Lucas Lima Zanin

Maybi Daminhani

• “A cromatografia é uma técnica usada para a separação dos

componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas

fases, uma estacionaria e a outra móvel. A fase estacionaria

pode ser um sólido, um liquido retido sobre um sólido ou um

gel. A fase móvel pode ser líquida ou gasosa.” (IUPAC)

• Essa técnica se destaca devido sua praticidade em realizar a

separação, identificação e quantificação das espécies químicas.

2

• Passagem da fase móvel sobre a fase estacionária:

componentes seletivamente retidos na fase

estacionária.

• A separação depende da interação dos componentes

da mistura com a fase móvel e com a fase

estacionária.

• Diferentes velocidades ao passarem pela fase

estacionária.

3

• Processo cromatográfico comparado a um grupo de abelhas e

moscas sobrevoando certa região.

• Ao passarem por uma flor, espera-se que:

4

Fase estacionária Analito

5

• Para mesma mistura simples, a troca de fase estacionária

pode ser suficiente para alterar a ordem de eluição de

componentes da mistura.

Fase estacionária Analito

• O nome deriva das palavras gregas “chrom” (cor) e

“graphe” (escrever), embora o processo não dependa da

cor, exceto para facilitar a identificação dos componentes

separados.

6 http://artn.highforum.net/t858p30-2-atividade-abstracionismo-rauschenberg

• Foi criada pelo botânico russo Mikhail S. Tswett no

inicio do século XX.

7

Mikhail Semenovich Tswett (1872 – 1919)

http://cromatografialiqui

da.com.br/claetswett.htm

• Seu primeiro trabalho de cromatografia foi em 1903 pela

Sociedade de Cientistas Naturais de Varsóvia, no qual

estudava pigmentos de folhas extraído de plantas.

• Em seu livro, Tswett justificou a separação da seguinte

maneira:

8

"Uma vez que as diferentes substâncias

apresentarem diferentes constantes, irão

consequentemente, mover-se com diferentes

velocidades de deslocamento ao longo do fluxo

e assim, serão separadas como zonas de

adsorção independentes."

9

10

M. Valcárcel Cases, A.Gomez Hens. Técnicas analíticas de separación, Reverte, Paris, 1988, 800p

• As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando os seguintes critérios:

- Forma física do sistema cromatográfico (Cromatografia em Coluna e Cromatografia Planar);

- Fase móvel empregada (Cromatografia Gasosa, Cromatografia

Líquida, Cromatografia Supercrítica);

- Fase estacionária utilizada (Sólidas, Líquidas e Quimicamente Ligadas);

- Modo de separação (adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou

misturas desses mecanismos).

11

Cromatografia

Planar Líquido

Fase Ligada

CCD

Sólido CCD

Líquido CP

Em coluna

Gás

Líquido CGL

Sólido CGS

Fase Ligada CGFL

Fluído Supercrítico

Líquido CSS

Sólido CSFL

Líquido

Líquido CLL

Sólido

CLS

CE

Fase Ligada

CLFL

CTI

CB

12

Tipos de Cromatografia

• Consiste na separação dos componentes de uma mistura sólido-líquido onde a fase móvel (líquida) migra sobre uma camada delgada de adsorvente retido em uma superfície plana (fase estacionária - sólida).

• O processo de separação está fundamentado, principalmente no fenômeno de adsorção.

• Vantagens: • Facilidade na execução

• Versatilidade

• Baixo custo

13

14

Absorção Adsorção

• Na adsorção as moléculas do analito unem-se à superfície

do adsorvente (fase estacionária - sólida). As forças que

unem a molécula à superfície são as interações

moleculares.

• Sequência das intensidades de interações:

15

Ligação de Hidrogênio > Dipolo – Dipolo > Forças de London

16

Moléculas

Polares

Dipolo-Dipolo:

Moléculas polares que

não apresentam H

ligados a F, O ou N.

Ligação de

Hidrogênio:

H ligado a

F, O ou N.

17

Moléculas Apolares FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON

Afastadas = Não

existe atração

Aproximação = Indução

Atração

• Sílica (SiO2): é o adsorvente mais utilizado em CCD.

18

• É empregada na

separação de compostos

lipofílicos como aldeídos,

alcalóides, terpenóides e

esteróides, usando o

mecanismo de adsorção.

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-

40422005000300030&script=sci_arttext

• Alumina (Al2O3): A alumina é geralmente empregada na

separação de compostos lipofílicos e, pelo fato de poder

ser preparada com características ácida, neutra e

alcalina, é bastante útil na separação de substâncias que

apresentam variações dessas características.

19

http://www.cempeqc.iq.unesp.br/Jose_Eduardo/Cromatografia%20em%20Camada%20Delgada.pdf

• Trata-se da porção do sistema, geralmente contendo uma

substância polar ou apolar, catiônica ou aniônica, podendo ser

um sólido puro ou um gel.

• Na prática, a fase estacionária será a sílica.

20 Autoria: J. Cavalheiro, Alberto – Métodos Analíticos de Separação – Aula 3 - CCD

21

http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422005000300030&script=sci_arttext

• Eliminar impurezas (substâncias aderidas, água)

• 110°C na estufa por 10 minutos.

• A fase móvel é o solvente ou uma mistura de solventes que é

usada para eluir uma mistura e promover a separação dos seus

componentes.

22

23 http://www3.uma.pt/jcmarques/docs/qaii/QAII03TLC2007JCM.pdf

• Mostrar que dois compostos são idênticos.

• Determinar o número de componentes em uma mistura.

• Verificar a eficiência de uma separação.

• Monitorar o andamento de uma reação.

24

25

Riscos

Amostra

Placa • Riscar as placas

• Determinar a altura que irá

iniciar a cromatografia.

• Dissolver a amostra em um solvente volátil, a

evaporação do solvente ajuda a manter as manchas

formadas menores, facilitando a separação.

• É importante ressaltar que a solução não deve

ser muito diluída, pois exige um grande volume

de amostra, aumentando assim as manchas na placa.

26

• Para a aplicação da amostra na placa, utiliza-se micropipetas, micro seringas, tubos capilares de vidro ou aplicadores automáticos.

• As manchas devem ser aplicadas 1,5 a 2,0 cm acima da borda inferior e devem ficar no mínimo 1cm da superfície do eluente na cuba;

• As microgotas deverão ser aplicadas no centro das faixas riscadas na placa.

27

Capilar com a amostra

Ponto de Aplicação

• O nível do solvente colocado na cuba deverá ficar abaixo dos pontos de aplicação das amostras.

• Papel de filtro: utilizado para facilitar a saturação da cuba, que é indispensável para boa migração das substâncias.

• Durante ascensão do solvente, deixar cuba fechada para que a atmosfera esteja saturada pelo vapor do solvente, isso é importante pois se aberto o sistema o solvente irá se evaporar para saturar a atmosfera e equilibrar o sistema liquido-gasoso, podendo produzir variações nos resultados.

28

A CUBA

29

• http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cr

omatografia_FINAL/cromatografia.swf

• http://www.lapeq.fe.usp.br/labdig/animacoes/papel

_ani.php

30

• Em alguns casos de separação cromatográficas, os

compostos são incolores.

• Para revelá-los, três métodos existentes são

utilizados: físicos, químicos, biológicos e enzimáticos.

31

• Físicos:

• Luz ultravioleta

• Adsorventes impregnados com reagentes fluorescentes

• Biológicos e enzimáticos:

• Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para

tornar a mancha visível.

• Tipos de reveladores biológicos:

• Antibióticos

• Enzimas

• Substratos

32

• Químicos:

• Consiste em utilizar reveladores químicos que, em ao

reagir com as substâncias da amostra, as tornam

coloridas e visíveis.

• Alguns tipos de reveladores químicos:

• Revelador universal: vapores de iodo

• Compostos fenólicos: FeCl3

• Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico

33

• Vapores de Iodo: iodo reage com compostos

orgânicos para formar complexos amarelados ou

castanhos

• Pontos amarronzados (temporários).

34 Foto obtida da prática realizada na disciplina Química Orgânica Experimental – Licenciatura 2013

• Raio UV: substâncias fluorescentes misturadas à sílica

durante a preparação das placas, possibilitando a

revelação dos compostos em câmaras de luz

ultravioleta. A SÍLICAGEL 60 PF254 já contém a

substância fluorescente de fábrica.

35

Foto obtida da prática realizada na disciplina Química Orgânica Experimental – Licenciatura 2013

• Sob condições bem estabelecidas, um dado composto

sempre percorre uma distância fixa em relação à

distância percorrida pelo solvente.

36

AMOSTRA

D d 10,0 cm

7,3 cm

3,6 cm

0,8 cm

Rf = d/D 1,00

0,00 (ORIGEM)

0,73

0,36

0,08

Rf = fator de retenção

D = distância percorrida pela FM

d = distância percorrida pela mancha

Origem = ponto de aplicação da

amostra

Autoria: J. Cavalheiro, Alberto – Métodos

Analíticos de Separação – Aula 3 - CCD

• Nas mesmas condições experimentais – Rf é uma

constante para um dado composto.

• Usado para auxiliar na identificação de uma

substância.

• Muitos compostos têm o mesmo Rf, assim como

diferentes compostos tem p.f. iguais.

• Melhor resolução cromatográfica 0,2 > Rf > 0,8.

37

38

Substância Etanol Ácido acético

Densidade (g/mL) 0,789 1,049

Ponto de Fusão (ºC) -114,1 16,7

Ponto de Ebulição (ºC) 78,37

118

Toxicidade Causa náusea, vômito e

depressão

Se ingerido causa vômito,

diarreia e colapso circulatório

Primeiros

Socorros

Olhos e Pele: Lavar com água em abundância. Inalação:

Exposição ao ar fresco. Ingestão : Não induzir vômito.

Diagrama de Hommel

Estrutura Molecular

39

Substância Diclorometano 1,2-dicloroetano

Densidade (g/mL) 1,326 1,257

Ponto de Fusão (ºC) -25 -40

Ponto de Ebulição (ºC) 39,75 83-84

Toxicidade

Causa fadiga, náusea,

irritação nos olhos e na

cabeça.

Depressão do sistema nervoso

central

Primeiros

Socorros

Olhos e Pele: Lavar com água em abundância. Inalação:

Exposição ao ar fresco. Ingestão : Atenção em caso de vômitos,

beber muita água

Diagrama de Hommel

Estrutura Molecular

40

Substância Metanol Acetato de Etila

Densidade (g/mL) 0,7866

0,902

Ponto de Fusão (ºC) -97,8 -83

Ponto de Ebulição (ºC) - 77

Toxicidade

Dermatite, dor de cabeça,

náusea, vômitos, anorexia.

Irritação nos olhos, pele, nariz

e garganta

Primeiros

Socorros

Olhos e Pele: Lavar com água em abundância. Inalação:

Exposição ao ar fresco. Ingestão : Não induzir o vômito.

Diagrama de Hommel

Estrutura Molecular

41

Substância Cafeína Ácido

Acetilsalicílico Acetaminofenol

Densidade

(g/mL)

1,23

- 1,293

Ponto de Fusão

(ºC) 238 152 170,5

Ponto de

Ebulição

(ºC)

-

- -

Toxicidade

Estimulante do

sistema nervoso

central

[Antitérmico] [Antitérmico]

Estrutura

Molecular

• Recipientes adequados e devidamente rotulados.

• Posterior descarte por empresa especializada.

42

43

• http://www.cempeqc.iq.unesp.br/Jose_Eduardo/Blog2013/Apostila%20QOEXP%20LIC%202009-2.pdf– acessada em 19/11/2013.

• PAVIA, D.L.; LAMPMAN, G.M.; KRIZ, G.S.; ENGEL, R.G.. Química Orgânica Experimental: Técnicas de pequena escala. Editora Bookman, São Paulo, 2009. 880p

• Seminário CCD, Química Orgânica Experimental 2012. Lívia Saraiva, Nicole Pedroso.

• Cavalheiro, A.J. – Métodos Analíticos de Separação – Aula 3 - CCD

44

Solução de 1,2-dicloroetano e ácido acético

12:1

Transferir a solução para uma

cuba cromatográfica (béquer)

até atingir 1,5 cm de altura

(Aproximadamente 5,0 mL)

Colocar uma folha de papel de

filtro da altura da cuba, tampa-

la e deixar saturar até que

toda a folha esteja umedecida

com a fase móvel

Triturar o comprimido

5,0 mL de etanol e

Dicloroetano (1:1)

Aplicar as 4 soluções (uma em cada coluna e no mínimo 1 cm acima da

superfície do solvente) na placa ativada

Riscar a placa (sentido

longitudinal) em 4

colunas deixando 2 cm

em cada extremidade

Cuba Saturada

Cromatograma

0,1g de cafeína 0,1g de ácido acetilsalicílico 0,1g de p-acetoaminofenol 1 comprimido (amostra)

4 tubos de ensaio (1 para cada

padrão e amostra)

3 soluções padrão e amostra

Placa Aplicada

Placa de Vidro com Sílica

Placa Riscada

Placa Ativada

Revelar com UV

Fluxograma – Cromatografia em Camada Delgada

Colocar a placa aplicada na cuba

(rapidamente para evitar evaporação) e

aguardar a fase móvel atingir o limite

traçado (O limite deverá ser traçado somente

quando o solvente atingir a altura desejada

...

1ª Etapa 2ª Etapa

3ª Etapa

Poderá ser feita uma placa com aplicação dos

3 padrões a da mistura dos padrões (para

verificar efeito de matriz no cromatograma)

...

Revelar em uma

cuba com vapores

de Iodo

Cromatograma Revelado

Cálculo dos Rf

Delinear as manchas

para calcular os Rf se a

fonte de UV for portátil.

Delinear as manchas em

capela para calcular os Rf

Indicação dos

componentes do

comprimido

analisado