LUCILENE OLLIVIER DE OLIVEIRA - UENF - Universidade ... · ... tudo mesmo...obrigada pela...

UMA VISÃO INTEGRADA DOS EVENTOS PROTEOLÍTICOS DE

SEMENTES DE VIGNA UNGUICULATA AO LONGO DOS

PROCESSOS GERMINATIVOS E PÓS-GERMINATIVOS COM

ÊNFASE EM PROTEINASES CISTEÍNICAS

LUCILENE OLLIVIER DE OLIVEIRA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

FEVEREIRO - 2010

II

UMA VISÃO INTEGRADA DOS EVENTOS PROTEOLÍTICOS DE

SEMENTES DE Vigna unguiculata AO LONGO DOS PROCESSOS

GERMINATIVOS E PÓS-GERMINATIVOS COM ÊNFASE EM

PROTEINASES CISTEÍNICAS

LUCILENE OLLIVIER DE OLIVEIRA

Dissertação apresentada ao Centro

de Biociências e Biotecnologia da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, como

parte dos requisitos para obtenção

do título de Mestre em Biociências e

Biotecnologia, com ênfase em

Biologia Celular.

ORIENTADORA: PROF.ª DRª. KÁTIA VALEVSKI SALES FERNANDES

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ

FEVEREIRO - 2010

IV

Este projeto foi desenvolvido no laboratório de Química e Função de

Proteínas e Peptídeos – LQFPP, do Centro de Biociências e Biotecnologia – CBB,

na Universidade Estadual do Norte Fluminense - Darcy Ribeiro – UENF, sob

orientação da pesquisadora Kátia Valevski Sales Fernandes.

Apoio financeiro: FAPERJ e CNPq

V

Dedico, ao meu filho Rafael: Sua

chegada me deu forças para lutar por

meus sonhos, pela vida e alcançar

meus objetivos.

VI

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por me dar forças e oferecer a serenidade necessária para

aceitar as coisas que eu não podia modificar; coragem para modificar aquelas que

eu podia e sabedoria para distinguir uma da outra.

À Professora Kátia Valevski Sales Fernandes, pela dedicada orientação, grande

amizade, estímulo, confiança e muita paciência. Você é uma pessoa maravilhosa.

Admiro-te!! Obrigada por todos os ensinamentos ao longo destes anos.

Agradeço à professora Antônia Elenir Amâncio Oliveira por ter aceitado participar da

revisão desta dissertação.

Agradeço aos professores Jorge Hernadez Fernandez, Cristiane Martins Cardoso de

Salles e Beatriz dos Santos Ferreira, por aceitarem fazer parte dessa banca

examinadora e por todas as contribuições que vierem a oferecer.

Aos professores Cláudio Andrés Retamal e Maura Da Cunha pela valiosa

contribuição nos experimentos, nos ensinamentos, amizade e pelas colaborações ao

nosso trabalho.

À grande amiga Nathália Bastos, pela amizade, carinho, preocupação e por toda

ajuda constante concedida durante todos esses anos no laboratório. Gosto muito de

você e te admiro muito.

Ao Márcio por sua ajuda constante, pelos ensinamentos concedidos; e é claro as

brincadeiras no laboratório que tornam nossos dias mais engraçados e mais

alegres!!!! Muito obrigada.

Ao Fábio Maciel que com muita paciência me ensinou muita coisa no laboratório.

Saudades!!!

Agradeço de maneira especial aos meus colegas de laboratório Elane, Simone,

Keysson, Evenilton, Gustavo, Nádia, Amanda, Hélio, Nathália Deus, Flávia e os

demais, por tornar tão agradável a convivência durante tantos dias de trabalho.

VII

Ao técnico do LBCT, Arthur Rodrigues, pela ajuda e auxílio no preparo de soluções e

pela amizade.

À minha mãe Lúcia por ser uma verdadeira guerreira e exemplo de mãe e amiga! É

por você que tenho batalhado na vida, pois você sempre me instruiu e me ensinou o

caminho certo para vencer na vida. Te amo muito!!! Você é uma grande heroína!!!!

Que Deus lhe abençõe!!!

À minha Avó Sebastiana que sempre me deu força, me ensinou acima de tudo a

respeitar as pessoas, me ensinou tantas coisas que não caberiam aqui...Vó,

obrigada por tudo, tudo mesmo...obrigada pela confiança em mim depositada e pela

amizade. Te amo muito...

Agradeço ao meu marido Carlos Alberto Laczynski Júnior por todo carinho,

paciência, compreensão e pela força nas horas difíceis. Você é muito mais que

especial para mim. Te amo muito.

Agradeço a minha nova família Carlos, Maria Amélia, Gabriela e Rafaela, que me

acolheram de braços abertos e me tratam como se fosse da família, sempre me

respeitando e me ajudando em tudo o que preciso. Essa conquista também é de

vocês. Obrigada pelo apoio, carinho, ajuda e por todo amor...Amo muito vocês..

E a todos que de alguma forma contribuíram para o meu trabalho e que infelizmente

não conseguiria listar a todos, muito obrigada.

VIII

SUMÁRIO

RESUMO................................................................................................................XVIII

ABSTRACT..............................................................................................................XIV

1- INTRODUÇÃO.........................................................................................................2 1.1 - Importância das sementes...................................................................................2

1.2- Germinação...........................................................................................................2

1.2.1- Eventos pós-germinativos..................................................................................5

1.2.2- Proteólise em sementes.....................................................................................6

1.3- Proteínas de reserva sementes..........................................................................11

1.3.1- As globulinas....................................................................................................12

1.4- Corpos protéicos.................................................................................................13

1.5- Feijão-de-corda - Vigna unguiculata (L. Walp)....................................................14

1.5.1- Proteólise em semente de Vigna unguiculata..................................................17

2- OBJETIVO GERAL................................................................................................19

2.1- Objetivos específicos..........................................................................................19

3- MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................20 3.1- Sementes............................................................................................................20

3.2- Germinação e desenvolvimento pós-germinativo...............................................20

3.3- Extração de proteínas.........................................................................................20

3.4- Isolamento de corpos protéicos..........................................................................21

3.5- Determinação da concentração de proteínas.....................................................21

3.6- Visualização dos perfis protéicos por eletroforese em gel de poliacrilamida.....21

3.7- Western blotting para detecção de vicilinas........................................................22

3.8- Detecção de atividade enzimática em gel...........................................................23

3.9- Ação de inibidores sobre as atividades proteolíticas em gel...............................23

3.10- Análise bidimensional nativo / SDS-PAGE e nativo / gelatina-PAGE de

proteínas e proteinases cisteínicas de cotilédones quiescentes e germinates 108

HAE de feijão-de-corda..............................................................................................24

3.11- Determinação do grau de anomalia das proteases na migração eletroforética e

determinação das massas moleculares das proteases.............................................25

3.12- Análise densitométrica......................................................................................26

4- RESULTADOS.......................................................................................................27

IX

4.1- Análise do perfil eletroforético e Western blotting da fração globulínica do tecido

cotiledonário ao longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de

feijão-de-corda............................................................................................................27

4.2- Análise do perfil eletroforético da fração albumínica do tecido cotiledonário ao

longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de feijão-de-

corda...........................................................................................................................27

4.3- Análise do perfil eletroforético e Western blotting de proteínas de corpos

protéicos e proteínas citoplasmáticas ao longo do processo germinativo e pós-

germinativo das sementes de feijão-de-corda............................................................30

4.4- Detecção de atividade gelatinolítica e ação de inibidores sobre as atividades

proteásicas ao longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de

feijão-de-corda............................................................................................................33

4.5- Detecção de atividade proteásica ao longo do processo germinativo e pós-

germinativo das sementes de feijão-de-corda na ausência e presença de agente

redutor........................................................................................................................37

4.6- Comparação da migração eletroforética de proteínas e atividades proteásicas

em géis bidimensionais SDS-PAGE/ SDS-PAGE e SDS-PAGE em presença de

gelatina 0,1% e determinação das massas moleculares de

proteases....................................................................................................................37

4.7- Análise do perfil eletroforético por géis bidimensionais das proteínas e proteases

do tecido cotiledonário de sementes de feijão-de-corda............................................38

4.8- Ensaio de termoestabilidade enzimática.............................................................43

5- DISCUSSÃO..........................................................................................................44

6- CONCLUSÃO........................................................................................................50

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................51

X

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1- Feijão-de-corda, (Vigna unguiculata): planta, flores e vagens...................16

Figura 2- Determinação das massas moleculares das proteases.............................28

Figura 3- Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% (a) e “Western blotting” para

detecção de vicilinas específicas (b) da fração globulínica extraída de cotilédones

das sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE.............................................28

Figura 4- Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração albumínica extraída

de cotilédones das sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE.....................29

Figura 5- Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração de corpos protéicos

extraída de cotilédones de sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE, na

presença (a) e ausência de agente (b) redutor (β-mercaptoetanol) e western blotting

(c) para detecção de vicilinas específicas..................................................................31

Figura 6- Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração de proteínas do

citosol extraídas de cotilédones de sementes de V. unguiculata ao longo de 144

HAE, na preseça de agente redutor (β-mercaptoetanol) (a) e Gelatina-PAGE

(b)...............................................................................................................................32

Figura 7- Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% contendo 0,1% de gelatina, da

fração albumínica extraída de cotilédones das sementes de V. unguiculata ao longo

de 120 HAE, na presença de diferentes inibidores de proteinases

cisteínicas...................................................................................................................34

Figura 8- Análise densitométrica de atividades proteinásicas de cotilédones

germinantes de V. unguiculata em função da mobilidade relativa (Rf) da principal

banda de atividade.....................................................................................................35

Figura 9- Análise densitométrica de atividades proteinásicas de cotilédones


banda de atividade.....................................................................................................36

Figura 10- Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração albumínica extraída

de cotilédones das sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE. (a)- Gelatina-

PAGE com β-mercaptoetanol. (b)- Gelatina-PAGE sem β-

mercaptoetanol...........................................................................................................39

Figura 11- Migração anômala de proteases: sobreposição de géis 2D desnaturantes

com e sem gelatina 0,1%. Imagens invertidas no Photo Impact das

imagens......................................................................................................................40

XI

Figura 12- Eletroforese bidimensional nativo/SDS-PAGE 12% (a) e nativo/SDS 12%

com gelatina 0,1% (b) da fração albumínica extraída de cotilédones (0 HAE semente

quiescente) das sementes de V. unguiculata.............................................................41

Figura 13- Eletroforese bidimensional nativo/SDS-PAGE 12% (a) e nativo/SDS 12%

com gelatina 0,1% (b) da fração albumínica extraída de cotilédones (108 HAE e 108

HAE incubado com PMSF (c)) das sementes de V. unguiculata...............................41

Figura 14- Sobreposição das imagens da eletroforese bidimensional nativo/SDS-

PAGE 12%.................................................................................................................42

Figura 15- Determinação da estabilidade enzimática por gelatina-PAGE em gel de

poliacrilamida 12% da fração albumínica extraída de cotilédones das sementes de V.

unguiculata em 108 HAE............................................................................................43

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1- Classificação botânica do feijão-de-corda, Vigna unguiculata...................16

XII

LISTA DE ABREVIATURAS

1D- Eletroforese unidimensional (primeira eletroforese)

2D- Eletroforese bidimensional (segunda eletroforese)

BSA- Albumina sérica bovina

DAB- Diaminobenzidina

DFP – Diisopropilfluorfosfato

DNA- Ácido Desoxirribonucléico

DTT- Ditiotreitol

E-64- L-trans-epoxi-succinil-L-leucilamido-4-guanidino-butano

EDTA- Ácido etileno diamino tetracético

FCP- Fração de corpos protéicos

FC- Fração citoplasmática

HAE- Horas após embebição

HCl- Ácido clorídrico

LEAs- “Late-embryogenesis abundant”

NaCl- Cloreto de sódio

PAGE- Eletroforese em gel de poliacrilamida

PBS- Tampão fosfato-salino

PMSF- Fenil metil sulfonil fluoreto

PVP- Polivinil pirrolidona

Rf- Mobilidade relativa

RNA- Ácido Ribonucléico

SBTI – inibidor de tripsina de soja

SDS- Dodecil sulfato de sódio

TPBS- Tampão fosfato-salino contendo Tween-20

VPEs- Enzimas processadas no vacúolo

XIII

RESUMO

Proteinases cisteínicas melhor caracterizadas são as que participam da

degradação de proteínas de reserva durante a germinação de sementes. No

presente trabalho nós observamos dois grupos de atividades de proteinases

cisteínicas, um grupo de alto peso molecular (45 a 97 kDa) e outro grupo com peso

molecular (15 a 29 kDa) que estão temporalmente ativas após 24 e 48 após

embebição (HAE), respectivamente, em cotilédones de feijão-de-corda em

germinantes. Os grupos anteriormente citados são encontrados ambos em corpos

protéicos e em frações citoplasmáticas, enquanto este último está presente

principalmente fora dos corpos protéicos. Uma terceira atividade de proteinase

cisteínica de aproximadamente 45 kDa está especificamente ativa em cotilédones

quiescentes, 12 e 60 horas após embebição (HAE). A mobilização das principais

proteínas de reserva, as vicilinas, foi mais notável a partir de 60 HAE em diante,

aumentando sua mobilização até 144 HAE, quando as pequenas subunidades de

vicilinas estavam em seus baixos níveis. Proteinases cisteínicas de cotilédones

germinantes foram geralmente susceptíveis a inibidores como iodoacetamida, E-64,

ácido iodoacético e pCMB exceto para proteinases de ~45 kDa, que não foram

afetadas por nenhuma concentração dos inibidores usados. β-mercaptoetanol

também reduziu em 50 % a atividade gelatinolítica das proteases. Por uma

combinação de eletroforese bidimensional (nativo / SDS-PAGE) foi observada uma

aparente disposição linear dos produtos de quebra, bem como das atividades de

proteinases. O resultado pode indicar um complexo de eventos proteolíticos

seqüenciais onde proteinases induzem ou ativam novas proteinases, que podem

atuar como diferentes agregados ou zimogênios, e estes produtos de hidrólise

aparecem em uma linha constante aumentando sua proporção Rf x Mr.

PALAVRAS CHAVES: Cotilédones, corpos protéicos, germinação, proteinases

cisteínicas, proteínas de reserva, vicilinas e Vigna unguiculata.

XIV

ABSTRACT

Cysteine proteinases are the best characterized proteases among those

involved with storage protein mobilization during seed germination. In the present

work we show two major groups of cysteine proteinase activities, one of higher (45

to 97 kDa) and other with lower (15 to 29 kDa) molecular masses which are

temporally activated after 24 and 48 HAI, respectively, in germinating cowpea

cotyledons. The former group is found both in protein bodies and in cytoplasmic

fraction, while the latter is mostly present outside protein bodies. A third cysteine

proteinase activity of ~45 kDa was specifically active at the quiescent cotyledons and

at 12 and 60 hours after imbibition (HAI). Major vicilin mobilization was more

pronounced from 60 HAI onwards and steadily increased until 144 HAI, when low

levels of the smallest vicilin subunits were present. Cysteine proteinases from

germinating cotyledons were generally susceptible to the iodoacetamide, E-64,

iodoacetic acid and pCMB inhibitors except for the ~45 kDa proteinase, which was

not affected by any of the inhibitors at the used concentrations. β-Mercaptoethanol

also reduced by 50 % the gelatinolytic activity of the proteases. By a two-dimensional

native / SDS-PAGE combination it was observed an apparent linear arrangement of

protein breakdown products as well as of proteinase activity spots. The finding may

indicate a complex set of sequential proteolytic events where proteinases induces or

activates new proteinases, which may act upon different aggregates or zymogens,

and these hydrolysis products appear in a line of constant increasing Rf x Mr ratio.

KEY WORDS: Cotyledons, protein bodies, germination, cysteine proteinases,

reserve proteins,vicilins and Vigna unguiculata.

2

1- INTRODUÇÃO 1.1- Importância das sementes

As sementes são muito importantes na vida das plantas superiores. O

sucesso no estabelecimento do novo indivíduo é fortemente determinado pelas

características fisiológicas das sementes, visto que estas são capazes de se

defenderem dos estresses causados pelo ambiente, além de possuírem todas as

reservas necessárias ao desenvolvimento da planta jovem (Bewley e Black, 1994).

As sementes também são importantes por sua utilização como alimento pelo

homem. Aproximadamente 70% da alimentação humana são provenientes de

sementes, principalmente dos cereais e leguminosas (Bewley e Black, 1994). O

constante crescimento das civilizações tornou de grande importância o aumento da

produção de alimentos ricos em proteínas de boa qualidade e baixos custos.

Constituintes como proteínas, lipídeos e carboidratos justificam a ampla utilização

das sementes como fonte alimentar de alta qualidade (Xavier-Filho,1993).

Em virtude do valor nutricional, as sementes foram, desde muito cedo,

selecionadas em função das características adequadas ao consumo pelo homem. O

conhecimento da composição química das sementes é, portanto, essencial por

várias razões: 1) as sementes constituem uma fonte de alimento para o homem e

para os animais; 2) elas são importantes fontes de matéria prima para a medicina e

farmacologia; 3) possuem anti-metabólitos adversos à nutrição humana e animal; 4)

contêm reservas alimentares e substâncias de crescimento que influenciam na

germinação, no vigor da planta jovem, assim como também, no seu uso industrial e

agronômico (Xavier-Filho,1993).

A figura abaixo esquematiza o ciclo de vida de uma angiosperma:

3

1.2- Germinação

A germinação de sementes é o processo que envolve eventos que são

iniciados com a embebição de água pela semente seca e termina com a elongação

do eixo embrionário. O sinal visível de que a germinação está completa é a

conseqüente saída da radícula do interior da semente. Eventos subseqüentes,

incluindo a mobilização de reservas estocadas, estão associados com o crescimento

e desenvolvimento da plântula (Bewley, 1997; Vidal e Vidal, 2000).

Este processo é dependente de fatores internos (tais como a dormência) e de

fatores ambientais incluindo água, temperatura e oxigênio (Alberts et al., 1997).

A absorção de água pela semente madura é dividida em três fases. A fase

inicial é caracterizada por uma rápida tomada de água (fase I), seguida por uma fase

de estabilização (fase II). Posteriormente, somente após a germinação estar

completa, ocorre uma nova fase de absorção de água (fase III). Sementes

dormentes não completam a germinação, conseqüentemente, estas não entram na

fase III (Bewley, 1997). O influxo de água nas células da semente seca durante a

fase I resulta em alterações estruturais temporais, particularmente nas membranas,

culminando em um imediato vazamento de solutos e de metabólitos de baixo peso

molecular. Dentro de pouco tempo após a re-hidratação, as membranas retomam a

sua configuração estável (Bewley, 1997).

Esquema 1: Esquema demonstrando a absorção de água pela semente em

função do tempo. Adaptado de Bewley e Black, (1994).

4

Após o início da embebição, a semente rapidamente reassume as suas

atividades metabólicas. As estruturas e enzimas necessárias para essa retomada

inicial de atividade já estão presentes na semente seca (Bewley, 1997). Uma das

primeiras mudanças após a embebição é a atividade respiratória, que pode ser

detectada em poucos minutos. Posteriormente, inicia-se a segunda fase, que é

caracterizada por um declínio nessa atividade até que a radícula penetre as

estruturas ao redor, quando ocorre um novo aumento da atividade respiratória

(Botha et al., 1992; Bewley e Black, 1994). A ativação da via glicolítica, da via das

pentoses fosfato, bem como a ativação das enzimas do ciclo de Krebs, ocorrem na

fase I de absorção de água (Nicolás e Aldasoro, 1979; Sato et al., 1988).

Sabe-se que tecidos de sementes quiescentes contêm mitocôndrias, e

embora estas organelas sejam pobremente diferenciadas como conseqüência da

maturação, elas contêm níveis suficientes de enzimas do ciclo de Krebs e oxidases

que fornecem uma quantidade adequada de ATP para suportar o metabolismo por

várias horas, após o início da embebição (Ehrenshaft e Brambi, 1990; Attucci et al.,

1991).

Durante a germinação há o aparecimento de dois padrões distintos de

desenvolvimento de mitocôndrias. Estes padrões, que são observados em

cotilédones, dependem das reservas estocadas na semente. Em sementes que

armazenam amido, o reparo e ativação de pró-plastídeos pré-existentes são

predominantes; no entanto, em sementes que armazenam óleos, há uma produção

de novas mitocôndrias (Morohashi e Bewley, 1980; Morohashi, 1986).

Estas observações implicam em uma coordenada regulação da expressão

dos genomas nucleares e mitocondriais em plantas, iniciada durante os primeiros

estágios da germinação (Bewley, 1997).

A emergência da radícula através das estruturas ao redor do embrião é o

evento que termina a germinação e marca o início do desenvolvimento da nova

plântula. Esta emergência, resultante do alongamento de tecidos radiculares, pode

ou não ser acompanhada por divisões celulares. Três possíveis mecanismos para o

início do crescimento da radícula são considerados. A primeira possibilidade é que,

durante a germinação, o potencial osmótico das células da radícula torna-se mais

negativo devido ao acúmulo de solutos, talvez como resultado da hidrólise de

reservas poliméricas presentes dentro das células da radícula. A diminuição do

potencial osmótico leva ao aumento da tomada de água, e resulta no aumento do

5

turgor, levando a extensão celular. No entanto, não há evidências consistentes para

esta mudança no potencial osmótico durante a germinação (Welbaum e Bradford,

1990; Bradford, 1995). A segunda possibilidade é que a extensibilidade da parede

celular da radícula permita o seu crescimento. No entanto, o mecanismo pelo qual

as células da radícula iniciam a sua extensibilidade diferencial ainda não é

conhecido. O afrouxamento da parede celular poderia resultar da clivagem e

rearranjo de moléculas de xiloglucanos, que amarram as microfibrilas de celulose

adjacentes (Wu et al., 1994). Um mecanismo alternativo para o afrouxamento da

parece celular seria através da ação de proteínas chamadas de expansinas, que

têm habilidade para romper pontes de hidrogênio entre polímeros da parede celular.

Expansinas têm sido fortemente implicadas na expansão de hipocótilos de pepinos

(McQueen-Mason e Cosgrove, 1995).

A terceira possibilidade é o enfraquecimento dos tecidos da extremidade ao

redor da radícula. O declínio da resistência é provavelmente devido à ação de

enzimas do tipo hidrolases, tais como hemicelulases, produzidas e secretadas pelo

endosperma adjacente (Bewley, 1997).

O alimento para a plântula crescer e desenvolver-se na primeira fase da

germinação é retirado das reservas contidas na própria semente. Esgotadas as

reservas alimentares da semente, a plântula, nesta fase, já possui pêlos radiculares

e parênquima clorofiliano nas folhas, de tal modo que já pode retirar do solo, água e

minerais, e fotossintetizar matérias orgânicas (Vidal e Vidal, 2000).

Existem dois tipos de germinação: a epígea e a hipógea. A germinação

epígea ocorre quando os cotilédones saem da semente e se elevam acima do solo,

como por exemplo, em feijão e mamona. Enquanto a germinação hipógea ocorre

quando os cotilédones permanecem sob a terra; como exemplos, estão o milho e a

ervilha (Vidal e Vidal, 2000).

1.2.1- Eventos pós-germinativos

A síntese de DNA, RNA e proteínas pode ocorrer em sementes com um

conteúdo de água de aproximadamente 50%. As primeiras atividades de sementes

sob embebição são associadas ao reparo dos danos acumulados durante a

secagem e período de armazenamento das sementes, como o reparo do DNA. A

formação de polissomos, a partir de ribossomos livres, também acontece cedo

durante a embebição, de modo a criar o maquinário para a tradução de RNAs

6

mensageiros (mRNAs) em proteínas (Bewley e Black, 1994). A síntese de proteínas

é iniciada usando, em primeiro lugar, os mRNAs preexistentes acumulados durante

o desenvolvimento e a maturação das sementes; posteriormente, a síntese depende

de novos mRNAs, recentemente sintetizados durante a embebição (síntese de

novo). Como exemplo, nas primeiras horas de embebição a síntese de proteínas em

embriões de rabanete é insensível a cordicepina (um composto químico inibidor da

síntese de RNA), indicando que o mRNA já existente é que está sendo usado.

Entretanto, depois de algumas horas, esse mRNA é degradado, e a síntese de

proteínas torna-se dependente do mRNA novo, recentemente sintetizado (Bewley e

Black,1994). Acredita-se que as proteínas codificadas por mRNAs residuais são

importantes durante o processo de maturação e desidratação da semente, dentre

estas, podemos citar as proteínas LEAs (“Late-embryogenesis abundant”), que

protegem as membranas durante a desidratação e podem ser rapidamente

degradadas após a embebição (Jiang e Kermode, 1994; Han et al., 1996, Hong-Bo

et al., 2005). Proteínas LEAs estão presentes nas sementes de plantas superiores.

Estas proteínas também são encontradas em plântulas, raízes e outros órgãos da

planta (Chen et al., 2002), estando principalmente localizadas no citoplasma e

regiões nucleares (Zhang et al., 2002; Chen et al., 2002). Em plântulas de algodão

submetidas a estresses (hídricos e altas temperaturas) ocorreu o acúmulo de

mRNAs para proteínas LEAs (Li et al., 1998; Wisniewski e Zagdanska, 2001; Yang et

al., 2002; Chen et al., 2002; Jiang e Huang, 2002). Zhang et alli, em 2002,

demonstraram que a expressão de genes para proteínas LEAs é induzida por

diferentes tipos de estresses, provavelmente com o intuito de manter o metabolismo

normal de plantas superiores sob condições severas. Novos mRNAs são transcritos

durante os processos germinativos; a maioria destes, provavelmente, codifica para

proteínas essenciais para o suporte do metabolismo celular normal (Bewley e

Marcus, 1990). Muitas enzimas requeridas para a mobilização de reservas são

sintetizadas de novo, constituindo-se em alguns dos produtos iniciais da síntese de

proteínas (Bewley, 1997).

A biossíntese e a degradação de proteínas nas sementes representam

importantes fatores na regulação de fontes de nitrogênio. Durante a mobilização de

proteínas nas sementes, proteinases desempenham o importante papel de gerar

aminoácidos que serão utilizados para biossíntese de novas proteínas da própria

7

semente ou da futura planta, já que muitas destas proteínas desempenham um

papel de reserva nutritiva para a germinação.

1.2.2- Proteólise em sementes

Proteases são enzimas proteolíticas que catalisam a hidrólise de ligações

peptídicas em outras proteínas. As proteases são classificadas como endo e

exopeptidases, segundo Storey e Wagner (1986). Endopeptidases, também ditas

proteinases, são enzimas que clivam ligações peptídicas internas. Estas são ainda

convenientemente sub-classificadas, de acordo com seu mecanismo de ação, em

quatro grupos mecanísticos, segundo Storey e Wagner (1986):

proteinases serínicas: são enzimas proteolíticas que possuem o aminoácido

serina envolvido no processo de catálise. Possuem pH ótimo em torno de 8 e 9,

sendo sua atividade inibida por aprotinina, SBTI, DFP e outros.

proteinases cisteínicas: são enzimas proteolíticas que possuem o aminoácido

cisteína envolvido no processo de catálise. Possuem pH ótimo em torno de 5 e 6 e

sua atividade é inibida por E-64, cistatina, leupeptina, e outros.

proteinases aspárticas: são enzimas proteolíticas que possuem o aminoácido

ácido aspártico envolvido no processo de catálise. Possuem pH ótimo em torno de 3

e 4 e sua atividade é inibida por pepstatina e outros.

metaloproteinases: são enzimas proteolíticas que possuem um metal envolvido

no processo de catálise. Possuem pH ótimo em torno de 8 e 9 e sua atividade é

inibida por EDTA, 1,10-fenantrolina e outros.

Vários grupos têm relatado, que a maioria do conhecimento sobre proteinases

em plantas refere-se a proteinases da classe cisteínica. Algumas destas proteinases

de plantas têm sido amplamente utilizadas na indústria alimentícia e como exemplo

podemos citar a bromelaína e a papaína (Uchikoba et al., 1998). As proteinases

cisteínicas melhor caracterizadas são aquelas que participam da degradação de

proteínas de reserva durante a germinação. Entretanto, menos se sabe sobre a

presença destas proteinases durante o desenvolvimento das sementes e até mesmo

nas sementes quiescentes (Yamauchi et al., 1992; Tanaka et al., 1993).

Em 1975, Chrispeels e Boulter mostraram que cotilédones maduros de

sementes de Vigna radiata têm uma atividade endopeptidásica do tipo cisteínica,

que seria um pré-requisito para o rápido catabolismo de proteínas de reserva, tão

logo se inicia o processo de germinação da semente. Foram ainda demonstradas

8

novas atividades enzimáticas, não presentes em corpos protéicos isolados de

sementes secas, mas que precisam ser ativadas ou sintetizadas, e possivelmente

inclusas nos corpos protéicos, antes do início da degradação de proteínas de

reserva, pós-germinação (Harris e Chrispeels, 1975). Estudos ultra-estruturais

demonstraram que o retículo endoplasmático rugoso prolifera e pode dar origem a

vesículas que se fusionam com os corpos protéicos antes da digestão de proteínas

de reserva dos cotilédones (Chrispeels et al., 1976).

Baumgartner e Chrispeels (1977) purificaram e caracterizaram a vicilina

peptídeo-hidrolase, a principal endopeptidase cisteínica de cotilédones de Vigna

radiata. Ela age sobre a proteína 7S de reserva isolada de sementes quiescentes de

Vigna radiata, sendo sintetizada três dias após a germinação, como resultado da

síntese de novo dependente do eixo embrionário (Chrispeels et al., 1976).

A presença de enzimas durante o desenvolvimento de sementes, que clivam

especificamente a ligação peptídica Asn-Gly, localizada na junção entre as cadeias

e da molécula de pró-legumina, transformando-a na sua forma madura,

legumina, a principal proteína de reserva em sementes de algumas leguminosas,

tais como a soja (Hara-Nishimura et al., 1998). Nong et alli (1995) demonstraram

ainda a presença de proteinases cisteínicas, em cotilédones de soja em

desenvolvimento, pertencentes à família da papaína e que mostraram alta

homologia com proteinases induzidas por estresse. Estas proteinases poderiam

estar sendo sintetizadas em resposta ao processo fisiológico de dessecação durante

a maturação da semente ou por outros fatores de estresses do meio. Eles também

não descartaram a possibilidade destas proteinases estarem envolvidas no

“turnover” vacuolar de proteínas e enzimas envolvidas em diversos eventos

metabólicos dos cotilédones em desenvolvimento. Ainda neste trabalho, foi

demonstrado que estas proteinases cisteínicas também se encontravam em

sementes secas de soja e que provavelmente estariam envolvidas na fase inicial de

degradação de proteínas de reserva da soja, após germinação.

Mikola e Jones (2000) caracterizaram endopeptidases de cevada que

hidrolizam as principais proteínas de reserva (globulinas) destas sementes em

germinação. Estas proteinases foram classificadas como proteinases cisteínicas e

mostraram-se ativas em pH 3,8. Como estas proteinases hidrolizam rapidamente

globulinas quando em pH 3,8, os autores sugerem que há uma provável

compartimentalização protéica, dependente de pH, dentro do endosperma.

9

A maioria dos estudos mostra a mobilização de proteínas de reserva de

sementes de leguminosas sendo feita por uma única endopeptidase cisteínica

(Baumgartner e Chrispeels, 1977), mas outros estudos têm demonstrado que há

dois grupos de enzimas distintas envolvidas neste processo; proteinases A e

proteinases B (Shutov e Vaintraub, 1987). Neste trabalho, os autores sugerem que

as proteinases A são responsáveis por iniciarem o processo de proteólise das

proteínas de reserva, gerando então peptídeos que posteriormente sofrerão a ação

de endopeptidases A e B em conjunto. Ambas endopeptidases foram classificadas

como sendo proteases da classe cisteínica. Posteriormente, Kembhavi et alli (1993)

demonstraram, através de ensaios fluorimétricos específicos, que existem duas

endopeptidases cisteínicas envolvidas na mobilização de proteínas de reserva de

sementes de Vigna acuntifolia.

Portanto, como conclusão de diferentes estudos, acredita-se que em

sementes de leguminosas a proteólise limitada das proteínas de reserva inicia-se

dias após o crescimento da plântula e é dirigida por proteinases cisteínicas que, em

geral, encontram-se ausentes nas sementes secas. Porém, em cereais, como no

caso de sementes de trigo selvagem, foi observado que a proteólise inicial ocorre

devido à ação de uma metaloproteinase que se encontra presente em sementes

secas. A hidrólise prematura destas proteínas de reserva é impedida devido à

presença de um inibidor desta protease nestas sementes e da conseqüente

formação de um complexo enzima-inibidor (Elpidina et al., 1991).

Proteinases semelhantes à proteinase A, anteriormente descrita por Shutov e

Vaintraub (1987), denominam-se de vignaínas e as semelhantes à proteinase B,

denominam-se de legumaínas. Como já mencionado, Shutov e Vaintraub (1987)

sugeriram que proteinases A estariam envolvidas em disparar a clivagem proteolítica

parcial, durante os estágios iniciais de degradação das globulinas em cotilédones de

sementes germinantes de Vicia sativa L. Mais tarde, em 1997, Becker et alli

demonstraram que a proteinase A não estava envolvida na degradação de

globulinas de reserva de Vicia sativa, já que tal enzima não se encontra presente

durante estes estágios iniciais de germinação, quando as globulinas são

degradadas.

Rotari et alli (1997) isolaram e caracterizaram parcialmente uma proteinase

cisteínica de sementes germinantes de Phaseolus vulgaris que participaria na

degradação da faseolina, principal proteína de reserva destas sementes. Ela

10

pertence ao grupo de proteinases cisteínicas homólogas às proteinases A, também

presentes em sementes germinantes de outras plantas.

Müntz et alli (1998) realizaram uma análise do padrão temporal e

histoquímico da degradação de proteínas de reserva e de proteinases cisteínicas em

eixos embrionários e cotilédones durante a germinação e estágios iniciais de

desenvolvimento da plântula de Vicia sativa L. Neste trabalho, os autores sugeriram

que durante os primeiros dois dias após a embebição, a biossíntese de proteínas no

eixo embrionário é principalmente alimentada pela degradação de proteínas de

reserva do próprio eixo e que após a exaustão destas proteínas no eixo, inicia-se a

degradação de globulinas nos cotilédones para obtenção de aminoácidos para o

posterior desenvolvimento da plântula. Os autores encontraram cinco diferentes

proteinases cisteínicas, quatro delas sendo da família da papaína, incluindo a

proteinase A, e uma classificada como uma proteinase B, recentemente associada à

família das “legumaína-like”, sendo os dois grupos responsáveis pela degradação de

proteínas de reserva. Legumaínas de plantas são chamadas usualmente de

Enzimas Processadas no Vacúolo - VPEs, mas elas também estão presentes na

parede celular e sua função não está apenas restrita a processamento de proteínas

precursoras; inclui também a quebra de proteínas no vacúolo e na parede celular

(Müntz et al., 2002).

Proteinases cisteínicas da família da papaína são enzimas bem estudadas e

contribuem para o “turnover” protéico em animais e plantas. Vários estudos têm

discutido a indução da expressão destas proteinases por giberelinas (hormônio

vegetal) durante a germinação de sementes de cevada (Rogers et al., 1985; Koehler

e Ho, 1990), arroz (Watanabe et al., 1991) e milho (De Barros e Larkins, 1990;

Domoto et al., 1995). Considera-se que esta indução de proteinases cisteínicas por

giberelinas é necessária para que ocorra a degradação de proteínas de reserva e

conseqüente fornecimento de aminoácidos que desempenharão um papel

importante na síntese protéica de novo na germinação. Por outro lado, plantas

também acumulam inibidores de proteinases cisteínicas em sementes maduras (Abe

et al., 1987; Fernandes et al., 1991).

Proteinases cisteínicas foram também purificadas de sementes de trigo

(Triticum aestivum) (Kuroda et al., 1997) e soja (Asano et al., 1999) e suas

propriedades estudadas através do uso de substratos sintéticos como Z-Phe-Arg-

MCA. Bottari et alli (1996) também isolaram e caracterizaram parcialmente uma

11

proteinase cisteínica que provavelmente encontra-se envolvida na clivagem de

gliadina (proteína de reserva de trigo) em sementes germinantes de Triticum durum.

Ainda com proteinases cisteínicas, foi realizado um estudo comparativo da

seqüência completa de aminoácidos da ananaína (do melão) com a bromelaína (do

abacaxi) e outras proteinases cisteínicas de plantas, onde foi demonstrado que a

ananaína possui características próprias que incluem uma série hidrofóbica de

aminoácidos próximos à His-157. Estas diferenças podem contribuir para a ligação

desta proteinase a substratos e inibidores distintos dos da bromelaína (Lee et al.,

1997).

Schlereth et alli (2000) fizeram uma comparação da mobilização da globulina

e a expressão de proteinases cisteínicas em eixos embrionários e cotilédones

durante a germinação e crescimento de plântulas de Vicia sativa L. Neste trabalho,

eles concluíram que a mobilização da globulina de reserva em sementes

germinantes de Vicia sativa é iniciada por um complexo de proteinases cisteínicas

estocadas na semente seca, enquanto que a mobilização do restante das globulinas

é predominantemente mediada por um complexo de proteinases cisteínicas,

sintetizadas de novo.

Acredita-se que, para mobilização de proteínas de reserva em cotilédones de

sementes de dicotiledôneas, quatro proteinases cisteínicas do tipo papaína estão

envolvidas (CPR1, CPR2, proteinase A e CPR4) e duas legumaínas (VsPB2 e

proteinase B) (Fischer et al., 2000; Schlereth et al., 2000;). Adicionalmente,

Tiedemann et alli (2001) apresentaram evidências imunohistoquímicas de que duas

proteinases do tipo papaína (CPR1 e CPR2) e uma legumaína-like (proteinase B)

estão envolvidas na mobilização de globulinas em sementes de Vicia sativa L..

Também neste caso, proteinases formadas tardiamente durante a embriogênese

iniciam a mobilização de proteínas de reserva no eixo embrionário, antes de síntese

de novo de outras proteases (Tiedemann et al., 2001). Proteinases cisteínicas do

tipo papaína-like (CPR1 e CPR2) são responsáveis pela mobilização de vicilinas,

globulinas 7 S armazenadas, de Vicia faba L.

A complexidade do processo de germinação em sementes de dicotiledôneas

e a função de proteinases cisteínicas na degradação de proteínas de reserva vem

sendo discutida por Fischer et alli (2000), Schlereth et alli (2000), Tiedemann et alli

(2001) e Müntz et alli (2002). Embora muitos detalhes ainda estejam para ser

descobertos, a expressão tempo e tecido-específicos, bem como a interação entre

12

proteinases cisteínicas e cistatinas, podem ser fenômenos-chave envolvidos na

regulação do metabolismo protéico de sementes (Flores et al., 2001).

1.3- Proteínas de reserva em sementes

As sementes de plantas contêm proteínas de várias classes, que são

depositadas durante o desenvolvimento. As proteínas de reserva classicamente

encontradas na maioria das dicotiledôneas são as globulinas, que são

caracteristicamente insolúveis em água e solúveis em soluções salinas e estão

presentes tipicamente em sementes de leguminosas. Elas são classificadas em dois

grupos, quanto ao coeficiente de sedimentação; vicilinas 7 – 8 S e leguminas 11 –

12 S (Bewley and Black, 1994).

Prolaminas, solúveis em álcool, são geralmente encontradas em sementes de

cereais e são ricas em prolinas e amidas (Bewley and Black, 1994). As albuminas

(2S) também são amplamente encontradas em dicotiledôneas, e são solúveis em

água. As glutelinas, presentes no trigo, no milho e em outros cereais, são insolúveis

em soluções aquosas neutras ou salinas e em álcool, mas podem ser extraídas em

soluções básicas (Shewry e Casey, 1999).

Classificações de proteínas de reserva baseiam-se em dois critérios: função e

relações bioquímicas e moleculares. Em termos de função, podemos classificá-las

em três classes principais: 1- proteínas de reserva, cuja função é armazenar

nitrogênio, carbono e enxofre; 2- proteínas estruturais e metabólicas

(“housekeeping”), que são essenciais para o crescimento e a estrutura da semente;

e 3- proteínas de proteção, que podem conferir resistência a pestes e patógenos ou

dessecação. Em alguns casos, a proteína pode apresentar uma combinação de

funções como reserva e proteção (Bewley, 2001; Fernandes e Xavier-Filho, 1998).

1.3.1- As globulinas

As sementes de leguminosas caracteristicamente contêm proteínas de

reserva do tipo globulinas, chegando a cerca de 50% das proteínas totais,

compreendendo leguminas e vicilinas. Estas proteínas são depositadas durante a

maturação e são utilizadas durante a germinação para o desenvolvimento dos

tecidos e órgãos da nova planta (Shewry e Lucas, 1997).

As vicilinas, que fazem parte do grupo das globulinas 7S – 8S, devido ao seu

tamanho e massa molecular, são proteínas de reserva de cadeia única, sem pontes

13

dissulfeto, formando trímeros com massa molecular de aproximadamente 150 kDa

(Shewry, 1995) e cadeias polipeptídicas de 56, 54 e 52 kDa (Derbyshire et al., 1976.,

Fernandes e Xavier-Filho, 1998). As vicilinas podem ser glicosiladas e são bastante

heterogêneas. Apresentam composição de aminoácidos com altas concentrações de

ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, fenilalanina e leucina tendo, no entanto,

concentrações mínimas de aminoácidos sulfurados como metionina e cisteína

(Carasco et al., 1978; Macedo et al., 1995). As três cadeias polipeptídicas das

vicilinas são codificadas por três famílias distintas de genes. Cada família de gene é

constituída aparentemente de seis genes diferentes (Higgins, 1984). Como proteína

de reserva, a vicilina serve principalmente como uma fonte de nitrogênio orgânico e

esqueleto carbônico para as reações biossintéticas necessárias ao crescimento da

plântula. Alternativamente, seus componentes aminoácidos podem ser usados como

combustível para o metabolismo energético. Por isto, as vicilinas são, como outras

proteínas de reserva, gradualmente degradadas durante a germinação e

crescimento da plântula (Freitas et al., 2006).

As vicilinas apresentam uma grande homologia na seqüência dos resíduos de

aminoácidos com as leguminas. As leguminas são globulinas com massas

moleculares entre 300 e 400 kDa, formadas por seis subunidades, com massas

moleculares de aproximadamente 50 a 60 kDa e cada subunidade é composta de

duas cadeias polipeptídicas ligadas por pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína,

em posições conservadas.

Vicilinas isoladas de sementes de Vigna unguiculata interferiram com a

germinação de esporos ou conídios dos fungos Fusarium oxyporum, F. solani,

Colletotrichum musae, Phytophtora capsici, Neurospora crassa e Ustilago maydis

(Gomes et al., 1997). Gomes et alli (1998) também mostraram que vicilinas isoladas

de diferentes sementes de leguminosas inibem o crescimento de leveduras, e

sugeriram que as vicilinas ligam-se á estruturas de leveduras que contêm quitina e

esta associação poderia resultar em inibição de bombas de H+, do crescimento das

células e da formação de esporos. O efeito inibitório de vicilinas de sementes de V.

unguiculata sobre o desenvolvimento de F. oxysporum e de células da levedura S.

cerevisiae foi observado por microscopia eletrônica, mostrando que há uma inibição

na germinação dos esporos do fungo e um desenvolvimento anormal das células de

levedura. Estes resultados sugerem que o efeito inibitório das vicilinas de sementes

de V. unguiculata no desenvolvimento dos fungos pode estar associado a sua

14

habilidade de ligar-se à superfície celular dos microrganismos, parede celular e/ou

membrana plasmática (Gomes et al., 1998).

Sales et alli (1996) mostraram que vicilinas de V. unguiculata têm a

propriedade de se ligar reversivelmente a matrizes de quitina. Formas variantes

dessas proteínas poderiam ligar-se à quitina presente no intestino médio de C.

maculatus, impedindo o desenvolvimento da larva no interior da semente.

Vicilinas são um exemplo de proteínas de reserva que apresentam a função

dual de fornecer seus esqueletos carbônicos e nitrogenados para o desenvolvimento

de plântulas, bem como participar em processos de defesa das sementes

(Fernandes e Xavier-Filho, 1998).

1.4- Corpos protéicos

No desenvolvimento das sementes de plantas superiores, o retículo

endoplasmático (RE) é o local de síntese das proteínas de reserva que são

posteriormente transportadas até seu local de acúmulo, os vacúolos de reservas,

chamados de corpos protéicos. A síntese e a deposição dessas proteínas estão

sujeitas a uma regulação espacial e temporal, sendo que, em cada espécie pode

aparecer em diferentes estágios do desenvolvimento (Herman e Larkins, 1999).

Na maioria das dicotiledôneas e das gimnospermas, a formação dos corpos

protéicos envolve a fragmentação de um grande vacúolo central após as proteínas

de reserva terem sido transportadas dos locais de síntese. Em geral, o transporte

das proteínas de reserva ocorre por meio do complexo de Golgi (glutelinas do arroz,

algumas prolaminas de trigo e globulinas das leguminosas), mas, em alguns cereais,

ocorre a formação direta do corpo protéico a partir do retículo endoplasmático

rugoso. Em monocotiledôneas, o corpo protéico pode ser simplesmente uma

agregação de proteínas de reserva que são lançadas no citoplasma sem qualquer

membrana de proteção. Pode ainda ser uma vesícula formada pela ruptura do

retículo endoplasmático, onde as proteínas de reserva são sintetizadas. Há também

outro tipo de vacúolo que acumula proteínas que são produzidas ao longo do

desenvolvimento da semente. São os vacúolos líticos que contêm enzimas

proteolíticas ácidas (hidrolases ácidas), cuja função é hidrolisar proteínas para o

crescimento na fase pós-germinativa, suportando o desenvolvimento inicial da

plântula. Proteases são expressas especificamente em tempo e local, e acumuladas

em diferentes compartimentos subcelulares (Van der Hoorn, 2008).

15

1.5- Feijão-de-corda, Vigna unguiculata (L.) Walpers

O feijão-de-corda foi trazido para o Brasil pelos portugueses que faziam o

tráfico de escravos, sendo introduzido primeiramente na Bahia, disseminado pelos

colonizadores através do país, e estabelecendo-se nas regiões de melhor adaptação

da cultura, em climas tropicais do Norte e Nordeste do Brasil (Freire-Filho, 1988).

Também foi indicado que o Oeste da África, mais precisamente a Nigéria, foi

o primeiro centro de origem e diversidade de Vigna unguiculata (L.) Walp. O

estabelecimento da espécie no Sudeste da Ásia teria ocorrido mais ou menos há

2300 anos a.C. e no Sul da Europa há 300 anos a.C. Nas Américas a espécie foi

introduzida nos séculos 16 e 17, proveniente do Sul da Europa e certamente do

Oeste da África, juntamente com o tráfico de escravos (Ng e Maréchal, 1985).

A área ocupada com feijão-de-corda, no mundo, está em torno de 12,5

milhões de ha, com 8 milhões (64% da área mundial) na parte Oeste e Central da

África. A parte restante está principalmente localizada na América do Sul, América

Central e Ásia, com pequenas áreas espalhadas pelo sudoeste da Europa, sudoeste

dos Estados Unidos e da Oceania. Entre todos os países, os principais produtores

mundiais são Nigéria, Niger e Brasil (Quin, 1997).

No Brasil, o feijão-de-corda é cultivado predominantemente no sertão semi-

árido da região Nordeste e em pequenas áreas na Amazônia.

A planta (figura 1) é botanicamente descrita como uma herbácea anual que

mostra grandes variações de acordo com o cultivar, condições de solo e clima.

Existem arquiteturas eretas, rasteiras, trepadeiras e arbustivas. A raiz principal é

bem desenvolvida com grande quantidade de raízes laterais próximas à superfície

do solo possuindo grandes nódulos fixadores de nitrogênio. As folhas são

alternadas, trifolioladas com o pecíolo medindo de 5 a 25 cm e sua cor é usualmente

verde escuro e o formato é ovalado. A inflorescência é um racemo axilar não

ramificado com um longo pedúnculo medindo de 5 a 60 cm. As flores são

pedunculadas e se inserem no eixo a uma certa distância umas das outras. As flores

são conspícuas, autogâmicas, podendo ser brancas, amareladas, roxas ou violetas.

Elas comumente abrem-se no início do dia e fecham-se por volta do meio dia.

Depois de abertas e polinizadas, as flores murcham e caem. As vagens variam em

tamanho, forma, cor e textura. Elas podem ser lineares ou apresentar curvatura, e

normalmente seu tamanho varia de 7,5 a 45 cm; são indeiscentes e quando

16

maduras podem ser amareladas, marrons ou violáceas e normalmente contém de 8

a 20 sementes. As sementes variam em tamanho, cor e forma (Kay, 1979).

O feijão-de-corda é altamente susceptível a pestes e doenças. Diversos

agentes patogênicos causam danos à cultura do feijão-de-corda no Brasil, como

fungos, vírus e bactérias (Allen, 1982). O gorgulho, Callosobruchus maculatus, é o

principal inseto predador de sementes de feijão-de-corda durante a armazenagem,

podendo danificar até 70% dos grãos produzidos em uma região (Santos et al.,

1977).

Figura 1- Feijão-de-corda, (Vigna unguiculata): planta, flores e vagens. Foto

feita pela autora, no Sítio Sapucaia, localizado em Santo Antônio de Pádua – RJ.

A tabela 1, abaixo, resume a classificação botânica do feijão-de-corda

(adaptado de Lima, 2001).

Tabela 1- Classificação botânica do feijão-de-corda, Vigna unguiculata.

Classificação

Subdivisão Gimnosperma

Classe Dicotiledônea

Subclasse Choripetalae

Família Leguminosae

Subfamília Papilionoideae

17

1.5.1- Proteólise em sementes de Vigna unguiculata

Em sementes de feijão-de-corda foram observados padrões complexos e

coordenados de atividades de proteinases cisteínicas e de cistatinas (inibidores

capazes de inibir a atividade biológica de proteinases cisteínicas), durante o

desenvolvimento de sementes (Fernandes et al., 1991), bem como variada

localização de cistatinas, em células e tecidos (Flores et al., 2001). Neste último

trabalho foi observada uma distribuição uniforme de cistatinas em cotilédones e

eixos embrionários de feijão-de-corda, exceto por uma maior concentração em

células epidérmicas da zona de abscisão entre os cotilédones (Flores et al., 2001).

De maneira similar, a cistatina de sementes de soja concentra-se numa camada

periférica de células cotiledonárias (Misaka et al., 1996). No entanto, a seqüência de

aminoácidos deduzida de uma cistatina clonada por Fernandes et al. (1993) foi vista

como deficiente em um peptídeo sinal N-terminal, sugerindo que esta não deve ser

transportada por um sistema secretório. Outros resultados demonstram que, além

de uma localização citoplasmática principal, cistatinas de V. vexillata, espécie não

domesticada do gênero Vigna, também são encontradas em espaços extra-celulares

de cotilédones e que, portanto, um processo de translocação nesta espécie poderia

ser admitido (Ávila et al., 1999).

Lima (2001) constatou que extratos de eixos embrionários de sementes de

Vigna unguiculata apresentaram atividade de proteinases cisteínicas durante a fase

de desenvolvimento, decaindo até o estágio de semente seca. Ainda, neste trabalho,

durante a fase de germinação só foi possível observar atividade de proteinases

cisteínicas em extratos de eixos embrionários após 24 horas de embebição e esta

mostrou-se crescente até os últimos estágios de germinação analisados. Em

extratos de cotilédones, o padrão de atividade de proteinases cisteínicas foi bastante

similar aos encontrados em eixos embrionários, onde a atividade mostrou-se

decrescente até o estágio de semente quiescente, elevando-se após 24 horas de

germinação até o último estágio analisado.

O acompanhamento dos eventos proteolíticos que estão associados ao

processo de germinação de sementes de valor agronômico traz à luz conhecimentos

sobre os componentes envolvidos e seus mecanismos de ação e regulação, os

quais podem servir de base para programas de melhoramento ou manipulação

genética de espécies cultivadas.

18

Investigações de atividades proteolíticas de sementes durante a germinação

são geralmente restritas a cotilédones e endospermas, os tecidos de reservas

nitrogenadas típicos. No entanto, é sabido que já durante as primeiras horas de

embebição das sementes ocorre síntese de proteínas tanto em cotilédones como

em eixos embrionários de sementes (Bewley e Black, 1994), apesar de atividades

proteolíticas de hidrólise de proteínas de reserva só iniciarem-se nos cotilédones

após 2 ou 3 dias de embebição (Wilson, 1986; Vaintraub, 1987; Müntz, 1996). Isso

sugere a necessidade de uma análise mais aprofundada da expressão tempo e

tecido específicas de atividades proteolíticas em sementes, o que tem sido estudado

por Müntz et alli (1998) e Schlereth et alli (2000), em Vicia sativa L., durante os

primeiros momentos da germinação.

Neste trabalho, perseguimos objetivos semelhantes aos dos autores acima

mencionados e a seguir descritos, usando como planta de estudo, Vigna

unguiculata.

19

2- OBJETIVO GERAL

Avaliar os eventos proteolíticos envolvidos nos processos germinativos e pós-

germinativos (desenvolvimento de plântulas) de feijão-de-corda (V. unguiculata),

com ênfase na atividade de proteinases da classe cisteínica e mobilização de

proteínas de reserva ao longo destes processos.

2.1- Objetivos específicos

Acompanhar a mobilização de proteínas de reserva em cotilédones, durante

os processos de germinação e desenvolvimento das plântulas;

Acompanhar as atividades de proteinases cisteínicas em cotilédones durante

os mesmos processos;

Identificar atividades proteinásicas e mobilização de proteínas de reserva em

frações de corpos protéicos e citossólicas de cotilédones durante os

processos;

Caracterizar as atividades proteinásicas encontradas nos cotilédones

germinantes de feijão-de-corda.

20

3- MATERIAIS E MÉTODOS 3.1- Sementes

As sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata (L.) Walp, cultivar

EPACE-10), foram originalmente fornecidas pelo Departamento de Fitotecnia do

Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Ceará, Fortaleza.

Atualmente, sementes originadas destas matrizes são plantadas e obtidas no

campus da Universidade Estadual do Norte Fluminense e no Sítio Sapucaia,

localizado em Santo Antônio de Pádua – RJ.

3.2- Germinação e desenvolvimento pós-germinativo

Para os experimentos de germinação, sementes quiescentes foram

esterilizadas com álcool 70 % por um minuto e lavadas com água destilada cinco

vezes. As sementes foram embebidas em água destilada por 1 hora a 30 C, antes

de serem transferidas para placas de Petri contendo papel filtro embebido em água

destilada. Foram colocadas 30 sementes embebidas por placa. As sementes foram

mantidas em uma câmara de germinação a 30º C, em fotoperíodo de 12 horas com

luz e 12 horas sem luz. As sementes foram selecionadas (seguindo um padrão de

uniformidade fenotípica, baseado em tamanho e peso) nos tempos 0, 6, 12, 24, 36,

48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 e 144 horas após embebição (HAE). As sementes foram

dissecadas em seus tecidos constituintes: cotilédones, eixo embrionário e

tegumentos, sendo apenas os tecidos cotiledonários utilizados nos experimentos.

Os tecidos separados foram liofilizados e macerados, a farinha resultante foi pesada

e estocada a – 20° C, para ensaios posteriores.

3.3- Extração de proteínas

As farinhas dos tecidos obtidos como descrito anteriormente, foram tratadas

com éter na proporção de 1:10 (p/v) durante 10 minutos. A suspensão foi

centrifugada por 2 minutos a 4.000 x g, sendo o sobrenadante descartado. Tal

tratamento com éter foi repetido, como descrito acima, visando a remoção máxima

de clorofila. 1,0 g das farinhas livres de clorofila foram então submetidas à extração

de proteínas adicionando-se 10 mL de tampão fosfato de potássio 0,1M com NaCl

0,5 M pH 8,0, contendo 1% de PVP (para evitar a ação de fenóis). A extração

processou-se durante duas horas, sob agitação a 4° C, e posteriormente, o material

foi centrifugado durante 30 minutos a 10.000 x g, a 4° C. Para obtenção das frações

21

de albuminas e globulinas o sobrenadante foi dialisado contra água durante 48

horas a 4°C. Após a diálise, o material foi centrifugado durante 30 minutos a 10.000

x g, a 4° C. A fração de globulina encontra-se no sedimento e a fração de albumina

encontra-se no sobrenadante. A fração globulínica foi lavada com água por três

vezes, intercaladas por centrifugação a 10.000 x g, a 4º C, para retirar os resíduos

da fração albumínica.

3.4- Isolamento de corpos protéicos

O isolamento de corpos protéicos foi realizado de acordo com Mäder e

Chrispeels (1984). Após a homogeneização das farinhas dos tecidos (1g / 2mL) em

tampão MES 100 mM (pH 5,5), EDTA 1 mM, Manitol 600 mM, os extratos foram

filtrados e centrifugados por 4 min, a 100 x g, para remoção de grânulos. O

sobrenadante foi colocado sobre uma solução de Ficoll 5%, no mesmo tampão, e

centrifugado por 20 minutos a 100 x g. O sedimento resultante foi lavado duas vezes

e ressuspenso em Tris / HCl 100 mM contendo NaCl 150 mM (pH 8,0). No

sedimento, a fração de corpos protéicos foi obtida e no sobrenadante, as proteínas

do citosol e de outros compartimentos celulares. A fração de corpos protéicos dos

tecidos cotiledonários, nos diferentes tempos de germinação e eventos pós-

germinativos, foi visualizada por SDS-PAGE. Seguida por “Western blotting” para

detecção de vicilinas. A fração citoplasmática foi visualizada por SDS-PAGE e

gelatina-PAGE.

3.5- Determinação da concentração de proteínas

A determinação da concentração total de proteínas dos tecidos foi baseada

no método descrito por Bradford (1976), usando-se albumina sérica bovina (BSA),

como proteína de referência. As concentrações foram avaliadas por leitura

espectrofotométrica, em comprimento de onda de 595 nm.

3.6- Visualização dos perfis protéicos por eletroforese em gel de poliacrilamida

As amostras protéicas de cotilédones foram ressuspensas (razão v/v) em

(tampão de amostra - Tris-HCl 0,5 M, glicerol, SDS 10%, azul de bromofenol 1%) e

visualizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (12%) na presença de SDS,

segundo método descrito por Laemmli (1970). A estratégia utilizada para

visualização da mobilização de proteínas de reserva foi a isovolumétrica. A

22

eletroforese foi realizada em um sistema vertical Mini Protean II da BIORAD. A

separação protéica procedeu-se sob uma corrente constante de 100 V.

O gel foi corado com solução de azul brilhante de Coomassie G 2% em água,

metanol e ácido acético (6:3:1, v/v/v), e descorado com solução composta de água

destilada, metanol e ácido acético na mesma relação de proporcionalidade usada na

preparação da solução corante.

Os marcadores de peso molecular (200 kDa: Miosina, 116 kDa: β-

galactosidase, 97 kDa: Fosforilase b, 66 kDa: Albumina bovina, 45 kDa: Albumina de

ovo, 29 kDa: Anidrase carbônica) foram usados para nos auxiliar na identificação das

massas moleculares das bandas de proteínas.

3.7- “Western blotting” para detecção de vicilinas

Para realização do “Western blotting” as proteínas dos tecidos cotiledonários,

separadas por eletroforese em gel de poliacrilmida-SDS (12%) foram transferidas

para uma membrana de nitrocelulose, de medidas idênticas ao gel. O sistema

utilizado foi o de transferência semi-seca Trans-blot Sigma.

A membrana e o gel foram equilibrados em tampão de transferência (Tris 25

mM, glicina 192 mM e metanol 20%) durante 30 e 5 minutos, respectivamente. Dez

folhas de papel filtro, com as mesmas medidas do gel e da membrana, foram

mergulhadas no mesmo tampão durante 30 minutos.

O sanduíche de transferência foi montado da seguinte maneira: 5 pedaços de

papel de filtro, seguidos da membrana de nitrocelulose, do gel e outros 5 pedaços de

papel de filtro umedecidos no tampão de transferência. Após 2 h de transferência

em amperagem de 1 mA/cm2 do gel. A membrana foi corada com Ponceau S

(Sigma) para verificação da transferência.

Após confirmação de que as proteínas foram transferidas para a membrana de

nitrocelulose, esta foi submersa em solução bloqueadora (tampão fosfato de sódio

0,1 M, NaCl 0,5 M pH 7,2 [PBS], com 2% de leite desnatado Molico em pó), por 2

horas. Posteriormente foram feitas 5 lavagens em tampão PBS-Tween-20 (TPBS)

0,05%, e a membrana foi colocada em contato com solução bloqueadora contendo

anticorpo contra vicilina, na diluição de 1: 2000, e mantida nesta solução durante a

noite (16 horas, 4ºC). Posteriormente, a solução de anticorpo foi descartada e 5

lavagens, de 20 minutos cada, com TPBS foram efetuadas. Nova solução

bloqueadora, desta vez contendo anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com

23

peroxidase na diluição de 1: 2000, foi despejada sobre a membrana e deixada sob

agitação leve, por duas horas. Nova série de 5 lavagens em tampão TPBS e uma

última com PBS foram efetuadas.

Para a revelação da reação imunoquímica, foi utilizado o método de revelação

por diaminobenzidina (DAB), onde foram utilizados 100 µL do tampão Tris-HCl 2 M

pH 7,5, 5 mg de DAB, 0,3 mL de imidazol 0,1 M, 4,9 mL de água destilada e 5 µL de

água oxigenada 30%. Esta solução (10 mL) foi vertida sobre a membrana e mantida

por aproximadamente 10 minutos. A reação foi parada pela substituição da solução

reveladora por água destilada. Os procedimentos descritos baseiam-se no método

descrito por Towbin et alli (1979).

3.8- Detecção de atividade enzimática em gel

As amostras protéicas dos tecidos cotiledonários foram visualizadas por

eletroforese em gel de poliacrilamida (12%) na presença de SDS, contendo

gelatina em uma concentração de 0,1%, baseado na metodologia descrita

primeiramente por Heussen e Dowdle (1980). De uma solução concentrada de

gelatina (1%), uma alíquota foi utilizada de forma a alcançar-se uma concentração

final de 0,1% de gelatina, na composição do gel. A separação protéica procedeu-se

sob uma corrente constante de 100 V. Após a corrida eletroforética, o gel foi lavado

com Triton X-100 2,5 % duas vezes por 30 minutos cada; logo após, o gel foi

incubado em tampão citrato de sódio 100 mM; fosfato de sódio 100 mM; DTT 1,5

mM e Triton X-100 0,1 % pH 5.6 em banho-maria a 370 C durante 16 horas.

Posteriormente o gel foi corado com Coomassie Brilhante Blue R 2% e então

descorado com uma solução de metanol : ácido acético : água (40:10:50, v/ v/ v),

respectivamente. As bandas de atividade aparecem brancas em fundo azul.

3.9- Ação de inibidores sobre as atividades proteolíticas em gel

A caracterização da atividade proteolítica foi realizada mediante o uso de

diferentes inibidores de proteases. As amostras protéicas dos tecidos cotiledonários

foram visualizadas de acordo com o item 3.8. Após a corrida eletroforética, os géis

foram lavados com Triton X-100 2,5 %, duas vezes por 30 minutos cada; logo após,

o gel foi incubado em tampão citrato de sódio 100 mM; fosfato de sódio 100 mM;

DTT 1,5 mM e Triton X-100 0,1 % pH 5.6 contendo diferentes inibidores (E-64,

PCMB, Ácido Iodoacético e Iodoacetamida – para visualização de inibição das

24

proteinases da classe cisteínicas; PMSF – para inibição de proteinases da classe

serínica; EDTA – para inibição de proteinases da classe metaloproteases). Após

incubação em banho-maria a 370 C durante 16 horas, o gel foi corado com

Coomassie Brilhante Blue R 2% e então descorado com uma solução de

metanol:ácido acético:água (40:10:50, v/ v/ v), respectivamente. Um gel controle foi

incubado com tampão de incubação sem inibidores.

3.10- Avaliação do perfil de atividades proteinásicas a partir de géis nativo / SDS-PAGE e nativo / gelatina-PAGE de proteínas e proteinases cisteínicas de

cotilédones quiescentes e germinantes 108 HAE de feijão-de-corda

As amostras protéicas de cotilédones quiescentes e de 108 HAE foram

ressuspensas (razão v/v) em (tampão de amostra - Tris-HCl 0,5 M, glicerol 10%,

SDS 10%, azul de bromofenol 1%) e foram submetidas a géis (1D) nativo 10%. Uma

vez realizada a eletroforese e antes de corar o gel, os géis foram cortados em tiras

correspondentes aos canais de amostra e, uma delas, foi corada com azul de

Coomassie. A outra foi incubada em tampão de amostra 2x (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8,

SDS 10% (v/v), azul de bromofenol 1%, glicerol 10 % (v/v)), em temperatura

ambiente, e submetidas a uma segunda eletroforese (2D) em géis de poliacrilamida

12 %, SDS 0,1% (v/v) (Dias, 2002) e géis contendo gelatina 0,1% em condições

desnaturantes (Hummel et al., 1996, Métayer et al., 2002). Os géis com gelatina

foram lavados com Triton X-100 2,5 % e incubados em tampão de incubação como

descrito anteriormente no item 3.9, em seguida os géis foram corado com

Coomassie Brilhante Blue R e então descorado com uma solução de metanol:ácido

acético:água (40:10:50, v/ v/ v), respectivamente. A eletroforese foi realizada em um

sistema vertical Mini Protean II da BIORAD. A separação protéica procedeu-se sob

uma corrente constante de 100 V.

Os marcadores de peso molecular (200 kDa: Miosina, 116 kDa: β-

galactosidase, 97 kDa: Fosforilase b, 66 kDa: Albumina bovina, 45 kDa: Albumina de

ovo, 29 kDa: Anidrase carbônica) foram usados para nos auxiliar na identificação das

massas moleculares das bandas de proteínas.

25

3.11- Determinação do grau de anomalia das proteases na migração eletroforética e determinação das massas moleculares das proteases

A determinação do grau de anomalia das proteases na migração eletroforética

causada pela gelatina foi observada na sobreposição de géis 2D desnaturantes

(Dias, 2002) com e sem gelatina 0,1% (v/v). As proteínas do tecido cotiledonário

quiescente e em cotilédones germinantes 108 HAE foram submetidas a eletroforese

em SDS-PAGE 12%. As tiras correspondentes aos poços foram cortadas e

incubadas durante 20 minutos em tampão de amostra 2 x com β-mercaptoetanol a

uma concentração de 10%. Cada tira foi então submetida a uma segunda

eletroforese (re-eletroforese) em SDS-PAGE 12 % com e sem gelatina 0,1 % (v/v).

Estes géis SDS/SDS e SDS/SDS com gelatina foram sobrepostos. As imagens

foram invertidas no programa computacional Photo Impact. Além disso, foram feitos

gráficos de Ferguson para determinação da constante de retardação (Ferguson,

1964). Estes gráficos foram construídos com base na migração das proteases em

géis de acrilamida 10% cm gradiente de gelatina (0-0,6%). Estes gráficos permitiram

a obtenção do Kr (constante de retardação) de cada banda proteásica. E de acordo

com a obtenção do Kr foi traçado uma reta para ilustrar de maneira didática a

variação no coeficiente angular das retas de diferentes mobilidades relativas (RFs)

que foram geradas pela presença de gelatina. Na figura 11 se visualiza a

sobreposição de géis em relação às suas massas moleculares e se observa

claramente o efeito de retardação na migração das proteases.

A determinação da massa molecular relativa (Figura 2) das proteases foi

estipulada relacionando a mobilidade das proteínas das amostras do gel 1 D, as

quais correspondiam às atividades proteolíticas do gel 2 D, com a mobilidade de

proteínas que apresentam massa molecular conhecida.

26

Figura 2: Determinação das massas moleculares das proteases (as amostras foram

submetidas à eletroforese em gel SDS-PAGE 12% (1D), as tiras foram submetidas a

uma segunda eletroforese em SDS-PAGE 12% contendo gelatina 0,1%). PM-

Padrão de massa molecular. As setas indicam o sentido da migração das proteínas

na análise eletroforética.

3.12- Análise densitométrica

A análise densitométrica dos géis foi realizada através do uso do programa

computacional “Gel Perfect” (Bozzo e Retamal, 1991; Retamal et al., 1999), após

obtenção de uma imagem cinza em formato TIFF através de um scanner comercial

em 400 dpi. As massas moleculares relativas foram obtidas por comparação da sua

mobilidade eletroforética com proteínas de massa molecular conhecida, que co-

migraram no mesmo gel. O programa calcula a mobilidade relativa (Rf) de cada

banda e a área ocupada por ela, dando também uma representação diagramática

das bandas protéicas e sua concentração relativa em relação ao total de proteínas

por canal.

27

4- RESULTADOS 4.1- Análise do perfil eletroforético e “Western blotting” da fração globulínica do tecido cotiledonário ao longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de Vigna unguiculata.

Na fração globulínica (Figura 3a) foi possível observar que as vicilinas (com

massas moleculares aproximadamente entre 56, 54 e 52 kDa), proteínas de reserva

da semente, são as mais abundantes. Também foi observado sua mobilização ao

longo dos processos germinativos e pós-germinativos. A subunidade de 56 kDa é a

primeira a ser totalmente mobilizada e a de 52 kDa, a última. A degradação de

vicilinas em cotilédones de Vigna unguiculata foi mais notável 72 HAE (Figura 3a).

Outras alterações protéicas, em momentos específicos do processo germinativo e

pós-germinativo também podem ser observadas. Como o desaparecimento de uma

banda (retângulo figura 3a) após 6 HAE e seu aparecimento em 12HAE. Também

pode ser observado o aparecimento de duas bandas de baixo peso molecular

(retângulo figura 3a) a partir de 72 HAE até o ultimo tempo analisado. A figura 3(b)

mostra o resultado de “Western blotting” para detecção específica de vicilinas. Foi

possível observar a degradação das vicilinas ao longo do processo germinativo e

pós-germinativo, bem como o aparecimento, a partir de 72 HAE, de produtos da

quebra das principais subunidades de vicilinas. Tais produtos, apresentam massas

moleculares mais baixas entre 35 e 25 kDa, retiveram epítopos de reconhecimento

pelos anticorpos policlonais contra vicilinas.

4.2- Análise do perfil eletroforético da fração albumínica do tecido cotiledonário ao longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de Vigna unguiculata.

Foi observada a presença de várias proteínas nesta fração, em especial uma

banda com massa molecular em torno de 29 kDa em todos os tempos analisados.

Também foi visível a mobilização de bandas protéicas com massas moleculares

próximas a 97 kDa que foram diminuindo de intensidade ao longo do processo

germinativo e pós-germinativo, as quais podem representar proteínas de reserva do

tipo leguminas. Não há, no entanto, dados suficientes que confirmem tal sugestão.

28

kDa 200 116 97 66 45 29

(a) (b)

Figura 3: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% (a) e “Western blotting” para

detecção de vicilinas específicas (b) da fração globulínica extraída de cotilédones

das sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE, na ausência de -

mercaptoetanol. Foram aplicados 8µL de amostra por poço. Poços: M- Marcador de

peso molecular; 0 HAE (Semente quiescente); 6 HAE; 12 HAE; 24 HAE; 36 HAE; 48

HAE; 60 HAE; 72 HAE; 84 HAE; 96 HAE; 108 HAE; 120 HAE; 144 HAE,

respectivamente.

M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 144 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96108120144

29

kDa 200 116 97 66 45 29

Figura 4: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração albumínica extraída

de cotilédones das sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE. Foram

aplicados 3µL de amostra por poço. Poços: M- Marcador de peso molecular; 0 HAE

(Semente quiescente); 6 HAE; 12 HAE; 24 HAE; 36 HAE; 48 HAE; 60 HAE; 72

HAE; 84 HAE; 96 HAE; 108 HAE; 120 HAE; 144 HAE, respectivamente.

M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 144

30

4.3- Análise do perfil eletroforético e “western blotting” de proteínas de corpos protéicos e proteínas citoplasmáticas ao longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de feijão-de-corda

A degradação de proteínas foi perceptível na fração de corpos protéicos

(FCP) (Figuras 5 a e b) e na fração citoplamática (FC) de cotilédones ao longo do

processo germinativo e pós-germinativo de sementes de feijão-de-corda, quando

visualizadas por SDS-PAGE (Figura 6). A degradação de vicilinas armazenadas em

corpos protéicos foi visível por detecção através de Western blotting (Figura 5c). O

perfil de corpos protéicos foi modificado quando usado um agente redutor, como β-

mercaptoetanol (Figura 5b), especificamente enfatizado por alterações em proteínas

de massa molecular compatível com a de leguminas e nas subunidades de vicilinas

de 56, 54 e 52 kDa . Uma série de polipeptídeos de baixo peso molecular foram

também mais proeminentes (retângulo vermelho figura 5b) quando estavam na

presença de β-mercaptoetanol. Inversamente algumas proteínas foram melhor

visualizadas na ausência do agente redutor.

Atividade de proteinases cisteínicas foi detectada na fração citoplasmática

(FC), por análise zimográfica (Figura 6b). Bandas das proteinases majoritárias

aparecem entre 66 e 97 kDa, demonstrando atividade a partir de 24 HAE até 144

HAE. Houve aparecimento de atividades em bandas com massas moleculares

abaixo de 29 kDa; estas últimas foram detectadas apenas a partir de 48 HAE em

diante, aumentando sua intensidade ao longo dos tempos analisados.

31

kDa 200 116 97 66 45 29

(a) (b)

(c)

Figura 5: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração de corpos protéicos

extraída de cotilédones de sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE, na

ausência (a) e na presença (b) de agente redutor (β-mercaptoetanol) e “western

blotting” (c) para detecção de vicilinas. Foram aplicados 8µL de amostra por poço.

Poços: M- Marcador de peso molecular; 0 HAE (Semente quiescente); 6 HAE; 12

HAE; 24 HAE; 36 HAE; 48 HAE; 60 HAE; 72 HAE; 84 HAE; 96 HAE; 108 HAE; 144

HAE; respectivamente.

M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108144 M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 144

0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 144

32

kDa 200 116 97 66 45 29

kDa 200 116 97 66 45 29

(a)

(b)

Figura 6: - Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração de proteínas do

citosol extraída de cotilédones de sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE,

na presença de agente redutor (β-mercaptoetanol) (a) e Gelatina-PAGE (b). Foram

aplicados 3µL de amostra por poço. Poços: M- Marcador de peso molecular; 0 HAE


HAE; 84 HAE; 96 HAE; 108 HAE; 144 HAE; respectivamente.

M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 144

M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 144

33

4.4- Detecção de atividade gelatinolítica e ação de inibidores sobre as atividades proteinásicas ao longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de Vigna unguiculata

A figura 7 mostra os resultados encontrados nas eletroforeses em gel de

poliacrilamida (12%) na presença de SDS, contendo gelatina 0,1%, das amostras da

fração enriquecida em albuminas dos tecidos cotiledonários das sementes de feijão-

de-corda nos diferentes tempos de embebição. É possível visualizar a presença de

proteases com atividade gelatinolítica no tempo 0, onde a semente está em estágio

quiescente, desidratada, nos tempos de 12 h e 60 h (com massa molecular em torno

de 45 kDa). Após 36 HAE até o último tempo analisado de 144 HAE foi possível

observar atividade gelatinolítica de uma principal banda que apresenta massa

molecular acima das principais proteínas de reserva chamadas vicilinas (com

massas moleculares entre 56, 54 e 52 kDa).

Os géis de atividade, em presença de -mercaptoetanol, foram incubados em

soluções contendo os diferentes inibidores, ácido iodoacético, iodoacetamida,

PCMB, E-64 (inibidores de proteases da classe cisteínicas), EDTA (inibidor da

classe de metaloproteases) e PMSF (inibidor de proteases da classe serínica). De

acordo com a análise densitométrica dos géis, pode-se observar que o inibidor

iodoacetamida interferiu em 65 % na atividade da protease (Figura 8), sendo o

inibidor que inibiu mais eficientemente as proteases. Quando o gel foi incubado com

PMSF houve uma inibição considerável da principal banda de atividade (Figura 9). O

PMSF é um inibidor irreversível para proteases serínicas, mas achados na literatura

dizem que é raro, mas podem inibir proteases da família da papaína (Segundo

Calbiochem).

34

Imagem invertida

Figura 7: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% contendo 0,1% de gelatina, da

fração albumínica extraída de cotilédones das sementes de V. unguiculata ao longo

de 120 HAE, na presença de diferentes inibidores de proteinases cisteínicas; em (a)

controle na presença de β-mercaptoetanol, em (b) na ausência de β-mercaptoetanol,

em (c) na presença de iodoacetamida, em (d) na presença de E-64, em (e) na

presença de PCMB em (f) na presença ácido iodoacético. Foram aplicados 3µL de

amostra por poço. Poços: M- Marcador de peso molecular; 0 HAE (Semente

quiescente); 6 HAE; 12 HAE; 24 HAE; 36 HAE; 48 H; 60 HAE; 72 HAE; 84 HAE; 96

HAE; 108 HAE; 120 HAE; respectivamente.

M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108120 M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

(a)

Con

trole

com

β

(c)

Iodo

acet

amid

a (e

) PC

MB

(b) C

ontrole sem β

(d) E-64

(f) Á

cido iodoacético

35

Concentração

dos inibidores

Inibidores Área Ocupada por

bandas de atividade

Percentagem de Atividade

Residual(%)

- Controle com β-

mercaptoetanol 6187 50

- Controle sem β-

mercaptoetanol 1200 100

50 µM Iodoacetamida 4200 65

100 µM E-64 5756 53

10 mM PCMB 6842 43

300 µM Ácido Iodoacético 5832 52

Figura 8: Análise densitométrica de atividades proteinásicas de cotilédones


banda de atividade. Os gráficos são resultados obtidos da análise no programa

computacional Gel Perfect.

0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108120

Controle com β-mercaptoetanol

Controle sem β-mercaptoetanol

Iodoacetamida

E-64

PCMB

Ácido Iodoacético

36

Figura 9: Análise densitométrica em função da mobilidade relativa ( Rf ) da principal

banda de atividade. O gráfico mostra os resultados obtidos da análise no programa

computacional Gel Perfect.

0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 144

Áre

a

Mobilidade Relativa

Ácido Iodoacético

Controle

Proteínas

EDTA

PCMB

PMSF

EDTA

PCMB

Ac. Iodoacético

Controle

PMSF

37

4.5- Detecção de atividade proteásica ao longo do processo germinativo e pós-germinativo das sementes de feijão-de-corda na ausência e presença de agente redutor

A atividade proteásica em cotilédones ao longo do processo germinativo e

pós-germinativo foi detectada em géis unidimensionais SDS-PAGE 12% com

gelatina 0,1%, com (Figura 10a) e sem β-mercaptoetanol (Figura 10b). Os

resultados demonstraram que o perfil eletroforético das bandas de atividade de

menores massas moleculares é alterado na presença do agente redutor, o que

sugere que estas proteases possuem pontes dissulfeto (RS-RS) importantes para

sua atividade catalítica. As atividades de maior massa molecular, majoritárias nos

cotilédones de 36 a 144 HAE, não foram afetadas pelo agente redutor. Bandas de

atividade de abaixo de 29kDa sofreram redução parcial de sua atividade com a

presença de agente redutor.

4.6- Comparação da migração eletroforética de proteínas e atividades proteásicas em géis bidimensionais SDS-PAGE / SDS-PAGE e SDS-PAGE em presença de gelatina 0,1% e determinação das massas moleculares de

proteases

Uma abordagem para determinação do grau de anomalia na migração das

proteases, causada pela presença de gelatina, foi a sobreposição de géis 2D-PAGE

desnaturantes com e sem gelatina 0,1% das proteínas do tecido cotiledonário ao

longo do processo germinativo e pós-germinativo. As imagens destes géis

(SDS/SDS e SDS/SDS com gelatina) foram sobrepostas no programa computacional

Photo Impact, onde algumas foram invertidas. Nossos resultados confirmam a

anomalia na migração das proteases em géis com gelatina em relação aos géis sem

gelatina. Além disso, foram traçadas linhas para ilustrar de maneira didática a

variação no coeficiente angular das retas de diferentes Rfs (Figura 11), onde foram

utilizadas as imagens de proteínas e proteases das amostras do tecido cotiledonário

sobrepostas. Conforme a massa molecular das proteínas decresce, o grau de desvio

aumenta, o que significa que o polímero de gelatina altera mais efetivamente a

migração de proteínas de massas moleculares pequenas. Esta técnica permite

também localizar proteases em géis que não contêm gelatina, com a prévia correção

do valor do coeficiente angular das retas que originam as proteínas.

38

Devido à anomalia a migração das proteínas em géis com gelatina em relação

a géis sem gelatina (Hummel et al., 1996), estimada pela variação no coeficente

angular (figura 11), determinação da massa molecular relativa das proteases do

tecido cotiledonário dos tempos de 0 HAE (semente quiescente) e 108 HAE, foi

realizada relacionando a mobilidade das proteases no gel 1D (SDS-PAGE 12%) com

a mobilidade das proteases no gel 2D (SDS-PAGE 12%, contendo gelatina 0,1%)

(Figura 11).

4.7- Análise do perfil eletroforético das proteínas e proteases por géis

bidimensionais do tecido cotiledonário de sementes de Vigna unguiculata

A figura 12a mostra o perfil eletroforético analisado em géis bidimensionais da

amostra do tecido cotiledonário no tempo 0 HAE (semente seca) de feijão-de-corda.

Foi possível detectar atividade proteásica em gel bidimensional nativo 10% / SDS-

PAGE 12% com gelatina 0,1%, neste tempo (Figura 12b).

A figura 13 mostra o perfil eletroforético analisado em géis bidimensionais da

amostra do tecido cotiledonário no tempo 108 HAE. Foi possível detectar atividade

proteásica em gel bidimensional nativo 10% / SDS-PAGE 12% com gelatina 0,1%,

neste tempo (Figura 13b). A figura 13a mostra proteínas do tempo 108 HAE de

massa molecular idêntica também tiveram o mesmo Rf sob condições nativas,

sugerindo a existência de agregados. Uma reta de proteínas (Fig. 13a) e proteases

(Fig. 13b) foi observada. Um constante aumento da proporção entre mobilidade

relativa e massa molecular também foi notado.

A figura 13c mostra o resultado quando o gel foi incubado com PMSF (10

mM). O inibidor foi eficaz, gerando uma inibição considerável da principal banda de

atividade no tempo de 108 HAE.

A figura 14 mostra o resultado da sobreposição das imagens. Uma drástica

alteração pode ser vista especialmente nas massas de alto peso molecular em

proteínas de reserva acídicas, que parecem originar uma serie linear de produtos de

degradação em 108 HAE nas amostras do tecido cotiledonário.

39

kDa

200 116 97 66 45 29 14

(a ) (b)

(+ β-mercaptoetanol ) (- β-mercaptoetanol )

Figura 10: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% da fração albumínica extraída

de cotilédones das sementes de V. unguiculata ao longo de 144 HAE. a - Gelatina-

PAGE com β-mercaptoetanol. b - Gelatina-PAGE sem β-mercaptoetanol. Foram

aplicados 3µL de amostra por poço. Poços: M- Marcador de peso molecula ; 0 HAE


HAE; 84 HAE; 96 HAE; 108 HAE; 120 HAE; 144 HAE, respectivamente.

M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108120144 M 0 6 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 144

40

Figura 11: Migração anômala de proteases: sobreposição de géis 2D desnaturantes

com e sem gelatina 0,1%. O tecido cotiledonário do tempo de 108 HAE foi analisado

em géis 2D: SDS-PAGE 12% / SDS-PAGE 12% e SDS-PAGE 12% / SDS-PAGE

12% com gelatina. Imagens invertidas no Photo Impact das imagens

respectivamente.

kDa 200 116 97 66 45 31 21 14

kDa 200 116 97 66 45 31 21 14

0 HAE

kDa 200 116 97 66 45 31 21 14

kDa 200 116 97 66 45 31 21 14

108 HAE

Protease

Proteínas

41

Figura 12- Eletroforese bidimensional nativo 10% / SDS-PAGE 12% (a) e

nativo/SDS 12% com gelatina 0,1% (b) da fração albumínica extraída de cotilédones

das sementes de V. unguiculata. Poços: M- Marcador de peso molecular, 0 HAE

(sementes quiescente).

Figura 13- Eletroforese bidimensional nativo10% / SDS-PAGE 12% (a) e nativo/SDS

12% com gelatina 0,1% (b) da fração albumínica extraída de cotilédones das

sementes de V. unguiculata. Poços: M- Marcador de peso molecular, 108 HAE e 108

HAE incubado com PMSF (c).

kDa 200 116 97 66 45 31 21 14

kDa 200 116 97 66 45 31 21 14

42

(b) (c)

(b) (c)

Figura 14- Sobreposição das imagens da eletroforese bidimensional nativo 10% /

SDS-PAGE 12% dos tempos de 0 HAE (semente quiescente) e 108 HAE; e nativo

10% / SDS 12% com gelatina 0,1% dos mesmos tempos citado acima da fração

albumínica extraída de cotilédones das sementes de V. unguiculata. Em (a)

sobreposição das imagens de 0 HAE (proteínas) e 108 HAE (atividade). Em (b)

sobreposição das imagens de 0 HAE (proteínas) e 108 HAE (proteínas). E em (c) 0

HAE (atividade) e 108 HAE (atividade).

Massa SDS

Rf Nativo (a)

Protease

Proteínas

43

4.8- Ensaio de termoestabilidade enzimática

Na caracterização de termoestabilidade enzimática, foi possível observar que

a enzima perde sua atividade com 5 minutos de fervura (Figura 15a). Foi possível

também observa que não houve inibição da enzima quando esta foi corrida junto no

gel com inibidor (PMSF). Quando o inibidor foi adicionado no tampão de incubação

foi possível observar inibição enzimática (Figura 15b).

(a) (b)

Figura 15: Gelatina-PAGE em gel de poliacrilamida 12% da fração albumínica

extraída de cotilédones das sementes de V. unguiculata em 108 HAE. Foram

aplicados 3µL por poço. M- Marcador de peso molecular. 1a- 108 HAE; 2 a- 108

HAE + PMSF (corrido no gel - 10mM); 3 a- 108 HAE após 5 minutos de fervura; 4 a-

108 HAE após 15 minutos após fervura; 5 a- 108 HAE após 30 minutos de fervura; 6

a- 108 HAE após 5 minutos de fervura + PMSF; 7a- 108 HAE após 15 minutos após

fervura + PMSF; 8 a- 108 HAE após 30 minutos de fervura + PMSF. 1 b- 108 HAE +

PMSF (10mM) incubado em banho a 37 °C por 16 h.

M 1 2 3 4 5 6 7 8

M 1 kDa 200 116 97 66 45 29

44

5- Discussão

Neste trabalho, foi traçado um quadro do processo germinativo e pós-

germinativo de sementes de Vigna unguiculata, acompanhando as alterações

principais nos teores de proteínas e de atividades proteinásicas da classe cisteínica

em tecidos cotiledonários. Pretendeu-se também contribuir com o entendimento da

questão enunciada por Schlereth et alli (2000), que consiste na busca dos processos

e mecanismos que estão por trás do intervalo temporal entre o início da biossíntese

protéica durante os estágios iniciais de germinação e o início da mobilização de

reservas protéicas no período pós-germinativo.

Como tecido principal de armazenamento em sementes, cotilédones tiveram

suas proteínas de reserva bastante reduzidas até 144 HAE. Como resultado visível

deste processo de degradação, um padrão interessante de hidrólise foi revelado por

análise bidimensional onde os polipeptídeos resultantes estavam alinhados

linearmente em uma relação crescente constante entre seus Rfs e Mrs (Figura 13). A

mobilização da principal proteína de reserva chamada vicilina foi mais proeminente

após 72 HAE como visto por SDS-PAGE e por análise de “Western blotting” da

fração de globulínica (Figura 3) assim como na fração de corpos protéicos (Figura 5)

preparadas de células cotiledonárias. Além da mobilização de proteínas de reserva

do tipo globulinas, várias outras proteínas da fração citoplasmática destas células de

cotilédones também foram mobilizadas ao longo do processo de germinação. De

acordo com Shutov et alli (2003), quase todas as proteínas de sementes

germinantes são degradadas em célula e tecidos de armazenamento, semelhante

com cotilédones de leguminosas. Elas representam a garantia de sucesso para a

futura planta, como provêem constituintes aminoácidos para o novo conjunto de

proteínas a serem formadas em todos tecidos localizados na nova planta.

A ocorrência de proteinases cisteínicas em plantas é bastante conhecida. As

proteinases cisteínicas melhor caracterizadas são aquelas que participam da

degradação de proteínas de reserva durante a germinação. Pouco se sabe sobre a

presença destas proteinases durante o desenvolvimento das sementes e até mesmo

nas sementes quiescentes (Yamauchi et al., 1992; Tanaka et al., 1993).

Schlereth et alli (2000) correlacionaram atividades de proteinases cisteínicas

com a mobilização de globulina em cotilédones e eixos embrionários de sementes

de Vicia sativa durante a germinação. Os autores mostraram que a mobilização de

globulina em sementes germinantes de V. sativa é iniciada através de proteinases

45

cisteínicas presentes em sementes quiescentes e mais adiante controladas por

proteinases cisteínicas sintetizadas de novo.

Foi demonstrado que a degradação de proteínas de reserva em cotilédones

de sementes de dicotiledôneas é geralmente controlada através de grupos de

proteinases cisteínicas como as papaínas- like (CPR1, CPR2, proteinase A e CPR4) e

de proteinases cisteínicas leguminas - like (VsPB2 e proteinase B) (Fischer et al.,

2000; Schlereth et al., 2000; 2001; Tiedemann et al., 2001). Primeiro, as proteínas

de reserva são atacadas por proteinases papaína-like de baixa especificidade, uma

ou outra espécie ativa em corpos protéicos de sementes secas ou ativadas durante

o início da germinação, causando uma proteólise limitada. Tais proteinases

cisteínicas de baixa especificidade coexistem com proteinases de reserva

vacuolares (VPEs) e globulinas em corpos protéicos de sementes em

desenvolvimento (Müntz et al., 2001). A inacessibilidade das globulinas às enzimas

do tipo papaína pode ser devida a tal separação espacial em diferentes

compartimentos vacuolares, como visto em sementes de tomate (Jiang et al., 2001)

ou devido à transformação de globulinas em cristais inacessíveis, como sugerido por

Weber e Neumann (1980). As degradações limitadas também podem ser mediadas

por aumento das quantidades de proteinases sintetizadas de novo e podem ser

transportadas dos corpos protéicos durante crescimento da plântula (Müntz et al.,

1998; 2001). Em alguns casos, o ataque proteolítico é suficiente o bastante para

causar alterações estruturais em proteínas de reserva que ativam degradação

ilimitada de globulinas de armazenamento principalmente executadas por

proteinases cisteínicas do tipo legumaína-like. Em cotilédones de feijão-de-corda, foi

possível detectar uma proteinase cisteínica ativa com massa molecular de ~45 kDa

em cotilédones quiescentes (Figuras 7 e 10) que também é ativa nos tempos de 12 e

60 HAE, sugerindo um papel pontual no metabolismo de processamento protéico.

Como os eventos principais de mobilização de globulina foram observados após 72

HAE, nós sugerimos que em cotilédones de feijão-de-corda proteinases cisteínicas

papaína-like de ~45 kDa são enzimas responsáveis pela proteólise limitada de

globulinas de reserva. Proteases são especificamente expressas em tempo e

espaço e acumuladas em diferentes compartimentos subcelulares (Van der Hoorn,

2008). Em cotilédones de feijão-de-corda, proteinases cisteínicas ativas foram

descobertas em frações citoplasmáticas (FC) (Figura 6). Proteinases de alto peso

molecular (> 45 kDa, <97 kDa), encontradas em FC e na fração albumínica foram

46

principalmente sintetizadas de novo após 24 HAE e de baixo peso molecular (<29

kDa,>14 kDa), encontradas principalmente nas FC, foram detectadas somente após

48 HAE (Figura 6). Proteinases cotiledonares de sementes de feijão-de-corda foram

inibidas através de inibidores de proteinases cisteínica clássicos como E-64, ácido

de iodoacético, pCMB e iodoacetamida, este último sendo o mais efetivo, nas

concentrações usadas (Figuras 7, 8 e 9).

Proteinases cisteínicas semelhantes de alto peso molecular (~70 kDa) foram

encontradas em eixos embrionários germinantes de V. sativa, mas não em

cotilédones onde foi observado proteinases cisteinicas de 25 a 50 kDa (Schlereth et

al., 2000). Em sementes de Phaseolus vulgaris, proteinases cisteínicas papaína-like

apresentaram massas moleculares em torno de 29 kDa, enquanto proteinases

cisteínicas legumaína-like apresentaram massas em torno de 40 kDa (Zakharov et

al., 2004).

A complexidade dos eventos proteolíticos que ocorrem em sementes

germinantes e a função específica de cada proteinase envolvidas foram informadas

em trabalhos por Shutov e Vaintraub (1987), Hara-Nishimura et alli (1998), Fischer et

alli (2000), Schlereth et alli (2000), Tiedemann et alli (2001) e Müntz et alli (2002),

entre vários outros. Alguns dos aspectos intrigantes ainda a serem esclarecidos

estão relacionados com as modificações e processos regulados conduzindo à

proteção precoce de degradação de proteínas em corpos protéicos, onde ambas as

proteases e substratos-alvo às vezes são co-localizados.

Há décadas atrás foi introduzido o procedimento baseado na utilização de

géis de poliacrilamida SDS contendo gelatina, caseína ou fibrina como substratos

para a localização da atividade de proteases. Estas enzimas têm a habilidade de

renaturar após a remoção de SDS e de exercer atividade proteolítica no substrato

co-polimerizado, e assim, serem analisadas com este método (Frederiks e Mook,

2004). Sabe-se que a presença do polímero de gelatina pode reduzir a migração de

proteínas de massa conhecida de 15 a 20%. Em géis de acrilamida a 7,5% a adição

de gelatina reduz a mobilidade dos padrões 13 ± 3,4%; em gel de acrilamida a 10%

a redução é de 16 ± 3,8%; e em géis 12,5%, a redução é de 15 ± 2,8% (Hummel et

al., 1996). Um retardo similar foi observado com proteínas não proteásicas de

Schizophyllum commune. As proteases migram muito mais devagar em SDS-PAGE

com gelatina do que os padrões. Para as proteases testadas, a redução da

mobilidade com a adição de gelatina em acrilamida 10% foi de 48% para

47

quimiotripsina, 44% para elastase, 43% para tripsina e 41% para papaína (Hummel

et al., 1996). O retardo não é constante entre proteases. Portanto, a massa

molecular das proteases não pode ser estimada precisamente em géis SDS com

gelatina. Para determinar a massa molecular das proteases foram realizados géis

bidimensionais SDS-PAGE / SDS-PAGE e SDS-PAGE / SDS-PAGE com gelatina, e

relacionadas as massas moleculares obtidas na primeira dimensão com a posição

das proteases na segunda dimensão. Assim, foram determinadas as massas

moleculares das bandas de atividade proteásica sem o efeito anômalo causado pelo

polímero de gelatina.

No presente trabalho, um padrão interessante de proteólise de proteases em

cotilédones após 108 HAE (Figura 13b) foi observado através de eletroforese

bidimensional nativo / SDS-PAGE. A disposição linear aparente de bandas de

atividades pode significar que a atividade proteolítica principal neste tecido induz ou

ativa novas proteases que podem agir sobre diferentes agregados ou zimógenos e

estes produtos de hidrólise são organizados em uma linha de relação crescente

constante Rf x Mr. A procura por substratos endógenos de cada proteinase cisteínica

ativa em sementes de feijão-de-corda germinantes é o objeto de investigações em

curso. Também é importante lembrar o papel que pode ser realizado através de

inibidores de proteinases cisteínicas do tipo cistatinas, regulando eventos que

harmonizam a ação de proteinases cisteínicas e a mobilização de proteínas de

reserva durante o curso da germinação de sementes, como previamente discutido

por (Fernandes et al., 1991; Flores et al. 2001).

Durante a germinação e eventos pós-germinativos as globulinas são

quebradas em condições ácidas. A análise de diferentes inibidores revelou a

presença de representantes da família de proteinases cisteínicas. Atividade de

proteinases ácidas também esteve presente na semente seca. De acordo com

informado por Shutov and Vaintraub (1987) estes resultados indicam que

proteinases cisteínicas são responsáveis pela mobilização de globulinas.

As determinações de atividades de proteinases cisteínicas realizadas neste

trabalho mostram que nos extratos de cotilédones de sementes de feijão-de-corda

(Figura 7), houve atividade enzimática em sementes quiescentes. Uma fraca

atividade acídica do tipo cisteínica esteve também presente em cotilédones e eixos

de sementes secas de V. sativa (Schlereth et al., 2000).

48

O padrão de comportamento onde, diferentes isoformas de proteases estão

ativas em diferentes estágios de germinação, sugere, provavelmente, um complexo

sistema de síntese de novo e ação destas enzimas durante esse processo. Dentre

os registros de proteinases cisteínicas de sementes em germinação e

desenvolvimento estão os já citados Müntz et alli (1998), Kalinski et alli (1992) e o de

Hara-Nishimura et alli (1998); estes últimos documentaram uma proteinase cisteínica

vacuolar (VPE), cuja principal função seria provavelmente a de processar proteínas

de reserva de mamona no interior dos corpos protéicos.

Com o objetivo de observar a inibição de tais atividades enzimáticas os géis

foram incubados em solução contendo diferentes inibidores. Foi possível observar

que os inibidores iodoacetamida, ácido iodoacético, E-64 e PCMB (inibidores de

proteinases da classe cisteínica) não afetaram totalmente as atividades enzimáticas

nas amostras do tecido cotiledonário. As atividades de eixos embrionários de Vicia

sativa foram inibidas por E-64 e parcialmente inibidas por ácido iodoacético que inibe

tanto proteinases cisteínicas do tipo papaína como legumaínas-like. Já as atividades

de proteinases de baixo peso molecular foram inibidas, tanto em cotilédones como

em eixos embrionários (Schlereth et al., 2000). Os autores sugerem que isso

provavelmente ocorra devido ao efeito do ácido iodoacético nos grupos SH que são

importantes para dobramento correto da enzima. Quando o gel foi incubado com

PMSF houve uma considerável inibição das proteases com massa molecular de ~70

kDa. Schlereth et alli (2000) não observaram inibição das proteinases de Vicia sativa

com o mesmo inibidor, mas estas foram afetadas por EDTA (inibidor de

metaloproteases). Nossos resultados indicaram um aumento das atividades

proteinásicas de cotilédones germinantes de feijão-de-corda quando incubada com

EDTA. Cotilédones de Fagopyrum esculentum L. contêm uma metaloproteinase-Zn

dependentes que em contraste com outras metaloproteases de eucariotos e

procariotos, tem uma ação limitada especificamente para proteínas de reserva de

sementes desta espécie (Müntz et al., 2001). Este substrato endógeno é localizado

em corpos protéicos e a metaloprotease tem uma atividade in vitro ótima em pH

ligeiramente ácido. In vitro a metaloprotease atua mediando uma proteólise limitada

das proteínas de reserva do tipo legumina 13 S, de cotilédones de F. esculentum L.

e gera uma fragmento com função similar que aparece durante a degradação de

globulina in vivo (Müntz et al., 2001). Estas observações são comparáveis com a

degradação inicial de globulinas em cotilédones de V. sativa (Shutov e Vaintraub,

49

1987 citado por Müntz et al., 2001) V. faba L. (Lichtenfeld et al ., 1979, 1981 citado

por Müntz et al., 2001) e G. max (L.) Merr. (Wilson et al., citado por Müntz et al.,

2001).

Nossos dados de detecção de proteinases cisteínicas, visualizadas por géis

de gelatina PAGE (Figura 7), reforçam resultados anteriores. Síntese de novo de

proteinases cisteínicas atuando no processo germinativo é um fato bastante

documentado na literatura (Harris e Chrispeels, 1975; Baumgartner e Chrispeels

1977; Müntz, 1998) e estas enzimas reconhecidamente desempenham importantes

papéis na mobilização de proteínas de reserva das sementes germinantes.

O diagrama abaixo representa um sumário dos resultados de atividades de

proteinases cisteínicas e mobilização de vicilina durante os processos germinativos e

pós-germinativos em sementes de V.unguiculata.

50

Figura 16: M* - Morfologia da semente de feijão-de-corda durante os eventos

de germinação e pós-germinação. Em A, SDS-PAGE da fração enriquecida em

globulinas; em B “western blotting” para detecção de vicilina; em C gelatina-PAGE

da fração albumínica. Em A' SDS-PAGE da fração de corpos protéicos; em B'

“western blotting” para detecção de vicilinas em corpos protéicos; em C' gelatina-

PAGE da fração albumínica.

51

6- Conclusões

A visualização da fração enriquecida em globulinas dos tecidos cotiledonários

de sementes germinantes de Vigna unguiculata mostrou a diminuição na

principal proteína de reserva, a vicilina.

A visualização eletroforética e o “imunoblotting” da fração de corpos protéicos

dos tecidos cotiledonários de sementes germinantes de Vigna unguiculata

confirmaram a degradação da principal proteína de reserva, a vicilina, a partir

de 72 HAE.

Na fração enriquecida em albuminas dos tecidos cotiledonários de sementes

germinantes de Vigna unguiculata observou-se a presença de uma banda

com massa molecular de 29 kDa, de concentração conservada ao longo do

processo germinativo e pós-germinativo.

Atividades de proteinases cisteínicas foram detectadas a partir de 36 HAE

(>66 kDa) na fração enriquecida em albuminas do tecido cotiledonário ao

longo do processo germinativo e pós-germinativo.

Atividades de proteinases cisteínicas pontuais foram detectadas na semente

quiescente (tempo 0 HAE), em 12 HAE e em 60 HAE no tecido cotiledonário.

Atividades de proteinases cisteínicas foram detectadas na fração

citoplamática (FC), por zimografia. Visualizaram-se bandas com massas

moleculares acima de 66 kDa a partir de 36 HAE até 144 HAE e bandas de

baixo peso molecular a partir de 48 HAE em diante, aumentando sua

atividade ao longo de todo o processo.

O estudo com diferentes inibidores iodoacetamida, E-64, ácido iodoacético e

pCMB indica que as proteases do tecido cotiledonário correspondem a

proteinases cisteínicas. Apesar disso, quando o inibidor PMSF foi utilizado,

houve uma inibição considerável das principais bandas de proteases com

massa molecular de ~70 kDa.

• A visualização através de eletroforese bidimensional nativo / SDS-PAGE

revelou a disposição linear aparente de bandas de atividades, isto pode

significar que a atividade proteolítica principal neste tecido induz ou ativa

novas proteases que podem agir sobre diferentes agregados ou zimógenos e

estes produtos de hidrólise são organizados em uma linha de relação

decrescente constante de Rf x Mr.

52

7- Referências Bibliográficas

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