trabalhos publicados recentemente relatam a presena do microrganismo em

alimentos, tornando-se uma preocupao devido ingesto de produtos de origem

animal ser considerada a principal fonte de transmisso para o Homem (LOVETT,

1988; SCHLECH, 1988; NASCIMENTO; CULLOR, 1994; INTERLAB, 2002).

Outro prisma a ser abordado que, na rotina bacteriolgica de um laboratrio,

observa-se que aproximadamente 90% dos isolados so bactrias Gram negativas,

sendo que 95% pertencem famlia Enterobacteriaceae, onde a Escherichia coli

inclui-se no quadro das espcies mais comumente identificadas. No caso do

Homem, estas bactrias podem determinar processos entricos, assim como uma

variedade de infeces extra-intestinais. Segundo a Organizao Mundial da Sade

(OMS), estima-se a ocorrncia no mundo de um bilho de episdios diarricos por

17

ano, atingindo, particularmente, crianas menores de cinco anos, tendo como

conseqncia elevada letalidade (BRASIL, 2002).

Escherichia coli a espcie predominante entre os diversos microrganismos

anaerbios facultativos que fazem parte da microbiota intestinal de animais de

sangue quente. O significado da sua presena nos alimentos deve ser avaliado sob

dois ngulos: indica contaminao microbiana de origem fecal e portanto condies

higinicas insatisfatrias; e o outro aspecto a ser considerado que diversas

linhagens so comprovadamente patognicas para o Homem e os animais. A

enumerao laboratorial de E. coli auxilia na deteco do perigo potencial de uma

toxinfeco alimentar atravs da gua e dos alimentos fornecidos ao consumo

(HOBBS; ROBERTS, 1992; FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Franco (2002) relata que esta espcie foi descrita pela primeira vez por Dr.

Theodor Escherich em 1885 ao tentar isolar o agente etiolgico da clera. Germano

e Germano (2001) citam que o primeiro nome dado a esta bactria foi Bacterium coli

commune devido ao fato de ser encontrada no clon e extremamente comum nos

animais e no Homem.

Os surtos decorrentes da infeco por Escherichia coli (EPEC, EIEC, EaggEC

e EHEC) so considerados severos. A Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC) e

a E. coli enteroagregativa (EaggEC) destacam-se entre os microrganismos

classificados como emergentes (MARTINS et al., 2003). Os sorotipos de EHEC so

os que produzem duas citotoxinas responsveis pela colite hemorrgica no homem,

tendo como complicao mais importante a sndrome hemoltica urmica. O sorotipo

O157:H7 a EHEC mais freqentemente encontrada. A EaggEC foi descrita mais

recentemente e est associada a casos crnicos de diarria (ibid.).

A E. coli O157:H7 tem sido reconhecida mundialmente, nos ltimos tempos,

como um dos microrganismos mais envolvidos nos surtos de doenas veiculadas por

alimentos em humanos. Em 1982 ocorreu um surto de E.coli O157:H7 pelo consumo

de hambrguer mal cozido em uma grande rede de fast food nos Estados Unidos,

que envolveu 600 pessoas resultando na morte de quatro crianas (SILVA et al,

1997).

A Listeria spp., Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC) e a E. coli

enteroagregativa (EaggEC) so patgenos emergentes que vm sendo relacionados

a diversos surtos de doenas de origem alimentar principalmente por estarem

18

presentes no trato gastrintestinal dos animais, sendo muito comum a contaminao

da carcaa e cortes de carne durante o abate ou processamento inadequado.

Os relatos anteriormente citados contribuem para que o controle

microbiolgico se apresente como uma etapa essencial durante o processamento da

carne, para o fornecimento de um alimento aceitvel e seguro ao consumo. Tanto a

presena de microrganismos contaminantes quanto a de patgenos podem provocar

alteraes que descaracterizam o produto ou, no caso de alguns patgenos, tornar

somente o seu consumo perigoso e imprprio para a sade humana, sem,

entretanto, causarem alteraes aparentes.

Com base nos fatos mencionados, o presente estudo teve como objetivo:

- Verificar a ocorrncia de bactrias dos gneros Listeria e Escherichia a

partir de amostras de corte de carne bovina (alcatra), inteira e moda, em

diferentes estabelecimentos nas condies oferecidas ao consumo;

- Isolar e identificar Listeria utilizando a metodologia proposta pelo USDA;

- Enumerar, isolar e identificar E. coli nas respectivas amostras por

diferentes mtodos;

- Realizar a sorologia e o teste de sensibilidade antimicrobiana das cepas

de Listeria spp. e E. coli isoladas;

- Alertar as autoridades sanitria e fiscalizadora para possveis riscos de

ocorrncia de surtos por Listeria e diferentes sorotipos de E. coli.

19

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 Listeria spp. 2.1.1 TAXONOMIA E CARACTERSTICAS DO MICRORGANISMO

Segundo Seeliger e Jones (1986), as bactrias do gnero Listeria so

bastonetes Gram positivos curtos, no formadores de esporos, anaerbios

facultativos, com extremidades arredondadas, medindo 0,4 a 0,5 m de dimetro e

0,5 a 2,0 m de comprimento. Podem ocorrer isoladamente em cadeias curtas ou

arranjados em ngulos formando V entre si ou em grupos que se mantm paralelos

ao longo dos eixos (ANEXOS- FIGURA 5).

A Listeria monocytogenes mvel devido a flagelos peritrquios,

apresentando movimento caracterstico denominado tombamento ou

turbilhonamento que auxilia na sua identificao, mas a 37C a produo de flagelos

reduzida notavelmente (FARBER; PETERKIN, 1991; FRANCO; LANDGRAF, 1996;

TODAR, 2003) (ANEXOS-FIGURA 6).

Em relao s caractersticas bioqumicas, Listeria spp catalase positiva,

oxidase negativa, mvel a 20C; algumas espcies so hemolticas em gar

sangue (L. monocytogenes, L. seeligeri e L. ivanovii), D-xilose negativo, D-manitol

negativo, L-ramnose positivo, metil-D-manosdio positivo, fermentam a glicose,

vermelho de metila positivo, Voges Proskauer positivo, indol negativo, esculina

positivo e no reduzem nitrato (SEELIGER; JONES, 1986; LOVETT, 1988; BILLE et

al., 1992) (ANEXOS- TABELA 14).

Em gar nutriente, as colnias, aps 24 48 horas de incubao, so

arredondadas, translcidas, pouco convexas e de bordos regulares. Apresentam

20

colorao cinza azulada pela iluminao normal e produzem um brilho verde azulado

caracterstico quando a luz transmitida obliquamente (SEELIGER; JONES, 1986).

O gnero Listeria classificado juntamente com os gneros Lactobacillus,

Erysipelotrix, Brochothrix, Caryophanon e Renibacterium (ANEXOS- TABELA 15).

As espcies reconhecidas so: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L.

welshimeri, L. seeligeri, L. grayi, L. murayi. A espcie L. denitrificans foi transferida

para o gnero Jonesia (ibid.).

No que diz respeito sorologia, foram descritos 16 sorovares, sendo 15

antgenos somticos O e cinco antgenos flagelares H. A Listeria monocytogenes,

considerada a espcie patognica para homens e animais, contm os sorovares

1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 7 (ibid) (ANEXOS- TABELA 16).

2.1.2 EPIDEMIOLOGIA

A listeriose apresenta distribuio geogrfica mundial, sendo aparentemente

mais freqente nos climas temperados que nos tropicais. Ocorre em todas as

espcies de animais domsticos, sendo mais comum em ruminantes, coelhos e aves

(CORRA; CORRA, 1992).

Listeria monocytogenes encontra-se amplamente disseminada na natureza.

Tanto o Homem como os animais e o ambiente servem como reservatrios. No

Homem, o seu isolamento de indivduos assintomticos, provavelmente,

conseqncia da colonizao do trato intestinal (LAGE, 1993; OLIVEIRA, 1993;

FRANCO; LANDGRAF, 1996; SILVA, 1996; TODAR, 2003).

O primeiro surto de listeriose humana veiculada por alimentos data de 1979,

nos EUA, quando 20 pacientes internados apresentaram a doena atribuda ao

consumo de saladas de alface, tomate e salso (LOGUERCIO et al., 2001).

Durante a dcada de 80 ocorreram vrios surtos, como, por exemplo, os

relatados no Canad em 1981; Califrnia em 1983; Sua 1983-1987; Reino Unido

1989-1990 e Frana 1993-1995 (SCHLECH, 1988; UBOLDI EIROA, 1990;

PEREIRA; ROCOURT, 1993; NASCIMENTO; CULLOR, 1994; FRANCO;

LANDGRAF, 1996; LOGUERCIO et. al., 2001; CRESPO et al., 2003).

Entretanto, o primeiro surto que realmente despertou os microbiologistas de

alimentos para o problema ocorreu no Canad, e o alimento incriminado foi a salada

21

de repolho cru (tipo coleslaw). A hortalia era cultivada em campos fertilizados com

fezes de ovinos, que haviam sido portadores da listeriose (ibid.).

O ocorrido em Massachussets (USA) foi atribudo ao consumo de leite

pasteurizado; na Califrnia, foi associado ao consumo de queijos estilo Mexicano; na

Sua, o alimento envolvido tambm foi o queijo (ibid.).

A maioria dos casos diagnosticados se concentra na Europa e Estados

Unidos. Recentemente o nmero de casos informados vem aumentando,

provavelmente devido a um melhor diagnstico laboratorial juntamente com um

aumento da populao susceptvel; alta prevalncia da bactria no ambiente e

hbitos de manuseio, preparo e armazenamento inadequados dos alimentos

(CRESPO et. al., 2003).

Em estudos diversos, ficou evidenciada a presena de Listeria spp a partir de

diversas fontes como animais domsticos e silvestres; peixes, animais marinhos e

gua do mar; vegetao, silagem e forragens; em solos e esgoto. A habilidade do

microrganismo em sobreviver s condies ambientais extremas explica a

ocorrncia em reas rurais e urbanas em diferentes regies do mundo (BRACKETT,

1988; SCHLECH, 1988; HOBBS; ROBERTS, 1992). Hofer e Pvoa (1984)

demonstraram essa capacidade de sobrevivncia ao isolarem L. monocytogenes a

partir de 20 amostras de solo da cidade do Rio de Janeiro.

A Listeria monocytogenes tem sido identificada com relativa freqncia em

fezes de pessoas e animais aparentemente sadios, sendo encontrada em guas de

esgoto; como foi demonstrado por Hofer (1975) em amostras provenientes da

estao de tratamento de esgoto da Penha e do Galeo (Rio de Janeiro).

A Listeria spp tambm tem sido isolada em superfcies de equipamentos e de

vrios produtos de usinas de processamento de leite e derivados; indstrias

processadoras de carnes; desde a entrada da matria-prima at s guas residuais

(FRANCO; LANDGRAF, 1996; SILVA, 1996).

A Listeria monocytogenes pode acometer uma variedade de espcies de

animais silvestres ou domsticos, de sangue frio ou quente. Deste modo, a listeriose

considerada uma zoonose na qual o agente etiolgico apresenta grande potencial

patognico para o Homem (SCHLECH, 1988).

No perodo de 1969 a 1983, Hofer et al. (1984) caracterizaram

sorologicamente 71 cepas de L. monocytogenes, isoladas de processos patolgicos

e de portadores humanos no estado do Rio de Janeiro.

22

Kampelmacher e Van Noorle Jansen1 (1969; apud BRYAN, 1986) constataram que entre as pessoas que trabalhavam em abatedouros 10 a 30% eram

portadores assintomticos de Listeria monocytogenes e tambm que veterinrios de

campo apresentavam listeriose cutnea adquirida pela manipulao de produtos de

aborto infectados.

Durante os surtos, a mortalidade pode atingir 40% dos acometidos pela

infeco; nos casos de meningite, essa taxa pode atingir 70% e nas septicemias

50% (GERMANO; GERMANO, 2001).

No Brasil no existem descries de surtos de listeriose causados por

alimentos, entretanto, h relatos da presena do microrganismo em alimentos,

tornando-se uma preocupao, j que a ingesto de alimentos de origem animal

considerada a principal fonte de transmisso para o Homem (NASCIMENTO;

CULLOR, 1994).

A ocorrncia dessa enfermidade est crescendo em nvel mundial, fato esse

que preocupa as indstrias e as autoridades sanitrias devido sua alta taxa de

mortalidade, larga distribuio em produtos crus, capacidade de crescimento em

baixas temperaturas e de se estabelecer nos vrios ambientes do processamento de

alimentos (SILVA; TIBANA, 1995; MURIANA, 1996; RIJPENS et al., 1997).

2.1.3 OCORRNCIA DE LISTERIA EM ALIMENTOS

De acordo com a literatura 32% dos casos espordicos de listeriose so

atribudos ao consumo de alimentos contaminados (CRESPO et al., 2003).

Dediol et al. (2002) ressaltam que muitos animais portam Listeria

monocytogenes em seu trato intestinal, o que impossibilitaria sua total eliminao da

carne crua. Este fato associado ao carter ubquo do patgeno e s restritas normas

de higiene resultaria na inevitvel contaminao de numerosos alimentos.

Deste modo, os alimentos incriminados so diversos tais como: leite cru e

pasteurizado, queijos, carnes bovinas, sunas, de aves, peixes, embutidos, carne

moda, produtos crneos crus e termoprocessados, alm de produtos de origem

vegetal, origem marinha e refeies preparadas (FRANCO; LANDGRAF, 1996;

GERMANO; GERMANO, 2001; DEDIOL et al., 2002).

1 KAMPELMACHER, E.H.; VAN NOORLE JANSEN, L.M. Zentrakbl. Bakteriol. Parasitenk, Infektionskr.Hyg. Abt.1:Orig. A211, 353, 1969.

23

O leite e produtos lcteos (principalmente queijos) tm sido os alimentos mais

freqentemente envolvidos em casos recentes e espordicos de listeriose

associados aos produtos alimentares (DESTRO; SERRANO, 1990; NASCIMENTO;

CULLOR, 1994; LOGUERCIO et. al. 2001).

Guerra e Bernardo (1999) analisaram 68 amostras de queijos alentejanos e

isolaram Listeria sp. em 25% dessas; tendo sido encontrada L. monocytogenes em

11,8%.

H relatos da presena de Listeria monocytogenes em diversos tipos de

queijos, nos processos de produo e armazenamento de leite em p, manteiga,

leite fermentado refrigerado, leitelho, iogurte desnatado e integral (DESTRO;

SERRANO, 1990).

Em relao presena do microrganismo em leite pasteurizado, vrios

estudos foram realizados com o intuito de esclarecer a termotolerncia do

microrganismo devido localizao intracelular, contudo ainda h discordncia

sobre esta questo (DESTRO; SERRANO, 1990; PEREIRA; ROCOURT, 1993;

FRANCO; LANDGRAF, 1996). Alguns autores justificaram a ocorrncia devido a

uma insuficiente pasteurizao ou a recontaminao ps-processamento (UBOLDI

EIROA, 1990; LOGUERCIO et. al., 2001).

Destro e Serrano (1990) advertiram para a sobrevivncia do microrganismo

em carnes de cordeiro, suno e bovina moda mantidas a 0C por 20 a 24 dias.

Tambm descreveram outros produtos que possibilitavam a sobrevivncia e/ou o

crescimento de L. monocytogenes, como ovos lquidos e desidratados, salames,

embutidos, peito de frango e msculo bovino.

Existem relatos de isolamentos de L. monocytogenes de cortes de frango,

peru, salsichas, salame, carne bovina moda e outros produtos crneos, pescados

(camaro, caranguejo, lagostas, mariscos, lula), vegetais (alface, tomate, salso) e

alimentos congelados (FABER et al., 1989; JOHNSON et. al., 1990; UBOLDI EIROA,

1990; WONG et. al., 1990; PEREIRA; ROCOURT, 1993).

Em um programa realizado pelo USDA-FSIS para verificar a ocorrncia de L.

monocytogenes em carne bovina crua, no perodo de 1987 a 1990, o microrganismo

foi isolado de 122 (7,1%) das 1.726 amostras monitoradas (RYSER; MARTH, 1991).

A incidncia de Listeria em produtos crneos tambm foi demonstrada por Truscott e

24

McNab2 (apud RYSER; MARTH, 1991) ao isolarem Listeria spp. em 45 das 50

amostras de carne bovina moda analisadas no Canad. Na Frana, Le Guillox et

al.3 (apud RYSER; MARTH, 1991) tambm demonstraram a ocorrncia de L.

monocytogenes em 4,9%, 21,2% e 19,8% das amostras avaliadas de carcaa

bovina, carne moda e carne moda congelada respectivamente.

Dentre os trabalhos realizados no Brasil, referentes ao isolamento de Listeria

em alimentos, destacam-se alguns, como: a anlise de 20 produtos crneos e

lcteos nos quais foi detectada a presena de L. monocytogenes em 4,4% das

amostras de carne de frango, 70% das de salsicha, 80% das de lingia frescal, 65%

das de carne moda, 8,9% das de camaro industrializado e 10% das de queijo tipo

minas frescal (DESTRO et al., 1992); amostras originrias de 25 quartos dianteiros

bovinos, que, aps a desossa, foram utilizados como matria-prima para

industrializao, das quais 24 resultaram em positivas (PICCHI et al., 2003); 50

amostras de carne moda, das quais 24 estavam contaminadas por Listeria spp.

(MESQUITA, 1990); a carne de frango na cidade de Belo Horizonte, na qual a

freqncia foi alta em 100% das amostras, tendo a ocorrncia de L. monocytogenes

em 4,4% (LAGE, 1993); 40 amostras de peito de frango congelado em que 100%

foram positivas e 50% para a espcie L. monocytogenes (GONALVES, 1998);

amostras fatiadas de blanquet de peru e presunto de peru com a freqncia de 50%

e 60% de L. monocytogenes respectivamente (ARAJO, 1998).

Dediol et al. (2002) analisaram 100 amostras de carne moda de

supermercados e aougues da rea de Mendoza, detectando 37% dessas amostras

contaminadas com Listeria monocytogenes. No total, isolaram e estudaram 306

colnias, das quais 68 cepas foram identificadas como Listeria monocytogenes. Os

autores relataram que os resultados encontrados assemelhavam-se as 34,2%

amostras positivas de carne fresca analisadas por Iida4 (1998; apud DEDIOL et al.,

2002). Numa avaliao da qualidade microbiolgica de 20 amostras de carne moda

em supermercados e aougues, realizada por uma equipe da defesa do consumidor,

a Listeria monocytogenes foi encontrada em duas amostras modas no momento da

2 TRUSCOTT, R.B.; McNAB, W.B. Comparison of media and procedures for the isolation of Listeria monocytogenes from ground beef. J. Food Prot. V.51, p. 626-628, 1988. 3 LE GUILLOUX, M.; DOLLINGER, Cl.; FREYBURGER, G. Listeria monocytogenes- Sa frequence dnas les produits de charcuterie. Bull. Soc. Vet. Prat. France, V.64, n1, p. 45-53,1980.

25

compra, em duas das previamente modas e vendidas a granel e em cinco das pr-

modas e embaladas (PROTESTE, 2003).

Existem numerosos caldos de enriquecimento e meios de plaqueamento para

isolamento e deteco de Listeria spp. em alimentos. Os mais comumente utilizados

so os desenvolvidos pelo FDA e USDA (RYSER; DONNELLY, 2001). O mtodo do

FDA usado para examinar leite, produtos lticos, pescado e vegetais. Por

conseguinte, McClain e Lee (1988),testando o procedimento do USDA, isolaram L.

monocytogenes de 20 das 41 amostras de carne moda congelada e 12 das 23

amostras de lingia de porco; comprovando a eficincia do mtodo na avaliao de

carne crua, produtos crneos e de aves.

2.1.4 FATORES INTERFERENTES NA SOBREVIVNCIA E NO CRESCIMENTO DE Listeria spp.

Diversos fatores podem afetar o crescimento, a sobrevivncia e a

multiplicao da Listeria em alimentos, dentre eles: temperatura, pH, atividade de

gua, cloreto de sdio, nitrito de sdio, conservantes, atmosfera e outros.

Os alimentos de origem animal, particularmente os que passam por

aprecivel manuseio, como, por exemplo, os produtos crneos que sofrem processo

de moagem, apresentam condies propcias para instalao, sobrevivncia e

multiplicao de grande nmero de microrganismos (MOTTA et al., 2000;

PROTESTE, 2003).

O desenvolvimento da agroindstria alimentar, a forma como os alimentos

so produzidos, a habilidade da Listeria spp de sobreviver em condies adversas,

sua capacidade de crescer em temperatura de refrigerao, aliada sua resistncia

ao congelamento, ao calor e a diversos antibiticos, tornaram esse microrganismo

emergente e de grande importncia entre os patgenos transmitidos por alimentos

(FARBER; PETERKIN,1991; SILVA; TIBANA, 1995; MURIANA, 1996; RIJPENS et

al., 1997; BRACKETT,1998).

As listerias crescem em temperatura de 1 a 45C, sendo a faixa tima de 30 a

37C, embora existam relatos sobre o crescimento a 0C. Suportam repetidos

congelamentos e descongelamentos (LOVETT,1988; FRANCO; LANDGRAF, 1996;

SEELIGER; JONES, 1986; GERMANO; GERMANO, 2001.). A caracterstica

4 IIDA, T., et al. Detection of Listeria monocytogenes in humans, animals and foods. J. Vet. Med. Sci.

26

psicrotrfica depende da integridade celular e de um sistema de transporte

energtico resistente ao frio, que estimula o metabolismo sob baixas temperaturas,

propiciando altas concentraes de substratos intracelulares e uma lag fase

prolongada em temperaturas de refrigerao (OLIVEIRA, 1993). Destro e Serrano

(1990) relataram estudos sobre o isolamento de Listeria spp. em carne moda

armazenada sob refrigerao (4C), onde se verificou que o microrganismo

permanecia vivel por duas semanas ou at por 30 dias. Alm de sua caracterstica

psicrotrfica, diversos autores mencionaram sua capacidade de termotolerncia

(VARNMAM; EVANS, 1996a; LOGUERCIO et. al., 2001).

Embora o pH timo para crescimento esteja numa faixa entre 6,0 e 8,0 (ibid;

LOVETT, 1988), podem resistir a um intervalo mais amplo de 5,0 e 9,6 (UBOLDI

EIROA, 1990). No entanto, em algumas situaes especiais, foi relatada a

ocorrncia do microrganismo em pH 4,3 e 4,8; apesar desses serem considerados

imprprios para a bactria (ibid; MARTINIS et. al. ,1997.).

Com relao concentrao de NaCl, constatou-se a sobrevivncia em

10,5% e 13% quando incubada a 37C por 15 e 10 dias respectivamente. Em

concentraes de 20 a 30% de NaCl, o tempo de sobrevivncia foi reduzido para

cinco dias. Mas, se a temperatura for reduzida para 4C, a bactria pode sobreviver

por mais de 100 dias em concentraes entre 10,5 e 30,5% de Na Cl (UBOLDI

EIROA, 1990; FRANCO; LANDGRAF, 1996). Martinis et. al. (1997) relataram que a

L. monocytogenes capaz de crescer em meios contendo 10% de NaCl com pH 7,0

a 25C e em 20% de NaCl a 4C por oito semanas.

A atividade de gua (Aa) tima para seu crescimento prxima a 0,97;

contudo foi observada sua sobrevivncia em alimentos desidratados com Aa inferior

a 0,93, levando suposio de que pelo menos um certo perodo de tempo seja

capaz de tolerar condies de baixa Aa (UBOLDI EIROA, 1990; FRANCO;

LANDGRAF, 1996). Varnmam e Evans (1996a) relataram um valor mnimo de Aa de

0,932 com glycol como humectante e 0,942 com sacarose ou NaCl.

Foi constatado que a L. monocytogenes capaz de tolerar concentraes de

nitrito de sdio da ordem de 156ppm, mximo permitido nos Estados Unidos da

Amrica do Norte. Entretanto, combinando o seu uso com a influncia de outros

fatores ou agentes inibidores, foi possvel controlar o desenvolvimento do

n. 60(12), p. 1341-1343, 1998.

27

microrganismo (UBOLDI EIROA, 1990; VARNMAM; EVANS, 1996a.). Por esta razo

muitos autores consideram a Listeria um problema para a indstria de carne, uma

vez que sobrevive aos nveis recomendados de nitrato de sdio e de cloreto de

sdio (OLIVEIRA, 1993; FRANCO; LANDGRAF, 1996; GERMANO; GERMANO,

2001; LOGUERCIO et al., 2001).

Em relao composio da atmosfera, o crescimento de Listeria

estimulado por baixas concentraes de oxignio e pela suplementao com dixido

de carbono (VARNMAM; EVANS, 1996a; LOGUERCIO et al., 2001). Segundo Uboldi

Eiroa (1990), atmosferas compostas de 85% de nitrognio, 10% de anidrido

carbnico e 5% de oxignio parecem ser timas para o crescimento do

microrganismo. Mano (1997), estudando carnes envasadas em atmosferas

modificadas, constatou que o patgeno realmente se desenvolvia; porm, o efeito

inibidor do dixido de carbono se potencializava mediante o seu uso em altas

concentraes, associado ao armazenamento a temperaturas de refrigerao as

mais baixas possveis.

As bacteriocinas so protenas bacterianas que normalmente apresentam

atividade inibitria para algumas espcies e cepas de bactrias, sendo, por este

motivo, utilizadas como agentes antimicrobianos em diversos alimentos. A nisina e

pediocina so exemplos de bacteriocinas produzidas por determinadas cepas de

Lactococcus lactis e Pediococcus spp. respectivamente, capazes de inativar a

Listeria (LOGUERCIO et. al., 2001). Entretanto, Martinis et. al. (1997) constataram

capacidade desse microrganismo apresentar uma certa resistncia nisina,

comprometendo a eficincia desse preservativo aprovado pela OMS para uso na

indstria de alimentos, que depender de fatores como pH, concentrao de NaCl e

temperatura. Por outro lado, Ming et al. (1997) obtiveram resultados satisfatrios em

relao inibio do crescimento da Listeria spp., quando fizeram uso de pediocina

em carne bovina e de ave frescas, processadas e embaladas com filmes plsticos.

Convm ressaltar a existncia de alguns estudos envolvendo bactrias

lcticas capazes de produzir uma diminuio no nmero de clulas viveis de L.

monocytogenes, no s pela reduo do pH, como pela produo de bacteriocinas

(LOGUERCIO et. al., 2001). Destacam-se tambm estudos sobre a produo de

bacteriocinas apresentando atividade contra Listeria spp. por bactrias do gnero

Enterococcus (GIRAFFA et.al., 1995; AYMERICH et. al. ,1996).

28

A irradiao de alimentos com doses de 3kGy pode eliminar 99% das

bactrias patognicas, sendo considerada efetiva para o controle de Listeria spp. em

produtos crneos, incluindo a carne moda (ROBERTS; WEESE, 1998).

2.1.5 VIRULNCIA E PATOGENICIDADE

Dentre as espcies de Listeria, a L. monocytogenes inquestionavelmente

patognica para o homem. um microrganismo de distribuio ubiquitria,

encontrando-se vastamente disseminado na natureza e em diversos tipos de

alimentos, quer seja in natura ou processados. Apesar de rara, a listeriose uma

doena alimentar atpica devido alta gravidade, natureza no entrica, alta

mortalidade (20-30%), longo perodo de incubao, e prevalncia particular em

indivduos com imunidade comprometida, idosos, crianas, recm-nascidos,

gestantes e seus fetos (PEREIRA; ROCOURT, 1993; LOGUERCIO et al., 2001;

INTERLAB, 2002). Segundo Todar (2003), a L. ivanovii tambm considerada

patognica, entretanto, causadora da doena apenas em animais, principalmente

em ovinos.

A Listeria spp., aps entrar no organismo hospedeiro por via oral, atinge o

trato intestinal, aderindo e invadindo a mucosa. Em seguida, a clula bacteriana

fagocitada por macrfagos e aps a lise da membrana fagoctica, liberada no

citoplasma da clula do hospedeiro onde se multiplica rapidamente (LOVETT;

TWEDT, 1988; FRANCO; LANDGRAF, 1996; GERMANO; GERMANO, 2001).

Os mecanismos pelos quais a Listeria monocytogenes causa listeriose ainda

no esto bem definidos. Sabe-se, entretanto, que a bactria produz algumas

toxinas, dentre estas se destacam as toxinas hemolticas (hemolisinas) e as toxinas

lipolticas; responsveis pelo aumento na produo de moncitos e pela depresso

na atividade de linfcitos. Entre as toxinas j isoladas esto includas uma toxina

hemorrgica, uma frao pirognica e uma toxina capaz de causar alteraes

eletrocardiogrficas (MARTH, 1988). Os componentes da parede celular parecem

estar tambm envolvidos no mecanismo de patogenicidade (ibid; SCHLECH, 1988).

Schlech (ibid) considera a sorotipagem como o melhor caracterizador da

virulncia de Listeria monocytogenes e de outras espcies de Listeria. Entre os

sorotipos virulentos, como tem sido demonstrado pelos estudos de patogenicidade

29

em animais de laboratrio, est bem evidenciado que o 1 e o 4 causam a maioria

das infeces humanas.

Farber e Peterkin (1991) destacam como fatores de patogenicidade

associados Listeria monocytogenes: a capacidade de crescer intracelularmente, os

altos ndices de compostos de ferro, a catalase e a superoxidase dismutase e a

produo de hemolisina.

Benedict e Schultz (1991) tambm afirmam que a virulncia atribuda

presena de hemolisinas e enzimas oxidativas que permitem a entrada e

sobrevivncia em macrfagos e clulas intestinais. Deste modo, estudaram o efeito

do nvel de ferro e tipo de alimento na produo destas substncias, concluindo que

o alto nvel de ferro e a aerao aumentaram o crescimento e induziram a produo

de vrias catalases.

Para Franco e Landgraf (1996), vrios so os fatores de virulncia que tentam

explicar o mecanismo de patogenicidade, entre eles: listeriolisina O (LLO), que tem

como funo mediar a lise dos vacolos que contm a clula bacteriana; fosfolipases

(fosfatidilinositol fosfolipase C e fosfatidilcolina fosfolipase C), que hidrolisam os

lipdeos da membrana causando ruptura da clula; p60 (60 KDa), que uma

protena associada capacidade invasiva da bactria; internalina uma protena de

membrana (80KDa) tambm associada ao mecanismo de invaso da clula do

hospedeiro.

A virulncia pode ser modificada por fatores ambientais: a temperatura do

inculo, o crescimento varivel em alimentos, o estado hormonal do hospedeiro, a

presena ou a ausncia de ctions divalentes como ferro e magnsio e a

interferncia no trato gastrintestinal (SCHLECH, 1988; FARBER; PETERKIN, 1991).

2.1.6 CARACTERSTICAS DA DOENA

A listeriose no organismo humano e no animal apresenta um quadro clnico

diferente da maioria das outras enfermidades enquadrada como ETA. Isto se deve

natureza intracelular facultativa do seu agente casual, que rompendo as clulas

produz septicemia, o que propicia a infeco de tecidos normalmente no afetados,

como crebro e o sistema nervoso central, a placenta e o tero gravdico. A Listeria

monocytogenes a nica espcie do gnero patognica para o Homem (LOVETT;

30

TWEDT, 1988; MARTH, 1988; CASTRO, 1989; FARBER; PETERKIN, 1991;

PEREIRA ; ROCOURT, 1993; FRANCO; LANDGRAF, 1996).

A listeriose humana comumente caracterizada pela formao de

granulomas miliares e necrose focal ou por supurao no tecido infectado

(LOGUERCIO et al., 2001). Na ausncia de tratamento mdico a morte ocorre,

sendo usualmente resultado de meningites e tendo a idade avanada, a gravidez, os

neonatos e os imunodeprimidos como fatores predisponentes de risco (DEDIOL et

al., 2002).

A transmisso da Listeria spp. pode ocorrer tanto por contato direto quanto

indireto com fontes contaminadas; por via oral, ocular, cutnea, respiratria e

urogenital. Pode estar presente em secrees ocular, nasal e purulenta da epiderme

e na urina, na placenta de bovino infectado e outros tecidos contaminados, nas

fezes e sangue. Porm a transmisso por alimentos parece ser a forma mais

importante (BRACKETT, 1988; MARTH, 1988; CASTRO, 1989; GODOY, 1991;

LAGE, 1993; SILVA, 1996; MILLER et al., 1997). Os portadores assintomticos

podem eliminar o microrganismo nas fezes por um tempo indeterminado,

aumentando o risco de transmisso de pessoa a pessoa (ibid; NASCIMENTO;

CULLOR, 1994).

Farber e Peterkin (1991), em um levantamento, observaram que doses entre

102 e 104 produziram a doena em cerca de 35 dias, enquanto que dose de 3,0 x 109

produziu a doena em 24 horas. Os relatos de surto de listeriose por alimento

sugerem que a dose infectante baixa, porm, dada a impossibilidade de se

trabalhar em experimentos com seres humanos, esta permanece indeterminada. H

contudo indcios de que esteja relacionada com a susceptibilidade do hospedeiro. O

perodo de incubao varia de dias a algumas semanas (mais ou menos trs a

setenta dias) (PEREIRA; ROCOURT, 1993; FRANCO; LANDGRAF, 1996; SILVA,

1996).

Na fase entrica, a sintomatologia semelhante a da gripe, acompanhada de

diarria e febre moderada. No entanto, em alguns casos esses sintomas so

inaparentes (ibid).

A ocorrncia de bacteremia em adultos no rara e os sintomas mais

comuns so: febre, fadiga, mal-estar, podendo haver ou no presena de nuseas,

vmitos, dores e diarria (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

31

A infeco por L. monocytogenes pode causar vrias formas diferentes de

listeriose, sendo divididas em cinco categorias: infeco em gestantes,

granulomatose infantissptica, septicemia, meningite e meningoencefalite e infeco

local (BAHK; MARTH, 1990; HOBBS; ROBERTS, 1992; SILVA, 1996). Varnmam e

Evans (1996a) descrevem outras formas de listeriose alm das citadas

anteriormente: a crvico-glandular (linfoadenopatia purulenta cervical e

submandibular), a cutnea (pstulas nodulares na pele), a oculoglandular

(conjuntivite), que pode ser seguida de meningite purulenta, e a granulomatose

sptica e pneumnica.

Em mulheres grvidas, a L. monocytogenes produz geralmente sintomas de

gripe (febre, calafrios, dor de cabea, dor nas costas), mas pode haver invaso do

feto e, dependendo do estgio em que a gravidez se encontre, pode ocorrer aborto,

parto prematuro, natimorto, septicemia neonatal ou meningite no recm nascido

(SCHLECH, 1988; LAGE, 1993; SILVA, 1996; FRANCO; LANDGRAF, 1996;

VARNMAN; EVANS, 1996a).

A granulomatose infantissptica a infeco do feto via transplacentria que

usualmente resulta em bacteremia. conhecida como listeriose de recm-nascidos,

na qual os sinais clnicos so variados, em geral incluem: dispnia, falncia

cardaca, cianose, regurgitao de lquidos, vmitos, convulses, choro baixo,

expulso precoce do mecnio, fezes com muco, hiper ou hipotermia (VARNMAN;

EVANS, 1996a).

Na listeriose septicmica o primeiro sinal clnico a febre e usualmente esto

presentes a faringite severa e leucocitose acompanhada de mononucleose. A

recuperao completa do quadro clnico freqente, entretanto, algumas vezes

pode evoluir para meningite (ibid.).

A listeriose do tipo meningite e meningoencefalite mais comum em recm-

nascidos e idosos, sendo o curso desta patologia fulminante e com alta taxa de

mortalidade. Em recm-nascidos e crianas os sintomas so de um processo

infeccioso agudo, no qual ocorrem respirao com baixa amplitude e alta freqncia,

leve cianose, letargia, febre, anorexia e s vezes crises convulsivas. Em adultos,

comea como uma gripe seguida de dor de cabea, dores nas pernas, calafrios,

febre baixa, rigidez na nuca, nuseas, vmito, fotofobia, convulses intermitentes,

podendo evoluir para o coma (ibid.).

32

Nos casos de comprometimento do SNC, a manifestao d-se atravs do

aparecimento de meningite, encefalite e de abscessos. Entre outras formas

localizadas de listeriose, podem ser citadas a endocardite e osteomielite, porm so

mais raras (FRANCO; LANDGRAF, 1996). Varnman e Evans (1996a) descrevem

como infeces locais a artrite, peritonite, abscessos cerebrais ou espinhais e

colecistite.

A ingesto de alimentos contaminados com Listeria particularmente

perigosa para gestantes, recm-nascidos, indivduos com sndrome de

imunodeficincia adquirida, carcinomas e outras doenas ou medicamentos que

provoquem comprometimento do sistema imunolgico (SCHLECH, 1988; CASTRO,

1989; GODOY, 1991; HOBBS; ROBERTS, 1992; LAGE, 1993; BAIRD-PARKER,

1994; FRANCO; LANDGRAF, 1996; SILVA, 1996; VARNMAN; EVANS, 1996a).

No tratamento da enfermidade recomenda-se a associao de ampicilina-

gentamicina ou ampicilina- t-sulfametoxazole (CRESPO et al., 2003).

2.2 Escherichia coli

2.2.1 TAXONOMIA E CARACTERSTICAS DO MICRORGANISMO

A Escherichia coli um microrganismo pertencente famlia

Enterobacteriaceae, constituindo parte da microbiota normal do trato intestinal de

humanos e de uma de variedade de animais. Dentre suas principais caractersticas,

destacam-se: bacilos Gram-negativos, no esporulados, capazes de fermentar

glicose com produo de cido e gs; a maioria tambm fermenta a lactose.

Apresentam antgenos somticos O, relacionados com polissacardeos da

membrana externa; antgenos flagelares H, relacionados com protenas de flagelos,

e ainda, antgenos K, relacionados com polissacardeos capsulares (FRANCO;

LANDGRAF, 1996; MENG et al., 2001).

Esta espcie compreende grupos e tipos sorolgicos, identificados por meio

de anti-soros preparados contra as trs variedades de antgenos que ocorrem na

espcie, ou seja, antgenos O, K e H. O antgeno O identifica o sorogrupo da cepa e

a combinao do antgeno O e H identifica o sorotipo. Entretanto nem todas as

amostras apresentam os trs tipos ao mesmo tempo (TRABULSI; TOLEDO, 1989a;

MENG et al., 2001).

33

Elevadas temperaturas e o lauril sulfato de sdio utilizado no caldo para a

estimativa do nmero mais provvel (NMP) podem causar a perda de plasmdios

que so fatores associados virulncia da E. coli. Como conseqncia, no h um

determinado mtodo eficaz para detectar todas as cepas patognicas de E. coli; mas

sim mtodos adaptados ou desenvolvidos para um grupo especfico de E. coli

patognica. Por isso, a importncia de primeiramente se identificar bioquimicamente

as cepas isoladas antes de se realizar a sorologia e a verificao dos fatores de

virulncia (MENG et.al., 2001).

Com base nos fatores de virulncia, manifestaes clnicas, epidemiologia e

sorotipagem, as linhagens de E. coli consideradas patognicas so agrupadas em

classes: EPEC (E. coli enteropatognica clssica), EIEC (E. coli enteroinvasora),

ETEC (E. coli enterotoxignica), EHEC (E. coli entero hemorrgica), EaggEC ou

EAEC ( E. coli enteroagregativa) e DAEC (E. coli difusivamente aderente)

(BUCHANAN; DOYLE, 1997; ibid.).

EPEC um importante microrganismo causador de gastroenterite em

crianas e possui um nmero restrito de sorotipos pertencentes aos sorogrupos:

O26, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128ab, O142 e O158

(HOBBS; ROBERTS, 1992; FRANCO; LANDGRAF, 1996). Entretanto, de acordo

com Levine5 (1987; apud MIOKO; FRANCO, 1991), os sorogrupos de E. coli que

incluem sorotipos de EPEC so O18, O26, O44, O55, O86, O111, O112, O114,

O119, O125, O126, O127, O128ab e O142.

As cepas de EIEC no possuem flagelos, fermentam ou no tardiamente a

lactose, so capazes de penetrar em clulas epiteliais e causar manifestaes

clnicas semelhantes s infeces causadas por Shigella; pertencem a um nmero

limitado de sorogrupos: O21, O28ac, O29, O112c, O124, O136, O143, O144, O152,

O164, O167 e O173 (HOBBS; ROBERTS, 1992; FRANCO; LANDGRAF,1996).

ETEC so as cepas capazes de aderir mucosa do intestino delgado atravs

de fmbrias (tipo um pili e antgeno de colonizao) e produzir enterotoxinas.

Atualmente so conhecidas as toxinas termolbeis (LT), com dois tipos imunolgicos

e geneticamente distintos (LT-I e LT-II), e as toxinas termoestveis (ST), que

tambm apresentam duas variantes (ST-I e ST-II) (MIOKO; FRANCO, 1991;

HOBBS; ROBERTS, 1992; FRANCO; LANDGRAF, 1996; MENG et al., 2001).

5 LEVINE, M.M. Escherichia coli that cause diarrhea; enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent. J. Infect. Dis.Chicago, 155:377-389,1987.

34

A designao de EHEC foi inicialmente empregada para as cepas

pertencentes ao sorotipo O157:H7, porm mais recentemente foi includo o sorotipo

O26:H11; tm a capacidade de produzir citotoxinas denominadas shiga-like toxins

(SLT) ou verotoxinas (VT) (ibid.). Alm desses, Michanie (2003) cita outros sorotipos

isolados em vrios pases: O111:H8, O103:H2, O113:H 21 e O104:H21.

As cepas de E. coli O157:H7 diferem das demais cepas pela no fermentao

do sorbitol e a no produo da enzima beta-glicuronidase (SILVA et al., 1997;

MENG et al ,2001). Temperaturas elevadas de incubao aplicadas na confirmao

de coliformes fecais ou procedimentos de enriquecimento podem inibir o crescimento

deste patgeno (MENG et al., 2001).

A partir da E. coli O157:H7 foram identificadas duas verotoxinas: a VT1 ou

toxina de Shiga, por ser estrutural e imunologicamente semelhante produzida pela

Shigella spp., com duas subunidades A e B, ambas neutralizadas pela toxina anti-

shiga; e a VT2, tambm com duas subunidades A e B , porm nenhuma das duas

neutralizadas pela toxina anti-shiga (SILVA et al., 1997; GERMANO;

GERMANO,2001; MENG et al ,2001).

Existem poucos dados disponveis em relao a EAEC; sua ocorrncia em

surtos alimentares ainda no foi relatada, entretanto, parecem estar associadas com

casos crnicos de diarria (HOBBS; ROBERTS, 1992; FRANCO; LANDGRAF,

1996). Meng et al. (2001) definem como cepas de E. coli que no secretam

enterotoxina LT ou ST e que aderem s clulas Hep-2 agregativamente; so

responsveis pela diarria persistente, particularmente em crianas.

A DAEC est associada com diarria em crianas e definida pela

caracterstica padro de aderncia difusa em clulas Hep-2 ou HeLa. De acordo com

Meng et al. (ibid.), no h relatos de surtos com alimentos.

De um modo geral a ocorrncia em alimentos de coliformes a 35C,

antigamente denominados coliformes totais, indica condies higinicas precrias e

a de coliformes a 45C, anteriormente denominados coliformes fecais, considerada

como indicadora de contaminao fecal e da possibilidade da presena de bactrias

patognicas que tm seu habitat no trato intestinal (LEITE et al., 1988;

FLORENTINO et al., 1997; COSTA et al., 2000).

35

2.2.2 EPIDEMIOLOGIA

A principal via de transmisso da E. coli representada pelo consumo de

alimentos contaminados, direta ou indiretamente, atravs de fezes bovinas. Entre

outras fontes de infeces conhecidas, destacam-se a carne, o leite cru, as saladas

contaminadas com fezes de animais usadas como adubo e a transmisso pessoa a

pessoa presumivelmente atravs da via oral-fecal devido a hbitos de higiene

inadequados (BRASIL, 2002).

Atualmente, em pases desenvolvidos, EPEC isolada em surtos espordicos

e com freqncia muito baixa em casos de diarria endmica. Entretanto, em pases

subdesenvolvidos (destacando os da Amrica Latina e frica), principalmente em

zonas tropicais, EPEC est entre os principais agentes enteropatognicos, em

especial na diarria dos recmnascidos e lactentes, com ndices de mortalidade

altos (MIOKO; FRANCO, 1991; FRANCO; LANDGRAF, 1996).

No Brasil, EPEC responsvel por cerca de 30% dos casos de diarria aguda

em crianas pobres com idade inferior a seis meses, com predominncia dos

sorotipos O111: [H], O111[H2], O119:H6 e O55:H6. Nos anos 60-70, diversos surtos

causados pelo consumo de gua e/ou alimentos contaminados com EPEC foram

registrados em diversas partes do mundo, envolvendo principalmente os sorogrupos

O86 e O111 (FRANCO; LANDGRAF, 1996). Em 1995, dois surtos na Frana foram

associados salada de maionese com lagostim, alface e pepino em conserva,

totalizando 59 casos dos quais EPEC O111 foi isolada dos pacientes (MENG et al.,

2001).

A EIEC acomete mais comumente adultos e alguns estudos apontam surtos

relacionados ingesto de alimentos e/ou gua contaminados. Entretanto , acredita-

se que a via de transmisso mais comum seja o contato interpessoal (TRABULSI;

TOLEDO, 1989a; FRANCO; LANDGRAF, 1996; MENG et al., 2001). O maior surto

ocorrido nos Estados Unidos em 1973 foi devido ao consumo de queijo importado da

Frana. Um grande surto tambm foi relatado no Japo em 1988, com 670 casos

relatados, em que a febre alta e a diarria aquosa eram caractersticas da infeco

(MENG et.al., 2001).

As bactrias do grupo ETEC so importantes causas de diarria em pases

subdesenvolvidos, onde as condies de saneamento so precrias, principalmente

nos trpicos. Alm disso, ETEC considerada um dos principais agentes etiolgicos

36

da chamada diarria dos viajantes, acometendo indivduos que se locomovem de

reas desenvolvidas para regies com problemas de saneamento bsico. A doena

atinge pessoas de todas as faixas etrias (TRABULSI; TOLEDO, 1989a; FRANCO;

LANDGRAF, 1996; MENG et al., 2001).

Alimentos e gua contaminados so os mais freqentes veculos da infeco

por ETEC, documentada pela primeira vez em 1970. Em 1994, ETEC O153:H43 foi

identificada como causa de dois surtos alimentares em Wisconsin e Louisiana,

envolvendo batatas e po de milho respectivamente. Em junho de 1998, uma salada

de batatas contaminada com cepas de ETEC foi identificada como o veculo do

grande surto nos Estados Unidos, envolvendo mais de 4.500 pessoas. No Japo um

grande surto afetou mais de 800 estudantes de quatro escolas elementares em

1996, no qual E. coli O25:NM foi isolada (MENG,et. al., 2001).

O bovino considerado reservatrio natural de EHEC, razo pela qual os

alimentos de origem animal, principalmente a carne bovina, parecem ser o principal

veculo deste patgeno. Diversos surtos de colite hemorrgica ocorridos nos Estados

Unidos, Canad, Japo, Inglaterra e Alemanha foram associados ao consumo de

carne bovina, em especial ao hambrguer (TRABULSI,1999; SCARCELLI; PIATTI,

2002). No Brasil ainda no houve registro de surtos epidemiolgicos e o nmero de

crianas com infeces endmicas por EHEC relatado tem sido muito baixo

(FRANCO; LANDGRAF, 1996; TRABULSI, 1999.). Entretanto, estudos realizados no

Rio de Janeiro demonstraram que mais de 80% do rebanho bovino brasileiro

portador de EHEC (TRABULSI, 1999).

O sorotipo O157:H7 o mais implicado como agente etiolgico de colite

hemorrgica, sndrome urmica hemoltica e prpura trombtica (CDC, 1995). Este

foi primeiramente reconhecido como ptogeno humano em 1982 quando dois surtos

de colite hemorrgica foram associados ao consumo de carne moda mal cozida,

que estava contaminada com este microrganismo. Os maiores surtos incluem o

ocorrido em 1992/1993 no oeste dos Estados Unidos, que envolveu mais de 700

indivduos, evoluindo para quatro mortes; e um severo, no Japo, em 1996 onde

mais de 9.000 casos foram reportados. De acordo com estimativas do CDC (Center

of Disease Control) a E. coli O157:H7 causa aproximadamente 73.400 casos de

infeco, com 60 associados morte, anualmente, nos Estados Unidos

(SCARCELLI; PIATTI, 2002; SCHROEDER et al., 2002). Os maiores reservatrios

so os bovinos e outros ruminantes, embora tenha sido isolado de outros animais

37

como caninos, felinos, eqinos e aves. Relatos de transmisso de pessoa a pessoa

e pela gua vm sendo acrescentado literatura (HEUVELINK et al., 1996; MENG

et al., 2001; SCARCELLI; PIATTI, 2002).

Michanie (2003) adverte para outros sorogrupos enterohemorrgicos que vm

sendo isolados em vrios pases como: O26:H11, O111:H8, O103:H2, O113:H21 e

O104:H21.

A ocorrncia de cepas EaggEC foi reportada pela primeira vez em 1980, no

Chile, como causa de diarria entre crianas. Em 1994, foram relatados, no Reino

Unido, quatro surtos de infeco associados ao consumo de refeio em um

restaurante, afetando 133 pacientes. Os sintomas incluam vmito e diarria, sendo

mais persistente em um nmero menor de pacientes (HEUVELINK et al., 1996;

MENG et al., 2001.).

Em relao a DAEC no foram relatados surtos associados a alimentos (ibid).

2.2.3 OCORRNCIA DE DIFERENTES SOROVARES DE E. coli EM ALIMENTOS

As cepas de ETEC, EIEC e EPEC, quando isoladas de alimentos, so

provenientes da contaminao fecal veiculada diretamente das mos dos

manipuladores de alimentos ou indiretamente da gua (DESMARCHELIER; GRAU,

1997). A gua contaminada com despejos de esgoto uma das mais importantes

vias de transmisso do agente na natureza (GERMANO; GERMANO, 2001).

Na maioria dos surtos descritos, a transmisso foi veiculada atravs de

alimentos de origem bovina, tendo sido a carne moda crua ou mal passada,

implicada em quase todos os surtos documentados e mesmo em casos espordicos

(GERMANO; GERMANO, 2001; BRASIL, 2002; PATOLOGIA, 2003). Leite et al.

(1988) analisaram 50 amostras de alimentos, entre elas 11 de carne bovina,

adquiridas em nove estabelecimentos comerciais da cidade de Araraquara-SP e

observaram alta freqncia de coliformes, apesar de no identificarem nenhuma E.

coli enteropatognica clssica ou enteroinvasora.

Cerqueira et al. (1997) afirmaram que produtos de origem animal,

especialmente produtos crneos, eram importantes veculos nas infeces por E.

coli. Essa afirmao foi baseada na anlise de 105 amostras de carne moda bovina

crua, incluindo 35 pores de carne moda refrigerada, 35 de hambrguer congelado

e 35 de kibe congelado; nas quais E. coli patognica foi isolada de 34 amostras de

38

carne (32,4%), sendo 14 amostras de carne moda. Costa et al. (2000) tambm

isolaram E. coli de 30 amostras de carne bovina moda comercializada nos principais

mercados, feiras e aougues da cidade de So Luis. Bryan (1986) atribuiu presena de E. coli nas fezes animais a causa da

contaminao das carcaas e carnes de um abatedouro. Este motivo justificou o

isolamento desse microrganismo em carne moda, salsicha, carne de frango,

hambrguer e quibes. Entretanto, sabe-se que apenas uma parte de E. coli isolada

de alimentos considerada patognica (ibid.).

Segundo diversos estudos de avaliao microbiolgica da carne bovina in

natura e moda comercializadas em diferentes locais do Brasil, todos os resultados

foram significativos para enumerao de coliformes a 35C e a 45C (NMP). Motta et

al. (2000) examinaram amostras de carne moda comercializada em supermercados

localizados na regio oeste de So Paulo, e nos resultados obtidos a contagem de

coliformes a 35C em 53,3% das amostras foi superior a 104 NMP/g e 46,7% foram

positivas para coliformes a 45C. Ritter et al. (2001) efetuaram a anlise em

amostras de carne moda bovina comercializada em bancas do mercado pblico de

Porto Alegre e encontraram um nmero elevado (>110,0 UFC/g) para ambos grupos

de coliformes. Oliveira et al. (2002) avaliaram a contaminao das carnes frescas

bovinas e sunas em 20 aougues da cidade de Alfenas-MG, sendo que 92% das

amostras apresentavam coliformes a 35C e 52% coliformes a 45C. Ferreira e

Sobrinho (2003) realizaram a avaliao da qualidade bacteriolgica da carne bovina

moda comercializada em supermercados, feiras e frigorficos de So Lus, onde,

das 12 amostras analisadas, 83,3% estavam contaminadas com coliformes a 35C e

16,66% com coliformes a 45C. Pigatto e Barros (2003) avaliaram o grau de

contaminao da carne bovina moda comercializada na regio de Curitiba em 60

amostras oriundas de trs aougues escolhidos aleatoriamente e verificaram que a

contagem para coliformes foi muito elevada, pois 86,6% (52/60) das amostras

tiveram contagens superiores a 105UFC/g.

Petri et al. (1989a; 1989b), analisando 100 amostras de carne moda de

segunda qualidade, isolaram cepas de E. coli em 97 dessas amostras, sendo mais

freqente as linhagens de EPEC, porm sem capacidade toxignica. De acordo com

esses autores, em trabalhos realizados no Brasil e nos Estados Unidos foi

demonstrada que a incidncia de ETEC em alimentos de origem animal,

39

principalmente os que sofrem algum tipo de processamento, era de 5% a 10%,

predominando as cepas de E. coli produtoras de enterotoxina LT.

Mioko e Franco (1991) elaboraram um trabalho similar no qual verificaram a

freqncia de EPEC e ETEC entre as 339 cepas de E. coli isoladas de alimentos de

origem animal. Dentre os alimentos analisados 34 constituam amostras de carne

crua, sendo 13 de carne bovina, da qual foram isoladas quatro cepas de EPEC (1

cepa do sorotipo O125:H11).

Segundo estudos realizados em diversos pases, a incidncia de ETEC em

alimentos no associada a surtos bastante varivel (PETRI et al., 1989b; MIOKO;

FRANCO, 1991).

Os produtos lcteos, especialmente o leite cru, tambm tm sido associados

a surtos de toxinfeces (GERMANO; GERMANO, 2001; PATOLOGIA, 2003). A

contaminao ocorre atravs do bere das vacas ou dos equipamentos de ordenha

em contato com contedo fecal (PATOLOGIA, 2003).

Surtos envolvendo a gua so associados presena de EPEC, ETEC e

EIEC, provavelmente pela contaminao com material de esgoto (VARNMAN;

EVANS, 1996b; DESMARCHELIER; GRAU, 1997). Os autores citados anteriormente

tambm reportam surtos de EIEC e ETEC envolvendo o consumo de queijos.

Segundo Desmarchelier e Grau (1997), EIEC j foi isolada de salmo e

salada de batatas; e ETEC de carne de caranguejo, carne curada de peru, maionese

e saladas. Varnman e Evans (1996b) relataram surtos envolvendo carne suna, torta

de carne, manteiga, iogurte e outros produtos crneos e lticos.

De acordo com Desmarchelier e Grau (1997), os produtos implicados em

surtos com E. coli O157 so produtos crneos, vegetais (melo, melancia, alface e

cenoura), saladas, suco de ma e gua.

Varnman e Evans (1996b) associaram s infeces por E. coli O157 ao

consumo de leite cru, hambrguer, carne moda, carne de peru, de suno, aves e

cordeiro. Em todos os casos envolvendo produtos crneos, estes no sofreram o

cozimento adequado.

Trabulsi (1999) enfatizou que, apesar de muitos surtos estarem associados ao

consumo de carne moda mal cozida, outros alimentos j foram relatados, como:

rosbife, leite cru e pasteurizado, iogurte, suco de ma, salame, alface, melo,

batatas, broto de rabanete e broto de alfafa.

40

notvel que determinados alimentos, como salame, maionese, a cidra e o

suco de ma, que so considerados seguros e prontos para o consumo devido

elevada acidez, podem ser veculo desse patgeno (CDC, 1995; BUCHANAN;

DOYLE, 1997).

2.2.4 FATORES INTERFERENTES NA SOBREVIVNCIA E NO CRESCIMENTO

Semelhante a todas as bactrias, o crescimento e a sobrevivncia da

Escherichia coli em alimentos dependem da interao de vrios fatores intrnsecos e

extrnsecos, como, por exemplo: temperatura, pH, atividade de gua (Aa), cloreto de

sdio, dentre outros.

Em relao temperatura, o padro geral de E. coli situa-se na faixa de 7 a

48C, com o timo de temperatura a 37C; com excees que das cepas

patognicas. Algumas cepas enteropatognicas crescem em baixas temperaturas

(4-5C) e inmeras so incapazes de crescer a 44C, temperatura usada

rotineiramente no isolamento de E. coli (VARNMAM; EVANS, 1996b).

Segundo Desmarchelier e Grau (1997), a temperatura mnima em que E. coli

capaz de se desenvolver 7-8C e a mxima prximo a 46C. sensvel ao

aquecimento, contudo essa sensibilidade dependente de fatores como composio

do alimento, pH e atividade de gua (Aa). Germano e Germano (2001) relatam que,

por no apresentar termoresistncia, destruda a 60C em poucos segundos.

Entretanto, capaz de resistir por longo tempo em temperaturas de refrigerao

(ibid.).

A atividade de gua mnima para o crescimento do microrganismo 0,95

(VARNMAM; EVANS, 1996b; DESMARCHELIER; GRAU, 1997; GERMANO;

GERMANO, 2001).

Em meios convencionais de cultivo a E. coli cresce numa faixa de pH entre

4,4 e 10,0, com o nvel timo em pH 6,0-7,0 (DESMARCHELIER; GRAU, 1997).

Para Buchanan e Doyle (1997), a faixa tima de pH est entre 5,5-7,5, com o

mnimo entre 4,0-4,5. Entretanto, o pH dependente da interao com outros

parmetros de crescimento, como temperatura e atividade de gua com a natureza

do acidulante (VARNMAM; EVANS, 1996b; BUCHANAN; DOYLE, 1997).

41

A E. coli O157:H7 resistente s diversas situaes, tendo como temperatura

tima de crescimento 37C, mnima de 8C e mxima de 45C, podendo sobreviver

at nove meses a -20C em carne moda. Seu pH timo 7,5, entretanto sobrevive

por longos perodos em alimentos fermentados ou cidos. Pode se desenvolver em

concentraes de 6,5% NaCl (SILVA et al., 1997; MENG et al ,2001; GERMANO;

GERMANO,2001). Essa cepa no se desenvolve bem quando submetida

temperatura entre 42-45C e s altas concentraes de sais biliares

(DESMARCHELIER; GRAU, 1997).

Particularmente este microrganismo tolera condies de acidez baixas, o que

permite atravessar a acidez do estmago sem ser afetado (MICHANIE, 2003). Essa

caracterstica de resistncia a pH extremo foi confirmada experimentalmente por

Miller e Kaspar (1994), ao isolarem O157:H7 em cidra de ma, armazenada a 4C,

durante 14 a 21 dias, apesar da presena de preservativos e da acidez da prpria

cidra.

Quanto irradiao, a sensibilidade de E. coli semelhante a de outros

patgenos, sendo a dose de 3kGy proposta para controlar este microrganismo

(ROBERTS; WEESE, 1998).

2.2.5 VIRULNCIA E PATOGENICIDADE

Em relao aos grupos de E. coli patognicos, existem particularidades

quanto virulncia. A virulncia das cepas EPEC est associada capacidade de

adeso e destruio das clulas da mucosa intestinal, mediada por um plasmdio

(eaf) que promove um tipo de adeso localizada, a qual caracterstica, uma vez

que outras cepas de E. coli promovem adeso difusa ao entercito. Tem sido

demonstrado que esse patgeno induz profundas alteraes no citoesqueleto das

clulas epiteliais, como destruio das microvilosidades e acmulo de actina no local

da adeso, denominado efeito attachment and effacement, causado pela protena

intimina mediada pelo gene cromossomial eae (Escherichia coli attaching and

effacing) (TRABULSI; TOLEDO, 1989a; FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Segundo os autores citados acima, a EIEC inicia o processo de invaso com

a internalizao (endocitose) do entercito, rompendo a clula, multiplicando-se e

invadindo as clulas vizinhas. No local da invaso ocorre um acmulo de actina que

42

acarreta no desarranjo da estrutura celular, determinando a morte da clula.

Protenas denominadas IPA mediadas por plasmdios invasion (inv) esto

diretamente relacionadas com esse processo.

A adeso e colonizao da mucosa intestinal pelas cepas ETEC so

mediadas por fatores de colonizao denominados fmbrias, que parecem ser

espcies especficas e so codificadas por plasmdios. Podem produzir enterotoxina

termolbil (LT; variantes LT-I e LT-II) e/ou uma enterotoxina termoestvel (ST;

variantes ST-I e ST-II), alm do fator de colonizao (CFA) (ibid; MIOKO; FRANCO,

1991; MENG et al.,2001). As toxinas LT-I e LT-II so constitudas por uma

subunidade A envolta por cinco subunidades B. As subunidades B tm a funo de

fixao mucosa do intestino, atravs de receptores monosialogangliosdicos

presentes na membrana externa dos entercitos. Aps a fixao, a subunidade A

internalizada pelo entercito e estimula a adenilciclase, provocando um acmulo de

AMPcclico intracelular; promovendo uma hipersecreo de gua e eletrlitos que

resulta em diarria aquosa. A toxina ST-I tem ao sobre a guanilciclase, que

acarreta um acmulo intracelular de GMPcclico, provocando aumento da secreo

de cloreto e diminuio de absoro de sdio (MIOKO; FRANCO, 1991; FRANCO;

LANDGRAF, 1996).

As cepas EHEC possuem o mecanismo de patogenicidade relacionado com a

produo de citotoxinas denominadas verotoxinas (VT), uma vez que sua atividade

biolgica pode ser observada em culturas de clulas Vero, originrias de rim de

macaco. Tambm conhecidas como toxinas shiga-like (SLT), j que so

semelhantes toxina produzida pelo bacilo de Shiga, causador da disenteria bacilar,

possuem as variantes VT-I (SLT-I) e VT-II (SLT-II), formadas por duas subunidades,

sendo uma delas responsvel pela ligao com a frao 60S dos ribossomas dos

entercitos, inibindo a sntese protica, resultando em colite hemorrgica. A

produo dessas citotoxinas mediada por fagos especficos. Outros fatores de

virulncia incluem o gene eae e enterohemolisina mediada pelo plasmdeo 60-mDal

(FRANCO; LANDGRAf, 1996; MENG et al., 2001).

A EaggEC a mais recente linhagem patognica descrita. A patogenicidade

parece estar relacionada com adeso mucosa intestinal, principalmente do clon,

mediada por fmbrias chamadas BFP (bundle forming pilus), que so diferentes das

outras fmbrias de adeso. Alguns autores relatam que as cepas so capazes de

produzir toxinas e que interferem no metabolismo celular do entercito com ao na

43

absoro de sais e eletrlitos (TRABULSI; TOLEDO, 1989a; FRANCO; LANDGRAF,

1996).

A patogenicidade da DAEC foi pouco estudada, entretanto sabe-se que

geralmente no elaboram toxinas (MENG et al., 2001)

A E. coli patognica pode ser diferenciada das variedades no patognicas

atravs de testes imunolgicos e de outros mtodos, incluindo a sorotipagem

essencial para os estudos epidemiolgicos.

2.2.6 CARACTERSTICAS DA DOENA

O perodo de incubao das gastroenterites por E. coli de 12 horas a trs

dias. Os sintomas consistem principalmente em diarria, algumas vezes com

presena de sangue e muco nas fezes (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

A diarria provocada por EPEC clinicamente mais grave do que quelas

provocadas por outros patgenos e geralmente acompanhada de dores abdominais,

vmito e febre. A durao da doena varia de seis horas a trs dias com perodo de

incubao variando entre 17 e 72 horas. As cepas de EPEC so agentes causais da

diarria infantil de lactentes e recm-nascidos, entretanto, alguns autores sugerem

que possam causar distrbios gastrointestinais tambm em adultos (PETRI et al.,

1989a; ibid).

Franco e Landgraf (1996) ressaltam que a gastroenterite provocada por EIEC

bastante semelhante quela provocada por Shigella, em que os sintomas so:

disenteria, clicas abdominais, febre e mal-estar geral, com eliminao de sangue e

muco nas fezes; variando o perodo de incubao entre oito e 24 horas. Apesar de

se assemelhar bioqumica e antigenicamente Shigella, sua dose infectante alta,

em torno de 106 a 108 clulas, enquanto que para Shigella de 103 (ibid.; MENG et.

al., 2001).

A doena provocada por ETEC caracteriza-se pela diarria aquosa,

normalmente acompanhada de febre baixa, dores abdominais e nuseas; porm, em

sua forma mais severa, ocorrem fezes aquosas bem caracterstica (gua de arroz)

que levam desidratao. O perodo de incubao varia de oito a 44 horas e a dose

infectante alta (106 a 108 clulas) (ibid.; PETRI et al., 1989b).

A EHEC a causadora da colite hemorrgica, caracterizada clinicamente por

dores abdominais severas e diarria aguda, sanguinolenta, diferindo das demais

44

pela grande quantidade de sangue nas fezes e pela febre no elevada ou at

mesmo inexistente. O perodo de incubao varia de trs a nove dias (mdia de

quatro) e a durao da doena de dois a nove dias. A enterocolite pode evoluir para

uma doena grave, denominada sndrome urmica hemoltica (SUH), com

destruio dos eritrcitos e falncia aguda dos rins, podendo ser fatal (FRANCO;

LANDGRAF, 1996; MENG et al., 2001). A infeco por E. coli O157:H7 tambm

pode desencadear um quadro de Prpura Trombocitopnica Trombtica (PTT),

caracterizada por anemia hemoltica microangioptica, trombocitopenia,

manifestaes neurolgicas, insuficincia renal e febre (MENG et al., 2001;

SCARCELLI; PIATTI, 2002; PATOLOGIA,2003).

J as cepas EaggEC parecem estar associadas com casos crnicos de

diarria (diarria protrada). A diarria persiste pelo menos por 14 dias e a presena

de sangue ocorre em 11% dos casos (FRANCO, LANDGRAF, 1996; MENG et al.,

2001).

As EPEC, EIEC, ETEC e EHEC raramente causam infeces extra-

intestinais. Estas infeces so causadas por amostras de E. coli dos sorogrupos

que participam da microbiota normal dos intestinos, mas que podem se localizar em

qualquer rgo ou tecido. Entretanto as infeces mais freqentes so: infeces

urinrias ascendentes, meningite do recm-nascido e bacteremia (TRABULSI;

TOLEDO, 1989).

Na maioria das vezes dispensvel a antibioticoterapia na teraputica das

infeces por Escherichia coli. No tratamento das infeces causadas por E. coli

O157 h controvrsias em relao ao uso de antimicrobianos, devido a potencial

leso da parede bacteriana, liberando a shiga toxina e acarretando

conseqentemente a SUH (SCHROEDER et. al, 2002).

2.3 MEDIDAS DE CONTROLE

Pigatto e Barros (2003) relatam em seu trabalho que, segundo a FAO (Food

Agriculture Organization), um quinto da populao mundial alimenta-se de carne,

justificando a preocupao de proporcionar s pessoas um alimento mais saudvel.

Todavia, o produto crneo, mesmo que obtido de animais sadios, pode ser

contaminado ao abate, no processamento e na comercializao pela manipulao e

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armazenamento inadequados e, conseqentemente, chegar mesa do consumidor

um alimento de risco.

Entretanto, a contaminao das carcaas pode ser reduzida adotando-se

medidas eficazes de limpeza e desinfeco do local de abate e cuidados higinicos

durante o procedimento (RITTER et al., 2001).

Considera-se de suma importncia o controle especfico da carne em sua

origem e nos procedimentos de desossa no sentido de que se possa, seno eliminar

o microrganismo, reduzi-lo em sua grande expresso (PICCHI et al., 2003).

Scarcelli e Piatti (2002) advertem para a importncia da rastreabilidade dos

alimentos em todas as fases de produo, industrializao, transporte, distribuio,

armazenamento e comercializao, possibilitando ao consumidor obter uma perfeita

correlao entre o produto final e a sua origem, permitindo a aquisio de um

produto seguro e saudvel.

Ferreira e Sobrinho (2003), ao encontrarem um alto ndice de coliformes em

suas anlises, atriburam a causa s condies higinicas insatisfatrias, como, por

exemplo: contaminao no manuseio, limpeza e sanitizaes deficientes de

equipamentos e utenslios e falta de refrigerao do produto. Com o resultado

obtido, esses autores advertiram para a necessidade do controle desses pontos que

provavelmente acarretaram a contaminao.

Convm ressaltar a extrema importncia da