Dezembro 2012 Catarina Isabel Fernandes Loureno Licenciada Diagnstico laboratorial em microbiologia clnica: Um estudo no centro hospitalar Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Gentica Molecular e Biomedicina Orientadora: Ilda Maria Barros dos Santos Gomes Sanches, Professora Doutora, UNL/ FCT Jri: Presidente: Professor Doutor Jos Paulo Nunes de Sousa Sampaio Arguente: Professora Doutora Rita Maria Rodrigues Teixeira de Castro Vogais: Professora Doutora Ilda Maria Barros dos Santos Gomes Sanches i Diagnstico laboratorial em microbiologia clnica: Um estudo no centro hospitalar Copyright Catarina Loureno, FCT/UNL, UNL AFaculdadedeCinciaseTecnologiaeaUniversidadeNovadeLisboatmodireito,perptuoesemlimites geogrficos, de arquivar e publicar esta dissertao atravs de exemplares impressos reproduzidosem papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser inventado, e de a divulgar atravs de repositrioscientficosedeadmitirasuacpiaedistribuiocomobjectivoseducacionaisoudeinvestigao, no comerciais, desde que seja dado crdito ao autor e editor. ii iii Agradecimentos Concludo este longo percurso existem agradecimentos que no posso deixar de fazer. QueroagradeceraoCentroHospitalarquemedisponibilizouesteestgioeatodaaequipado laboratrio de anlises clnicas, em especial seco de microbiologia. Aosmeuspaiseaomeumano,quesempremeapoiaramemtudoequepossibilitaramaminha evoluo a nvel acadmico. Ao meu namorado, no s pela maneira como sempre me tratou, mas tambm por todo o apoio que me deu nos momentos em que me apeteceu desistir de tudo. Por me devolver sempre a vontade de fazer mais e melhor. Aosamigosquesempreestiveramdomeuladoequemeproporcionarammomentosnicos, especiaiseinequecveis,nomeadamente:CludiaPinheiro,TatianaFera,DboraFera,Andreia Forte,MartaMonteiro,RuiSemio,CarinaSilva,AndrMonteiro,NdiaSilvestre,PauloPalminha, CarlaCorreia,PatriciaBarreiros,CeciliaBento,SandraPiarra,MariaMoniz,ArmnioSilva,Edgar Gramacho e Bruno Gonalves. A todos os colegas de curso, especialmente Ana Cludia, Ctia e Ndia, pelas horas de estudo que passamos juntas, e pelos sorrisos que partilhamos tantas vezes. Aos meus padrinhos, afilhada e respectivas familias, e a todos os familiares que sempre quiseram o melhorparamim:primaXana,primaMariaAntnia,primoManel,AvAdlia,tiaHortence,tio Ramos,tiaMaria,tioRenato,primaAna,primoPaulo,primoNuno,primoGuilherme,primoValter, primoMauro,tioAntnio,tiaQuina,primaIsabel,primoAntnio,primoValter,primaIns,prima Mavilde,primo Olmpio,primoTiago,primaGina,primoZ,primoNuno,primaSilvia,primoPedro, prima Patrcia, primo Diogo, prima Soraia, primo Vitor, prima Anabela, primo Rodrigo, prima Catarina, primo Manel e prima Maria. minha cadela Kira, pela companheira que . E por ltimo, mas no em ltimo, ao meu grande AV, que mesmo ausente, estar sempre presente no meu corao. A todos voces o meu muito obrigado por tudo. Estamos juntos! Catarina Loureno iv v Resumo: ArealizaodoestgionasecodemicrobiologiadoServiodePatologiaClnicadeumCentro Hospitalar, durante um perodo de seis meses (Outubro de 2011-Maro de 2012) consistiu em duas fases.Numa primeira fase (Trabalho 1), realizada durante os seis meses de estgio (de 1 de outubro a 31 de maro), foi possvel adquirir conhecimentos gerais de bacteriologia, dando ateno metodologia utilizada no processamento de diferentes amostras biolgicas provenientes dos diferentes servios. A urina foi o produto mais analisado com 36% (n=3294) das amostras totais. A segunda fase (Trabalho 2), realizada durante um perodo de trs meses (de 1de janeiro a 31 de maro), incidiu no estudo microbiolgico de urinas. Foram analisadas 1408 amostras de urina provenientes dos vrios servios, com o objectivo de isolar e identificar possveis agentes infecciosos. Deste estudo resultaram 500 uroculturas positivas (36%), e um total de 604 microrganismos isolados. Com a avaliao por sexo, das uroculturas positivas, foi possvelverificarqueaprevalnciafoimaiornosexofeminino(68%)eemidadessuperioresa60 anos (63,2%).Dos22tiposdemicrorganismosisoladosomaisfrequentefoiE.coli(46,5%),seguidodeoutras Enterobactereaceas spp. e cocos Gram positivo, podendo esta ordem alterar significativamente com a situao clnica em estudo (doentes internado/externos e doentes algaliados/no algaliados).Foiaindapossveldetectarqueonmerodeamostraspolimicrobianasfoimaisincidenteem indivduosalgaliados(41%)doqueemnoalgaliados(7%),equeaprevalnciadeuroculturas positivas em algaliados voltou a ser maior para o sexo feminino (58,6%) e para idadessuperiores a 60 anos (86,9%) vi vii Abstrat Therealizationofthe internship inmicrobiologysectionoftheDepartmentofClinicalPathologyofa hospitalcenter,duringaperiodofsixmonths(fromOctober2011toMarch2012)wasbuiltintwo parts. One of these parts (part number one)was made during six months of internship (from October 1to March31)itwaspossibletoobtaingeneralknowledgeofbacteriology,payingattentiontothe methodology used in the processing of different biological samples who came from several services. The urine was the most analyzed product at 36% (n = 3294) of the total samples.. Thesecondpart(partnumbertwo)completedduringaperiodofthreemonths(fromJanuary1to March31) focusedonthestudymicrobiologicalofurine.1408urinesamples fromdifferentservices were analyzed with the goal of isolate and correctly identify possible infectious agents. From this study resulted 500 urocultures (36%) and a total of 604 isolated microorganisms. With the gender evaluation of the positive urocultures was possible to verify that the prevalence was bigger to the feminine gender (68%) and to people over than 60 years old (63.2%). From the 22 types of isolated microorganisms the most frequent was E.coli (46,5%) followed by others Enterobactereaceas spp. And Gram positive cocci, this order may change significantly with the clinical condition under study (intern/extern patients and patients with/without catheter). Itwaspossibletofindoutthatthenumberofpolymicrobialsampleswasmostincidentinthe individualswithcatheter(41%)thanintheindividualswithoutcatheter(7%).Itwasstillpossibleto observethatthepredominanceofpositivesurocultureswasinfemaleindividualswithcatheter (58,6%) as it was in individuals with ages over 61 years old (86,9%). viii ix ndice Geral 1Introduo ...................................................................................................................................1 1.1Objectivo do Estgio ............................................................................................................1 1.2Flora comensal ....................................................................................................................1 1.3Tipos de amostras ...............................................................................................................2 1.3.1Urina ............................................................................................................................2 1.3.2Sangue ........................................................................................................................3 1.3.3Amostras provenientes do aparelho reprodutor ............................................................4 1.3.4Fezes ...........................................................................................................................4 1.3.5Amostras provenientes das Vias Respiratrias .............................................................5 1.3.6Exsudado Cutneo, de ferida, escara ou auricular externo ...........................................5 1.3.7Exsudado Ocular .........................................................................................................5 1.3.8Lquidos Corporais........................................................................................................... 6 1.4Meios de cultura ..................................................................................................................6 1.5Crescimento bacteriano .......................................................................................................7 1.6Preparaes a fresco e coloraes ......................................................................................8 1.6.1Colorao de Gram ...........................................................................................................9 1.6.2Colorao lcool-cido resistente (Ziehl-Neelsen) ...................................................... 10 1.7Testes de Identificao ...................................................................................................... 10 1.7.1Oxidase ..................................................................................................................... 10 1.7.2Catalase .................................................................................................................... 11 1.7.3Coagulase ................................................................................................................. 11 1.7.4Urease ....................................................................................................................... 11 1.7.5Indol........................................................................................................................... 12 1.7.6Teste de CAMP.......................................................................................................... 12 1.7.7Hidrlise de esculina .................................................................................................. 12 1.7.8Sistemas automatizados .......................................................................................... 133 1.8Antibiograma - Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (TSA) .............................. 133 1.9Microrganismos ................................................................................................................. 16 1.9.1Microrganismos Gram negativo: ............................................................................... 177 1.9.1.1 Famlia de Enterobactereaceas: .......................................................................... 17 1.9.1.2 Bacilos Gram negativo no fermentadores .......................................................... 17 1.9.2Microrganismos Gram positivo: .................................................................................. 18 1.9.2.1Famlia deStaphylococcaceae ........................................................................... 18 1.9.2.2 Famliade Enterococcaceae .............................................................................. 19 1.9.2.3 Famlia de Streptococcacea ................................................................................ 19 1.9.2.4 Bacilos Gram positivo .......................................................................................... 19 x 1.9.3Outros microrganismos .............................................................................................. 20 2.Parte Experimental: ................................................................................................................... 21 2.1Materiais, Equipamentos e Reagentes: .............................................................................. 21 2.2Procedimento Experimental ............................................................................................... 22 2.2.1Trabalho 1: Estudo estatstico das vrias amostras biolgicas .................................... 22 2.2.1.1 Processamento de vrias amostras biolgicas .................................................... 22 2.2.1.2 Procedimento efectuado para coloraes ............................................................ 26 2.2.2Trabalho 2: Uroculturas .............................................................................................. 26 3.Resultados e Discusso ............................................................................................................ 33 3.1Trabalho 1: Estudo estatstico das vrias amostras biolgicas ........................................... 33 3.2Trabalho 2: Uroculturas ..................................................................................................... 35 4.Concluses: .............................................................................................................................. 45 5.Bibliografia ................................................................................................................................ 47 6.Apndices: ................................................................................................................................ 51 xi ndice de Figuras Figura 1. 1Observao microscpica de bacilos Gram negativo ........................................................9 Figura 1. 2Observao microscpica de cocos Gram positivo ...........................................................9 Figura 1. 3Morfologia das bactrias ................................................................................................ 10 Figura 2. 1 Fluxograma com procedimento efectuado em urinas ....................................................... 26 Figura 2. 2Fluxograma de Bacilos Gram negativo ........................................................................... 30 Figura 2. 3Fluxograma de Cocos Gram positivo .............................................................................. 31 Figura 2. 4Fluxograma de Bacilos Gram positivo ............................................................................. 31 Figura 6. 1 E.coli em MacConkey .................................................................................................... 52 Figura 6. 2 E.coli em gelose Sangue ............................................................................................... 52 Figura 6. 3 Klebsiella pneumoniae em MacConkey ......................................................................... 53 Figura 6. 4 Proteus mirabilis em gelose Sangue .............................................................................. 53 Figura 6. 5 Proteus mirabilis em MacConkey ................................................................................... 53 Figura 6. 6 P.aeruginosa em gelose Sangue ................................................................................... 54 Figura 6. 7 P.aeruginosa em MacConkey ........................................................................................ 54 Figura 6. 8S.aureus em gelose Sangue ........................................................................................... 54 Figura 6. 9 Estafilococos coagulase negativa em gelose Sangue .................................................... 54 Figura 6. 10Enterococcus spp. em gelose Sangue .......................................................................... 55 Figura 6. 11S.agalactiae em gelose Sangue ................................................................................... 55 Figura 6. 12 S.pneumoniae em gelose Sangue ............................................................................... 55 Figura 6. 13 Corynebacterium spp. em gelose Sangue .................................................................. 556 Figura 6. 14 Leveduras ao microscpico ....................................................................................... 556 Figura 6. 15 Demonstrao da exigncia dos factores de crescimento para H.influenzae ................ 57 Figura 6. 16 H.influenzae em gelose Chocolate ............................................................................... 57 Figura 6. 17Ovo de Ascaris lumbricoides......................................................................................... 57 Figura 6. 18Ovo de Trichuris trichiura .............................................................................................. 57 Figura 6. 19 Quisto de Entamoeba spp. .......................................................................................... 58 Figura 6. 20 Larva de Strongyloides spp.......................................................................................... 58 Figura 6. 21Ovo de Ancylostoma spp. ............................................................................................. 58 xii xiii ncide de Tabelas Tabela 1. 1 Distribuio dos principais microrganismos da flora comensal ........................................2 Tabela 1. 2 Meios de cultura ............................................................................................................6 Tabela 1. 3Locais de aco dos antimicrobianos nas bactrias ..................................................... 13 Tabela 1. 4 Enterobactereaceas spp.associadas a infeces no homem. ..................................... 17

Tabela 3. 1Produtos biolgicos analisados durante o perodo de estgio....................................... 33 Tabela 3. 2Produtos biolgicos analisados nos primeiros seis meses do ano de 2011..................... 33 Tabela 3. 3Resultados positivos e negativos ................................................................................... 35 Tabela 3. 4Resultados positivos consoante o sexo. ......................................................................... 35 Tabela 3. 5Percentagens de uroculturas positivas no sexo masculino, por grupo etrio ................... 36 Tabela 3. 6Percentagens de uroculturas positivas no sexo feminino, por grupo etrio ..................... 36 Tabela 3. 7Isolamentos de S.agalactiae por sexo e grupo etrio ..................................................... 40 Tabela 3. 8Amostras polimicrobianas em algaliados e no algaliados. ............................................ 41 Tabela 3. 9Percentagens de microrganismos em indivduos algaliados, por sexo feminino e grupo etrio ................................................................................................................................................ 43 Tabela 3. 10 Percentagens de microrganismos em indivduos algaliados, por sexo masculino e grupo etrio ...................................................................................................................................... 43 Tabela 6. 1Resistncias intrnsecas de Microrganismos Gram negativo......................................... 51 Tabela 6. 2Resistncias intrnsecas de Microrganismos Gram positivo ............................................ 51 Tabela 6. 3Antibiticos utilizados no mtodo de Kirby-Bauer ........................................................... 52 Tabela 6. 4 Resultados de testes de identificao para bacilos Gram negativo ................................ 58 Tabela 6. 5 Resultados de testes de identificao para Estafilococos .............................................. 59 Tabela 6. 6 Resultados de testes de identificao para Estreptococos ............................................ 59 Tabela 6. 7Resultados de testes de identificao para Enterococos .............................................. 59 Tabela 6. 8Resultados para os microrganismos isolados nas uroculturas positivas...................... 60 Tabela 6. 9Uroculturas positivas para doentes internos e doentes externos .................................. 61 Tabela 6. 10Uroculturas positivas para doentes algaliados e no algaliados ................................... 62 xiv xv ndice de Grficos Grfico 3. 1Percentagens de produtos biolgicos analisados durante o perodo de estgio ............. 33 Grfico 3. 2Percentagens de produtos biolgicos analisados nos primeiros seis meses de 2011 ..... 33 Grfico 3. 3Percentagens de resultados positivos e negativos ......................................................... 35 Grfico 3. 4Percentagens de resultados positivos consoante o sexo ............................................... 35 Grfico 3. 5Uroculturas positivas no sexo masculino, por grupo etrio ............................................. 36 Grfico 3. 6 Uroculturas positivas no sexo feminino, por grupo etrio .............................................. 36 Grfico 3. 7 Distribuio dos microrganismos isolados nas amostras de urina ................................. 37 Grfico 3. 8 Distribuio dos microrganismos isolados por doentes internados e externos ............... 39 Grfico 3. 9Distribuio dos microrganismos por indivduos algaliados e no algaliados ................. 41 Grfico 3. 10 Microrganismos em indivduos algaliados, por sexo feminino e grupo etrio ............... 43 Grfico 3. 11 Microrganismos em indivduos algaliados, por sexo masculino e grupo etrio ............ 43 xvi xvii Lista de abreviaturas ITUInfeces do trato urinrio LCRLquido Cefalorraquidiano CNAColumbia, colistina e cido nalidxico VCATVancomicina, Colistina, Anfotericina e Trimetoprim MRSAMethicillin-resistant Staphylococcus aureusUfcUnidades formadoras de colnias Ufc/ml Unidades formadoras de colnias por mililitro spp.Espcies NADNicotinamida adenina dinucleotdeo McfMcfarland TSATeste de Susceptibilidade aos antimicrobianos Lac+ Fermentador de Lactose Lac-No fermentador de Lactose P.mirabilisProteus mirabilis K.pneumoniaeKlebsiella pneumoniae K.oxytocaKlebsiella oxytoca A.baumaniiAcinetobacter baumanii E.faecalisEnterococcus faecalis E.faeciumEnterococcus faecium S.epidermidisStaphylococcus epidermidis S.saprophyticusStaphylococcus saprophyticus S.aureusStaphylococcus aureus S.agalactiaeStreptococcus agalactiae P.aeruginosaPseudomonas aeruginosa P.stuartiiProvidencia stuartii M.morganiiMorganella morganii E.coliEscherichia coli P.vulgarisProteus vulgaris E.aerogenesEnterobacter aerogenes C.koseriCitrobacter koseri S.marcescensSerratia marcescens E.cloacaeEnterobacter cloacae S.liquefaciensSerratia liquefaciens Caldo GNCaldo para Gram negativos AMAntimicrobianos CMIConcentrao mnima inibitria CLSIClinical and Laboratory Standards Institute

xviii 1 1Introduo 1.1Objectivo do Estgio Oobjectivodo Estgionolaboratriode microbiologiafoiodeadquirirconhecimentosgeraissobre microbiologiaclinicaetomarcontactocommetodologiaetcnicasutilizadasnoprocessamentode amostrasbiolgicasprovenientesdedoentesdosvriosservioshospitalares,comofezes, expectorao e exsudado vaginal, dando especial ateno s amostras de urina As amostras so inicialmente semeadas em diferentes meios de cultura, e posteriormente incubadas em atmosfera adequada ao crescimento e isolamento de microrganismos. Em algumas amostras so efectuados exames a fresco (ex. urina), e na maioria realizam-se exames ps-colorao. Depois do crescimento bacteriano procede-se identificao do agente isolado e determinao do perfildesusceptibilidadeadiversosantimicrobianos(antibiograma).Concludotodooprocessoe apsvalidaointroduzidooresultadonosistemainformtico,paraquepossafacilmenteser consultado pelo clnico. 1.2Flora comensal O nosso organismo colonizado por milhares de microrganismos. Esta populao de microrganismos numerosa e diversificada e coloniza a pele, mucosas, aparelho respiratrio, intestinal, reprodutor e urinrio(vertabela1.1).Aconstituiodestafloraocorrenomomentodonascimentoatravsda passagempelocanaldopartoecontinuaposteriormente,atqueseestabeleaumamicroflora.A microflora do organismo humano, embora de base estvel, mantm ao longo da vida de um indivduo umcontnuofluxodeterminadoporumavariedadedefactores(idade,dieta,alteraeshormonais, sadeehigienepessoal),quecontribuemparaalterarquantitativaequalitativamenteamicroflora. Nasregiesdocorpoquesoestreisqualquerisolamentodemicrorganismodeextrema importncia, e deve ser alvo de estudo (Pinto A.M., 2004). Vriassoasfunesdestafloramicrobiana,podendodestacar-seasuainterfernciano metabolismodohospedeiro,eaindaadefesacontrapotenciaismicrorganismospatognicos(Pinto A.M., 2004). Quandoosmembrosdafloracomensalsoencontradosregularmentenumadeterminadarea corporal so designados como flora residente. Quando os microrganismos apenas sobrevivem e no semultiplicam,permanecendonum localporumcurtoperododetempo,recebemonomede flora transitria (Forbes & Sahm, 2004). Amaioriadosmicrorganismosencontradosnafloracomensalsobactrias.Arelaoqueestes microrganismosestabelecemcomohospedeirochamadadecomensalismo,seformutuamente benfica,ousebenificiaremdarelaosemcausardanos.Existemtambmospatognicos 2 oportunistas,quecausaminfecescasohajaalteraesdafloraresidente,eospatognicos obrigatrios, cuja presena origina sempre danos no hospedeiro (Forbes & Sahm, 2004). Tabela 1. 1 Distribuio dos principais microrganismos da flora comensal (Forbes & Sahm, 2004) (Murray, 2007) (Versalovic, 2011). RegioFlora comensal Agentes potencialmente patognicos Pele - Staphylococcus coagulase negativa- Propionibacterium spp. - Corynebacterium spp. - S.epidermidis - S.aureus Olhos (conjuntiva) - Streptococcus viridans- Staphylococcus coagulase negativa - Difterides spp. - S.pneumoniae - S.aureus - H.influenzae - N.meningitidis Vias areas superiores (Fossas nasais e nasofaringe) - Streptococcus viridans- Staphylococcus coagulase negativo - Corynebacterium spp.- S.pneumoniae - S.aureus - H.influenzae Aparelho intestinal (intestino grosso e delgado) - Lactobacillus spp. - Enterococcus spp. - Anaerbios- Enterobactereaceas spp.- Salmonella spp. - Campylobacter spp. - E.coli - Shigella spp. - Yersinia spp. Aparelho urinrio (Uretra) - Staphylococcus epidermidis- Difterides spp. - Lactobacillus spp. - Entecococcus spp. - Enterobactereaceas spp. Aparelho reprodutor (Vagina) - Lactobacillus spp.- Streptococcus spp.- Bacterides spp. - Difteroides spp. - Trichomonas vaginallis - C.albicans - C.glabrata - N. gonorrhoeae Oconhecimentodafloracomensalmuitoimportantenaanlisedosprodutosbiolgicosque chegam ao laboratrio, para que no sejam obtidos falsos resultados positivos. 1.3Tipos de amostras 1.3.1Urina (Urocultura) Oaparelhourinrio formadopelosrins,ureteres,bexigaeuretra,sendoqueestaltimaestrutura possuiumamicrofloraresidente.Acimadauretra,todasasreasdoaparelhourinriosoestreis numserhumanosaudvel,oquefazcomqueaurinasejahabitualmenteestril(Forbes&Sahm, 2004) (Washington Jr. et al, 2006). Contudo, as bactrias podem invadir a bexiga e causar infeco por duas vias principais: ascendente edescendente.Emboraaviaascendentesejamaisfrequente,elafavorecidaporintroduode corposestranhosaoorganismo(ex:cateterurinrio). Aointroduzirumcateterurinrio,asbactrias podem ser introduzidas directamente na bexiga ou, mover-se atravs deste instrumento da uretra at bexiga, aumentando desta forma o risco de infeco (Forbes & Sahm, 2004). 3 Adisseminaoporviadescendentepodeserresultadodeumabacterimia.Qualquerinfeco sistmicapodeprovocar infecourinria mascertosmicrorganismos,comoS.aureusouespcies de Salmonella, so particularmente invasivos. A via descendente causadora de menos de 5% das ITU (infeces do trato urinrio) (Forbes & Sahm, 2004). Asinfecesurinriassoumadasinfecesmaisfrequentementeencontradas(Forbes&Sahm, 2004). Para o estudo dasamostras de urina deve ser efectuada uma colheita adequada, tendo em conta a idade e a situao clnica, de forma a minimizar os agentes contaminantes: Jacto mdio: colheita para doentes com controlo de esfncter. Cateter urinrio: recolha atravs de puno do cateter (doentes algaliados). Puno supra-pbica: aspirao de urina directamente da bexiga. Este mtodo assegura uma amostra livre de contaminao (com excepo de microrganismos presentes na pele). Saco colector: recm-nascidos e crianas sem controlo de esfncter. Paraavalidaodaamostranecessrioteremcontaalgunscritrios,entreelesencontra-sea contagem directa de unidades formadoras de colnias por mililitro (ufc/ml).Para obteno do nmero de ufc/ml deve-se fazer contagem das colnias aps incubao da amostra de urina semeada com ansa calibrada e correlacionar com os seguintes dados: Nmero de ufc/ml > 105 Infeco urinria; Nmero de ufc/ml < 104 Contaminao uretral ou vaginal; Nmero de ufc/ml104-105 Avaliao deve ser feita segundo critrios clnicos. Paraasamostrasdeurinarecolhidaspelomtododepunosupra-pbica,omtodode quantificaoanteriormentediscritodeveserignorado,edevemservalorizadostodosos microrganismos isolados, com excepo de microrganismos comensais da pele (Faria, 2010). 1.3.2Sangue (Hemocultura) Ainvasomicrobianadacorrentesanguneapodeterconsequnciasgraves,comochoque, insuficinciademltiplosorgos,coagulaointravasculardisseminadaemorte(Forbes&Sahm, 2004). A presena de um cateter venoso central (CVC) aumenta o risco de colonizao por microrganismos podendo levar a disseminao microbiana (Melo et al, 2007). Peranteasuspeitadeinfecodacorrentesanguneaassociadaapontadecateterdeveser realizadooseuexamemicrobiolgico,bemcomodehemoculturacomsanguecolhidodeveia perifrica de outro acesso venoso. A amostra de sangue venoso colhida e inoculada directamente no meio lquido para hemocultura em aerobiose. Ashemoculturassoanalisadasnumsistemaautomatizado,comooBact/Alert,que fazadetecodocrescimentodemicrorganismos(bactriasefungos)emamostrasdesangue(BioMrieux, Bact/Alert MB, 2004). 4 Os frascos dehemocultura fornecem um meio de cultura com os nutrientes e condies ambientais recomendadas para os microrganismos normalmente encontrados nas infeces sanguneas. Apssemeadoscomsangue,osfrascossocolocadosnoequipamentoBact/Alertondefeita incubao(35-37C)eagitaocontnua.Bact/Alertutilizaumsensorcolorimtricoeluzreflectida paradetectarapresenadeCO2.SeexistirproduodeCO2,confirma-seapresenade microrganismos que durante a metabolizao dos substratos do meio de cultura produzem este gs. Com a produo deste gs d-se uma alterao da cor do meio existente no frasco de hemocultura e a amostra lida pelo aparelho como positiva (BioMrieux, Bact/Alert MB, 2004). Ocumprimentorigorosodemedidasdeasspsiaextremamenteimportantenareduoda incidncia de contaminao (BioMrieux, Bact/Alert MB, 2004). 1.3.3Amostras provenientes do aparelho reprodutor Anatomicamente, o aparelho genital feminino constituido por uma sucesso de cavidades (trompas, tero,endocolo,exocoloevagina)quesecomunicamcomoexterioratravsdeumafendavulvar (vulva).Estaestruturapermiteaentradademicrorganismospatognicosquepodemprejudicaro processo de reproduo (Linhares et al, 2010). A microflora vaginal constitui um dos mais importantes mecanismos de defesa da funo reprodutora, impedindo a proliferao de microrganismospotencialmente patognicos, nomeadamente devido ao seuambientecido. Esteambiente mantidoporalgunsmicrorganismospresentes,comdestaque paraLactobacillusacidophilus(baciloGrampositivo),queoprincipalconstituintedestaflora (Linhares et al, 2010). Acomposiodafloravaginalnoconstante,sofrendovariaesconsoanteaidadeeestado fisiolgico. Na infncia e aps a menopausa, o pH vaginal neutro e a flora vaginal substituda por outras espcies microbianas (Linhares et al, 2010) (Faria, 2010). NocasodegrvidasnecessriofazerapesquisadeStreptococcusagalactiaeparaprevenir contaminao materno-fetal (Faria, 2010) (Melo et al, 2007). Paraadetecodeinfeces,soefectuadascolheitasdeexsudados(ex:exsudadovaginaledo endocolo).Ascolheitassoefectuadascomzaragatoaeenviadasparaolaboratrioemmeiode transporte adequado. 1.3.4Fezes (Coproculturas) Ointestinodelgado(pH=4.5),encontra-seinfluenciadopelaacidezdoestmado(pH=2), apresentando por isso uma flora escassa (Baron, 1996). J o intestino grosso (pH=7), contem o um vasto nmero de microrganismos, sendo que, nagrande maioria so bactrias anaerbias (Vandenplas, 2009). As infeces do aparelho gastrointestinal tm uma alta incidncia sobretudo em determinados grupos etrios (crianas e idosos).5 Paraumaavaliaodopossvelagenteinfeccioso,devesercolhidaumaamostradefezesem recipiente adequado. 1.3.5Amostras provenientes das Vias Respiratrias OSistemarespiratriopodedividir-seemsuperioreinferior.Apartesuperiorenvolveaepiglotee tecidoscircundantes,laringe,cavidadenasalefaringe(Forbes&Sahm,2004).Aparteinferior compreende a traqueia, brnquios, bronquolos e pulmes.O diagnstico deinfeces frequentemente dificultado pela contaminao das amostras pela flora comensal das vias respiratrias superiores durante a sua colheita (Fonseca et al., 2004). Deve-se ter em conta, os microrganismos presentes nesta flora e observ-los como contaminantes das amostras, e no como causadores de infeco.Podem ser efectuadas colheitas das seguintes amostras:Expectorao Secreces brnquicasLavado brnquico ou Lavado bronco-alveolar Bipsia brnquica ou Bipsia pulmonar Aspirado transtraqueal ou Aspirado pulmonar O exame microbiolgico do exsudado nasal efectuado para despiste deMRSA (S.aureus resistente meticilina).Cercade20a30%dosindivduossaudveissoportadoresdeS.aureus,podendo existir MRSA. Neste sentido, importante fazer despiste de MRSA nos doentes hospitalizados, para que seja possvel tomar medidas de preveno e controlo de infeco hospitalar (Versalovic, 2011). 1.3.6Exsudado Cutneo, de ferida, escara ou auricular externo: A pele representa uma barreira consideravelmente eficaz contra as infeces bacterianas. Apesar de viveremsobreapelemuitasbactrias,normalmentesoincapazesdeprovocarumainfeco. Existem mais microrganismos nas zonas mais hmidas da pele (ex: axilas e virilhas).Quandoexisteasuspeitadeumainfeco,devemsercolhidosexsudadosparaanlise microbiolgica, sendo tambm efectuados exsudadoscutneos para controlo de infeco Hospitalar (Forbes & Sahm, 2004). 1.3.7Exsudado Ocular: Devidosuaexposioconstanteparaomeioexterno,aconjuntivaestsujeitaacontaminao microbianaintensa.Amaioriadosmicrorganismossoremovidosporlacrimao(quecontm lisozima), ficando apenas uma microbiota relativamente escassa. Quando ocorre uma interrupo do equilbrio entre a flora residente e transitria, podem surgir doenas (Trindade, 1999) (Baron, 1996). Perante a suspeita de infeco procede-se recolha de exsudado ocular.6 1.3.8Lquidos Corporais Qualquertecidodoorganismooulquidocorporalestrilpodeserinvadidoeinfectadoporagentes potencialmente patognicos (Forbes & Sahm, 2004). Oslquidosdevemsercolhidosseguindoasnormasdecolheitaedevemserenviadosdeimediato paraolaboratrio.Almdojreferidosangue,existemoutroslquidosestreiscomo:lquido peritoneal(cavidadeabdominal),lquidopleural(trax),lquidoarticular(articulaes),LCR(lquido cerebrospinal) e blis (lquido biliar). Informaoclnicaadicionalumdadoimportante,napesquisadoagenteetiolgicoedeveser fornecida ao laboratrio, juntamente com a amostra a analisar (Fonseca et al., 2004). 1.4Meios de cultura: Osmeiosdeculturafornecemsbactriasosnutrientesnecessriosparaoseucrescimento (vitaminas,elementosmineraisefontesdeenergia,essencialmentedecarbonoeazoto),tornando assimpossvelamultiplicaodemicrorganismosemlaboratrio,sobcondiescontroladas.As exignciasmetablicasdebactriaseoutrosmicrorganismossomuitodiversificadasealguns microrganismos ainda no so cultivveis (Forbes & Sahm, 2004) (Nelson & Cox, 2002). Os meios de cultura podem dividir-se essencialmente em trs categorias gerais: Noselectivos:contmnutrientesquefavorecemocrescimentodamaioriados microrganismos (Forbes & Sahm, 2004). Selectivos: contm um ou mais agentes que inibem todos os microrganismos excepto os que se pretendem obter (Forbes & Sahm, 2004). Diferenciais:contmfactoresquepermitemscolniasbacterianasexibircertas caractersticas que podem ser utilizadas para diferenciao de outras bactrias que crescem no mesmo meio (Forbes & Sahm, 2004). Apenas alguns meios de cultura so requeridos para uso dirio no diagnstico microbiolgico e cabe aos responsveis do laboratrio a escolha dos meios a utilizar. Tabela 1. 2 Meios de cultura utilizados neste estudo MeioObjectivo principal MacConkey MeiodeselecoediferenciaoparabacilosentricosGramnegativo fermentadoresenofermentadoresdelactose(nomeadamente Enterobactereaceas spp. e Pseudomonas spp.)(Forbes & Sahm, 2004). Gelose SangueMeionoselectivoquepermiteocrescimentodamaioriados microrganismos (Faria, 2010). Chocolate Meionoselectivoparticularmenterecomendadoparaocrescimentode estirpesexigentespertencentesaogneroNeisseriaeHaemophilus (BioMriuex, 2009). 7 Columbia-colistina-cido nalidxico (CNA) Meio de seleco para microrganismos Gram positivo(BioMriuex, 2009). Yersinia CINMeio de seleco para espcies Yersinia (BioMriuex, 2009). Campylosel Meio de seleco para isolamento de Campylobacter spp. (C.jejuni e C.coli principalmente) (BioMriuex, 2009). Legionella GVPC MeiodeselecoparamaioriadasespciesdeLegionella(BioMriuex, 2009)(BioMrieux,GeloseLegionellaGVPC:Isolamentoselectivodas legionellas, 2004). SabouraudMeio de seleco para fungos (BioMriuex, 2009). D-coccosel (bile-esculina) Meiodeselecoediferenciao,paradiferenciarenterococosde estreptococos (BioMrieux, Produtos conventional culture media, 2012). Hektoen Meio de seleco e diferenciao para espcies de Shigella e Salmonella (Becton, Hektoen Enteric Agar, 2011). Chocolate com Vancomicina, colistina, anfotericina e trimetoprim (V.C.A.T) Meio de seleco para Neisseria spp. (Forbes & Sahm, 2004).

MRSA MeiodeselecoediferenciaoparaS.aureusresistentesameticilina (MRSA) (BioMrieux, Gelose MRSA, 2006). Mueller-Hinton Meionoselectivousadoparaoestudodasusceptibilidadeaos antimicrobianos (BioMrieux, Gelose Mueller Hinton 2, 2002). MacConkey com SorbitolMeiodeselecoediferenciaoparaE.coliO157:H7(Becton, MacConkey Agar with Sorbitol, 2003). Granada MeiodeselecoediferenciaoparaadetecodeStreptococcus agalactiae(Becton, Granada Medium, 2011). Almdosmeiosmencionadosanteriormente,existemoutrostipos,taiscomomeiosde enriquecimento.SoexemplosdissooCaldoparamicrorganismosGramnegativo(GN),meio selectivoparapatognicosentricos,oCaldoToddHewitt,meioselectivoparaStreptococos (ex.:S.agalactiae), e a Hemoline que se destina pesquisa de microrganismos aerbios (BioMrieux, Caldo Todd Hewitt + Antibiticos, 2003). 1.5Crescimento bacteriano: Alm dos nutrientes fornecidos pelos meios de cultura,os microrganismos apresentam ainda outras exignciasparaqueoseucrescimentosejaobtidocomsucesso:temperatura,atmosferaepH(pH tambm fornecido pelomeio de cultura). Atemperaturade incubaoquepossibilitaocrescimento maisrpidonum curtoperododetempo (geralmente 18-24 horas) chamada de temperatura ptima. Relativamente s temperaturas podem-se distiguir os seguintes grupos de microrganismos: Bactrias psicrotrfilas: capazes de crescer a temperaturas baixas (entre 0 e 15C).Bactrias mesfilas: capazes de crescer entre 20 e 40C. Bactrias termfilas: capazes de crescer a temperaturas altas (entre 40 e 60C); 8 Bactriashipertermfilas:capazesdecresceratemperaturasmuitoaltas(acimade60C) (Arcuri & et al, 2008) (Madigan & et al., Biology of Microorganisms, 2012). A maioria dos microrganismos isolados neste estudo crescem a 36C 1, sendo por isso classificados como mesfilos. Aexignciaounodedeterminadosgases,nomeadamenteoOxignioeoDixidodeCarbono, permite classificar as bactrias em:Aerbiosobrigatrios:proliferamnoarambientequecontem21%deOxignio(O2)euma pequena quantidade (0,03%) de Dixido de Carbono (CO2); Anaerbios obrigatrios: no crescem na presena de oxignio livre, podendo esta atmosfera ser obtida atravs de geradores, bolsas ou cmaras de anaerobiose, compostas por 5 a 10% de Hidrognio (H2) e CO2, 80 a 90% de Azoto (N2) e 0% de O2; Anaerbios facultativos: crescem na presena ou ausncia de oxignio livre; Captanfilos: requerem maior concentrao de CO2 (5-10%) e aproximadamente 15% de O2; Microaerfilas:requeremconcentraesmenoresdeoxigniolivre(5a10%)emaioresde CO2(8a10%).Esteambientetambmpodeserobtidoatravsdegeradoresoudebolsas (Forbes & Sahm, 2004). A maioria dos microrganismos analisados neste estudo so aerbios e anaerbios facultativos. TambmopHinterferenocrescimentobacteriano.Estedeveserajustado,consoanteas necessidadesdabactriaemestudo.MicrorganismosquecrescemoptimamenteavaloresdepH aproximadamenteneutros,sochamadosneutrfilos(amaioriadosanalisadosnesteestudo).Por contraste,osmicrorganismosquecrescemmelhoravaloresdepHinferioresa5,5sochamados acidfilos. Microrganismosque demonstrem um crescimento ptimo a valores de pH superiores a 8, designam-se de alcaliflicos. A populao atinge condies ptimas de crescimento quandose encontram reunidas as condies nutricionais fornecidas pelo meio de cultura, e as condies fsicas a que so expostos (temperatura, atmosfera e pH). 1.6Preparaes a fresco e coloraes Aobservaomicroscpicatambmumprocedimentomuitoimportantenumlaboratrioclnico, pois ajuda na validao da amostra. Existemdoismtodosgerais(mtodosdirectos)utilizadosnapreparaodeamostras microbiolgicas:oExame a Fresco: baseia-se na observao directa da amostra ao microscpio, preservando a forma natural dos microrganismos (Pereira & Petrechen, 2011) (Fonseca et al., 2004). oExameps-colorao:possibilitaacoloraoefixaodemicrorganismos,paraposterior observao microscpica (Pereira & Petrechen, 2011). 9 Amaioriadasobservaesmicroscpicasfeitacomcolorao.Omaterialcelulareos microrganismos so frequentemente transparentes e podem ser mais facilmente distinguidos pelo uso de corantes (Pereira & Petrechen, 2011). NesteLaboratriosoutilizadasdoistiposdecoloraes:coloraodeGramecoloraode Ziehl-Neelsen. 1.6.1Colorao de Gram A colorao de Gram um dos mtodos de colorao mais importantes utilizados em laboratrios de microbiologia,indispensvelparaodiagnsticoeidentificaodediversosmicrorganismos.Esta coloraoclassificaosmicrorganismoscombasenassuascaractersticasmorfolgicasetinturiais (tamanho,formaecolorao)(Pereira&Palomo,2010)(Madigan&etal.,Biologyof Microorganisms, 2012)(Murray, 2007) (Freitas & Picoli, 2007). Certasbactriasquandotratadasporum corantebsicodepararosanilina (ex.:violetadecristal),e seguidamente pelo iodo, fixam o corante de tal modo que este no removido pelos diferenciadores comolcool-acetona.Aestasbactriasd-seonomedebactriasGrampositivo,ecoramdeazul escuro (Pereira & Palomo, 2010). AparededasbactriasGrampositivobasicamenteconstitudaporumacamadaespessade peptidoglicanosuficientementeporosaparapermitirapassagemdemetabolitosparaamembrana plasmtica (Forbes & Sahm, 2004) (Murray, 2007). Outrasbactriassodescoradasquandoaplicado odiferenciadorlcool-acetona,echamadasde Gramnegativo.Estasbactriasapresentamumafinacamadadepeptidoglicanonaconstituioda parede.Paraquesepossam ver mais facilmentequandoobservadasaomicroscpio,aplica-seum corante de contraste, geralmente vermelho (fucsina ou safranina) (Forbes & Sahm, 2004) (Pereira & Palomo, 2010) (Madigan & et al., Biology of Microorganisms, 2012). ainda possvel observar, atravs da colorao de Gram, as diferentes morfologias que as bactrias podemapresentar.Destemodo,asbactriaspodemapresentarformaesfrica(coco),formade bastonete(bacilo),formaoval(cocobacilo),formadevrgula(vibrio),formaondulada(espirlo),ou Figura 1. 1Observao microscpica de bacilos Gram negativo (1000x),onde tambm visvel uma clula epitelial (foto deste trabalho). Figura 1. 2Observao microscpica de cocos Gram positivo em cacho (1000x) (foto deste trabalho). 10 em formadeespiral(espiroqueta)(ver Figura1)(Madigan & et al., Biology of Microorganisms, 2012) (Murray, 2007). Algumasbactriasformamaindaagregadospodendo dispor-se em:pares, cachos e cadeias. 1.6.2Colorao lcool-cido resistente (Ziehl-Neelsen) Certos microrganismos possuem na sua parede cidos gordos de cadeia longa (cido miclico), que conferemimpermeabilidadeaovioletadecristaleaoutroscorantesbsicos.Caloroudetergentes devemserusadosparapermitiraentradadecorantesprimriosnestasbactrias.Umavezdentro das clulas bacterianas, o corante no eliminado mesmo com solvente lcool-cido.AcoloraoZiehlNeelsentemcomoprincpiofundamentalacoloraolcool-cido-resistentede microrganismosediferenciagruposespecficosdebactriascomoMycobacteriumspp.(Pereira& Petrechen, 2011). 1.7Testes de Identificao Para a identificao do agenteisolado alm de se ter em conta as observaes macroscpicas (ex: caractersticas de colnias nos meios) e microscpicas (ex: caractersticas tinturiais e morfolgicas), tambm temos que ter em considerao alguns testes de identificao (Pereira & Petrechen, 2011). Para identificao do agente etiolgico foram realizados os seguintes testes: 1.7.1Oxidase DeterminaapresenadaenzimaintracelularCitocromoCOxidaseembactrias.Estaenzima participanotransportedeelectresdasviasmetablicasdamaioriadasPseudomonasspp., permitindoadiferenciaodosbacilosGramnegativo(Forbes&Sahm,2004)(Macfaddin,2000) (BioMriux, 2005) (Versalovic, 2011). Contudo,deve-seteremcontaalgumaslimitaesdesteteste,paraquenosejamobtidos resultados falsos: oNo utilizar ansas de ferro, oNo utilizar uma cultura mista. Figura 1. 3Morfologia das bactrias (Murray, 2007). 11 2H2O2 2 H2O + O2 1.7.2Catalase Detectaapresenadecatalaseembactrias,servindoessencialmenteparaadistinodecocos Gram positivo. A catalase uma enzima intracelular que decompe o perxido de hidrognio (H2O2)segundo a reaco qumica: Quandoacatalaseestpresenteverifica-seefervescncianarealizaodaexperincia,devido libertaodeoxignioresultantedahidrlisedeH2O2(Forbes&Sahm,2004)(Macfaddin,2000) (Versalovic, 2011). Para evitar resultados falsos, deve-se: oEvitar a utilizao de meios que contm sangue, pois os eritrcitos podem produzir uma fraca reaco de catalase. 1.7.3Coagulase Verifica a capacidade de um microrganismo reagir com o plasma e formar um cogulo, por aco da enzimacoagulase.Umtestedecoagulasepositivoumcritriodediagnsticopresuntivopara identificarS.aureus.DestaformapossveldistinguirStaphylococcuscoagulasepositivade Staphylococcus coagulase negativa.As clulas de uma colnia recente so adicionadas a plasma de coelho.Seoorganismopossuircoagulase,aenzimaagesobreofibrognionoplasmaecausa agregao da bactria (de la Maza, Pezzlo, & Baron, 1999) (Macfaddin, 2000) (Versalovic, 2011). Paraquenosejamobtidosresultadosdefalsospositivosoufalsosnegativosdeve-seutilizarum nmero suficiente de colnias na realizao do teste (uma a duas colnias). 1.7.4Urease Detectaapresenadaenzimaurease.Estaenzimacatalisaahidrlisedeureiaemdixidode carbono e amnia: Seaureaseestiverpresente,hidrolisaaureiaeaamniaresultanteaumentaopHdomeio alcalinizando-o, pelo que a sua presena se detecta facilmente por meio de um indicador. A prova considerada positiva aquando da alterao da cor do meio, e negativa na ausncia dessa alterao. Deste modo, este teste ajuda na identificao de certas espcies de Enterobactereaceas (ex: Proteus spp.)(Forbes & Sahm, 2004) (Versalovic, 2011). Resultados de falsos positivos so considerados raros, mas podem ocorrer se o teste for lido aps 24 horas. (NH2)2CO + H2O CO2 + 2 NH3 12 1.7.5Indol DeterminaacapacidadedomicrorganismodegradarotriptofanoatproduodeIndol.O Triptofanoumaminocidoquepodesofreroxidaopelasactividadesenzimticasdealgumas bactrias, devido presena de triptofanase1 (Forbes & Sahm, 2004) (Macfaddin, 2000) (Versalovic, 2011). Paraqueseobtenhaumresultadovlido,deve-seconsiderarcomopositivoalteraesdecor imediatas. 1.7.6Teste de CAMP Aidentificaopresuntivadeestreptococos-hemolticosdogrupoBdeLancefield(S.agalactiae) pode ser feita atravs deste teste. A actividade hemoltica da -hemolisina produzida pela maioria das estirpesdeS.aureusacentuadaporumaprotenaextracelularproduzidaporestreptococosdo grupoB.Interaesda-hemolisinacomestaprotenacausamsinergismohemoltico,que facilmenteobservadoemplacadegardesangue,poisa-hemliseapresenta-sesobaformade flecha.Estefenmenoobservadoqueremisoladoshemolticos,quernohemolticosde estreptococos do grupo B (Washington Jr. et al, 2006) (de la Maza, Pezzlo, & Baron, 1999). Para que se obtenham resultados vlidos, no devem ser utilizadas colnias velhas de S.aureus (pois podemnoproduzir-hemolisina),nemsedevetocarasestriasdasementeira(paraquenohaja resultado de falso positivo). 1.7.7Hidrlise de esculina Estaprovautiliza-separadeterminaracapacidadedeummicrorganismohidrolisaraesculina, presentenomeioD-coccosel.Aesculinaumcompostofluorescente,contudo,aquandodasua hidrliseafluorescnciaperdidaeomeiotorna-sepreto.Destemodoemprovasconsideradas positivas,omeiosofrealteraodecorparapreto,sendoassimpossveldistinguirosenterococos (positivos para este teste) dos estreptococos. A incubao do meio deve ser feita em aerobiose, pois existemestreptococos do grupo viridans que conseguemhidrolisaraesculinaquandoincubadosematmosferadeCO2(Forbes&Sahm,2004) (Washington Jr. et al, 2006). 1 Termo geral usado para denominar o sistema completo de enzimas que medeiam a produo de Indol 13 1.7.8Sistemas automatizados Podeaindaserutilizadoumsistemaautomatizado2:Vitek2Compact,paraaidentificaodo microrganismo isolado. Este sistema realiza em simultneo a identificao de bactrias e os resultados do respectivo teste de susceptibilidade a antimicrobianos (TSA) num nico relatrio e encontra-se associado a um programa decomputadorqueauxlianainterpretaodosresultadosdostestesdesensibilidade (Fonsecaet al., 2004) (BioMrieux, VITEK 2 Compact , 2005). 1.8Antibiograma - Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos (TSA) O antibiograma uma tarefa executada pelo sector de microbiologia clnica, que possibilita avaliar o padro de resposta de bactrias (padro desensibilidade) perante concentraes pr-estabelecidas deantimicrobianos3.Destemodo,asbactriaspodemserconsideradasemtrscategorias: Resistente (R), Intermdio (I), ou Sensvel (S) ao agente antimicrobiano.

Mecanismos de aco dos antimicrobianos: Omodocomoactuamosantimicrobianosbaseia-senainibiodeprocessosessenciais multiplicaodaclulae,emltimainstncia,suasobrevivncia.Sodivididosdeacordocoma estrutura alvo na clula bacteriana, como evidenciado na tabela 1.3 (Murray, 2007) (Washington Jr. et al, 2006). tabela 1. 3Locais de aco dos antimicrobianos nas bactrias (Sousa, 2006). Local de acoExemplos Sntese da parede celular Penicilina, Aztreonamo, Imepenemo,Ampicilina,Amoxacilina, Piperacilina,Ticarcilina,Oxacilina, Meticilina, Cefpime,Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftazidima,Cefalotina,Cefoxitina, Meropenemo, Vancomicina e Teicoplanina Membrana plasmticaPolimixina B e E (Colistina) Sntese de cidos nucleicos cido nalidixco Ciprofloxacina e Ofloxacina Sntese proteica Linezolida, Amicacina, Tobramicina, Gentamicina, Cloranfenicol, Tetraciclina, Eritromicina, Telitromicina, Lincosamina, Clindamicina, Novobiocina, Estreptomicina, Estreptogramina A (quinupristina), Estreptogramina B (dalfopristina) e Nitrofurantona. Anti-metabolitosTrimetoprim, Sulfonamidas e Cotrimoxazole (Trimetropim-Sulfametoxazol) 2Nestelaboratrio,normalmente,procede-seaidentificaoatravsdesistemasautomatizados,quandose tratamdemicrorganismosmenosfrequentesempatologiasclnicas,ouquandonopossvelasua identificao atravs dos testes de identificao mencionados.3 qualquer tipo de droga, incluindo antibiticos, que tem a capacidade de inibir o crescimento de bactrias ou de as matar, bacteriosttica ou bacteriocida, respectivamente. 14 Mecanismos de Resistncia aos antimicrobianos: Osprincipaismecanismosderesistnciaqueumabactriapodeapresentaracodos antimicrobianos baseiam-se em:a)InativaoEnzimtica:Inactivaodoantibiticoatravsdaproduodeenzimasque neutralizamosantibiticos.Estasenzimaspodemser:constitutivas,seforemproduzidas independentementedapresenadoantimicrobiano;ouinduzidas,seoantimicrobiano, quandoemcontactocomabactria,desencadeiaouestmulaa produoenzimticaque proteger a bactria dos efeitos dos antibiticos. b)Alteraoda permeabilidade damembrana:Aalteraonoscanaisdeporinaimpedema passagem e consequentemente, a aco dos antimicrobianos. c)Efluxo activo de antibiticos: Capacidade de expulsar activamente os antibiticos para fora da clulaatravsdebombasdeefluxo,contribuindoparaumaconcentraoinsuficiente realizao do seu efeito. d)Alteraodoalvodoantimicrobiano:Osantimicrobianosligam-seaalvosespecficosna paredecelulardabactria.Seesteforalteradooantimicrobianonoseconsegueligare torna-se ineficaz contra a bactria. Nocontextodaresistnciaaosantimicrobianos,osorganismosprocariticospodemapresentar fundamentalmente os seguintes fentipos: resistncia intrnseca e resistncia adquirida. Aresistnciaintrnsecaumacaractersticanaturalapresentadaportodososexemplaresdeuma determinadabactria,podendosertilnaidentificao.Exemplo:aresistnciadeS.aureus polimixina B (ver resistncias intrnsecas em apndice 1).Aresistnciaadquiridaresultademutaescromossmicase/outransfernciasdegenesde resistncia por elementos genticos mveis atravs de :a)Conjugao,ondeocontactocomoutrasbactriaspossibilitaatransfernciadegenesde resistncia a antibiticos.b)Transformao, onde ocorre a captao de DNA livre no meio ambiente; c)Transduo, onde vrus que infectam bactrias (bacterifagos) transferem genes de virulncia para as mesmas (Vieira, 2009)(Stansfield, 2005). Umoutrofentipoqueasbactriaspodemapresentaracodosantimicrobianosa susceptibilidade. Esta resulta da ausncia total de mecanismos de resistncia. TodasasetapasenvolvidasnoprocedimentodoTSAenoresultadodomesmo,sopadronizadas por organizaes especializadas como:Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA) utilizada neste laboratrio British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido);Comit de LAntibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie (CA-SFM, Frana); European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, Europa). 15 OTSAdeveserrealizado paraqualquermicrorganismoquesejaresponsvelporumprocesso infecciosoequenecessitedeteraputicaantimicrobiana,semprequeasusceptibilidadenopuder ser previsvel pelo conhecimento da identidade do microrganismo, ou esse microrganismo sejacapaz de exibir resistncia aos antimicrobianos mais frequentemente utilizados. Os antimicrobianos a utilizar diferemconsoanteotipodemicrorganismoemestudo(verlistasemapndice2)(CLSI,2011) (Fonseca et al., 2004). Osmtodoscorrentesdetestesdesusceptibilidadeaantimicrobianos(TSA),podemserclassificados em trs grandes grupos: Testes de diluio (pontos I e II) Testes de difuso (ponto III) Testes de gradiente de difuso ( ponto IV) I.Macrodiluo em meio lquido Foi o primeiro mtodo a ser desenvolvido, sendo considerado o de referncia. Este mtodo consiste narealizaodediluiessucessivasdeagenteantimicrobianoemcaldo,existindoaindaumtubo livredeagenteantimicrobiano,paracontrolodecrescimento.Cadatuboinoculadocomuma suspensodomicrorganismoasertestadoeincubadoa36C1,durante18-24horas.Apsa incubao,ostubossoexaminadosvisualmentepelaturvao.Aexistnciadestaturvaoindica que o crescimento bacteriano no foi inibido pela concentrao de agente antimicrobiano presente. A maisbaixaconcentraodeantimicrobianoemg/mlque impedeo crescimentobacteriano(tubo onde ja no visivel turvao) representa a concentrao minima inibitria, CMI. Contudo,estemtodonoutilizadodevidoaofactodesermuitotrabalhosoedispendioso(Fonseca et al., 2004). II.Microdiluo em meio lquido (sistemas automatizados) Namaioriadoslaboratriosutilizadoumsistemaautomatizadoquesebaseianaadaptaodo testeanterioravolumesmenores.Estemtodopermiteavaliarasusceptibilidadedasbactrias contra um vasto painel de AM (antimicrobianos) e a baixo custo. O uso dos sistemas automatizados (ex: Vitek e Walk away) permite a execuo dos testes de sensibilidade com maior rapidez, pois estes aparelhospossuemsistemasdedetecopticacapazesdemediralteraesdiscretasdo crescimentobacteriano.NestelaboratrioutilizadoosistemaautomatizadoVitek2compact (Fonseca et al., 2004) (BioMrieux, VITEK 2 Compact , 2005). III.DifusoOs testes de difuso utilizam uma suspenso bacteriana padronizada que semeada em meio slido apropriado ao mtodo utilizado (ex.: gelose Meller-Hinton para o mtodo de Kirby-Baer). Os discos impregnadosemantimicrobianossocolocadosnasementeiraeapsincubaosomedidosos tamanhosdoshalosdeinibiodecrescimento,obtendo-seumresultadoqualitativoquepodeser lido em Sensvel / Intermdio /Resistente (Fonseca et al., 2004). 16 oMtodo de KIRBY-BAER O mtodo de difuso em disco utilizado na rotina dos laboratrios clnicos, descrito por Kirby e Baer em 1966, um dos mtodos de sensibilidade mais simples e confiveis. O gar de Meller-Hinton considerado o meio mais adequado para testes de rotina de sensibilidade contra bactrias no fastidiosas pelas seguintes razes: Permitecrescimentosatisfatriodemicrorganismospatognicosnofastidiosos:A composiodestemeiopermiteocrescimentodebactriasnoexigentes (Enterobactereaceasspp.,bacilosGramnegativonofermentadores,estafilococose enterococos)detectadosempatologia,garantindoummnimodeinterfernciados componentesdafrmulanoresultadodoantibiograma(BioMriuex,2009)(BioMrieux, Gelose Mueller Hinton 2, 2002). Contem baixos teores de inibidores de sulfonamida, trimetoprim e tetraciclina: Os meios que contm teores excessivos de timidina ou timina podem reverter o efeito inibitrio destestrs antibiticos,produzindohalosdeinibio menoresemenosntidos,ouatmesmonenhum halodeinibio,oquepoderesultaremfalsaresistncia(BioMriuex,2009)(BioMrieux, Gelose Mueller Hinton 2, 2002) (CLSI, 2011). Concentraoajustadadeiesbivalentes:Asvariaesnoscatiesdivalentes, principalmentemagnsioeclcio,afectamosresultadosdostestesdeaminoglicosdeose tetraciclinascontraestirpesdePseudomonasaeruginosa.Umteorexcessivodecaties reduzotamanhodoshalosdeinibio,enquantoqueumbaixoteordecatiespoder resultaremhalosdeinibioexageradamentegrandes.Porestemotivo,aconcentrao destemeioajustadaparaassegurarumaprecisomaiscorrectanadeterminaoda sensibilidadedasPseudomonasspp.aosaminoglicosdeosestetraciclinas(BioMriuex, 2009) (CLSI, 2011) (BioMrieux, Gelose Mueller Hinton 2, 2002). IV.Gradiente de difuso (Etest) Um dos mtodos quantitativos mais utilizados, o Etest, baseia-se em tcnicas de diluo e difuso. O sistema compreende um gradiente antimicrobiano pr-definido que usado para quantificar a CMI em g/ml (BioMrieux, Products: Etest, 2012). QuandoumatiradeEtestinoculadanumaplacadegar,humaimediatadifusodoantibitico pelomeio.Apsincubao,almdeservisvelumcrescimentobacteriano,tambmvisveluma inibio elptica volta datira (BioMrieux, Products: Etest, 2012). 1.9Microrganismos Omundodosmicrorganismosmuitovasto,contudo,seroapenasfocadosaquelesqueforam isolados com mais frequncia nas amostras clnicas estudadas. 17 1.9.1Microrganismos Gram negativo: Dentro destas caractersticas podemos destacar a famlia das Enterobactereaceas e os bacilos Gram negativo no fermentadores. 1.9.1.1Famlia de Enterobactereaceas: Estafamliaenglobamicrorganismosobquoseconstituintesdamicrobiotaintestinalcomensalda maioriadosanimais,inclundosereshumanos.Estesmicrorganismossocomunseminfeces humanas,sendoosmaisfrequentementeisoladosnumlaboratriodemicrobiologia. Todosos membrosdesta famliasobacilos Gramnegativo, aerbioseanaerbiosfacultativos,oxidase negativo e fermentadores de glicose que crescem em MacConkey (Fonseca et al., 2004) (Poeta & Rodrigues, 2008-2009) (de la Maza, Pezzlo, & Baron, 1999). Tabela 1. 4 Lista de espcies Enterobactereaceas que podem ser associadas a infeces no homem(Fonseca et al., 2004). Citrobacterkoseri Shigella dysenteriae (grupo A) Enterobacter aerogenes Shigella flexeneri (grupo B) Enterobacter cloacaeShigella boydii (grupo C) Serratia marcescensShigella sonnei (grupo D) Serratia liquefaciensSalmonella (todos os serotipos) Proteus mirabilisYersinia pestis Proteus vulgarisYersinia enterocolitica Proteus penneri Yersinia pseudotuberculosis Providencia retgeriEscherichia coliProvidencia stuartiKlebsiella pneumoniaeMorganella morganniKlebsiella oxytoca Estes microrganismos so associados a infeces gastrointestinas, urinrias e respiratrias, actuando normalmente como patognicos oportunistas(Fonseca et al., 2004). (ver morfologia tpica de algumas Enterobactereaceas em apndice 3) 1.9.1.2Bacilo Gram negativo no fermentadores Existembactriasque,emboraseapresentemcomo bacilosGramnegativo,talcomoa famliadas Enterobactereaceas,diferemdestapornoutilizaremouoxidaremaglucose(aocontrrioda familiadasEnterobactereaceasqueafermentam).SoexemplosdissoosgnerosAcinetobacter spp. e Stenotrophomonas spp.. Estes microrganismos no fazem parte da flora normal humana, mas devidoaltaprevalnciadealgunsdelesemmeiohospitalar,essencialmenteAcinetobacterspp., podem colonizar a pele e o aparelho respiratrio de doentes hospitalizados (Fonseca et al., 2004). 18 OutrosmicrorganismosquesediferenciamdafamliadasEnterobactereaceasporseremOxidase positiva, como o caso de Pseudomonas spp., Burvodimonas spp., Rhizobium spp. e Ochrobactrum spp.. Pseudomonas aeroginosa a espcie no pertencente famlia das Enterobactereaceas encontrada com mais frequncia em amostras clnicas. Tambm a espcie Acinetobacter baumanii encontrada algumas vezes,enquantoqueasrestantesraramenteseencontramassociadasainfecesnoser humano (ver morfologia tpica de P.aeruginosa em apndice 4). 1.9.2Microrganismos Gram positivo: Destacam-seasfamlias:Micrococcacea,Staphylococcacea,StreptococcaceaeEnterococcacea, como sendo as de maior interesse a nvel clnico. 1.9.2.1Familia deStaphylococcaceae Os gneros pertencentes a esta famlia so: Staphylococcus spp., Gemella spp., Jeotgalicoccus spp., Macrococcusspp. eSalinicoccusspp.. Contudo,osagentesetiolgicosmaiscomunsdedoenas humanassoospertencentesaogneroStaphylococcus(Forbes&Sahm,2004)(delaMaza, Pezzlo, & Baron, 1999) (Washington Jr. et al, 2006). Os estafilococos so, geralmente, comensais ou patognicos oportunistas.A maioria das espcies aerbiaouanaerbiafacultativa,catalasepositivaeapresenta-sefrequentementecomococos em forma de cacho, quando observados ao microscpio aps colorao de Gram. Contudo, tambm podemserobservadosisoladamente,aospares,ouempequenascadeias (Forbes&Sahm,2004) (Washington Jr. et al, 2006) (Poeta & Rodrigues, 2008-2009) (de la Maza, Pezzlo, & Baron, 1999). AespciepatognicamaisencontradaeminfeceshumanasoS.aureus.Adistribuiodeste microrganismomuitoamplapodendoserencontradoemdiversoslocais,comoemalimentos, superfciessecaseemvriasregiesdocorpohumano(intestino,pele,mucosas,nasofaringee fossasnasais).S.aureusproduzumacoagulase,enzimacujadetecopermitedistinguiremdois grupos,estafilococoscoagulasepositiva(s.aureus)eestafilococoscoagulasenegativo.O estafilocococoagulasenegativo,maisfrequentementeencontradoemamostrasclnicaso S.epidermidis,quenamaiorpartedasvezescorrespondeaumagentecontaminante (Forbes& Sahm,2004) (WashingtonJr.etal,2006)(Poeta&Rodrigues,2008-2009)(delaMaza,Pezzlo,& Baron, 1999). Devidosuavirulncia,oStaphylococcusaureuspodecomprometeroorganismohumanoem infecessistmicas,ocasionandosepticmia,endocardite,choquetxicoeoutrascomplicaes, independente da faixa etria e do ambiente em que foi adquirida a infeco (Souza, 2011). (ver morfologia tpica de Estafilococos em apndice 5) 19 1.9.2.2Famliade Enterococcaceae Osgnerospertencentesaestafamliaso:Enterococcusspp.,Melissococcusspp., Tetragenococcus spp. e Vagococcus spp.

Destes microrganismos, os mais encontrados em infeces humanassoosEnterococcusspp.,nomeadamente:E.faecaliseE.faecium,quesoaerbiosou anaerbiosfacultativosecatalasenegativa(Forbes&Sahm,2004)(WashingtonJr.etal,2006) (de la Maza, Pezzlo, & Baron, 1999). Enterococcus spp. muito associado infeco hospitalar e a ITU (Fonseca et al., 2004). (ver morfologia tpica deEnterococos em apndice 6) 1.9.2.3 Famlia de Streptococcacea Osmicrorganismosdestafamliadispem-senormalmenteaospares(diplococos)ouemcadeias lineares,quandovistosaomicroscpio,apscoloraodeGram.Soaerbiosouanaerbios facultativosecatalasenegativa(Forbes&Sahm,2004)(WashingtonJr.etal,2006)(Poeta& Rodrigues, 2008-2009) (de la Maza, Pezzlo, & Baron, 1999). OsgnerosquefazempartedestafamliasoStreptococcusspp.eLactococcusspp..Destes microrganismos,osmaisencontradoseminfeceshumanassoosStreptococcusspp., nomeadamente:S.pyogenes(ouestreptococosdogrupoAdeLancefield),S.agalactiae(ou estreptococos do grupo B de Lancefield), S.pneumoniae eS.viridans (Forbes & Sahm, 2004). S.pyogenes (-hemoltico) um patognico que causa amigdalite bacteriana nas crianas dos 5 aos 10 anos de idade (Fonseca et al., 2004). S.agalactiae(gamaou-hemoltico)cujodespisteimportanteno3trimestredegravidez,para previnir a infeco neonatal que pode ocasionar quadros graves de septicmia e meningite (Forbes & Sahm, 2004) (Poeta & Rodrigues, 2008-2009). S.pneumoniae (-hemoltico), a principal causa de pneumonia da comunidade e frequente causa de pneumonia, meningite, otite e sinusite, contudo o microrganismo pode residir sem provocar danos nas vias respiratrias superiores (Forbes & Sahm, 2004) (Fonseca et al., 2004). S.viridans,(gamaou-hemoltico),consideram-seemgeralpatognicosoportunistasdebaixa virulncia.Somicrorganismosfrequentementeenvolvidosemendocarditebacteriana (Forbes& Sahm, 2004). (ver morfologia tpica de Estreptococos em apndice 7) 1.9.2.4Bacilos Gram positivo DosmicrorganismosqueseapresentamsobaformadebacilosGrampositivo,aquelesquemais frequentementesoisoladosemamostrasclnicassoospertencentesaosgneros:Listeriae Corynebacterium ( Mena & et al, 2004). Contudo, durante este estgio apenas foi detectada a presena de Corynebacterium spp. 20 Corynebacterium spp.podeseraerbioouanaerbiofacultativo,fermentadorasdeglicosee outros carbohidratos e , na sua maioria so catalase positiva(Oliveira & et al, 2005). Estasbactriasencontram-seamplamentedistribudasnanatureza(soloegua)efazemparteda floradapeleemucosasdohomem.Osisolamentosemprodutosbiolgicosdebactriasdeste gnero, so geralmente considerados contaminantes. No entanto, o seu repetido isolamento sugere a suaimplicaonaetiologiadoprocessoinfeccioso(WashingtonJr.etal,2006)(Oliveira&etal, 2005).(ver morfologia tpica de Corynebacterium spp. em apndice 8) 1.9.3Outros microrganismos Alm dos microrganismos anteriormente mencionados detectou-se tambm a presena de leveduras. (ver apndice 9) Paraaslevedurasrealizado,nestelaboratrio,umtestedegerminao,quepermiteconcluirse estamosperanteC.albicans(germinaopositiva).aindautilizadoosistemaautomticode identificao, quando se justifica (ex:hemoculturas). Tambmfoipossvelaobservaodeoutrosmicrorganismospresentesemamostrasclnicas,que noasurinas,comoocasodeHaemophilusinfluenzae(coco-baciloGramnegativo),muito frequente em exsudados oculares.Paradetecodestemicrorganismoalmdoexamedirecto(coloraodeGram)eexamecultural (gelose Sangue e Chocolate) utilizam-se testes de identificao: otestededemonstraodaexignciadosfactoresdecrescimentohemina(X)e/ou Nicotinamidaadeninadinucleotdeo-NAD(V).Haemophilusinfluenzaeexigeapresenade ambos para o seu desenvolvimento, no crescendo quando apenas se encontra presente um dos factores (Forbes & Sahm, 2004)(Fonseca et al., 2004). (ver apndice 10) osistemas automatizados 21 2.Parte Experimental: 2.1 Materiais, Equipamentos e Reagentes: Equipamentos:Previ-Color Gram: colorao automtica de Gram, da Biomrieux Microscpio ptico Olympus BX41: Microscpio com ocular de 10x e quatro objectivas diferentes, 10x, 20x, 40x e 100x.Bact/Alert 3D 120: sistema automatizado para Hemoculturas e Micobactrias (Biomriuex). Vitek2compact(BioMrieux):sistemaautomatizadoparaidentificaodebactriase antibiograma Camaradeseguranabiolgica(classeII):paraprotecodooperadoreseguranano processamento de amostras. Estufa (ar ambiente ) e estufa de CO2 Materiais: Meios de cultura da BioMrieux. Ansas calibradas de 1l e 10l, de Sarstedt Zaragatoas, de APTACA. LminasNormax:Lminascombordosesmeriladoscomdimenses76x26mmeespessura 0,95x1,05 mm.Lamelas Normax: dimenses 22x22 mm e espessura 0,13x0,17 mm. BD BBL DRYSlide: Discos impregnados com reagente oxidase de dimetro 6mm, para a prova da oxidase. Kit slidex staph plus: teste de identificao presuntiva deS.aureus, para prova da coagulase, da Bio-Rad. Aplicador automtico de discos de antibiticos em placas de agar (90 e 150mm), para realizao de antibiogramas pelo mtodo de Kirby-Bauer Densimat:MedidordedensidadeparaantibiogramasrealizadospelomtododeKirby-Bauer: (BioMrieux)Materiais para Vitek2-Compact: oCartas de identificao oCartas para antibiogramas oTubos polisterino oDispensador de soluo salina oAparelho de densidades DensiCHEK Nos procedimentos experimentais foi ainda utilizado material corrente de laboratrio, Micropipetas e geradores de microaerofilia e anaerobiose da BioMrieux 22 Reagentes: Reagente Kovacs,para o teste da Ureia/Indol (BioMrieux) Perxido de Hidrognio (H2O2) para catalase Soluo salina da BioMrieux, para Vitek2-Compact Reagentes para colorao de Ziehl-Neelsen: oFucsina: Reagente de Kinyoun (BioMrieux) olcool-cido (970ml lcool etlico 96% ; 30 ml de HCl) oAzul de Metileno: Soluo de Gabett (BioMrieux) Reagentes para Previ-color Gram: oPrevi-Color Gram Soluo de Violeta de Cristal, da bioMrieux oPrevi-Color Gram Soluo de Iodo, da bioMrieux oPrevi-Color Gram Soluo de Acetona-Fucsina, da bioMrieux 2.2 Procedimento Experimental 2.2.1Trabalho 1: Estudo estatstico das vrias amostras biolgicas 2.2.1.1Processamento das vrias amostras UrinaExame cultural Aps homogeneizao, a amostra semeada com ansa calibrada de 1l, utilizando a tcnica de sementeira em estrias4. Meiosdecultura:geloseSangueeMacConkey(ageloseSanguesubstitudaporgelose CNA nos algaliados)As placas so incubadas durante um perodo de 18-24 horas a 36C1 em aerobiose; Exame directooExame de esfregao da urina pela colorao de Gram Comaajudadeumapipetadepasteur,colocarumagotadeurinapreviamente homogeneizadaenocentrifugadanalmina,semaespalhar(tcnicadeesfregaode lquidos). Esperar que a gota seque e fixar chama (bico de bnsen) Proceder colorao oExame directo a fresco do sedimento urinrio Centrifugaoa1800rpmdurante5minutos.Decantareutilizarosedimentoparafazer exame citolgico. Avaliao semi-quantitativa da presena de elementos celularestais como clulas epiteliais, eritrcitos, leuccitos, e microrganismos (bactrias, fungos e parasitas). 4Depositaraamostranomeiodeculturaatravsdeumaestriaaomeiodaplaca.Realizarestrias perpendiculares primeira estria, rodar a placa 90 e fazer novamente estrias.23 SangueExame culturalA amostra de sangue venoso colhida e inoculada directamente no meio lquido para hemocultura em aerobioseintroduzidanoequipamentoautomtico(Bact/ALERT3D),porleituradecdigode barras.Seoaparelhodetectaralgumapositividadeemitidoumsinaleofrascoretirado.Asnegativas mantm-seem incubaoatao5dia,findoosquaissoassinaladascomonegativoe retiradas.Exame cultural (Hemocultura positiva): So efectuadas passagens para meios de cultura: Agitar suavemente o frasco.Inserirumaagulhaparaventilarofrascoecolocarposteriormenteumaseringanaagulha para retirar aproximadamente 1ml.Colocarumagotaemcadaumdosseguintesmeios:geloseCNA,geloseChocolatee MacConkey. Efectuar a sementeira em quadrantes5 com a ajuda de uma ansa descartvel. Incubar a gelose de Chocolate e CNA em atmosfera de aerobiose rica em CO2 e MacConkey emaerobiosedurante18-24horasa36C1.VoltaraincubarageloseCNAeagelose Chocolate at 48 horas, se no houver crescimento s 24 horas.Exame directo: efectuadoesfregao6paracoloraopelomtododeGram,cujaobservaopode constituir informao importante como resultado preliminar. Ponta de cateter vascular Deve ser enviada hemocultura acompanhante colhida de veia perifrica 30 minutos antes da retirada do cateter. critrio de rejeio o no cumprimento desta norma. Exame cultural: Colocar o cateter em gelose Chocolate asspticamente com o auxlio de uma ansa.Fazer o cateter rodar sobre a superfcie do meioIncubar a 36C1 em atmosfera de aerobiose rica em CO2, at 48 horas. Amostras provenientes do aparelho reprodutor: Exame culturalUtiliza-se a tcnica de sementeira em quadrantes, em gelose Chocolate e Sabouraud. Podem ainda ser utilizados outros meios, alm destes, em casos especficos: oGranada: despiste de S.agalactiae, solicitado no 3 trimestre de gravidez. oVCAT: perante suspeita clnica de N.gonorrhoeae 5 Depositar a amostra no meio de cultura atravs da realizao de vrias estrias num primeiro quadrante (sem levantar a ansa do meio). Realizar estrias nos quadrantes seguintes, tocando sempre com a ansa nas estrias do quadrante anterior. 6Colocarumagotadesanguenaextremidadedalmina,emseguidaposicionarumasegundalminajunto dessa gota com uma inclinao de sensvelmente 45, e fazer correr esta segunda lmina sobre a primeira. 24 Incubar durante, 18-24 horas a 36C1,a gelose Chocolate, VCAT e Granada em atmosfera de aerobiose rica em CO2 ,e a gelose sabouraud em atmosfera de aerobiose. Exame directo Efectuar um esfregao de zaragatoa7 e corar pela tcnica de Gram. FezesPorrotina,soefectuadaspesquisasdeSalmonellaspp.,Shigellaspp.,Yersiniaenterocoliticae Campylobacter spp. Exame macroscpico Devemserregistadostodososaspectosmacroscpicosimportantes,taiscomo:fezes moldadas ou diarreicas, mucosas, sanguinolentas. Exame cultural Deve-se selecionar uma poro com muco e/ou sangue. Semearemquadrantes,usandoumaansadescartvel,nosseguintesmeios:Hektoen, MacConkey com sorbitol, Yersinia e Campylosel. IncubargaloseCampylosela42Cemmicroaerfiliadurante48horas,eosrestantesem aerobiose, durante 18-24 horas a 36C 1Colocar o resto da amostra em caldo GN. Incubar a 36C 1 em aerobiose, durante 6 horas e fazer a subcultura para gelose Hektoen.

Amostras provenientes das vias respiratrias Exame cultural oExpectorao, secreces brnquicas e lavado bronco-alveolar Fazer sementeira utilizando a tcnica em quadrantes, nos seguintes meios: gelose Chocolate, CNA, e MacConkey. Incubar os meios gelose Chocolate e CNA em atmosfera de aerobiose rica em CO2 e o meio de MacConkey em aerobiose, durante 18-24 horas a uma temperatura de 36C 1. oExsudado Nasal pesquisa de Staphylococcus aureus (portador) Vigilancia epidemiolgica pesquisa de Staphylococcus aureus meticilino resistente ( MRSA) Fazer sementeiras, utilizando a tcnica em quadrantesnos meios: MRSA e CNA Incubar os meios em atmosfera de aerobiose rica em CO2 durante 18-24 horas, a 36C 1. oExsudado farngeo Utilizartambmatcnicadesementeiraemquadrantes,parafazerocultivodesteproduto em CNA . Semear em meio liquido (caldo de Todd Hewitt), subcultura aps incubao de24 horas para gelose CNA Incubar em atmosfera de aerobiose rica em CO2 durante um periodo de 18-24h, a 36C1. 7 Rodar a zaragatoa para a frente e para trs em reas contguas da lmina. 25 Exame directo oExpectorao, secreces brnquicas e lavado bronco-alveolar Exame macroscpico da amostra e escolha da poro purulenta para execuo de esfregao Fazer duas lminas por tcnica de esmagamento8 CorarpelatcnicadeGrame Ziehl-Neelsen(quandosolicitadopesquisadebaciloslcool-cido resistente, por suspeita de Tuberculose.) Exsudado cutneo, ferida, escara e auricular externoExame culturalSemearemquadrantes,utilizandoazaragatoacomaamostrapararealizaroprimeiro depsito nos seguintes meios: MRSA (apenas para exsudado cutneo), MacConkey, CNA e Chocolate. Em seguida utilizam-se ansas descartveis para realizao dos quadrantes seguintes. IncubarosmeiosdeChocolate,MRSAeCNAematmosferadeaerobiosericaemCO2,e MacConkey em aerobiose, durante 18-24 horas a 36C 1Exame directoFazer lmina por rolamento de zaragatoaCorar por Gram Exsudado Ocular Exame cultural: Semear em quadrantes nos seguintes meios: gelose de Sangue e gelose Chocolate. Em seguida utilizar ansas descartveis para realizar os quadrantes seguintes. Incubar o meiogelose Chocolate em atmosfera de aerobiose rica em CO2 e gelose Sangue em aerobiose, durante 24-48 horas a 36C 1. Exame directo: Fazer lmina por rolamento de zaragatoa Corar por Gram. Lquidos corporais Exame cultural: Retirar 2 a 3ml de lquido, com a ajuda de uma seringa. Colocar uma gota em gelose Chocolate e semear em quadrantes. Incubar o meio em atmosfera de aerobiose rica em CO2 durante 24-72horas a 36C 1. Inocular em meio lquido de enriquecimento (Hemoline), incubar a 36C 1, em aerobiose Exame directo: Esfregao corado pelo mtodo de Gram (tcnica de esfregao de lquidos) 8 Depositar amostra sobre a lmina e pressionar com uma segunda lmina. Deslizar suavemente as lminas em direces opostas. 26 EsfregaocoradopelomtododeZiehl-Neelsen:nocasodepesquisadeBaciloslcool-cido resistentes. (tnica de esfregao de lquidos) 2.2.1.2Procedimento efectuado para coloraes Para qualquer colorao necessrio iniciar com os seguintes procedimentos: Depositar a amostra na lmina Esperar que seque e fixar chama (bico de bnsen) Colorao de Gram utilizando o aparelho Previ-color Gram Colocar os esfregaospreviamente fixadosno aparelho e esperar que este complete o ciclo de colorao. Colorao de Ziehl-Neelsen Cobrir a lmina com soluo de Fucsina e aquecer, passando uma chama no lado oposto da lmina, at emisso de vapores; Deixar actuar o corante durante 15minutos; Lavar a lmina com gua corrente; Cobrir novamente a lmina, mas agora com lcool-cidoLavar a lmina com gua corrente; Corar com azul de metileno durante 20 segundos; Lavar com gua corrente e esperar que seque. Observar ao microscpio ptico. 2.2.2Trabalho 2: Uroculturas Aps a recepo das amostras de urina so efectuados os seguintes procedimentos: Figura 2. 1 Fluxograma com procedimento efectuado em urinas Exame a fresco e ps-colorao Sementeira e incubao Validao da amostra Identificao do agente isolado Execuo do Antibiograma Leitura e interpretao do Antibiograma Validao e emisso do resultado 27 O exame a fresco, a colorao de Gram, a sementeira e incubao so realizados tal como descrito na primeira parte do estudo. Para validao da amostra temos em conta a avaliao a fresco, a colorao de Gram, a presena de culturas puras e o nmero de ufc/ml. Paraidentificaodomicrorganismoisolado,sorealizadosvriostestes/provas,quejuntamente comoutrosdados(ex:crescimentoemdeterminado meiodecultura), vopermitira identificaodo microrganismo. Prova da Urease Transferirumaporodocrescimentobacteriano,paraummeio contendo ureia e um indicador de pH (vermelho de fenol); Incubao a 36C 1 por 18 a 24 horas. Resultado positivo: alterao da cor do meio (amarelo) para rosa; Resultado negativo: ausncia de alterao de cor. Prova do Indol Utilizar o tubo que contem o resultado da prova da urease;Colocar uma gota de reagente kovacs; Resultadopositivo: Quando se forma anel rosa superfcie do meio Resultadonegativo:Quandoseformaaneldequalqueroutra tonalidade. Prova da OxidaseRetirar do meio, uma colnia com a ajuda de uma ansa descartvel; Espalharacolniasobreodiscoimpregnadoquejcontmo reagente de oxidao (BD Dryslide Oxidase- slidex) Resultado positivo: aparecimento em 20 segundos de uma colorao que vai de violeta a prpura; Resultado negativo: reaces tardias, ou a ausncia de cor, indicam um teste negativo. Prova da Catalase Depositar uma gota de perxido de hidrognio (H2O2) numa lmina de vidro; Colocar uma colnia sobre esta gota; Resultado positivo: quando h efervescncia devido libertao de oxignio; Resultado negativo: no h efervescncia. 28 Prova da Coagulase Dispensarumagotadereagentepatorex:staph-plus(vermelho),numdos crculos da placa de reaco (disponvel com o kit); Colocarumagotadereagentedecontrolopositivo(S.Aureus:ATCC 29213)noutro crculo; Adicionar 1-3 colnias em cada uma das gotas; Resultado positivo: formam-se partculas vermelhas isoladas (agregao) Resultado negativo: no se formam as partculas. Hidrlise de Esculina Utilizar uma ansa de plstico para colocar uma poro de colnias no meio; semear em quadrantes Resultado positivo: o meio apresenta uma tonalidade escura; Resultado negativo: o meio no altera a sua cor. Teste de CAMPColocar no centro da placa de gar de sangue (horizontalmente) uma estria de -hemolisina produzidaporS.aureuscomercial(Controlopositivo:S.aureus ATCC 29213)InocularperpendicularmenteaoS.aureusoestreptococoatestar, tendo o cuidado para no intersetar com o S.aureus Incubar em aerobiose 36C 1, durante 18-24 horas Resultadopositivo:quandoa-hemliseseapresentasobaforma de flecha; Resultado negativo: a -hemolise no apresenta esta forma. (Ver possveis resultados dos testes de identificao em apndice 12) Sistema automatizado oProcedimento utilizado em Cartas de identificao para Vitek2Encher tubos de vidro com 3ml de soluo tampo; Colocar uma colnia nesta soluo, com a ajuda de uma zaragatoa; Agitar no vortex; Observar a densidade da soluo que deve estar entre : 0,50 e 0,63 Mcf (Mcfarland) para Gram negativo e Gram positivo; 1,8 e 2,2 Mcfpara leveduras; 2,7 e 3,3 Mcf para Corynebacterium sp. Colocar no aparelho para que seja identificado o microrganismo. 29 Depois de identificado o microrganismo, pode ento proceder-se realizao do antibiograma. Este pode ser feito por dois metodos: atravs de sistema automatizado Vitek 2 compact, ou atravs do mtodo manual de Kirby-Baer. Sistema automatizado Pipetar 145l da soluo preparada para carta de identificao; Colocar a soluo pipetada em outro tubo que j continha 3ml de soluo tampo; Colocarcartadeidenfificaoemcontactocomestasoluo,atravsdeumtubode aspirao ligado carta;Colocar todo este conjunto no aparelho. Mtodo de Kirby-Baer: O meio de cultura e os discos de antimicrobianos devem ser armazenados no frio (2 a 8C) e retirados deste para arrefecer temperatura ambiente antes de serem usados; Seomeioapresentarexcessodehumidadenasuperfcie,asplacasdevemsercolocadas numa estufa (36C 1), at que o excesso de humidade evapore (normalmente entre10 a 30 minutos); Colhercolniaspuraseisoladas,comoauxiliodeumaansa,esuspenderemsoluo fisiolgica estril; Comparar a suspenso com a escala 0,5 de McFarland de turvao; Realizar inoculao no meio de cultura ( Meller-Hinton)Colocar os discos de antibitico com a ajuda de um dispensador, pressionandosuavemente contraomeio,demodoagarantirquepermaneam fixosnolocaldeaplicao.Depoisde colocados, os discos no devem ser removidos. As placas so incubadas por 16- 24 horas, em aerobiose, a 36C 1. Para o TSA de Staphylococcus spp., o disco da oxacilina e cefoxitina, devem ser incubados a temperaturas mais baixas, aproximadamente 30C. Aps o crescimento procede-se realizao da leitura e interpretao de antibiograma: Medio dos halos: efectuar a leitura por observao directa do halo de inibio (rea sem crescimento) e, com o auxlio de uma rgua, fazer a medio do dimetro. Comparar com o valores consenso de CLSI, para dar o resultado de Resistente/Intermdio ou Sensvel. Leituraeinterpretaodoantibiograma:teremcontaosdiferentesfentiposdas bactrias. Durante este procedimento verificar se a tcnica foi bem executada: Num inculo bem executado, os halos de inibio resultantes sero uniformemente circulares e haver um tapeteconfluentedecrescimento.Seseobservaremcolniasindividuais,oinculofoi demasiado leve e o teste dever ser repetido.No caso de crescimento evidente de colnias dentrodeumhalode inibio,deverser feitaarepetiodo teste.Seo crescimentodas colniaspersistir,devesermedidoohalodeinibiolivredecolnias.EmalgunsProteus 30 spp.pode-seorbservarumvudecrescimentodentrodohalodealgunsantibiticosque deve ser ignorado. importante o conhecimento dosmecanismos de resistncia, e ateno aosdiferentesfentiposderesistnciabacteriana(naturaleadquirida)deformaapermitir uma validao correcta dos resultados do antibiograma. Concludosestesprocessos,analisam-setodososseusresultadosemsimultneo,eseno levantarem qualquer suspeita de erro, a amostra validada e enviada para o clnico atravs de um sistema computadorizado. Resumindo os passos anteriormente descritos, os microrganismos isolados so identificados segundo os fluxogramas que se seguem: Figura 2. 2Fluxograma de Bacilos Gram negativo Bacilos Gram negativo Crescimento em gelose de Sangue e MacConkey Teste de Oxidase Negativo (sugere famlia de Enterobactereacea) Antibiograma Validao e emisso do resultado Positivo (sugere bacilo Gram negativo no fermentador ex:Pseudomonas spp.) Testes de identificao manuais (ex: Urease e Indol) e sistema automatizado 31 Figura 2. 3Fluxograma de cocos Gram positivo Figura 2. 4Fluxograma de bacilos Gram positivo Cocos Gram positivo Crescimento em gelose sangue(e gelose de CNA) Teste da Catalase Positivo (sugere Staphylococcus spp.) Antibiograma Validao e emisso do resultado Negativo (sugere Streptococcus spp. e Enterococcus spp.) Testes de identificao manuais (ex:Testede Camp, coagulase e Hidrlise de esculina) e sistema automatizado Bacilos Gram positivo Crescimento em gelose sangue (e gelose de CNA) Teste da Catalase Positivo (sugere Corynebacterium spp.) Antibiograma Validao e emisso do resultado Negativo Testes de identificao manuais (ex: Gram da cultura) e sistema automatizado 32 Esta pgina foi propositadamente deixada em branco 33 Urina 34% Sangue 25% Vias Respiratrias 19% Aparelho reprodutor 8% Fezes 7% Ex.cutneo 3% Lquidos 3% Exsudado ocular 1% Urina 36% Sangue 25% Vias respiratrias 15% Aparelho reprodutor 7% Fezes 7% Exsudado cutneo 5% Lquidos 4% Ex.ocular 1% 3.Resultados e Discusso 3.1 Trabalho 1: Estudo estatstico das vrias amostras biolgicas Duranteoestgiodeseismesesrealizadonolaboratriodemicrobiologia(outubro2011-maro 2012),foramanalisados9092produtosbiolgicos.Umavaliaoestatsticadetodososprodutos, permitiu conclur acerca do produto mais frequentemente analisado neste laboratrio. Tabela 3. 1 Produtos biolgicos analisados durante o perodo de estgio (outubro 2011- maro 2012) Produtototal Urina3294 Sangue2288 Amostras das Vias respiratrias 1405 Amostras do Aparelho reprodutor 668 Fezes614 Exsudado cutneo425 Lquidos corporais345 Exsudado ocular53 TOTAL9092 Tabela3.2Produtosbiolgicosanalisados de janeiro a junho de 2011Produtototal Urina3409 Sangue2478 Amostras das Vias respiratrias1883 Amostras do Aparelho reprodutor756 Fezes656 Exsudado cutneo340 Lquidos corporais270 Exsudado ocular60 TOTAL9852 Grfico 3. 1 Percentagens de produtos biolgicos analisados durante o perodo de estgio Grfico 3. 2Percentagens de produtos biolgicos analisados de janeiro a junho de2011 34 Observandoosdadosanteriores(grfico3.1etabela3.1), verifica-sequeoprodutobiolgicomais analisado durante o perodo de estgio foi a urina com 36% (n=3294). Este resultado est de acordo comaliteratura,poisasinfecesurinriasencontram-seentreasquemaislevamospacientesa consultasmdicas.Estima-sequecercade10%dossereshumanossofremumainfecourinria emalgumaalturadasuavida(Forbes&Sahm,2004)(Camargo&etal,2001)(Sahm,Forbes,& Weissfeld, 2007). De janeiro a junho de 2011 foram analisados 9852 produtos biolgicos, e foi verificado mais um dado a favor de que as urinas so realmente o produto mais analisado. Tambmosanguefoiumaamostraanalisadacomalgumafrequncia(25%),sendoosegundo examemaisfrequentenesteestudo.Ainvasomicrobianadacorrentesanguneapodetergraves consequncias,comochoque,insuficinciademltiplosorgos,coagulaointravascularemorte. Isto d-nos a indicao de que a invaso da corrente sangunea uma das infeces mais graves, e por conseguinte, a rpida deteco e identificao dos patognios transportados pelo sangue uma das funes do laboratrio de microbiologia (Forbes & Sahm, 2004). As amostras provenientes das vias respiratrias tambm foram analisadas com alguma regularidade (15%),oquecorroboraoutrostrabalhosdescritos.Segundoosmesmos,estesprodutosso analisados com bastante frequncia, mas ainda assim, menos que as urinas e o sangue (Jorgetto & et al, 2005). Osprodutosprovenientesdoaparelhoreprodutorforamunicamentedosexofemininoe corresponderam a 7% dos analisados. O exsudado vaginal foi o mais requisitado, poistrata-se de um exameimportantenodiagnsticopr-natalparadespistedemulheresportadorasdeS.agalactiae (estreptococosdo grupo B de Lancefield), no 3 trimestre da gravidez, como preveno da infeco neonatal. Asdoenasdiarreicasso,portodoomundo,umaimportantecausademorte,especialmenteem crianas com idade inferior a 5 anos (Forbes & Sahm, 2004). Asfezesconstituem7%dasamostrasanalisadas,semelhanadoqueseverificouparaas amostrasprovenientesdoaparelhoreprodutor.Destaforma,estetipodeamostrasurgecomoo quinto produto mais analisado. OutrosProdutosbiolgicosrelacionadoscomoexsudadocutneo,exsudadoocularelquidos corporais,somenosfrequentes,apresentandoporissoumamenoraflunciadeanliseneste laboratrio. Finalmente,analisandootabela3.1emsimultneocomotabela3.2,observa-sequeaordemdos produtos analisados se mantem inaltervel, independentemente da altura do ano em estudo. 35 Negativos 64% Positivos 36% Feminino 68% Masculino 32% 3.2 Trabalho 2: Uroculturas Duranteumperododetrsmeses(de1janeirode2012a31marode2012),foramanalisadas 1408amostrasdeurinaprovinientesdepacientesdosexofemininoemasculino,quese apresentaramnosdiferentesservioshospitalares.Destaanlise,36%(n=500)apresentaram resultado positivo (uroculturas positivas). Opredomniodasuroculturaspositivasocorreunosexo femininocom68%doscasos(grfico3.4), assemelhando-seassimavriostrabalhosjdescritos(Muller&etal,2008)(Kazmirczak&etal., 2005) (Menin & et al., 2010). Tabela 3. 4Resultados positivos consoante o sexo. SexoResultados Feminino341 Masculino159 total500 Este predomnio pode ser explicado pelo facto das mulheres serem mais susceptveis a este tipo de infeco, devido estrutura anatmica do aparelho urinrio (uretra curta e proximidade com o nus).O factodenoshomensaincidnciasermenor(32%),podeserexplicadopelomaiorcomprimento uretral, maior fluxo urinrio e pela presena de antibacteriano prosttico (Muller & et al, 2008). Alm desta diferena entre sexos, foi tambm verificada uma diferente distribuio por grupo etrio. Tabela 3. 3Resultados positivos e negativos UrinasResultados Negativos908 Positivos500 total1408 Grfico 3. 3Percentagens de resultados positivos e negativos Grfico 3. 4 Percentagens de resultados positivos consoante o sexo 36 12 6 00 2 11 71 57 1 2-10 11-20 21-30 31-40 41-60 61-80 81Quantidade de Uroculturas positivas Grupoetrio(anos) Masculino 10 32 1920 28 44 105 83 1 2-10 11-20 21-30 31-40 41-60 61-80 81Quantidade de uroculturas positivas Grupoetrio(anos) Feminino Tabela 3. 5Percentagens de uroculturas positivas no sexo masculino por grupo etrio. Grupo etrioPercentagens1 2,4 2-10 1,2 11-20 0,0 21-30 0,0 31-40 0,4 41-60 2,2 61-80 14,2 81 11,4 Total32 Atravsdaobservaodosvaloresanteriores(Grfico3.5eTabela3.5),verifica-sequepara crianas com idade inferior a 1 ano, o resultado de uroculturas positivas no sexo masculino foi 2,4% (n=12), e que h medida que a idade da criana aumentou (2-10anos), ocorreu uma diminuio para 1,2% (n=6). Entre os 11 e os 30 anos no se obtiveram uroculturas positivas, voltando estas a surgir a partir dos 31 anos. Tabela3.6Percentagensdeuroculturas positivasnosexofemininoporgrupo etrio Grupo etrioPercentagens1 2,0 2-10 6,4 11-20 3,8 21-30 4,0 31-40 5,6 41-60 8,8 61-80 21,0 81 16,6 Total68 Nosvaloresapresentadosnogrfico3.6etabel