Asparagus Days, Cesena 2018

Dominique Ruggli1,2, Julien Crovadore2, Ali AsaffTorres1,3 Jorge Verdin Ramos4, Bastien Cochard2, Romain Chablais2, Raúl Rodríguez Heredia1, Julien Adi5,François Lefort2

Los microrganismos en el cultivo del espárragoLes micro-organismes dans la culture de l’asperge

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Distributeur agrée

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Programa / programme

1. El microbioma de la raizdel esparrago

2. Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?

3. Experiencias y resultados de aplicaciones de microorganismos en el cultivo del esparrago

4. Preguntas

1. Le microbiome de la racine des asperges

2. Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge ainsi que leurs fonctions?

3. Expériences et résultats d’applications de micor-organismes dans la culture de l’asperge

4. Questions

La metagenomica, que es? / la métagénomique, c’est quoi?

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Palabra creada por Handelsman en la Universidad de Wisconsin, Departamento de Fitopatología en 1998.

En griego, meta significa "trascendente".

La metagenómica trasciende genes y genomas individuales y permite estudiar todos los genomas presentes en una comunidad en conjunto.

Esa es la aplicación de técnicas modernas de genómica para el estudio de comunidades de organismos microbianos (microbiota) directamente de sus entornos naturales (microbioma).

Mot créé en 1998 par Handelsman de l’Université du Wisconsin, département de pathologie des plantes

Du grec meta, qui signifie “au-delà de, après”

La métagénomique vient après la génomique et permet d’étudier les organisms directementdans leur environnement, ensemble et encommunauté

C’est l’application de la technique de génomique moderne pour étudier la communauté des micro-organisms (micobiote) directement dans leur environnement naturel (microbiome)

La pregunta central: Porque es tan importante la microbiota ?La question centrale: pourquoi le microbiote est si important?

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Microbiota son todos los microorganismosque viven en el microbioma

Los Microorganismos activos en el sueloson escenciales para los ciclos de nitrogeno, carbono y azufre, que sustentan la vida en la tierra.

Los conocemos major por las enfermedades que causan.

Son muy importantes para mantener la salud vegetal y animal; así como, la estabilidad ambiental.Protección contra organismos patógenos.Proporcionan vitaminas y otrosnutrientes importantes para el desarrollode macro-organismos.

Le microbiote est l’ensemble des microbes vivant dans le microbiome

Les micro-organisms actifs dans le sol sontessentiels pour les cycles de l’azote, du carbone et du soufre. Ils conditionnent la vie sur Terre.

Si on les connaît mieux pour les maladies qu’ils causent

Mais ils sont essentiels pour la santé des plantes et des animaux ainsi que pour la stabilité de l’environnement.Ils assurent une protection contre des organismes pathogènes. Ils fournissent des vitamines et autres nutriments importants pour le développement des macro-organismes.

Hasta hace poco, la genómica y la microbiología se basaban en el aislamiento de microbios individuales en cultivos puros, pero el 99.9% de los microbios no puedenser cultivados facilmente y la mayoría nisiquiera pueden ser cultivados.

La gran mayoría de los microbios son inaccecibles para su estuidio.

El número total de especies de bacteriasdescritas es aproximadamente de 14,000 pero el número total Estimado de especiesde bacterias es10,000,000,000,000,000,000 (1019) o diezhexillones de especies de bacterias.

La Metagenomica soluciona estasdificultades y captura los DNAs de organismos desconocidos, no cultivables.

Esto nos revela una compleja y occulta realidad.

Una diversidad de microbios invisibles / une diversité de microbes invisibles

Jusqu'à récemment, la génomique et la microbiologie reposaient sur l'isolement de microbes individuels dans des cultures pures. Mais 99,9% des microbes ne peuvent pas être cultivés facilement et la plupart ne peuvent pas être cultivés du tout.

La grande majorité des microbes ne peuvent pas être étudiés.

Le nombre total d'espèces de bactéries décrites est d'environ 14’000, mais on estime à 10’000’000’000’000’000’000 (1019) ou 10 hexillion le nombre total d’espèces de bactéries

La métagenomique surmonte ces difficultés et détecte l’ADN des organismes non cultivables et inconnus.

Elle permet de découvrir une réalité complexe et cachée..

Aplicaciones de metagenómica en agriculturaApplications de la métagénomique en agriculture

Comprender la microbiota asociada con suelos, plantas y animales domésticos ayudará a la detección y prevención de enfermedades en cultivos, ganado y productos alimenticios.

Ayudará a desarrollar nuevas prácticas agrícolas utilizando las ventajas de la microbiota favorable en asociación con plantas y animales.

La compréhension du microbiote associé aux sols, aux plantes et aux animaux domestiques aidera à la détection et à la prévention des maladies dans les cultures, le bétail et les produits alimentaires.

Cela aidera à développer de nouvelles pratiques agricoles en utilisant les avantages d'un microbiote favorable en association avec des plantes et des animaux.

El proceso de metagenómica en resumen/ Le processus de la métagénomique en résumé

DNA extraction

Sequencing

Assembly Contigs Search against

database

Phylogenetic classificationWho is there?

Functional classificationWhat can they do?

Bacterium ABacterium B...Bacterium X

Gene AGene B...Gene X

100++ Abundant species (≈3 Mbp each)

1000+ bp

100-150 bp

Reads

Albertsen M. Extracting genomes from metagenomes. Center for microbial communities, Aalborg University (2013)

Extraction de l’ADNExtracción del ADN

SequençageSecuenciación

LecturesLecturas

100-150 pb

AssemblageEnsamblaje

1000 + pb

Classification phylogénétiqueQui est là?

Clasificación filogenética ¿Quién esta ahi?Classification fonctionnelle Que font-ils?Clasificación funcional ¿Que hacen ellos?

Recherche dans des bases de données

100++ especies mas abundantes

Busqueda de base de datos

Metagenómica de suelo en campos de espárrago, tratado con Bioestimulantes

Métagénomique du sol d’une culture d'asperges traités avec des biostimulant

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El presente estudio combinó ensayos con bioestimulantes y metagenómina, con la expectativa de que un potencial incremento de rendimiento podría estar relacionado a unavariación de la microbiota.

El ensayo fue conducido en un Sistema de cultivoperenne de espárrago, en un suelo francoarenoso, en el sur de Francia.

Se evaluaron dos bioestimulante comerciales.

Cérès (Biovitis): Trichoderma harzianum + Pseudomonas fluorescens

Exuroot (Innovak Global): Un inductor de exudados basado en compuestos fenólicos.

Los espárragos se cosecharon y los metagenomasdel suelo fueron secuenciados.

La présente étude combinait des essais avec des biostimulants et la métagénomique, en espérant qu'une augmentation potentielle du rendement pourrait être liée à une variation du microbiote.

Les tests ont été réalisés dans un système de culture pérenne d'asperges, sur un sol sableux et limoneux, dans le sud de la France.

Deux biostimulants commerciaux ont été choisis.

Cérès (Biovitis): Trichoderma harzianum + Pseudomonas fluorescens

Exuroot (Innovak Global): une inducteurd’exsudats racinaires à base d’acides phénoliques

Les asperges ont été collectées et les métagénomes des sols ont été séquencés

Sitio/ Site: Aimargues, Gard, France

Riego por goteoIrrigation: goutte à goutte

Variedad / Variété: Darlise

Tipo de suelo / sol : franco arenoso / limoneux sableux

Unidad exeperimental: 4 hileras de 20 metrosExperimental unit size: 4 rows of 20 meters long

Manejo del cultivo: convencionalMode de culture: conventionnel

Año de plantación / Année plantation: 2015

Descripción del campo / Description de la parcelle

• Tratamientos / Traitements:

• T, A : Testigo / témoin: Manejo convencional / gestionconventionnelle

• T1, B : Exuroot (Innovak) 1 kg/ha

• T2, C : Exuroot (Innovak) 1 kg/ha + Cérès (Biovitis) Pseudomonas fluorescens et Trichoderma harzianum 1 kg/ha

• Tres bloques experimentales con 3 repeticiones. /Trois blocks expérimentaux avec 3 répétitions

• Aplicaciones / Applications: En cada unidad experimental (UE) de 800 m2 (3 rep.), se hicieron 4 aplicaciones de losbioestimulantes; a las 1, 4, 8 y 12 semanas desde el primer brote. / les traitements aux biostimulants ont été répétés 4 fois de la mi juin à la mi septembre, sur chaque unite expérimentale (UE) de 800 m2 (3 rép.) à 1, 4, 8 et 12 semaines après le depart de la végétation

• El testigo se aplicó solo agua / Seule de l’eau a été appliquée sur le témoin.

Protocolo / Plan experimental

• Muestreo de suelo / Échantillonnage du sol : Todas las muestras, excepto el control original, se recolectaron en septiembre de 2016. / tous les échantillons, sauf le témoin initial, ont été collectés en septembre 2016.

• Muestreo / Echantillonnage: Dos filas centrales / deux rangées centrales

• Para cada una de las 3 modalidades y sus repeticiones, se recogieron 50 g de suelo de rizosfera de 10 puntos a profundidades entre 20 y 40 cm / Pour chacune des 3 modalités et leurs répétitions, 50 g de sol de la rhizosphère ont été prélevés sur 10 points à des profondeurs comprises entre 20 et 40 cm.

• Los testigos fueron muestreados al principio y al final del ensayo. / Les témoins ont été échantillonnés au début et à la fin de l’essai.

• Los puntos de muestreo se combinaron y se homogeneizaron y el ADN se extrajo de subgrupos de 10 g. / Les points d'échantillonnage ont été regroupés et homogénéisés et l'ADN extrait de 10 g des sous-échantillons.

• La secuenciación de metagenoma se realizó con un Illumina MiniSeq. / Le séquençage des métagénomes a été effectué avec un MiniSeq Illumina.

• Dos metagenomas fueron secuenciados. / Douze métagénomes ont été séquencés

• La secuenciación dio entre 3.360.000 secuencias de 150 pb (0.5 Gb) y 12.350.000 secuencias (1.85 Gb) por muestra. / Le séquençage a donné entre 3 360 000 séquences de 150 pb (0,5 Gb) et 12’350’000 séquences (1,85 Gb) par échantillon.

Muestreo de suelo, extracción de ADN y secuenciación. Échantillonnage du sol, extraction de l'ADN et séquençage

• Turiones tot. por exp. Unid

Total des pousses par UE

– Testigo/Témoin:182

– T1: 185

– T2: 199

• Turiones/ha / Pousses/ha

– Testigo/Témoin: 2279

– T1: 2317

– T2: 2492

Resultados de espárragos: total de brotes recolectadosRésultats des asperges: Total des pousses collectées

182185

199

CONTROL T1 T2

Total de turiones / UETotal des pousses / UE

22792317

2492

CONTROL T1 T2

Turiones/haPousses/ha

Los turiones de espárrago se cosecharon de marzo a abril de 2017, se contaron cada dos días en cada unidad experimental y se distribuyeron en 4 grupos de tamaño comercial / Les pousses d'asperges ont été récoltées de mars à avril 2017, comptées tous les deux jours dans chaque unité expérimentale et réparties en quatre groupes de taille commerciale ( >22mm diam, 16mm-22mm, 12mm-16mm et <12mm)

Hay una diferencia significativa en T2 pero solo debido a más espárragos <12 mm / Il y a une différence significative en T2, mais seulement en raison des asperges <12mm

Rendimientos totals / total des rendements

48,5 4852

0

10

20

30

40

50

60

Rendimiento promedio (kg/UE)Rendement moyen (kg/UE)

Témoin Exuroot Exuroot avec micro-organismes

606 600647

0

150

300

450

600

750

Rendimiento promedio (kg/UE)Rendement moyen (kg/ha)

Témoin Exuroot Exuroot avec micro-organismes

Análisis de metagenómica– A Nivel Filo (> 1%)Analyse métagénomique – Au niveau du phylum (> 1%)

Análisis de metagenómica– A Nivel Clase (> 1%)Analyse métagénomique – Au niveau de la classe (> 1%)

Análisis de metagenómica– A Nivel Orden (> 1%)Analyse métagénomique – Au niveau de l’ordre (> 1%)

Análisis de metagenómica – A Nivel Orden (> 0%)Analyse métagénomique – Au niveau de l’ordre (> 0%)

Análisis de metagenómica– A Nivel Género (> 1%)Analyse métagénomique – Au niveau du genre (> 1%)

Análisis de metagenómica– A Nivel Género (> 0%)Analyse métagénomique – Au niveau du genre (> 0%)

Resultados de Metagenómica / Résultats métagénomiques

Gran diversidad de OTUs.

Alphaproteobacteria y Actinobacteria fuerondominantes.

Los 10 generos mas abundantes, representó entre 29.43% y 42.8% de todas las especies en las muestras.

Estos fueron: Bradyrhizobium, Nocardioides, Mycobacterium, Rhizobium, Streptomyces, Mesorhizobium, Microbacterium, Pseudomonas, and Sphingomonas. Se ha demostrado previamente que Los Rhizobialestienen una asosiación con esparragos, lo cual podríaexplicar por que representan un componente mayoren la microbiota de estos suelos..

La mayoria de los generos encontrados, son conocidos por contener especies de rhizobacteriaspromotoras del crecimiento de plantas ,tales comoaquellas pertenecientes al genero Bradyrhizobium, Rhizobium, y Mesorhizobium, además demostradotener una gran diversidad, con dozenas de OTUsdiferentes en cada muestra.

Grande diversité d’UTO.

Les Alphaproteobacteria et Actinobacteria étaient dominants.

Les 10 genres les plus abondants représentaient entre 29,43% et 42,8% de toutes les espèces dans tous les échantillons.

Ce sont Bradyrhizobium, Nocardioides, Mycobacterium, Rhizobium, Streptomyces, Mesorhizobium, Microbacterium, Pseudomonas, et Sphingomonas. Il a été démontré dans le passé que les rhizobialesétaient associées aux asperges, ce qui pourrait expliquer qu’elles représentent une composante majeure du microbiote de ce sol à asperges.

La plupart des genres trouvés ici sont connus pour héberger des espèces de rhizobactéries favorisant la croissance des plantes, telles que celles appartenant aux genres Bradyrhizobium, Rhizobiumet Mesorhizobium, et ont montré une grande diversité, avec des dizaines d’UTO différents dans chaque échantillon..

Conclusiones / Conclusions

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Bioestimulantes

Decepción ya que no hubieron diferencias significativas de rendimiento entre Control y Exuroot. Exuroot + Cérès dio más espárragos pero solo para el tamaño comercial más pequeñoLa aplicación fue seis-ocho meses antes del crecimiento

Metagenomica

Gran diversidadLigeras diferencias entre el control inicial y el control finalLigeras diferencias entre el control final y los tratamientosRhizobiales son el componente principal> 10%¿Qué significa?¿Tal vez una pista para futuros bioestimulantesdiseñados específicamente para espárragos?

Biostimulants

Décevant car aucune différence de rendement significative entre Control et Exuroot. Exuroot + Cérès a donné plus d'asperges mais seulement pour la plus petite taille commercialeL'application a été faite six-huit mois avant la croissance

Métagénomique

Grande diversitéLégères différences entre le contrôle initial et le contrôle finalLégères différences entre le contrôle final et les traitementsLes rhizobiales sont la composante principale> 10%Quelle signification?Peut-être une piste pour les futurs biostimulants adaptés aux asperges?

Programa / programme

1. El microbioma de la raizdel esparrago

2. Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?

3. Experiencias y resultados de aplicaciones de microorganismos en el cultivo del esparrago

4. Preguntas

1. Le microbiome de la racine des asperges

2. Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge et quels sont leurs fonctions?

3. Expériences et résultats d’applications de micor-organismes dans la culture de l’asperge

4. Questions

Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge et quels sont leurs fonctions?

Antagónicos contra enfermedades como rhizoctonia, pythium, fusarium…

Antagonistes des maladies commerhizoctonia, pythium, fusarium …

• Trichoderma harzianum, Trichoderma asperellum,

Trichoderma viride

• Bacillus subtillis, Bacillus amyloliquefaciens

• Streptomyces lidycus.

Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge et quels sont leurs fonctions?

Antagónicos contra nematodos

Antagoniste des nématodes

Purpurocillum lillacinus, Bacillus subtilis,

Pochonia clamydospora, Trichoderma harzianum

Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge et quels sont leurs fonctions?

Fijadores de nitrógeno

Solubilizadores de fósforo

Plant grow promoting rhizobacteria -PGPRs

Bactéries fixatrices d’azote

Bactéries solubilisatrices de phosphore

Rhizobactéries favorisants la croissancedes plantes - RFCP

Azospirillum brasilense,

Bacillus mycoides,

Bacillus megaterium.

Azotobacter chrococcum,

Azotobacter vinelandi,

Azospirillum brasilense.

Penicillum bilaii, Penicillium Rubens,

Pseudomonas fluorescens

Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge ainsi que leurs fonctions?

Hongos formadores de micorrizas Champignons mycorhiziens

Glomus intraradicesGigaspora sp.

Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge ainsi que leurs fonctions?

Entomopatogenos Champignons entomopathogènes

Bauveria bassianaMetarhizum anisoplae.

Novedosa Tecnología para Incrementar

eficiencia de la Nutrición Vegetal

Technologie innovante pour augmenter

l’efficience de la nutrition des plantes

Inductor de Exudados Radiculares

inducteur d’exsudats racinaires

Cuáles bioestimulantes se usan con microbiológicos?

Quels biostimulants sont utilisés avec les micro-organismos?

Actividad radicular

Activité racinaire

Raíz Activa Raíz Inactiva Testigo

Racine inactive, témoin

Fotos tomadas con la cámara Minirhizotron 30X

Photo prise avec la caméra Minirhizotron 30X

Racine active

Favorece colonización y establecimiento de microorganismos /

Favorise la colonisation et l’installation des micro-

organismes

Mejora la acción preventiva de microorganismos antagónicos

contra patógenos /Améliore l’action preventive des

micro-organismes contre les pathogènes

Promueve biodiversidad en el suelo /

Promoteur de la biodiversitédans le sol

Participa en la estimulaciónradicular /

contribue à la stimulation racinaire

Beneficios

Bénéfices

Programa / programme

1. El microbioma de la raizdel esparrago

2. Cual son los microorganismos y funcciones que se aplican en el esparrago?

3. Experiencias y resultados de aplicaciones de microorganismos en el cultivo del esparrago

4. Preguntas

1. Le microbiome de la racine des asperges

2. Quels sont les micro-organismes appliqués dans l’asperge ainsi que leurs fonctions?

3. Expériences et résultats d’applications de micor-organismesdans la culture de l’asperge

4. Questions

ResultadosRésultats

Antagónicos y entomopatógenosMétodos alternativas para combate de plagas y enfermedades utilizando dentro del manejo integrado.

Fijadores de nitrógeno y solubilizadoresde fósforo y PGPRS Bien aceptados por resultados satisfactorios y buen efecto bioestimulante.

Micorrizas Dan los resultados mas contundentes siempre y cuando se usen productos de buena calidad y con buen manejo.

Antagonistes et entomopathogènesMéthode alternative de lutte contre les parasites et les maladies à combineravec d’autres solutions en lutteintégrée.

Bactéries fixatrices d’azote, solubilisatrices de phosphore et RFCP Bien acceptées car elles montrent des résultats satisfaisants avec de bonseffets biostimulant.

MycorhizesDonnent toujours les meilleurs résultatslorsque les produits sont de bonnequalité et utilisés correctement.

Testigo / Témoin

Sanidad radicular en espárrago tratado con un biopreparado de Trichoderma.Santé des racines d’asperges traitée avec une préparation biologique de Trichoderma.Caborca, Sonora. México.

Resultados de la aplicación del consorcio de microorganismos en Espárrago. Résultats d’applications d’un consortium de micro-organismos dans l’aspergeSan Luis Rio Colorado. México.

TESTIGOTEMOIN

TESTIGOTEMOIN

Resultados de la aplicación del consorcio de microorganismos en Espárrago. Résultats d’applications d’un consortium de micro-organismos dans l’aspergeLe Barp. France.

Producción acumulada en plantación de primera cosecha en Esparrago.Production cumulée d’une aspergeraie en première année

ICA Perú.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Manejo Convencional Biofit+Nutrisorb

42384800

Ton

ela

das

/Ha

Producción acumulada/Ha - por campaña

+ 562 Kg (13%)

Production cumulée/ha – total annuel

Gestion convetionnelle

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ne

s/h

a

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Agradecimientos/ Remerciements

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Distributeur agrée